JP2005040137A - Jnkを標的化することによりプログラム細胞死またはアポトーシスをブロックする新規な因子の同定 - Google Patents
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Abstract
【課題】 プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法および組成物を提供すること。
【解決手段】 プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法。この方法は、
アミノ酸配列NH2−TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHを有するペプチドを得る工程、および
このペプチドを使用することによってか、またはこのペプチドのアミノ酸配列の知識から開発した組成物を使用することによって、JNK経路を調節する工程、
を包含する。別の方法は、
(a)JNK経路内にある標的を選択する工程、および
(b)このJNK経路をアップレギュレートするかまたはダウンレギュレートするかのいずれかをする因子によって、この標的に干渉する工程、
を包含する。
【選択図】 なし
【解決手段】 プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法。この方法は、
アミノ酸配列NH2−TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHを有するペプチドを得る工程、および
このペプチドを使用することによってか、またはこのペプチドのアミノ酸配列の知識から開発した組成物を使用することによって、JNK経路を調節する工程、
を包含する。別の方法は、
(a)JNK経路内にある標的を選択する工程、および
(b)このJNK経路をアップレギュレートするかまたはダウンレギュレートするかのいずれかをする因子によって、この標的に干渉する工程、
を包含する。
【選択図】 なし
Description
アポトーシスを調節する方法および組成物は、細胞生存経路または細胞死経路の成分を、NF−κB/IκBから遺伝子活性化を介してJNK経路の成分(例えば、MKK7)と相互作用するGadd45βまでをブロックまたは刺激することに基づく。Gadd45β非依存性JNK調節は、特定の細胞型において存在して、アポトーシスまたは細胞生存を調節する。JNK経路は、生存または死へ向かう細胞の進行の制御に関する焦点である。
アポトーシスまたはプログラム細胞死は、正常な発生および組織ホメオスタシスにおいて中心的役割を果す生理学的プロセスである。多くの因子が、複雑な経路において相互作用して、細胞死または細胞生存をもたらす。
(A.NF−κB)
(1.免疫応答および炎症応答におけるNF−κB)
NF−κB転写因子は、先天性免疫応答および適応性免疫応答の協調的調節因子である。NF−κBの特徴は、多数の細胞外シグナル(その内には、腫瘍壊死因子(TNFα)がある)に応答した、細胞質から核への迅速なトランスロケーションである。NF−κBダイマーは、一般的には、非刺激細胞の細胞質中に休眠状態で存在し、IκBとして公知である阻害タンパク質によりそこに保持される。NF−κBダイマーは、IκBの連続的なリン酸化およびタンパク質分解を誘導するシグナルによって、迅速に活性化され得る。そのインヒビターを除去すると、NF−κBが細胞核に移動して、防御関連遺伝子の協調的セット(例えば、多数のサイトカイン、増殖因子、ケモカイン、接着分子、および免疫レセプターをコードする遺伝子)を迅速に誘導することが可能になる。進化に関して、細胞防御遺伝子とNF−κBとの間の関係は、5億年前に始まる。なぜなら、この関係は、脊椎動物および無脊椎動物の両方において見出されるからである。後者の生物において、NF−κB因子は、Tollレセプターにより主に活性化されて先天性防御機構を誘導する。脊椎動物において、これらの因子はまた、Bリンパ球およびTリンパ球により広範に使用されて、抗原に対する細胞応答および腫瘍応答を開始する。
(1.免疫応答および炎症応答におけるNF−κB)
NF−κB転写因子は、先天性免疫応答および適応性免疫応答の協調的調節因子である。NF−κBの特徴は、多数の細胞外シグナル(その内には、腫瘍壊死因子(TNFα)がある)に応答した、細胞質から核への迅速なトランスロケーションである。NF−κBダイマーは、一般的には、非刺激細胞の細胞質中に休眠状態で存在し、IκBとして公知である阻害タンパク質によりそこに保持される。NF−κBダイマーは、IκBの連続的なリン酸化およびタンパク質分解を誘導するシグナルによって、迅速に活性化され得る。そのインヒビターを除去すると、NF−κBが細胞核に移動して、防御関連遺伝子の協調的セット(例えば、多数のサイトカイン、増殖因子、ケモカイン、接着分子、および免疫レセプターをコードする遺伝子)を迅速に誘導することが可能になる。進化に関して、細胞防御遺伝子とNF−κBとの間の関係は、5億年前に始まる。なぜなら、この関係は、脊椎動物および無脊椎動物の両方において見出されるからである。後者の生物において、NF−κB因子は、Tollレセプターにより主に活性化されて先天性防御機構を誘導する。脊椎動物において、これらの因子はまた、Bリンパ球およびTリンパ球により広範に使用されて、抗原に対する細胞応答および腫瘍応答を開始する。
免疫応答および炎症応答におけるNF−κBの役割について、証拠が存在する。この転写因子はまた、広範なヒト疾患(自己免疫状態および慢性炎症状態(例えば、喘息、慢性関節リウマチ、および炎症性腸疾患)を含む)において役割を果す。実際、これらの状態を処置するために最も広範に使用される抗炎症剤および免疫抑制剤(例えば、グルココルチコイド、アスピリン、および金塩)は、NF−κBを抑制することによって主に作用する。
TNFαは、最も強力な炎症促進サイトカインであり、そしてNF−κBの最も強力なアクチベーターのうちの1つであると論証できる。同様に、NF−κBは、TNFαの強力な誘導因子であり、サイトカインとこの転写因子との間のこの相互調節は、ポジティブフィードバックループの確立のための基礎である。このポジティブフィードバックループは、敗血症性ショックおよび慢性炎症状態(例えば、慢性関節リウマチ(RA)および炎症性腸疾患(IBD))の病理において中心的な役割を果す。実際、これらの後者の障害の処置における標準的な治療アプローチは、高用量のNF−κBブロッカー(例えば、アスピリンおよびグルココルチコイド)の投与からなる。中和抗体の使用によるTNFαの阻害は、これらの状態の処置における有効なツールを示す。しかし、NF−κBインヒビターを用いる慢性的処置は、かなりの副作用を有する。この副作用としては、免疫抑制効果が挙げられる。そして、宿主免疫応答の発生に起因して、患者は、抗TNFα中和抗体の有益な効果に対して迅速に治療抵抗性になる。
(2.NF−κBおよびアポトーシス制御)
協調的な免疫応答および炎症応答に加えて、NF−κB/Rel群の転写因子は、アポトーシスを制御する。アポトーシス(すなわち、プログラム細胞死(PCD))は、正常な発生および組織ホメオスタシスにおいて中心的な役割を果す生理学的プロセスである。アポトーシスの特徴は、内因性自殺プログラムの実行を介するその細胞自体の破壊に、その細胞が積極的に関与することである。このプロセスにおける重要な事象は、進化的に保存されたプロテアーゼファミリーであるカスパーゼのタンパク質分解切断による活性化である。カスパーゼ活性の1つの経路、すなわち「内因性」経路は、発生上の合図または環境的な合図(例えば、遺伝子毒性因子)に応答して、Bcl−2ファミリーメンバー(例えば、BaxおよびBak)により誘発される。もう1つの経路は、「デスレセプター(DR)(例えば、TNFレセプター1(TNF−R1)、Fas(CD95)、ならびにTRAIL−R1およびTRAIL−R2)の誘発により開始され、これは、アダプター分子(例えば、TRADDおよびFADD)をこれらのレセプターにリガンド誘導性動員してカスパーゼ活性化を生じることに依存する。
協調的な免疫応答および炎症応答に加えて、NF−κB/Rel群の転写因子は、アポトーシスを制御する。アポトーシス(すなわち、プログラム細胞死(PCD))は、正常な発生および組織ホメオスタシスにおいて中心的な役割を果す生理学的プロセスである。アポトーシスの特徴は、内因性自殺プログラムの実行を介するその細胞自体の破壊に、その細胞が積極的に関与することである。このプロセスにおける重要な事象は、進化的に保存されたプロテアーゼファミリーであるカスパーゼのタンパク質分解切断による活性化である。カスパーゼ活性の1つの経路、すなわち「内因性」経路は、発生上の合図または環境的な合図(例えば、遺伝子毒性因子)に応答して、Bcl−2ファミリーメンバー(例えば、BaxおよびBak)により誘発される。もう1つの経路は、「デスレセプター(DR)(例えば、TNFレセプター1(TNF−R1)、Fas(CD95)、ならびにTRAIL−R1およびTRAIL−R2)の誘発により開始され、これは、アダプター分子(例えば、TRADDおよびFADD)をこれらのレセプターにリガンド誘導性動員してカスパーゼ活性化を生じることに依存する。
細胞死を制御する精巧な機構の調節解除は、ヒトにおいて深刻な疾患(自己免疫障害および癌を含む)を引き起こし得る。実際、アポトーシスの妨害は、細胞周期の調節における異常とちょうど同じ程度に癌の病因に対して重要である。この生理学的アポトーシス機構の不活化はまた、腫瘍細胞が抗癌処置を回避するのを可能にする。このことは、化学療法剤および放射線が、癌細胞を殺傷させるためにアポトーシス経路を最終的には使用することが原因である。
種々のノックアウトモデルの分析を含む証拠は、NF−κBの活性化が、多数のアポトーシス誘発因子(TNFαおよびTRAILを含む)による細胞殺傷に拮抗するためには必要とされることを示す。実際、ほとんど細胞は、NF−κB活性化またはタンパク質合成がブロックされない限り、TNFα細胞傷害性に対して完全に治療抵抗性である。顕著なことに、NF−κBの強力な生存促進効果は、広範囲の生理学的プロセス(Bリンパ球産生、B細胞およびT細胞同時刺激、骨形成、およびマイトジェン応答を含む)を提供する。NF−κBの抗アポトーシス機能はまた、癌における腫瘍形成および化学療法抵抗性および放射線療法抵抗性ならびに他のいくつかの病理学的状態にとって重要である。
JNKが、TRAILに対するアポトーシス応答に関与することを示唆する証拠が存在する。第1に、TRAIL−Rにより誘発されるアポトーシス機構は、TNF−R1により活性化されるものと類似する。第2に、TNF−R1を用いる場合と同様に、TRAIL−Rのリガンド係合は、JNKおよびNF−κBの両方の強力な活性化をもたらす。第3に、TRAILによる殺傷は、NF−κBのこの活性化によりブロックされる。それにも関わらず、TRAILによるアポトーシスにおけるJNKの役割は、未だ公式には実証されていない。
TRAIL−Rの誘発は、特定の癌の処置のための強力なツールとして広範な注目を受けた。TRAILの投与を含む臨床試験が、存在する。このことは、正常細胞とは異なり、腫瘍細胞がTRAIL誘導性殺傷に対して非常に感受性であることに、主に起因する。腫瘍細胞についてのTRAILの細胞傷害性効果の選択性は、少なくとも部分的には、TRAILと有効に会合する不活性レセプターであるいわゆる「デコイ(decoy)レセプター」が正常細胞上に存在すること、そしてそれによって、そのレセプターがシグナル伝達DR、TRAIL−R1およびTRAIL−R2に結合するのが妨げられることに、起因する。デコイレセプターは、代わりに、ほとんどの癌細胞上に低レベルで発現される。さらに、FasLおよびTNFαとは異なり、TRAILの全身投与は、ほんのわずかな副作用しか誘導せず、全体的には、患者によって十分に許容される。
NF−κBの細胞防御は、生存促進遺伝子の活性化を包含する。しかし、調査にも関わらず、腫瘍形成形質転換の間、癌化学療法の間、およびTNFα刺激の間のNF−κB防御機能についての基礎は、ほとんど理解されていないままである。TNF−Rに関して、NF−κBによる防御は、Bcl−2ファミリーメンバー、Bcl−XLおよびA1/Bfl−1、XIAPの誘導、ならびにTRAF1/2およびc−IAP1/2の刺激的アップレギュレーションに関係付けられている。しかし、TRAF2、c−IAP1、Bcl−XLおよびXIAPは、種々の細胞型においてTNFαによって有意には誘導されず、いくつかのNF−κB欠損細胞において、ほぼ正常なレベルで見出される。さらに、Bcl−2ファミリーメンバー、XIAP、またはTRAFとc−IAPとの組み合わせは、NF−κBヌル細胞においてPCDを部分的にしか阻害し得ない。さらに、TRAF1およびA1/Bfl−1の発現は、特定の組織に制限されており、そして多くの細胞型は、TRAF2(TRAF1をTNF−R1に動員するために必要な因子)の非存在下で、TRAF1を発現する。他の推定NF−κB標的(A20およびIEX−1Lを含む)は、NF−κB欠損細胞を保護できないか、またはそれらは、抗アポトーシス活性を有することが最近疑われている。従って、これらの遺伝子は、NF−κBの防御活性を完全には説明できない。
(3.腫瘍形成および癌治療抵抗性におけるNF−κB)
NF−κBは、腫瘍形成において役割を果す。NF−κB群のメンバー(例えば、p52/p100、Rel、およびRelA、ならびにIκB様タンパク質Bcl−3)をコードする遺伝子は、ヒトリンパ腫および白血病において頻繁に再配列または増幅される。IκBαの不活性化変異が、ホジキンリンパ腫(HL)において見出される。NF−κBはまた、変異または染色体転移事象とは無関係に、癌と関係がある。実際、NF−κBは、ほとんどのウイルスオンコジーン産物および細胞オンコジーン産物(HTLV−I Tax、EBV EBVA2およびLMP−1、SV40ラージT、アデノウイルスE1A、Bcr−Ab1、Her−2/Neu、ならびにRasのオンコジーン改変体を含む)により活性化される。NF−κBは、腫瘍形成のいくつかの局面(癌細胞増殖、分化抑制、および腫瘍侵襲性を含む)に関与するが、インビボモデルおよびインビトロモデルの両方からの直接的証拠は、NF−κBのアポトーシス制御が、癌発症にとって重要であることを示唆する。癌の初期段階において、NF−κBは、オンコジーンによる形質転換に関連するアポトーシスを抑制する。例えば、Bcr−Ablまたは、ヒト腫瘍における最も頻繁に変異したオンコジーンのうちの1つであるRasのオンコジーン改変体の発現の際に、NF−κBの阻害は、細胞形質転換をもたらすのではなく、アポトーシス応答をもたらす。EBVにより駆動される腫瘍形成はまた、IκBαM(NF−κBインヒビターであるIκBαの超活性形態)により阻害される。さらに、NF−κBは、後期腫瘍の増加中のリスト(HL、びまん性ラージB細胞リンパ腫(DLBCL)、多発性骨髄腫、および乳癌における非常に侵襲性のエストロゲンレセプター(ER)を含む)の生存を維持するために必須である。これらの悪性腫瘍の初代組織および細胞株モデルの両方が、高いNF−κB活性を構成的に示す。IκBαMまたは他の種々の手段によるこの異常な活性の阻害は、これらの癌性細胞の死を誘導する。ER乳房腫瘍において、NF−κB活性は、しばしば、Her−2/Neuレセプターの過剰発現により活性化される、PI−3KおよびAkt1キナーゼによりしばしば維持される。このHer−2/Neu/PI−3K/Akt1/NF−κB経路の構成的活性化は、これらの腫瘍のホルモン非依存性増殖および生存、ならびに抗癌処置に対するその周知の抵抗性およびその乏しい予後に関係している。この経路の活性化に起因して、癌細胞はまた、TNF−RおよびFas誘発に対して抵抗性になり、このことは、その癌細胞が免疫サーベイランスを回避するのを補助する。
NF−κBは、腫瘍形成において役割を果す。NF−κB群のメンバー(例えば、p52/p100、Rel、およびRelA、ならびにIκB様タンパク質Bcl−3)をコードする遺伝子は、ヒトリンパ腫および白血病において頻繁に再配列または増幅される。IκBαの不活性化変異が、ホジキンリンパ腫(HL)において見出される。NF−κBはまた、変異または染色体転移事象とは無関係に、癌と関係がある。実際、NF−κBは、ほとんどのウイルスオンコジーン産物および細胞オンコジーン産物(HTLV−I Tax、EBV EBVA2およびLMP−1、SV40ラージT、アデノウイルスE1A、Bcr−Ab1、Her−2/Neu、ならびにRasのオンコジーン改変体を含む)により活性化される。NF−κBは、腫瘍形成のいくつかの局面(癌細胞増殖、分化抑制、および腫瘍侵襲性を含む)に関与するが、インビボモデルおよびインビトロモデルの両方からの直接的証拠は、NF−κBのアポトーシス制御が、癌発症にとって重要であることを示唆する。癌の初期段階において、NF−κBは、オンコジーンによる形質転換に関連するアポトーシスを抑制する。例えば、Bcr−Ablまたは、ヒト腫瘍における最も頻繁に変異したオンコジーンのうちの1つであるRasのオンコジーン改変体の発現の際に、NF−κBの阻害は、細胞形質転換をもたらすのではなく、アポトーシス応答をもたらす。EBVにより駆動される腫瘍形成はまた、IκBαM(NF−κBインヒビターであるIκBαの超活性形態)により阻害される。さらに、NF−κBは、後期腫瘍の増加中のリスト(HL、びまん性ラージB細胞リンパ腫(DLBCL)、多発性骨髄腫、および乳癌における非常に侵襲性のエストロゲンレセプター(ER)を含む)の生存を維持するために必須である。これらの悪性腫瘍の初代組織および細胞株モデルの両方が、高いNF−κB活性を構成的に示す。IκBαMまたは他の種々の手段によるこの異常な活性の阻害は、これらの癌性細胞の死を誘導する。ER乳房腫瘍において、NF−κB活性は、しばしば、Her−2/Neuレセプターの過剰発現により活性化される、PI−3KおよびAkt1キナーゼによりしばしば維持される。このHer−2/Neu/PI−3K/Akt1/NF−κB経路の構成的活性化は、これらの腫瘍のホルモン非依存性増殖および生存、ならびに抗癌処置に対するその周知の抵抗性およびその乏しい予後に関係している。この経路の活性化に起因して、癌細胞はまた、TNF−RおよびFas誘発に対して抵抗性になり、このことは、その癌細胞が免疫サーベイランスを回避するのを補助する。
実際、構成的に活性なNF−κBを含まない癌においてさえ、電離放射線または化学療法剤(例えば、ダウノルビシンおよびエトポシド)によるこの転写因子の活性化は、癌治療が腫瘍細胞を殺傷する能力を鈍くし得る。実際、特定の腫瘍が、CPT−11全身処置およびIκBαMのアデノウイルス送達によって、マウスにおいて除去され得る。
(B.JNK)
(1.アポトーシスにおけるJNKの役割)
c−Jun−N末端キナーゼ(JNK1/2/3)は、哺乳動物細胞において見出されるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)カスケードの3つの主要な群のうちの1つの下流成分である。他の2つは、細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK1/2)およびp38プロテインキナーゼ(p38α/β/γ/δ)からなる。各キナーゼ群は、MAPKを含む3つのモジュールカスケード(JNK、ERK、およびp38)の一部である。MAPKは、MAPKキナーゼ(MAPKK)によるリン酸化により活性化され、次いで、MAPKKキナーゼ(MAPKKK)によるリン酸化により活性化される。ERKの活性化は、細胞の増殖および生存に主に関係付けられているが、概して、JNKおよびp38の活性化は、アポトーシスの誘導に関係付けられている。多くの細胞型を使用して、JNKの持続的活性化が細胞死を誘導すること、およびドミナントネガティブ(DN)インヒビターによるJNK活性化の遮断が、一群のアポトーシス刺激による殺傷を防ぐことが、示された。アポトーシスのおけるJNKの役割はまた、jnk遺伝子の標的化破壊を用いるマウス分析によって実証される。JNK1およびJNK2の両方を欠くマウス胚線維芽細胞(MEF)は、種々のストレス刺激(遺伝子毒性因子、UV照射、およびアニソマイシンを含む)によるアポトーシスに対して、完全に抵抗性である。jnk3−/−ニューロンは、興奮毒に対するアポトーシス応答の重篤な欠損を示す。さらに、JNK2は、未成熟胸腺細胞における抗CD3誘導性アポトーシスのために必要であることが示された。
(1.アポトーシスにおけるJNKの役割)
c−Jun−N末端キナーゼ(JNK1/2/3)は、哺乳動物細胞において見出されるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)カスケードの3つの主要な群のうちの1つの下流成分である。他の2つは、細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK1/2)およびp38プロテインキナーゼ(p38α/β/γ/δ)からなる。各キナーゼ群は、MAPKを含む3つのモジュールカスケード(JNK、ERK、およびp38)の一部である。MAPKは、MAPKキナーゼ(MAPKK)によるリン酸化により活性化され、次いで、MAPKKキナーゼ(MAPKKK)によるリン酸化により活性化される。ERKの活性化は、細胞の増殖および生存に主に関係付けられているが、概して、JNKおよびp38の活性化は、アポトーシスの誘導に関係付けられている。多くの細胞型を使用して、JNKの持続的活性化が細胞死を誘導すること、およびドミナントネガティブ(DN)インヒビターによるJNK活性化の遮断が、一群のアポトーシス刺激による殺傷を防ぐことが、示された。アポトーシスのおけるJNKの役割はまた、jnk遺伝子の標的化破壊を用いるマウス分析によって実証される。JNK1およびJNK2の両方を欠くマウス胚線維芽細胞(MEF)は、種々のストレス刺激(遺伝子毒性因子、UV照射、およびアニソマイシンを含む)によるアポトーシスに対して、完全に抵抗性である。jnk3−/−ニューロンは、興奮毒に対するアポトーシス応答の重篤な欠損を示す。さらに、JNK2は、未成熟胸腺細胞における抗CD3誘導性アポトーシスのために必要であることが示された。
しかし、ストレス誘導性アポトーシスにおけるJNKの役割は十分に確立されているが、DR(例えば、TNF−R1、Fas、およびTRAIL−R)による殺傷におけるその役割は、不明のままである。いくつかの初期研究は、JNKが、DR誘導性殺傷の重要な媒介因子ではないことを示唆した。このことは、TNFαを用いるチャレンジの間に、MEKK1(JNKの上流活性化因子)のDN変異体によるJNK活性化の阻害は、細胞生存に対して何の影響も有さなかったという知見に主に基づいた。この知見を支持して、ストレス誘導性アポトーシスに対する抵抗性にも関わらず、JNKヌル線維芽細胞は、Fasによる殺傷に対して感受性のままであるということもまた、着目された。対照的に、JNKキナーゼMKK4/SEK1のDN改変体を使用する別の初期研究は、代わりに、TNF−Rによるアポトーシス促進性シグナル伝達におけるJNKの重要な役割を示した。
(2.癌におけるJNKの役割)
JNKは、いくつかの化学療法剤およびオンコジーン産物(例えば、Bcr−Abl、Her−2/Neu、SrcおよびオンコジーンRas)により、活性化可能である。従って、癌細胞は、これらの因子により誘導されるJNK媒介性アポトーシスを抑制するための機構を採用しなければならない。実際、JNK経路の非重複(non−redundant)成分(例えば、JNKK1/MKK4)は、候補腫瘍サプレッサーとして同定アクチベーター分に特徴付けられた腫瘍サプレッサーであるBRCA1は、JNKの強力なアクチベーターであり、JNKに依存して死を誘導する。JNKの生物学的機能のうちのいくつかは、S63およびS73にて、c−Junオンコプロテインのリン酸化により媒介され、このことは、c−Jun転写活性を刺激する。しかし、細胞形質転換に対するc−Junの影響は、JNKによるその活性化とはほぼ無関係であるようである。実際、ノックイン(knock−in)研究によって、c−JunのJNKリンアクセプター部位は、インビトロでオンコジーンによる形質転換のために不必要であることが示された。同様に、形質転換およびアポトーシスならびに細胞増殖におけるJNKの活性のうちのいくつかは、c−Junリン酸化によって媒介されない。例えば、c−JunのJNKリン酸化部位の変異は、ニューロンアポトーシスにおけるJNK3消失の効果を再利用し得る(これは、転写事象に依存する)が、MEFにおけるJNK媒介性アポトーシスは、c−Junによる新たな遺伝子誘導を必要としない。さらに、JNKはまた、JunBおよびJunDを活性化し、これらは、腫瘍サプレッサーとして、インビトロおよびインビボの両方で作用する。他の研究は、Ras形質転換細胞におけるJNKの阻害は、固定非依存性増殖に対しても組織侵襲性に対しても、影響を有さないことを報告している。従って、JNKおよびc−Junは、アポトーシスおよび腫瘍形成において独立した機能を有する可能性があり、JNKは、いくつかの場合においてオンコジーンによる形質転換のためには必要ないが、代わりに、腫瘍形成を抑制することに寄与し得る。実際、JNKの阻害は、NF−κBが腫瘍形成および癌化学療法抵抗性を促進する機構を示し得る。
JNKは、いくつかの化学療法剤およびオンコジーン産物(例えば、Bcr−Abl、Her−2/Neu、SrcおよびオンコジーンRas)により、活性化可能である。従って、癌細胞は、これらの因子により誘導されるJNK媒介性アポトーシスを抑制するための機構を採用しなければならない。実際、JNK経路の非重複(non−redundant)成分(例えば、JNKK1/MKK4)は、候補腫瘍サプレッサーとして同定アクチベーター分に特徴付けられた腫瘍サプレッサーであるBRCA1は、JNKの強力なアクチベーターであり、JNKに依存して死を誘導する。JNKの生物学的機能のうちのいくつかは、S63およびS73にて、c−Junオンコプロテインのリン酸化により媒介され、このことは、c−Jun転写活性を刺激する。しかし、細胞形質転換に対するc−Junの影響は、JNKによるその活性化とはほぼ無関係であるようである。実際、ノックイン(knock−in)研究によって、c−JunのJNKリンアクセプター部位は、インビトロでオンコジーンによる形質転換のために不必要であることが示された。同様に、形質転換およびアポトーシスならびに細胞増殖におけるJNKの活性のうちのいくつかは、c−Junリン酸化によって媒介されない。例えば、c−JunのJNKリン酸化部位の変異は、ニューロンアポトーシスにおけるJNK3消失の効果を再利用し得る(これは、転写事象に依存する)が、MEFにおけるJNK媒介性アポトーシスは、c−Junによる新たな遺伝子誘導を必要としない。さらに、JNKはまた、JunBおよびJunDを活性化し、これらは、腫瘍サプレッサーとして、インビトロおよびインビボの両方で作用する。他の研究は、Ras形質転換細胞におけるJNKの阻害は、固定非依存性増殖に対しても組織侵襲性に対しても、影響を有さないことを報告している。従って、JNKおよびc−Junは、アポトーシスおよび腫瘍形成において独立した機能を有する可能性があり、JNKは、いくつかの場合においてオンコジーンによる形質転換のためには必要ないが、代わりに、腫瘍形成を抑制することに寄与し得る。実際、JNKの阻害は、NF−κBが腫瘍形成および癌化学療法抵抗性を促進する機構を示し得る。
(C.Gadd45)
(1.Gadd45タンパク質の生物学的機能)
gadd45β(Myd118としても公知である)は、誘導性遺伝子のgadd45ファミリーの3つのメンバー(gadd45α(gadd45)およびgadd45γ(oig37/cr6/grp17)もまた含む)のうちの1つである。Gadd45タンパク質は、転写レベルで主に調節され、いくつかの生物学的機能(G2/M細胞周期チェックポイントおよびDNA修復を含む)に関係付けられている。これらの機能は、Gadd45αを用いて特徴付けられており、PCNA、コアヒストン、Cdc2キナーゼ、およびp21にこの因子が結合する能力に関連付けられている。Gadd45αに対する配列類似性にも関わらず、Gadd45βは、いくらか異なる生物学的活性を示す。なぜなら、例えば、Gadd45βは、ほとんど細胞においてネガティブ増殖制御に関与しないようであるからである。Gadd45タンパク質の過剰発現はまた、いくつかの系におけるアポトーシスに関係付けられている。しかし、これは、生理学的活性であることが明らかではない。なぜなら、他の多くの系において、内因性Gadd45タンパク質の誘導は、細胞保護に関係付けられており、内因性ポリペプチドの発現は、死を誘導しないからである。最後に、Gadd45タンパク質は、MEKK4/MTK1と会合することが示されており、JNKおよびp38シグナル伝達の開始因子であることが提唱されている。他の報告は、これらのタンパク質の発現が、種々の細胞株においてJNKもp38も誘導しないこと、および内因性産物が、ストレスによるこれらのキナーゼの活性化に何ら寄与しないことを、結論付けている。Gadd45タンパク質がMEKK4に結合する能力は、これらのタンパク質とMAPK経路におけるキナーゼとの間の関係の存在を支持する。T細胞系を使用する研究は、JNKおよびp38の両方の活性化にGadd45γを関係付けており、サイトカイン応答の間のp38の調節にGadd45βを関係付けている。
(1.Gadd45タンパク質の生物学的機能)
gadd45β(Myd118としても公知である)は、誘導性遺伝子のgadd45ファミリーの3つのメンバー(gadd45α(gadd45)およびgadd45γ(oig37/cr6/grp17)もまた含む)のうちの1つである。Gadd45タンパク質は、転写レベルで主に調節され、いくつかの生物学的機能(G2/M細胞周期チェックポイントおよびDNA修復を含む)に関係付けられている。これらの機能は、Gadd45αを用いて特徴付けられており、PCNA、コアヒストン、Cdc2キナーゼ、およびp21にこの因子が結合する能力に関連付けられている。Gadd45αに対する配列類似性にも関わらず、Gadd45βは、いくらか異なる生物学的活性を示す。なぜなら、例えば、Gadd45βは、ほとんど細胞においてネガティブ増殖制御に関与しないようであるからである。Gadd45タンパク質の過剰発現はまた、いくつかの系におけるアポトーシスに関係付けられている。しかし、これは、生理学的活性であることが明らかではない。なぜなら、他の多くの系において、内因性Gadd45タンパク質の誘導は、細胞保護に関係付けられており、内因性ポリペプチドの発現は、死を誘導しないからである。最後に、Gadd45タンパク質は、MEKK4/MTK1と会合することが示されており、JNKおよびp38シグナル伝達の開始因子であることが提唱されている。他の報告は、これらのタンパク質の発現が、種々の細胞株においてJNKもp38も誘導しないこと、および内因性産物が、ストレスによるこれらのキナーゼの活性化に何ら寄与しないことを、結論付けている。Gadd45タンパク質がMEKK4に結合する能力は、これらのタンパク質とMAPK経路におけるキナーゼとの間の関係の存在を支持する。T細胞系を使用する研究は、JNKおよびp38の両方の活性化にGadd45γを関係付けており、サイトカイン応答の間のp38の調節にGadd45βを関係付けている。
以前の研究は、多くの重要な細胞プロセスを解明することを補助したが、特に、アポトーシスを制御することを担う細胞経路に関して、さらなる理解が必要なままである。例えば、NF−κBがアポトーシスを制御する様式は、不明なままである。アポトーシスの調節を担う重要な経路の解明が、アポトーシスの異常なレベルに関係する種々の疾患を処置し得る新規な治療剤を開発するためには、必要である。
NF−κBのインヒビターは、癌患者(例えば、HLまたは多発性骨髄腫を有する患者)を処置するために、標準的な抗癌剤と組み合わせて、使用される。さらに、治療インヒビター(例えば、グルココルチコイド)は、NF−κBの部分的阻害を達成するに過ぎず、かなりの副作用を示し、この副作用は、ヒトにおけるその使用を制限する。より良好な治療アプローチは、NF−κBをブロックするのではなく、癌細胞におけるその下流抗アポトーシスエフェクターをブロックする、因子を使用することであり得る。しかし、集中的調査にも関わらず、これらのエフェクターは、未知のままである。
プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法および組成物を提供すること。
(要旨)
JNK経路は、プログラム細胞死をもたらす経路の制御についての焦点であることが見出された。1)ストレス誘導性アポトーシスにおいて役割を果すことに加えて、JNK活性化は、TNF−R1および他のDR(例えば、FasおよびTRAIL−R)による効率的な殺傷のために必要である。2)JNKカスケードの阻害は、TNFα誘導性細胞傷害性に対するNF−κBによる防御機構を示す。3)JNK活性化の抑制は、NF−κBによる一般的防御機構を示し得、腫瘍形成および癌化学療法抵抗性の間にNF−κBの強力な効果を媒介する可能性がある。4)NF−κBによるJNK活性化および細胞防御の阻害は、gadd45βの転写活性化を包含する。5)Gadd45βタンパク質は、JNKK2/MKK7(JNKの特異的かつ非重複的なアクチベーター)への結合および阻害によって、JNKシグナル伝達をブロックする。この後者の知見に関して、JNKK2のGadd45β相互作用ドメインおよびGadd45βのJNKK2結合表面が、同定された。このことは、Gadd45βが(それゆえ、NF−κBが)JNK活性化をブロックしてアポトーシスを妨げる能力に干渉し得る、細胞透過性ペプチドおよび低分子の単離を容易にする。
JNK経路は、プログラム細胞死をもたらす経路の制御についての焦点であることが見出された。1)ストレス誘導性アポトーシスにおいて役割を果すことに加えて、JNK活性化は、TNF−R1および他のDR(例えば、FasおよびTRAIL−R)による効率的な殺傷のために必要である。2)JNKカスケードの阻害は、TNFα誘導性細胞傷害性に対するNF−κBによる防御機構を示す。3)JNK活性化の抑制は、NF−κBによる一般的防御機構を示し得、腫瘍形成および癌化学療法抵抗性の間にNF−κBの強力な効果を媒介する可能性がある。4)NF−κBによるJNK活性化および細胞防御の阻害は、gadd45βの転写活性化を包含する。5)Gadd45βタンパク質は、JNKK2/MKK7(JNKの特異的かつ非重複的なアクチベーター)への結合および阻害によって、JNKシグナル伝達をブロックする。この後者の知見に関して、JNKK2のGadd45β相互作用ドメインおよびGadd45βのJNKK2結合表面が、同定された。このことは、Gadd45βが(それゆえ、NF−κBが)JNK活性化をブロックしてアポトーシスを妨げる能力に干渉し得る、細胞透過性ペプチドおよび低分子の単離を容易にする。
プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法は、
アミノ酸配列NH2−TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHを有するペプチドを得る工程、および
このペプチドを使用することによってか、またはこのペプチドの知識から開発した組成物を使用することによって、JNK経路を調節する工程、
を包含する。
アミノ酸配列NH2−TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHを有するペプチドを得る工程、および
このペプチドを使用することによってか、またはこのペプチドの知識から開発した組成物を使用することによって、JNK経路を調節する工程、
を包含する。
プログラム細胞死をもたらすJNK経路を調節する因子を同定するための方法は、
アミノ酸配列NH2−TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHを有するペプチドを得る工程、および
このペプチドと相互作用する因子を同定する工程、
を包含する。
アミノ酸配列NH2−TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHを有するペプチドを得る工程、および
このペプチドと相互作用する因子を同定する工程、
を包含する。
アミノ酸配列NH2−TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHのペプチドをコードするために十分なcDNA分子もまた、JNK経路を調節する。
JNKシグナル伝達を調節する因子を同定するための方法は、
(a)この因子がアミノ酸配列NH2−TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHのペプチドに結合するか否かを決定する工程;および
(b)この結合した因子の活性についてアッセイして、JNKシグナル伝達に対する効果を決定する工程
を包含する。
(a)この因子がアミノ酸配列NH2−TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHのペプチドに結合するか否かを決定する工程;および
(b)この結合した因子の活性についてアッセイして、JNKシグナル伝達に対する効果を決定する工程
を包含する。
JNKK2と相互作用することによってJNK活性化を抑制するために十分な模倣物を得るための方法は、
(a)ペプチドNH2−TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHの機能を模倣するようにこの模倣物を設計する工程;
(b)この模倣物を、このJNK経路を含む系に接触させる工程;および
(c)JNKシグナル伝達の抑制が存在するか否かを決定する工程
を包含する。
(a)ペプチドNH2−TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHの機能を模倣するようにこの模倣物を設計する工程;
(b)この模倣物を、このJNK経路を含む系に接触させる工程;および
(c)JNKシグナル伝達の抑制が存在するか否かを決定する工程
を包含する。
プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法は、
(a)JNK経路内にある標的を選択する工程、および
(b)このJNK経路をアップレギュレートするかまたはダウンレギュレートするかのいずれかをするように、この標的に干渉する工程、
を包含する。
(a)JNK経路内にある標的を選択する工程、および
(b)このJNK経路をアップレギュレートするかまたはダウンレギュレートするかのいずれかをするように、この標的に干渉する工程、
を包含する。
干渉する方法は、
(a)Gadd45タンパク質によるJNK活性化の抑制をブロックするために十分な因子を得る工程;および
(b)上記細胞をこの因子と接触させて、プログラム細胞死を経験する細胞の割合を増加させる工程
である。
(a)Gadd45タンパク質によるJNK活性化の抑制をブロックするために十分な因子を得る工程;および
(b)上記細胞をこの因子と接触させて、プログラム細胞死を経験する細胞の割合を増加させる工程
である。
この因子は、gadd45β遺伝子配列もしくはそのフラグメントに対するアンチセンス分子、小干渉RNA分子(siRNA)、リボザイム分子、Gadd45βの結合部位と有効に競合するJNKK2に融合した細胞透過性ペプチド、無機低分子、またはGadd45タンパク質の機能を模倣するペプチド模倣物であり得る。
干渉する別の方法は、
(a)JNKK2上のGadd45結合領域と相互作用することによってJNKシグナル伝達を抑制する分子を得る工程;および
(b)細胞をこの分子に接触させて、この細胞をプログラム細胞死から保護する工程
である。
(a)JNKK2上のGadd45結合領域と相互作用することによってJNKシグナル伝達を抑制する分子を得る工程;および
(b)細胞をこの分子に接触させて、この細胞をプログラム細胞死から保護する工程
である。
干渉するためにcDNAを使用することは、
(a)Gadd45タンパク質の全長または部分をコードするcDNA分子を得る工程;
(b)上記細胞をこのcDNA分子でトランスフェクトする工程;および
(c)この細胞におけるこのcDNAの発現のための条件を提供して、JNKK2を結合させ、JNKK2が、プログラム細胞死を誘導するJNK経路を活性化するために利用不能であるようにする、工程
を包含する。
(a)Gadd45タンパク質の全長または部分をコードするcDNA分子を得る工程;
(b)上記細胞をこのcDNA分子でトランスフェクトする工程;および
(c)この細胞におけるこのcDNAの発現のための条件を提供して、JNKK2を結合させ、JNKK2が、プログラム細胞死を誘導するJNK経路を活性化するために利用不能であるようにする、工程
を包含する。
このcDNA分子は、JNKシグナル伝達を抑制するために十分なGadd45タンパク質フラグメント、Gadd45βのアミノ酸69〜113に対応するペプチドをコードし得る。
上記プログラム細胞死は、TNFα、Fas、TRAIL、または遺伝子毒性因子(例えば、ダウノルビシン(deunorubicin)またはシスプラチナム(cisplatinum))によって誘導され得る。
JNKシグナル伝達を調節する因子を同定するための方法は、
(a)この因子がGadd45βに結合するか否かを決定する工程;および
(b)この結合したGadd45βの活性についてアッセイして、JNKシグナル伝達に対する効果を決定する工程
を包含する。
(a)この因子がGadd45βに結合するか否かを決定する工程;および
(b)この結合したGadd45βの活性についてアッセイして、JNKシグナル伝達に対する効果を決定する工程
を包含する。
JNKK2と相互作用することによってJNK活性化を抑制するために十分な模倣物を得るための方法は、
(a)Gadd45タンパク質の機能を模倣するようにこの模倣物を設計する工程;
(b)この模倣物を、このJNK経路を含む系に接触させる工程;および
(c)JNKシグナル伝達の抑制が存在するか否かを決定する工程
を包含する。
(a)Gadd45タンパク質の機能を模倣するようにこの模倣物を設計する工程;
(b)この模倣物を、このJNK経路を含む系に接触させる工程;および
(c)JNKシグナル伝達の抑制が存在するか否かを決定する工程
を包含する。
JNK経路をインビトロで調節する因子をスクリーニングおよび同定するための方法は、
(a)この経路の標的成分を得る工程;
(b)細胞をこの因子に曝露する工程;および
(c)この因子がJNK経路を調節する能力を決定する工程
を包含する。
(a)この経路の標的成分を得る工程;
(b)細胞をこの因子に曝露する工程;および
(c)この因子がJNK経路を調節する能力を決定する工程
を包含する。
適切な因子としては、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプチド様分子、変異体タンパク質、cDNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンス構築物、脂質、糖質、および合成化合物または天然化合物が挙げられる。
JNK活性をインビボで調節する因子をスクリーニングおよび同定するための方法は、
(a)候補因子を得る工程;
(b)この因子を非ヒト動物に投与する工程;および
(c)JNK活性のレベルを、この因子を受けていない動物におけるJNK活性と比較して決定する工程
を包含する。
(a)候補因子を得る工程;
(b)この因子を非ヒト動物に投与する工程;および
(c)JNK活性のレベルを、この因子を受けていない動物におけるJNK活性と比較して決定する工程
を包含する。
Gadd45βがアポトーシスをブロックするのを防ぐ因子を同定するための方法は、
(a)TNFα誘導性アポトーシスに対して保護されている高レベルのGadd45βを発現する細胞を、TNFαと接触させる工程;
(b)(a)における細胞におけるアポトーシスを、この因子に曝露されているがTNFαには曝露されていないコントロール細胞と比較する工程;および
(c)コントロール細胞に対する処理細胞におけるアポトーシスの差異から、この因子はGadd45βがアポトーシスをブロックするのを妨げるか否かを推測する工程
を包含する。
(a)TNFα誘導性アポトーシスに対して保護されている高レベルのGadd45βを発現する細胞を、TNFαと接触させる工程;
(b)(a)における細胞におけるアポトーシスを、この因子に曝露されているがTNFαには曝露されていないコントロール細胞と比較する工程;および
(c)コントロール細胞に対する処理細胞におけるアポトーシスの差異から、この因子はGadd45βがアポトーシスをブロックするのを妨げるか否かを推測する工程
を包含する。
JNK経路の調節因子についてスクリーニングするための方法は、
(a)このJNK経路の候補調節因子を得る工程であって、この候補は、このJNK経路の成分を調節し得る潜在的に任意の因子であり、この因子は、ペプチド、変異体タンパク質、cDNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンス構築物、合成化合物または天然化合物を包含する、工程;
(b)この候補因子を癌細胞に投与する工程;および
(c)このJNK経路のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを含む、この候補物質のこのJNK経路の調節能力を決定し、そしてアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのレベルをアッセイする工程
を包含する。
(a)このJNK経路の候補調節因子を得る工程であって、この候補は、このJNK経路の成分を調節し得る潜在的に任意の因子であり、この因子は、ペプチド、変異体タンパク質、cDNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンス構築物、合成化合物または天然化合物を包含する、工程;
(b)この候補因子を癌細胞に投与する工程;および
(c)このJNK経路のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを含む、この候補物質のこのJNK経路の調節能力を決定し、そしてアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのレベルをアッセイする工程
を包含する。
罹患した細胞におけるアポトーシスの影響により引き起こされる変性障害および他の状態を処置する方法は、
(a)JNK経路の活性化に干渉する分子を得る工程;および
(b)この罹患した細胞をこの分子に接触させる工程
を包含する。
(a)JNK経路の活性化に干渉する分子を得る工程;および
(b)この罹患した細胞をこの分子に接触させる工程
を包含する。
免疫系が癌細胞を殺傷させるのを、JNKシグナル伝達を増強することによって補助する方法は、
(a)JNKシグナル伝達をブロックするためのインヒビターを得る工程;および
(b)この癌細胞をこのインヒビターに接触させる工程
を包含する。
(a)JNKシグナル伝達をブロックするためのインヒビターを得る工程;および
(b)この癌細胞をこのインヒビターに接触させる工程
を包含する。
このインヒビターは、Gadd45βによってJNKK2の活性化をブロックし得る。
gadd45βプロモーターをトランスアクチベートするための方法は、
(a)gadd45βのプロモーターエレメントにNF−κB複合体を結合する工程;および
(b)gadd45β遺伝子発現についてアッセイする工程
を包含する。
(a)gadd45βのプロモーターエレメントにNF−κB複合体を結合する工程;および
(b)gadd45β遺伝子発現についてアッセイする工程
を包含する。
癌を処置するための方法は、
(a)Gadd45β機能を阻害することによってJNK活性を増加する工程;および
(b)Gadd45β機能に干渉するインヒビターを投与する工程
を包含する。
(a)Gadd45β機能を阻害することによってJNK活性を増加する工程;および
(b)Gadd45β機能に干渉するインヒビターを投与する工程
を包含する。
化学療法剤もまた、使用され得る。
Gadd45タンパク質とJNKK2との間の結合に干渉する因子を決定するための方法は、
(a)Gadd45タンパク質に結合する因子を得る工程;
(b)一過性JNK活性化を誘導する条件下で、細胞をこの因子と接触させる工程;および
(c)この因子と接触された細胞を、この因子に接触されていない細胞と比較して、JNK経路が活性化されるか否かを決定する工程
を包含する。
(a)Gadd45タンパク質に結合する因子を得る工程;
(b)一過性JNK活性化を誘導する条件下で、細胞をこの因子と接触させる工程;および
(c)この因子と接触された細胞を、この因子に接触されていない細胞と比較して、JNK経路が活性化されるか否かを決定する工程
を包含する。
プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法は、
アミノ酸配列NH2−TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHを有するペプチドを得る工程、および
このペプチドを使用することによってか、またはこのペプチドのアミノ酸配列の知識から開発した組成物を使用することによって、JNK経路を調節する工程、
を包含する。
アミノ酸配列NH2−TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHを有するペプチドを得る工程、および
このペプチドを使用することによってか、またはこのペプチドのアミノ酸配列の知識から開発した組成物を使用することによって、JNK経路を調節する工程、
を包含する。
プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法は、
(a)JNK経路内にある標的を選択する工程、および
(b)このJNK経路をアップレギュレートするかまたはダウンレギュレートするかのいずれかをする因子によって、この標的に干渉する工程、
を包含する。
(a)JNK経路内にある標的を選択する工程、および
(b)このJNK経路をアップレギュレートするかまたはダウンレギュレートするかのいずれかをする因子によって、この標的に干渉する工程、
を包含する。
JNK活性をインビボで調節する因子をスクリーニングおよび同定するための方法は、
(a)Gadd45βとは独立してJNKK2と相互作用する候補因子を得る工程;
(b)この因子を、非ヒト動物に投与する工程;および
(c)この動物におけるJNK活性のレベルを、この因子を受けていない動物におけるJNK活性と比較して決定する工程
を包含する。
(a)Gadd45βとは独立してJNKK2と相互作用する候補因子を得る工程;
(b)この因子を、非ヒト動物に投与する工程;および
(c)この動物におけるJNK活性のレベルを、この因子を受けていない動物におけるJNK活性と比較して決定する工程
を包含する。
JNK経路の調節因子についてスクリーニングするための方法は、
(a)このJNK経路の候補調節因子を得る工程であって、この候補調節因子は、アミノ酸配列NH2−TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHを有するペプチドに結合し得る、工程;
(b)この候補調節因子を癌細胞に投与する工程;および
(c)このJNK経路のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを含むこの候補調節因子のJNK経路調節能力を決定し、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのレベルをアッセイする工程
を包含する。
(a)このJNK経路の候補調節因子を得る工程であって、この候補調節因子は、アミノ酸配列NH2−TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHを有するペプチドに結合し得る、工程;
(b)この候補調節因子を癌細胞に投与する工程;および
(c)このJNK経路のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを含むこの候補調節因子のJNK経路調節能力を決定し、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのレベルをアッセイする工程
を包含する。
罹患した細胞におけるアポトーシスの影響により引き起こされる変性障害および他の状態を処置する方法は、
(a)Gadd45βとは独立してJNKシグナル伝達の活性化に干渉する分子を得る工程;および
(b)この罹患した細胞にこの分子を接触させる工程
を包含する。
(a)Gadd45βとは独立してJNKシグナル伝達の活性化に干渉する分子を得る工程;および
(b)この罹患した細胞にこの分子を接触させる工程
を包含する。
免疫系が癌細胞を殺傷させるのを、JNKシグナル伝達を増強することによって補助する方法は、
(a)Gadd45βとは独立してJNKシグナル伝達をブロックするインヒビターを得る工程;および
(b)この癌細胞を該インヒビターに接触させる工程
を包含する。
(a)Gadd45βとは独立してJNKシグナル伝達をブロックするインヒビターを得る工程;および
(b)この癌細胞を該インヒビターに接触させる工程
を包含する。
上記分子は、Gadd45βとは独立してJNKK2の活性化に干渉する。
JNKK2相互作用因子を同定する方法は、
(a)アミノ酸配列TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMDを含むペプチドをベイト(bait)として提供する工程;および
(b)このペプチドと相互作用する因子を同定する工程
を包含する。
(a)アミノ酸配列TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMDを含むペプチドをベイト(bait)として提供する工程;および
(b)このペプチドと相互作用する因子を同定する工程
を包含する。
全長JNKK2の142位〜166位(TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD)に結合し得る分子へのJNKK2の結合に干渉する因子を決定するための方法は、
(a)全長JNKK2の142位〜166位(TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD)へのこの分子の結合に干渉する因子を得る工程;
(b)一過性JNK活性化を誘導する条件下で、細胞をこの因子に接触させる工程;および
(c)この因子に接触した細胞をこの因子に接触しなかった細胞と比較して、JNK経路が活性化されているか否かを決定する工程
を包含する。
(a)全長JNKK2の142位〜166位(TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD)へのこの分子の結合に干渉する因子を得る工程;
(b)一過性JNK活性化を誘導する条件下で、細胞をこの因子に接触させる工程;および
(c)この因子に接触した細胞をこの因子に接触しなかった細胞と比較して、JNK経路が活性化されているか否かを決定する工程
を包含する。
本発明の組成物としては、
gadd45βプロモーターとして機能する、GeneBank登録番号AF441860を有する、ヌクレオチド配列;
図8に記載の−447位/−438位(κβ−1)、−426位/−417位(κβ−2)、−377位/−368位(κβ−3)からなる群より選択されるアミノ酸位置にあるプロモーターのエレメントである、ヌクレオチド配列;
全長Gadd45βタンパク質の60位〜114位由来のアミノ酸配列により特徴付けられるGadd45β領域を含む、分子;
全長JNKK2の132位〜156位(GPVWKMRFRKTGHVIAVKQMRRSGN)由来のアミノ酸配列により特徴付けられるJNKK2の結合領域を含む、分子;および
全長JNKK2の220位〜234位(GKMTVAIVKALYYLK)由来のアミノ酸配列により特徴付けられるJNKK2の結合領域を含む、分子;
全長JNKK2の142位〜166位(TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD)由来のアミノ酸配列により特徴付けられるJNKK2の結合領域を含む、分子
が挙げられる。
gadd45βプロモーターとして機能する、GeneBank登録番号AF441860を有する、ヌクレオチド配列;
図8に記載の−447位/−438位(κβ−1)、−426位/−417位(κβ−2)、−377位/−368位(κβ−3)からなる群より選択されるアミノ酸位置にあるプロモーターのエレメントである、ヌクレオチド配列;
全長Gadd45βタンパク質の60位〜114位由来のアミノ酸配列により特徴付けられるGadd45β領域を含む、分子;
全長JNKK2の132位〜156位(GPVWKMRFRKTGHVIAVKQMRRSGN)由来のアミノ酸配列により特徴付けられるJNKK2の結合領域を含む、分子;および
全長JNKK2の220位〜234位(GKMTVAIVKALYYLK)由来のアミノ酸配列により特徴付けられるJNKK2の結合領域を含む、分子;
全長JNKK2の142位〜166位(TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD)由来のアミノ酸配列により特徴付けられるJNKK2の結合領域を含む、分子
が挙げられる。
JNKK2およびMKK7は、互換可能に使用される。
(項1)
プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法であって、この方法は、
アミノ酸配列NH2−TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHを有するペプチドを得る工程、および
このペプチドを使用することによってか、またはこのペプチドのアミノ酸配列の知識から開発した組成物を使用することによって、JNK経路を調節する工程、
を包含する、方法。
(項2)
プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法であって、この方法は、
(a)JNK経路内にある標的を選択する工程、および
(b)このJNK経路をアップレギュレートするかまたはダウンレギュレートするかのいずれかをする因子によって、この標的に干渉する工程、
を包含する、方法。
(項3)
JNK活性をインビボで調節する因子をスクリーニングおよび同定するための方法であって、この方法は、
(a)Gadd45βとは独立してJNKK2と相互作用する候補因子を得る工程;
(b)この因子を、非ヒト動物に投与する工程;および
(c)この動物におけるJNK活性のレベルを、この因子を受けていない動物におけるJNK活性と比較して決定する工程
を包含する、方法。
(項4)
JNK経路の調節因子についてスクリーニングするための方法であって、この方法は、
(a)このJNK経路の候補調節因子を得る工程であって、この候補調節因子は、アミノ酸配列NH2−TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHを有するペプチドに結合し得る、工程;
(b)この候補調節因子を癌細胞に投与する工程;および
(c)このJNK経路のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを含むこの候補調節因子のこのJNK経路調節能力を決定し、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのレベルをアッセイする工程
を包含する、方法。
(項5)
罹患した細胞におけるアポトーシスの影響により引き起こされる変性障害および他の状態を処置する方法であって、この方法は、
(a)Gadd45βとは独立してJNKシグナル伝達の活性化に干渉する分子を得る工程;および
(b)この罹患した細胞にこの分子を接触させる工程
を包含する、方法。
(項6)
免疫系が癌細胞を殺傷させるのを、JNKシグナル伝達を増強することによって補助する方法であって、この方法は、
(a)Gadd45βとは独立してJNKシグナル伝達をブロックするインヒビターを得る工程;および
(b)この癌細胞をこのインヒビターに接触させる工程
を包含する、方法。
(項7)
項5に記載の方法であって、上記分子が、Gadd45βとは独立してJNNK2の活性化に干渉する、方法。
(項8)
JNKK2相互作用因子を同定する方法であって、この方法は、
(a)アミノ酸配列TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMDを含むペプチドをベイトとして提供する工程;および
(b)このペプチドと相互作用する因子を同定する工程
を包含する、方法。
(項9)
全長JNKK2の142位〜166位(TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD)に結合し得る分子へのJNKK2の結合に干渉する因子を決定するための方法であって、この方法は、
(a)全長JNKK2の142位〜166位(TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD)へのこの分子の結合に干渉する因子を得る工程;
(b)一過性JNK活性化を誘導する条件下で、細胞をこの因子に接触させる工程;および
(c)この因子に接触した細胞をこの因子に接触しなかった細胞と比較して、JNK経路が活性化されているか否かを決定する工程
を包含する、方法。
(項10)
全長JNKK2の132位〜156位(GPVWKMRFRKTGHVIAVKQMRRSGN)由来のアミノ酸配列により特徴付けられるJNKK2の結合領域を含む分子。
(項11)
全長JNKK2の220位〜234位(GKMTVAIVKALYYLK)由来のアミノ酸配列により特徴付けられるJNKK2の結合領域を含む分子。
(項12)
全長JNKK2の142位〜166位(TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD)由来のアミノ酸配列により特徴付けられるJNKK2の結合領域を含む分子。
(項13)
プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法であって、この方法は、
(a)JNK経路内にある標的を選択する工程;および
(b)このJNK経路をアップレギュレートするかまたはダウンレギュレートするかのいずれかをする因子によって、この標的に干渉する工程
を包含する、方法。
(項14)
項13に記載の方法であって、この方法は、
(a)Gadd45タンパク質によるJNK活性化の抑制をブロックするために十分な因子を得る工程;および
(b)上記細胞をこの因子と接触させて、プログラム細胞死を経験する細胞の割合を増加させる工程
を包含する、方法。
(項15)
項14に記載の方法であって、上記因子が、gadd45β遺伝子配列またはそのフラグメントに対する、アンチセンス分子である、方法。
(項16)
項14に記載の方法であって、上記因子が、小干渉RNA分子(siRNA)である、方法。
(項17)
項14に記載の方法であって、上記因子が、リボザイム分子である、方法。
(項18)
項14に記載の方法であって、上記因子が、Gadd45βの結合部位と有効に競合するJNKK2に融合した細胞透過性ペプチドである、方法。
(項19)
項14に記載の方法であって、上記因子が、低分子である、方法。
(項20)
項18に記載の方法であって、上記分子が、Gadd45タンパク質の機能を模倣するペプチド模倣物である、方法。
(項21) 項13に記載の方法であって、上記方法が、
(a)JNKK2上のGadd45結合領域と相互作用することによってJNKシグナル伝達を抑制する分子を得ることによって、上記標的に干渉する工程;および
(b)細胞をこの分子に接触させて、この細胞をプログラム細胞死から保護する工程
を包含する、方法。
(項22) 項21に記載の方法であって、
(a)Gadd45タンパク質の全長または部分をコードするcDNA分子を得る工程;
(b)上記細胞をこのcDNA分子でトランスフェクトする工程;および
(c)この細胞におけるこのcDNAの発現のための条件を提供して、JNKK2を結合させ、JNKK2が、プログラム細胞死を誘導するJNK経路を活性化するために利用不能であるようにする、工程
を包含する、方法。
(項23) 項22に記載の方法であって、上記cDNA分子が、JNKシグナル伝達を抑制するために十分なGadd45タンパク質のフラグメントをコードする、方法。
(項24) 項22に記載の方法であって、上記cDNA分子が、Gadd45βのアミノ酸69〜113に対応するペプチドをコードする、方法。
(項25) 項22に記載の方法であって、上記プログラム細胞死が、TNFαによって誘導される、方法。
(項26) 項22に記載の方法であって、上記プログラム細胞死が、Fasによって誘導される、方法。
(項27) 項22に記載の方法であって、上記プログラム細胞死が、TRAILによって誘導される、方法。
(項28) 項22に記載の方法であって、上記プログラム細胞死が、遺伝子毒性因子によって誘導される、方法。
(項29) 項28に記載の方法であって、上記因子が、ダウノルビシンおよびシスプラチナムからなる群より選択される、方法。
(項30) JNKシグナル伝達を調節する因子を同定するための方法であって、この方法は、
(a)この因子がGadd45βに結合するか否かを決定する工程;および
(b)この結合したGadd45βの活性についてアッセイして、JNKシグナル伝達に対する効果を決定する工程
を包含する、方法。
(項31) JNKK2と相互作用することによってJNK活性化を抑制するために十分な模倣物を得るための方法であって、この方法は、
(a)Gadd45タンパク質の機能を模倣するようにこの模倣物を設計する工程;
(b)この模倣物を、このJNK経路を含む系に接触させる工程;および
(c)JNKシグナル伝達の抑制が存在するか否かを決定する工程
を包含する、方法。
(項32) JNK経路をインビトロで調節する因子をスクリーニングおよび同定するための方法であって、この方法は、
(a)このJNK経路の標的成分を得る工程;
(b)細胞をこの因子に曝露する工程;および
(c)この因子がこのJNK経路を調節する能力を決定する工程
を包含する、方法。
(項33) 項32に記載の因子であって、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプチド様分子、変異体タンパク質、cDNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンス構築物、脂質、糖質、および合成化合物または天然化合物からなる群より選択される、因子。
(項34) JNK活性をインビボで調節する因子をスクリーニングおよび同定するための方法であって、この方法は、
(a)候補因子を得る工程;
(b)この因子を非ヒト動物に投与する工程;および
(c)この動物におけるJNK活性のレベルを、この因子を受けていない動物におけるJNK活性と比較して決定する工程
を包含する、方法。
(項35) Gadd45βがアポトーシスをブロックするのを防ぐ因子を同定するための方法であって、この方法は、
(a)TNFα誘導性アポトーシスに対して保護されている高レベルのGadd45βを発現する細胞を、この因子およびTNFαと接触させる工程;
(b)(a)における細胞におけるアポトーシスを、この因子に曝露されているがTNFαには曝露されていないコントロール細胞と比較する工程;および
(c)コントロール細胞に対する処理細胞におけるアポトーシスの差異から、この因子はGadd45βがアポトーシスをブロックするのを妨げるか否かを推測する工程
を包含する、方法。
(項36) JNK経路の調節因子についてスクリーニングするための方法であって、この方法は、
(a)このJNK経路の候補調節因子を得る工程であって、この候補は、このJNK経路の成分を調節し得る潜在的に任意の因子であり、この因子は、ペプチド、変異体タンパク質、cDNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンス構築物、合成化合物または天然化合物を包含する、工程;
(b)この候補因子を癌細胞に投与する工程;および
(c)このJNK経路のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを含む、この候補物質のこのJNK経路の調節能力を決定し、そしてアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのレベルをアッセイする工程
を包含する、方法。
(項37) 罹患した細胞におけるアポトーシスの影響により引き起こされる変性障害および他の状態を処置する方法であって、この方法は、
(a)JNK経路の活性化に干渉する分子を得る工程;および
(b)この罹患した細胞をこの分子に接触させる工程
を包含する、方法。
(項38) 免疫系が癌細胞を殺傷させるのを、JNKシグナル伝達を増強することによって補助する方法であって、この方法は、
(a)JNKシグナル伝達をブロックするためのインヒビターを得る工程;および
(b)この癌細胞をこのインヒビターに接触させる工程
を包含する、方法。
(項39) 項38に記載の方法であって、上記インヒビターが、Gadd45βによるJNKK2の活性化をブロックする、方法。
(項40) gadd45βプロモーターをトランスアクチベートするための方法であって、この方法は、
(a)gadd45βのプロモーターエレメントにNF−κB複合体を結合する工程;および
(b)gadd45β遺伝子発現についてアッセイする工程
を包含する、方法。
(項41) 癌を処置するための方法であって、この方法は、
(a)Gadd45β機能を阻害することによってJNK活性を増加する工程;および
(b)Gadd45β機能に干渉するインヒビターを投与する工程
を包含する、方法。
(項42) Gadd45タンパク質とJNKK2との間の結合に干渉する因子を決定するための方法であって、この方法は、
(a)Gadd45タンパク質に結合する因子を得る工程;
(b)一過性JNK活性化を誘導する条件下で、細胞をこの因子と接触させる工程;および
(c)この因子と接触された細胞を、この因子に接触されていない細胞と比較して、JNK経路が活性化されるか否かを決定する工程
を包含する、方法。
(項43) gadd45βプロモーターとして機能する、GeneBank登録番号AF441860を有するヌクレオチド配列を有する分子。
(項44) 図8に記載の−447位/−438位(κβ−1)、−426位/−417位(κβ−2)、−377位/−368位(κβ−3)からなる群より選択されるアミノ酸位置にあるプロモーターのエレメントであるヌクレオチド配列を有する、分子。
(項45) 全長Gadd45βタンパク質の60位〜114位由来のアミノ酸配列により特徴付けられるGadd45β領域を含む、分子。
(項1)
プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法であって、この方法は、
アミノ酸配列NH2−TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHを有するペプチドを得る工程、および
このペプチドを使用することによってか、またはこのペプチドのアミノ酸配列の知識から開発した組成物を使用することによって、JNK経路を調節する工程、
を包含する、方法。
(項2)
プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法であって、この方法は、
(a)JNK経路内にある標的を選択する工程、および
(b)このJNK経路をアップレギュレートするかまたはダウンレギュレートするかのいずれかをする因子によって、この標的に干渉する工程、
を包含する、方法。
(項3)
JNK活性をインビボで調節する因子をスクリーニングおよび同定するための方法であって、この方法は、
(a)Gadd45βとは独立してJNKK2と相互作用する候補因子を得る工程;
(b)この因子を、非ヒト動物に投与する工程;および
(c)この動物におけるJNK活性のレベルを、この因子を受けていない動物におけるJNK活性と比較して決定する工程
を包含する、方法。
(項4)
JNK経路の調節因子についてスクリーニングするための方法であって、この方法は、
(a)このJNK経路の候補調節因子を得る工程であって、この候補調節因子は、アミノ酸配列NH2−TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHを有するペプチドに結合し得る、工程;
(b)この候補調節因子を癌細胞に投与する工程;および
(c)このJNK経路のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを含むこの候補調節因子のこのJNK経路調節能力を決定し、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのレベルをアッセイする工程
を包含する、方法。
(項5)
罹患した細胞におけるアポトーシスの影響により引き起こされる変性障害および他の状態を処置する方法であって、この方法は、
(a)Gadd45βとは独立してJNKシグナル伝達の活性化に干渉する分子を得る工程;および
(b)この罹患した細胞にこの分子を接触させる工程
を包含する、方法。
(項6)
免疫系が癌細胞を殺傷させるのを、JNKシグナル伝達を増強することによって補助する方法であって、この方法は、
(a)Gadd45βとは独立してJNKシグナル伝達をブロックするインヒビターを得る工程;および
(b)この癌細胞をこのインヒビターに接触させる工程
を包含する、方法。
(項7)
項5に記載の方法であって、上記分子が、Gadd45βとは独立してJNNK2の活性化に干渉する、方法。
(項8)
JNKK2相互作用因子を同定する方法であって、この方法は、
(a)アミノ酸配列TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMDを含むペプチドをベイトとして提供する工程;および
(b)このペプチドと相互作用する因子を同定する工程
を包含する、方法。
(項9)
全長JNKK2の142位〜166位(TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD)に結合し得る分子へのJNKK2の結合に干渉する因子を決定するための方法であって、この方法は、
(a)全長JNKK2の142位〜166位(TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD)へのこの分子の結合に干渉する因子を得る工程;
(b)一過性JNK活性化を誘導する条件下で、細胞をこの因子に接触させる工程;および
(c)この因子に接触した細胞をこの因子に接触しなかった細胞と比較して、JNK経路が活性化されているか否かを決定する工程
を包含する、方法。
(項10)
全長JNKK2の132位〜156位(GPVWKMRFRKTGHVIAVKQMRRSGN)由来のアミノ酸配列により特徴付けられるJNKK2の結合領域を含む分子。
(項11)
全長JNKK2の220位〜234位(GKMTVAIVKALYYLK)由来のアミノ酸配列により特徴付けられるJNKK2の結合領域を含む分子。
(項12)
全長JNKK2の142位〜166位(TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD)由来のアミノ酸配列により特徴付けられるJNKK2の結合領域を含む分子。
(項13)
プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法であって、この方法は、
(a)JNK経路内にある標的を選択する工程;および
(b)このJNK経路をアップレギュレートするかまたはダウンレギュレートするかのいずれかをする因子によって、この標的に干渉する工程
を包含する、方法。
(項14)
項13に記載の方法であって、この方法は、
(a)Gadd45タンパク質によるJNK活性化の抑制をブロックするために十分な因子を得る工程;および
(b)上記細胞をこの因子と接触させて、プログラム細胞死を経験する細胞の割合を増加させる工程
を包含する、方法。
(項15)
項14に記載の方法であって、上記因子が、gadd45β遺伝子配列またはそのフラグメントに対する、アンチセンス分子である、方法。
(項16)
項14に記載の方法であって、上記因子が、小干渉RNA分子(siRNA)である、方法。
(項17)
項14に記載の方法であって、上記因子が、リボザイム分子である、方法。
(項18)
項14に記載の方法であって、上記因子が、Gadd45βの結合部位と有効に競合するJNKK2に融合した細胞透過性ペプチドである、方法。
(項19)
項14に記載の方法であって、上記因子が、低分子である、方法。
(項20)
項18に記載の方法であって、上記分子が、Gadd45タンパク質の機能を模倣するペプチド模倣物である、方法。
(項21) 項13に記載の方法であって、上記方法が、
(a)JNKK2上のGadd45結合領域と相互作用することによってJNKシグナル伝達を抑制する分子を得ることによって、上記標的に干渉する工程;および
(b)細胞をこの分子に接触させて、この細胞をプログラム細胞死から保護する工程
を包含する、方法。
(項22) 項21に記載の方法であって、
(a)Gadd45タンパク質の全長または部分をコードするcDNA分子を得る工程;
(b)上記細胞をこのcDNA分子でトランスフェクトする工程;および
(c)この細胞におけるこのcDNAの発現のための条件を提供して、JNKK2を結合させ、JNKK2が、プログラム細胞死を誘導するJNK経路を活性化するために利用不能であるようにする、工程
を包含する、方法。
(項23) 項22に記載の方法であって、上記cDNA分子が、JNKシグナル伝達を抑制するために十分なGadd45タンパク質のフラグメントをコードする、方法。
(項24) 項22に記載の方法であって、上記cDNA分子が、Gadd45βのアミノ酸69〜113に対応するペプチドをコードする、方法。
(項25) 項22に記載の方法であって、上記プログラム細胞死が、TNFαによって誘導される、方法。
(項26) 項22に記載の方法であって、上記プログラム細胞死が、Fasによって誘導される、方法。
(項27) 項22に記載の方法であって、上記プログラム細胞死が、TRAILによって誘導される、方法。
(項28) 項22に記載の方法であって、上記プログラム細胞死が、遺伝子毒性因子によって誘導される、方法。
(項29) 項28に記載の方法であって、上記因子が、ダウノルビシンおよびシスプラチナムからなる群より選択される、方法。
(項30) JNKシグナル伝達を調節する因子を同定するための方法であって、この方法は、
(a)この因子がGadd45βに結合するか否かを決定する工程;および
(b)この結合したGadd45βの活性についてアッセイして、JNKシグナル伝達に対する効果を決定する工程
を包含する、方法。
(項31) JNKK2と相互作用することによってJNK活性化を抑制するために十分な模倣物を得るための方法であって、この方法は、
(a)Gadd45タンパク質の機能を模倣するようにこの模倣物を設計する工程;
(b)この模倣物を、このJNK経路を含む系に接触させる工程;および
(c)JNKシグナル伝達の抑制が存在するか否かを決定する工程
を包含する、方法。
(項32) JNK経路をインビトロで調節する因子をスクリーニングおよび同定するための方法であって、この方法は、
(a)このJNK経路の標的成分を得る工程;
(b)細胞をこの因子に曝露する工程;および
(c)この因子がこのJNK経路を調節する能力を決定する工程
を包含する、方法。
(項33) 項32に記載の因子であって、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプチド様分子、変異体タンパク質、cDNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンス構築物、脂質、糖質、および合成化合物または天然化合物からなる群より選択される、因子。
(項34) JNK活性をインビボで調節する因子をスクリーニングおよび同定するための方法であって、この方法は、
(a)候補因子を得る工程;
(b)この因子を非ヒト動物に投与する工程;および
(c)この動物におけるJNK活性のレベルを、この因子を受けていない動物におけるJNK活性と比較して決定する工程
を包含する、方法。
(項35) Gadd45βがアポトーシスをブロックするのを防ぐ因子を同定するための方法であって、この方法は、
(a)TNFα誘導性アポトーシスに対して保護されている高レベルのGadd45βを発現する細胞を、この因子およびTNFαと接触させる工程;
(b)(a)における細胞におけるアポトーシスを、この因子に曝露されているがTNFαには曝露されていないコントロール細胞と比較する工程;および
(c)コントロール細胞に対する処理細胞におけるアポトーシスの差異から、この因子はGadd45βがアポトーシスをブロックするのを妨げるか否かを推測する工程
を包含する、方法。
(項36) JNK経路の調節因子についてスクリーニングするための方法であって、この方法は、
(a)このJNK経路の候補調節因子を得る工程であって、この候補は、このJNK経路の成分を調節し得る潜在的に任意の因子であり、この因子は、ペプチド、変異体タンパク質、cDNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンス構築物、合成化合物または天然化合物を包含する、工程;
(b)この候補因子を癌細胞に投与する工程;および
(c)このJNK経路のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを含む、この候補物質のこのJNK経路の調節能力を決定し、そしてアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのレベルをアッセイする工程
を包含する、方法。
(項37) 罹患した細胞におけるアポトーシスの影響により引き起こされる変性障害および他の状態を処置する方法であって、この方法は、
(a)JNK経路の活性化に干渉する分子を得る工程;および
(b)この罹患した細胞をこの分子に接触させる工程
を包含する、方法。
(項38) 免疫系が癌細胞を殺傷させるのを、JNKシグナル伝達を増強することによって補助する方法であって、この方法は、
(a)JNKシグナル伝達をブロックするためのインヒビターを得る工程;および
(b)この癌細胞をこのインヒビターに接触させる工程
を包含する、方法。
(項39) 項38に記載の方法であって、上記インヒビターが、Gadd45βによるJNKK2の活性化をブロックする、方法。
(項40) gadd45βプロモーターをトランスアクチベートするための方法であって、この方法は、
(a)gadd45βのプロモーターエレメントにNF−κB複合体を結合する工程;および
(b)gadd45β遺伝子発現についてアッセイする工程
を包含する、方法。
(項41) 癌を処置するための方法であって、この方法は、
(a)Gadd45β機能を阻害することによってJNK活性を増加する工程;および
(b)Gadd45β機能に干渉するインヒビターを投与する工程
を包含する、方法。
(項42) Gadd45タンパク質とJNKK2との間の結合に干渉する因子を決定するための方法であって、この方法は、
(a)Gadd45タンパク質に結合する因子を得る工程;
(b)一過性JNK活性化を誘導する条件下で、細胞をこの因子と接触させる工程;および
(c)この因子と接触された細胞を、この因子に接触されていない細胞と比較して、JNK経路が活性化されるか否かを決定する工程
を包含する、方法。
(項43) gadd45βプロモーターとして機能する、GeneBank登録番号AF441860を有するヌクレオチド配列を有する分子。
(項44) 図8に記載の−447位/−438位(κβ−1)、−426位/−417位(κβ−2)、−377位/−368位(κβ−3)からなる群より選択されるアミノ酸位置にあるプロモーターのエレメントであるヌクレオチド配列を有する、分子。
(項45) 全長Gadd45βタンパク質の60位〜114位由来のアミノ酸配列により特徴付けられるGadd45β領域を含む、分子。
プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法および組成物を提供する。
(詳細な説明)
JNK経路は、プログラム細胞死にいたる経路の制御の中心である。
JNK経路は、プログラム細胞死にいたる経路の制御の中心である。
本発明は、疾患を改善するための新規の方法および組成物の開発を促進する。実際に、JNKの抑制がNF−κBによる保護機構を表すという観察は、炎症部位(ここでは、高レベルのTNFαが存在する)における不必要な自己反応性リンパ球および他の炎症誘導性細胞(例えば、マクロファージ)のアポトーシスが、NF−κBがJNKの活性化を停止する能力を妨害することによって増大し得るということを示唆する。この妨害を達成するための強力な手段としては、例えば、Gadd45βのブロッカーおよびJNKK2相互作用因子を妨害する因子の使用が挙げられる。1つのこのような因子は、ペプチドNH2−TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHである。
Fasと同様に、TNF−R1もまた、宿主免疫監視機構に関与する。従って、本発明の別の局面において、これらの因子は、癌治療における強力な新規のアジュバントを提供し得る。
逆に、JNKのダウンレギュレーションによる細胞生存の増大は、変性障害および免疫不全、ならびに増大した細胞死によって一般的に特徴付けられる状態において有益な効果を有する。
本発明は、JNK経路を調節する因子(例えば、JNKK2(これは、Gadd45βと直接接触する)のアミノ酸領域を含む細胞透過性融合ペプチド(例えば、TAT融合ペプチド))の設計を可能にする。これらのペプチドは、JNKK2への結合について、内在性Gadd45βタンパク質と効率的に競合する。さらに、これらの知見は、低分子のライブラリーのスクリーニング、およびGadd45βがJNKK2と会合する能力を妨害し得る化合物の同定のための生化学的アッセイの設計を可能にする。これらのペプチドとこれらの低分子の両方が、このGadd45βの能力を妨害し、それによりNF−κBがJNKの活性化を停止し、最終的にはアポトーシスをブロックする能力を妨害し得ることが予測される。これらの化合物は、ヒトの疾患(慢性炎症および自己免疫状態、ならびに特定のタイプの癌が挙げられる)の処置において有用である。
NF−κBの抗アポトーシス活性を調節するための新規の分子標的は、特定のヒト疾患の処置において有用である。これらの知見の適用は、以下の2つの広く規定されたクラスのヒト病理の処置に関連するようである:a)免疫学的障害(例えば、自己免疫状態および慢性炎症状態、ならびに免疫不全);b)特定の悪性腫瘍、特に、それらの生存についてNF−κBに依存する悪性腫瘍(例えば、乳癌、HL、多発性骨髄腫およびDLBCL)。
問題は、JNKがTNF−R誘導性アポトーシスにおいて役割を果たすか否かということであった。NF−κB欠損細胞における知見を確認すると、本明細書中に示された証拠は、終局的に、JNKの活性化が、ストレス誘導性アポトーシスにのみ必須なのではなく、TNFαによる有効な殺傷にも必須であることを証明した。ASK1(JNK(およびp38)へシグナル伝達するTNF−R経路の必須成分)を欠く線維芽細胞は、TNFαによる殺傷に対して耐性であることが示された。さらに、JNK1およびJNK2の二重ノックアウトMEFは、絶対的ではないにも関わらず、TNFαおよびシクロへキシミドを用いる併用細胞傷害性処置に対するアポトーシス応答の著しい欠損を示す。さらに、DrosophilaのTNFαホモログであるEigerが、死を引き起こすのにJNKに完全に依存し、一方で、このEigerが、カスパーゼ−8ホモログのDREDDを必要としないことが示された。従って、JNKへの結合は、TNFαにより保証される原始アポトーシス機構の痕跡のようであり、これは、進化の後半にのみ、FADD依存性経路を利用して、カスパーゼを活性化し始めた。
DN−MEKK1を用いた初期の観察は、これらのより最近の知見とどのように調和され得るのであろうか?おそらく、鍵は、TNF−RによるJNK誘導の動態学にある。実際に、アポトーシスは、持続性であるが一過性ではないJNK活性と関連している。この見解は、JNKの活性化が、それ自体でアポトーシス原性(apoptogenic)であるという最近の発見により支持され、このことは、外因性細胞刺激の非存在下において、構成的に活性なJNKを生じるMKK7−JNK融合タンパク質の使用によって簡潔に証明されている。UVおよび他の形態のストレスと異なり、TNFαは、JNKの一過的な誘導しか引き起こさず、そして実際に、この誘導は、通常、有意な細胞死を伴うことなく生じ、このことは、DN−MEKK1変異体によるJNKの阻害が細胞生存に対して影響を有さない理由を説明する。その代わり、JNKのアポトーシス促進活性は、キナーゼが、例えば、NF−κBの阻害によって、慢性的にシグナル伝達し得る場合に現れる。
JNKがアポトーシスを促進する正確な機構は、知られていない。いくつかの場合において、JNK媒介性殺傷は、ストレスまたはTNFαのチャレンジの間に遺伝子発現の調節に関与するが、JNKアポトーシス促進シグナル伝達の標的は、すでに細胞中に存在するようである。MKK7−JNKタンパク質による殺傷は、Bcl−2群のBax様因子を必要とすることが示された;しかしながら、これらの因子が、JNKの直接標的であるのか、またはこれらがTNF−Rシグナル伝達の間のJNK細胞傷害性を媒介するのかは明らかではない。
(I.JNKカスケードの活性化は、DR(TNF−R1、FasおよびTRAIL−R)による効率的な殺傷に必要であり、このカスケードの抑制は、NF−κBの保護活性に重要である)
(A.TNF−R誘導性アポトーシス)
JNK経路およびNF−κB経路(サイトカインおよびストレスによって大抵常に同時活性化される)は、親密に関連している。NF−κBサブユニットRelAの除去またはIκBαMスーパーインヒビターの発現のいずれかによるNF−κB活性化のブロックは、TNF−RによるJNK誘導の正常な停止を妨害する(図5Aおよび5B)。実際、種々の手段によるJNKシグナル伝達の阻害が、TNFα誘導性アポトーシスからNF−κB欠損細胞をレスキューするという知見によって示されるように、NF−κBによるJNKカスケードの下方制御は、TNFα誘導性アポトーシスの抑制に必要である(図5Dおよび5E)。NF−κBを欠く細胞において、JNKの活性化は、カスパーゼインヒビターでの保護的処置の後でさえ、持続したままであり、このことは、JNK経路に対するNF−κBの効果が、カスパーゼ阻害の二次的結果ではないことを示している。従って、NF−κB複合体は、JNK活性化の真のブロッカーである。これらの知見は、NF−κBによる新規の保護機構を規定し、そしてTNFαに対するアポトーシス応答における、JNK(p38でもERKでもなく)に重要な役割を確立する(図18を参照のこと)。
(A.TNF−R誘導性アポトーシス)
JNK経路およびNF−κB経路(サイトカインおよびストレスによって大抵常に同時活性化される)は、親密に関連している。NF−κBサブユニットRelAの除去またはIκBαMスーパーインヒビターの発現のいずれかによるNF−κB活性化のブロックは、TNF−RによるJNK誘導の正常な停止を妨害する(図5Aおよび5B)。実際、種々の手段によるJNKシグナル伝達の阻害が、TNFα誘導性アポトーシスからNF−κB欠損細胞をレスキューするという知見によって示されるように、NF−κBによるJNKカスケードの下方制御は、TNFα誘導性アポトーシスの抑制に必要である(図5Dおよび5E)。NF−κBを欠く細胞において、JNKの活性化は、カスパーゼインヒビターでの保護的処置の後でさえ、持続したままであり、このことは、JNK経路に対するNF−κBの効果が、カスパーゼ阻害の二次的結果ではないことを示している。従って、NF−κB複合体は、JNK活性化の真のブロッカーである。これらの知見は、NF−κBによる新規の保護機構を規定し、そしてTNFαに対するアポトーシス応答における、JNK(p38でもERKでもなく)に重要な役割を確立する(図18を参照のこと)。
(B.Fas誘導性アポトーシス)
ASK1−/−およびJNKヌル線維芽細胞は、TNFαの細胞傷害性効果に対して保護されるが、これらの細胞は、Fas誘導性アポトーシスに対して正常な感受性を保持しており、このことが、FasおよびTNF−Rにより引き起こされるアポトーシス機構の間の基本的な差異を強調する。それにもかかわらず、特定の細胞(例えば、B細胞リンパ腫)において、JNKはまた、Fas誘発に対するアポトーシス応答に関与する。実際、種々の手段(特定の薬理学的ブロッカーSP600125を含む)によるJNKの抑制は、BJAB細胞をFas誘導性細胞傷害性から救う(図14)。この観察と一致して、これらの細胞において、Fasによる殺傷はまた、Gadd45βの過剰発現によってほとんど完全にブロックされる(図13B)。共に、これらの知見は、JNKが、いくつかの場合(例えば、カスパーゼを活性化して死を引き起こすために、アポトーシスシグナルのミトコンドリア増幅を必要とする2型細胞(例えば、BJAB細胞))において、Fas誘導性アポトーシスに必要であることを示す。
ASK1−/−およびJNKヌル線維芽細胞は、TNFαの細胞傷害性効果に対して保護されるが、これらの細胞は、Fas誘導性アポトーシスに対して正常な感受性を保持しており、このことが、FasおよびTNF−Rにより引き起こされるアポトーシス機構の間の基本的な差異を強調する。それにもかかわらず、特定の細胞(例えば、B細胞リンパ腫)において、JNKはまた、Fas誘発に対するアポトーシス応答に関与する。実際、種々の手段(特定の薬理学的ブロッカーSP600125を含む)によるJNKの抑制は、BJAB細胞をFas誘導性細胞傷害性から救う(図14)。この観察と一致して、これらの細胞において、Fasによる殺傷はまた、Gadd45βの過剰発現によってほとんど完全にブロックされる(図13B)。共に、これらの知見は、JNKが、いくつかの場合(例えば、カスパーゼを活性化して死を引き起こすために、アポトーシスシグナルのミトコンドリア増幅を必要とする2型細胞(例えば、BJAB細胞))において、Fas誘導性アポトーシスに必要であることを示す。
TNF−Rと同様に、Fasは、癌細胞に対する宿主免疫監視機構において重要な役割を果たす。興味深いことに、構成的に高いNF−κB活性の存在に起因して、特定の腫瘍細胞は、これらの免疫監視機構を逃れ得る。従って、JNKシグナル伝達の増強(Gadd45β、またはより広範には、NF−κBのJNK阻害活性をブロックすることによって達成される)は、免疫系が腫瘍細胞を効率的に処理するのを助ける。
Fasはまた、リンパ球ホメオスタシスにとって重要である。実際に、このレセプターまたはそのリガンドであるFasLにおける変異は、自己反応性リンパ球の排除を妨害し、自己免疫疾患の発症を生じる。従って、特定の自己免疫障害の処置について、JNKに対するGadd45βの阻害活性は、適切な標的として働き得る。
(C.TRAIL−R誘導性アポトーシス)
Gadd45βはまた、アポトーシスに関与するTRAIL−Rをブロックし(図1A)、このことは、JNKが、このDRの誘発に対するアポトーシス応答において重要な役割を果たすことを示唆する。JNKがDRによるアポトーシスに必要であるという知見は、癌治療に利用され得る。例えば、アジュバント処置によるTRAIL誘導性殺傷に対する癌細胞の感受性は、JNK活性化をアップレギュレートする因子を用いて増大される。このことは、Gadd45βまたはNF−κBがTRAIL誘導性JNK活性化をブロックする能力を妨害することによって達成され得る。この知見はまた、併用抗癌処置の相乗効果についての機構を提供し得る。なぜなら、遺伝子毒性化学治療薬によるJNKの活性化は、DR誘導性殺傷の閾値を低下させ得るからである。
Gadd45βはまた、アポトーシスに関与するTRAIL−Rをブロックし(図1A)、このことは、JNKが、このDRの誘発に対するアポトーシス応答において重要な役割を果たすことを示唆する。JNKがDRによるアポトーシスに必要であるという知見は、癌治療に利用され得る。例えば、アジュバント処置によるTRAIL誘導性殺傷に対する癌細胞の感受性は、JNK活性化をアップレギュレートする因子を用いて増大される。このことは、Gadd45βまたはNF−κBがTRAIL誘導性JNK活性化をブロックする能力を妨害することによって達成され得る。この知見はまた、併用抗癌処置の相乗効果についての機構を提供し得る。なぜなら、遺伝子毒性化学治療薬によるJNKの活性化は、DR誘導性殺傷の閾値を低下させ得るからである。
(II.JNKの抑制は、NF−κBが腫瘍形成および癌化学療法抵抗性を促進する機構を示す)
DR誘導性殺傷の拮抗に加えて、NF−κBの保護活性は、腫瘍形成、ならびに癌における化学療法抵抗性および放射線療法抵抗性に重要である。しかし、この保護活性の基礎は、あまり理解されていない。JNKカスケードの標的化は、NF−κBによる一般的な抗アポトーシス機構を示すことが可能であり、実際に、NF−κBによるこの標的化の関連性が、腫瘍形成および抗癌治療に対する腫瘍細胞の抵抗性の両方におよぶという証拠がある。悪性転換の間、癌細胞は、癌遺伝子により誘導されるJNK媒介性アポトーシスを抑制する機構を採用するはずであり、少なくともいくつかの場合において、このアポトーシス性JNKシグナル伝達の抑制は、NF−κBに関与し得る。実際に、NF−κBの活性化は、転換関連アポトーシスをブロックために必要であるが、MKK4およびBRCA1のようなJNKカスケードの非重複成分は、腫瘍サプレッサとして同定されている。
DR誘導性殺傷の拮抗に加えて、NF−κBの保護活性は、腫瘍形成、ならびに癌における化学療法抵抗性および放射線療法抵抗性に重要である。しかし、この保護活性の基礎は、あまり理解されていない。JNKカスケードの標的化は、NF−κBによる一般的な抗アポトーシス機構を示すことが可能であり、実際に、NF−κBによるこの標的化の関連性が、腫瘍形成および抗癌治療に対する腫瘍細胞の抵抗性の両方におよぶという証拠がある。悪性転換の間、癌細胞は、癌遺伝子により誘導されるJNK媒介性アポトーシスを抑制する機構を採用するはずであり、少なくともいくつかの場合において、このアポトーシス性JNKシグナル伝達の抑制は、NF−κBに関与し得る。実際に、NF−κBの活性化は、転換関連アポトーシスをブロックために必要であるが、MKK4およびBRCA1のようなJNKカスケードの非重複成分は、腫瘍サプレッサとして同定されている。
NF−κB依存性腫瘍形成の十分に特徴付けされたモデル系(例えば、乳癌細胞を含む)は、作用機構の識見を提供する。乳癌細胞株(例えば、MDA−MD−231およびBT−20(これらは、その生存のためにNF−κBに依存することが知られている))は、JNKブロッカーSP600125での保護的処置によって、NF−κB阻害によって引き起こされるアポトーシスから救われ得る(図17)。従って、これらの腫瘍細胞において、JNKの除去は、NF−κBについての要件を克服し得、このことは、NF−κB不活性化による細胞傷害性が、JNK経路の過剰活性化に関連し、そして腫瘍抑制におけるこの経路の役割を示すことを示唆する。Gadd45βは、腫瘍形成および癌化学両方抵抗性の間のNF−κBの保護効果を媒介し、抗癌治療のための新規の標的である。
癌における化学療法抵抗性に関して、遺伝毒性ストレスによるアポトーシス(特定の抗癌剤(例えば、ダウノルビシン、エトポシド(etopopside)、およびシスプラチン)の所望の効果)は、JNKの活性化を必要とする一方で、これは、NF−κBによって拮抗される。従って、JNKの阻害は、NF−κBが腫瘍の化学療法抵抗性を促進する機構である。実際、NF−κBのブロッカーは、癌患者(例えば、HLを有する患者)を処置するために慣用的に使用され、そして他の困難な悪性腫瘍(例えば、多発性骨髄腫)を処置するために首尾良く使用されている。しかし、これらのブロッカー(例えば、グルココルチコイドおよびプロテオソームインヒビター)は、NF−κBの部分的な阻害しか達成し得ず、そして慢性的に使用された場合、ヒトにおけるその使用を制限するかなりの副作用(免疫抑制効果を含む)を示す。従って、DRと共に議論される場合、特定の悪性腫瘍の処置において、NF−κB標的化因子ではなく、NF−κBの抗アポトーシス活性のブロックを目標とする治療因子を用いることが有益である。例えば、癌治療における非常に有効なアプローチは、NF−κBがJNKの活性化を抑制する能力を特異的に妨害する薬理学的化合物の使用であり得る。これらの化合物は、腫瘍細胞のJNK媒介性殺傷を促進するだけでなく、転写因子の抗アポトーシス機能および炎症誘発機能の脱共役を可能にする。従って、NF−κBの全ブロッカーと異なり、このような化合物は、免疫抑制効果を有さず、それにより、癌治療における有望な新規の手段を示す。適切な治療標的は、Gadd45β自体である。なぜなら、この因子は、化学療法剤によるアポトーシスを阻害し得(図3Dおよび3E)、これらの薬物によるその誘導が、NF−κBに依存する(図2D)からである。これについて、Gadd45βおよびNF−κBがJNKカスケードをブロックする正確な機構の同定(すなわち、JNKK2の試験)は、特定のタイプの癌、特に、NF−κBに依存する癌(癌形成Ras、Bcr−Ab1またはEBVがコードする癌遺伝子によって駆動される腫瘍、および後期腫瘍(例えば、HL、DLBCL、多発性骨髄腫および乳癌)を含む)における治療的介入のための新たな手段を開拓する。
(III.Gadd45βは、NF−κBによるJNKカスケードの阻害を媒介する)
(A.Gadd45βは、DR誘導性アポトーシスに対するNF−κBの保護効果を媒介する)
NF−κBによる細胞保護作用は、遺伝子発現のプログラムの活性化を含む。NF−κBのこの重要な機能を媒介する生存促進(pro−survival)遺伝子を単離した。癌についての分子基礎のより良い理解を得ることに加え、これらの遺伝子の同定は癌治療のための新規標的を提供する。NF−κB/RelAヌル細胞の機能的スクリーニングを使用して、TNF−α誘導性殺傷に対するNF−κBの保護活性の中心的メディエーターとして、Gadd45βを同定した。gadd45βは、NF−κBを必要とするメカニズムを通して、サイトカインにより迅速にアップレギュレートされ(図2Aおよび図2B)、TNF−α誘導性殺傷に拮抗するのに必須であり(図1F)、そしてNF−κBヌル細胞におけるアポトーシスをブロックする(図1A、図1C、図1D、図3Aおよび図3B)。Gadd45βによる細胞保護作用は、JNK経路の阻害を含み(図4A、図4Cおよび図4D)、そしてこの阻害はNF−κBによるアポトーシスの制御に対して中心的である(図5A、図5B、図5Dおよび図5E)。NF−κBを欠失した細胞中でのGadd45βの発現は、TNFαに応答するJNK活性化を完全に抑止し、そしてアンチセンスgadd45βによる内因性タンパク質の阻害は、この応答の終結を妨げる(図4D)。Gadd45βはまた、TNFαによるJNK誘導の、カスパーゼに非依存的な局面を抑制し、従って、JNKカスケードの真なるインヒビターである(図4Aおよび図4C)。JNKシグナル伝達のさらなるNF−κB誘導性ブロッカーが存在し得る。
(A.Gadd45βは、DR誘導性アポトーシスに対するNF−κBの保護効果を媒介する)
NF−κBによる細胞保護作用は、遺伝子発現のプログラムの活性化を含む。NF−κBのこの重要な機能を媒介する生存促進(pro−survival)遺伝子を単離した。癌についての分子基礎のより良い理解を得ることに加え、これらの遺伝子の同定は癌治療のための新規標的を提供する。NF−κB/RelAヌル細胞の機能的スクリーニングを使用して、TNF−α誘導性殺傷に対するNF−κBの保護活性の中心的メディエーターとして、Gadd45βを同定した。gadd45βは、NF−κBを必要とするメカニズムを通して、サイトカインにより迅速にアップレギュレートされ(図2Aおよび図2B)、TNF−α誘導性殺傷に拮抗するのに必須であり(図1F)、そしてNF−κBヌル細胞におけるアポトーシスをブロックする(図1A、図1C、図1D、図3Aおよび図3B)。Gadd45βによる細胞保護作用は、JNK経路の阻害を含み(図4A、図4Cおよび図4D)、そしてこの阻害はNF−κBによるアポトーシスの制御に対して中心的である(図5A、図5B、図5Dおよび図5E)。NF−κBを欠失した細胞中でのGadd45βの発現は、TNFαに応答するJNK活性化を完全に抑止し、そしてアンチセンスgadd45βによる内因性タンパク質の阻害は、この応答の終結を妨げる(図4D)。Gadd45βはまた、TNFαによるJNK誘導の、カスパーゼに非依存的な局面を抑制し、従って、JNKカスケードの真なるインヒビターである(図4Aおよび図4C)。JNKシグナル伝達のさらなるNF−κB誘導性ブロッカーが存在し得る。
NF−κBによるgadd45βの活性化は、gadd45βプロモーターの位置−447/−438(κB−1)、位置−426/−417(κB−2)および位置−377/−368(κB−3)に位置する、3つの保存されたκBエレメントの機能であることが、示された(図8、図9A、図9B、図10A、図10Bおよび図11)。これらの部位の各々は、インビトロでNF−κB複合体に結合し、そして最適なプロモーターのトランス活性化のために必要とされる(図12A、図12B、および図12C)。併せると、これらのデータは、Gadd45βが新規抗アポトーシス因子であること、JNK活性化の生理学的インヒビターであること、そしてNF−κBの直接の転写の標的であることを、確立する。従って、Gadd45βは、JNKカスケードの標的化、およびNF−κBによる細胞保護作用の標的化を媒介する。
Gadd45βの保護活性は、TNF−R以外のDR(FasおよびTRAIL−Rを含む)へと広がる。Gadd45βの発現は、これらのDRのいずれか1つの誘発により誘導されるアポトーシスから、BJAB細胞を劇的に保護し、一方、コントロール細胞における死滅を効率的に誘導した(それぞれ、図13Bおよび13A)。注目すべきことに、Fasの場合において、Gadd45βによる保護は、ほぼ完全であった。TNF−R1と同様に、Fasによる殺傷に対するGadd45βの保護活性、およびおそらくはTRAIL−Rによる殺傷に対するGadd45βの保護活性は、JNKカスケードの阻害を含むようである(図13A、図13Bおよび図14)。従って、Gadd45βは、種々のヒトの障害において、DR誘導性アポトーシスを調節するための新規ターゲットである。
(B.Gadd45βは、腫瘍形成および癌の化学耐性(chemoresistance)の間の、NF−κBの保護活性の潜在的エフェクターである)
腫瘍形成および癌の化学耐性の間に、NF−κBにより活性化される保護遺伝子は、未知である。Gadd45βはJNK阻害およびNF−κBによる細胞保護を媒介するので、Gadd45βは1つの候補である。実際、DR誘導性アポトーシスのコントロールを用いる場合、gadd45βの誘導は、NF−κBが癌細胞の生存を促進する手段を提供する。3DO腫瘍細胞において、Gadd45βの発現は、シスプラチンおよびダウノルビシン(抗癌治療で広範に使用される2つの遺伝毒性薬物)による殺傷に拮抗した(図3Dおよび図3E)。従って、Gadd45βは、DR、および哺乳動物細胞において見出されるカスパーゼ活性化の内在性経路の両方を、ブロックする。遺伝毒性薬剤によるアポトーシスはJNKを必要とするので、Gadd45βの後者の保護活性はまた、JNKカスケードの阻害により説明され得る。3DO細胞において、gadd45βの発現は、ダウノルビシンまたはシスプラチンのいずれかの処理により強力に誘導され、そしてこの誘導は、IκBαMスーパーレプレッサーにより、ほぼ完全に排除された(図2D)。このことは、これらの薬物によるgadd45βの活性化が、NF−κBに依存することを示す。従って、Gadd45βは、抗腫瘍治療の効力をブロックし得、このことは、Gadd45βが癌患者におけるNF−κB依存性化学耐性に寄与すること、およびGadd45βが新規の治療標的を示すことを示唆する。
腫瘍形成および癌の化学耐性の間に、NF−κBにより活性化される保護遺伝子は、未知である。Gadd45βはJNK阻害およびNF−κBによる細胞保護を媒介するので、Gadd45βは1つの候補である。実際、DR誘導性アポトーシスのコントロールを用いる場合、gadd45βの誘導は、NF−κBが癌細胞の生存を促進する手段を提供する。3DO腫瘍細胞において、Gadd45βの発現は、シスプラチンおよびダウノルビシン(抗癌治療で広範に使用される2つの遺伝毒性薬物)による殺傷に拮抗した(図3Dおよび図3E)。従って、Gadd45βは、DR、および哺乳動物細胞において見出されるカスパーゼ活性化の内在性経路の両方を、ブロックする。遺伝毒性薬剤によるアポトーシスはJNKを必要とするので、Gadd45βの後者の保護活性はまた、JNKカスケードの阻害により説明され得る。3DO細胞において、gadd45βの発現は、ダウノルビシンまたはシスプラチンのいずれかの処理により強力に誘導され、そしてこの誘導は、IκBαMスーパーレプレッサーにより、ほぼ完全に排除された(図2D)。このことは、これらの薬物によるgadd45βの活性化が、NF−κBに依存することを示す。従って、Gadd45βは、抗腫瘍治療の効力をブロックし得、このことは、Gadd45βが癌患者におけるNF−κB依存性化学耐性に寄与すること、およびGadd45βが新規の治療標的を示すことを示唆する。
腫瘍抑制におけるJNKの役割、およびJNK活性化をブロックするGadd45βの能力が示されると、Gadd45βはまた、腫瘍形成においてNF−κBの機能を媒介する1つの候補である。実際、発現パターンは、Gadd45βが、特定の後期の腫瘍(ER乳癌およびHL細胞を含む)において、NF−κB依存性生存に寄与し得ることを示唆する。癌細胞において、gadd45βは、構築的に高いレベルで発現されるが、より浸襲性でないER+乳癌のようなコントロール細胞においてはそうでなく(図16)、そしてこれらのレベルは、NF−κB活性と相関がある。
(C.Gadd45βがJNK活性化をブロックするメカニズムの同定:JNKK2/MKK7の標的化)
Gadd45βもNF−κBもいずれも、ERKカスケードにもp38カスケードにも影響しない(図4C)。このことは、これらの因子がMAPKKKモジュールの下流のJNKシグナル伝達をブロックすることを示唆する。この注目と一致して、MAPKK、JNKK2/MKK7(JNKの特異的アクチベーターかつJNK活性化のTNF−R経路の必須成分)を、JNKカスケードにおけるGadd45βの分子標的として同定した。
Gadd45βもNF−κBもいずれも、ERKカスケードにもp38カスケードにも影響しない(図4C)。このことは、これらの因子がMAPKKKモジュールの下流のJNKシグナル伝達をブロックすることを示唆する。この注目と一致して、MAPKK、JNKK2/MKK7(JNKの特異的アクチベーターかつJNK活性化のTNF−R経路の必須成分)を、JNKカスケードにおけるGadd45βの分子標的として同定した。
Gadd45βは、これまでに、MEKK4と会合することが示された。しかし、このMAPKKKはDRによっては活性化されなかったので、この相互作用の機能的結果は、それ以上は試験されなかった。従って、Gadd45βがTNF−RによるJNK誘導を制御するメカニズムを調査するのを開始するために、TNF−Rによって誘導されることが報告されている、MAPKKK、MAPKKおよびMAPKについて焦点を当て、さらなるキナーゼと物理的に相互作用する能力について、Gadd45βを試験した。免疫共沈アッセイにより、Gadd45βがMEKK4に結合する能力が、確認された(図19)。これらのアッセイはまた、Gadd45βがASK1と会合し得るが、他のTRAF2相互作用性MAPKKK(例えば、MEKK1、GCKおよびGCKR)とも、試験したさらなるMAPKKK(例えば、MEKK3)とも会合し得ないことを示した(図19)。注目すべきことに、Gadd45βはまた、JNKK2/MKK7と相互作用したが、他のJNKキナーゼとも、JNKK1/MEKK4とも、試験した他のMAPKKおよびMAPKのいずれ(2つのp38特異的アクチベーターMKK3bおよびMKK6、ならびにERKキナーゼMEK1を含む)とも、相互作用しなかった(図19)。インビトロにおけるGSTプルダウン実験により、Gadd45βとJNKK2との間の強力かつ直接的相互作用、およびASK1とのずっと弱い相互作用を、確認した(図20)。これらはまた、Gadd45βとJNKK1との非常に弱い会合を明らかにした(図20)。
Gadd45βは、JNKK2活性の強力なインヒビターである。このことは、組換えGadd45βタンパク質を使用したインビトロアッセイ(図22A)および3DOクローンのライセートを使用したインビボアッセイ(図22A)の両方において示された。JNKK2活性に対するGadd45βの作用は特異的である。なぜなら、これらの因子は、高濃度で使用した場合でさえ、JNKK1、MKK3b、ASK1(この因子がASK1に結合するにもかかわらず)のいずれも阻害し得なかったからである(図21B、図21C、図22Aおよび図22B)。JNKK2のこの阻害は、MAPKシグナル伝達に対するGadd45βの作用を説明するのに十分であり、そしてJNK経路に対するこれらの作用の特異性を説明するようである。併せると、これらのデータは、Gadd45βが、TNFαにより誘導されるJNK活性化(これによるアポトーシス)、および直接的にJNKK2を標的化することによるストレス刺激を阻害することを、示す(図21Aおよび22A)。Gadd45βがJNKカスケードに対するNF−κBの作用を媒介するという注目に一致して、Gadd45βおよびNF−κBは、インビボで、TNFαによるMAPK活性化に対して同様の作用を有する(図4C)。ASK1は、JNKの持続的活性化、およびTNF−Rによるアポトーシスに必須であるので、Gadd45βとこのMAPKKKとの間の相互作用はまた、これらのレセプターによるJNK誘導に関係することが、有り得る。
GST−Gadd45βまたはGST−JNKK2のいずれか、ならびにJNKK2およびGadd45βのいくつかのN末端欠失変異体およびC末端欠失変異体をそれぞれ使用する、GSTプルダウン実験を実施することによって、Gadd45βのキナーゼ結合表面(図24Aおよび図24B)ならびにJNKK2のGadd45β結合ドメイン(図23Aおよび図23B)を、同定した。Gadd45βは、JNKK2の触媒ドメイン内の2つの異なるアミノ酸領域に接触し(図23Aおよび図23B)、この触媒ドメインは、JNKK2に対するGadd45βの阻害性作用のための根拠についての、重要な機能的洞察を提供する。JNKK2のこれらの領域は、MEKK4内では相同性を共有せず、このことは、Gadd45βが異なる表面を介してこれらのキナーゼに接触することを示唆する。Gadd45βは酵素活性(例えば、ホスファターゼ活性またはタンパク質分解活性)を有することは知られておらず、そしてGadd45βのJNKK2に対する結合は、インビトロで、キナーゼ機能を阻害するのに十分であるので(図21A)、Gadd45βは、キナーゼ活性または基質に対する接近を阻害する、構造的変化または立体的妨害のいずれかを原因とすることによって、触媒ドメインとの直接的な妨害を介してJNKK2をブロックし得る。
変異体分析を実施することによって、TNFα誘導性殺傷のブロックを担うGadd45βのドメインを、マップ付けした(図25)。RelA−/−細胞における細胞保護作用アッセイにより、GFP−Gadd45β(69−160)およびGFP−Gadd45β(1−113)は、全長のGFP−Gadd45βのTNFαに対する抗アポトーシス活性に匹敵する、TNFαに対する抗アポトーシス活性を提示し、一方、Gadd45β(87−160)と融合したGFPタンパク質またはGadd45β(1−86)と融合したGFPタンパク質は、緩やかな保護作用のみを有することが、示された。より短い短縮は、細胞生存に対して実質的に作用を有さず(図25)、このことは、アミノ酸69とアミノ酸113との間にまたがるGadd45βの領域が細胞保護作用に必須であり、そして隣接するアミノ酸60−68の領域が、この活性に緩やかに寄与することを、示唆する。
Gadd45βドメイン(69−104)を含むこの同じアミノ酸領域は、JNKK2とのGadd45βの相互作用のために必須である(図24Aおよび図24B)。このことは、Gadd45βの保護活性がJNKK2に結合し、そしてJNK活性化を抑制するGadd45βの能力と関連するという注目と、一致する。興味深いことに、これらの発見は、ここで、Gadd45βと直接的に接触するようになる、JNKK2のアミノ酸領域を包含する、細胞透過性のTAT融合ペプチドの設計を可能とする。これらのペプチドは、JNKK2に結合することに対して、内因性Gadd45βタンパク質と効果的に競合し得ることが、期待される。さらに、これらの発見は、低分子のライブラリーをスクリーニングし、そしてJNKK2と会合するGadd45βの能力を妨害し得る化合物を同定するための、生化学的アッセイを設計することを可能とする。これらのペプチドおよびこれらの低分子の両方は、JNK活性化を閉鎖しそして最終的にアポトーシスをブロックする、Gadd45βの能力(およびこれによるNF−κBの能力)を防止し得ることが、予測される。この要約全体を通して考察されるように、これらの化合物は、ヒトの疾患(慢性的炎症性状態および自己免疫状態、ならびに特定のタイプの癌を含む)の処置において、有用な適用を見出し得る。
(要約)
c−Jun−N末端キナーゼ(JNK)経路に対して作用することによりアポトーシスを調節するための方法および組成物、ならびにアポトーシスを調節し得る因子(JNK経路の調節因子を含む)の単離のためのアッセイが、開示される。Gadd45βとは独立してJNK経路を調節する方法が、開示される。アポトーシスの上昇または減少に関連する疾患および状態を調節するための新規な治療組成物の調製および使用のための、方法および組成物が提示される。
c−Jun−N末端キナーゼ(JNK)経路に対して作用することによりアポトーシスを調節するための方法および組成物、ならびにアポトーシスを調節し得る因子(JNK経路の調節因子を含む)の単離のためのアッセイが、開示される。Gadd45βとは独立してJNK経路を調節する方法が、開示される。アポトーシスの上昇または減少に関連する疾患および状態を調節するための新規な治療組成物の調製および使用のための、方法および組成物が提示される。
(引用文献)
以下の参考文献は、それが本明細書中に示されるものを補充する例示的手順または他の詳細を提供する程度に、本明細書中で参考として詳細に援用される。
以下の参考文献は、それが本明細書中に示されるものを補充する例示的手順または他の詳細を提供する程度に、本明細書中で参考として詳細に援用される。
以下の実施例は、本発明の実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技術が、本発明の実行において十分機能するように、本発明者らによって発見された技術を表すということは、当業者により理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示を照会して、開示される特定の実施形態において多くの変更がなされ得、そして本発明の本質および範囲から逸脱することのなく、類似の結果または同等の結果を依然として得るべきであることを理解するべきである。
(実施例1:TNFR誘導性アポトーシスの新規アンタゴニストとしてのGadd45βの同定)
TNFαで処理した場合に急速にアポトーシスを受けるRelA−/−線維芽細胞の機能的補完(BegおよびBaltimore、1996)を、TNFαで活性化した野生型線維芽細胞から誘導した、cDNA発現ライブラリーのトランスフェクションによって、達成した。4×106個より多くの独立したプラスミドから開始して、ライブラリーのトランスフェクション、TNFαでの細胞傷害性処理およびエピソームDNA抽出の継続的サイクルを全部で4回、完了した。
TNFαで処理した場合に急速にアポトーシスを受けるRelA−/−線維芽細胞の機能的補完(BegおよびBaltimore、1996)を、TNFαで活性化した野生型線維芽細胞から誘導した、cDNA発現ライブラリーのトランスフェクションによって、達成した。4×106個より多くの独立したプラスミドから開始して、ライブラリーのトランスフェクション、TNFαでの細胞傷害性処理およびエピソームDNA抽出の継続的サイクルを全部で4回、完了した。
選択後、約200個のランダムなクローンを、一過性トランスフェクションアッセイにおいて分析し、71(35%)が、RelAヌル細胞をTNFα誘導性死から有意に保護することを見出した。これらの中には、マウスのRelA、cFLIP、およびFADDのドミナントネガティブ(DN)形態をコードするcDNAがあり、これらは、新規に単離されたライブラリーの3.6%を示すRelAを用いて、選択プロセスの間に富化された。従って、このライブラリーは、TNFR誘発性アポトーシスの既知のレギュレーターに富んでいる(Budihardjoら、1999)。
細胞保護作用アッセイにおいてポジティブを記録したcDNAのうちの1つは、全長Gadd45βをコードしており、これは、TNFαに対する細胞性応答においてこれまで関係付けられていない因子である。Gadd45βのインサートは、2回のサイクルの選択後82倍に富化され、0.41%の絶対的な頻度に達した。上記の実験は、Gadd45βが新規の推定の抗アポトーシス因子であることを示す。
上記の発見を確認するために、pEGFP−Gadd45β構築物、pEGFP−RelA構築物、またはインサートのないpEGFP構築物を、RelA−/−線維芽細胞中での一過性トランスフェクションアッセイにおいて、試験した。コントロールGFPタンパク質を発現する細胞は、予想通り、TNFα誘導性死に高度に感受性であり、一方対照的に、pEGFP−Gadd45βを受容した細胞は、アポトーシスから劇的に保護された(8時間後、コントロール培養物中では生存率13%に対して、ほぼ生存率60%を示した)(図1A)。以前に示されたように、pEGFP−RelAを用いると、細胞のレスキュー(rescue)は実際に完全であった(BegおよびBaltimore、1996)。
Gadd45βの活性が細胞型特異的であるかどうかを決定するために、NF−κB欠損のさらなる細胞モデルを調製し、ここで、3DO T細胞ハイブリドーマを、IκBαM(NF−κBの核移行を効果的に阻害する、IκBαインヒビター改変体(Van Antwerpら、1996))を安定に発現させた。
レプレッサーの存在下で、3DO細胞は、核のヨウ化プロピジウム(PI)染色によって示されるように、IκBαMタンパク質レベルに相関した毒性の程度に従って、TNFα誘導性殺傷に対して高度に感受性になった(図1B、下側パネル)。Neoのコントロール細胞は、その代わりに、サイトカインに対して完全な耐性を維持した。次に、全長Gadd45βを発現する構築物、または空のコントロールベクター(Hygro)を、IκBαMを最も高レベルで提示した、3DO−IκBαM−25系列に安定に導入した(図1B)。試験した各々11個のIκBαM−Hygroクローンは、TNFαに高度に感受性のままであったが、Gadd45βを発現するクローンはアポトーシス耐性(Gadd45βタンパク質レベルに相関した、31個の独立したIκBαM−Gadd45βクローンの生存率)になった(図1Cおよび図1D、代表の線は、高レベルのGadd45βおよび低レベルのIκBαM−Hygroコントロールを表す)。Gadd45βの保護作用は、いくつかのIκBαM−Gadd45β系列の生存率が、Neoクローンの生存率と匹敵する場合、初期の時点で最も劇的であった(図1Cおよび図1D、8時間)。高量のGadd45βを発現するIκBαM−Gadd45β−33系列において、細胞死の頻度は、24時間でさえNeoコントロールにおけるより、約15%のみ高かった(図1C)。従って、Gadd45βは、NF−κBの欠失に対して一時的に代償するのに十分である。
さらに、IκBαM−Gadd45β細胞は、感受性のIκBαMクローンにおいて検出されるIκBαMタンパク質レベルと同等かまたはそれより高く(図1D、下側パネル)、そして、TNFαによるNF−κBの活性化を完全にブロックするのに十分である、IκBαMタンパク質レベル(電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA;図1E)によって判定する場合)を、維持した。従って、RelA−/−細胞においても見られたように、Gadd45βは、NF−κB複合体の下流で作用することによって、アポトーシス経路をブロックする。
(実施例2:Gadd45はNF−κBの生理学的標的である)
Gadd45βは、IL−6、IL−18およびTGFβのようなサイトカイン、ならびに遺伝毒性ストレスによって、誘導され得る(Zhangら、1999;Yangら、2001;Wangら、1999b)。NF−κBの抗アポトーシス機能は遺伝子活性化と関係するので、Gadd45βもまたTNFαによって調節されるかどうかを決定した。図2Aに示されるように、サイトカイン処理は、野生型マウス胚線維芽細胞(MEF)において、Gadd45β転写物の強力かつ迅速なアップレギュレーションを決定した。対照的に、RelAを欠損する細胞において、特に初期の時点で遺伝子誘導は重篤に損なわれた(図2A、0.5時間での+/+のレーンと−/−のレーンとを比較のこと)。これらの細胞において、誘導はまた、遅延され、そしてNH−κBの既知の標的であるIκBαMの発現パターンを反映した(Ghoshら、1998)。このことは、緩やかな誘導が、RelA以外のNF−κBファミリーのメンバー(すなわち、Rel)に起因するようであることを示唆する。Gadd45αは、TNFαによっては活性化されず、一方、Gadd45γは両方の細胞型において緩やかにアップレギュレートされた。
Gadd45βは、IL−6、IL−18およびTGFβのようなサイトカイン、ならびに遺伝毒性ストレスによって、誘導され得る(Zhangら、1999;Yangら、2001;Wangら、1999b)。NF−κBの抗アポトーシス機能は遺伝子活性化と関係するので、Gadd45βもまたTNFαによって調節されるかどうかを決定した。図2Aに示されるように、サイトカイン処理は、野生型マウス胚線維芽細胞(MEF)において、Gadd45β転写物の強力かつ迅速なアップレギュレーションを決定した。対照的に、RelAを欠損する細胞において、特に初期の時点で遺伝子誘導は重篤に損なわれた(図2A、0.5時間での+/+のレーンと−/−のレーンとを比較のこと)。これらの細胞において、誘導はまた、遅延され、そしてNH−κBの既知の標的であるIκBαMの発現パターンを反映した(Ghoshら、1998)。このことは、緩やかな誘導が、RelA以外のNF−κBファミリーのメンバー(すなわち、Rel)に起因するようであることを示唆する。Gadd45αは、TNFαによっては活性化されず、一方、Gadd45γは両方の細胞型において緩やかにアップレギュレートされた。
類似して、Gadd45βは、親の3DO細胞およびNeo 3DO細胞においてTNFαによって、誘導されたが、IκBαM系列においては誘導されなかった(図2B)。中程度の活性化がIκBαM−6細胞のみで見られ、この細胞は低レベルのレプレッサーを発現していた(図1Bを参照のこと)。Neoクローンにおいて、Gadd45βはまた、NF−κBを活性化することが既知な処理である(Wangら、1996)、ダウノルビシン、またはPMA+イオノマイシン(P/I;それぞれ図2Dおよび図2C)によって、誘導された。繰返すと、遺伝子誘導は、IκBαMによって実際に抑止された。Gadd45αはTNFα処理によっては影響されなかったが、ダウノルビシンまたはP/IによってNF−κB非依存的であるがアップレギュレートされた(図2B、図2C、図2D);一方、Gadd45γは、いくつかの系列においてのみ、サイトカインによって僅かに誘導された(図2B)。nfkb1を、NF−κB依存的遺伝子発現のポジティブコントロールとして使用した(Ghoshら、1998)。
これらの結果は、gadd45βが新規のTNFα誘導性の遺伝子であり、そしてNF−κBの生理学的標的であることを、確立する。gadd45βプロモーターの調査から、3つのκB結合部位の存在が明らかにされた。EMSAおよび変異体分析により、これらの部位の各々が、最適な転写活性化のために必要とされることが確認され、このことは、Gadd45βがまたNF−κBの直接的な標的であることを示す。これらの発見は、TNFαに対する細胞応答の生理学的調節因子としてのgadd45βの役割と一致する。
(実施例3:内因性Gadd45βは、TNFαの生存に必要とされる)
Gadd45βは、NF−κBの下流の標的であり、そして外因性Gadd45βは、TNFαに対する応答の間、転写因子に対する部分的な代用となり得る。しかし、過剰発現の実験が実行されたので、細胞保護作用がGadd45βの生理学的機能を表し得ないということが論じられ得た。この問題を調査するために、Gadd45βをアンチセンスの方向で安定に発現する3DOクローンを調製した。これらのクローン中での構築的なGadd45β発現の阻害は、細胞周期における僅かな再配分を招き、G2にいる細胞の画分を低減させ、このことは、G2/MチェックポイントにおけるGadd45タンパク質の以前に提案された役割を強調する(Wangら、1999c)。NF−κBを活性化するそれらの能力にもかかわらず、高レベルのアンチセンスGadd45β(AS−Gadd45β)を発現する細胞は、TNFα+最適以下の濃度のCHXによる殺傷に、著明な感受性を提示した(図1F)。対照的に、空ベクター(AS−Hygro)を保持するコントロール系列は、この処理に対して耐性を維持した(図1F)。細胞周期の変化に関して、細胞毒性は、高レベルのアンチセンスmRNAと相関した。これらのデータは、正常な状況下では、内因性Gadd45βがTNFR誘導性アポトーシスに拮抗するのに必要とされることを示し、そしてNF−κBヌル細胞のサイトカイン殺傷に対する感受性が、少なくとも部分的に、これらの細胞がGadd45βの発現を活性化不能であることに起因することを、示唆する。
Gadd45βは、NF−κBの下流の標的であり、そして外因性Gadd45βは、TNFαに対する応答の間、転写因子に対する部分的な代用となり得る。しかし、過剰発現の実験が実行されたので、細胞保護作用がGadd45βの生理学的機能を表し得ないということが論じられ得た。この問題を調査するために、Gadd45βをアンチセンスの方向で安定に発現する3DOクローンを調製した。これらのクローン中での構築的なGadd45β発現の阻害は、細胞周期における僅かな再配分を招き、G2にいる細胞の画分を低減させ、このことは、G2/MチェックポイントにおけるGadd45タンパク質の以前に提案された役割を強調する(Wangら、1999c)。NF−κBを活性化するそれらの能力にもかかわらず、高レベルのアンチセンスGadd45β(AS−Gadd45β)を発現する細胞は、TNFα+最適以下の濃度のCHXによる殺傷に、著明な感受性を提示した(図1F)。対照的に、空ベクター(AS−Hygro)を保持するコントロール系列は、この処理に対して耐性を維持した(図1F)。細胞周期の変化に関して、細胞毒性は、高レベルのアンチセンスmRNAと相関した。これらのデータは、正常な状況下では、内因性Gadd45βがTNFR誘導性アポトーシスに拮抗するのに必要とされることを示し、そしてNF−κBヌル細胞のサイトカイン殺傷に対する感受性が、少なくとも部分的に、これらの細胞がGadd45βの発現を活性化不能であることに起因することを、示唆する。
(実施例4:Gadd45βはNF−κBヌル細胞におけるアポトーシスを効果的にブロックする)
Gadd45βの発現がカスパーゼの活性化に影響するかどうかという疑問が存在した。NF−κB欠損細胞において、3DO抽出物がカスパーゼ−8特異的基質をインビトロでタンパク質分解する能力によって評価した場合、カスパーゼ−8活性をTNFα処理の4時間後ほどの早さで検出した(図3A、IκBαMおよびIκBαM−Hygro)。このことは、カスパーゼ−9、カスパーゼ−2、カスパーゼ−6およびカスパーゼ−3/7のような下流のカスパーゼの著明な活性化と一致する。以前に報告されたように、事象のこのカスケード(カスパーゼ−8前駆体の活性化を含む)は、NF−κBによって完全にブロックされた(Neo;Wangら、1998)。イニシエーターカスパーゼおよび実行体(executioner)カスパーゼの両方のサイトカイン誘導性活性化はまた、高レベルのGadd45βを発現するIκBαM−Gadd45β−10において、抑制された(図3A)。非常に低度のカスパーゼ−3/7の活性化は、6時間までにこれらの後者の細胞において検出されたが(下側パネル、中央パネル)、この発見の重要性は明らかでない。なぜなら、ウェスタンブロットにおいてカスパーゼ−3もカスパーゼ−7もいずれもプロセッシングの兆候が存在しなかったからである(図3B)。実際、IκBαM−Gadd45β細胞およびNeo細胞において、他のカスパーゼ前駆体の切断、ならびにBidの切断もまた、これらの細胞中で正常レベルのタンパク質前駆形態で存在するにもかかわらず、完全に阻害された(図3B)。タンパク質分解は特異的であった。なぜなら、他のタンパク質(β−アクチンを含む)はこれらの細胞抽出物中では分解されなかったからである。従って、Gadd45βは、NF−κBヌル細胞において、カスパーゼ活性化のTNFα誘導性経路を抑止する。
Gadd45βの発現がカスパーゼの活性化に影響するかどうかという疑問が存在した。NF−κB欠損細胞において、3DO抽出物がカスパーゼ−8特異的基質をインビトロでタンパク質分解する能力によって評価した場合、カスパーゼ−8活性をTNFα処理の4時間後ほどの早さで検出した(図3A、IκBαMおよびIκBαM−Hygro)。このことは、カスパーゼ−9、カスパーゼ−2、カスパーゼ−6およびカスパーゼ−3/7のような下流のカスパーゼの著明な活性化と一致する。以前に報告されたように、事象のこのカスケード(カスパーゼ−8前駆体の活性化を含む)は、NF−κBによって完全にブロックされた(Neo;Wangら、1998)。イニシエーターカスパーゼおよび実行体(executioner)カスパーゼの両方のサイトカイン誘導性活性化はまた、高レベルのGadd45βを発現するIκBαM−Gadd45β−10において、抑制された(図3A)。非常に低度のカスパーゼ−3/7の活性化は、6時間までにこれらの後者の細胞において検出されたが(下側パネル、中央パネル)、この発見の重要性は明らかでない。なぜなら、ウェスタンブロットにおいてカスパーゼ−3もカスパーゼ−7もいずれもプロセッシングの兆候が存在しなかったからである(図3B)。実際、IκBαM−Gadd45β細胞およびNeo細胞において、他のカスパーゼ前駆体の切断、ならびにBidの切断もまた、これらの細胞中で正常レベルのタンパク質前駆形態で存在するにもかかわらず、完全に阻害された(図3B)。タンパク質分解は特異的であった。なぜなら、他のタンパク質(β−アクチンを含む)はこれらの細胞抽出物中では分解されなかったからである。従って、Gadd45βは、NF−κBヌル細胞において、カスパーゼ活性化のTNFα誘導性経路を抑止する。
アポトーシス経路のGadd45β依存性のブロックをさらに規定するために、ミトコンドリアの機能を分析した。IκBαMクローンおよびIκBαM−Hygroクローンにおいて、TNFαは、蛍光色素JC−1の使用によって測定した場合、ミトコンドリアのΔψmの落ち込み(drop)を誘導した。JC−1+細胞は、サイトカイン処理の4時間後、有意な数量で現れ始め、6時間までに約80%に達した(図3C)。従って、NF−κBヌル3DO細胞において、ミトコンドリアの事象の誘発、ならびにイニシエーターカスパーゼおよび実行体カスパーゼの活性化は、同様の動態で発生する。TNFα誘導殺傷に対するIκBαM細胞を保護するBcl−2の能力は、これらの細胞において、カスパーゼ活性化がミトコンドリアの増幅機構に依存することを示した(Budihardjoら、1999)。IκBαM−Gadd45β−10細胞およびNeo細胞において、ミトコンドリアの脱分極化を完全に阻害した(図3A)。低度のカスパーゼ活性を観察したIκBαM−Gadd45β−5細胞においてもまた、阻害はほぼ完全であった(図3A)。これらの発見は、ミトコンドリアに対するGadd45βの保護活性を追従し、カスパーゼ活性化のブロックが、主に、Gadd45βがミトコンドリアの増幅機構を完全に抑制する能力に依存することを示唆する。図3Dおよび図3Eに示されるように、Gadd45βはシスプラチンおよびダウノルビシンに対して細胞を保護し得、このことはGadd45βがミトコンドリアにおけるアポトーシス経路をブロックし得ることを示唆する。この可能性と一致して、この因子の発現はまた、遺伝毒性薬剤のシスプラチンおよびダウノルビシンによるアポトーシスに対して細胞を保護した(それぞれ、図3Dおよび図3E)。Gadd45βはミトコンドリアには局在しないようであるので、Gadd45βは、概ね、オルガネラを標的化する経路を阻害することによって、間接的にミトコンドリアの事象を抑制するようである。
(実施例5:Gadd45βはJNK活性化の特異的インヒビターである)
調査した疑問は、Gadd45βが、細胞死の制御において重要な役割を果たすMAPK経路(ChangおよびKarin、2001)に影響するかどうかである。IκBαM−Hygroクローンにおいて、抗リン酸化JNK抗体を用いたウェスタンブロットおよびJNKキナーゼアッセイによって示されるように、TNFαはJNKの強力かつ迅速な活性化を誘導した(図4Aおよび図5A、左パネル)。活性化は、5分でピークに達し、次いで減衰し、40分までに持続性レベルで安定した。この特異的シグナルは、カスパーゼ活性化に起因して、160分で再度上昇した(図4Aおよび図5A)。初期の誘導とは異なり、カスパーゼインヒビターzVAD−fmkで細胞を処理することによって、この作用を妨げ得る。IκBαM−Gadd45β細胞において、これらの細胞中で正常なレベルのJNKタンパク質が存在するにもかかわらず、各時点でTNFαによるJNK活性化を劇的に抑止した(図4A、右パネル)。Gadd45βはまた、ソルビトールおよび過酸化水素を含む、TNFα以外の刺激によるJNK活性化を抑制した(図4B)。それにもかかわらず、このブロックは特異的である。なぜなら、Gadd45βの存在はERK活性化、p38活性化のいずれにも影響しなかったからである(図4C)。内因性Gadd45βのアンチセンス阻害は、TNFR誘発後のJNKの長期化した活性化を導いた(図4D、AS−Gadd45βおよびHygro)。このことは、この因子および他の因子(AS−Gadd45β細胞におけるダウンレギュレーションを参照のこと)がこの経路の効果的な終結のために必要とされることを示す。AS−Gadd45β細胞において10分に見られる、僅かに増強された誘導は、構築的に発現されたGadd45βがまたJNKの阻害に寄与し得ることを示した(図2の、基底レベルのGadd45βを参照のこと)。Gadd45βは、JNK活性化の新規の生理学的インヒビターである。JNKがミトコンドリアにおいてアポトーシス経路を誘発する能力が示されると、これらの観察は、Gadd45βの保護活性についての機構を提供し得る。
調査した疑問は、Gadd45βが、細胞死の制御において重要な役割を果たすMAPK経路(ChangおよびKarin、2001)に影響するかどうかである。IκBαM−Hygroクローンにおいて、抗リン酸化JNK抗体を用いたウェスタンブロットおよびJNKキナーゼアッセイによって示されるように、TNFαはJNKの強力かつ迅速な活性化を誘導した(図4Aおよび図5A、左パネル)。活性化は、5分でピークに達し、次いで減衰し、40分までに持続性レベルで安定した。この特異的シグナルは、カスパーゼ活性化に起因して、160分で再度上昇した(図4Aおよび図5A)。初期の誘導とは異なり、カスパーゼインヒビターzVAD−fmkで細胞を処理することによって、この作用を妨げ得る。IκBαM−Gadd45β細胞において、これらの細胞中で正常なレベルのJNKタンパク質が存在するにもかかわらず、各時点でTNFαによるJNK活性化を劇的に抑止した(図4A、右パネル)。Gadd45βはまた、ソルビトールおよび過酸化水素を含む、TNFα以外の刺激によるJNK活性化を抑制した(図4B)。それにもかかわらず、このブロックは特異的である。なぜなら、Gadd45βの存在はERK活性化、p38活性化のいずれにも影響しなかったからである(図4C)。内因性Gadd45βのアンチセンス阻害は、TNFR誘発後のJNKの長期化した活性化を導いた(図4D、AS−Gadd45βおよびHygro)。このことは、この因子および他の因子(AS−Gadd45β細胞におけるダウンレギュレーションを参照のこと)がこの経路の効果的な終結のために必要とされることを示す。AS−Gadd45β細胞において10分に見られる、僅かに増強された誘導は、構築的に発現されたGadd45βがまたJNKの阻害に寄与し得ることを示した(図2の、基底レベルのGadd45βを参照のこと)。Gadd45βは、JNK活性化の新規の生理学的インヒビターである。JNKがミトコンドリアにおいてアポトーシス経路を誘発する能力が示されると、これらの観察は、Gadd45βの保護活性についての機構を提供し得る。
(実施例6:NF−κBによる新規の保護機構としてのJNK経路の阻害)
JNKのダウンレギュレーションは、NF−κBの生理学的機能を表す。一方、Neo細胞において、JNK活性化はサイトカイン処理の40分後に基底レベル近くにまで戻り、一方、IκBαM細胞およびIκBαM−Hygro細胞においては、低度な調節(down−modulation)にもかかわらず、JNKシグナル伝達は、時間経過の全体を通して持続性のままであった(図7A;図5Aもまた参照のこと)。定量的に同様な結果が、RelA欠損MEFを用いて得られ、この細胞では、野生型線維芽細胞において見られたものとは異なり、TNFα誘導性JNKを最終時点でさえ検出可能なレベルで堅持した(図5B)。従って、Gadd45βに関して、NF−κB複合体は、TNFR誘発後のJNK経路の効果的な終結のために必要とされ、従ってNF−κB経路とJNK経路との間の連結を確立する。
JNKのダウンレギュレーションは、NF−κBの生理学的機能を表す。一方、Neo細胞において、JNK活性化はサイトカイン処理の40分後に基底レベル近くにまで戻り、一方、IκBαM細胞およびIκBαM−Hygro細胞においては、低度な調節(down−modulation)にもかかわらず、JNKシグナル伝達は、時間経過の全体を通して持続性のままであった(図7A;図5Aもまた参照のこと)。定量的に同様な結果が、RelA欠損MEFを用いて得られ、この細胞では、野生型線維芽細胞において見られたものとは異なり、TNFα誘導性JNKを最終時点でさえ検出可能なレベルで堅持した(図5B)。従って、Gadd45βに関して、NF−κB複合体は、TNFR誘発後のJNK経路の効果的な終結のために必要とされ、従ってNF−κB経路とJNK経路との間の連結を確立する。
CHX処理もまた、TNFα誘導性JNKのダウンレギュレーションを妨げ(図5C)、このことは、3DO細胞において、このプロセスが新規に誘導された因子および/または迅速に代謝回転する因子を必要とすることを示す。いくつかの系において、CHXはJNKの緩やかな活性化を誘導することが報告されているが(Liuら、1996)、3DO細胞および他の細胞においてはこの薬剤は単独ではこの経路に対して全く影響しない(図5C;Guoら、1998)。これらの発見は、JNKのNF−κB依存的阻害が、概ね、転写的な事象でありそうであることを示す。この機能は、Gadd45βの活性化の関与を示す。なぜなら、この因子は、その発現をNF−κBに依存するからであり(図2)、そしてTNFR誘導性JNKのダウンレギュレーションにおいて必須の役割を果たすからである(図4D)。
2つの異なるNF−κBヌル系を用いると、CXH処理細胞およびAS−Gadd45β細胞は細胞毒性に相関してJNK活性化を堅持し、一方、IκBαM−Gadd45β細胞を用いると、JNK抑制が細胞保護作用と相関した。MAPKカスケードが、NF−κBヌル細胞のTNFα誘導性アポトーシス応答において役割を果たすかどうかを直接的に測定するため、JNKK1(MKK4;SEK1)もしくはJNKK2(MKK7)の触媒的不活性化変異体(これらの各々がJNK活性化をブロックする(Linら、1995))またはNKK3bの酵素的不活性化変異体(これはp38をブロックする(Huangら、1997))を発現するプラスミド、あるいは空ベクターを、pEGFPと一緒に、RelA−1−細胞中に一過性にトランスフェクションした。明らかに、p38の阻害は細胞の生存に全く関渉せず、一方、DN−JNKK2によるJNKの抑制は、TNFα誘導性殺傷からRelAヌル細胞を劇的にレスキューした(図5D)。JNKK1は、炎症誘発性サイトカインによって主に活性化されるのではなく(Davis、2000)、このことは、なぜJNKK1変異体がこの系において全く作用しないかを説明し得る。同様の発見は、MAPK経路が良好に特徴付けられた薬剤によって阻害された3DO−IκBαM細胞において、得られた。PD98059および低濃度のSB202190(5μM以下)(それぞれ、ERKおよびp38を特異的に阻害する)はTNFα細胞傷害性に拮抗し得ないが、一方、高濃度のSB202190(50μM)(これはp38およびJNKの両方をブロックする(Jacintoら、1998))は、細胞生存を劇的に増強した(図5E)。これらのデータは、JNKがTNFRにより誘発される重要なアポトーシスシグナルを伝達するがp38(またはERK)は伝達せず、そして少なくとも部分的にJNK経路のダウンレギュレーションを促進することによってNF−κB複合体が細胞を保護することを、示す。
(実施例7:gadd45βは、RelAの異所性発現により誘導されるが、Relでもp50でも誘導されない)
サイトカインまたはストレスによるgadd45βの活性化は、本明細書中に開示されるように、NF−κBを必要とする。なぜなら、RelAヌル変異体またはIκBαM(NF−κBの核移行をブロックするIκBαインヒビターの改変体(Van Antwerpら、1996))の発現のいずれかによって、廃止されるからである。NF−κBがまたgadd45βのアップレギュレーションを行うのに十分であるかどうかを決定するため、そしてその場合、どのNF−κBファミリーのメンバーが遺伝子制御に最も関連するかを規定するため、HeLa由来のHtTA−RelA細胞系列、HtTA−CCR43細胞系列およびHtTA−p50細胞系列(それぞれ、RelA、Relおよびp50を発現する)を、テトラサイクリン調節性プロモーターの制御下で使用した(図6)。これらの細胞系を使用した。なぜなら、これらは、NF−κBの転写因子を付随的に活性化し得る細胞外シグナルとは非依存的にNF−κB複合体が核に局在することを可能にするからである。
サイトカインまたはストレスによるgadd45βの活性化は、本明細書中に開示されるように、NF−κBを必要とする。なぜなら、RelAヌル変異体またはIκBαM(NF−κBの核移行をブロックするIκBαインヒビターの改変体(Van Antwerpら、1996))の発現のいずれかによって、廃止されるからである。NF−κBがまたgadd45βのアップレギュレーションを行うのに十分であるかどうかを決定するため、そしてその場合、どのNF−κBファミリーのメンバーが遺伝子制御に最も関連するかを規定するため、HeLa由来のHtTA−RelA細胞系列、HtTA−CCR43細胞系列およびHtTA−p50細胞系列(それぞれ、RelA、Relおよびp50を発現する)を、テトラサイクリン調節性プロモーターの制御下で使用した(図6)。これらの細胞系を使用した。なぜなら、これらは、NF−κBの転写因子を付随的に活性化し得る細胞外シグナルとは非依存的にNF−κB複合体が核に局在することを可能にするからである。
図6に示されるように、テトラサイクリンの除去は、HtTA−RelA細胞においてgadd45β mRNAレベルの強力な増加を、relA、ならびにiκbαおよびp105(NF−κBの2つの既知標的)の動態を反映する誘導動態で、促した。以前に報告されたように、これらの細胞中でのRelA発現により誘導される毒性(gadph mRNAレベル)は、gadd45β誘導の範囲の過小評価を招く。逆に、gadd45βは、高レベルのRelを条件付で発現するHtTA−CCR43細胞において、ほんの僅かに誘導された。iκbαおよびp105は、その代わり、これらの細胞において、HtTA−RelA系列におけるよりも小さい範囲であるが、有意に活性化され、このことは、テトラサイクリンの除去が機能性のRel含有複合体を生じたことを示す。p50の誘導および規定された活性化ドメインを欠失したNF−κBサブユニットの誘導は、gadd45β、rel、p105のいずれの内因性レベルにも影響しなかった。テトラサイクリンの除去は、HtTAコントロール細胞においてgadd45β(またはrelA、iκbαもしくはp105)のレベルに影響せず、このことは、HtTA−RelA細胞におけるgadd45βの誘導が、NF−κB複合体の活性化に起因したことを示す。
NF−κBサブユニットの誘導動態を、ウェスタンブロット分析によって確認した。従って、gadd45β発現は、転写活性なNF−κBサブユニットのRelAの異所性発現の際に、劇的かつ特異的にアップレギュレートされるが、p50の異所性発現でもRelの異所性発現でもアップレギュレートされない(図6)。これらの発見は、上記のRelAヌル線維芽細胞を用いた観察と一致し、そしてgadd45βの活性化におけるRelAの重要性を強調する。
(実施例8:gadd45β発現は、B細胞系列におけるNF−κB活性と相関する)
NF−κBは、Bリンパ球産生において重要な役割を果たし、そして成熟B細胞の生存のために必要とされる。従って、gadd45βの構築的かつ誘導性の発現を、NF−κBの存在点(stand point)から良好に特徴付けられたB細胞モデル系において、試験した。実際、gadd45β mRNAレベルは、これらの細胞における核内NF−κB活性と相関した(図7)。gadd45β転写物は、無刺激のWEHI−231 B細胞(これは、構築的な核NF−κBを提示する)において容易に見られ、一方、mRNAレベルは、70Z/3 B細胞前駆体(これは、代わりに、転写因子の古典的誘導形態を含む)において検出未満であった。両方の細胞型において、発現は、LPSによって劇的に増大し(70Z/3細胞についてのより長期の曝露を参照のこと)、そしてWEH−231細胞においてもまたPMA(これらの細胞においてNF−κBを活性化することが既知の2つの薬剤)によって、劇的に増大した。従って、gadd45βは、Bリンパ球においてNF−κBにより実行される重要な機能のいくつかを媒介し得る。
NF−κBは、Bリンパ球産生において重要な役割を果たし、そして成熟B細胞の生存のために必要とされる。従って、gadd45βの構築的かつ誘導性の発現を、NF−κBの存在点(stand point)から良好に特徴付けられたB細胞モデル系において、試験した。実際、gadd45β mRNAレベルは、これらの細胞における核内NF−κB活性と相関した(図7)。gadd45β転写物は、無刺激のWEHI−231 B細胞(これは、構築的な核NF−κBを提示する)において容易に見られ、一方、mRNAレベルは、70Z/3 B細胞前駆体(これは、代わりに、転写因子の古典的誘導形態を含む)において検出未満であった。両方の細胞型において、発現は、LPSによって劇的に増大し(70Z/3細胞についてのより長期の曝露を参照のこと)、そしてWEH−231細胞においてもまたPMA(これらの細胞においてNF−κBを活性化することが既知の2つの薬剤)によって、劇的に増大した。従って、gadd45βは、Bリンパ球においてNF−κBにより実行される重要な機能のいくつかを媒介し得る。
(実施例9:いくつかの推定のκBエレメントを含むgadd45βプロモーター)
NF−κBによるgadd45β発現の調節を調査するために、マウス(muring)gadd45βプロモーターをクローン化した。gadd45β遺伝子を含むBACクローンを、XhoIで消化した129SVマウスゲノムライブラリーから単離し、そしてpBSベクター中にサブクローン化した。gadd45βを含む7384bpのXhoIフラグメントを完全に配列決定し、そしていくつかの部分が先に寄託したGeneBank配列に一致することを見出した(受託番号AC073816、AC073701、およびAC091518)(図8もまた参照のこと)。このフラグメントは、転写開始部位の約5.4kbp上流からgadd45βの第4番目のエキソン端部近傍までに亘るゲノムDNA領域を保有していた。次に、TRANSFACデータベースを用いて、推定の転写因子結合エレメントを同定した。TATAAボックスは、転写開始部位に対する位置−56〜−60に位置することが見出された(図10)。このgadd45βプロモーターはまた、いくつかのκBエレメントを示し、そのいくつかは、他者により最近報告された。3つの強いκB部位が、近位プロモーター領域に、位置−377/−368、−426/−417、および−447/−438で見出された(図8);その一方、より弱い部位は、位置−4516、−4890/−4881、および−5251/−5242として位置決められた(図8)。3つのκBコンセンサス部位もまた、gadd45βの第1番目のエキソンとともに注目された(+27/+36、+71/+80、および+171/+180)。このプロモーターはまた、Sp1モチーフ(−890/−881)、および熱ショック因子(HSF)1および2、Ets、Stat、AP1、N−Myc、MyoD、CREB、およびC/EBPを含む、その他の転写因子のためのいくつかの推定の結合部位を含んでいた(図8)。
NF−κBによるgadd45β発現の調節を調査するために、マウス(muring)gadd45βプロモーターをクローン化した。gadd45β遺伝子を含むBACクローンを、XhoIで消化した129SVマウスゲノムライブラリーから単離し、そしてpBSベクター中にサブクローン化した。gadd45βを含む7384bpのXhoIフラグメントを完全に配列決定し、そしていくつかの部分が先に寄託したGeneBank配列に一致することを見出した(受託番号AC073816、AC073701、およびAC091518)(図8もまた参照のこと)。このフラグメントは、転写開始部位の約5.4kbp上流からgadd45βの第4番目のエキソン端部近傍までに亘るゲノムDNA領域を保有していた。次に、TRANSFACデータベースを用いて、推定の転写因子結合エレメントを同定した。TATAAボックスは、転写開始部位に対する位置−56〜−60に位置することが見出された(図10)。このgadd45βプロモーターはまた、いくつかのκBエレメントを示し、そのいくつかは、他者により最近報告された。3つの強いκB部位が、近位プロモーター領域に、位置−377/−368、−426/−417、および−447/−438で見出された(図8);その一方、より弱い部位は、位置−4516、−4890/−4881、および−5251/−5242として位置決められた(図8)。3つのκBコンセンサス部位もまた、gadd45βの第1番目のエキソンとともに注目された(+27/+36、+71/+80、および+171/+180)。このプロモーターはまた、Sp1モチーフ(−890/−881)、および熱ショック因子(HSF)1および2、Ets、Stat、AP1、N−Myc、MyoD、CREB、およびC/EBPを含む、その他の転写因子のためのいくつかの推定の結合部位を含んでいた(図8)。
保存された調節エレメントを同定するために、gadd45β転写開始部位のすぐ上流の5.4kbpのマウスDNA配列を、Joint Genome Initiativeにより先に寄託された対応するヒト配列(受託番号AC005624)とアラインした。図8に示されるように、マウスgadd45βプロモーターの位置−1477〜−1197および−466〜−300に亘るDNA領域は、ヒトプロモーターの部分と高度に類似し(灰色で強調したのは、相同性の領域内の同じヌクレオチドである)、これらの領域が、重要な調節エレメントを含むことを示唆した。より少ないが良好に保存された領域が、下流位置−183〜第1イントロンの始まりまでで同定された。相同性の、さらなるより短いストレッチもまた同定された(図8を参照のこと)。上流位置−2285には有意な類似性は見出されなかった。上記−466/−300相同性領域は、3つのκB部位を含み(以後κB1、κB2、およびκB3と称する)、これらはその他のκB部位と異なり、gadd45βプロモーター中いたるところに存在し、2つの種間で保存されていた。これらの知見は、これらのκB部位が、gadd45βの調節で重要な役割を演じ、おそらく、NF−κBによるgadd45βの誘導の原因であることを示唆している。
(実施例10:NF−κBは、3つの近位κBエレメントにより、gadd45βプロモーターを調節している)
gadd45βプロモーター中に存在するκB部位の機能的重要性を決定するために、一連のCATリポーター構築物を生成し、ここで、CAT遺伝子発現は、このプロモーターの種々の部分によって駆動される(図9A)。各CAT構築物は、単独または増加する量のRelA発現プラスミドとともに、NTera−2胎児癌腫細胞中にトランスフェクトし、そして細胞溶解物中のCAT活性を、液体シンチレーション計数により測定した(図9B)。RelAを、その他のNF−κBサブユニットと比較したとき、gadd45β発現の調節へのその関連度のために、これらの実験について選択した(図6を参照のこと)。図9Bに示されるように、上記−5407/+23−gadd45β−CATTリポーターベクターは、用量依存様式で、RelAによって劇的にトランス活性化され、最も高い量のpMT2T−RelAでRelAの不在下で観察された誘導に対し約340倍の誘導を示した。質的に同様のRelA依存性効果が、gadd45βプロモーターの遠位の切断を含んだ、上記−3465/+23−gadd45β−CAT構築物および−592/+23−gadd45β−CAT構築物で観察された。相対的により低い構築物は、これらは、gadd45βプロモーターの遠位の切断を含んでいた。相対的により低い基礎およびRelA依存性CAT活性が、上記−5407/+23−gadd45β−CATで観察され、少なくとも部分的には、前記の構築物においてもTATAボックスを含んでいた近位329bp調節領域の欠如に起因し得た(図9Aおよび9B)。この領域の存在下でさえ、位置−592まで近位方向に延びる欠失は、CAT遺伝子を活性化するRelAの能力を完全になくした(図9B、−265/+23−gadd45β−CAT構築物および−103/+23−gadd45β−CAT構築物を参照のこと)。同様の知見が、位置+23の下流のさらなる116bプロモーターフラグメントを含む類似のリポーター構築物で得られた。その一方、−592/+23−gadd45β−CATと類似して、−592/+139−gadd45β−CATは、RelAに高度に反応性であり、−265/+139−gadd45β−CATは、最も高い量のpMT2T−RelAによってでさえトランス活性化されなかった。このリポーター構築物は、位置+27/+36および+71/+80(図8、配列番号35を参照のこと)にある2つの推定のκB結合エレメントを保持するにもかかわらず、RelAに応答しなかったことに注目すべきである。ともに、これら知見は、マウスgadd45βプロモーター中の関係あるNF−κB/RelA応答性エレメントが、位置−592と+23との間に存在することを示す。それらはまた、第1番目のエキソンに含まれたκB部位、および遠位κB部位が、NF−κBによるgadd45βの調節には有意に寄与し得ないことを意味している。同様の結論が、NF−κBがPMAプラスイオノマイシン処置によって活性化されたJurkat細胞またはHeLa細胞を採用する実験で得られた。
gadd45βプロモーター中に存在するκB部位の機能的重要性を決定するために、一連のCATリポーター構築物を生成し、ここで、CAT遺伝子発現は、このプロモーターの種々の部分によって駆動される(図9A)。各CAT構築物は、単独または増加する量のRelA発現プラスミドとともに、NTera−2胎児癌腫細胞中にトランスフェクトし、そして細胞溶解物中のCAT活性を、液体シンチレーション計数により測定した(図9B)。RelAを、その他のNF−κBサブユニットと比較したとき、gadd45β発現の調節へのその関連度のために、これらの実験について選択した(図6を参照のこと)。図9Bに示されるように、上記−5407/+23−gadd45β−CATTリポーターベクターは、用量依存様式で、RelAによって劇的にトランス活性化され、最も高い量のpMT2T−RelAでRelAの不在下で観察された誘導に対し約340倍の誘導を示した。質的に同様のRelA依存性効果が、gadd45βプロモーターの遠位の切断を含んだ、上記−3465/+23−gadd45β−CAT構築物および−592/+23−gadd45β−CAT構築物で観察された。相対的により低い構築物は、これらは、gadd45βプロモーターの遠位の切断を含んでいた。相対的により低い基礎およびRelA依存性CAT活性が、上記−5407/+23−gadd45β−CATで観察され、少なくとも部分的には、前記の構築物においてもTATAボックスを含んでいた近位329bp調節領域の欠如に起因し得た(図9Aおよび9B)。この領域の存在下でさえ、位置−592まで近位方向に延びる欠失は、CAT遺伝子を活性化するRelAの能力を完全になくした(図9B、−265/+23−gadd45β−CAT構築物および−103/+23−gadd45β−CAT構築物を参照のこと)。同様の知見が、位置+23の下流のさらなる116bプロモーターフラグメントを含む類似のリポーター構築物で得られた。その一方、−592/+23−gadd45β−CATと類似して、−592/+139−gadd45β−CATは、RelAに高度に反応性であり、−265/+139−gadd45β−CATは、最も高い量のpMT2T−RelAによってでさえトランス活性化されなかった。このリポーター構築物は、位置+27/+36および+71/+80(図8、配列番号35を参照のこと)にある2つの推定のκB結合エレメントを保持するにもかかわらず、RelAに応答しなかったことに注目すべきである。ともに、これら知見は、マウスgadd45βプロモーター中の関係あるNF−κB/RelA応答性エレメントが、位置−592と+23との間に存在することを示す。それらはまた、第1番目のエキソンに含まれたκB部位、および遠位κB部位が、NF−κBによるgadd45βの調節には有意に寄与し得ないことを意味している。同様の結論が、NF−κBがPMAプラスイオノマイシン処置によって活性化されたJurkat細胞またはHeLa細胞を採用する実験で得られた。
図8に示されるように、gadd45βプロモーターの上記−592/+23領域は、3つの保存されたκB結合部位、すなわち、κB1、κB2、およびκB3を含んでいる。これらκBエレメントの機能的重要性を試験するために、これら部位の各々を、RelAによりトランス活性化され得る最小プロモーター領域を含んでいた−592/+23−gadd45β−CAT(図10A)の情況で変異させた。変異体リポーター構築物を、単独でかまたは増加する量のPMT2T−RelAとともに、NTera−2細胞中にトランスフェクトし、そしてCAT活性を、図9Bに関して記載したように測定した。図10Bに示されるように、各κB部位の欠失は、RelAが−592/+23−gadd45β−CAT構築物をトランス活性化する能力を顕著にそこなわせ、最も劇的な影響は、κB1の変異で観察され、CAT活性の約70%阻害を生じた(−592/+23−gadd45β−CATおよびκB−1M−gadd45β−CATを比較のこと)。興味深いことに、κB1およびκB2の同時変異は、最高量のトランスフェクトされたRelAプラスミドの存在下で、CAT誘導を約90%損なった(図10B)(κB−1/2M−gadd45β−CATを参照のこと)。劇的な影響はまた、RelAのインプットレベルを1μgまたは0.3μgまで減少したときに観察された(野生型プロモーターに比較して、それぞれ、約8倍の減少および約5倍の減少)。後者の変異体構築物で観察された残存CAT活性は、インタクトなκB3部位の存在に起因する可能性が高かった。質的に類似の結果が、RelAプラスp50、またはRel発現構築物のトランスフェクションで観察された。gadd45βプロモーターは、3つの機能的κBエレメントをその近位領域中に含み、しかも各々が、NF−κBの最適転写活性化に必要であることが結論付けられた。
これらの部位が、NF−κB依存性転写を駆動するに十分であったか否かを決定するために、CAT遺伝子の発現を駆動するために、Δ56−CAT中に、1コピーのgadd45β−κB部位または変異した部位がそれぞれクローン化されたリポーター構築物、Δ56−κB−1/2−CAT、Δ56−κB−3−CAT、およびΔ56−κB−M−CATを構築した(図11)。各Δ56−CAT構築物を、次に、単独または増加する量のRelA発現プラスミドと組合せNetra2細胞中のトランスフェクトし、そして前のようにCAT活性を測定した。図11に示されるように、κB−1プラスκB−2、またはκB−3いずれかの存在は、RelAに対するΔ56−CATの応答性を劇的に増大した。1つより、2つのκB部位を宿すという事実から予期され得たように、Δ56−κB−1/2−CATは、κB3より効率的に、特に最高量のpMT2T−RelAで誘導された。有意にもかかわらず、低いRelA−依存性CAT活性もまた、Δ56−κB−M−CAT、および空のΔ56−CATベクターで注目され、Δ56−CATが潜在的なκB部位を含むことを示唆した(図11)。これ故、κB−1プラスκB−2、またはκB−3いずれかのシスに作用するエレメントは、NF−κBに対するプロモーター応答性を与えるに十分である。
(実施例11:κB−1、κB−2、およびκB−3エレメントは、インビトロでNF−κBに結合する)
gadd45βプロモーター中のκBエレメントのNFκB複合体と相互作用する能力を評価するために、EMSAを実施した。κB−1、κB−2、またはκB−3の配列を含むオリゴヌクレオチドを、放射能標識し、そして操作前にpMT2T−p50、pMT2T−p50プラスpMT2T−RelA、または空のpMT2TプラスミドでトランスフェクトしたNTera−2細胞の抽出物と独立にインキュベートし、そしてDNA結合複合体をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した(図12A)。各κBプローブの、p50のみを発現する細胞からの種々の量の抽出物とのインキュベーションが、p50ホモダイマーと同時移動する単一のDNA結合複合体を生じた(図12A、レーン1〜3、5〜7、および9〜11)。逆に、p50およびRelAの両方を発現する細胞からの抽出物は、2つの特異的バンド:1つはp50/p50ダイマーと同じ移動度を示し、そして他方はp50/RelAヘテロダイマーと同時移動する(レーン4、8、および12)を生じた。モックトランスフェクトNTera2細胞からの抽出物は、EMSA中に任意の特異的シグナルを生じなかった(図12B)。各複合体の特異性は競争アッセイによって確認し、そこでは、放射能標識プローブに加え、抽出物を、50倍過剰の野生型または変異した冷κBプローブとインキュベートした。従って、gadd45βプロモーター中の機能的に関連するκBエレメントの各々は、インビトロでNF−κB複合体に結合し得る。
gadd45βプロモーター中のκBエレメントのNFκB複合体と相互作用する能力を評価するために、EMSAを実施した。κB−1、κB−2、またはκB−3の配列を含むオリゴヌクレオチドを、放射能標識し、そして操作前にpMT2T−p50、pMT2T−p50プラスpMT2T−RelA、または空のpMT2TプラスミドでトランスフェクトしたNTera−2細胞の抽出物と独立にインキュベートし、そしてDNA結合複合体をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した(図12A)。各κBプローブの、p50のみを発現する細胞からの種々の量の抽出物とのインキュベーションが、p50ホモダイマーと同時移動する単一のDNA結合複合体を生じた(図12A、レーン1〜3、5〜7、および9〜11)。逆に、p50およびRelAの両方を発現する細胞からの抽出物は、2つの特異的バンド:1つはp50/p50ダイマーと同じ移動度を示し、そして他方はp50/RelAヘテロダイマーと同時移動する(レーン4、8、および12)を生じた。モックトランスフェクトNTera2細胞からの抽出物は、EMSA中に任意の特異的シグナルを生じなかった(図12B)。各複合体の特異性は競争アッセイによって確認し、そこでは、放射能標識プローブに加え、抽出物を、50倍過剰の野生型または変異した冷κBプローブとインキュベートした。従って、gadd45βプロモーター中の機能的に関連するκBエレメントの各々は、インビトロでNF−κB複合体に結合し得る。
DNA結合複合体の組成を確認するために、スーパーシフトアッセイを、細胞抽出物を、ヒトp50またはRelAに対して惹起されたポリクローナル抗体とインキュベートすることにより実施した。抗p50抗体は、p50発現細胞の抽出物で観察された特異的複合体(図12B、レーン5、14、および23)、ならびにp50およびRelAの両方を発現する細胞の抽出物で検出された2つの複合体(レーン8、17、および26)を完全にスーパーシフトした。逆に、RelAのみに対して惹起された抗体は、p50とRelAの同時発現に際し観察されたより遅い複合体の移動を遅くし(レーン9、18、27)、そしてより速いDNA結合複合体の移動度に影響しなかった(レーン6、9、15、18、24、および27)。
gadd45β−κB部位は、NF−κB複合体に対して見かけ上別個の、インビトロ結合親和性を示した。実際、p50/RelAヘテロダイマーで、κB−2およびκB−3は、κB−1と比較したとき、有意により強いシグナルを生じた(図12B)。逆に、κB−2は、p50ホモダイマーと最も強いシグナルを生じ、その一方、κB−3は、この複合体とインビトロで最も不十分に会合しているようであった(図12B)。ゲル上で可視化されたp50/p50複合体およびp50/RelA複合体の量から判断すると、抗体(得に抗RelA抗体)の存在は、NF−κB−DNA相互作用を安定化したようであった(図12B)。いずれの抗体も、細胞抽出物の不在下で放射能標識プローブとインキュベートしたときバンドを生じなかった。スーパーシフトされたバンドの特異性は、非標識コンペティターオリゴヌクレオチドとの競合的結合反応によりさらに証明された。従って、移動度パターンと一致して(図14A)、より速い複合体は、主にp50ホモダイマーから構成され、その一方、より遅い複合体は、主にp50/RelAヘテロダイマーから構成されている。これらのデータは、CATアッセイで得たデータと一致しており、そしてgadd45βプロモーターの関連するκBエレメントの各々は、p50/p50およびp50/RelA、NFκB複合体にインビトロで特異的に結合し得、それによってgadd45β発現のNF−κBに対する依存性の基礎を提供する。従って、gadd45βは、NFκBの新たな直接標的である。
(実施例12:JNKK2(MKK7としても知られる)−Gadd45β相互作用ドメイン)
JNK1/2/3は、細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK1/2)およびp38(α/β/γ/δ)カスケードをも含む、主要な分裂促進因子で活性化されるタンパク質キナーゼ(MAPK)カスケードの1つの下流成分である。MAPKは、MAPKキナーゼ(MAPKK)によって活性化され、これは、今度はMAPKKキナーゼ(MAPKKK)によって活性化される。JNKシグナル伝達のGadd45β制御の基礎を理解するために、Gadd45βがこれらカスケード中のキナーゼと生理的に相互作用し得るか否かを決定した。HAタグ化キナーゼを、293細胞において、単独またはFLAG−Gadd45βとともに一時的に発現させ、そして結合を、免疫沈降およびウェスタンブロットアッセイの組み合わせによって評価した。Gadd45βは、ASK1に結合したが、TNFαによるJNK活性化に必要な因子であるTRAF2と相互作用し得るその他のMAPKKKには結合しなかった(図26a、左)。それはまた、MEKK4/MTK1−MAPKKK(それに代わりTNFαによって誘導されない)と結合した。特に、Gadd45βは、MKK7/JNKK2と強く相互作用したが、その他のJNKキナーゼ、MKK4/JNKK1、p38特異的アクチベーターMKK3bおよびMKK6、またはERKキナーゼ、MEK−1、およびMAPKとは相互作用しなかった(図26a、中央および右、ならびに図26b)。Gadd45β相互作用は、インビトロで確認された。グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)ではなく、GST−Gadd45βは、MKK7インプットの大きな画分を沈殿させ(図26c)、その一方、それは、ASK1またはMEKK4の小さな画分のみを吸収した。これ故、Gadd45βは、JNK−誘導性キナーゼと、そして最も強くMKK7と相互作用する。
JNK1/2/3は、細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK1/2)およびp38(α/β/γ/δ)カスケードをも含む、主要な分裂促進因子で活性化されるタンパク質キナーゼ(MAPK)カスケードの1つの下流成分である。MAPKは、MAPKキナーゼ(MAPKK)によって活性化され、これは、今度はMAPKKキナーゼ(MAPKKK)によって活性化される。JNKシグナル伝達のGadd45β制御の基礎を理解するために、Gadd45βがこれらカスケード中のキナーゼと生理的に相互作用し得るか否かを決定した。HAタグ化キナーゼを、293細胞において、単独またはFLAG−Gadd45βとともに一時的に発現させ、そして結合を、免疫沈降およびウェスタンブロットアッセイの組み合わせによって評価した。Gadd45βは、ASK1に結合したが、TNFαによるJNK活性化に必要な因子であるTRAF2と相互作用し得るその他のMAPKKKには結合しなかった(図26a、左)。それはまた、MEKK4/MTK1−MAPKKK(それに代わりTNFαによって誘導されない)と結合した。特に、Gadd45βは、MKK7/JNKK2と強く相互作用したが、その他のJNKキナーゼ、MKK4/JNKK1、p38特異的アクチベーターMKK3bおよびMKK6、またはERKキナーゼ、MEK−1、およびMAPKとは相互作用しなかった(図26a、中央および右、ならびに図26b)。Gadd45β相互作用は、インビトロで確認された。グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)ではなく、GST−Gadd45βは、MKK7インプットの大きな画分を沈殿させ(図26c)、その一方、それは、ASK1またはMEKK4の小さな画分のみを吸収した。これ故、Gadd45βは、JNK−誘導性キナーゼと、そして最も強くMKK7と相互作用する。
別の疑問は、これらキナーゼとのGadd45β結合が、インビボで機能的結果を有したか否かであった。著しく、IκBαM−Hygro 3DOコントロールクローンではTNFαはMKK7を強く活性化したが、Gadd45βを発現するクローンでは、この活性化はなくなった(図27a)。Gadd45βが、TNFαまたはPMAプラスアイオノマイシンのいずれによっても、その他のMAPKK(すなわち、MKK4、MKK3/6、およびMEK1/2)の誘導に対して影響を有さなかった(P/I;それぞれ、図27bおよび図27c)ので、阻害は、特異的であった。ASK1およびMEKK1は、TNFαによって弱く活性化され、そしてこの活性化もまた、Gadd45βによって影響されなかった(図27b)。従って、Gadd45βは、TNFαによるMKK7リン酸化/活性の誘導を選択的にブロックした。
Gadd45βは、NF−κBによるJNKシグナル伝達の抑制を媒介する。実際、MKK7は、NF−κBによって阻害された(図27d)。その一方、コントロール3DOクローン(Neo)では、TNFαによるMKK7活性化は、40分で基底レベルに戻り−それによってJNK応答を映し−NF−κBヌルクローン(IκBαM)において、この活性化は持続されたままであった。MKK7ダウンレギュレーションは、NF−κBによるGadd45β誘導と関連した。さらに、NF−κBは、MKK4、MKK3/6、またはMEK1/2に影響せず(図27dおよび図27e)、それによってMAPKカスケードに対するGadd45βの影響を要約した。
内因性Gadd45βおよびMKK7の相互作用は、容易に検出された(図28a)。抗Gadd45βモノクローナル抗体は、P/I処理3DO細胞からMKK7を同時免疫沈澱し、これは、強いGadd45β発現を示したが(下の右)、非処理細胞ではそうではなく、検出可能なGadd45βを欠いていた。MKK7は、刺激細胞および非刺激細胞で匹敵するレベルで存在し(下の左)、そしてアイソタイプ合致コントロール抗体によって同時沈殿されなかった。この相互作用は、免疫沈澱について抗MKK7抗体、およびウェスタンブロットについて抗Gadd45βモノクローナル抗体を用いて確認した(図28a、上の右)。抗MEKK1抗体は、Gadd45βを同時沈殿できず、MKK7−Gadd45β結合の特異性をさらに示した。Gadd45βがMKK7に直接結合するか否かを決定するために、本発明者らは、精製されたタンパク質を用いた(図28b)。精製されたGST−MKK7またはGSTを、インビトロで増加する量の精製His6−Gadd45βまたはコントロールHis6−JIP1とインキュベートし、そしてGSTタンパク質に結合したHis6タグ化ポリペプチドの画分を、ウェスタンブロッティングにより可視化した。His6−Gadd45βは、GST−MKK7と特異的に結合し(図28c)、そしてこの結合は、生理学的なMKK7調節因子JIP1の結合より強固で、最大半減結合(HMB)値はGadd45βについて約390nMであり、そしてJIP1について650nMを超える(左;JIP1は、非飽和条件下で用いた)。内因性Gadd45βおよびMKK7は、直接的に、高親和性接触により結合するようである。
疑問は、Gadd45βがインビトロで活性MKK7を阻害したか否かであった。FLAG−MKK7を、TNFα−処置293細胞または非処置293細胞から免疫沈降し、そしてキナーゼアッセイを、精製His6−Gadd45β、GST−Gadd45β、またはコントロールタンパク質(図28d;図28gもまた参照のこと)の存在下で実施した。両方のGadd45βは、用量依存様式でMKK7によるGST−JNK1リン酸化をブロックしたが、GSTもHis6−EF3のいずれもブロックしなかった(図28d)。インビボの知見(図27)と一致して、Gadd45βの阻害活性は特異的であった。事実、高濃度でさえ、この因子は、MKK4、MKK3b、または−過剰発現でそれに結合するその能力にもかかわらず(図26a)−ASK1を妨害しなかった(図28e;図28f、総レベルもまた参照のこと)。これ故、Gadd45βは、MKK7の強力かつ特異的インヒビターであり、実際、Gadd45βのTNFαによるMKK7リン酸化に対する影響は、自動リン酸化するか、および/または上流キナーゼのための基質として供するMKK7の阻害に起因し得る。全体で、これら知見は、MKK7能力を、Gadd45βの標的として、およびJNKカスケード中のNF−κBの標的として同定する。重要なことは、MKK7は、JNKの選択的アクチベーターであり、そしてその消去はTNFαによるJNK活性化を廃止する。従って、MKK7のブロックは、JNKシグナル伝達に関するGadd45βの影響を説明するためにそれ自体−すなわち、このシグナル伝達のその特異的かつほぼ完全な抑制−で十分である。
Gadd45βのアミノ酸配列は、ホスファターゼの配列に類似ではなく、そして酵素活性を有することは知られていない。従って、キナーゼ不活性化の機構を理解するために、MKK7のGadd45β結合領域を、N末端短縮型MKK7ポリペプチドおよびC末端短縮型MKK7ポリペプチドのセットを用いてマップした(それぞれ、図29aおよび図29c)ヒトおよびマウスのMKK7またはJNKK2の完全長のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図31に示す。本明細書で用いられるとき、アミノ酸位置は、ヒトMKK7またはJNKK2のアミノ酸配列をいう。MKK7/63−401、MKK7/91−401、およびMKK7/132−401は、GST−Gadd45βに、特異的かつ完全長MKK7の親和性に匹敵する親和性で結合し、その一方、アミノ酸157と213との間に存在する変異は、GST−Gadd45βと弱く相互作用した(図29b)。残基232までおよびそれを超えて延びる領域の切除は、結合を廃した。C末端短縮型の分析は、残基141と161との間のGadd45β相互作用ドメインの存在を確認したが(図29d;MKK7/1−140とMKK7/1−161とを比較のこと)、上記で同定されたC末端結合領域を示すことはできず、Gadd45βが、この後者の領域とより弱く相互作用することを示唆した。これ故、MKK7は、残基132−161および213−231内に位置する2つの別個の領域(以後、それぞれ、領域AおよびBと称する)によりGadd45βと接触する。
相互作用領域を規定し、そしてそれらが結合のために十分であるかを決定するために、これら領域に亘る重複ペプチド(図29e)とのGadd45β結合を決定した。図29fに示されるように、領域AおよびBの両方は、MKK7の情況から単離されたときでさえ、GST−Gadd45βに結合し−そしてペプチド132−156および220−234(すなわち、それぞれペプチド1および7)は、この結合を再利用するために十分であった。両方のペプチドは、MKK7キナーゼドメイン内に存在し、そしてペプチド1は、触媒機能に必要なATP結合部位K149に広がり−Gadd45βが重要残基をマスクすることによりMKK7を不活性化することを示唆する。これは、p27KIP1がサイクリン依存性キナーゼ(CDK)2を阻害する機構の暗示である。調査された疑問は、MKK7、Gadd45β結合性ペプチドが、キナーゼ活性を抑制するGadd45β能力を妨害するか否かであった。実際、ペプチド1は、Gadd45βによるMKK7阻害を防いだが、その一方、ペプチド7またはコントロールペプチドは阻害しなかった(図30a)。それ故、Gadd45βによるキナーゼ不活性化は、領域Bではなく領域Aとの接触を必要とする。
これらのデータは、インビボのGadd45βによるMKK7不活性化を防ぐことが、TNFα誘導アポトーシスに対して細胞を感作することを予測する。この仮説を試験するために、MKK7模倣ペプチドを、細胞透過性、HIV−TATペプチドに融合し、そして細胞中に形質導入した。著しく、ペプチド1は、IκBαM−Gadd45β細胞のTNFα誘導殺傷に対する感受性を顕著に増大し、その一方、予期されたように、DMSO処理細胞は、この殺傷に対して抵抗性であった(図30b)。重要なことには、ペプチド1は、最低限の基底毒性を示し、これは、その影響がTNFα刺激に特異的であったことを示し、そしてペプチド7を含むその他のペプチドは、TNFαに対するアポトーシス応答に関して影響を有さなかった。MKK7はNF−κBの標的であるという概念と一致して、ペプチド1は、NF−κB習得細胞−これは、通常、この殺傷に抵抗性である−のTNFα誘導殺傷を促進した(Neo;図30c)。Gadd45β発現クローンで観察されるように、このペプチドは、非処理細胞では最小の毒性を示した。ともに、これらの知見は、Gadd45βが、MKK7を阻害することによりJNKカスケードを停止させ、そして原因として、Gadd45β保護活性をこの阻害にリンクすることを支持する。さらに、MKK7のブロックは、NF−κBによるアポトーシスの抑制における因子であり、そしてこのブロックは、少なくとも一部、Gadd45βの誘導により媒介される。
Gadd45βによるJNKシグナル伝達の制御のための機構が同定された。MKK7と強固に結合したGadd45βは、触媒ドメイン中の重要な残基と接触することによりその酵素活性を阻害し、そしてこの阻害は、TNFα誘導アポトーシスのその抑制
おける因子である。その他のキナーゼとの相互作用は、TNFαによるJNK活性化およびPCDのGadd45β制御に関係あるようには見えない。なぜなら、MEKK4はTNF−Rシグナル伝達には関与せず、そしてASK1は、Gadd45βによって明らかに影響されないからである。実際、MKK7へのGadd45β結合を妨害するペプチドは、TNFαに対するGadd45β保護活性を鈍くする(図30aおよび図30b)。MKK7の標的化は、NF−κBによるアポトーシスの抑制における因子である。NF−κB欠乏細胞は、TNFαによるMKK7誘導をダウンレギュレートできず、そしてMKK7模倣ペプチドは、NF−κBのサイトカイン誘導殺傷をブロックする能力を妨げ得る(図30c)。これらの結果は、NF−κB活性化がGadd45βの転写を誘導し、これは次にMKK7を阻害し、JNKシグナル伝達の抑制し、そして最終的には、TNFαによって引き起こされるアポトーシスを導くというモデルと一致するように見える。
おける因子である。その他のキナーゼとの相互作用は、TNFαによるJNK活性化およびPCDのGadd45β制御に関係あるようには見えない。なぜなら、MEKK4はTNF−Rシグナル伝達には関与せず、そしてASK1は、Gadd45βによって明らかに影響されないからである。実際、MKK7へのGadd45β結合を妨害するペプチドは、TNFαに対するGadd45β保護活性を鈍くする(図30aおよび図30b)。MKK7の標的化は、NF−κBによるアポトーシスの抑制における因子である。NF−κB欠乏細胞は、TNFαによるMKK7誘導をダウンレギュレートできず、そしてMKK7模倣ペプチドは、NF−κBのサイトカイン誘導殺傷をブロックする能力を妨げ得る(図30c)。これらの結果は、NF−κB活性化がGadd45βの転写を誘導し、これは次にMKK7を阻害し、JNKシグナル伝達の抑制し、そして最終的には、TNFαによって引き起こされるアポトーシスを導くというモデルと一致するように見える。
慢性関節リウマチおよび炎症性腸疾患のような慢性の炎症性状態は、TNFαおよびNF−κBの相互活性化により生成されるポジティブフィードバックループによって駆動される。さらに、いくつかの悪性腫瘍は、それらの生存−JNKシグナル伝達の抑制を含み得るプロセス−のためにNF−κBに依存している。これらの結果は、NF−κBのMKK7をシャットダウンする能力のブロックが、自己反応性/炎症促進性細胞(pro−inflammatory cell)、そして、恐らく、癌細胞のアポトーシスを促進し得ることを示唆し、それによって、MKK7−Gadd45β相互作用を、潜在的な治療標的として同定する。興味深いことに、MKK7へのGadd45β結合を中断する薬理学的化合物は、NF−κBの抗アポトーシスおよび炎症促進性機能と連関せず、そして、それで、現在これらの病気を処置するために用いられている全体的なNF−κBブロッカーで観察される強力な免疫抑制副作用を回避する。NF−κB習得細胞におけるMKK7ペプチドのプロアポトーシス活性は、たとえ、NF−κBがさらなるMKK7インヒビターを誘導したとしても、これらのインヒビターは、そのGadd45β−結合表面を通じてMKK7を標的にし得、それによって、原則的にこの治療アプローチの有効性を提供することを意味する。
(実施例13:インビボのGadd45βによるMKK7不活性化は、細胞をTNFα誘導アポトーシス感受性にする)
NF−κB/Rel転写因子は、アポトーシスまたはプログラム細胞死(PCD)を調節し、そしてこの調節は、発癌、癌の化学抵抗性、および腫瘍壊死因子(TNF)α誘導殺傷と拮抗するという役割を演じている。TNFα誘導に際し、NF−κBの抗アポトーシス活性は、c−Jun−N−末端キナーゼ(JNK)カスケードを抑制することを含む。Gadd45ファミリーの誘導性因子のメンバーであるGadd45β/Myd118は、NF−κBのこの抑制性活性で重要な役割を演じている。しかし、Gadd45βがJNKシグナル伝達を鈍くする機構は、理解されていない。MKK7/JNKK2は、JNKシグナル伝達の特異的かつ必須のアクチベーターとして、およびGadd45βそしてまたNF−κBそれ自体の標的として同定される。Gadd45βは、MKK7に直接結合し、そしてその触媒活性をブロックし、それによって、NF−κBとJNK経路との間の分子リンクを提供する。Gadd45βはTNFα誘導細胞傷害性と拮抗するために必要であり、そしてGadd45β/MKK7相互作用を中断するペプチドは、Gadd45βおよびNF−κBの能力を-妨害し、この細胞傷害性を抑制する。これらの結果は、JNK活性化のNF−κB制御の基礎を確立し、そしてMKK7を、抗炎症治療および抗癌治療のための潜在的な標的として同定する。
NF−κB/Rel転写因子は、アポトーシスまたはプログラム細胞死(PCD)を調節し、そしてこの調節は、発癌、癌の化学抵抗性、および腫瘍壊死因子(TNF)α誘導殺傷と拮抗するという役割を演じている。TNFα誘導に際し、NF−κBの抗アポトーシス活性は、c−Jun−N−末端キナーゼ(JNK)カスケードを抑制することを含む。Gadd45ファミリーの誘導性因子のメンバーであるGadd45β/Myd118は、NF−κBのこの抑制性活性で重要な役割を演じている。しかし、Gadd45βがJNKシグナル伝達を鈍くする機構は、理解されていない。MKK7/JNKK2は、JNKシグナル伝達の特異的かつ必須のアクチベーターとして、およびGadd45βそしてまたNF−κBそれ自体の標的として同定される。Gadd45βは、MKK7に直接結合し、そしてその触媒活性をブロックし、それによって、NF−κBとJNK経路との間の分子リンクを提供する。Gadd45βはTNFα誘導細胞傷害性と拮抗するために必要であり、そしてGadd45β/MKK7相互作用を中断するペプチドは、Gadd45βおよびNF−κBの能力を-妨害し、この細胞傷害性を抑制する。これらの結果は、JNK活性化のNF−κB制御の基礎を確立し、そしてMKK7を、抗炎症治療および抗癌治療のための潜在的な標的として同定する。
これらのデータは、Gadd45βによりMKK7不活性化を防ぐことが、インビボでのTNFα誘導性アポトーシスに細胞を感受性にすることを予見する。MKK7模倣ペプチドを、細胞透過性HIV−TATペプチドに融合し、そして細胞中に形質導入した。フローサイトメトリー(FCM)および共焦点顕微鏡によって示されるように、ペプチドは、相当する効率で細胞に侵入した(図34a〜d)。ペプチド1は、IκBαM−Gadd45β細胞のTNFα誘導殺傷に対する感受性を顕著に増加したが、予期されるように、DMSO処置細胞はこの殺傷に対して抵抗性であった(図33a、左;)。ペプチド1は、最低限の基底細胞傷害性を示し、これはその影響が、TNFα刺激に特異的であったことを示し、そしてペプチド7を含むその他のペプチドは、TNFαに対するアポトーシス応答に関して影響を有さなかった。さらに、ペプチド1のインビボでの影響を、Gadd45β、Ala変異体ペプチドのプロアポトーシス活性にリンクさせることは、インビトロでのGadd45βに対するそれらの見かけの結合親和性と関連していた(図32dおよび33a、右)。MKK7はNF−κBの標的であるという概念と一致して、ペプチド1は、NF−κB習得細胞−これは、通常、この殺傷に抵抗性である−におけるTNFα誘導殺傷を促進した(Neo;図33b)。Gadd45β発現クローンで観察されたように、このペプチドは、非処理細胞で最小の細胞傷害性を示し、そしてGadd45βとの相互作用に必要な残基の変異は、TNFα細胞傷害性に対するその影響をなくした(図33b、右)。ともに、これらの知見は、Gadd45βがJNKカスケードを、MKK7を阻害することにより停止し、そして原因であるGadd45β保護活性をこの阻害にリンクさせることを実証する。さらに、MKK7のブロックは、NF−κBによるアポトーシスの抑制にとって重要であり、そしてこのブロックは、少なくとも一部分Gadd45βの誘導により媒介される。
慢性関節リウマチおよび炎症性腸疾患のような慢性の炎症性状態は、TNFαおよびNF−κBの相互活性化により生成されるポジティブフィードバックループによって駆動される。さらに、いくつかの悪性腫瘍は、それらの生存−JNKシグナル伝達の抑制を含み得るプロセス−のためにNF−κBに依存している。これらの結果は、NF−κBのMKK7をシャットダウンする能力のブロックが、自己反応性/炎症促進性細胞、そして、恐らく、癌細胞のアポトーシスを促進し得ることを示唆し、それによって、MKK7−Gadd45β相互作用を、潜在的な治療標的として同定する。MKK7へのGadd45β結合を中断する薬理学的化合物は、NF−κBの抗アポトーシスおよび炎症促進性機能と連関せず、そして、それで、現在これらの病気を処置するために用いられている全体的なNF−κBブロッカーで観察される強力な免疫抑制副作用を回避する。NF−κB習得細胞におけるMKK7ペプチドのプロアポトーシス活性は、重要なNF−κB誘導性インヒビターが、そのGadd45β−結合表面またはその近傍を通じてMKK7を標的にし得、それによって、原則的にこの治療アプローチの有効性を提供することを示す。
(実施例14:JNKK2活性の細胞特異的調節)
マウス胚性線維芽細胞(MEF)において、Gadd45β切除は、TNFα誘導性PCDに影響を及ぼさないことが報告された。MKK7由来ペプチドの効果を、これらの細胞において試験した。驚くべきことに、野生型線維芽細胞において、サイトカイン誘導性毒性は、ペプチド1およびペプチド2の両方によって劇的に増強されたのに対して、他のペプチドでの処置は、この毒性に影響なかった(図33c)。このことは、3DOリンパ球細胞において見られることと一致し、ここでペプチド1のみが、TNFαによる殺傷を促進した(図33b)。ペプチド2は、Gadd45βに結合しない(図32bおよびd)ので、そのアポトーシス促進活性は、さらなる阻害性因子のMKK7からの置換に起因するようである。ペプチド2(MKK7/JNKK2のaa142〜166)は、アミノ酸配列NH2−TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHを有し、そのTAT融合バージョンは、アミノ酸配列NH2−GRKKRRQRRRPPTGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHを有する。MKK7由来ペプチド2は、(a)乳癌細胞(細胞死が、形態的基準によってスコア付けされる)における殺傷を誘導する、および(b)細胞死がELISAベースの方法によってスコア付けされる、Gadd45βノックアウトマウスにおけるTNFα誘導性アポトーシスを促進する。
マウス胚性線維芽細胞(MEF)において、Gadd45β切除は、TNFα誘導性PCDに影響を及ぼさないことが報告された。MKK7由来ペプチドの効果を、これらの細胞において試験した。驚くべきことに、野生型線維芽細胞において、サイトカイン誘導性毒性は、ペプチド1およびペプチド2の両方によって劇的に増強されたのに対して、他のペプチドでの処置は、この毒性に影響なかった(図33c)。このことは、3DOリンパ球細胞において見られることと一致し、ここでペプチド1のみが、TNFαによる殺傷を促進した(図33b)。ペプチド2は、Gadd45βに結合しない(図32bおよびd)ので、そのアポトーシス促進活性は、さらなる阻害性因子のMKK7からの置換に起因するようである。ペプチド2(MKK7/JNKK2のaa142〜166)は、アミノ酸配列NH2−TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHを有し、そのTAT融合バージョンは、アミノ酸配列NH2−GRKKRRQRRRPPTGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHを有する。MKK7由来ペプチド2は、(a)乳癌細胞(細胞死が、形態的基準によってスコア付けされる)における殺傷を誘導する、および(b)細胞死がELISAベースの方法によってスコア付けされる、Gadd45βノックアウトマウスにおけるTNFα誘導性アポトーシスを促進する。
この考えと一致して、ペプチド2のアポトーシス促進活性は、gadd45β−/− MEF(図33d)において保持される(および、実際に、増強される)。しかし、顕著には、Gadd45β切除は、これらの細胞をペプチド1の細胞傷害性効果に対して完全に鈍感にした。このことは、野生型線維芽細胞において、これらの効果が、Gadd45β不活性化に起因することを示す。まとめると、これらの結果は、TNFαに応答して活性化したMKK7阻害性機構が、組織特異的であること(3DO細胞および線維芽細胞におけるMKK7ペプチドの異なる効果によって示される;図33b〜d)、および少なくともMEFにおいて、この機構が、機能的に過剰であることを実証する。これらはまた、Gadd45βが、TNFα誘導性殺傷をアンタゴナイズするために必要である(図33c)という説得力のある証拠を提供する。gadd45β−/−線維芽細胞において以前に報告されたアポトーシス性表現型の明らかな欠如は、補完的機構(ペプチド1による急性Gadd45β不活性化の間に上昇することができない機構)の活性化に起因するようである。
従って、特定の細胞型(例えば、線維芽細胞)において、JNKキナーゼ、MKK7/JNKK2を結合および阻害する、Gadd45β以外の因子が存在する。Gadd45βと同様に、これらの因子は、腫瘍壊死因子−レセプター(TNF−R)ファミリー(例えば、TNF−R1およびFas)のレセプターによって誘発される、プログラムされた細胞死またはアポトーシスの強力なインヒビターである。Gadd45βと同様に、これらの因子の生存促進活性は、MKK7の直接の標的化、およびINKカスケードの結果として生じる阻害によって媒介される。これらの因子の発現は、NF−κB(免疫および炎症性応答を調整し、そしておよび細胞生存を制御し、腫瘍形成および癌化学療法抵抗性において重要な役割を果たす転写因子のファミリー)によって調節され得る。NF−κBインヒビターは、慢性炎症状態(例えば、慢性関節リウマチおよび炎症性腸疾患)ならびに特定の悪性疾患(例えば、ホジキンリンパ腫および多発性骨髄腫)を処置するために使用される。しかし、これらのインヒビター(例えば、グルココルチコイド)は、NF−κBの部分的阻害を達成するのみであり得、ヒトにおけるそれらの使用を制限するかなりの副作用を示す。従って、これらの疾患の処置において、NF−κB標的化薬剤よりむしろ、NF−κBの下流の抗アポトーシス性エフェクターをブロックする目的で治療剤を使用することは有益である。結果は、Gadd45βに加えて、MKK7を阻害することによって作用する他の治療標的が存在することを示す。
(材料および方法)
(1.ライブラリー調製および富化)
cDNAを、TNFα処理NIH−3T3細胞から調製し、pLTPベクター(Vitoら,1996)に特定の方向に導入した。富化するために、RelA−/−細胞を、100mmプレート中に1.5×106/プレートにて播種し、24時間後に、スフェロプラスト融合法によるトランスフェクションのために使用した。計4.5×106ライブラリークローンを、最初のサイクルでトランスフェクトした。TNFα(100ユニット/ml)およびCHX(0.25μg/ml)で21時間処理した後、エピソームDNAの抽出のために接着性細胞を採取し、増幅後のエピソームDNAの抽出のために10mM EDTA、0.6% SDS中に溶解し、ライブラリーを、次のサイクルの選択のために使用した。計4サイクルを行った。
(1.ライブラリー調製および富化)
cDNAを、TNFα処理NIH−3T3細胞から調製し、pLTPベクター(Vitoら,1996)に特定の方向に導入した。富化するために、RelA−/−細胞を、100mmプレート中に1.5×106/プレートにて播種し、24時間後に、スフェロプラスト融合法によるトランスフェクションのために使用した。計4.5×106ライブラリークローンを、最初のサイクルでトランスフェクトした。TNFα(100ユニット/ml)およびCHX(0.25μg/ml)で21時間処理した後、エピソームDNAの抽出のために接着性細胞を採取し、増幅後のエピソームDNAの抽出のために10mM EDTA、0.6% SDS中に溶解し、ライブラリーを、次のサイクルの選択のために使用した。計4サイクルを行った。
(2.構築物)
IκBαMを、pCMX−IκBαM(Van Antwerpら,1996)から切り出し、pcDNA3−Neo(Invitrogen)のEcoRI部位に連結した。全長ヒトRelAを、BS−RelA(Franzosoら,1992)からPCR増幅し、pEGFP−C1(Clontech)のBamHI部位に挿入した。Gadd45β、Gadd45αおよびGadd45γのcDNAを、pLTPライブラリーに対してPCRにより増幅し、両方の方向において、XhoI部位およびpcDNA 3.1−Hygro(Invitrogen)にクローニングした。pEGFP−Gadd45βを生成するために、Gadd45βを、pCDNA−HygroからXhoI−XbaIで切り出し、リンカー5’−CTAGAGGAACGCGGAAGTGGTGGAAGTGGTGGA3’(配列番号13)を用いて、pEGFP−N1のXbaI−BamHI部位に連結した。pcDNA−Gadd45αを、EcoRI−XhoIで消化し、XhoI−BamHIで開いたpEGFP−Clおよびリンカー5’−GTACAAGGGAAGTGGTGGAAGTGTGGAATGACTTTGGAGG−3’(配列番号14)に連結した。pEGFP−N1−Gadd45γを、pCDNA−Hygro−Gadd45γのBspEI−XhoIフラグメントを、アダプター5’−ATTGCGTGGCCAGGATACAGTT−3’(配列番号15)とともに、pEGFP−C1−Gadd45αへと導入することによって生成した。ここでGadd45αを、EcoRI−SalIによって切り出した。全ての構築物を、配列決定によりチェックした。DN−JNKK1(S257A,T261A)、DN−JNKK2(K149M、S271A、T275A)およびMKK3bDN(S128A、T222A)を発現するpSRα3プラスミドは、以前に記載した(Linら,1995;Huangら,1997)。
IκBαMを、pCMX−IκBαM(Van Antwerpら,1996)から切り出し、pcDNA3−Neo(Invitrogen)のEcoRI部位に連結した。全長ヒトRelAを、BS−RelA(Franzosoら,1992)からPCR増幅し、pEGFP−C1(Clontech)のBamHI部位に挿入した。Gadd45β、Gadd45αおよびGadd45γのcDNAを、pLTPライブラリーに対してPCRにより増幅し、両方の方向において、XhoI部位およびpcDNA 3.1−Hygro(Invitrogen)にクローニングした。pEGFP−Gadd45βを生成するために、Gadd45βを、pCDNA−HygroからXhoI−XbaIで切り出し、リンカー5’−CTAGAGGAACGCGGAAGTGGTGGAAGTGGTGGA3’(配列番号13)を用いて、pEGFP−N1のXbaI−BamHI部位に連結した。pcDNA−Gadd45αを、EcoRI−XhoIで消化し、XhoI−BamHIで開いたpEGFP−Clおよびリンカー5’−GTACAAGGGAAGTGGTGGAAGTGTGGAATGACTTTGGAGG−3’(配列番号14)に連結した。pEGFP−N1−Gadd45γを、pCDNA−Hygro−Gadd45γのBspEI−XhoIフラグメントを、アダプター5’−ATTGCGTGGCCAGGATACAGTT−3’(配列番号15)とともに、pEGFP−C1−Gadd45αへと導入することによって生成した。ここでGadd45αを、EcoRI−SalIによって切り出した。全ての構築物を、配列決定によりチェックした。DN−JNKK1(S257A,T261A)、DN−JNKK2(K149M、S271A、T275A)およびMKK3bDN(S128A、T222A)を発現するpSRα3プラスミドは、以前に記載した(Linら,1995;Huangら,1997)。
(3.gadd45βのアンチセンス構築物)
Gadd45βのようなJNK経路の調節因子は、個々の機能的ポリペプチドをコードするRNA転写物に直接影響する分子によって調整され得る。アンチセンスおよびリボザイム分子は、このようなインヒビターの例であり、それは、Gadd45配列またはそのフラグメント(配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9または配列番号11)のような特定のポリペプチドの減少、排除または阻害を達成するために特定の配列を標的にする。
Gadd45βのようなJNK経路の調節因子は、個々の機能的ポリペプチドをコードするRNA転写物に直接影響する分子によって調整され得る。アンチセンスおよびリボザイム分子は、このようなインヒビターの例であり、それは、Gadd45配列またはそのフラグメント(配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9または配列番号11)のような特定のポリペプチドの減少、排除または阻害を達成するために特定の配列を標的にする。
アンチセンスの方法論は、核酸が「相補的」配列と対合する傾向にあるという事実を利用している。アンチセンス構築物は、例えば、JNK経路を調整するために本発明の一部分を特異的に形成する。本発明の1つの実施形態では、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11および配列番号35〜41の核酸配列、ならびにそれらのフラグメントの部分をアンチセンス方向で含むアンチセンス構築物を含む、Gadd45核酸を含むアンチセンス構築物が想定される。
相補性によって、それは、ポリヌクレオチドが、標準的なワトソン−クリック相補性規則に従って、塩基対合し得るポリヌクレオチドであることを意味する。すなわち、より大きなプリンがより小さなピリミジンと塩基対合し、シトシンと対合したグアニン(G:C)、およびDNAの場合、チミンと対合したアデニン(A:T)、またはRNAの場合ウラシルと対合したアデニン(A:U)の組合せを形成する。イノシン、5−メチルシトシン、6−メチルアデニン、ヒポキサンチンおよびその他のようなより一般的でない塩基をハイブリダイズ配列中に含むことは、対合を妨害しない。
ポリヌクレオチドで二本鎖(ds)DNAを標的にすることは、三重鎖形成に至る:RNAを標的にすることは、二重らせん形成に至る。アンチセンスポリヌクレオチドは、標的細胞中に導入されるとき、それらの標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、そして転写、RNAプロセッシング、トランスポート、翻訳および/または安定性を妨害する。アンチセンスRNA構築物、またはこのようなアンチセンスRNAをコードするDNAは、インビトロ、またはヒト被験体を含む宿主動物内のようなインビボいずれかで、宿主細胞内で、遺伝子転写または翻訳の両方を阻害するために採用され得る。
合成のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス構築物は、プロモーターおよびその他の制御領域、遺伝子のエキソン、イントロンまたはエキソン−イントロン境界でさえに結合するように設計され得る。大部分の有効なアンチセンス構築物が、イントロン/エキソンスプライス接続部に相補的な領域を含み得ることが企図される。従って、イントロン−エキソンスプライス接続部の50〜200塩基内の領域に相補性をもつアンチセンス構築物が用いられ得る。いくつかのエキソン配列が、その標的選択性に重篤に影響することなくこの構築物中に含まれ得ることが観察されている。含まれるエキソン性物質の量は、用いられる特定のエキソン配列およびイントロン配列に依存して変動する。含まれるエキソンDNAが多すぎるか否かは、インビトロで構築物を、正常な細胞機能が影響されるか否か、または相補的配列を有する関連する遺伝子の発現が影響されるか否かを決定することにより容易に試験し得る。
ゲノムDNAの部分を、cDNAまたは合成配列と組合せ、特異的構築物を生成することは有利であり得る。例えば、最終的な構築物中にイントロンが望まれる場合、ゲノムクローンを用いる必要がある。cDNAまたは合成ポリヌクレオチドは、構築物の残りの部分にためのより便利な制限部位を提供し得、そしてそれ故、残りの配列についても用いられ得る。
(4.細胞株、トランスフェクションおよび処置)
MEFおよび3DO細胞を、10%ウシ胎児血清を補填したDMEMおよびRPMIでそれぞれ培養した。RelA−/−MEF中の一時的トランスフェクションは、製造業者(Qiagen)の指示書に従ってSuperfectにより実施した。CHX(Sigma)プラスまたはマイナスTNFα(Peprotech)での細胞傷害性処置の後、接着性細胞を計数し、そしてFCM(FACSort、Becton Dickinson)により分析し、生存GFP+細胞の数を評価した。3DO安定株を生成するために、トランスフェクションを、エレクトロポーレーション(BTX)により実施し、そしてクローンをGeneticin(Gibco)および/またはHygromycin(Invitrogen)を含む適切な選択培地で増殖させた。アポトーシスの評価のために、2DO細胞をPI(Sigma)で染色し、そして先に記載のように(Nicolettiら、1991)、FCMによって分析した。Daunorubicin、PMA、Ionoymcin、過酸化水素、およびソルビトールはSigmaから入手し;Cisplatin(platinol AQ)はVHAplusからであり、そしてPD98059およびSB202190は、Calbiochemからであった。
MEFおよび3DO細胞を、10%ウシ胎児血清を補填したDMEMおよびRPMIでそれぞれ培養した。RelA−/−MEF中の一時的トランスフェクションは、製造業者(Qiagen)の指示書に従ってSuperfectにより実施した。CHX(Sigma)プラスまたはマイナスTNFα(Peprotech)での細胞傷害性処置の後、接着性細胞を計数し、そしてFCM(FACSort、Becton Dickinson)により分析し、生存GFP+細胞の数を評価した。3DO安定株を生成するために、トランスフェクションを、エレクトロポーレーション(BTX)により実施し、そしてクローンをGeneticin(Gibco)および/またはHygromycin(Invitrogen)を含む適切な選択培地で増殖させた。アポトーシスの評価のために、2DO細胞をPI(Sigma)で染色し、そして先に記載のように(Nicolettiら、1991)、FCMによって分析した。Daunorubicin、PMA、Ionoymcin、過酸化水素、およびソルビトールはSigmaから入手し;Cisplatin(platinol AQ)はVHAplusからであり、そしてPD98059およびSB202190は、Calbiochemからであった。
(5.ノザンブロット、ウェスタンブロット、EMSA、およびキナーゼアッセイ)
ノザンブロットは、6μgの総RNAを用いる標準的手順によって実施した。パリンドロームプローブを用いるEMSAおよび総細胞抽出物の調製は、先に記載のようであった(Franzosoら、1992)。ウェスタンブロットには、細胞抽出物は、改変溶解緩衝液(50mM Tris、pH7.4、100mM NaCl、50mM NaF、1mM NaBO4、30mM ピロリン酸、0.5%NP−40、およびプロテアーゼインヒビター(図1B;Boehringer Mannheim)、Triton X−100緩衝液中(図4A;Medemaら、1997)または1%NP−40、350mM NaCl、20mM HEPES(pH8.0)、20%グリセロール、1mM MgCl2、0.1mM EGTA、0.5mM DTT、1mM Na3VO4、50mM NaFおよびプロテアーゼインヒビターを含む溶解緩衝液中いずれかで調製した。各回で、等量のタンパク質(15〜50μgの範囲)をロードし、そしてウェスタンブロットを、標準的な手順に従って調製した。反応は、ECL(Amersham)によって可視化した。抗体は以下のようであった:IκBα、Bid、およびβアクチンはSanta Cruz Biotechnolgyから;カスパーゼ6、カスパーゼ7およびカスパーゼ9、ホスホ−p38および総−p38、ホスホ−ERKおよび総−ERK、ホスホ−JNKおよび総−JNKは、Cell Signaling Technologyから;カスパーゼ−8はAlexisから;カスパーゼ2およびカスパーゼ3はR&D systemsからであった。Gadd45β特異的抗体は、N末端ペプチドに対して生成された。キナーゼアッセイは、組換えGST−c−jun抗体および抗−JNK抗体(Pharmingen)、(Linら、1995)で実施した。
ノザンブロットは、6μgの総RNAを用いる標準的手順によって実施した。パリンドロームプローブを用いるEMSAおよび総細胞抽出物の調製は、先に記載のようであった(Franzosoら、1992)。ウェスタンブロットには、細胞抽出物は、改変溶解緩衝液(50mM Tris、pH7.4、100mM NaCl、50mM NaF、1mM NaBO4、30mM ピロリン酸、0.5%NP−40、およびプロテアーゼインヒビター(図1B;Boehringer Mannheim)、Triton X−100緩衝液中(図4A;Medemaら、1997)または1%NP−40、350mM NaCl、20mM HEPES(pH8.0)、20%グリセロール、1mM MgCl2、0.1mM EGTA、0.5mM DTT、1mM Na3VO4、50mM NaFおよびプロテアーゼインヒビターを含む溶解緩衝液中いずれかで調製した。各回で、等量のタンパク質(15〜50μgの範囲)をロードし、そしてウェスタンブロットを、標準的な手順に従って調製した。反応は、ECL(Amersham)によって可視化した。抗体は以下のようであった:IκBα、Bid、およびβアクチンはSanta Cruz Biotechnolgyから;カスパーゼ6、カスパーゼ7およびカスパーゼ9、ホスホ−p38および総−p38、ホスホ−ERKおよび総−ERK、ホスホ−JNKおよび総−JNKは、Cell Signaling Technologyから;カスパーゼ−8はAlexisから;カスパーゼ2およびカスパーゼ3はR&D systemsからであった。Gadd45β特異的抗体は、N末端ペプチドに対して生成された。キナーゼアッセイは、組換えGST−c−jun抗体および抗−JNK抗体(Pharmingen)、(Linら、1995)で実施した。
(6.カスパーゼ活性の測定およびミトコンドリア膜貫通電位)
カスパーゼインビトロアッセイには、細胞を、Triton X−100緩衝液中で溶解し、そして溶解物を、以下のアミノ酸トリフルオロメチルクマリン(ATC)標識カスパーゼ特異的ペプチド(Bachem)の40μM中でインキュベートした:xVDVAD(カスパーゼ2)、zDEVD(カスパーゼ3/7)、xVEID(カスパーゼ6)、xIETD(カスパーゼ8)、およびAc−LEHD(カスパーゼ9)。アッセイは、先に記載のように実施され(Steghら、2000)、そして比活性は、蛍光プレートリーダーを用いて決定された。ミトコンドリア膜貫通電位は、先の記載のように(Scaffidiら、1999)、蛍光色素JC−1(Molecular Probes、Inc.)により測定した。TNFα処理後、細胞を、1.25μg/mlの色素と暗所中37℃で10分間インキュベートし、PBSで一度洗浄し、そしてFCMによって分析した。
カスパーゼインビトロアッセイには、細胞を、Triton X−100緩衝液中で溶解し、そして溶解物を、以下のアミノ酸トリフルオロメチルクマリン(ATC)標識カスパーゼ特異的ペプチド(Bachem)の40μM中でインキュベートした:xVDVAD(カスパーゼ2)、zDEVD(カスパーゼ3/7)、xVEID(カスパーゼ6)、xIETD(カスパーゼ8)、およびAc−LEHD(カスパーゼ9)。アッセイは、先に記載のように実施され(Steghら、2000)、そして比活性は、蛍光プレートリーダーを用いて決定された。ミトコンドリア膜貫通電位は、先の記載のように(Scaffidiら、1999)、蛍光色素JC−1(Molecular Probes、Inc.)により測定した。TNFα処理後、細胞を、1.25μg/mlの色素と暗所中37℃で10分間インキュベートし、PBSで一度洗浄し、そしてFCMによって分析した。
(7.本発明の治療適用)
本発明は、JNK経路、そしてそれによってアポトーシスの調整のための方法および組成物を提供する。本発明の1つの実施形態では、この調整は、Gadd45βおよびその他のGadd45タンパク質または遺伝子の調整によって実施され得る。あるいは、治療は、JNK経路の別の成分、例えば、JNK1、JNK2、JNK3、MAPKKK(マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼキナーゼ):GCK、GCKR、ASK1/MAPKKK5、ASK2/MAPKKK6、DLK/MUK/ZPK、LZK、MEKK1、MEKK2、MEKK3、MEKK4/MTK1、MLK1、MLK2/MST、MLK3/SPRK/PTK1、TAK1、Tpl−2/Cot.MAPKK(マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ):MKK4/SEK1/SERK1/SKK1/JNKK1、MKK7/SEK2/SKK4/JNKK2.MAPK(マイトジェン活性化キナーゼ):JNK1/SAPKγ/SAPK1c、JNK2/SAPKα/SAPK1a、JNK3/SAPKβ/SAPK1b/p49F12に関し得る。
本発明は、JNK経路、そしてそれによってアポトーシスの調整のための方法および組成物を提供する。本発明の1つの実施形態では、この調整は、Gadd45βおよびその他のGadd45タンパク質または遺伝子の調整によって実施され得る。あるいは、治療は、JNK経路の別の成分、例えば、JNK1、JNK2、JNK3、MAPKKK(マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼキナーゼ):GCK、GCKR、ASK1/MAPKKK5、ASK2/MAPKKK6、DLK/MUK/ZPK、LZK、MEKK1、MEKK2、MEKK3、MEKK4/MTK1、MLK1、MLK2/MST、MLK3/SPRK/PTK1、TAK1、Tpl−2/Cot.MAPKK(マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ):MKK4/SEK1/SERK1/SKK1/JNKK1、MKK7/SEK2/SKK4/JNKK2.MAPK(マイトジェン活性化キナーゼ):JNK1/SAPKγ/SAPK1c、JNK2/SAPKα/SAPK1a、JNK3/SAPKβ/SAPK1b/p49F12に関し得る。
さらに、多数のホスファターゼ、骨格タンパク質(JIP1/IB1、JIP2/IB2、JIP3/JSAPを含む)および他の活性化補因子および阻害補因子が存在し、これらもまた、JNKシグナル伝達の調節において重要であり、そして本発明に従って調節され得る。治療的使用が、アポトーシスの増加または減少により影響され得る潜在的にすべての状態のために適切である。本発明は、重要である。なぜなら、多くの疾患が、アポトーシスの阻害または増加に関係しているからである。アポトーシスの阻害に関係する状態としては、癌、自己免疫障害(例えば、全身性エリテマトーデスおよび免疫媒介性糸球体腎炎)、ならびにウイルス感染(例えば、ヘルペスウイルス属感染、ポックスウイルス属感染、およびアデノウイルス属感染)が挙げられる。従って、本発明は、アポトーシスの阻害に関係するこれらおよび他の状態を処置するための治療を提供し、この治療は、アポトーシスを増加するJNK経路調節因子の投与を包含する。Gadd45のアップレギュレーションがアポトーシスをブロックするので、アポトーシスの阻害により引き起こされる疾患は、例えば、Gadd45の阻害を介してJNK活性化を増加することを目的とする治療から、利益を受ける。そのような阻害が達成され得る方法の一例は、アンチセンスGadd45核酸の投与による。
アポトーシスの調節のため、特にアポトーシスの増加のための、特定の使用は、癌の処置のためである。これらの場合、1つ以上の他の治療の組み合わせを含む処置が、望まれ得る。例えば、JNK経路の調節因子は、従来の化学療法または放射線療法と組み合わせて使用した場合に、非常に有益であり得る。当業者に公知の広範な種類の癌治療が、個別にか、または本明細書中に提供されるJNK経路の調節因子と組み合わせて、使用され得る。併用療法は、JNK経路に関与する遺伝子またはタンパク質を調節し得る因子を使用して治療の有効性を増加するために、使用され得る。JNK経路のそのような調節因子は、センス核酸またはアンチセンス核酸を含み得る。
併用療法の一例は、放射線治療、およびその後の、JNK経路を調節し得るタンパク質の核酸配列(例えば、センスGadd45β核酸配列またはアンチセンスGadd45β核酸配列)を用いる遺伝子治療である。あるいは、当業者は、手術および/または化学療法、および/または免疫療法、および/または他の遺伝子治療、および/または局所熱治療と組み合わせて、JNK調節因子ベースの抗癌治療を使用し得る。従って、当業者は、当該分野に存在する標準的癌治療のうちの1つまたはいくつかを本発明のJNK調節因子ベースの治療に加えて、使用し得る。
他の癌治療は、数分間〜数日間〜数週間の範囲にわたる間隔で、JNK経路調節因子ベースの治療の前に行われ得るか、または後に行われ得る。他の癌治療およびGadd45βインヒビターベースの治療が一緒に投与される実施形態において、当業者は、一般には、有意な時間が各送達時刻の間に満了しなかったことを確実にする。このような場合、当業者が、患者に、互いに約12時間〜24時間内に、より好ましくは互いに約6〜12時間内に、両方の治療様式を投与すること、そしてほんの約12時間の遅延時間が最も好ましいことが、企図される。しかし、いくつかの状況において、数日間(2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、または7日間)〜数週間(1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、または8週間)が、個々の投与の間で経過する場合に、処置のための時間を伸長することが有意に望ましくあり得る。
別の癌治療およびGadd45βインヒビターベースの治療のいずれかの1回より多くの投与が、完全な癌治癒を達成するために必要とされることもまた、考えられる。種々の組み合わせが、使用され得る。ここで、他の癌治療が「A」であり、JNK経路調節因子ベースの治療処置(Gadd45インヒビターを用いる処置を含む)が「B」であり、下記のように例証される:
(8.化学療法剤)
癌処置の場合、併用療法において使用するための他の種類の薬剤は、化学療法剤である。これらの薬剤は、腫瘍細胞に選択的かつ有害に影響を与え得る。DNA損傷を引き起こす薬剤は、1つの型の化学療法剤を含む。例えば、直接DNAを架橋する薬剤、DNA中にインターカレートする薬剤、および染色体異常および核酸合成に影響することによって有糸分裂異常をもたらす薬剤である。化学療法剤のいくつかの例としては、以下が挙げられる:抗生物質化学療法剤(例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン(ムタマイシン(mutamycin)および/またはマイトマイシンCとしても公知である)、アクチノマイシンD(ダクチノマイシン)、ブレオマイシン、プリコマイシン);植物アルカロイド(例えば、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン);種々の薬剤(例えば、シスプラチン、VP16、腫瘍壊死因子、アルキル化剤(例えば、カルムスチン、メルファラン(アルケラン、L−フェニルアラニンマスタード、フェニルアラニンマスタード、L−PAM、またはL−サルコリシンとしても公知であり、これは、ナイトロジェンマスタードのフェニルアラニン誘導体である)、シクロホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン(ミレラン(myleran)としても公知)、ロムスチン);ならびに他の薬剤(例えば、シスプラチン(CDDP)、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、カンプトテシン、イフォスファミド(Ifosfamide)、ニトロソ尿素、エトポシド(VP16)、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲンレセプター結合因子、ゲンシタビエン(Gemcitabien)、マベルビン(Mavelbine)、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼインヒビター、トランスプラチナ(Transplatinum)、5−フルオロウラシル、およびメトトレキサート、テマキソロミド(Temaxolomide)(DTICの水性形態)、または上記の任意のアナログもしくは誘導改変体。
癌処置の場合、併用療法において使用するための他の種類の薬剤は、化学療法剤である。これらの薬剤は、腫瘍細胞に選択的かつ有害に影響を与え得る。DNA損傷を引き起こす薬剤は、1つの型の化学療法剤を含む。例えば、直接DNAを架橋する薬剤、DNA中にインターカレートする薬剤、および染色体異常および核酸合成に影響することによって有糸分裂異常をもたらす薬剤である。化学療法剤のいくつかの例としては、以下が挙げられる:抗生物質化学療法剤(例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン(ムタマイシン(mutamycin)および/またはマイトマイシンCとしても公知である)、アクチノマイシンD(ダクチノマイシン)、ブレオマイシン、プリコマイシン);植物アルカロイド(例えば、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン);種々の薬剤(例えば、シスプラチン、VP16、腫瘍壊死因子、アルキル化剤(例えば、カルムスチン、メルファラン(アルケラン、L−フェニルアラニンマスタード、フェニルアラニンマスタード、L−PAM、またはL−サルコリシンとしても公知であり、これは、ナイトロジェンマスタードのフェニルアラニン誘導体である)、シクロホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン(ミレラン(myleran)としても公知)、ロムスチン);ならびに他の薬剤(例えば、シスプラチン(CDDP)、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、カンプトテシン、イフォスファミド(Ifosfamide)、ニトロソ尿素、エトポシド(VP16)、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲンレセプター結合因子、ゲンシタビエン(Gemcitabien)、マベルビン(Mavelbine)、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼインヒビター、トランスプラチナ(Transplatinum)、5−フルオロウラシル、およびメトトレキサート、テマキソロミド(Temaxolomide)(DTICの水性形態)、または上記の任意のアナログもしくは誘導改変体。
(a.シスプラチナム(Cisplatinum))
核酸(特にDNA)に直接架橋する薬剤は、変異体腫瘍崩壊性ウイルスとの相乗的抗新形成組み合わせをもたらすDNA損傷を容易にすることが予期される。シスプラチナム(cisplatinum)薬剤(例えば、シスプラチン(cisplatin))および他のDNAアルキル化剤が、使用され得る。シスプラチナムは、癌を処置するために広範に使用されており、合計3回の治療単位の間に3週間毎に5日間の間に20mg/m2の有効用量が、臨床適用において使用される。シスプラチンは、経口吸収されず、従って、静脈内注射、皮下注射、腫瘍内注射、または腹腔内注射を介して送達されなければならない。
核酸(特にDNA)に直接架橋する薬剤は、変異体腫瘍崩壊性ウイルスとの相乗的抗新形成組み合わせをもたらすDNA損傷を容易にすることが予期される。シスプラチナム(cisplatinum)薬剤(例えば、シスプラチン(cisplatin))および他のDNAアルキル化剤が、使用され得る。シスプラチナムは、癌を処置するために広範に使用されており、合計3回の治療単位の間に3週間毎に5日間の間に20mg/m2の有効用量が、臨床適用において使用される。シスプラチンは、経口吸収されず、従って、静脈内注射、皮下注射、腫瘍内注射、または腹腔内注射を介して送達されなければならない。
(b.ダウノルビシン)
ダウノルビシンハイドロクロライド、5,12−ナフタセネジオン(naphthacenedione)、(8S−cis)−8−アセチル−10−[(3−アミノ−2,3,6−トリデオキシ−a−L−リクソ(lyxo)−ヘキサノピラノシル)オキシ]−7,8,9,10−テトラヒドロ−6,8,11−トリヒドロキシ−10−メトキシ−,ハイドロクロライド;セルビジン(cerubidine)とも呼ばれ、そしてWyethから入手可能である。ダウノルビシンは、DNAにインターカレートし、DNAを用いるRNAポリメラーゼをブロックし、そしてDNA合成を阻害する。それは、核酸合成を妨げない用量によって、細胞分裂を阻害し得る。
ダウノルビシンハイドロクロライド、5,12−ナフタセネジオン(naphthacenedione)、(8S−cis)−8−アセチル−10−[(3−アミノ−2,3,6−トリデオキシ−a−L−リクソ(lyxo)−ヘキサノピラノシル)オキシ]−7,8,9,10−テトラヒドロ−6,8,11−トリヒドロキシ−10−メトキシ−,ハイドロクロライド;セルビジン(cerubidine)とも呼ばれ、そしてWyethから入手可能である。ダウノルビシンは、DNAにインターカレートし、DNAを用いるRNAポリメラーゼをブロックし、そしてDNA合成を阻害する。それは、核酸合成を妨げない用量によって、細胞分裂を阻害し得る。
他の薬剤との組み合わせにおいて、成体における急性骨髄性白血病において(寛解の誘導のために)、急性リンパ性白血病、および慢性骨髄性白血病の急性段階の第1に選択される治療療法に含まれる。経口吸収は、乏しく、そして静脈内に投与されなければならない。分布の半減期は、45分間であり、排泄半減期は、約19時間である。その活性代謝物ダウノルビシノールの半減期は、約27時間である。ダウノルビシンは、大部分が肝臓で代謝され、そして胆汁中に分泌される(約40%)。投与用量は、肝不全または腎不全においては、減少されなければならない。
適切な用量(塩基当量)は、60歳未満の成人の静脈内の場合、45mg/m2/日(60歳以上の患者については、30mg/m2)で、3週間または4週間ごとに、1,2または3日間、または0.8mg/kg/日で、3週間または4週間ごとに、3〜6日間であり;生涯において、550mg/m2を超えない量である、ただし胸部の照射があった場合は、450mg/m2である;小児の場合(2歳未満でも身体表面積が0.5mでもない場合)、週に一度25mg/m2、この場合、体重に基づく成人のスケジュールを使用する。それは、注入可能な投与形態(塩基当量)20mg、(ハイドロクロライド21.4mgの塩基当量として)。例示的な用量は、10mg/m2、20mg/m2、30mg/m2、50mg/m2、100mg/m2、150mg/m2、175mg/m2、200mg/m2、225mg/m2、250mg/m2、275mg/m2、300mg/m2、350mg/m2、400mg/m2、425mg/m2、450mg/m2、475mg/m2、500mg/m2であり得る。当然のことながら、これら投与量の全てが例示的であり、そしてこれらの点の間の任意の投与量もまた、本発明において有用であることが予測される。
(9.免疫治療)
本発明に従って、治療適用において、免疫治療を、JNK経路の調節因子と組み合わせて、使用し得る。あるいは、免疫治療を使用して、JNK経路を介するアポトーシスを調節し得る。例えば、抗Gadd45β抗体またはJNK経路の他の成分に対する抗体を使用して、標的分子の機能を破壊して、それによってGadd45を阻害し、アポトーシスを増加し得る。あるいは、抗体を使用して、JNK経路の調節因子を、それを必要とする細胞に標的送達し得る。例えば、免疫エフェクターは、腫瘍細胞表面の、あるマーカーに特異的な抗体であり得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、癌胎児抗原、前立腺特異的抗原、尿腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシンセ(tyrosinse)(97)、gp68、TAG−72、HMFG、シアリルルイス(Sialyl Lewis)抗原、MucA、MucB、PLAP、エストロゲンレセプター、ラミニンレセプター、erbBおよびp155が挙げられる。
本発明に従って、治療適用において、免疫治療を、JNK経路の調節因子と組み合わせて、使用し得る。あるいは、免疫治療を使用して、JNK経路を介するアポトーシスを調節し得る。例えば、抗Gadd45β抗体またはJNK経路の他の成分に対する抗体を使用して、標的分子の機能を破壊して、それによってGadd45を阻害し、アポトーシスを増加し得る。あるいは、抗体を使用して、JNK経路の調節因子を、それを必要とする細胞に標的送達し得る。例えば、免疫エフェクターは、腫瘍細胞表面の、あるマーカーに特異的な抗体であり得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、癌胎児抗原、前立腺特異的抗原、尿腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシンセ(tyrosinse)(97)、gp68、TAG−72、HMFG、シアリルルイス(Sialyl Lewis)抗原、MucA、MucB、PLAP、エストロゲンレセプター、ラミニンレセプター、erbBおよびp155が挙げられる。
本発明の実施形態において、抗体は、抗Gadd45β抗体であり得る。抗体単独で、治療のエフェクターとして作用し得るか、または他の細胞を補充して、実際に細胞の殺傷を起こし得る。抗体はまた、薬物または毒素(化学治療剤、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素、など)と結合体化して、単に標的化剤として作用し得る。あるいは、エフェクターは、腫瘍細胞中の標的(例えば、Gadd45β)に対して、直接的かまたは間接的のいずれかで相互作用する表面分子を保有するリンパ球であってもよい。種々のエフェクター細胞としては、細胞傷害性T細胞およびNK細胞が挙げられる。これらのエフェクターは、細胞死およびアポトーシスを引き起こす。アポトーシス癌細胞は、樹状細胞およびマクロファージを含む細網内皮細胞によって取り除かれ、そして、抗腫瘍免疫を生じるために免疫系に提示される(Rovereら、1999;Steinmanら、1999)。免疫刺激分子は、免疫治療として提供され得る:例えば、IL−2、IL−4、IL−12、GM−CSF、γ−IFNのようなサイトカイン、MIP−1、MCP−1、IL−8のようなケモカイン、ならびにFLTリガンドのような成長因子。Gadd45インヒビターと組み合わせた、免疫刺激分子(タンパク質として、または遺伝子送達を用いるかのいずれかで)の組み合わせは、抗腫瘍効果を増強する。このことは、以下を含み得る:(i)以下を含む受動免疫治療:抗体単独の注入;毒素または化学治療剤と結合した抗体の注入;放射性同位元素と結合した抗体の注入;抗イデオトープ抗体の注入;そして最後に、骨髄中の腫瘍細胞の除去;ならびに/あるいは(ii)抗原性ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、あるいは自己由来または同種異系の腫瘍細胞組成物、あるいは「ワクチン」を投与する能動免疫治療(一般的に、異なる細菌アジュバントを用いる)(RavindranathおよびMorton、1991;MortonおよびRavindranath、1996;Mortonら、1992;Mitchellら、1990;Mitchellら、1993)、ならびに/あるいは(iii)患者の循環リンパ球または腫瘍に浸潤したリンパ球がインビトロにおいて単離され、IL−2のようなリンホカインによって活性化されるか、または腫瘍壊死のための遺伝子を導入されて、再度投与される、養子免疫治療(Rosenbergら、1998;1989)。
(10.遺伝子治療)
本発明に従う治療は、1つ以上の治療用ポリヌクレオチドが、必要とする患者に投与される遺伝子治療を含み得る。この治療は、JNK経路の調節因子である核酸の投与を含み得、そしてまた、JNK経路の調節因子と組み合わされた任意の他の治療用ヌクレオチドの投与を含み得る。本発明に従う癌治療の1つの実施形態は、Gadd45βのインヒビターである核酸配列(例えば、Gadd45βインヒビターポリペプチドまたはアンチセンスGadd45β配列をコードする核酸)の投与を包含する。他の治療剤(遺伝子治療剤を含む)と組み合わせた、JNKインヒビターポリペプチドをコードするベクターまたはアンチセンスJNK経路調節因子を含むベクターの送達は、標的組織に対する、組み合わされた抗過剰増殖効果を有する。種々のタンパク質が、本発明者らによって、JNK経路の調節因子と組み合わされた遺伝子治療のための標的として、想定され、そのいくつかが、以下に記載される。
本発明に従う治療は、1つ以上の治療用ポリヌクレオチドが、必要とする患者に投与される遺伝子治療を含み得る。この治療は、JNK経路の調節因子である核酸の投与を含み得、そしてまた、JNK経路の調節因子と組み合わされた任意の他の治療用ヌクレオチドの投与を含み得る。本発明に従う癌治療の1つの実施形態は、Gadd45βのインヒビターである核酸配列(例えば、Gadd45βインヒビターポリペプチドまたはアンチセンスGadd45β配列をコードする核酸)の投与を包含する。他の治療剤(遺伝子治療剤を含む)と組み合わせた、JNKインヒビターポリペプチドをコードするベクターまたはアンチセンスJNK経路調節因子を含むベクターの送達は、標的組織に対する、組み合わされた抗過剰増殖効果を有する。種々のタンパク質が、本発明者らによって、JNK経路の調節因子と組み合わされた遺伝子治療のための標的として、想定され、そのいくつかが、以下に記載される。
(11.臨床プロトコール)
Gadd45遺伝子によるその活性または発現を含む、JNK経路の調節因子(例えば、Gadd45タンパク質のインヒビター)を使用する癌の処置を促進するための臨床プロトコールが、本明細書中に記載される。このプロトコールは、同様に、アポトーシスの減少に関連する他の状態のために使用され得る。あるいは、このプロトコールは、Gadd45のインヒビターを、Gadd45のアクチベータで置換することによって、アポトーシスの増加と関連する処置を評価するために使用され得る。
Gadd45遺伝子によるその活性または発現を含む、JNK経路の調節因子(例えば、Gadd45タンパク質のインヒビター)を使用する癌の処置を促進するための臨床プロトコールが、本明細書中に記載される。このプロトコールは、同様に、アポトーシスの減少に関連する他の状態のために使用され得る。あるいは、このプロトコールは、Gadd45のインヒビターを、Gadd45のアクチベータで置換することによって、アポトーシスの増加と関連する処置を評価するために使用され得る。
(12.治療用キット)
JNK経路の調節因子を含む治療用キットもまた、本明細書中に記載される。このようなキットは、一般に、適切な容器手段中に、JNK経路の少なくとも1つの調節因子の薬学的に受容可能な処方物を含む。このキットはまた、他の薬学的に受容可能な処方物(例えば、JNK経路の調節因子を、処置を必要とする患者または細胞型の異なる領域に標的化するための成分、あるいはJNK経路の調節因子と共に作用し得る範囲の薬物(例えば、化学療法剤)の任意の1つ以上を含む処方物)を含み得る。
JNK経路の調節因子を含む治療用キットもまた、本明細書中に記載される。このようなキットは、一般に、適切な容器手段中に、JNK経路の少なくとも1つの調節因子の薬学的に受容可能な処方物を含む。このキットはまた、他の薬学的に受容可能な処方物(例えば、JNK経路の調節因子を、処置を必要とする患者または細胞型の異なる領域に標的化するための成分、あるいはJNK経路の調節因子と共に作用し得る範囲の薬物(例えば、化学療法剤)の任意の1つ以上を含む処方物)を含み得る。
キットは、任意のさらなる成分を含むかまたは含まない、JNK経路の調節因子を含む単一の容器手段を有し得るか、あるいは、これらのキットは、各々の所望の因子のための別個の容器手段を有し得る。キットの成分が1つ以上の液体溶液で提供される場合、液体溶液は、水溶液であり、滅菌水溶液が特に好ましい。しかし、キットの成分は、乾燥粉末として提供され得る。試薬または成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、適切な溶媒の添加によって再構成され得る。溶媒がまた、別の容器手段で提供され得ることが想定される。キットの容器手段は、一般的に、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、注射器または他の容器手段を備え、これらの中に、モノテルペングリコシド/トルテルペングリコシド、および任意の他の所望の因子が、配置され得、そして好ましくは、適切に分割され得る。さらなる成分が含まれる場合、キットはまた、一般的に、これらが配置される第2のバイアルまたは他の容器を含み、これは、別々に設計された用量の投与を可能にする。キットはまた、滅菌の薬学的に受容可能な緩衝液または他の希釈液を含むための第2/第3の容器を備え得る。
キットはまた、動物または患者にJNK経路の調節因子を投与するための手段(例えば、1つ以上の針もしくは注射器、または点眼器、ピペット、もしくは他のこのような類似の装置(これから、処方物が、動物に注射され得るか、または身体の疾患領域に適用され得る)さえ)を備え得る。本発明のキットはまた、代表的に、バイアルなどおよび他の成分を市販のために密閉して含むための手段(例えば、所望のバイアルおよび他の装置が配置および保持される射出成形プラスチック容器またはブロー成形プラスチック容器)を備える。
(13.Gadd45組成物)
本発明の特定の局面は、Gadd45の調節因子を含む。本発明の1つの実施形態において、調節因子は、Gadd45または他の遺伝子またはタンパク質であり得る。本発明の特定の実施形態において、インヒビターは、アンチセンス構築物である。アンチセンス構築物は、アンチセンス方向の完全長コード配列を含み得、そしてまたコード配列の一部を含んでも良いしまたは含まなくても良い1つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。JNK経路の潜在的調節因子(Gadd45β)の調節因子を含む)としては、例えば、生体膜を通る自由な移動を可能にするための、Drosophila Antennapedia由来のペプチドまたはHIV TATタンパク質に融合され得る合成ペプチド;ドミナントネガティブ作用変異タンパク質(これらのタンパク質をコードする構築物を含む);ならびに天然および合成の化合物などが挙げられ得る。本発明に従う調節因子はまた、例えば、Gadd45タンパク質の過剰発現を引き起こすことによって、Gadd45をアップレギュレートし得る。同様に、Gadd45をコードする核酸は、標的細胞に送達されて、Gadd45を増加し得る。Gadd45をコードする核酸配列は、Gadd45の過剰発現を引き起こし得る異種プロモーターに作動可能に連結され得る。
本発明の特定の局面は、Gadd45の調節因子を含む。本発明の1つの実施形態において、調節因子は、Gadd45または他の遺伝子またはタンパク質であり得る。本発明の特定の実施形態において、インヒビターは、アンチセンス構築物である。アンチセンス構築物は、アンチセンス方向の完全長コード配列を含み得、そしてまたコード配列の一部を含んでも良いしまたは含まなくても良い1つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。JNK経路の潜在的調節因子(Gadd45β)の調節因子を含む)としては、例えば、生体膜を通る自由な移動を可能にするための、Drosophila Antennapedia由来のペプチドまたはHIV TATタンパク質に融合され得る合成ペプチド;ドミナントネガティブ作用変異タンパク質(これらのタンパク質をコードする構築物を含む);ならびに天然および合成の化合物などが挙げられ得る。本発明に従う調節因子はまた、例えば、Gadd45タンパク質の過剰発現を引き起こすことによって、Gadd45をアップレギュレートし得る。同様に、Gadd45をコードする核酸は、標的細胞に送達されて、Gadd45を増加し得る。Gadd45をコードする核酸配列は、Gadd45の過剰発現を引き起こし得る異種プロモーターに作動可能に連結され得る。
例示的なGadd45遺伝子は、ヒトcDNAについてのGenbank受け入れ番号NM−015675、ヒトタンパク質についてのNP 056490.1、マウスcDNAについてのNM−008655およびマウスタンパク質についてのNP−032681.1から得られ得る。同様に、Gadd45αヌクレオチド配列およびGadd45αタンパク質配列について、Genbank受け入れ番号は、以下である:ヒトcDNAについてNM−001924;ヒトタンパク質についてのNP−001915;マウスcDNAについてのNM−007836およびマウスタンパク質についてNP−031862.1。Gadd45γヌクレオチド配列およびGadd45γタンパク質配列について、Genbank受け入れ番号は、以下である:ヒトcDNAについてNM−006705;ヒトタンパク質についてのNP−006696.1;マウスcDNAについてのNM−011817およびマウスタンパク質についてNP−035947.1。核酸の連続したストレッチ(これらの配列の約25、約50、約75、約100、約150、約200、約300、約400、約55、約550、約750、約100、約1000、約1250および約1500またはそれ以上の連続した核酸を含む)がまた、本発明の一部を形成する。Gadd45プロモーター配列の結合部位は、kB−1、kB−2およびkB−3のコア結合部位を含み、これらの配列のいずれかによって与えられ、本明細書中に記載される方法および組成物において使用され得る。
固体支持体に結合される上記配列のいずれかを含むアレイが、本発明者によってさらに具体的に企図される。Gadd45およびJNK経路の他の成分のタンパク質はまた、アレイを作製するために使用され得、これは、これらの配列の約5、10、15、20、25、30、40、50、60またはそれ以上の連続したアミノ酸を含むその一部を含む。
(14.リボザイム)
JNK経路の成分に特異的なリボザイム(Gadd45β特異的リボザイムを含む)の使用はまた、本発明の一部である。以下の情報は、先の段落を補い、そして、この試みにおける当業者を手助けするために提供される。
JNK経路の成分に特異的なリボザイム(Gadd45β特異的リボザイムを含む)の使用はまた、本発明の一部である。以下の情報は、先の段落を補い、そして、この試みにおける当業者を手助けするために提供される。
リボザイムは、部位特異的様式で核酸を切断するRNAタンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特異的触媒ドメインを有する(KimおよびCech、1987;Gerlackら、1987;ForsterおよびSymons、1987)。例えば、多数のリボザイムは、高い程度の特異性を有するホスホエステル移動反応を加速し、しばしば、オリゴヌクレオチド基質のいくつかのホスホエステルのうちの1つのみを切断する(Cechら、1981;MichelおよびWesthof、1990;Reinhold−HurekおよびShub、1992)。この特異性は、化学反応の前に、基質が、リボザイムのインターナルガイド配列(internal guide sequence(「IGS」)に対する特異的な塩基対形成相互作用によって結合する必要条件に帰している。
(15.タンパク質)
(a.コードされるタンパク質)
それぞれの遺伝子によってコードされるタンパク質は、多量のポリペプチド産物を作製するためにかなり多くの異なる組換えDNA発現系において発現され得、このポリペプチド産物は、次いで、精製され得、そしてさらなる研究が実施され得る抗血清を作製するために動物をワクチン接種するために使用され得る。本発明の1つの実施形態において、Gadd45遺伝子産物またはその発現を阻害する核酸は、適切な発現系に挿入され得る。このような核酸は、Gadd45のインヒビター(ドミナントネガティブ変異タンパク質を含む)をコードし得、そしてまた、アンチセンスGadd45核酸を含み得る。アンチセンス配列は、アンチセンス方向で全長コード配列を含み得、そしてまたコード配列の一部を含んでも良いし含まなくても良い1つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。JNK経路の潜在的調節因子(Gadd45βの調節因子を含む)は、例えば、生体膜を通る自由な移動を可能にするための、Drosophila Antennapedia由来のペプチドまたはHIV TATタンパク質に融合され得る合成ペプチド;ドミナントネガティブ作用変異タンパク質(これらのタンパク質をコードする構築物を含む);ならびに天然および合成の化合物などを含み得る。
(a.コードされるタンパク質)
それぞれの遺伝子によってコードされるタンパク質は、多量のポリペプチド産物を作製するためにかなり多くの異なる組換えDNA発現系において発現され得、このポリペプチド産物は、次いで、精製され得、そしてさらなる研究が実施され得る抗血清を作製するために動物をワクチン接種するために使用され得る。本発明の1つの実施形態において、Gadd45遺伝子産物またはその発現を阻害する核酸は、適切な発現系に挿入され得る。このような核酸は、Gadd45のインヒビター(ドミナントネガティブ変異タンパク質を含む)をコードし得、そしてまた、アンチセンスGadd45核酸を含み得る。アンチセンス配列は、アンチセンス方向で全長コード配列を含み得、そしてまたコード配列の一部を含んでも良いし含まなくても良い1つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。JNK経路の潜在的調節因子(Gadd45βの調節因子を含む)は、例えば、生体膜を通る自由な移動を可能にするための、Drosophila Antennapedia由来のペプチドまたはHIV TATタンパク質に融合され得る合成ペプチド;ドミナントネガティブ作用変異タンパク質(これらのタンパク質をコードする構築物を含む);ならびに天然および合成の化合物などを含み得る。
当業者に公知の他の発現系の例としては、細菌(例えば、E.coli)、酵母(例えば、Pichia pastoris)、バキュロウイスルが挙げられ、そしてポリペプチドの遺伝子コード部分の哺乳動物発現フラグメントが作製され得る。
(b.模倣物)
本発明に従うポリペプチドの調製のため別の方法は、ペプチド模倣物の使用である。模倣物は、タンパク質2次構造のエレメントを模倣するペプチド含有分子である。例えば、Johnsonら、「Peptide Turn Mimetics」、BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY、Pezzutoら編、ChapmanおよびHall、New York(1993)を参照のこと。ペプチド模倣物の使用の後ろにある基礎になる原理は、タンパク質のペプチド骨格が、分子相互作用(例えば、抗体および抗原の相互作用)を促進するような方法で、アミノ酸側鎖を方向付けるように主に存在することである。ペプチド模倣物は、天然の分子に類似の分子相互作用を可能にするように期待される。
本発明に従うポリペプチドの調製のため別の方法は、ペプチド模倣物の使用である。模倣物は、タンパク質2次構造のエレメントを模倣するペプチド含有分子である。例えば、Johnsonら、「Peptide Turn Mimetics」、BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY、Pezzutoら編、ChapmanおよびHall、New York(1993)を参照のこと。ペプチド模倣物の使用の後ろにある基礎になる原理は、タンパク質のペプチド骨格が、分子相互作用(例えば、抗体および抗原の相互作用)を促進するような方法で、アミノ酸側鎖を方向付けるように主に存在することである。ペプチド模倣物は、天然の分子に類似の分子相互作用を可能にするように期待される。
(16.薬学的処方物および送達)
本発明の実施形態において、Gadd45インヒビター核酸を含む発現構築物の送達による癌の処置のための方法が意図される。「Gadd45インヒビター核酸」は、Gadd45インヒビター(ポリペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびドミナントネガティブ変異体を含む)のコード配列を含み得る。同様に、他の型のインヒビター(天然または合成の化合物および他の型の因子を含む)が投与され得る。薬学的処方物は、異常なアポトーシスレベルと関連する任意の疾患を処置するために使用され得る。
本発明の実施形態において、Gadd45インヒビター核酸を含む発現構築物の送達による癌の処置のための方法が意図される。「Gadd45インヒビター核酸」は、Gadd45インヒビター(ポリペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびドミナントネガティブ変異体を含む)のコード配列を含み得る。同様に、他の型のインヒビター(天然または合成の化合物および他の型の因子を含む)が投与され得る。薬学的処方物は、異常なアポトーシスレベルと関連する任意の疾患を処置するために使用され得る。
有効量の薬学的組成物は、一般的に、疾患またはその症状の程度を検出可能かつ反復的に改善するか、減少するか、最小化するかまたは制限するのに十分なその量として規定される。より厳密な定義は、疾患の排除、根絶または治癒を含んで、適用され得る。
(17.JNK経路の調節因子を発見する方法)
本発明の1つの局面は、JNKまたはアポトーシスの阻害を含む、Gadd45の任意の1つ以上の特性をスクリーニングする方法を包含する。調節因子は、例えば、JNK経路に関連するポリペプチドを阻害することによってタンパク質レベルで作用し得るか、またはこのようなポリペプチドの発現を調節することによって核酸レベルで作用し得る。あるいは、このような調節因子は、JNK経路における分子の化学的改変(例えば、分子のリン酸化)に影響し得る。スクリーニングアッセイは、アポトーシスを増加するようにJNK経路を調節する因子およびアポトーシスを減少するように作用する因子の両方であり得る。ポリペプチド活性のスクリーニングアッセイにおいて、候補物質は、最初に、基礎的生化学活性(例えば、標的分子への結合)をスクリーニングされ得、次いで、細胞、組織または動物全体のレベルにおける発現を調節する能力について試験され得る。アッセイは、Gadd45タンパク質またはGadd45 mRNAのレベルを検出するため、あるいはJNK経路における別の関与物(participant)のタンパク質または核酸のレベルを検出するために使用され得る。
本発明の1つの局面は、JNKまたはアポトーシスの阻害を含む、Gadd45の任意の1つ以上の特性をスクリーニングする方法を包含する。調節因子は、例えば、JNK経路に関連するポリペプチドを阻害することによってタンパク質レベルで作用し得るか、またはこのようなポリペプチドの発現を調節することによって核酸レベルで作用し得る。あるいは、このような調節因子は、JNK経路における分子の化学的改変(例えば、分子のリン酸化)に影響し得る。スクリーニングアッセイは、アポトーシスを増加するようにJNK経路を調節する因子およびアポトーシスを減少するように作用する因子の両方であり得る。ポリペプチド活性のスクリーニングアッセイにおいて、候補物質は、最初に、基礎的生化学活性(例えば、標的分子への結合)をスクリーニングされ得、次いで、細胞、組織または動物全体のレベルにおける発現を調節する能力について試験され得る。アッセイは、Gadd45タンパク質またはGadd45 mRNAのレベルを検出するため、あるいはJNK経路における別の関与物(participant)のタンパク質または核酸のレベルを検出するために使用され得る。
このようなスクリーニングのための例示的な手順は、以下に記載される。以下に提示される方法の全てにおいて、試験される薬剤は、低分子(すなわち、化合物)、ペプチド(例えば、ファージディスプレイ)、または他の型の分子のいずれかのライブラリーであり得る。
(a.インビトロでのGadd45に結合する因子のスクリーニング)
96ウェルプレートは、標準的な手順に従って、試験される因子でコーティングされる。非結合因子は、組換えGadd45βタンパク質とともにプレートをインキュベートする前に、洗浄される。さらなる洗浄後、プレートへのGadd45βの結合は、例えば、免疫検出(例えば、ELISA)のために慣用的に使用される抗Gadd45β抗体および方法論を使用して、結合されたGadd45の検出によって評価される。
96ウェルプレートは、標準的な手順に従って、試験される因子でコーティングされる。非結合因子は、組換えGadd45βタンパク質とともにプレートをインキュベートする前に、洗浄される。さらなる洗浄後、プレートへのGadd45βの結合は、例えば、免疫検出(例えば、ELISA)のために慣用的に使用される抗Gadd45β抗体および方法論を使用して、結合されたGadd45の検出によって評価される。
(b.Gadd45βの、JNK経路におけるその分子標的への結合を阻害する因子のスクリーニング)
特定の実施形態において、例えば、Gadd45βを阻害またはアップレギュレートする、JNK経路を調節する因子をスクリーニングおよび同定する方法が開示される。Gadd45を阻害する化合物は、アポトーシスの阻害を有効に妨げ得、従って、細胞をアポトーシスにより感受性にする。これは、代表的に、標的ポリペプチド(例えば、Gadd45タンパク質)を得ること、およびこのタンパク質を候補因子と接触させ、続いて、活性における任意の変化についてのアッセイすることによって、達成される。
特定の実施形態において、例えば、Gadd45βを阻害またはアップレギュレートする、JNK経路を調節する因子をスクリーニングおよび同定する方法が開示される。Gadd45を阻害する化合物は、アポトーシスの阻害を有効に妨げ得、従って、細胞をアポトーシスにより感受性にする。これは、代表的に、標的ポリペプチド(例えば、Gadd45タンパク質)を得ること、およびこのタンパク質を候補因子と接触させ、続いて、活性における任意の変化についてのアッセイすることによって、達成される。
候補化合物は、天然に存在する化合物のフラグメントまたは一部を含み得るか、あるいは、公知の化合物の活性の組み合わせ(これは、そうでなければ、不活性である)として見出され得るのみである。好ましい実施形態において、候補化合物は、低分子である。あるいは、天然の供給源(例えば、動物供給源、細菌供給源、真菌供給源、植物供給源(葉および樹皮を含む)および海洋サンプル)から単離された化合物が、潜在的に有用な薬学的因子の存在についての候補としてアッセイされ得ることが提供される。スクリーニングされる薬学的因子がまた、化学的組成物または人工の化合物由来であるかまたはこれらから合成され得ることが理解される。
組換えGadd45βタンパク質を、96ウェルプレートにコートし、そして非結合タンパク質を、徹底的に洗浄することによって除去される。次いで、試験される因子は、組換えGadd45β相互作用タンパク質とともに、プレートに添加される。あるいは、因子は、第2のタンパク質の添加の前または後のいずれかで添加される。徹底的な洗浄後、Gadd45β相互作用タンパク質へのGadd45βの結合は、例えば、後者のポリペプチドに対する抗体および免疫検出(ELISAなど)に慣用的に使用される方法論を使用することによって評価される。いくつかの場合において、プレートを組換えGadd45β相互作用タンパク質でコートし、そして抗Gadd45β抗体を使用することによってGadd45βとの相互作用を評価することが好ましくあり得る。目的は、Gadd45βとそのパートナーポリペプチドとの間の会合を破壊する因子を同定することである。
(c.Gadd45βのアポトーシスを妨げる能力を阻害する因子のスクリーニング)
高レベルのGadd45βを発現するNF−κB欠損細胞株は、TNFα誘導アポトーシスに対して保護される。細胞(例えば、3DO−IκBαM−Gadd45βクローン)は、96ウェルプレートにおいて増殖され、試験される因子に暴露され、次いで、TNFαで処理される。アポトーシスは、標準的な方法論(例えば、比色MTSアッセイ、PI染色など)を使用して測定される。コントロールは、TNFαの非存在下で、因子で処理される。さらなるコントロールにおいて、TNFα感受性NF−κBヌル細胞株(例えば、3DO−IκBαM細胞)、ならびにTNFα耐性NF−κBコンピテント細胞(例えば、3DO−Neo)は、TNFαの存在下または非存在下で試験される因子に暴露される。目的は、未処理細胞での動物毒性および3DO−IκBαM細胞または3DO−Neo細胞でのTNFα誘導アポトーシスに対する効果がないことを用いて、TNFα処理3DO−IκBαM−Gadd45βでのアポトーシスを誘導する因子を同定することである。これらの基準を満たす因子は、直接的または間接的のいずれかで、Gadd45β機能に影響するようである。
高レベルのGadd45βを発現するNF−κB欠損細胞株は、TNFα誘導アポトーシスに対して保護される。細胞(例えば、3DO−IκBαM−Gadd45βクローン)は、96ウェルプレートにおいて増殖され、試験される因子に暴露され、次いで、TNFαで処理される。アポトーシスは、標準的な方法論(例えば、比色MTSアッセイ、PI染色など)を使用して測定される。コントロールは、TNFαの非存在下で、因子で処理される。さらなるコントロールにおいて、TNFα感受性NF−κBヌル細胞株(例えば、3DO−IκBαM細胞)、ならびにTNFα耐性NF−κBコンピテント細胞(例えば、3DO−Neo)は、TNFαの存在下または非存在下で試験される因子に暴露される。目的は、未処理細胞での動物毒性および3DO−IκBαM細胞または3DO−Neo細胞でのTNFα誘導アポトーシスに対する効果がないことを用いて、TNFα処理3DO−IκBαM−Gadd45βでのアポトーシスを誘導する因子を同定することである。これらの基準を満たす因子は、直接的または間接的のいずれかで、Gadd45β機能に影響するようである。
(d.JNK活性を妨げるGadd45βの能力を阻害する因子のスクリーニング)
細胞株、処理および因子は、c.の通りである。しかし、アポトーシスよりも、TNFαによるJNK活性が評価される。このアプローチの潜在的な複雑化は、かなり多くの細胞および試薬を必要とし得ることである。従って、この型のスクリーニングは、例えば、他の方法を用いて単離される因子についての第2のスクリーニングとして最も有用ではなくてもよい。
細胞株、処理および因子は、c.の通りである。しかし、アポトーシスよりも、TNFαによるJNK活性が評価される。このアプローチの潜在的な複雑化は、かなり多くの細胞および試薬を必要とし得ることである。従って、この型のスクリーニングは、例えば、他の方法を用いて単離される因子についての第2のスクリーニングとして最も有用ではなくてもよい。
(e.インビトロアッセイ)
本発明の本実施形態は、JNK経路を調節する因子をスクリーニングおよび同定するための方法の使用を企図する。実施される迅速、安価かつ容易なアッセイは、結合アッセイである。標的への分子の結合は、立体的相互作用、アロステリック相互作用または荷電−荷電相互作用に起因して、本来それ自体で、阻害性であり得る。これは、溶液中または固相上で実施され得、そして最初の回のスクリーニングとして、使用されて、より洗練されたスクリーニングアッセイに移動する前に特定の化合物を迅速に排除し得る。標的は、溶液において遊離し得るか、支持体に固定され得るか、細胞の表面の中でまたは表面上において発現し得る。支持体の例としては、ニトロセルロース、カラムまたはゲルが挙げられる。標的または化合物のいずれかは、標識され得、それによって、結合の決定を可能にする。別の実施形態において、アッセイは、天然または人工の基質または結合パートナーへの標的の結合の増強を測定し得る。通常、標的は、標識された種であり、標識が結合部分の機能を妨害する可能性を減少させる。結合または結合の阻害を決定するために、遊離標識対結合標識の量が測定され得る。
本発明の本実施形態は、JNK経路を調節する因子をスクリーニングおよび同定するための方法の使用を企図する。実施される迅速、安価かつ容易なアッセイは、結合アッセイである。標的への分子の結合は、立体的相互作用、アロステリック相互作用または荷電−荷電相互作用に起因して、本来それ自体で、阻害性であり得る。これは、溶液中または固相上で実施され得、そして最初の回のスクリーニングとして、使用されて、より洗練されたスクリーニングアッセイに移動する前に特定の化合物を迅速に排除し得る。標的は、溶液において遊離し得るか、支持体に固定され得るか、細胞の表面の中でまたは表面上において発現し得る。支持体の例としては、ニトロセルロース、カラムまたはゲルが挙げられる。標的または化合物のいずれかは、標識され得、それによって、結合の決定を可能にする。別の実施形態において、アッセイは、天然または人工の基質または結合パートナーへの標的の結合の増強を測定し得る。通常、標的は、標識された種であり、標識が結合部分の機能を妨害する可能性を減少させる。結合または結合の阻害を決定するために、遊離標識対結合標識の量が測定され得る。
化合物のハイスループットスクリーニングのための技術は、WO84/03564に記載される。ハイスループットスクリーニングにおいて、多数の候補阻害性試験化合物(低分子、天然基質およびリガンドであり得るか、あるいはそのフラグメント、または構造的模倣物もしくは機能的模倣物であり得る)は、固体基質(例えば、プラスチックピンまたはいくつかの他の表面)で合成される。あるいは、精製された標的分子は、薬剤スクリーニング技術における使用のために、プレートまたは支持体上に直接的にコーティングされ得る。また、反応性領域(好ましくは、末端領域)を含む融合タンパク質は、酵素の活性領域を、固相、または支持体に連結するために使用され得る。試験化合物は、標的分子(例えば、Gadd45β)と反応し、そして結合された試験化合物は、種々の方法によって検出される(例えば、Coliganら、Current Protocols in Immunology 1(2):第5章、1991を参照のこと)。
スクリーニングされ得る低分子の例としては、有機低分子、ペプチドおよびペプチド様分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質または他の有機分子(炭素含有)もしくは無機分子が挙げられる。多くの製薬会社は、化学的混合物および/または生物学的混合物(しばしば、真菌、細菌、または藻類抽出物)の広範囲なライブラリーを有し、これは、JNK経路を調節する化合物を同定するために、本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングされ得る。さらに、薬物発見において、例えば、タンパク質は、ハイスループットスクリーニングアッセイのために、抗体Fc部分と融合されて、新規なポリペプチド標的の潜在的調節因子を同定する。D.Bennettら、Journal of Molecular Recognition,8:52−58(1995)およびK.Johnsonら、The Journal of Biological Chemistry,270,(16):9459−9471(1995)を参照のこと。
本発明の特定の実施形態において、アッセイは、Gadd45タンパク質、コード配列またはプロモーター核酸配列を支持体に結合する工程、Gadd45βを、Gadd45β核酸に結合し得る候補阻害性因子に暴露する工程を包含する。結合は、当該分野において任意の標準的手段(例えば、放射能、免疫学的検出、蛍光、ゲル電気泳動または比色手段を使用すること)によってアッセイされ得る。さおさらに、アッセイは、アポトーシスのGadd45β依存性遮断を開始し得る化合物の同定により、Gadd45βのインヒビターについて、細胞全体を使用して実施され得る(例えば、以下の実施例8〜11を参照のこと)。
(f.インビボアッセイ)
種々のトランスジェニック動物(例えば、マウス)は、調節因子の使用が、アポトーシスを導くシグナル伝達経路を調節し得る構築物を用いて作製され得る。
種々のトランスジェニック動物(例えば、マウス)は、調節因子の使用が、アポトーシスを導くシグナル伝達経路を調節し得る構築物を用いて作製され得る。
試験化合物によるこれらの動物の処置は、動物への適切な形態の化合物の投与を含む。投与は、経口、鼻腔内、頬、または局所でさえを含む、臨床的目的または非臨床的目的のために使用され得る任意の経路による。あるいは、投与は、気管内点滴、気管支点滴、皮内注射、皮下注射、筋内注射、腹腔内注射、または静脈内注射により得る。全身静脈内注射、血液供給またはリンパ供給による局所投与が具体的に企図される。
(g.細胞内(in cyto)アッセイ)
本発明はまた、細胞においてJNK経路を調節する能力について化合物をスクリーニングすることを企図する。種々の細胞株は、このようなスクリーニングアッセイのために使用され得る(この目的のために特に操作される細胞を含む)。アッセイに依存して、培養が必要とされ得る。細胞は、細胞におけるアポトーシスまたはJNK活性化をスクリーニングするための多くの異なるアッセイのいずれかを使用して試験される。
本発明はまた、細胞においてJNK経路を調節する能力について化合物をスクリーニングすることを企図する。種々の細胞株は、このようなスクリーニングアッセイのために使用され得る(この目的のために特に操作される細胞を含む)。アッセイに依存して、培養が必要とされ得る。細胞は、細胞におけるアポトーシスまたはJNK活性化をスクリーニングするための多くの異なるアッセイのいずれかを使用して試験される。
本発明の特定の実施形態において、スクリーニングは、一般的に、以下の工程を包含し得る:
(a)JNK経路の候補調節因子を得る工程であって、ここで、この候補は、潜在的に、JNK経路の成分を調節し得る任意の因子(ペプチド、変異タンパク質、cDNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは構築物、合成または天然の化合物などを含む)である、工程;
(b)候補薬剤を癌細胞と混合する工程;
(c)JNK経路を調節する(JNK経路のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを含む)候補物質の能力を決定し、そしてレベルアップまたはダウンレギュレーションをアッセイする工程。
(a)JNK経路の候補調節因子を得る工程であって、ここで、この候補は、潜在的に、JNK経路の成分を調節し得る任意の因子(ペプチド、変異タンパク質、cDNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは構築物、合成または天然の化合物などを含む)である、工程;
(b)候補薬剤を癌細胞と混合する工程;
(c)JNK経路を調節する(JNK経路のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを含む)候補物質の能力を決定し、そしてレベルアップまたはダウンレギュレーションをアッセイする工程。
レベルアップまたはダウンレギュレーションは、アポトーシスが細胞において生じる程度、および細胞が例えば、癌治療に受容性である程度を決定する。調節のレベルを検出するために、免疫検出アッセイ(例えば、ELISA)が、考慮され得る。
(18.インビトロおよびインビボで、Gadd45βを含むアポトーシス経路の調節因子を評価する方法)
Gadd45βの適切な調節因子が同定された後、これらの因子は、インビトロおよび/またはインビボでGadd45β活性を増加または減少するために、本発明に従って使用され得る。
Gadd45βの適切な調節因子が同定された後、これらの因子は、インビトロおよび/またはインビボでGadd45β活性を増加または減少するために、本発明に従って使用され得る。
JNK経路におけるGadd45βの分子標的の同定において、因子は、Gadd45βとGadd45β相互作用タンパク質との間の物理的相互作用を破壊する能力について試験される。これは、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための当該分野で一般に使用される方法論(免疫沈降、GSTプルダウン(pull−down)、酵母または哺乳動物ツーハイブリッド系などを含む)を使用することによって評価され得る。これらの研究について、タンパク質は、種々の系(インビトロ転写翻訳、細菌または真核生物の発現系、および類似の系を含む)を用いて作製され得る。
候補因子はまた、JNKまたはアポトーシスのGadd45β依存性阻害に影響を及ぼす能力について評価される。これは、Gadd45β(例えば、3DC−IκBαM−Gadd45β)を安定に発現する細胞株、またはGadd45β発現構築物を一過性トランスフェクトされた細胞株(例えば、HeLa、293、および他のもの)のいずれかを使用することによって試験され得る。細胞は、これらの因子で処理され、そして種々の誘因物質(trigger)(例えば、TNFα)によって誘導されるアポトーシスまたはJNK活性化を阻害するGadd45βの能力が、標準的な方法論を使用することによって試験される。並行して、コントロール実験は、Gadd45βを発現しない細胞株を使用して実施される。
Gadd45βを発現するトランスジェニックマウスまたは高レベルのGadd45βを発現する細胞株(例えば、癌細胞)を注射されたマウスが使用される。なぜなら、それらが、高レベルのGadd45βを天然に発現するか、またはそれらが、そうするように操作されている(例えば、トランスフェクトされた細胞)かのいずれかであるからである。次いで、動物は、試験される因子で処理され、そして種々の誘因物質によって誘導されるアポトーシスおよび/またはJNK活性化は、標準的な方法論を使用して分析される。これらの研究はまた、これらの因子の潜在的な毒性の評価を可能にする。
(19.Gadd45βを含む、アポトーシス経路の調節因子を用いて癌を処置する方法)
この方法は、Gadd45βタンパク質の機能、または細胞におけるタンパク質の発現のいずれかを妨害することによって、Gadd45βを阻害し得る任意の因子を潜在的に得るための手段を提供する。インヒビターは、天然に存在するかまたは合成の化合物(特に、本明細書中に記載されるように単離されたもの)、アンチセンス構築物またはオリゴヌクレオチド、Gadd45β変異タンパク質(すなわち、ドミナントネガティブ変異体)、Gadd45βの発現または機能を妨害する変異または野生型形態のタンパク質、抗Gadd45β抗体、上記タンパク質のいずれかをコードするcDNA、リボザイム、合成ペプチドなどが挙げられ得る。
この方法は、Gadd45βタンパク質の機能、または細胞におけるタンパク質の発現のいずれかを妨害することによって、Gadd45βを阻害し得る任意の因子を潜在的に得るための手段を提供する。インヒビターは、天然に存在するかまたは合成の化合物(特に、本明細書中に記載されるように単離されたもの)、アンチセンス構築物またはオリゴヌクレオチド、Gadd45β変異タンパク質(すなわち、ドミナントネガティブ変異体)、Gadd45βの発現または機能を妨害する変異または野生型形態のタンパク質、抗Gadd45β抗体、上記タンパク質のいずれかをコードするcDNA、リボザイム、合成ペプチドなどが挙げられ得る。
(a.インビトロ方法)
i)高レベルのGadd45βを発現する癌細胞(例えば、種々の乳癌細胞株)は、候補因子で処理され、そして、アポトーシスは、従来の方法(例えば、MTSアッセイ、PI染色、カスパーゼ活性化など)によって測定される。目的は、これらの因子による構成性Gadd45βの発現または機能の阻害が、癌細胞におけるアポトーシスを誘導し得るか否かを決定することである。ii)別の研究において、試験される因子とともに、細胞は、TNFαまたは他の「死レセプター」(DR)のリガンド(例えば、Fasに結合するFasリガンド、またはTRAIL−R1およびTRAIL−R2の両方に結合するTRAIL)で処理され得る。これらの研究の目的は、Gadd45βの阻害が、癌細胞を、DR誘導性アポトーシスに対してより感受性にさせるか否かを評価することである。iii)他の研究において、癌細胞は、従来の化学療法剤または放射線と組み合わせて、Gadd45βの発現または機能を阻害する因子を用いて処理される。DNA損傷因子は、これらの研究の重要な候補である。しかし、任意の化学療法剤が使用され得る。目的は、Gadd45βの阻害が、癌細胞を、化学療法または放射線によって誘導されるアポトーシスに対してより感受性にするか否かを決定することである。
i)高レベルのGadd45βを発現する癌細胞(例えば、種々の乳癌細胞株)は、候補因子で処理され、そして、アポトーシスは、従来の方法(例えば、MTSアッセイ、PI染色、カスパーゼ活性化など)によって測定される。目的は、これらの因子による構成性Gadd45βの発現または機能の阻害が、癌細胞におけるアポトーシスを誘導し得るか否かを決定することである。ii)別の研究において、試験される因子とともに、細胞は、TNFαまたは他の「死レセプター」(DR)のリガンド(例えば、Fasに結合するFasリガンド、またはTRAIL−R1およびTRAIL−R2の両方に結合するTRAIL)で処理され得る。これらの研究の目的は、Gadd45βの阻害が、癌細胞を、DR誘導性アポトーシスに対してより感受性にさせるか否かを評価することである。iii)他の研究において、癌細胞は、従来の化学療法剤または放射線と組み合わせて、Gadd45βの発現または機能を阻害する因子を用いて処理される。DNA損傷因子は、これらの研究の重要な候補である。しかし、任意の化学療法剤が使用され得る。目的は、Gadd45βの阻害が、癌細胞を、化学療法または放射線によって誘導されるアポトーシスに対してより感受性にするか否かを決定することである。
(b.インビボ方法)
上記方法は、動物モデルで使用される。試験される因子は、例えば、Gadd45βを発現するトランスジェニックマウスまたは高レベルのGadd45βを発現する腫瘍細胞を注射されたマウスにおいて使用される。なぜなら、これらは、高レベルのGadd45βを天然に発現するか、またはこれらが、そうするように操作されている(例えば、トランスフェクトされた細胞)かのいずれかであるからである。マウスにおいて腫瘍を形成し得る細胞株が、これらの研究について特に興味がある。Gadd45βインヒビターの効果は、腫瘍生存度に対して、単独で、あるいはDRのリガンド(例えば、TNFαおよびTRAIL)、化学療法剤、または放射線と組み合わせて、のいずれかで評価される。これらのアッセイはまた、動物におけるGadd45β阻害またはコンビナトリアル治療の特定の手段の潜在的な毒性の決定を可能にする。
上記方法は、動物モデルで使用される。試験される因子は、例えば、Gadd45βを発現するトランスジェニックマウスまたは高レベルのGadd45βを発現する腫瘍細胞を注射されたマウスにおいて使用される。なぜなら、これらは、高レベルのGadd45βを天然に発現するか、またはこれらが、そうするように操作されている(例えば、トランスフェクトされた細胞)かのいずれかであるからである。マウスにおいて腫瘍を形成し得る細胞株が、これらの研究について特に興味がある。Gadd45βインヒビターの効果は、腫瘍生存度に対して、単独で、あるいはDRのリガンド(例えば、TNFαおよびTRAIL)、化学療法剤、または放射線と組み合わせて、のいずれかで評価される。これらのアッセイはまた、動物におけるGadd45β阻害またはコンビナトリアル治療の特定の手段の潜在的な毒性の決定を可能にする。
(20.NF−κBによるgadd45βプロモーターの調節)
κB結合部位を、Gadd45βプロモーターにおいて同定した。gadd45βプロモーターにおける機能的κB部位の存在は、Gadd45βの調節におけるNF−κB複合体の直接的な関係を示し、それによって、NF−κBによって重要な保護機構を提供する。
κB結合部位を、Gadd45βプロモーターにおいて同定した。gadd45βプロモーターにおける機能的κB部位の存在は、Gadd45βの調節におけるNF−κB複合体の直接的な関係を示し、それによって、NF−κBによって重要な保護機構を提供する。
(21.gadd45βプロモーターの単離および分析)
マウスgadd45β遺伝子を含むBACクローンを、129SBマウスゲノムライブラリー(マウスES Iライブラリー;Research Genetics)から単離し、XhoIで消化し、そしてpBluescript II SK−(pBS;Stratagene)のXhoI部位に連結した。gadd45βの7384bpのXho Iフラグメントを保有するpBSプラスミド(pBS−014D)をその後単離し、University of Chicagoの配列決定施設にて自動配列決定によって完全に配列決定した。TRANSFACデータベース(Heinemeyerら、1999)を使用して、推定転写因子結合DNAエレメントを同定し、一方で、BLASTエンジン(Tatusovaら、1999)を、ヒトプロモーターとの比較分析のために使用した。
マウスgadd45β遺伝子を含むBACクローンを、129SBマウスゲノムライブラリー(マウスES Iライブラリー;Research Genetics)から単離し、XhoIで消化し、そしてpBluescript II SK−(pBS;Stratagene)のXhoI部位に連結した。gadd45βの7384bpのXho Iフラグメントを保有するpBSプラスミド(pBS−014D)をその後単離し、University of Chicagoの配列決定施設にて自動配列決定によって完全に配列決定した。TRANSFACデータベース(Heinemeyerら、1999)を使用して、推定転写因子結合DNAエレメントを同定し、一方で、BLASTエンジン(Tatusovaら、1999)を、ヒトプロモーターとの比較分析のために使用した。
(22.プラスミド)
pMT2T発現プラスミド、pMT2T−p50発現プラスミドおよびpMT2T−RelA発現プラスミドが、以前に記載された(Franzosoら、1992)。gadd45β−CATレポーター構築物を作製するために、gadd45βプロモーターの部分を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用することによって、pBS−014Dから増幅した。このPCRは、以下のプライマーを使用した:
pMT2T発現プラスミド、pMT2T−p50発現プラスミドおよびpMT2T−RelA発現プラスミドが、以前に記載された(Franzosoら、1992)。gadd45β−CATレポーター構築物を作製するために、gadd45βプロモーターの部分を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用することによって、pBS−014Dから増幅した。このPCRは、以下のプライマーを使用した:
κB−1M−gadd45β−CAT、κB−2M−gadd45β−CAT、およびκB−3M−gadd45β−CATを、QuickChangeTMキット(Stratagene)を製造業者の指示書に従って使用して、−592/+23−gadd45β−CATプラスミドの部位特異的変異誘発によって得た。以下の塩基置換を導入した。
Δ56−κB−1/2−CATレポータープラスミド、Δ56−κB−3−CATレポータープラスミド、およびΔ56−κB−M−CATレポータープラスミドを、マウスgadd45βプロモーター由来の野生型オリゴヌクレオチドまたは変異型オリゴヌクレオチドを、最小マウスc−fosプロモーターのすぐ上流に位置するBglII部位とXhoI部位との間のΔ56−CAT中に挿入することによって、構築した。使用したオリゴヌクレオチドは、
(23.トランスフェクション、CATアッセイ、および電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA))
NTera−2細胞のリン酸カルシウム媒介性の一過性トランスフェクションおよびCATアッセイ(シンチレーションバイアル計測を含む)を、以前に報告された(Franzosoら,1992,1993)ように実行した。EMSA、過剰シフト分析、ならびにヒトp50およびRelAのN末端ペプチドに対する抗体は、以前に記載された(Franzosoら,1992)とおりであった。以前に記載されたように、緩衝液C(20mM HEPES(pH7.9)、0.2MM EDTA;0.5mM MgCl2、0.5M NaCl、25%グリセロール、およびプロテアーゼインヒビターのカクテル(Boehringer Mannheim)中での凍結融解の繰り返し、引き続く超遠心分離によって、トランスフェクトされたNTera−2細胞からの全細胞抽出物を調製した。
NTera−2細胞のリン酸カルシウム媒介性の一過性トランスフェクションおよびCATアッセイ(シンチレーションバイアル計測を含む)を、以前に報告された(Franzosoら,1992,1993)ように実行した。EMSA、過剰シフト分析、ならびにヒトp50およびRelAのN末端ペプチドに対する抗体は、以前に記載された(Franzosoら,1992)とおりであった。以前に記載されたように、緩衝液C(20mM HEPES(pH7.9)、0.2MM EDTA;0.5mM MgCl2、0.5M NaCl、25%グリセロール、およびプロテアーゼインヒビターのカクテル(Boehringer Mannheim)中での凍結融解の繰り返し、引き続く超遠心分離によって、トランスフェクトされたNTera−2細胞からの全細胞抽出物を調製した。
(24.BJABクローンの生成および処理ならびにヨウ化オロピジウム(Oropidium)染色アッセイ)
安定なクローンを生成するために、BJAB細胞をpcDNA−HA−Gadd45βまたは空のpcDNA−HAプラスミド(Invitrogen)でトランスフェクトし、そして24時間後、G418における選択(セルグロ(Cellgro);4mg/ml)に供した。伸長し、そしてHAーGadd45βが発現した耐性クローンを、抗HA抗体、または充填を制御するための抗βアクチン抗体を使用するウェスタンブロッティングによって評価した。
安定なクローンを生成するために、BJAB細胞をpcDNA−HA−Gadd45βまたは空のpcDNA−HAプラスミド(Invitrogen)でトランスフェクトし、そして24時間後、G418における選択(セルグロ(Cellgro);4mg/ml)に供した。伸長し、そしてHAーGadd45βが発現した耐性クローンを、抗HA抗体、または充填を制御するための抗βアクチン抗体を使用するウェスタンブロッティングによって評価した。
次いで、高レベルのHA−Gadd45βを発現するクローンおよびコントロールHAクローン(新生クローンとも称される)を12ウェルプレート中に供与し、そして未処理のままか、またはアゴニスト性の抗Fas抗体APO−1(1μg/ml;Alexis)または組換えTRAIL(100ng/ml;Alexis)で処理した。示された時間で、細胞を回収し、2回PBS中で洗浄し、そして0.1%クエン酸Na(pH7.4)、50μg/mlヨウ化プロピジウム(PI;Sigma)、および0.1% Triton X−100を含む溶液中で一昼夜4°Cでインキュベートした。次いで、細胞を、FL−2チャネルおよびFL−3チャネルの両方においてフローサイトメトリー(FCM)によって試験し、そして2N未満のDNA含量を有する細胞(サブ−G1区分)を、アポトーシスとしてスコアリングした。
JNKブロッカーSP600125(Calbiochem)での保護処理のためにBJAB細胞を未処理のままにしておくか、または示されるように30分間種々の濃度のブロッカーで前処理し、次いで、さらに16時間アゴニスト性の抗Fas抗体APO−1(1μg/ml)とともにインキュベートした。アポトーシスを、本明細書中で記載されるようにPIアッセイにおいてスコアリングした。
(25.処理、ウイルス形質導入(tranduction)、およびJNKヌル繊維芽細胞でのJNKキナーゼアッセイ)
適切なコントロール繊維芽細胞とともに、jnk1およびjnk2遺伝子の同時欠損を含むJNKヌル繊維芽細胞を、Dr.Roger Davis(マサチューセッツ大学)から得た。細胞傷害実験のために、ノックアウト細胞および野生型細胞を、10,000細胞/ウェルの密度で48ウェルプレート中に播種し、そして24時間後、TNFα単独(1,000U/ml)または増加濃度のシクロヘキシミド(CHX)で処理した。アポトーシスを、メーカーの指示に従って細胞死検出ELISAキット(Boehringer−Roche)を使用する処理から8時間後にモニタリングした。簡単に言えば、細胞をウェル中で直接溶解した後、細胞溶解物中の遊離ヌクレオソームを、ビオチン化抗ヒストン抗体を使用するELISAによって定量した。実験は3回実行した。
適切なコントロール繊維芽細胞とともに、jnk1およびjnk2遺伝子の同時欠損を含むJNKヌル繊維芽細胞を、Dr.Roger Davis(マサチューセッツ大学)から得た。細胞傷害実験のために、ノックアウト細胞および野生型細胞を、10,000細胞/ウェルの密度で48ウェルプレート中に播種し、そして24時間後、TNFα単独(1,000U/ml)または増加濃度のシクロヘキシミド(CHX)で処理した。アポトーシスを、メーカーの指示に従って細胞死検出ELISAキット(Boehringer−Roche)を使用する処理から8時間後にモニタリングした。簡単に言えば、細胞をウェル中で直接溶解した後、細胞溶解物中の遊離ヌクレオソームを、ビオチン化抗ヒストン抗体を使用するELISAによって定量した。実験は3回実行した。
MIGR1レトロウイルスベクターを、Dr.Harinder Singh(シカゴ大学)から得た。活性JNK1を構成的に発現するMIGR1−JNKK2−JNK1を、pSRα−JNKK2−JNK1(Dr.Anning Lin、シカゴ大学)から得たJNKK2−JNK1のHindIII−BglIIフラグメントを切除することによって生成し、そしてクレノー反応によってこのフラグメントを埋めた後、MIGR1の埋められたXhoI部位に挿入した。高力価のレトロウイルス調製物を、MIGR1またはMIGR1−JNKK2−JNK1をトランスフェクトしたPhoenix細胞から得た。ウイルスの形質転換のために、突然変異繊維芽細胞を100,000/ウェルで6ウェルプレート中に播種し、そして一昼夜4mlのウイルス調製物および1mlの完全DMEM培地とともに5μg/mlのポリブレン(polybrene)中でインキュベートした。次いで、細胞を完全培地で洗浄し、そして48時間後、細胞傷害アッセイのために使用した。
JNKキナーゼアッセイのために、細胞を未処理のままにしておくか、またはTNFα(1,000U/ml)で10分間処理し、そして溶解物を20mM HEPES(pH8.0)、350mM NaCl、20%グリセロール、1%NP−40、1mM MgCl2、0.2mM EGTA、1mM DTT、1mM Na3VO4、50mM NaF、およびプロテアーゼインヒビターを含む緩衝液中で調製した。JNKを細胞溶解物から市販の抗JNK抗体(BD Pharmingen)を使用して免疫沈降し、そしてキナーゼアッセイを図6および7で示されるようにGST−c−Jun基質を使用して実行した。
(26.WEHI−231細胞の処理および電気泳動移動度シフトアッセイ)
WEHI−231細胞を、American Type Culture Collection(ATCC)の推奨に従って10%FBSを補充したRPMI培地中で培養した。電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)について、細胞を40μg/mlのリポ多糖類(LPS;Escherichia coli血清型0111:B4)で処理し、そして示された時間で回収した。細胞溶解物を、緩衝液C(20mM HEPES(pH7.9)、0.2mM EDTA、0.5mM DTT、1.5mM MgCl2、0.42M NaCl、25%グリセロール、およびプロテアーゼインヒビター)中での凍結融解の繰り返し、引き続く超遠心分離によって調製した。インビトロでのDNA結合アッセイについて、2μlの細胞抽出物を、マウスgadd45βプロモーターにおける見出される3つのκB部位のそれぞれに由来する放射性標識したプローブとともに20分間インキュベートした。インキュベーションを、1μg/mlのポリdI−dCおよび0.1μg/mlのBSAを含む緩衝液D(20mM HEPES(pH7.9)、20%グリセロール、100mM KCl、0.2mM EDTA、0.5mM DTT、0.5mM PMSF)中で実行し、そしてDNA結合複合体をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。過剰シフトのために、抽出物を10分間、1μlの個々のNF−κBサブユニットと反応する抗体と共にプレインキュベートした。
WEHI−231細胞を、American Type Culture Collection(ATCC)の推奨に従って10%FBSを補充したRPMI培地中で培養した。電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)について、細胞を40μg/mlのリポ多糖類(LPS;Escherichia coli血清型0111:B4)で処理し、そして示された時間で回収した。細胞溶解物を、緩衝液C(20mM HEPES(pH7.9)、0.2mM EDTA、0.5mM DTT、1.5mM MgCl2、0.42M NaCl、25%グリセロール、およびプロテアーゼインヒビター)中での凍結融解の繰り返し、引き続く超遠心分離によって調製した。インビトロでのDNA結合アッセイについて、2μlの細胞抽出物を、マウスgadd45βプロモーターにおける見出される3つのκB部位のそれぞれに由来する放射性標識したプローブとともに20分間インキュベートした。インキュベーションを、1μg/mlのポリdI−dCおよび0.1μg/mlのBSAを含む緩衝液D(20mM HEPES(pH7.9)、20%グリセロール、100mM KCl、0.2mM EDTA、0.5mM DTT、0.5mM PMSF)中で実行し、そしてDNA結合複合体をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。過剰シフトのために、抽出物を10分間、1μlの個々のNF−κBサブユニットと反応する抗体と共にプレインキュベートした。
(27.BT−20細胞およびMDA−MD−231細胞の処理)
乳癌細胞株を、10%FCSを補充した完全DMEM培地中で培養し、そして100,000/ウェルで12ウェルプレート中に播種した。24時間後、培養物を未処理のままにしておくか、または1時間示された濃度のSP600125インヒビター(Calbiochem)で前処理し、その後NF−κBインヒビターであるプロスタグランジンA1、CAPE、またはパルセノリド(parthenolide)(Biomol)を図20で示されるように添加した。示された時間で、細胞死を光学顕微鏡によって形態学的にスコアリングした。
乳癌細胞株を、10%FCSを補充した完全DMEM培地中で培養し、そして100,000/ウェルで12ウェルプレート中に播種した。24時間後、培養物を未処理のままにしておくか、または1時間示された濃度のSP600125インヒビター(Calbiochem)で前処理し、その後NF−κBインヒビターであるプロスタグランジンA1、CAPE、またはパルセノリド(parthenolide)(Biomol)を図20で示されるように添加した。示された時間で、細胞死を光学顕微鏡によって形態学的にスコアリングした。
(28.293細胞溶解物との共免疫沈降)
全長(FL)ヒトMEKK1、MEKK3、GCK、GCKR、ASK1、MKK7/JNKK2、およびJNK3またはマウスMEKK4およびMKK4/JNKK1のいずれかを発現する15μgのpcDNA−HAプラスミドで、15μgのFLマウスGadd45βを発現するpcDNA−FLAG−Gadd45βまたは空のpcDNA−FLAGベクター(pcDNAベクター(Invitrogen))とともに用いる、リン酸カルシウム法によって、293細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションから24時間後、細胞を回収し、そして細胞溶解物を、CO−IP緩衝液(40mM TRIS(pH7.4)、150mM NaCl、1% NP−40、5mM EGTA、20mM NaF、1mM Na3VO4、およびプロテアーゼインヒビター)中で細胞ペレットを再懸濁し、そしてそれらを超遠心分離に供することで調製した。
全長(FL)ヒトMEKK1、MEKK3、GCK、GCKR、ASK1、MKK7/JNKK2、およびJNK3またはマウスMEKK4およびMKK4/JNKK1のいずれかを発現する15μgのpcDNA−HAプラスミドで、15μgのFLマウスGadd45βを発現するpcDNA−FLAG−Gadd45βまたは空のpcDNA−FLAGベクター(pcDNAベクター(Invitrogen))とともに用いる、リン酸カルシウム法によって、293細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションから24時間後、細胞を回収し、そして細胞溶解物を、CO−IP緩衝液(40mM TRIS(pH7.4)、150mM NaCl、1% NP−40、5mM EGTA、20mM NaF、1mM Na3VO4、およびプロテアーゼインヒビター)中で細胞ペレットを再懸濁し、そしてそれらを超遠心分離に供することで調製した。
共免疫沈降(co−IP)について、200μgの細胞溶解物を抗FLAG(M2)でコートしたビーズ(Sigma)とともにCO−IP緩衝液中で4時間4°Cでインキュベートした。インキュベーション後、ビーズを4回洗浄し、そしてSDS−ポリアクリアミドゲル上に充填し、そしてウェスタンブロットを、抗HA抗体(Santa Cruz)を使用して実行した。
(29.GST融合タンパク質構築およびGSTプルダウンアッセイ)
マウスGadd45βおよびヒトJNKK2を、それぞれ、pGEX−3XおよびpGEX−2T細菌性発現ベクター(両方ともAmershamから)のEcoRiおよびBamHI部位でクローニングした。これらの構築物および挿入のないpGEX−3Xベクターを、GST−Gadd45βタンパク質、GST−JNKK2タンパク質、およびGSTタンパク質を発現させるためにE.coli BL21細胞に導入した。1mM IPTGでの誘導後、細胞をPBS中で超音波破砕によって溶解し、そしてグルタチオン−セファロースビーズ(Sigma)とともに1%Triton X−100の存在下で沈殿させ、そして4回同じ緩衝液中で洗浄した。
マウスGadd45βおよびヒトJNKK2を、それぞれ、pGEX−3XおよびpGEX−2T細菌性発現ベクター(両方ともAmershamから)のEcoRiおよびBamHI部位でクローニングした。これらの構築物および挿入のないpGEX−3Xベクターを、GST−Gadd45βタンパク質、GST−JNKK2タンパク質、およびGSTタンパク質を発現させるためにE.coli BL21細胞に導入した。1mM IPTGでの誘導後、細胞をPBS中で超音波破砕によって溶解し、そしてグルタチオン−セファロースビーズ(Sigma)とともに1%Triton X−100の存在下で沈殿させ、そして4回同じ緩衝液中で洗浄した。
インビトロでの転写反応および翻訳反応を、[35S]メチオニン存在下で、メーカーの指示書に従ってTNT結合化網状赤血球溶解システム(Promega)を使用して実行した。インビトロ反応を開始するために、cDNAをpBluescript(pBS)SK−プラスミド(Stratagene)にクローニングした。FLマウスMEKK4を、pBSのSpeI部位およびEcoRI部位にクローニングし、そしてT3ポリメラーゼで転写した;FLヒトJNKK2、FLマウスJNKK1、およびFLヒトASK1を、それぞれ、pBSのXbaI−EcoRI部位、NotI−EcoRI部位、およびXbaI−ApaI部位にクローニングし、そしてT7ポリメラーゼの使用によって転写した。pBS−C−ASK1(ヒトASK1のアミノ酸648〜1375をコードする)は、ASK1のEarIおよびXbaIフラグメントの切断ならびに以下のオリゴヌクレオチドリンカー:5’−CGCCACCATGGAGATGGTGAACACCAT−3’の挿入によってpBS−FL−ASK1に由来した。N−ASK1(ASk1の1〜756アミノ酸フラグメントをコードする)を、PpuMIで消化したpBS−FL−ASK1でインビトロでの転写/翻訳反応をプライムすることによって得た。
N末端が欠損したヒトJNKK2を発現するpBSプラスミドを、BamHIおよびJNKK2のコード配列内を切断する適切な制限酵素でのpBS−FL−JNKK2の消化、ならびに以下:BamHI部位、Kozak配列、開始ATG、およびJNKK2の7残基と13残基の間をコードするヌクレオチド配列を含む(5’→3’)オリゴヌクレオチドを有する切除フラグメントでの置換によって生成し、これは、図28において示されるJNKK2のカルボキシ末端のアミノ酸部分をコードするpBSプラスミドを生じる。JNKK2C末端欠損を生成するために、インビトロでの転写/翻訳反応をプライムするために使用する前に、pBS−FL−JNKK2をSacII、PpuMI、NotI、XcmI、BsgI、BspEI、BspHI、またはPflMIで直線化した。結果として生じたポリペプチド産物は、図28において示されるJNKK2のアミノ末端アミノ酸配列を含む。
Gadd45βポリペプチドを生成するために、インビトロ反応をpBS−GFP−Gadd45β(FLまたは切断したGadd45βに直接融合された緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする)でプライムした。これらのプラスミドを得るために、pBS−Gadd45β(FL)、pBS−Gadd45β(41−160)、pBS−Gadd45β(60−160)、pBS−Gadd45β(69−160)、pBS−Gadd45β(87−160)、およびpBS−Gadd45β(113−160)(マウスGadd45βの対応するアミノ酸残基をコードする)を、適切なgadd45β cDNAフラグメントをpBS SK−のXhoI部位およびHindIII部位にクローニングすることによって生成した。次いで、これらのプラスミド(FLまたは切断したGadd45βのいずれかをコードする)をKpnIおよびXhoIで開き、そして切断したDNAフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチドリンカー:5’―GTACAAGGGTATGGCTATGTCAATGGGAGGTAG−3’に直接結合するpEGFP−N1(Clontech;GFPをコードする配列を含む)のKpnI−BsrGIフラグメントで置換した。これらの構築物を、pBS−GFP−Gadd45βと称した。Gadd45βのC末端欠損を、インビトロでのタンパク質合成にするためにNgoMI、SphI、またはEcoRV制限酵素で消化したpBS−GFP−Gadd45β(FL)を使用することにより、JNKK2欠損について記載されるように得た。これらのプラスミドは、それぞれ、Gadd45βの1〜134アミノ酸フラグメント、1〜95アミノ酸フラグメント、および1〜68アミノ酸フラグメントをコードした。全てのpBS−Gadd45β構築物を、T7ポリメラーゼを使用して転写した。
GSTプルダウン実験について、5μlのインビトロで翻訳され、そして放射性標識したタンパク質を、GST、GST−JNKK2(Gadd45β翻訳産物を有するのみ)、またはGST−Gadd45β(ASK1、MEKK4、JNKK1、およびJNKK2翻訳産物を有するのみ)を有するグルタチオンビーズと混合し、そして1時間室温で、20mM TRIS、150mM NaC、および0.2% Triton X−100を含む緩衝液中でインキュベートした。次いで、このビーズを沈殿し、そして4回同じ緩衝液で洗浄し、そしてこの物質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。GSTおよびGST−JNKK2またはGST−Gadd45βビーズの各対と一緒に、2μlの粗製のインビトロ転写/翻訳反応物(投入量)を充填した。
(30.キナーゼアッセイ)
キナーゼ活性に対する組換えGadd45βタンパク質の阻害効果を試験するために、リン酸カルシウム方法を使用することによって、30μgの総DNAに対して1〜10μgのpCDNA−FLAG−JNKK2、pCDNA−FLAG−JNKK1、pCDNA−FLAG−MKK3bまたはpCDNA−FLAG−ASK1、および空のpCDNA−FLAGによりHEK−293細胞をトランスフェクトした。24時間後、細胞を20分間ヒトTNFα(1,000U/ml)で処理するかまたは未処理のままにし、回収し、そして20mM HEPES(pH8.0)、350mM NaCl、20%グリセロール、1%NP−40、1mM MgCl2、0.2mM EGTA、1mM DTT、1mM Na3VO4、50mM NaF、およびプロテアーゼインヒビターを含む緩衝液中で溶解し、そして超遠心分離に供した。抗FLAG(M2)をコーティングしたビーズ(Sigma)および200μgの細胞溶解物を使用して免疫沈降を実行した。免疫沈降後、ビーズを溶解緩衝液中で2回およびさらにキナーゼ緩衝液中で2回洗浄した。免疫沈降のキナーゼ活性についてアッセイするために、ビーズを10分間組換えHis6−Gadd45β、GST−Gadd45β、またはコントロールタンパク質の量を増加させて、10M ATPおよび10μCi[32P]−γATPを含む30μlのキナーゼ緩衝液中でプレインキュベートし、そして示されるように、さらに1時間30°Cで1μgの適切なキナーゼ基質とともにインキュベートした。以下のキナーゼ緩衝液を使用した:JNKK2について、20mM HEPES、20mM MgCl2、20mM β−グリセロリン酸、1mM DTT、および50μM Na3VO4;JNKK1について、20mM HEPES、10mM MgCl2、20mM β−グリセロリン酸、および0.5mM DTT;MKK3について、25mM HEPES、25mM MgCl2、25mM β−グリセロリン酸、0.5mM DTT、および50μM Na3VO4;ASK1について、20mM TrisHCl、20mM MgCl2、20mM β−グリセロリン酸、1mM DTT、および50μM Na3VO4。
キナーゼ活性に対する組換えGadd45βタンパク質の阻害効果を試験するために、リン酸カルシウム方法を使用することによって、30μgの総DNAに対して1〜10μgのpCDNA−FLAG−JNKK2、pCDNA−FLAG−JNKK1、pCDNA−FLAG−MKK3bまたはpCDNA−FLAG−ASK1、および空のpCDNA−FLAGによりHEK−293細胞をトランスフェクトした。24時間後、細胞を20分間ヒトTNFα(1,000U/ml)で処理するかまたは未処理のままにし、回収し、そして20mM HEPES(pH8.0)、350mM NaCl、20%グリセロール、1%NP−40、1mM MgCl2、0.2mM EGTA、1mM DTT、1mM Na3VO4、50mM NaF、およびプロテアーゼインヒビターを含む緩衝液中で溶解し、そして超遠心分離に供した。抗FLAG(M2)をコーティングしたビーズ(Sigma)および200μgの細胞溶解物を使用して免疫沈降を実行した。免疫沈降後、ビーズを溶解緩衝液中で2回およびさらにキナーゼ緩衝液中で2回洗浄した。免疫沈降のキナーゼ活性についてアッセイするために、ビーズを10分間組換えHis6−Gadd45β、GST−Gadd45β、またはコントロールタンパク質の量を増加させて、10M ATPおよび10μCi[32P]−γATPを含む30μlのキナーゼ緩衝液中でプレインキュベートし、そして示されるように、さらに1時間30°Cで1μgの適切なキナーゼ基質とともにインキュベートした。以下のキナーゼ緩衝液を使用した:JNKK2について、20mM HEPES、20mM MgCl2、20mM β−グリセロリン酸、1mM DTT、および50μM Na3VO4;JNKK1について、20mM HEPES、10mM MgCl2、20mM β−グリセロリン酸、および0.5mM DTT;MKK3について、25mM HEPES、25mM MgCl2、25mM β−グリセロリン酸、0.5mM DTT、および50μM Na3VO4;ASK1について、20mM TrisHCl、20mM MgCl2、20mM β−グリセロリン酸、1mM DTT、および50μM Na3VO4。
内因性キナーゼの活性をアッセイするために、示されたように、各酵素に特異的な適切な市販の抗体(Santa Cruz)およびTNFα(1,000U/ml)での刺激前および後に、3DO−IκBαM−Gadd45βおよび3DO−IκBαM−Hygroクローンから得た細胞溶解産物を使用して免疫沈降を実行した。組換えGadd45βタンパク質との免疫沈降物をプレインキュベートすることを除いて、キナーゼアッセイを上述されたように実行した。
(31.RelAノックアウト細胞およびpEGFP−Gadd45β構築物における細胞保護アッセイ)
マウスGadd45βのN末端切断物およびC末端切断物を発現するプラスミドを、適切なgadd45β cDNAフラグメントをpEGFP−N1(Clontech)のXhoI部位およびBamHI部位でクローニングすることによって得た。これらの構築物は、GFPのN末端に直接融合したGadd45βの示されたアミノ酸を発現した。細胞保護アッセイについて、製造者の指示書に従いSuperfect(Qiagen)を使用することによって、GFP−Gadd45βをコードするプラスミドまたは空のpEGFPをRelA−/−細胞にトランスフェクトし、そして24時間後、培養をCHX単独(0.1μg/ml)またはCHX+TNFα(1,000U/ml)で処理した。12時間の処理後、GFP陽性を評価するために、組織培養プレートに接着した生存細胞をFCMによって数え、そして試験した。CHX単独で処理したものと比較してCHXおよびTNFαで処理した培養中に存在する生存GFP+細胞の総数を外挿することによって、パーセント生存値を計測した。
マウスGadd45βのN末端切断物およびC末端切断物を発現するプラスミドを、適切なgadd45β cDNAフラグメントをpEGFP−N1(Clontech)のXhoI部位およびBamHI部位でクローニングすることによって得た。これらの構築物は、GFPのN末端に直接融合したGadd45βの示されたアミノ酸を発現した。細胞保護アッセイについて、製造者の指示書に従いSuperfect(Qiagen)を使用することによって、GFP−Gadd45βをコードするプラスミドまたは空のpEGFPをRelA−/−細胞にトランスフェクトし、そして24時間後、培養をCHX単独(0.1μg/ml)またはCHX+TNFα(1,000U/ml)で処理した。12時間の処理後、GFP陽性を評価するために、組織培養プレートに接着した生存細胞をFCMによって数え、そして試験した。CHX単独で処理したものと比較してCHXおよびTNFαで処理した培養中に存在する生存GFP+細胞の総数を外挿することによって、パーセント生存値を計測した。
(32.実施例12におけるプラスミド)
pcDNA−HA−GCKR、pCEP−HA−MEKK1、pcDNA−HA−ASK1、pCMV5−HA−MEKK3、pCMV5−HA−MEKK4、pcDNA−HA−MEK1、pMT3−HA−MKK4、pSRα−HA−JNK1、pMT2T−HA−JNK3、pcDNA−HA−ERK1、pSRα−HA−ERK2、pcDNA−FLAG−p38α、pcDNA−FLAG−p38β、pcDNA−FLAG−p38γ、およびpcDNA−FLAG−p38δは、A.Leonardi、H.Ichijo、J.Landry、R.Vaillancourt、P.Vito、T.H.Wang、J.Wimalasena、およびH.Gramによって提供された。pcDNA−HA−Gadd45β、pGEX−JNK1、pET28−His6/T7−JIPI(JIP1bのMKK7結合ドメインを発現する)、およびpProEx−1.His6−EF3(浮腫因子3を発現する)。他のFLAGまたはHAをコードする構築物全てを、pcDNA(Invitrogen)を使用して生成した。細菌性発現のために、以下のベクター内でサブクローニングした:pET−28(Novagen)におけるHis6/T7−Gadd45β;pProEx−1.H6 20におけるHis6−Gadd45β;pGEX(Amersham)におけるGST−p38α、GST−MKK7、およびGST−Gadd45β。インビトロでの転写/翻訳をプライムするために、pBluescript(BS)−MEKK4、pBS−ASK1、およびpBS−MKK7を生成した(図26);ヒトMKK7のN末端切断物およびポリペプチドフラグメントを発現するpBSをベースにしたプラスミド。放射性標識を増強するために、後者のプラスミドを強化緑色蛍光タンパク質(eGFP、Clontech)に融合して発現させた。ASK11−757(ASK1のアミノ酸1〜757をコードする)およびC末端MKK7切断物を、それぞれ適切な制限酵素でpBS−ASK1およびpBS−MKK7を直線化することによって得た。
pcDNA−HA−GCKR、pCEP−HA−MEKK1、pcDNA−HA−ASK1、pCMV5−HA−MEKK3、pCMV5−HA−MEKK4、pcDNA−HA−MEK1、pMT3−HA−MKK4、pSRα−HA−JNK1、pMT2T−HA−JNK3、pcDNA−HA−ERK1、pSRα−HA−ERK2、pcDNA−FLAG−p38α、pcDNA−FLAG−p38β、pcDNA−FLAG−p38γ、およびpcDNA−FLAG−p38δは、A.Leonardi、H.Ichijo、J.Landry、R.Vaillancourt、P.Vito、T.H.Wang、J.Wimalasena、およびH.Gramによって提供された。pcDNA−HA−Gadd45β、pGEX−JNK1、pET28−His6/T7−JIPI(JIP1bのMKK7結合ドメインを発現する)、およびpProEx−1.His6−EF3(浮腫因子3を発現する)。他のFLAGまたはHAをコードする構築物全てを、pcDNA(Invitrogen)を使用して生成した。細菌性発現のために、以下のベクター内でサブクローニングした:pET−28(Novagen)におけるHis6/T7−Gadd45β;pProEx−1.H6 20におけるHis6−Gadd45β;pGEX(Amersham)におけるGST−p38α、GST−MKK7、およびGST−Gadd45β。インビトロでの転写/翻訳をプライムするために、pBluescript(BS)−MEKK4、pBS−ASK1、およびpBS−MKK7を生成した(図26);ヒトMKK7のN末端切断物およびポリペプチドフラグメントを発現するpBSをベースにしたプラスミド。放射性標識を増強するために、後者のプラスミドを強化緑色蛍光タンパク質(eGFP、Clontech)に融合して発現させた。ASK11−757(ASK1のアミノ酸1〜757をコードする)およびC末端MKK7切断物を、それぞれ適切な制限酵素でpBS−ASK1およびpBS−MKK7を直線化することによって得た。
(33.処理およびアポトーシスアッセイ)
処理は以下のとおりであった;マウスTNFα(Peprotech)を1,000U/ml(図27)または10U/ml(図30);ヒトTNFα(Peprotech)を2,000U/ml;PMAおよびイオノマイシン(ionomycin)(Sigma)をそれぞれ100ng/mlおよび1μM。図30において、HIV−TATペプチド(5μM)またはDMSOでの前処理は30分間であり、TNFαとのインキュベーションは、それぞれさらに7時間および3.5時間であった。Cell Death Detection ELISAPLUS kit(Roche)を使用することによって、アポトーシスを測定した。
処理は以下のとおりであった;マウスTNFα(Peprotech)を1,000U/ml(図27)または10U/ml(図30);ヒトTNFα(Peprotech)を2,000U/ml;PMAおよびイオノマイシン(ionomycin)(Sigma)をそれぞれ100ng/mlおよび1μM。図30において、HIV−TATペプチド(5μM)またはDMSOでの前処理は30分間であり、TNFαとのインキュベーションは、それぞれさらに7時間および3.5時間であった。Cell Death Detection ELISAPLUS kit(Roche)を使用することによって、アポトーシスを測定した。
(34.結合アッセイ、タンパク質精製、およびキナーゼアッセイ)
インビトロで翻訳したタンパク質または精製したタンパク質とのGSTの沈降(図26〜30)およびキナーゼアッセイを実行した。His6/T7−Gadd45β、His6/T7−JIP1、His6−Gadd45β、His6−EF3、およびGSTタンパク質を、他で記載されたように細菌溶解物から精製し、そして緩衝液A19(図28)または5mM Na+リン酸緩衝液((pH7.6)図28、30)に対して透析した。組換えタンパクとのキナーゼプレインキュベーションは10分間であり(図28、30)、そしてペプチドまたはDMSO(−)とのGST−Gadd45βプレインキュベーションは、さらに20分間であった(図30)。抗P−MKK7抗体(Cell Signalingで開発した)との免疫沈降、引き続く抗総MKK7抗体でのウェスタンブロットを実行することによって、MKK7のリン酸化をモニタリングした。共免疫沈降のために、抽出物をIP緩衝液中に調製した。
インビトロで翻訳したタンパク質または精製したタンパク質とのGSTの沈降(図26〜30)およびキナーゼアッセイを実行した。His6/T7−Gadd45β、His6/T7−JIP1、His6−Gadd45β、His6−EF3、およびGSTタンパク質を、他で記載されたように細菌溶解物から精製し、そして緩衝液A19(図28)または5mM Na+リン酸緩衝液((pH7.6)図28、30)に対して透析した。組換えタンパクとのキナーゼプレインキュベーションは10分間であり(図28、30)、そしてペプチドまたはDMSO(−)とのGST−Gadd45βプレインキュベーションは、さらに20分間であった(図30)。抗P−MKK7抗体(Cell Signalingで開発した)との免疫沈降、引き続く抗総MKK7抗体でのウェスタンブロットを実行することによって、MKK7のリン酸化をモニタリングした。共免疫沈降のために、抽出物をIP緩衝液中に調製した。
(35.抗体)
抗MKK7抗体は、以下であった:図27、キナーゼアッセイ(ヤギ;Santa Cruz);図27、ウェスタンブロット、および図3a、右上、免疫沈降(ウサギ;Santa Cruz);図28、左上、ウェスタンブロット、(マウスモノクローナル;BD Pharmingen)。他の抗体は:Sigmaからの抗FLAG;Cell Signalingからの抗P−MKK4、抗P−MKK3/6、抗P−MeK1/2、抗総MKK3、および抗総MEK1/2;Novagenからの抗T7;Santa Cruzからの抗HA、抗総MKK4、抗総ASK1(キナーゼアッセイおよびウェスタンブロット)、および抗総MEKK1(キナーゼアッセイ、ウェスタンブロット、および共免疫沈降)であった。抗Gadd45βモノクローナル抗体(5D2.2)が存在した。
抗MKK7抗体は、以下であった:図27、キナーゼアッセイ(ヤギ;Santa Cruz);図27、ウェスタンブロット、および図3a、右上、免疫沈降(ウサギ;Santa Cruz);図28、左上、ウェスタンブロット、(マウスモノクローナル;BD Pharmingen)。他の抗体は:Sigmaからの抗FLAG;Cell Signalingからの抗P−MKK4、抗P−MKK3/6、抗P−MeK1/2、抗総MKK3、および抗総MEK1/2;Novagenからの抗T7;Santa Cruzからの抗HA、抗総MKK4、抗総ASK1(キナーゼアッセイおよびウェスタンブロット)、および抗総MEKK1(キナーゼアッセイ、ウェスタンブロット、および共免疫沈降)であった。抗Gadd45βモノクローナル抗体(5D2.2)が存在した。
(36.ペプチドの細胞内取り込みアッセイ、処理、およびアポトーシスアッセイ)
処理は以下のとおりであった:マウスTNFα(Peprotech)を1,000U/ml、10U/ml、または1,000U/ml+0.3μg/mlのシクロヘキシミド(CHX;図33);ヒトTNFα(Peprotech)を2,000U/ml;PMAおよびイオノマイシン(Sigma)を、それぞれ100ng/mlおよび1μM。H2O2およびソルビトールでの処理は、以前に記載されたとおりであった。図33において、HIV−TATペプチド(5μM)またはDMSOでの前処理は30分間であり、そしてTNFαとのインキュベーションは、それぞれさらに4時間および3.5時間であった。図33において、ペプチドを10μMで使用し、そしてTNFαとのインキュベーションは4時間であった。Cell Death Dection ELISAPLUS kit(Roche)を使用することによって、アポトーシスを測定した。細胞内取り込みを評価するために、FluoReporter FITCタンパク質標識キット(Molecular Probes)を使用することで、ペプチドを合成の間またHPLC精製後のいずれかでそのN末端にFITCを標識した。次いで、細胞を5μMのペプチドとともに20分間インキュベートし、トリプシン化に供し、PBSで3回洗浄し、そしてFCMまたは共焦点顕微鏡によって試験した。
処理は以下のとおりであった:マウスTNFα(Peprotech)を1,000U/ml、10U/ml、または1,000U/ml+0.3μg/mlのシクロヘキシミド(CHX;図33);ヒトTNFα(Peprotech)を2,000U/ml;PMAおよびイオノマイシン(Sigma)を、それぞれ100ng/mlおよび1μM。H2O2およびソルビトールでの処理は、以前に記載されたとおりであった。図33において、HIV−TATペプチド(5μM)またはDMSOでの前処理は30分間であり、そしてTNFαとのインキュベーションは、それぞれさらに4時間および3.5時間であった。図33において、ペプチドを10μMで使用し、そしてTNFαとのインキュベーションは4時間であった。Cell Death Dection ELISAPLUS kit(Roche)を使用することによって、アポトーシスを測定した。細胞内取り込みを評価するために、FluoReporter FITCタンパク質標識キット(Molecular Probes)を使用することで、ペプチドを合成の間またHPLC精製後のいずれかでそのN末端にFITCを標識した。次いで、細胞を5μMのペプチドとともに20分間インキュベートし、トリプシン化に供し、PBSで3回洗浄し、そしてFCMまたは共焦点顕微鏡によって試験した。
(37.gadd45β−/−繊維芽細胞の生成)
Gadd45βがゼロのマウスを、シカゴ大学のトランスジェニックおよびノックアウト施設の助力をもって、ES細胞における標準的な相同組換えをベースにした技術を使用することによって生成した。MEFをcoitumから14日目にマウスの胚から単離した。
Gadd45βがゼロのマウスを、シカゴ大学のトランスジェニックおよびノックアウト施設の助力をもって、ES細胞における標準的な相同組換えをベースにした技術を使用することによって生成した。MEFをcoitumから14日目にマウスの胚から単離した。
(38.ペプチド2と相互作用する因子を同定するための方法)
ペプチド2と相互作用する因子を同定するための方法としては、ツーハイブリッド系、ファージディスプレイ、アフィニティー精製、およびGSTプルダウンのような技術が挙げられる。
ペプチド2と相互作用する因子を同定するための方法としては、ツーハイブリッド系、ファージディスプレイ、アフィニティー精製、およびGSTプルダウンのような技術が挙げられる。
ファージディスプレイは、ペプチドまたはタンパク質がバクテリオファージのコートタンパク質を有する融合物として発現される選択技術を記載し、これはファージビリオンの外表面上の融合タンパク質のディスプレイを生じる一方で、この融合をコードするDNAがビリオン内に存在する。各配列をコードするDNAに対するランダムペプチド配列の巨大ライブラリー間の物理的な連結を創るために、ファージディスプレイを使用し、これは、「パニング」と呼ばれるインビトロでの選択プロセスによって、種々の標的分子(抗体、酵素、細胞表面レセプター、シグナル伝達物質など)に対するペプチドリガンドの迅速な同定を可能にする。Ph.D.TM Phage Display Peptide Library Kits(New England Biolabs、MA)のような市販のシステムを使用し得る。
相互作用するタンパク質を同定するために、アフィニティーカラムをベースにした精製システムもまた使用され得る。Strep−tag II融合タンパク質に対する操作されたストレプトアビジン(Strep−Tactinと呼ばれる)の高度な選択的結合をベースにしたStrep−tagTM精製システムのような市販のアフィニティー精製システムが有用である(IBA GmbH、Germany)。この技術は、生理学的条件下での組換えタンパク質の一工程精製を可能にし、従ってこれは、その生物活性を保存する。機能的なStrep−tag IIタンパク質をバキュロウイルス、哺乳動物細胞、酵母、および細菌を含む任意の発現系から精製するために、このStrep−tagシステムを使用し得る。この目的のために独特のStrep−Tactinアフィニティーカラムを開発し、そして対応する操作プロトコルを以下に記載する。その小さいサイズに起因して、一般的にStrep−tagは、融合パートナーの生物活性を妨げない。
酵母ツーハイブリッドシステムは、タンパク質−タンパク質相互作用を研究するために使用される、広く行き渡った方法である。このシステムにおいて、1つのタンパク質(「バイト(bait)」分子)をDNA結合ドメイン(例えば、Escherichia coli LexAタンパク質)に融合し、そして他方のパートナー(「プレイ(prey)」分子)を活性化ドメイン(例えば、酵母GAL4タンパク質)に融合する。これらのツーハイブリッドタンパク質が相互作用する場合、二部の転写因子が再構築され、そしてバイトタンパク質のDNA結合ドメインに対してDNA結合部位の下流であるレポーター遺伝子(例えば、lacZ(βガラクトシダーゼをコードする)またはhis3(イミダゾールアセトールホスフェートトランスアミナーゼ酵素をコードする))を転写活性し得る。このシステムはまた、DNA結合ドメインに融合する特定のタンパク質のための新規の結合パートナーを検出しそして特徴付けるのに非常に有用である。これは、活性化ドメインの配列に融合するcDNAのライブラリーをスクリーニングすることによって達成される。代表的なスクリーニングプロトコルにおいて、各酵母クローンからのプラスミドDNAは、cDNAを同定するために単離されなければならない。相互作用する因子を同定するために、CheckmateTM Mammalian Two−Hybrid System(Promega、Madison、WI)のような市販のシステムを使用し得る。
これらの知見へのさらなる支持を提供するために、適切な制限酵素により直線化されたpBS−JNKK2テンプレートとの網状溶解物(retyculo−lysate)反応をプログラムすることによって、JNKK2のカルボキシ末端欠失を作製した(図23B、下側)。これらの短縮を用いた結合アッセイを、本明細書に記載のように実施した。SacII(FL)、PpuMI、またはNotIによるpBS−JNKK2(FL)の消化は、JNKK2のGadd45βと相互作用する能力に有意に影響を及ぼさず、このことは、アミノ酸266〜401が、この因子への結合に必要でないことを示す。逆に、XcmIまたはBsgIによる消化(それぞれ、JNKK2(1〜197)ポリペプチドおよびJNKK2(1〜186)ポリペプチドを生成する)は、Gadd45βへの結合を部分的に阻害した。さらに、BspEI、BspHI、またはPf1MIによる切断は、より短いアミノ末端ポリペプチドを生成し、この結合を完全に抑制した。まとめると、これらの知見は、アミノ酸139〜186およびアミノ酸198〜265にわたるポリペプチド領域は、両方、JNKK2とGadd45βとの強い会合を担うことを示す。JNKK2とGadd45βとの相互作用を、JNKK2残基132と156との間および残基231と244との間にわたる2つのポリペプチドに対して主にマッピングした。JNKK2はまた、さらなるアミノ酸領域を介してGadd45βと接触し得た。
Gadd45βは、JNKK2触媒ドメイン内の2つの別個のアミノ酸領域と直接接触するという知見は、Gadd45βのJNKK2に対する阻害的効果についての機械的基礎への洞察を提供する。JNKK2のこれらの領域は、MEKK4内で相同性を共有せず、このことは、Gadd45βが、別個の表面を介してこれらのキナーゼと接触することを示唆する。Gadd45βは、酵素的活性(例えば、ホスファターゼ活性またはタンパク質分解活性)を有することは知られておらず、そして、JNKK2へのその結合が、インビトロでキナーゼ機能を阻害するのに十分であるので、Gadd45βは、キナーゼ活性または基質への接触を阻害するコンフォメーション変化または立体障害のいずれかを引き起こすことによって、触媒ドメインとの直接妨害を介してJNKK2をブロックし得る。この点に関して、133〜156ペプチド領域は、アミノ酸K149(キナーゼ活性に重要な残基)を含み、それにより、Gadd45βによるJNKK2の強力な阻害についての可能性のある機構を提供する。
図24A〜Bは、残基69〜104にわたるGadd45βアミノ酸領域が、JNKK2との相互作用に必須であることを示す。JNKK2との会合を媒介するGadd45βの領域を同定するために、GSTプルダウン実験を実施した。標準プロトコルおよびGST−JNKK2−コーティングビーズまたはGST−コーティングビーズを使用して、アッセイを実施した。Gadd45βの徐々に短くなるアミノ末端欠失をコードするpBSプラスミドを、インビトロで翻訳し、35S−メチオニンにより標識した(図24A)。マウスGadd45β(1〜160;FL)ポリペプチド、Gadd45β(41〜160)ポリペプチド、Gadd45β(60〜160)ポリペプチド、およびGadd45β(69〜160)ポリペプチドは、JNKK2と強く相互作用し、一方、Gadd45β(87〜160)は、キナーゼのみに弱く結合した。対照的に、Gadd45β(114〜160)は、JNKK2と会合することができなかった。これらの知見を確認するために、一連のカルボキシ末端Gadd45β短縮を、適切に線状化したpBS−Gadd45βプラスミドとのインビトロでの転写/翻訳反応をプログラムすることによって作製した(図24B)。pBS−Gadd45βのNgoMIによる消化は、JNKK2へのGadd45β結合に影響を及ぼさなかったが、SphIおよびEcoRVによる消化(それぞれ、Gadd45β(1〜95)およびGadd45β(1〜68)を生成する)は、JNKK2に対するGadd45β親和性を進行的に減失させた。実際に、後者のポリペプチドは、JNKK2と会合することができなかった。まとめると、このデータは、残基69〜104にわたるGadd45βポリペプチドが、JNKK2との相互作用に関与していることを示す。
図25は、残基69と113との間にわたるアミノ酸領域が、Gadd45βがTNFα誘導性アポトーシスを抑制する能力に必須であることを示す。突然変異分析を実施することによって、TNFα誘導性死滅のブロックに必要であるGadd45βのドメインを、69〜113アミノ酸領域に対してマッピングした。RelA−/−細胞における発現の際に、GFP−Gadd45β(69〜160)およびGFP−Gadd45β(1〜113)は、TNFαに対する抗アポトーシス活性を呈し、この活性は、全長GFP−Gadd45βに匹敵した。対照的に、これらのアッセイにおいて、Gadd45β(87〜160)またはGadd45β(1〜86)と融合したGFPタンパク質は、中程度の保護効果のみを有した。より短い短縮は、細胞生存に対して実質的な効果を有さず、このことは、アミノ酸69と113との間にわたるGadd45β領域が、細胞保護を提供し、隣接する60〜68領域は、この活性に中程度でのみ寄与することを示す。
このアミノ酸領域は、JNKK2との相互作用をも担うGaddのドメインを含む。このことは、Gadd45βの保護活性が、そのJNKK2への結合能力およびJNK活性化を抑制する能力に連関するという意見と一致する。
図26は、Gadd45βが、JNK経路におけるキナーゼと物理的に相互作用することを示す。a、b、293細胞由来の抗FLAG免疫沈降物(上側)または全溶解産物(中および下側)によるウェスタンブロットであり、ASK1、MEKK4、およびMKK7とのGadd45β会合を示す。c、GST−コーティングビーズまたはGST−Gadd45β−コーティングビーズおよび35S標識した、インビトロで翻訳されたタンパク質を使用するプルダウンアッセイ。40%の投入が示される。
図27は、Gadd45βおよびNF−κBが、インビボでMKK7を特異的に阻害することを示す。a〜e、リン酸化(P)キナーゼまたは全キナーゼおよびキナーゼアッセイ(K.A.)に対する抗体を用いたウェスタンブロットであり、(a〜c)IκBαM−HygroクローンおよびIκBαM−Gadd45βクローンならびに(d、e)NeoクローンおよびIκBαM 3DOクローンにおけるTNFαまたはP/IによるMAPKKおよびMAPKKKの活性化を示す。a、d、MKK7リン酸化(P−MKK7)を、組み合わせ免疫沈降(抗P−MKK7抗体)およびウェスタンブロッティング(抗全MKK7抗体)によってモニタリングした。
図28は、Gadd45βが、MKK7の直接的なインヒビターであることを示す。a、免疫沈降に続くウェスタンブロットであり、P/Iにより処理(2時間)した3DO細胞または未処理のまま(US)の3DO細胞における、内因性Gadd45βとMKK7との物理的会合(上側)を示す。タンパク質レベルを示す(下側)。b、g、クーマシーブリリアントブルー染色(CS)であり、それぞれ(c)および(d、e)において使用されたタンパク質の純度を示す。c、精製したタンパク質を用いたインビトロプルダウンアッセイであり、His6/T7−Gadd45βとGST−MKK7との間の直接的な相互作用を示す。沈降したGSTタンパク質および結合したHis6/T7タグ化タンパク質を、それぞれ抗T7抗体を用いるCSおよびウェスタンブロッティング(WB)により視覚化した。His6/T7−タグ化タンパク質の投入を示す。His6/T7−Gadd45βおよびHis6/T7−JIP1のGST−MKK7への結合の画分(任意の単位[a.u.]で表す;左)を、公知のタンパク質濃度により作製された標準曲線に対して計算した19。d、e、キナーゼアッセイであり、精製したGST−Gadd45βおよびHis6−Gadd45βによるインビトロでの活性MKK7の特異的阻害を示す。FLAGタグ化キナーゼを、TNFαにより処理した(10分)293細胞または未処理のままの293細胞から免疫沈降させ、示された濃度のGadd45βポリペプチドとともにプレインキュベートした。f、293細胞における内因性キナーゼレベルを示すウェスタンブロット。
図29は、MKK7が、その触媒ドメイン中の2つのペプチド(petidic)領域を介してGadd45βに接触することを示す。a、c、e、は、結合アッセイに使用した、MKK7 N末端短縮およびMKK7 C末端短縮ならびにペプチドそれぞれの模式図である。相互作用領域は、灰色で陰をつけてある。b、d、f、GSTがプルダウンされており、示された35S−標識されたインビトロで翻訳されたMKK7産物に結合するGST−Gadd45βを示す。40%投入を示す。g、は、Gadd45β相互作用ペプチド1および7のアミノ酸配列であり、K149を強調している。
図30は、ペプチド1が、Gadd45β(およびNF−κB)がTNFαにより誘導されるJNK活性化およびアポトーシスを抑制する能力を減失させることを示す。a、ペプチド領域1への結合が、Gadd45βによるMKK7不活性化に必要であることを示すキナーゼアッセイ(K.A.)である。FLAG−MKK7を、TNFα処理した(10分間)293細胞から免疫沈降させた。b、c、は、ペプチド1が、それぞれIκBαM−Gadd45βクローンおよびNeoクローンにおけるTNFαによる殺傷を促進することを示すアポトーシスアッセイである。TNFα処理した細胞の値から未処理の細胞のバックグラウンド値を減算することによって値(任意の単位として表す)を得、この値は、3つの実験の平均(+/−標準偏差)を表す。
図31(A〜D)は、ヒトおよびマウスのJNKK2のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
図31(A〜D)は、ヒトおよびマウスのJNKK2のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
図31(A〜D)は、ヒトおよびマウスのJNKK2のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
図32は、Gadd45βが、その触媒ドメイン中のペプチド領域に接触することによってMKK7ブロックすることを示す。a、結合アッセイに使用したMKK7ペプチドの模式図である。相互作用領域は灰色である。b、d、e、GSTプルダウンアッセイであり、示された35S標識されたインビトロで翻訳されたMKK7産物のGST−Gadd45βへの結合を示す。40%の投入を示す(b、d)。e、ATPを示されるように使用した。c、(d)において使用したGadd45β相互作用ペプチド1および7、ならびにペプチド1変異体のアミノ酸配列である。K149をアスタリスクにより印す。Gadd45βへの結合に関与するアミノ酸は、灰色であり、黒色は、この結合に対するそれらの明らかな関連と相関する。f、ペプチド領域1への結合が、Gadd45βによるMKK7不活性化に必要であることを示すキナーゼアッセイ(K.A.)である。FLAG−MKK7を、TNFα処理した(10分間)293細胞から免疫沈降させた。cにおける下線および太字のアミノ酸は、元のp1(132〜156)には存在しなかった挿入されたアミノ酸を表す。
図33は、MKK7のGadd45β媒介性抑制が、TNFα誘導性アポトーシスをブロックするのに必要であることを示す。a、b、ペプチド1が、それぞれIκBαM−Gadd45βクローンおよびNeo 3DOクローンにおけるTNFαによる殺傷を効率的に促進することを示すアポトーシスアッセイである。c、d、ペプチド1およびペプチド2の両方が、野生型MEFにおけるTNFα誘導性細胞傷害性を促進し得ること、およびペプチド2のみが、Gadd45β ヌル_MEFにおけるこの傷害性を促進し得ることをそれぞれ示すアポトーシスアッセイである。MEFは双生児胚由来であり、継代(p)4において使用した。a〜d、TNFα処理した細胞の値から未処理の細胞のバックグラウンド値を減算することによって値(任意の単位として表す)を得、この値は、3つの実験の平均(+/−標準偏差)を表す。
図34は、合成のFITC標識したTATペプチドが、匹敵する効率で細胞に進入することを示す。a〜d、DMSO(Ctr)または示されたペプチド(5μM)と20分インキュベートした後の、3DO細胞のFCM(a、c)および共焦点顕微鏡(b、d)分析である。a、c、DMSO(灰色)およびペプチド(黒色)で処理した細胞の重なりプロフィールを、ヒストグラムに示す。e、インビボ研究のためにTATに融合されたペプチド1変異体のアミノ酸配列である。Ala−II*は、Ala−IIに存在しないR140変異体を含み、Ala−V*において、変異は、Ala−Vと比較してC末端側に1アミノ酸だけシフトしていることに留意すること(図32cを参照のこと)。Ala−IV*は、Ala−IVに対して、そのMKK7模倣部分において同一である。(配列表)
Claims (45)
- プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法であって、該方法は、
アミノ酸配列NH2−TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHを有するペプチドを得る工程、および
該ペプチドを使用することによってか、または該ペプチドのアミノ酸配列の知識から開発した組成物を使用することによって、JNK経路を調節する工程、
を包含する、方法。 - プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法であって、該方法は、
(a)JNK経路内にある標的を選択する工程、および
(b)該JNK経路をアップレギュレートするかまたはダウンレギュレートするかのいずれかをする因子によって、該標的に干渉する工程、
を包含する、方法。 - JNK活性をインビボで調節する因子をスクリーニングおよび同定するための方法であって、該方法は、
(a)Gadd45βとは独立してJNKK2と相互作用する候補因子を得る工程;
(b)該因子を、非ヒト動物に投与する工程;および
(c)該動物におけるJNK活性のレベルを、該因子を受けていない動物におけるJNK活性と比較して決定する工程
を包含する、方法。 - JNK経路の調節因子についてスクリーニングするための方法であって、該方法は、
(a)該JNK経路の候補調節因子を得る工程であって、該候補調節因子は、アミノ酸配列NH2−TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD−COOHを有するペプチドに結合し得る、工程;
(b)該候補調節因子を癌細胞に投与する工程;および
(c)該JNK経路のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを含む該候補調節因子の該JNK経路調節能力を決定し、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのレベルをアッセイする工程
を包含する、方法。 - 罹患した細胞におけるアポトーシスの影響により引き起こされる変性障害および他の状態を処置する方法であって、該方法は、
(a)Gadd45βとは独立してJNKシグナル伝達の活性化に干渉する分子を得る工程;および
(b)該罹患した細胞に該分子を接触させる工程
を包含する、方法。 - 免疫系が癌細胞を殺傷させるのを、JNKシグナル伝達を増強することによって補助する方法であって、該方法は、
(a)Gadd45βとは独立してJNKシグナル伝達をブロックするインヒビターを得る工程;および
(b)該癌細胞を該インヒビターに接触させる工程
を包含する、方法。 - 請求項5に記載の方法であって、前記分子が、Gadd45βとは独立してJNNK2の活性化に干渉する、方法。
- JNKK2相互作用因子を同定する方法であって、該方法は、
(a)アミノ酸配列TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMDを含むペプチドをベイトとして提供する工程;および
(b)該ペプチドと相互作用する因子を同定する工程
を包含する、方法。 - 全長JNKK2の142位〜166位(TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD)に結合し得る分子へのJNKK2の結合に干渉する因子を決定するための方法であって、該方法は、
(a)全長JNKK2の142位〜166位(TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD)への該分子の結合に干渉する因子を得る工程;
(b)一過性JNK活性化を誘導する条件下で、細胞を該因子に接触させる工程;および
(c)該因子に接触した細胞を該因子に接触しなかった細胞と比較して、JNK経路が活性化されているか否かを決定する工程
を包含する、方法。 - 全長JNKK2の132位〜156位(GPVWKMRFRKTGHVIAVKQMRRSGN)由来のアミノ酸配列により特徴付けられるJNKK2の結合領域を含む分子。
- 全長JNKK2の220位〜234位(GKMTVAIVKALYYLK)由来のアミノ酸配列により特徴付けられるJNKK2の結合領域を含む分子。
- 全長JNKK2の142位〜166位(TGHVIAVKQMRRSGNKEENKRILMD)由来のアミノ酸配列により特徴付けられるJNKK2の結合領域を含む分子。
- プログラム細胞死をもたらす経路を調節するための方法であって、該方法は、
(a)JNK経路内にある標的を選択する工程;および
(b)該JNK経路をアップレギュレートするかまたはダウンレギュレートするかのいずれかをする因子によって、該標的に干渉する工程
を包含する、方法。 - 請求項13に記載の方法であって、該方法は、
(a)Gadd45タンパク質によるJNK活性化の抑制をブロックするために十分な因子を得る工程;および
(b)前記細胞を該因子と接触させて、プログラム細胞死を経験する細胞の割合を増加させる工程
を包含する、方法。 - 請求項14に記載の方法であって、前記因子が、gadd45β遺伝子配列またはそのフラグメントに対する、アンチセンス分子である、方法。
- 請求項14に記載の方法であって、前記因子が、小干渉RNA分子(siRNA)である、方法。
- 請求項14に記載の方法であって、前記因子が、リボザイム分子である、方法。
- 請求項14に記載の方法であって、前記因子が、Gadd45βの結合部位と有効に競合するJNKK2に融合した細胞透過性ペプチドである、方法。
- 請求項14に記載の方法であって、前記因子が、低分子である、方法。
- 請求項18に記載の方法であって、前記分子が、Gadd45タンパク質の機能を模倣するペプチド模倣物である、方法。
- 請求項13に記載の方法であって、前記方法が、
(a)JNKK2上のGadd45結合領域と相互作用することによってJNKシグナル伝達を抑制する分子を得ることによって、前記標的に干渉する工程;および
(b)細胞を該分子に接触させて、該細胞をプログラム細胞死から保護する工程
を包含する、方法。 - 請求項21に記載の方法であって、
(a)Gadd45タンパク質の全長または部分をコードするcDNA分子を得る工程;
(b)前記細胞を該cDNA分子でトランスフェクトする工程;および
(c)該細胞における該cDNAの発現のための条件を提供して、JNKK2を結合させ、JNKK2が、プログラム細胞死を誘導するJNK経路を活性化するために利用不能であるようにする、工程
を包含する、方法。 - 請求項22に記載の方法であって、前記cDNA分子が、JNKシグナル伝達を抑制するために十分なGadd45タンパク質のフラグメントをコードする、方法。
- 請求項22に記載の方法であって、前記cDNA分子が、Gadd45βのアミノ酸69〜113に対応するペプチドをコードする、方法。
- 請求項22に記載の方法であって、前記プログラム細胞死が、TNFαによって誘導される、方法。
- 請求項22に記載の方法であって、前記プログラム細胞死が、Fasによって誘導される、方法。
- 請求項22に記載の方法であって、前記プログラム細胞死が、TRAILによって誘導される、方法。
- 請求項22に記載の方法であって、前記プログラム細胞死が、遺伝子毒性因子によって誘導される、方法。
- 請求項28に記載の方法であって、前記因子が、ダウノルビシンおよびシスプラチナムからなる群より選択される、方法。
- JNKシグナル伝達を調節する因子を同定するための方法であって、該方法は、
(a)該因子がGadd45βに結合するか否かを決定する工程;および
(b)該結合したGadd45βの活性についてアッセイして、JNKシグナル伝達に対する効果を決定する工程
を包含する、方法。 - JNKK2と相互作用することによってJNK活性化を抑制するために十分な模倣物を得るための方法であって、該方法は、
(a)Gadd45タンパク質の機能を模倣するように該模倣物を設計する工程;
(b)該模倣物を、該JNK経路を含む系に接触させる工程;および
(c)JNKシグナル伝達の抑制が存在するか否かを決定する工程
を包含する、方法。 - JNK経路をインビトロで調節する因子をスクリーニングおよび同定するための方法であって、該方法は、
(a)該JNK経路の標的成分を得る工程;
(b)細胞を該因子に曝露する工程;および
(c)該因子が該JNK経路を調節する能力を決定する工程
を包含する、方法。 - 請求項32に記載の因子であって、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプチド様分子、変異体タンパク質、cDNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンス構築物、脂質、糖質、および合成化合物または天然化合物からなる群より選択される、因子。
- JNK活性をインビボで調節する因子をスクリーニングおよび同定するための方法であって、該方法は、
(a)候補因子を得る工程;
(b)該因子を非ヒト動物に投与する工程;および
(c)該動物におけるJNK活性のレベルを、該因子を受けていない動物におけるJNK活性と比較して決定する工程
を包含する、方法。 - Gadd45βがアポトーシスをブロックするのを防ぐ因子を同定するための方法であって、該方法は、
(a)TNFα誘導性アポトーシスに対して保護されている高レベルのGadd45βを発現する細胞を、該因子およびTNFαと接触させる工程;
(b)(a)における細胞におけるアポトーシスを、該因子に曝露されているがTNFαには曝露されていないコントロール細胞と比較する工程;および
(c)コントロール細胞に対する処理細胞におけるアポトーシスの差異から、該因子はGadd45βがアポトーシスをブロックするのを妨げるか否かを推測する工程
を包含する、方法。 - JNK経路の調節因子についてスクリーニングするための方法であって、該方法は、
(a)該JNK経路の候補調節因子を得る工程であって、該候補は、該JNK経路の成分を調節し得る潜在的に任意の因子であり、該因子は、ペプチド、変異体タンパク質、cDNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンス構築物、合成化合物または天然化合物を包含する、工程;
(b)該候補因子を癌細胞に投与する工程;および
(c)該JNK経路のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを含む、該候補物質の該JNK経路の調節能力を決定し、そしてアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのレベルをアッセイする工程
を包含する、方法。 - 罹患した細胞におけるアポトーシスの影響により引き起こされる変性障害および他の状態を処置する方法であって、該方法は、
(a)JNK経路の活性化に干渉する分子を得る工程;および
(b)該罹患した細胞を該分子に接触させる工程
を包含する、方法。 - 免疫系が癌細胞を殺傷させるのを、JNKシグナル伝達を増強することによって補助する方法であって、該方法は、
(a)JNKシグナル伝達をブロックするためのインヒビターを得る工程;および
(b)該癌細胞を該インヒビターに接触させる工程
を包含する、方法。 - 請求項38に記載の方法であって、前記インヒビターが、Gadd45βによるJNKK2の活性化をブロックする、方法。
- gadd45βプロモーターをトランスアクチベートするための方法であって、該方法は、
(a)gadd45βのプロモーターエレメントにNF−κB複合体を結合する工程;および
(b)gadd45β遺伝子発現についてアッセイする工程
を包含する、方法。 - 癌を処置するための方法であって、該方法は、
(a)Gadd45β機能を阻害することによってJNK活性を増加する工程;および
(b)Gadd45β機能に干渉するインヒビターを投与する工程
を包含する、方法。 - Gadd45タンパク質とJNKK2との間の結合に干渉する因子を決定するための方法であって、該方法は、
(a)Gadd45タンパク質に結合する因子を得る工程;
(b)一過性JNK活性化を誘導する条件下で、細胞を該因子と接触させる工程;および
(c)該因子と接触された細胞を、該因子に接触されていない細胞と比較して、JNK経路が活性化されるか否かを決定する工程
を包含する、方法。 - gadd45βプロモーターとして機能する、GeneBank登録番号AF441860を有するヌクレオチド配列を有する分子。
- 図8に記載の−447位/−438位(κβ−1)、−426位/−417位(κβ−2)、−377位/−368位(κβ−3)からなる群より選択されるアミノ酸位置にあるプロモーターのエレメントであるヌクレオチド配列を有する、分子。
- 全長Gadd45βタンパク質の60位〜114位由来のアミノ酸配列により特徴付けられるGadd45β領域を含む、分子。
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