KR100740337B1

KR100740337B1 - 저분자량 열충격단백질 결합 펩티드를 이용한 방사선 내성측정 방법

Info

Publication number: KR100740337B1
Application number: KR1020040080337A
Authority: KR
Inventors: 이윤실; 김경중; 이윤진; 이수재; 조철구; 배상우; 이대훈
Original assignee: 재단법인 한국원자력의학원
Priority date: 2004-10-08
Filing date: 2004-10-08
Publication date: 2007-07-19
Also published as: KR20060031345A

Abstract

본 발명은, 동물로부터 시료를 채취한 후, 저분자량 열충격단백질인 HSPB1 또는 Hspb1에 결합하는 결합 펩티드를 이용하여, HSPB1 또는 Hspb1과 상기 결합 펩티드와의 결합량을 측정한 후, 결합량이 적은 경우 HSPB1 또는 Hspb1의 발현량이 적은 것으로 보고 방사선 내성이 작은 것으로 판단하며, 결합량이 많은 경우 HSPB1 또는 Hspb1의 발현량이 많은 것으로 보고 방사선 내성이 큰 것으로 판단하는 것을 포함하는, 방사선 내성의 정량적 측정 방법을 제공한다.

방사선 내성, 방사선 민감, 저분자량 열충격 단백질

Description

저분자량 열충격단백질 결합 펩티드를 이용한 방사선 내성 측정 방법{A radioresistance prediction method using small heat shock protein-binding peptide}

도 1은 산화적 스트레스로 인한 세포 자가사멸(apoptosis)에 대한 PKCδ의 활성의 영향을 도시한 그래프이고,

도 2a 내지 도 2d는 Hspb1이 PKCδ의 활성에 미치는 영향을 각종 스트레스를 가한 후 관찰한 결과이며,

도 3은, Hspb1과 PKCδ 사이의 특이적 결합 유무를 확인하기 위한 면역침전반응 결과이며,

도 4는 Hspb1과 결합하는 PKCδ의 결합 부위의 결정 방법을 나타낸 것으로서, 도 4a는 유전자 재조합 기술을 이용한 PKCδ의 부분 삭제 단백질의 모식도이며, 도 4b 및 도 4c는 Hspb1과 결합하는 PKCδ의 결합 부위를 나타내는 면역침전반응 결과이며,

도 5는 PKCδ와 결합하는 Hspb1의 결합 부위의 결정 방법을 나타낸 것으로서, 도 5a는 유전자 재조합 기술을 이용한 PKCδ의 부분 삭제 단백질의 모식도이며, 도 5b 및 도 5c는 PKCδ와 결합하는 Hspb1의 결합 부위를 나타내는 면역침전반응 결과이며,

도 6은 여러종류의 Hspb1 변이 펩티드들의 세포사멸 저해 효과를 나타낸 그래프이며,

도 7a는 H1299, H596, 및 H460 세포에 방사선을 조사했을 때의 세포사멸을 나타낸 그래프이고, 도 7b는 H1299, H596, 및 H460 세포의 HSBP1 발현량을 나타낸 그래프이고, 도 7c는 H1299, H596, 및 H460 세포에서의 HSPB1 발현량과 PKCδ 발현량을 나타낸 그래프이고, 도 7d는 HSPB1에 대한 Si RNA를 H1299세포에 넣어주었을 때의 효과를 나타낸 그래프이고, 도 7e는 H1299 세포에 HSPB1에 대한 Si RNA를 넣어주었을 때의 효과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은, 방사선 조사를 통한 항암 치료시 방사선 내성의 측정 방법 및 이를 이용한 방사선 조사량의 예측 방법에 관한 것이다.

암의 치료법은 외과적 수술, 방사선치료법, 항암화학요법으로 크게 나눌 수 있는데, 현재 암 환자 중 국내의 경우 약 40%, 미국의 경우 약 50% 정도가 방사선 치료를 받고 있으며, 국내에서 방사선치료를 받는 암 환자의 수가 매년 증가하고 있는 추세여서 암 치료에 있어 방사선 치료의 중요성 또한 증가하고 있다.

항암치료에서는 크게 두 가지가 문제시되고 있다. 하나는 정상세포 사멸이고, 다른 하나는 암세포의 내성이다. 정상세포 사멸을 방지하기 위해서는 보호제가 개발되고 있으며, 암세포의 내성을 줄이기 위해서는 민감제가 개발되고 있다.

항암치료의 민감제의 개발은, 주로 세포사멸단계에 관여하는 생체물질들(p53 암 억제 인자, Bcl-2 족, IAP 족, 스핑고지질 족, 세포신호전달체계 등)을 그 대상으로 하고 있다. 특히, 열충격단백질(heat shock proteins, HSP)은, 고온, 중금속, 에탄올, 산소결핍 등 세포에 대한 각종 외부 스트레스에 대하여 직접적인 저항성을 나타낼 뿐만 아니라, 세포사멸에 관여하는 중요한 기작들을 직접 또는 간접적으로 저해하여 세포사멸에 대한 저항성을 높여 주는 것으로 최근 보고되었다. 그 중, 저분자량 열충격단백질인 HSPB1(쥐에서는 Hspb1)은 시토크롬 씨(cytochrome C), 닥스(DAXX), 섬유성 액틴(F-actin) 등과 결합하여 세포사멸을 억제하는 것으로 밝혀진 바 있다.

따라서, 암세포 특이적으로 열충격단백질들을 무력화시켜 암세포의 치료에 대한 민감도를 증가시키려는 노력들이 그동안 많이 있었다. 특히, 분자량이 90,000인 열충격단백질(HSP90)에 대한 저해제는 이미 임상2상에 들어가 있고, 분자량이 70,000인 열충격단백질 HSPA(HSP70)에 대한 저해제 개발도 활발히 진행되고 있다. 그러나, 저분자량 열충격단백질(예를 들면, HSPB1(분자량 27kD) 등)에 대한 저해제는 가능성만 생각되어 왔을 뿐, 현재 개발되고 있는 민감제가 없는 실정이다.

이와 관련하여, 암의 방사선 치료시 나타나는 암세포의 내성에 대한 정확한 분자적 기작은 불분명한 것으로 알려져 있었으나, 본 연구진의 연구결과에 의하면, 방사선 치료시 정상세포의 사멸과 암세포의 방사선 내성의 주된 원인 중의 하나가 정상세포에 그 양이 매우 적으나 암세포에서 많이 발현이 되고 있는 저분자량 열충 격단백질 때문인 것으로 나타났다. 따라서, 본 연구진은 암세포의 저분자량 열충격단백질에 의한 방사선 내성 기작과 그 암세포의 방사선 내성을 정량적으로 평가하고, 차후에 이를 바탕으로 방사선 민감제를 개발할 필요성을 절실히 느끼게 되어 본 발명을 수행하게 되었다.

또한 본 발명은, 암세포의 저분자량 열충격단백질에 의한 방사선 내성 기작과 그 암세포의 방사선 내성을 정량적으로 평가하고, 이를 바탕으로 방사선 치료시 적용할 방사선 조사량을 결정하는 방법을 제공하고자 한다.

또한 본 발명은, 방사선 내성에 영향을 미치는 저분자량 열충격단백질을 이용한 방사선 민감제 및 방사선 보호제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은,

동물로부터 시료를 채취한 후, HSPB1 또는 Hspb1에 결합하는 결합 펩티드를 이용하여, HSPB1 또는 Hspb1과 상기 결합 펩티드와의 결합량을 측정한 후, 결합량이 적은 경우 HSPB1 또는 Hspb1의 발현량이 적은 것으로 보고 방사선 내성이 작은 것으로 판단하며, 결합량이 많은 경우 HSPB1 또는 Hspb1의 발현량이 많은 것으로 보고 방사선 내성이 큰 것으로 판단하는 것을 포함하는, 방사선 내성의 정량적 측정 방법 및 방사선 내성 예측 방법을 제공한다. 이 때, 바람직하게는 상기 결합 펩티드는 서열번호 1과 95% 이상 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드일 수 있으며, 상기 아미노산 서열은 PKCδ-유래일 수 있다.

또한 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 서열번호 1과 95% 이상 상동성을 가지며, HSPB1 또는 Hspb1과 결합하는 특성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 제공한다. 이 때, 바람직하게는 상기 아미노산 서열은 PKCδ-유래일 수 있다.

본 발명은 또한 상기와 같은 결합 펩티드를 포함하는 방사선 민감제를 제공한다.

본 발명은 또한 서열번호 1과 95% 이상 상동성을 가지며, HSPB1 또는 Hspb1과 결합하는 특성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하며, 더 나아가, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 서열번호 2와 95% 이상 상동성을 가지며, PKCδ과 결합하는 특성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 제공한다. 이 때, 바람직하게는, 상기 아미노산 서열은 HSPB1 또는 Hspb1-유래일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기와 같은 결합 펩티드를 포함하는 방사선 보호제를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 2와 95% 이상 상동성을 가지며, PKCδ과 결합하는 특성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하며, 더 나아가, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 이해를 돕기 위하여, 다음과 같이 용어를 정의한다.

본 발명에서 사용되는 "저분자량 열충격단백질"이라 함은, 열충격이나 다른 자극에 의해 유도되는 저분자량 단백질로서, 열충격 같은 자극에 의해 단백질 구조에 이상이 생긴 다른 단백질에 결합하여 그 단백질을 안정화시키고 원래의 구조로 돌아가게 도와주거나 구조이상이 심한 단백질을 분해시키도록 도와주는 단백질을 말한다.

본 발명에서 사용되는 "HSPB1"은, 저분자량 열충격단백질들 중에서 인간에서는 Heat shock protein 27을 의미하며, 쥐에서는 Heat shock protein 25를 의미한다. 뒤에 붙은 숫자 27과 25는 분자량을 의미하는데, 종에 따라 그 분자량에는 차이가 있지만 기능과 유전자 구성으로 보았을 때 서로 같은 유전자이기 때문에 개념의 통일성을 위해 HSPB1과 HspB1로 표기하는 관례를 따른다.

본 발명에서 사용되는 "PKC"는 프로틴 키나아제 C (Protein Kinase C)를 의미하며, 고전적으로는 칼슘(Ca²⁺) 의존형 단백질 인산화 효소로 발견되었으나, 이후에 새로운 타입(type)의 칼슘 비의존형 타입이 발견되었다. PKC는 외부 자극에 대한 세포의 사멸과 생존을 결정하는 신호 전달체계에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. "PKCδ"는 새로운 노블 타입(novel type)의 PKC로 칼슘 비의존형 인산화 효소이며, 주로 외부자극에 의한 세포의 사멸을 유도하는데 관여하는 것으로 보고되고 있다. 노블 타입의 PKC들의 아미노산 서열을 비교하여 보았을 때, 네 개 의 보존되어 있는 부분 (conserved region C1, C2, C3 그리고 C4)과 변화가 있는 부분 (Variable region V1, V2, V3, V4 그리고 V5)으로 나눌 수 있는데, 이 때 "PKCδ V5"는 변화가 있는 부분인 V5 부분을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 "95%의 상동성"이라 함은, 두 개 이상의 펩티드 (peptide)들의 아미노산 서열을 비교함에 있어, 아미노산 서열의 상동성이 95%이며, 동일한 기능을 나타내는 단백질을 코딩하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 "방사선 민감"이라 함은, 일반적으로 방사선 조사에 의해 쉽게 영향을 받는 세포의 성향, 예를 들어 방사선 조사된 후 억제된 세포 복원 또는 세포 성장의 유사분열 단계에 있는 세포의 감소된 비율을 보여주는 세포의 성향을 가리키는 것으로 사용된다.

본 발명에서 사용되는 "방사선 내성"이라 함은, 일반적으로 방사선 조사에 의해 쉽게 영향을 받지 않고 방사선에 노출되었을 대 세포 복원 또는 증식에서 아무런 변화가 일어나지 않는 세포의 성향을 가리키는 것으로 사용된다.

이하, 상기 내용에 기초하여 본 발명을 설명한다.

상기한 바와 같이, 본 출원인은, 방사선 치료시 정상세포의 사멸과 암세포의 방사선 내성의 주된 원인 중의 하나가 정상세포에 그 양이 매우 적으나 암세포에서 많이 발현이 되고 있는 저분자량 열충격단백질 때문인 것으로 밝혀 내었다. 이를 토대로, 본 출원인은 암세포의 저분자량 열충격단백질에 의한 방사선 내성 기작을 밝혀내고, 그 암세포의 방사선 내성을 정량적으로 평가하고, 이를 바탕으로 방사선 치료시 방사선 조사량을 예측하고, 더 나아가 방사선 민감제 및 방사선 보호제를 개발하고자 하였다.

더욱 상세히 설명하면, 본 출원인은, 방사선 내성 세포를 연구한 결과, 방사선 내성의 주된 원인이 저분자량의 열충격단백질 HSPB1(사람에서는 HSPB1, 쥐에서는 Hspb1)의 과발현 때문이라는 것을 먼저 밝혔다. 즉, 세포의 자가사멸에는 프로테인 키나제 Cδ (Protein kinase Cδ, PKCδ) 효소가 관여하는데, 과발현된 HSPB1(또는 Hspb1)는, PKCδ의 특정 부위에 결합할 수 있으며, 따라서 PKCδ가 불활성화됨으로써 방사선에 의한 세포의 자가 사멸이 저해되고 방사선 내성을 가지게 된다는 것이다.

이러한 사실로부터, 본 발명은 방사선에 의한 세포사멸에 중요한 역할을 하는 프로테인 키나제 C와 프로테인 키나제C를 저해하는 HSPB1(또는 Hspb1)의 상세 결합 부위를 유전자 재조합기술과 면역침전방법을 이용하여 규명하였고, 방사선에 대한 세포의 내성 기작을 분자생물학적 기법에서 규명하였으며, 이를 방사선 내성 예측 기법으로 사용하였다.

또한 상기 규명된 결과로부터, HSPB1(또는 Hspb1)과 결합하는 PKCδ부위 아미노산 서열을 이용하여 방사선 민감제를 제공할 수 있으며, PKCδ와 결합하는 HSPB1(또는 Hspb1) 부위 아미노산 서열을 이용하여 방사선 보호제를 제공할 수 있다.

즉, HSPB1(또는 Hspb1)과 특이적으로 결합할 수 있는 결합 펩티드를 암세포에 도입하면, PKCδ의 저해가 억제되고, 따라서 방사선에 의한 자가사멸의 저해가 억제됨으로써 방사선 민감 효과를 나타낼 수 있는 것이다.

또한 반대로, PKCδ와 특이적으로 결합할 수 있는 결합 펩티드를 암세포 주변 세포에 도입하면, 세포의 자가 사멸이 억제됨으로써, 방사선 보호 효과를 나타낼 수 있는 것이다.

따라서, 본 발명에서는, 방사선 치료 효율을 극대화시키기 위해, 방사선 치료에 앞서, 치료부위 암세포와 정상세포에 대한 방사선 내성을 정량적으로 평가하는 기준을 마련하는 하나의 인자로 PKCδ와 HSPB1의 결합검사법을 제공하며, 이를 토대로 장차 정상세포의 손실을 최소화하면서 암 치료를 성공적으로 수행할 수 있는 방사선 조사선량에 대한 기준을 제시하며, 유효한 방사선 민감제와 방사선 보호제를 제공할 수 있을 것으로 판단된다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에서는 방사선에 대한 내성이 높은 암세포일수록 HSPB1(또는 Hspb1)의 발현량이 높음을 확인하였다. 방사선이나 산화적 스트레스에 의해 유도되는 세포의 자가사멸(Apotosis)은 p38나 ERK1/2와 같은 MAP(mitogen-activated protein) 키나아제를 통해서 일어나며, 여기에는 PKCδ가 그 상위 단계에서 중요한 역할을 한다고 보고되었다. 즉, 방사선이나 산화적 스트레스를 처리하면, PKCδ의 활성이 증가되어 세포자가사멸을 유도함을 관찰할 수 있는데, 하기와 같이 HSPB1(또는 Hspb1)을 과발현시킨 세포에서는 대조군에 비해 PKCδ의 활성화가 줄어듦을 관찰하였다.

HSPB1(또는 Hspb1)의 PKCδ-활성화 저해 기작을 정확히 밝히기 위하여, 우선 상기 두 단백질의 세포 내에서의 상호작용을 조사하였다. 상기한 바와 같이, 방사 선 내성이 높은 세포주에서 HSPB1(쥐에서는 Hspb1)은 그 발현량이 많을 뿐만 아니라, PKCδ와 결합하여 PKCδ의 활성을 저해함을 우선 확인한 후, 좀 더 상세한 저해 기작을 연구하기 위해 Hspb1을 이용하여 Hspb1과 PKCδ의 결합부위를 결정하였다.

그 결과, 하기하는 바와 같이 PKCδ의 카복시 말단 아미노산 630-674 부분이 Hspb1와의 결합에 필수적이며, 카복시 말단 아미노산 606-674 부분이 Hspb1와의 결합에 충분함을 확인하였다(서열번호 1):

아미노말단-SLLEKRKVEPPFKPKVKSPSDYSNFDPEFLNEKPQLSFSDKNLIDSMDQEAFHGFSFVNPKFEQFLDI-카복시말단

또한, 하기하는 바와 같이, Hspb1의 아미노산 92-105 부분이 PKCδ와의 결합에 필수적인 것으로 관찰되었으며, Hspb1의 아미노산 92-145 부분이 PKCδ와의 결합에 충분함을 확인하였다(서열번호 2):

아미노말단-IRQTADRWRVSLDVNHFAPEELTVKTKEGVVEITGKHEERQDEHGYISRCFTRK-카복시말단

마지막으로 PKCδ와 결합하여 그 활성을 저해하는 능력이 있는 Hspb1과 그 변이 단백질들만이 세포자가사멸에 대해 유효한 저해 효과가 있음을 관찰하였다.

상기한 바와 같이, 본 발명은 암세포의 방사선 내성이 Hspb1에 의한 PKCδ와의 직접 결합으로 인한 PKCδ-활성 저해임을 규명하였으며, Hspb1와 PKCδ의 결합 부위를 각각 규명하였다. 그 결합 부위 펩티드를 이용하여, 방사선 치료에 앞서 특 정 암세포와 정상세포에 대한 방사선 내성을 정량적으로 평가하는 기법을 마련함으로써 효과적인 방사선 조사량을 결정하고, 암치료의 효율을 극대화시키는데 이용할 수 있다.

특히, 본 발명의 방법에 의하면, 시료의 채취가 어려운 암 발생 부위(예를 들어, 폐 등)에서도, 적은 양의 시료 채취만으로도 간단히 방사선 내성을 측정할 수 있다는 잇점이 있다.

또한, 상기한 바와 같은 결합 펩티드를 이용하면, HSPB1(또는 Hspb1)과 결합하는 PKCδ부위 아미노산 서열을 이용하여 방사선 민감제를 제공할 수 있으며, PKCδ와 결합하는 HSPB1(또는 Hspb1) 부위 아미노산 서열을 이용하여 방사선 보호제를 제공할 수 있다.

이하, 하기하는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

세포의 자가사멸은 세포손상이 회복불능일 때, 이를 감지한 세포내의 신호전달체계에 의해 자가사멸 작동인자들에 전달이 된다. 방사선에 의해 유도되는 L929세포의 자가사멸은 p38이 주요한 신호전달을 담당하고 있으며, Caspase3가 초기작동인자임을 관찰하였다. Caspase3와 p38의 활성화는 PKCδ를 통해서 이루어짐을 PKC 저해제를 이용한 실험에서 관찰하였다. PKCδ를 저해하는 것으로 알려진 Rottlerin을 처리하였을 때 Caspase3와 p38의 활성화가 효과적으로 저해되었으나, PKCδ의 저해제로 알려진 Go6976이나 Safingol을 처리하였을 때에는 Capase3와 p38의 활성화가 효과적으로 저해되지 않았다. 이로써 방사선에 의해 유도되는 세포의 자가사멸은 PKCδ를 통하여 이루어진다고 결론지었다. 또한 본출원인은 이미 산화 적 스트레스에 의해 유도되는 세포의 자가사멸은 ERK1/2와 같은 MAP 키나아제를 통해서 일어나며, 여기에는 PKCδ가 그 상위단계에서 중요한 역할을 할 것이라고 보고하였다. 따라서 PKCδ가 여러 가지 종류의 외부자극에 의한 세포사멸에 결정적인 역할을 할 것으로 결론짓고 이를 확인하기 위한 각 시료에 대하여 다음과 같은 실험을 진행하였다.

실시예

본 실시예에서는 다음과 같은 방법으로 실험을 행하였다.

사용세포주

쥐의 L929, RIF, 그리고 TR 세포는 Dulbeccos 최소필수배지(DMEM) (GIBCO, Gaithersburg, MD)에 열처리한 10% 소 태아 혈청 (FBS, GIBCO)와 항생제를 첨가하여 섭씨 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 키웠다. 사람의 비소세포성 폐암 (Non-Small-Cell Lung Cancer) 세포주인 H460, H596, H1299 그리고 T 임파종 세포인 Jurkat 세포주는 RPMI 1640 배지에 10% FBS, 글루타민, HEPES, 그리고 항생제를 첨가하여 섭씨 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 키웠다.

유전자 재조합

쥐의 저분자량 열충격단백질인 Hspb 1 유전자(Genbank 등록번호 XM_124655을 사용)를 아미노 말단에 His-tag를 달고 있는 벡터 pcDNA4HisMaxC (Invitrogen로부터 입수)에 통상의 방법으로 클로닝하였다. 쥐의 PKCδ 유전자(Genbank 등록번호 AY545076을 사용)을 HA-tag을 달고 있는 벡터 pcDNA3(Invitrogen)에 통상의 방법으 로 클로닝하였다.

두 번의 연속된 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, 이하 PCR)을 이용하여 부분 삭제 단백질을 세포 내에서 발현할 수 있도록 재조합벡터를 재조하여 세포에 넣어 주었다.

방사선 조사

세포를 3.5, 6, 그리고 10 cm 배양접시에 깔아서 37℃ CO₂ 배양기에서 70-80% 정도 자랄 때까지 키운 뒤 감마선 (¹³⁷Cs) (Atomic Energy of Canada, Ltd., Canada)을 3.81 Gy/min 선량률로 조사하였다. 총 5 Gy를 조사하였다.

세포분석

세포를 키운 뒤, 주어진 시간에 채취하여 요오드화 프로포듐(propodium iodide, PI)로 염색한 뒤, 판매자의 지시대로 FACScan 유세포 분석기(flow cytometer)를 이용하여 분석하였다.

세포분획

세포를 채취한 후, 차가운 Phosphate Buffered Saline (이하 PBS) 용액으로 두 번 씻어 준 다음, S-100 용액 [20 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM KCl, 1.9 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 10 ㎍/ml 아프로티닌(aprotinin), 10 ㎍/ml 류펩틴(leupeptin), 그리고 0.1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드(phenylmethylsufonyl fluoride)]에 현탁한 후, 얼음에 20분 동안 방치한다. 20분 후 유리로 된 절구공이를 가진 Dounce 호모게나이저(homogenizer) (Wheaton, Millville, NJ)를 이용하 여 세포를 잘게 으깬 다음 1,000 x g에서 원심분리하여 그 침전물을 버리고, 상등액을 취한다. 그 상등액을 다시 14,000 x g에서 30분 동안 원심분리하여 그 침전물을 세포막부분으로, 그 상등액을 세포질 부분으로 취한다. 다시 한 번 씻어준 뒤에, 용해용액 [150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl (pH 7.4), 1% NP40, 0.25% sodium deoxycholate, 1 mM EGTA, 10 ㎍/ml 아프로티닌, 10 ㎍/ml 류펩틴, 그리고 0.1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드]에 현탁한 후 분석을 수행하였다.

전기영동과 면역반응을 이용한 단백질 분석

시료 속의 단백질을 분석하기 위하여 우선 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)를 수행한 후, 웨스턴 블롯(Western blot)을 수행하였다. 실험하고자 하는 세포들을 우선 용해용액 [120 mM NaCl, 40 mM Tris (pH 8.0), 0.1% NP40]에 현탁하여 세포들을 터뜨린 다음, 일정량의 단백질을 10% SDS-PAGE를 통해 분자량별로 분리한 다음, 단백질들을 니트로셀룰로스 멤브레인에 옮긴 다음 면역 블로팅을 이용하여 분석하였다.

PKC 활성 측정

탈인산화효소 저해제 [1 mM NaF, 0.1 mM Na3VO4, 그리고 10 mM 베타-글리세로포스페이트]와 단백질분해효소 저해제 [10 ㎍/ml 아프로티닌, 10 ㎍/ml 류펩틴, 그리고 0.1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드]를 첨가한 PKC 추출 버퍼 [50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 0.1% Tween 20, 1mM EDTA, 2.5mM EGTA, 그리고 10% 글리세롤]에 세포를 넣어 으깬 다음, 많은 단백질들 중에서 HA-tagged PKC 단백질을 3㎍ 항-HA 항체와 30㎕ 단백질 G-세파로스를 이용하여 4℃에서 3시간 동안 면역침전시 켰다. 면역침전된 단백질을 PKC 추출버퍼로 두 번 씻은 후, PKC 반응 버퍼 [50mM HEPES (pH7.5), 10mM MgCl₂, 1mM 디티오쓰레이톨(dithiothreitol), 2.5mM EGTA, 1mM NaF, 0.1mM Na3VO4, 그리고 10mM 베타-글리세로포스페이트]에 현탁하였다. PKC의 인산화효소 활성 측정 반응은 그 반응 기질인 10㎍의 글루타치온 S-트랜스퍼라아제(GST)-미리스토일화(myristoylated) 알라닌-리치 C 키나아제 기질 (MARCKS)와 5 μCi 의 [γ-³²P] ATP가 녹아 있는 40μl 의 PKC reaction buffer를 첨가함으로써 시작하였다. 30℃에서 30분간 진행하였으며, 반응의 종료는 SDS 시료 버퍼를 넣고 5분 간 끊임으로써 이루어 졌다. 그 반응물은 SDS-PAGE를 거친 다음 오토라디오그래피(autoradiography)를 통해 분석하였다. 기질인 재조합 GST-MARCKS 단백질은 대장균 E, coli BL21 (DE3)/LysS에서 만들어진 다음 글루타치온 S-세파로스 비드(Pharmacia)를 통해 순수하게 분리하였다.

실시예 1

과도한 산화 스트레스의 결과로 세포의 자가사멸(Apotosis)이 일어날 때, 그 신호전달에는 PKCδ가 중요함을 관찰하였다. PKCδ 야생형(WT), 그 우성-음성 형태인 WT-KR, PKCδ의 활성부위 (CAT), PKCδ의 조절부위 (REG), 그리고 CAT의 우성-음성 형태인 CAT-KR을 세포 내에서 발현하도록 상기와 같은 방법으로 재조합 DNA를 넣어준 다음, H₂O₂를 처리하여 세포의 자가사멸의 증가가 일어나는 양상을 관찰하였다. 우성-음성 PKCδ 유전자를 세포 내에 넣어 주게 되면, 세포 내의 야생형의 PKCδ도 그 활성을 잃어버리게 된다. PKCδ의 활성이 없는 WT-KR, CAT-KR, REG를 넣어 주었을 경우에는, H₂O₂를 처리하여도 세포의 자가사멸이 대조군에 비해 증가하지 않았다. 이로써 방사선뿐만이 아니라 산화적 스트레스와 같은 외부 자극에 의한 세포의 자가 사멸에도 PKCδ의 활성이 중요함을 확인할 수 있었다. 대조군으로는 PKCδ를 포함하지 않는 빈 벡터만을 넣어 준 세포를 사용하였다. 그래서 우성-음성 형태의 PKCδ를 세포 내에서 발현시키게 되면, 산화 스트레스를 받았을 때, 대조군보다 세포의 자가사멸이 더 적게 일어남을 관찰할 수 있었다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

실시예 2

Hspb1 과발현을 통한 PKCδ활성의 저해를 다음과 같이 관찰하였다.

이온화 방사선 (Ionizing Radiation) 조사 후 세포자가사멸을 유도하는 PKCδ의 활성화를 세포막으로의 전이와 티로신 잔기의 인산화를 통해 확인하였다(도 2). 산화적 스트레스(H₂O₂)를 준 뒤, PKCδ의 활성을 그 인산화효소활성을 측정하여 확인하였다. Hspb1을 과발현 시켰을 때, 대조군에 비해 세포자가사멸을 유도하는 PKCδ의 활성화가 줄어듬을 관찰하였다. 또한 산화적 스트레스를 주었을 때도 PKCδ의 활성이 증가함을 인산화효소활성 측정으로 확인할 수 있는데, Hspb1을 과발현시켰을 경우에는 PKCδ의 활성이 증가하지 않음을 관찰할 수 있었다(제2도).

도 2a를 참조하면, 방사선 조사 후 시간에 따른 PKCδ의 세포막으로의 전이를 관찰한 결과, 대조군에 비해 Hspb1을 과발현시킨 세포에서 세포막으로의 전이가 줄어듬을 관찰하였다. 또한 도 2b에서도 볼 수 있는 바와 같이, 방사선 조사후 PKC δ의 티로신 잔기의 인산화(Tyrosine phosphorylation, p-Tyr)가 증가됨을 알 수 있는데, Hspb1 과발현시킨 세포에서는 대조군에 비해 티로신 잔기의 인산화가 줄어듬을 관찰하였다. 도 2c에 나타난 바와 같이, PKCδ의 인산화 효소 활성을 기질로서 Myelin basic protein (MBP)을 사용하여 측정하였다. 그 결과, 산화적 스트레스를 주었을 때 PKCδ의 활성이 증가함을 볼 수 있는데, Hspb1을 과발현시켰을 경우에는 PKCδ의 활성이 증가하지 않음을 관찰할 수 있었다. 도 2d를 보면, 세포 외부에서 PKCδ를 넣어 준 경우 PKCδ의 활성이 증가됨을 기질로 미리스토일화 알라닌-리치 C-키나아제 기질(MARCKS)를 이용하여 확인하였다. 하지만, HspB1을 과발현시켰을 경우에는, 대조군에 비해 현저하게 PKCδ의 활성이 떨어짐을 확인하였다.

실시예 3

세포 내 Hspb1와 PKCδ의 결합을 다음과 같이 확인하였다.

Hspb1의 PKCδ활성화 저해 기작을 연구하기 위해 우선 두 단백질의 세포내에서 상호작용을 조사하였다. 두 단백질의 상호작용 연구에는 면역침전반응과 친화적 층분리법을 사용하였다. 세포 내에서 Hspb1과 PKCδ가 직접 결합하고 있음을 면역침전반응을 통하여 확인하였다. Hspb1의 발현량이 작은 L929세포에 Hspb1과 PKCδ-CAT을 넣어준 뒤, 그리고 TR세포에 PKCδ-CAT를 넣어준 뒤, 면역침전반응을 통해 Hspb1과 PKCδ-CAT사이에 특이적인 결합이 생김을 확인하였다(도 3).

실시예 4

Hspb1과 결합하는 PKCδ 부위를 다음과 같이 결정하였다.

좀 더 상세한 저해 기작을 연구하기 위해 Hspb1과 PKCδ의 결합부위를 결정 하고자 하였는데, 우선 PKCδ의 어느 부위가 Hspb1과 결합하는 지를 알아보기 위해 조절부위(REG)와 활성부위(CAT), 인산화 활성이 없는 변이 단백질(CAT-KR), 그리고 여러 가지 종류의 부분절단 단백질을 유전자 재조합기술로 제조하여 면역침전반응을 이용하였다(도 4).

그 결과, PKCδ의 카복시 말단 아미노산 630-674 부분이 Hspb1와의 결합에 필수적이며, 카복시 말단 아미노산 606-674 부분이 Hspb1와의 결합에 충분함을 확인하였다. Hspb1과 결합하는 PKCδ V5부위의 아미노산 서열(서열번호 1)은 다음과 같다.

상기 아미노산 서열 전체는 PKCδ의 606-674 번째 아미노산서열에 해당하며, 이 부분만으로도 Hspb1과 결합할 수 있다. 밑줄 친 부분은 630-674 번째 아미노산서열에 해당하며 Hspb1과의 결합에 꼭 필요한 부분을 나타낸다.

실시예 5

PKCδ과 결합하는 Hspb1 부위를 다음과 같이 결정하였다.

Hspb1의 어느 부위가 PKCδ와 결합하는지를 알아보기 위해 여러 가지 종류의 부분 삭제 단백질을 제조하여 단백질 결합을 조사하였다(도 5).

그 결과, Hspb1의 아미노산 92-105 부분이 PKCδ와의 결합에 필수적인 것으로 관찰되었으며, Hspb1의 아미노산 92-145 부분이 PKCδ와의 결합에 충분함을 확 인하였다. PKCδ과 결합하는 Hspb1과 부위의 아미노산 서열(서열번호 2)은 다음과 같다.

상기 아미노산 서열 전체는 Hspb1의 92-145 번째 아미노산서열에 해당하며 이 부분만으로도 PKCδ와 결합할 수 있다. 밑줄 친 부분은 92-105번째 아미노산서열에 해당하며 PKCδ와의 결합에 꼭 필요한 부분이다.

실시예 6

여러 종류의 Hspb1 부분 삭제 단백질들의 세포 사멸 저해 효과를 확인한 결과, PKCδ와 결합하는 능력이 있는 Hspb1과 그 변이 펩티드들만이 방사선에 대하여 유효한 세포자가사멸 저해 효과가 있음을 관찰하였다.

실시예 7

암세포들의 방사선 내성과 HSPB1 발현량과의 상관관계를 다음과 같이 확인하였다.

즉, 본 출원인이 쥐 모델(Hspb1)에서 관찰한 현상들이 사람의 암세포에서도 동일하게 일어나는지를 관찰하기 위해, 사람의 비소세포성 폐암 (Non-Small-Cell Lung Cancer) 세포인 H1299, H596, H460의 방사선에 대한 내성을 조사하였다. 10 Gy의 방사선을 조사하였을 때, 세포는 손상을 입게되고 이들 중 회복이 불가능한 세포들은 자가사멸(Apoptosis)을 일으켰다. 이때 방사선에 대해 높은 내성을 가지는 암세포일수록 HSPB1의 발현량이 높음을 관찰 할 수 있었다.

도 7a를 보면, 10 Gy의 방사선을 조사하였을 때, 자가사멸 되는 세포가 증가됨을 확인하였고, 그 경향에 있어 H1299>H596>H460 의 순으로 방사선 내성이 높음을 관찰 할 수 있었다.

또한 도 7b를 보면, 방사선 내성이 큰 순서(H1299>H596>H460)대로 HSPB1의 발현량이 높음을 관찰 할 수 있었다. 이 때 모든 세포에서 그 발현량이 일정한 것으로 알려진 β-액틴의 발현량을 대조군으로 사용하였다.

도 7c를 보면, 방사선 내성이 높은 H1299 세포에서 H460세포에 비해, PKCδ의 발현량은 비슷하지만 HSPB1의 발현량이 더 높으며, PKCδ와의 결합량도 더 많으며, PKCδ 활성도 떨어짐을 관찰할 수 있다.

도 7d에서 알 수 있는 바와 같이, HSPB1에 대한 Si(small interference) RNA를 H1299세포에 넣어주었을 때, HSPB1의 발현량이 줄어들고, PKCδ와의 결합량도 줄어들고, PKCδ 인산화 효소 활성도 떨어짐을 관찰하였다.

또한 도 7e를 보면, H1299세포에 HSPB1에 대한 Si RNA를 넣어 주었을 때, 방사선에 대한 내성이 떨어짐을 관찰할 수 있었다.

본 발명에 의하면, 암세포의 방사선 내성이 저분자량 열충격단백질인 HSPB1의 발현량과 양의 상관관계가 있음을 밝힘으로써, 이를 바탕으로 방사선 치료 시 암세포의 HSPB1 발현량을 미리 검사하여 암세포의 방사선 내성을 예상할 수 있으며, 그에 따라 치료시 사용할 방사선 조사선량을 조절하는데 중요한 자료로 활용될 수 있을 것이다. 또한 방사선에 의한 세포사멸시 죽음의 신호전달에 중요한 기능 을 하는 PKCδ와 그 저해작용을 하는 Hspb1의 결합부위를 밝힘으로써 이를 바탕으로 한 방사선 민감제 및 방사선 보호제를 제공할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

HSPB1 또는 Hspb1과 결합하는 특성을 갖고 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩티드.
제 1 항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 PKCδ-유래인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 1 항의 펩티드를 포함하는 방사선 민감제.
HSPB1 또는 Hspb1과 결합하는 특성을 갖는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자.
제 4 항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제 4 항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물.
PKCδ과 결합하는 특성을 갖고 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩티드.
제 7 항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 HSPB1 또는 Hspb1-유래인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 7 항의 펩티드를 포함하는 방사선 보호제.
PKCδ과 결합하는 특성을 갖는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자.
제 10 항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제 10 항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물.
동물로부터 시료를 채취한 후, HSPB1 또는 Hspb1에 결합하는 결합 펩티드를 이용하여, HSPB1 또는 Hspb1과 상기 결합 펩티드와의 결합량을 측정한 후, 결합량이 적은 경우 HSPB1 또는 Hspb1의 발현량이 적은 것으로 보고 방사선 내성이 작은 것으로 판단하며, 결합량이 많은 경우 HSPB1 또는 Hspb1의 발현량이 많은 것으로 보고 방사선 내성이 큰 것으로 판단하는 것을 포함하는, 방사선 내성의 정량적 측정 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 결합 펩티드는 서열번호 1과 95% 이상 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드인 것을 특징으로 하는 방사선 내성의 정량적 측정 방법.