CN113201591A - 一种长链非编码rna及其抑制剂在预防、治疗乳腺癌中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种长链非编码RNA及其抑制剂在预防、治疗乳腺癌中的应用，首次克隆了长链非编码RNA LINC01778V2的全长序列，长链非编码RNA LINC01778 V2在顺铂耐药乳腺癌和顺铂敏感乳腺癌中差异表达。所以通过检测LINC01778 V2有助于实现乳腺癌顺铂耐药性的诊断。同时，LINC01778 V2对应表达抑制剂能抑制乳腺癌肿瘤细胞的增殖、促进乳腺癌肿瘤细胞的凋亡，对肿瘤细胞起到杀伤作用，并能逆转顺铂耐药三阴性乳腺癌的顺铂耐药性。本发明还公开了对应抑制剂在预防、治疗发生顺铂耐药的三阴性乳腺癌中的应用。

Description

一种长链非编码RNA及其抑制剂在预防、治疗乳腺癌中的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤分子生物学领域，更具体地，涉及一种长链非编码RNA及其抑制剂在预防、治疗乳腺癌中的应用。

背景技术

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，根据2018年GLOBOCAN及2019年中国肿瘤登记中心的数据，乳腺癌在全球和我国均为发病率最高的女性恶性肿瘤，严重影响女性的生命健康。在临床实践中，根据乳腺癌细胞的雌/孕激素受体(ER/PR)是否阳性、人类表皮生长因子受体2(HER2)是否过表达、Ki67百分比，可以把乳腺癌分成四个不同的分子亚型：LuminalA型，Luminal B型，HER2过表达型，三阴型(TNBC)。不同类型的乳腺癌预后不同，采取的治疗方式也不一样。目前乳腺癌现有治疗手段主要包括外科手术、化疗、放疗、内分泌治疗和靶向治疗。近年来，随着肿瘤分子生物学研究的日趋深入，肿瘤的基因治疗以其治疗的高特异性和相对较低的毒副作用为乳腺癌的治疗开辟了一个新天地。因此，寻找可用于诊断的生物标志物，并由此引出新的治疗靶点，是当今肿瘤学研究的重要内容。

尤其是对于三阴性乳腺癌而言，寻找相关诊断或治疗靶点更为重要；三阴型乳腺癌因为肿瘤细胞不表达激素受体与HER2受体，缺乏有效的内分泌治疗和靶向治疗靶点，是乳腺癌中预后最差的类型。所以，目前，对于三阴性乳腺癌主要采取的治疗方式是化疗。随着治疗水平的不断提高，乳腺癌的五年生存率已经达到70％-90％。然而，据CREATE-X研究，三阴型乳腺癌作为预后最差的类型，即使在接受化疗后，其五年复发率最高仍可达44％。化疗耐药是肿瘤细胞死灰复燃，从而发生复发转移，导致治疗失败，肿瘤进展的重要原因。目前，铂类药物是三阴型乳腺癌临床上常用的化疗药物之一，所以，如能寻找到三阴性乳腺癌耐药治疗的靶点，解决对铂类药物耐药的状况，结合顺铂药物有助于解决当前因耐药而导致的治疗效果低下、患者得不到有效治疗、生存期短的问题。

长非编码RNA是近年来发现与肿瘤的发生、发展和转移密切相关的分子。人类基因组当中只有大约3％的转录本是编码蛋白的，其他97％的转录本并不翻译成蛋白。但是，这些不编码蛋白的基因组在各种状态下依然会被转录，被称为非编码。其中，长非编码RNA(long non coding RNA,lncRNA)是一组不翻译蛋白，长度大于200nt的RNA。过去，lncRNA被认为是基因组转录过程中的“噪音”，不发挥生物学功能。然而，近来已经发现lncRNA参与多种生物学过程，在多个病理、生理过程中均发挥着重要的作用，其与肿瘤的发生、发展和转移过程也密切相关。随着对LncRNA的研究逐渐深入，研究开始关注LncRNA与肿瘤治疗耐药之间的关系。2017年，Lin等人报道长非编码RNA HOXD-AS1促进了前列腺癌的化疗耐药。2019年，Jiang等人报道长非编码RNA Lnc-TALC通过与miR-20b-3p的结合，促进脑胶质瘤的TMZ耐药。本申请在此基础上，意在从长非编码RNA层面获取乳腺癌的标志物以及治疗靶点，尤其是针对于三阴性乳腺癌以及对顺铂耐药的三阴性乳腺癌。

发明内容

本发明首次发现核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的长链非编码RNA(以下记作LINC01778 V2)在顺铂耐药乳腺癌组织中相比顺铂敏感乳腺癌组织明显上调，其至少通过调控热休克蛋白27(Hsp27)的表达发挥促进肿瘤细胞增殖、抵抗凋亡以及产生铂类药物耐药性的生物学功能。本发明人通过顺铂药物进行诱导，建立起对顺铂药物耐药的顺铂耐药三阴性乳腺癌稳定细胞株后，提取顺铂药物耐药三阴性乳腺癌细胞株和顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株的总RNA进行lncRNA芯片检测并通过生物信息学的分析得到差异表达的新的长链非编码RNA，验证发现LINC01778 V2在顺铂药物耐药三阴性乳腺癌细胞株表达水平高，而在顺铂药物敏感三阴性乳腺癌细胞株中表达水平较低。随后，通过RACE实验技术获取长链非编码RNA LINC01778 V2的全长序列。且由LINC01778 V2在三阴性乳腺癌中表现的特点，提示LINC01778 V2或许也能作为其他类型乳腺癌的诊断或治疗靶点，用于制备诊断乳腺癌的产品或药物。且本发明人下调LINC01778 V2表达后发现，对应的三阴性乳腺癌细胞增殖受到抑制，三阴性乳腺癌细胞的凋亡被促进，所以通过下调LINC01778 V2表达还能实现对乳腺癌的治疗作用，所以基于LINC01778 V2还能用于制备治疗乳腺癌的产品或药物。同时，本发明人还发现下调LINC01778 V2表达后能实现顺铂耐药乳腺癌细胞株的耐药性逆转，使耐药乳腺癌细胞株恢复对顺铂类药物的敏感性，结合下调LINC01778 V2表达和顺铂药物能实现更为显著的治疗效果。

本发明首次运用5′RACE和3′RACE技术鉴定长链非编码RNA LINC01778 V2的序列为1542bp，长非编码RNA在不同的细胞、组织中可有变异，本申请中所指的LINC01778 V2序列为本发明人在人乳腺癌细胞中通过RACE实验证实的长非编码RNA LINC01778全长序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，即：

aaggaactctcactgcgcccttgtttggacaagacgaggaggcgcactcagagtcagagaccccggggcagagacaggggcaagaagaaggggccaccgagaccccaagagagtcagggagacagacgcaccaaacgaccgacacaaccagggacagatatccttcgagttggatttcgactgggttctgccagtgggatgtatccatgcgagattctggaactaacatcagagagagtccaagcttctaacttttatcagcggcagtgacaatagtcaagcagcattgatgacaaacggcaagagtttagaaagtaccagtgacgtgcctgatagaatctcaccacaagatggaagccaactcgtcagaagcctggaaagcccacccagcgtgggacctctgtgggtccaggatcttggaatggtatcccatggttcaatcttctggattcaaccacataaatttaccccacccatgtcgtggacccaagcttcctaccatgtatacttagcttaaatgcaagatagtactattttgttcatcttgattggagtgagaaatgaataggtccatgcacatatatttcttttaccacaacaagatgatgaagaaataaatccataatatcgatacttttgtataagttgtgtttacagttgcggtaagaaattttataattgttgatttgctttatataatttctgcttgctttttatgatatttaaaacaaaatctaagcaacaaattttatgtctgattagatttacagaagctgcttaagtgcttagggataatttgttcatcatatttgtaagtctcccttgttaggtgtttgaagtgtttgaattggctaaattaaatttgtaattgtagtttgaaatatctaaaggaattttcttaattaagtgtttaaatgatgttaaaagtttgtgggaatttaatctatcaaatttatgagttaattgaatatgaatcaatgaacaagtaaatgtgatcttgcttttatataaaaactactaagttcataaataaaatacaaagatccataagttgagaggaaaagcaaaagagccagattctaagatctataacttaaaaaaattaaatattgattgaaatgtaagtcattgcaattatccccactagctgaaatctcacatctgagtgcttacacacaaaacaaaatgttaccctgaacatactaaacaaataaaaaaccacgtggtaattactatacacatgctcactgctggaagcattcatactgcactcaaatccaggtgggagaatgcagcgtgtgctacaggtgaatctcggctgttctcttatggggatcaggtctttttcttaattatcttccacggatttttcttcctttacccagagacctggaggccctcccagcccaggtccaattcagatggatacatacttaacatcactaacctattgatttgcttgtttatttacactgcagcacatgtttgttgtggtgcagaaggaaaacctccttcacatcttatactgaataatatcaatgc。

本发明提供了一种长链非编码RNA LINC01778 V2在制备诊断、治疗乳腺癌产品中的应用，所述LINC01778 V2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次克隆了LINC01778的全长cDNA序列，cDNA的序列如SEQ ID NO.1所示。现有技术中还未公开如本申请所获得的LINC01778 V2，也未公开本申请所获得的长度的LINC01778 V2。因为长链非编码RNA LINC01778 V2在顺铂耐药乳腺癌、顺铂敏感乳腺癌中差异表达，提示通过检测长链非编码RNA LINC01778 V2的表达有助于应用于乳腺癌以及乳腺癌顺铂耐药的诊断。更具体的，因长链非编码RNA LINC01778 V2在三阴性乳腺癌和顺铂耐药三阴性乳腺癌中差异表达，其在顺铂耐药三阴性乳腺癌中为更高水平的表达，所以通过检测LINC01778 V2更能实现三阴性乳腺癌诊断以及三阴性乳腺癌的顺铂耐药性诊断。同时，本发明人发现通过抑制LINC01778V2的表达，能抑制乳腺癌肿瘤细胞的增殖、促进乳腺癌肿瘤细胞的凋亡。所以LINC01778 V2能实现在制备诊断、治疗乳腺癌产品中的应用。

基于本申请中的LINC01778 V2序列设计的检测引物，有助于减少检测过程中的干扰，提高检测准确率。同时，基于LINC01778 V2的cDNA序列，能为进一步研究LINC01778在三阴性乳腺癌顺铂耐药性的发生、发展过程中的功能奠定基础。当LINC01778 V2作为标志物时，基于本申请所公开的序列设计的引物能够提高检测LINC01778 V2基因表达的准确率，从而提高LINC01778 V2作为基因标志物提供检测信息的可靠性。当LINC01778 V2作为治疗靶点时，基于本申请所公开的LINC01778 V2序列也有助于准确的设计抑制剂，如siRNA，从而实现精准的抑制，提高治疗效果。基于LINC01778 V2的cDNA序列设计的靶位点序列具有更高的靶向准确性，为乳腺癌，更具体的为三阴性乳腺癌、顺铂类药物耐药三阴性乳腺癌治疗药物的研发和治疗提供了更多以及更为有效的功能靶点，有助于显著提高治疗药物的靶向治疗效果。

本发明提供了一种抑制剂在制备预防或治疗乳腺癌的药物中的应用，所述抑制剂特异性抑制LINC01778 V2基因的表达，所述LINC01778 V2基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。在本发明的一个实施例中，通过抑制剂siRNA抑制LINC01778 V2的表达后，三阴性乳腺癌细胞增殖明显受到抑制，同时，还促进了三阴性乳腺癌细胞的凋亡。所以，下调LINC01778V2表达的抑制剂能够实现三阴性乳腺癌的治疗，同时，也有助于在预防三阴性乳腺癌上实现应用。

进一步地，乳腺癌为顺铂耐药的三阴性乳腺癌。在本发明的一个实施例中，采用抑制剂抑制LINC01778 V2表达后，顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株的耐药性被逆转，重新对顺铂药物敏感，同时利用顺铂药物作用于三阴性乳腺癌细胞时，相比于未抑制LINC01778 V2表达的顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株，抑制LINC01778 V2表达的顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株实验组肿瘤细胞活性明显降低，且肿瘤细胞的增殖受抑制、肿瘤细胞的凋亡加快；即抑制剂作用于顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞时实现了顺铂耐药的逆转，结合顺铂药物同时作用于顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞能显著提高对顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞的治疗效果。所以抑制LINC01778 V2表达的抑制剂能在制备预防或治疗顺铂耐药三阴性乳腺癌的药物或产品中应用。

进一步地，所述抑制剂为siRNA分子；siRNA能够靶向作用于LINC01778 V2，一方面基于其靶向性能够提高作用靶基因的效率，实现靶向沉默LINC01778 V2对应的基因片段，同时，还能避免对其他基因的表达造成干扰而导致副作用，有助于实现对乳腺癌组织、细胞的靶向杀伤、治疗。且当抑制剂为siRNA分子时还有利于借助其他载体实现更进一步的高效运输、靶向运输，有助于基于较少的剂量即能实现显著的治疗效果，能有效避免剂量过多而可能导致的副作用。且siRNA用于基因抑制时，干扰效果好，能够有效抑制LINC01778 V2基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。相比于非靶向性的治疗药物或抑制剂，siRNA能够除了能避免对其他基因表达造成影响外，还能在联合其他药物治疗时避免对其他药物的治疗效果产生负向影响；有助于结合其他药物或载体实现在治疗上增益的效果。

进一步地，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述siRNA的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；或，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，所述siRNA的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。其中SEQ ID NO.2和SEQID NO.3形成相应的一对siRNA，记该对siRNA为si1。SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5形成相应的另一对同样能沉默LINC01778 V2表达的siRNA，记该对siRNA为si2。SEQ ID NO.2～SEQID NO.5均为由5’→3’顺序表现的序列。所以实际上si1对应的正义链为5'-CAUGGUUCAAUCUUCUGGATT-3'，反义链为3'-UCCAGAAGAUUGAACCAUGTT-5'；si2对应的正义链为5'-GUGUUUGAAUUGGCUAAAUTT-3'，反义链为3'-AUUUAGCCAAUUCAAACACTT-5'。在本发明的多个实施例中，采用si1、si2均能对LINC01778 V2实现有效的沉默，从而抑制其表达，以达到对包括三阴性乳腺癌、顺铂耐药三阴性乳腺癌的乳腺癌的治疗效果。

进一步地，所述siRNA分子为被修饰的siRNA分子，所述被修饰的siRNA分子使所述LINC01778 V2基因的表达沉默。所述修饰包括核糖修饰、碱基修饰或磷酸骨架修饰。由于siRNA是基于SEQ ID NO.1核苷酸序列而设计的，所以往往不单单只有与si1或si2完全相同的siRNA才能实现沉默的效果，当对所述siRNA进行修饰并使得修饰后的siRNA仍能抑制LINC 01778V2表达时，修饰后的siRNA同样能起到预防、治疗三阴性乳腺癌的效果。且为了siRNA的运输以及靶向作用，对siRNA进行修饰还有助于改进siRNA在临床上的实际应用，有助于进一步提高单独的siRNA或siRNA联合其他物质时的治疗效果。针对性的修饰除了能产生上述效果外，还能利用核糖、碱基、磷酸骨架的修饰进一步研究后续siRNA沉默机制以及沉默所引发的生物学过程，如应用标记进行修饰，有助于研究siRNA在临床使用时的运输效率以及可能引发的生物机制、其他抑癌机制，从而有助于基于该研究基础实现更为有效的治疗药物或方案，以提高治疗效果、患者的生存率。

进一步地，所述siRNA分子的核苷酸被部分替换和/或增减，核苷酸被部分替换和/或增减后的siRNA分子使所述LINC01778 V2基因的表达沉默。所述siRNA是作为LINC01778V2表达抑制剂而存在，而基于同一LINC01778 V2对应的核苷酸序列，除了si1、si2外，部分在si1、si2基础上增减和/或替换部分核苷酸所产生的siRNA同样能抑制LINC01778 V2的表达，所以，siRNA并不局限于只有si1、si2对应的核苷酸序列，且在si1、si2基础上进行部分核苷酸的增加和/或替换有助于随着对LINC01778 V2研究的深入而获取能进一步高效抑制LINC01778 V2表达或便于联合其他治疗物质实现治疗的siRNA。

本发明提供了一种抑制剂在制备逆转三阴性乳腺癌顺铂耐药的药物中的应用，所述抑制剂特异性抑制LINC01778 V2基因的表达，所述LINC01778 V2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。抑制LINC01778 V2表达的抑制剂，即下调LINC01778 V2表达的抑制剂，除了能直接能应用于治疗包括三阴性乳腺癌、顺铂耐药三阴性乳腺癌的乳腺癌以杀伤肿瘤细胞外，在本发明的一个以上实施例中，通过LINC01778 V2的抑制剂能够实现顺铂耐药三阴性乳腺癌的耐药逆转，所以抑制LINC01778 V2表达的抑制剂同样能直接在制备逆转三阴性乳腺癌顺铂耐药的药物中应用，以便逆转耐药性后进行顺铂药物的持续治疗，因为顺铂药物仍然是目前三阴性乳腺癌化疗的主要治疗手段，所以通过逆转顺铂耐药性有助于避免产生顺铂耐药性的三阴性乳腺癌患者缺失有效的治疗手段。

进一步地，所述抑制剂为siRNA分子；

进一步地，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述siRNA的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；或，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，所述siRNA的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供了一种抑制剂在制备预防或治疗乳腺癌的药物中的应用，所述抑制剂特异性抑制HSPB1基因表达和/或抑制Hsp27蛋白产生。在本发明的一个实施例中，发现LINC01778 V2是通过影响HSPB1基因表达和/或Hsp27蛋白产生而促进乳腺癌耐药性产生的。进一步地，所述抑制剂抑制LINC01778 V2表达。

本发明提供了一种药物组合物，包括特异性抑制LINC01778 V2基因表达的抑制剂，所述LINC01778 V2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，还包括顺铂药物。所述药物组合物同时包含抑制LINC01778 V2基因表达的抑制剂和顺铂药物时，一方面能基于抑制剂直接实现对肿瘤细胞的靶向杀伤，另一方面，抑制剂还能逆转对顺铂耐药三阴性乳腺癌的顺铂耐药性，所以结合同时作用的顺铂能够实现效果更为显著的治疗作用。在本发明中的一个实施例中，同时包含抑制剂和顺铂药物的实验组对肿瘤细胞的杀伤、抑制效果达到最佳。同时，药物组合物还包含顺铂药物时，能应用于三阴性乳腺癌治疗中预防可能产生的顺铂耐药性，从而使顺铂药物顺利实现对应的药物作用。

进一步地，所述药物组合物还包括与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。所述与抑制剂配伍的载体和/辅料有助于抑制剂快速作用；进一步地，载体选择病毒、纳米颗粒、胆固醇或脂质体中的一种或多种，纳米粒子不仅便于抑制剂的包裹，还有助于基于纳米粒子进行修饰以便实现更为多样的靶向治疗。病毒、胆固醇、脂质体载体也能为抑制剂提供适用多种场景下的载体环境。

进一步地，所述药物组合物的剂型选自溶液剂、悬液剂、乳剂、粉剂、控制释放剂或持续释放制剂。进一步地，所述药物组合物的给药方式选自注射给药或灌注给药。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：基于LINC01778 V2在不同组织中的差异表达，LINC01778 V2能作为一种标志物而应用于乳腺癌、三阴性乳腺癌以及三阴性乳腺癌顺铂耐药性的诊断，有助于及时判断病症，从而实现对症下药。同时，通过抑制剂以沉默LINC01778V2的表达，从而实现对三阴性乳腺癌细胞的杀伤作用，为现代乳腺癌的治疗提供新的靶点，有助于基于该治疗靶点提高治疗效果，延长患者的生存期。且通过抑制剂沉默LINC01778 V2表达还能逆转顺铂耐药三阴性乳腺癌的耐药性，从而使其恢复对顺铂药物的敏感性，有助于为当前临床治疗中因产生耐药机制而无法获得有效治疗的患者提供新的治疗方案和治疗靶点，提高患者的生存率和生存期。抑制剂结合顺铂药物同时作用时，则能实现双重的治疗效果，相比于现有技术单独的顺铂药物治疗，效果得到明显提升，能够实现协同治疗效果。本发明将siRNA作为抑制剂，不仅有助于实现靶向性的治疗，减少副反应。还有助于后续应用其他载体或辅助药物进行更为高效的治疗过程，为患者的治疗提供更为多样、有效的选择。促进在乳腺癌治疗方向上的研究，以便为临床治疗提供快速有效的治疗方案，克服当前临床治疗乳腺癌所存在的缺陷，为乳腺癌尤其是三阴性乳腺癌提供强有力的治疗手段。

附图说明

图1为顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株和顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株的lncRNA表达谱；

图2为经RACE实验验证的LINC01778 V2转录本全长示意图；

图3为基于Mfold和RNAfold软件包预测的RNA二级结构示意图；

图4为LINC01778 V2在231CisR中的荧光原位杂交结果图。

图5为顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株(MDA-MB-231CisR)和顺铂敏感三阴性乳腺癌菌株(MDA-MB-231parental)在顺铂药物下的细胞活性折线图(左)和LINC01778 V2在顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株(MDA-MB-231CisR)和顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株(MDA-MB-231parental)中的表达水平柱状图(右)；

图6为顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株(MDA-MB-468CisR)和顺铂敏感三阴性乳腺癌菌株(MDA-MB-468parental)在顺铂药物下的细胞活性折线图(左)和LINC01778 V2在顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株(MDA-MB-468CisR)和顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株(MDA-MB-468parental)中的表达水平柱状图(右)。

图7为原位杂交实验检测LINC01778 V2分别在顺铂化疗不敏感患者乳腺癌组织(右)、顺铂化疗敏感患者乳腺癌组织(左)中的表达情况。

图8为LINC01778 V2抑制剂及其联用顺铂于乳腺癌细胞杀伤实验的结果。

图9为LINC01778 V2表达下调后乳腺癌细胞部分基因表达结果以及HSPB1与乳腺癌患者、化疗乳腺癌患者的不良预后相关性分析。

图10为LINC01778 V2与多个基因表达的相关性研究结果。

具体实施方式

下面结合具体的实施案例对本发明做进一步的详细说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。除非另外说明，实施例所公开的实验方法均采用本领域常规技术，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施。

实施例1

长链非编码RNA LINC01778 V2的获取及分析

一、筛选长链非编码RNA LINC01778 V2

使用顺铂药物进行诱导，建立对顺铂药物耐药的三阴性乳腺癌稳定细胞株，本实施例中是通过浓度梯度递增法，从低浓度开始，经过两年时间，建立对顺铂完全耐药的三阴性乳腺癌稳定耐药细胞株。然后，通过lncRNA的芯片检测，对比顺铂药物耐药三阴性乳腺癌细胞株和顺铂药物敏感三阴性乳腺癌细胞株，筛选出一批差异表达的lncRNA；所述的顺铂药物敏感即对顺铂药物不耐药；具体的，利用华大基因测序基于Illumina四代高通量测序平台的lncRNA高通量测序进行准确筛选，lncRNA高通量测序包括lncRNA鉴定、lncRNA定量及差异分析、lncRNA表达聚类、lncRNA靶基因分析、转录本mRNA鉴定、mRNA定量及差异分析、mRNA表达聚类、mRNA功能及结构分析、circRNA鉴定、circRNA定量及差异分析、circRNA表达聚类，并基于上述分析结果获取包括靶基因分析、ceRNA互作网络分析、蛋白互作网络分析、共表达互作网络分析、关键驱动基因网络分析的分析结果。通过华大公司lncRNA 高通量测序筛选出一批差异表达的lncRNA后，本发明人进行了差异lncRNA表达的验证，基于表达谱发现长非编码RNA LINC01778 V2在顺铂药物耐药细胞株表达水平高，而在敏感三阴性乳腺癌细胞株中表达水平较低，从而初步筛选出该长链非编码RNA LINC01778 V2。具体的，表达谱如图1所示，LINC01778在两种细胞株中表达差异明显，为此，本申请基于LINC01778进行了后续的进一步分析。本实施例以及后续实施例所采用的顺铂药物为sigma的顺铂。

二、利用RACE对筛选出的长链非编码RNA LINC01778 V2进行序列分析

RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)是一种获得RNA转录本全长序列的技术。利用RACE技术可以根据转录本中的一小段已知序列获得转录本的5′端(5′RACE-PCR)或3′端(3′RACE-PCR)序列。本实施例中通过SMARTer RACE方法(clontech公司专利技术)，扩增长链非编码RNA (Long non-coding RNA,LncRNA)的末端未知序列。

具体包括以下步骤：

1、从顺铂耐药乳腺癌细胞中提取总RNA

采用普洛麦格的total RNA抽提试剂盒(SV Total RNA Isolation SystemStart-Up Kit),利用改进型重组DNA酶I从细胞样品中高效快速除掉基因组DNA，分离纯化和富集包括有长非编码RNA 在内的总RNA。

2、基于RACE技术获取完整cDNA

(1)利用SMARTer RACE 5’/3’试剂盒，完整地反转录包括LINC01778 V2在内的总RNA的带有完整5’和3’序列的cDNA。

(2)根据NCBI数据库中已知的长LINC01778 V2的部分序列，设计与其互补配对的特异性引物，并进行PCR扩增。

引物序列如下：01778-Forward:5’-GTCAGAAGCCTGGAAAGCCC-3’；01778-Reverse:5’-CACGACATGGGTGGGGTAAAT-3’；

(3)通过DNA凝胶电泳判断和分离PCR的扩增长度。使用胶回收试剂盒回收和纯化扩增后的cDNA。

3、利用一代测序技术鉴定LINC01778 V2的序列并与UCSC的基因序列进行比对，从而获取验证后的LINC01778 V2全长序列。

过程及结果如图2所示，通过RACE实验验证了LINC01778 V2的转录本全长。

三、利用结构预测软件预测LINC01778 V2的二级结构

在基于实施例2的RACE实验获得LINC01778 V2的序列全长后，利用Mfold和RNAfold软件包对LINC01778 V2的RNA二级结构进行预测，结果如图3所示，LINC01778 V2具有茎环结构。

四、利用RNA荧光原位杂交(RNA-FISH)实验定位LINC01778 V2

基于实施例3的RACE实验获得LINC01778 V2的序列全长后，设计并通过Exiqon公司合成具有5’地高辛标记的锁核酸(LNA)探针，并利用LNA探针原位检测细胞中LINC01778V2的表达。

包括以下步骤：

1、用多聚甲醛将乳腺肿瘤细胞固定于载玻片上，通过0.5％triton冰上破膜5分钟，0.05％胰蛋白酶消化蛋白，暴露RNA位点，通过LINC01778 V2特异的地高辛标记探针于52℃杂交炉杂交过夜。

2、严格清洗后用带绿色荧光的抗地高辛抗体在4℃孵育过夜。

3、在DAPI孵育后封片，在荧光显微镜下观察LINC01778 V2在乳腺肿瘤细胞中的定位，结果如图4所示，显示其主要分布于细胞浆，有助于基于LINC01778 V2制备的药物设置为靶向细胞浆，从而提高检测准确率或靶向作用效率。

实施例2

基于MDA-MB-231细胞系检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞在顺铂药物作用下的活性变化，并采用荧光定量PCR(qPCR)检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞中LINC01778 V2的表达

1、检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞在顺铂药物作用下的活性变化

顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株为MDA-MB-231CisR，顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株为MDA-MB-231parental，在同一时间分别施加同剂量的顺铂药物，并观察2d内MDA-MB-231CisR和MDA-MB-231parental的细胞活性变化，结果如图5(左)所示，MDA-MB-231CisR细胞活性在2d内总体上仍然是保持升高，而顺铂药物治疗MDA-MB-231parental则能获取有效的治疗效果，MDA-MB-231parental细胞组2d内的细胞活性在顺铂药物起效后显著下降。表明构建的MDA-MB-231CisR对顺铂药物耐药，而MDA-MB-231parental不耐药。

2、荧光定量PCR(qPCR)检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞中LINC01778V2的表达

其中，荧光定量PCR检测顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231CisR中LINC01778 V2的表达的步骤如下所示：

(1)利用NCBI数据库的primer blast功能，基于如SEQ ID NO.1所示序列设计LINC01778V2的引物。引物序列如下：

LINC01778-Forward:5’-GTCAGAAGCCTGGAAAGCCC-3’

LINC01778-Reverse:5’-CACGACATGGGTGGGGTAAAT-3’

(2)提取顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231CisR的总RNA。

(3)样品cDNA的制备：采用TAKARA公司的PrimeScript RT逆转录酶，并按说明书操作:①RT-PCR体系：提取的总RNA 500ng、PrimeScript RT逆转录酶2ul，利用无RNA酶的ddH₂O补到10μl；②置于PCR仪中37℃孵育15min，85℃孵育5s以灭活逆转录酶，获得cDNA。

(4)荧光定量PCR

①采用TAKARA公司的TB Green Premix Ex Taq II试剂盒，其反应体系如下：TBGreen5ul、LINC01778 V2正向引物0.4μL、LINC01778 V2反向引物0.4μL、cDNA 1μL、ddH2O3.2μL，总体积10μL。

②基于①反应体系在罗氏PCR系统LightCycler480 system中进行反应并分析数据。

荧光定量PCR检测顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231parental中LINC01778V2的表达的步骤与上述荧光定量PCR检测顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株中LINC01778 V2的表达步骤相同；最后，荧光定量PCR(qPCR)检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞中LINC01778 V2的结果如图5(右)所示。图5(右)显示了顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株中LINC01778 V2表达的显著差异，MDA-MB-231CisR中LINC01778 V2的表达水平是MDA-MB-231parental的LINC01778 V2表达水平的4倍多，足以显示其在对顺铂不同反应的三阴性乳腺癌中的差别，结合图5(左)对细胞株的验证结果，证明LINC01778 V2能作为标志物判断三阴性乳腺癌的顺铂耐药性，且基于其差异的显著，基于检测LINC01778V2表达的诊断也具备充足的诊断准确性。

实施例3

基于MDA-MB-468细胞系检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞在顺铂药物作用下的活性变化，并采用荧光定量PCR(qPCR)检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞中LINC01778 V2的表达

1、检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞在顺铂药物作用下的活性变化

顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株为MDA-MB-468CisR，顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株为MDA-MB-468parental，在同一时间分别施加同剂量的顺铂药物，并观察2d内MDA-MB-468CisR和MDA-MB-468parental的细胞活性变化，结果如图6(左)所示，MDA-MB-468CisR细胞活性在2d内总体上仍然是保持升高，而顺铂药物治疗MDA-MB-468parental则能获取有效的治疗效果，MDA-MB-468parental细胞组2d内的细胞活性在顺铂药物起效后显著下降。表明构建的MDA-MB-468CisR对顺铂药物耐药，而MDA-MB-468parental不耐药。

2、荧光定量PCR(qPCR)检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞中LINC01778V2的表达

其中，荧光定量PCR检测顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-468CisR中LINC01778 V2的表达的步骤如下所示：

(1)利用NCBI数据库的primer blast功能，基于如SEQ ID NO.1所示序列设计LINC01778V2的引物。引物序列如下：

LINC01778-Forward:5’-GTCAGAAGCCTGGAAAGCCC-3’

LINC01778-Reverse:5’-CACGACATGGGTGGGGTAAAT-3’

(2)提取顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-468CisR的总RNA；

(3)样品cDNA的制备：采用TAKARA公司的PrimeScript RT逆转录酶，并按说明书操作:①RT-PCR体系：提取的总RNA 500ng、PrimeScript RT逆转录酶2ul，利用无RNA酶的ddH₂O补到10μl；②置于PCR仪中37℃孵育15min，85℃孵育5s以灭活逆转录酶，获得cDNA。

(4)荧光定量PCR

①采用TAKARA公司的TB Green Premix Ex Taq II试剂盒进行，反应体系如下：TBGreen5ul、LINC01778 V2正向引物0.4μL、LINC01778 V2反向引物0.4μL、cDNA 1μL、ddH2O3.2μL，总体积10μL。

②基于①反应体系在罗氏PCR系统LightCycler480 system中进行反应并分析数据。

荧光定量PCR检测顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-468parental中LINC01778V2的表达的步骤与上述荧光定量PCR检测顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株中LINC01778 V2的表达步骤相同；最后，荧光定量PCR(qPCR)检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞中LINC01778 V2的结果如图6(右)所示。

通过对基于不同的三阴性乳腺癌细胞系检测，进一步验证了实施例2的结论，且通过不同细胞系能证明LINC01778 V2作为标志物或靶点是具有三阴性乳腺癌广谱性的，能够适用不同三阴性乳腺癌患者。

实施例4

在获得LINC01778 V2对应的全长序列后，除了上述对多种细胞系的检测外，本发明人同时还对顺铂化疗敏感患者乳腺癌组织及对顺铂化疗不敏感患者乳腺癌组织进行LINC01778V2基因表达的检测。

1、原位杂交检测FFPE样本中的LINC01778 V2表达。

本实施例中采用的原位杂交检测方法为常规检测方法，主要包括步骤：脱蜡和补液，然后使用20μg/ml罗氏蛋白酶K进行消化，消化过程完成后通过4％多聚甲醛进行固定，再基于Exiqon公司的双(5’和3’)digoxin-labeled(DIG-labeled)LNA-modified CREILA探针实现杂化作用，并于52℃下孵育过夜；随后在4℃下与anti-DIG单克隆抗体结合，基于碱性磷酸酶(罗氏,目录11093274910)、硝基蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(Roche)实现染色显示，最后将切片裱起来观察。ISH中使用的探针序列为5’-AGATTCTATCAGGCACGTCACT-3’。强度记录为0(无染色)，1(浅紫色)，2(紫蓝色)和3(深紫色)。且本实施例中乳腺癌组织为三阴性乳腺癌组织。

如图7所示，检测发现在顺铂化疗不敏感患者乳腺癌组织表达量较顺铂化疗敏感患者乳腺癌组织中高，见图7(右)，所以LINC01778 V2可以作为一种对顺铂化疗不敏感乳腺癌患者的标志物。

实施例5

在LINC01778 V2基础上，本发明人进一步设计相应的siRNA以研究LINC01778 V2作为治疗靶点的可行性。

发明人基于LINC01778 V2序列设计了多条靶向LINC01778 V2的siRNA，采用脂质体介导的方法转染癌细胞后，通过荧光定量PCR的方法检测siRNA沉默LINC01778 V2的效率，以及siRNA结合顺铂对乳腺癌细胞的杀伤效果。所述siRNA即为SEQ ID NO.2～NO.5所示序列。以下及以下实施例以si1/sh1标识包含SEQ ID NO.2～NO.3所示序列的siRNA，以si2/sh2标识包含SEQ ID NO.4～NO.5所示序列的siRNA，其中sh1代表经载体导入细胞株的si1，sh2代表经载体导入细胞株的si2。

本发明人通过siRNA敲低LINC01778 V2在MDA-MB-231CisR细胞株中的表达，以下实施例中以231CisR表示MDA-MB-231CisR耐药细胞株，231标识MDA-MB-231非耐药细胞株，结果如图8A所示，NC为不加入siRNA的对照组，而si1为加入包括SEQ ID No.2、SEQ ID No.3的siRNA的实验组，结果显示，通过siRNA能够有效降低LINC01778 V2的表达。进一步地，本发明人还结合siRNA和顺铂研究siRNA下调LINC01778 V2表达后对三阴性乳腺癌细胞活性以及三阴性乳腺癌细胞对顺铂耐药性的影响，结果如图8B所示，其中w/o代表不加入顺铂，with cisplatin代表加入顺铂，从图中可以看出，不加顺铂时，通过siRNA下调LINC01778V2表达后，细胞活性显著地受到抑制。而相比于不加顺铂，结合siRNA下调LINC01778 V2表达并加入顺铂的实验组在细胞活性受到更为显著的抑制，基于NC对照组中加入顺铂与不加入顺铂的活性差异不显著的表现以及单独siRNA实验组的表现，可知siRNA下调LINC01778V2表达还会逆转三阴性乳腺癌细胞对顺铂的耐药性。

同时，本发明还进一步的基于细胞计数、平板克隆检测了NC阴性对照组、sh1组、sh1+顺铂组下231CisR细胞的增殖情况，其中sh1组即代表使用si1下调LINC01778 V2表达的组别；sh1+cisplatin即为sh1+顺铂，代表同时使用si1和顺铂的实验组，结果如图8C所示，可以明显的看出抑制LINC01778 V2表达能够直接抑制乳腺癌细胞的增殖，且当LINC01778V2表达抑制剂结合顺铂药物时，乳腺癌细胞增殖抑制更为显著。本发明人还通过Annexin-V/PI染色流式分析进行231原始细胞株、231CisR细胞株、231CisR细胞株+si1实验组中加入和不加入顺铂时的凋亡研究，其中w/o Cis代表不含顺铂、with Cis代表包含顺铂，结果如图8D所示。从图中也可以看出，231CisR细胞株+si1组别、231CisR细胞株+si1+Cis组别细胞凋亡明显，表明siRNA能够直接促进乳腺癌细胞的凋亡，且231CisR细胞株+si1+Cis组别细胞凋亡较231CisR细胞株+si1组别细胞凋亡更加显著，表明si1能逆转顺铂耐药，且si1联合顺铂能够起到最佳的治疗效果。

实施例6

本发明还比较了下调LINC01778表达后231CisR细胞株的mRNA表达谱，结果如图9A所示，相应的HSPB1表达下调，证明LINC01778的下调直接影响HSPB1的表达。为了进一步验证该结果，本发明人通过QRT-PCR验证HSPB1在稳定敲低LINC01778的耐药株中的表达下调，结果如图9B所示。其中NC为阴性对照，sh1、sh2分别为加入si1、si2的实验组。进一步地，本发明人还研究HSPB1与乳腺癌患者及接受化学治疗的乳腺癌患者群体的不良预后关系，结果如图9C、9D所示，结果显示，乳腺癌患者以及经化学治疗的乳腺癌患者中HSPB1与不良预后密切相关。

实施例7

本发明人还比较了三阴性乳腺癌非耐药细胞株231和耐药细胞株231CisR中HSPB1mRNA的表达情况，如图10A所示，表明耐药三阴性乳腺癌细胞株中HSPB1呈现特异性高表达。同时，也比较了Hsp27、AKT、pAKT蛋白的表达情况，结果如图10B所示。结果显示，HSPB1mRNA在耐药细胞株较非耐药株表达较高。同时，对应的Hsp27蛋白也表达较高，且AKT、pAKT蛋白也较高。表明LINC01778V2可能是通过影响HSPB1表达，从而促进Hsp27的产生，以引发三阴性乳腺癌的耐药机制。为此，本发明人进一步的研究了Hsp27与顺铂耐药三阴性乳腺癌之间的关联，下调Hsp27后发现能够直接对231CisR细胞株产生抑制，并逆转其对顺铂的耐药性，使CisR恢复对顺铂的敏感性，结果如图10C所示。本发明人为进一步研究LINC01778V2的作用机制，研究了下调LINC01778表达的同时过表达Hsp27蛋白对231CisR细胞的影响，其中Hsp27过表达是通过构建过表达载体并转入细胞株实现的，结果如图10D所示，单独的下调LINC01778 V2均能实现对癌细胞的杀伤作用，而当同时过表达Hsp27时，下调LINC01778的效果则有所减弱，且顺铂耐药的逆转也不明显，由此，也表明了LINC01778是通过影响HSPB1基因表达以及Hsp27蛋白的产生而达到肿瘤细胞杀伤、顺铂耐药逆转效果的。从而进一步的获得了LINC01778 V2的作用机制研究基础，也为乳腺癌的治疗提供新的靶点和研究方向。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学孙逸仙纪念医院

<120> 一种长链非编码RNA及其抑制剂在预防、治疗乳腺癌中的应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1542

<212> DNA

<213> 未知

<400> 1

aaggaactct cactgcgccc ttgtttggac aagacgagga ggcgcactca gagtcagaga 60

ccccggggca gagacagggg caagaagaag gggccaccga gaccccaaga gagtcaggga 120

gacagacgca ccaaacgacc gacacaacca gggacagata tccttcgagt tggatttcga 180

ctgggttctg ccagtgggat gtatccatgc gagattctgg aactaacatc agagagagtc 240

caagcttcta acttttatca gcggcagtga caatagtcaa gcagcattga tgacaaacgg 300

caagagttta gaaagtacca gtgacgtgcc tgatagaatc tcaccacaag atggaagcca 360

actcgtcaga agcctggaaa gcccacccag cgtgggacct ctgtgggtcc aggatcttgg 420

aatggtatcc catggttcaa tcttctggat tcaaccacat aaatttaccc cacccatgtc 480

gtggacccaa gcttcctacc atgtatactt agcttaaatg caagatagta ctattttgtt 540

catcttgatt ggagtgagaa atgaataggt ccatgcacat atatttcttt taccacaaca 600

agatgatgaa gaaataaatc cataatatcg atacttttgt ataagttgtg tttacagttg 660

cggtaagaaa ttttataatt gttgatttgc tttatataat ttctgcttgc tttttatgat 720

atttaaaaca aaatctaagc aacaaatttt atgtctgatt agatttacag aagctgctta 780

agtgcttagg gataatttgt tcatcatatt tgtaagtctc ccttgttagg tgtttgaagt 840

gtttgaattg gctaaattaa atttgtaatt gtagtttgaa atatctaaag gaattttctt 900

aattaagtgt ttaaatgatg ttaaaagttt gtgggaattt aatctatcaa atttatgagt 960

taattgaata tgaatcaatg aacaagtaaa tgtgatcttg cttttatata aaaactacta 1020

agttcataaa taaaatacaa agatccataa gttgagagga aaagcaaaag agccagattc 1080

taagatctat aacttaaaaa aattaaatat tgattgaaat gtaagtcatt gcaattatcc 1140

ccactagctg aaatctcaca tctgagtgct tacacacaaa acaaaatgtt accctgaaca 1200

tactaaacaa ataaaaaacc acgtggtaat tactatacac atgctcactg ctggaagcat 1260

tcatactgca ctcaaatcca ggtgggagaa tgcagcgtgt gctacaggtg aatctcggct 1320

gttctcttat ggggatcagg tctttttctt aattatcttc cacggatttt tcttccttta 1380

cccagagacc tggaggccct cccagcccag gtccaattca gatggataca tacttaacat 1440

cactaaccta ttgatttgct tgtttattta cactgcagca catgtttgtt gtggtgcaga 1500

aggaaaacct ccttcacatc ttatactgaa taatatcaat gc 1542

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caugguucaa ucuucuggat t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttguaccaag uuagaagacc u 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

guguuugaau uggcuaaaut t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttcacaaacu uaaccgauuu a 21

Claims (10)

1.长链非编码RNA LINC01778 V2在制备诊断、治疗乳腺癌产品中的应用，所述LINC01778 V2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种抑制剂在制备预防或治疗乳腺癌的药物中的应用，所述抑制剂抑制LINC01778V2基因的表达，所述LINC01778 V2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，乳腺癌为顺铂耐药三阴性乳腺癌。

4.根据权利要求2～3任一项所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为siRNA分子；

所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述siRNA的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；或

所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述siRNA的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述siRNA分子为被修饰的siRNA分子，所述被修饰的siRNA分子沉默所述LINC01778 V2基因的表达。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述siRNA分子的核苷酸被部分替换和/或增减，核苷酸被部分替换和/或增减后的siRNA分子沉默所述LINC01778 V2基因的表达。

7.一种抑制剂在制备逆转三阴性乳腺癌顺铂耐药的药物中的应用，所述抑制剂抑制LINC01778 V2基因的表达，所述LINC01778 V2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

8.一种抑制剂在制备预防或治疗乳腺癌的药物中的应用，所述抑制剂抑制HSPB1基因表达和/或抑制Hsp27蛋白产生。

9.一种药物组合物，其特征在于，包括抑制LINC01778 V2基因表达的抑制剂，所述LINC01778 V2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，还包括顺铂药物。

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