WO2000072011A1 - Methode pour mesurer une activite enzymatique de phosphorylation - Google Patents

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Akira Ogawa
Toshiko Kobayashi
Minoru Yano
Katsuyuki Tamai
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Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring a phosphorylase activity or a phosphatase activity using an antibody that identifies a phosphorylation state, and a method for inhibiting or promoting a phosphoric acid enzyme or a phosphatase.
  • the present invention relates to a screening method and a kit for measuring and screening the same. Skill
  • DNA-PK DNA-dependent protein kinase
  • ATM AT mutated
  • ATR ATM and rad3 related
  • p53 an expression product of the tumor suppressor gene. It is a closely related serine Z threonine kinase.
  • the cell cycle can be divided into G1 (DNA synthesis preparation), S (DNA synthesis), G2 (division), and M (division) phases. .
  • p21CIPl / WAFl binds to Cycl in E-Cdk2, Cyclin D-Cdk4, and 6 required for Gl phase progression and inhibits its activity as a protein kinase (SJ Elledge. Science Vol. 274, 1996, D. 0. Morgan. Nature Vol. 374, pl31, 1995). This mechanism achieves Gl phase arrest.
  • 14-3-3 ⁇ binds to Cdc25C (phosphoserine 216) phosphorylated by Chkl or Chk2 and inactivates Cdc25C by translocating to the nucleus (Paul Nurse. Cell Vol 91, p865, 1997).
  • the active Cyclin B-Cdc2 complex required for the progression of the G2 / M phase is phosphorylated by Weel kinase and inactivated, and the inactive Cyclin B-Cdc2 (phosphomouth mouth 15) is dephosphorylated by Cdc25C protein phosphatase. It is oxidized and activated (Paul Nurse. Cell Vol 91, p865, 1997).
  • G2 arrest is achieved by inducing the expression of the 14-3-3 sigma protein.
  • S-phase arrest is also achieved via Chk2 kinase activated with DNA damage (S. Matsuoka et al. Science Vol 282, pl893, 1998).
  • ATM a gene responsible for ataxia telangiectasia (AT), known as a human genetic disease, is activated when cells are exposed to ionizing radiation, and phosphorylates p53 Serl5. Oxidizes (S. Banin et al. Science Vol 281, pl674, 1998, CE Canraan et al. Science Vol 281, pl677, 1998).
  • ATR ATM and rad3 related activated by ultraviolet irradiation of cells also phosphorylates p53 Serl5 (E. Canraan et al. Science Vol 281, pl677, 1998).
  • Radiotherapy chemotherapy, and immunotherapy are used in cancer treatment. It is presumed that the presence of a drug that absents or reduces the function of DNA damage checkpoints in cancer cells will enable the selective killing of cancer cells. Drugs that increase the checkpoint function of normal cells may also be effective during radiation therapy.
  • AT patients are known to be 3-4 times more sensitive to ionizing radiation than normal individuals (H. Westphal et al. Nat. Genet. Vol 16, p397, 1997). In cells from AT patients (AT cells), there is no arrest at G1, S or G2 / M phase following ionizing radiation (K. Savitsky et al. Science Vol 268, pl749, 1995, WA Cliby et al. EMBO J. Vol 17, pl59, 1998).
  • the phosphorylation activity measurement system is not only useful for screening drugs against ATM, but also provides an effective screening system for drug development against ATR and DNA-PK.
  • Phosphorylase enzymes such as DNA-PK, ATR, or ATM, phosphorylate p53 and other proteins such as c_Abl, PHAS-I, I ⁇ , ⁇ , RPA, and c-Jun It has been known.
  • c-Abl is one of the proto-oncogenes that is activated in more than 90% of chronic myeloid leukemias.
  • PHAS-I phosphorylated heat and acid stable protein regulated by insulin
  • I / cBa is a protein involved in controlling the activity of transcription factor NF- ⁇ .
  • RPA replication protein II
  • C-Jun is a nuclear oncogene that is a component of the transcription factor API. Therefore, a simple measurement principle that can determine the phosphatase activity of ATM, ATR, or DNA-PK has important significance in research to elucidate the cell cycle. But so far, in the activity measurement of the protein kinase, labeled with 32 P radioactive same position elements, / - 32 for using P-ATP, when implementing has been required special equipment .
  • DNA-PK, ATM, and ATR belonging to the PI3K family are serine Z threonine phosphorylases having similar primary structures, and thus, it has not been possible to measure the activity of these enzymes separately. Therefore, the development of a simple phosphorylase activity measurement system has been demanded.
  • PKA and PKC activity measuring methods have been put to practical use as a simple method for measuring the kinase activity.
  • a synthetic peptide called a PS peptide is used as a substrate, and the enzymatic phosphorylation is detected by an antibody that recognizes the phosphorylated PS peptide, thereby measuring the kinase activity.
  • the PS peptide which is a substrate peptide, does not serve as a substrate for DNA-PK, ATM, or ATR, which are phosphorylases of p53.
  • the present invention relates to a method for measuring the activity of DNA-PK, ATM, and ATR, which are enzymes that phosphorylate p53 and the like, or dephosphorylation of p53 and the like phosphorylated by the action of these phosphoenzymes.
  • An object is to provide a method for measuring oxidase activity.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening a compound capable of controlling the kinase activity of DNA-PK, ATM and ATR. Further, the present invention is not limited to simply measuring the activity of these kinases.
  • the present invention is an object to provide a measuring method capable of grasping the phosphate I inhibit the enzyme activity separately, it is an object to provide a kit for these measuring methods Ya screening method.
  • the present inventors used a substrate peptide phosphorylated by DNA-PK, ATM, and ATR, and immunologically measured changes in the level of phosphorylation of the substrate peptide. It was thought that it would be possible to determine the phosphoenzyme activity by doing this.
  • the SQ motif such as p53 or the serine residue that constitutes the SQE motif could be a target for phosphorylation and dephosphorylation by these kinases.
  • the phosphorylation level of a substrate peptide can be easily evaluated by using an antibody against phosphorylated P53.
  • the present inventors have found that by using the antibody, it is possible to screen a compound that inhibits or promotes the phosphorylation or dephosphorylation of a substrate peptide by enzymatic action. completed.
  • the present invention relates to the following methods for measuring a phosphorylase activity, a method for measuring a phosphatase activity, and a method for screening a compound that regulates the activity of a phosphatase / phosphatase based on these methods.
  • a method for measuring protein kinase activity in a sample comprising the following steps, wherein the protein kinase is selected from the group consisting of DNA-PK, ATM, and ATR. Features method.
  • a method for screening for a compound that inhibits or promotes protein kinase activity comprising the following steps, wherein the protein kinase is selected from the group consisting of DNA-PK, ATM, and ATR.
  • a method characterized by being selected. (a) any one of a phosphorylating enzyme selected from the group consisting of DNA-PK, ATM, and ATR, and a substrate peptide phosphorylated by the phosphorylating enzyme; Incubating in the presence and conditions necessary for the phosphorylation reaction
  • a method for measuring dephosphorylation enzyme activity of a phosphorylated protein in a sample comprising the following steps, wherein the phosphorylated protein comprises DM-PK, ATM, and ATR.
  • a method for screening a compound that inhibits or promotes phosphatase activity on a phosphorylated protein comprising the following steps, wherein the phosphorylated protein is DNA-PK, ATM, and ATR.
  • An antibody that can identify the phosphorylation state can identify its phosphorylation site, and the activity of a kinase that is contained in a sample in which multiple kinases that phosphorylate different sites coexist [1] The method of [1], in which is measured individually.
  • a method for measuring DNA-PK activity comprising the following steps.
  • the term “peptide” refers to a compound in which two or more amino acids are bound by a peptide bond, and the chain length is not limited. Therefore, proteins are also included in the “peptide” of the present invention.
  • the kinase to be measured in the present invention is selected from the group consisting of DNA-PK, ATM, and ATR.
  • the measurement target may be a natural enzyme derived from human tissue or a recombinant that can be obtained by expressing a gene encoding the same in an appropriate expression system.
  • the origin of the enzyme is not limited to human, and may be a homologue in other vertebrates or microorganisms.
  • enzymes having the same amino acid sequence as the natural enzyme protein but also mutants consisting only of the region (kinase region) that supports the expression of the enzyme activity, or this region fused with other proteins
  • Enzymatic proteins having essentially the same enzymatic activity, such as fusion proteins are all phosphorylated by the present invention. It can be a subject of a method for measuring enzyme activity.
  • the present invention firstly relates to a method for measuring a kinase activity using an antibody that specifically binds to a substrate peptide that is phosphorylated by DNA-PK, ATM, and ATR. More specifically, the measuring method includes the following steps (a) and (b).
  • the substrate peptide used in the present invention is not particularly limited as long as it is a peptide that is phosphorylated by DNA-PK, AT, and ATR.
  • a peptide containing an SQ motif comprising the following amino acid sequence is known to have a serine residue (S) that is phosphorylated by these kinases.
  • n amino acid residues X at the amino terminal side x - n and n amino acid residues at the carboxyl terminal side Is written as X + n .
  • Peptides containing this motif are generally said to undergo phosphorylation at the S position. Since the Km of the kinase varies depending on the difference in the amino acid of X, the use of a substrate peptide having an amino acid sequence with a lower Km makes it possible to measure the kinase with higher sensitivity. it can. For example, ATM and ATR are presumed to be susceptible to phosphorylation, especially when the position 2 of the SQ motif is E. Such an amino acid sequence called an SQE motif is a desirable substrate peptide for the purpose of measuring the activity of ATM or ATR.
  • proteins derived from living organisms that can be used as substrate peptides include: For example, the following proteins can be shown.
  • the substrate peptide can be any of a natural peptide, a peptide prepared using a genetic recombination technique, and a synthetic peptide. It may be fused with another peptide (eg, glutathione-S-transferase) for the purpose of facilitating purification of the peptide.
  • the substrate peptide is used in an amount sufficient for the expected enzyme activity. For example, when phosphorylation is performed at a certain substrate concentration and most of the substrate peptide is phosphorylated, there is a concern that the substrate peptide may be insufficient. In such cases, it is desired to increase the relative concentration of the substrate peptide by increasing the substrate concentration or diluting the sample.
  • the substrate peptide is brought into contact with a sample under conditions that allow phosphorylation by the kinase.
  • the conditions under which phosphorylation is possible are as follows: in a reaction medium that provides the pH necessary to maintain the activity of the target phosphorylation enzyme, at the appropriate reaction temperature in the presence of the components necessary for the reaction together with the substrate peptide. It means to incubate.
  • Components required for the reaction include a substrate that supplies a phosphate group required for a phosphorylation reaction, and a phosphatase inhibitor that is added for the purpose of protecting a phosphorylation reaction product.
  • Adenosine triphosphate (hereinafter abbreviated as ATP) or the like is generally used as a substrate for supplying a phosphate group, and i3-glycerophosphate is used as a phosphatase inhibitor.
  • ATP Adenosine triphosphate
  • i3-glycerophosphate is used as a phosphatase inhibitor.
  • Mn ion is used when measuring the kinase activity of ATM or ATR.
  • an ATM / ATR reaction buffer having the following composition can be shown.
  • the substrate peptide will be phosphorylated according to its activity if a kinase is present in the sample.
  • specific components support the phosphoric acid reaction of each enzyme, it is possible to construct a specific activity measurement method for each enzyme.
  • DNA-PK requires a double-stranded DNA fragment for expression of activity (T. Carter et al., Mol. Cel. Biol. Vol 10, p64 60-6471 (1990)). Enzyme activity with and without strand DNA fragment Based on this difference, the kinase activity derived from DNA-PK can be known.
  • the phosphorylation level of the phosphorylated substrate peptide is evaluated by an immunological reaction with an antibody capable of discriminating the phosphorylation state of the substrate peptide.
  • the term "phosphorylation level" is used as a term meaning not only the ratio of phosphorylated peptide in the substrate peptide but also the degree of phosphorylation on the substrate peptide molecule.
  • an increase in the phosphoric acid level of a substrate peptide means either a state in which the proportion of phosphorylated peptide is increased or a state in which the number of phosphorylation sites on the substrate peptide is increased.
  • the antibody capable of distinguishing the phosphorylation state used in the present invention means an antibody whose reactivity with a substrate peptide changes depending on the presence or absence of phosphorylation. Specifically, it is possible to show an antibody whose reactivity to a phosphorylated substrate peptide is larger (or smaller) than its reactivity to a non-phosphorylated substrate peptide.
  • an antibody that specifically recognizes ⁇ 53 phosphorylated by DNA- ⁇ is known (S-Y. Shieh et al. Cell Vol 91, p325, 1997). Similar antibodies can be prepared by methods known to those skilled in the art (for example, Cell Engineering Separate Volume Anti-Peptide Antibody Experimental Protocol 1994 Shujunsha, BM Tuner and G.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • a phosphorylated peptide-specific monoclonal antibody can be obtained from an antiserum obtained by immunization with a phosphorylated peptide from a non-phosphorylated peptide column (a column for absorption of a non-specific reactive antibody) or a phosphorylated peptide column ( It can be purified using a specific antibody purification column).
  • hybridomas producing monoclonal antibodies can be cloned by screening those producing specific antibodies from hybridomas established from antibody-producing cells of animals immunized with the phosphorylated peptide. Screening was performed using non-phosphorylated peptides in the culture supernatant.
  • the reactivity to the phosphorylated peptide is examined by ELISA, and the selection is made by selecting clones highly reactive to the phosphorylated peptide.
  • the necessary monoclonal antibody can be purified from the culture supernatant or ascites.
  • a measurement method based on an antibody that can recognize not only the phosphorylation state but also a difference in structure including the amino acid sequence constituting the substrate peptide is used.
  • Phosphorylase does not necessarily phosphorylate the same part of the substrate peptide. For example, when DNA-PK phosphorylates p53, phosphorylation progresses around two serine residues at positions 15 and 37. On the other hand, the main phosphorylation site is the serine residue at position 15 even in the case of ATM and ATR that have the same phosphorylation of p53.
  • the present invention provides a measurement method that can independently grasp the activity of each phosphorylase using a sample in which a plurality of phosphorylases may coexist.
  • the reaction between the substrate peptide and the antibody can be detected using the well-known principle of Imnoassay. Generally, by using either the substrate peptide or the antibody in a solid phase, the unreacted components can be easily separated.
  • Methods for immobilizing a substrate peptide antibody on a solid phase are known.
  • a substrate peptide antibody can be directly immobilized on a solid phase by chemical bonding or physical adsorption. If the substrate peptide is biotinylated, streptavidin can be captured on the sensitized solid phase and indirectly solidified. In general, when a substrate peptide is immobilized, it is performed under conditions where the adsorption of a protein to a carrier is saturated.
  • the immobilization of the biotinylated substrate peptide can be performed at any timing before, after, or simultaneously with the contact with the sample.
  • any combination other than avidin-biotin can be applied to the present invention as long as the combination has an affinity for each other.
  • substrate ⁇ The peptide can be conjugated with an appropriate antigenic substance, and the substrate peptide can be captured using a solid phase sensitized with an antibody against the antigenic substance.
  • a solid phase generally used as a solid phase such as the inner wall of a reaction vessel, a particulate carrier, or a bead-like carrier, may be used as a solid phase for immobilizing a substrate peptide antibody.
  • the material those generally used for physical adsorption and chemical bonding of proteins can be used.
  • a microtiter plate made of polystyrene or the like is used.
  • the change in the level of phosphorylation is evaluated based on the principle of Imno-Assy
  • simple operation can be realized by labeling either the substrate peptide or the antibody.
  • a label there is no particular restriction as long as it has detectable sensitivity.
  • enzymes such as peroxidase, 3-D-galactosidase, alkaline phosphatase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, and acetylcholinesterase Labels, fluorescent labels such as delphinium, radioactive labels, and the like can be used.
  • a so-called indirect labeling system for labeling a substance that specifically binds to the antibody for example, a secondary antibody, protein A, protein G, protein AZG (a fusion protein of A and G), etc. Can also be used.
  • Evaluation of the phosphoric acid level of the substrate peptide can be performed by a method known to those skilled in the art according to the specificity of the antibody and the label (for example, ultra-sensitive enzyme immunoassay by Eiji Ishikawa Gakkai Shuppan Center) 1993)). That is, when an antibody having reactivity with a phosphorylated substrate peptide is used in combination with a labeled substrate peptide, the magnitude of the signal derived from the labeled substrate peptide that has reacted with the antibody is phosphorylated. It is proportional to the activity. Conversely, if an antibody having reactivity with the non-phosphorylated substrate peptide is used, the magnitude of the signal will be inversely proportional to the phosphoric acid activity.
  • the phosphorylation level can be quantified based on a standard curve prepared in advance using a substrate peptide whose phosphoric acid level is known as a standard sample. Alternatively, a qualitative comparison can be made using a sample of the kinase activity free as a control.
  • the method for measuring a kinase activity according to the present invention can be applied to any sample in which the presence of DNA-PK, ATM, and ATR is suspected. Representative samples include tissues derived from human and non-human animals, extracts of various cultured cells and extracts thereof, cell culture supernatants, secretion of blood, urine, body fluids, sweat, saliva, breast milk, etc. Things can be shown.
  • DNA-PK the kinase activity of DNA-PK contained in the nuclear extract is measured by using the presence or absence of the double-stranded DNA fragment described above, and is linked to the cell cycle and immune function. It is expected to provide useful information for clarifying the relationship between various events and DNA-PK.
  • DNA-PK deficiency in mice results in immunodeficient individuals called SCID mice, and functionally DNA-PK activity is closely related to the host defense of immunity. Measuring DNA-PK activity in the thymus and bone marrow, which are the sites of differentiation of immunocompetent cells, can be used to estimate rejection after transplantation or to recover the prognosis of patients who have received immunosuppressants for any reason. It is thought to be useful for estimating. Furthermore, DNA-PK is known to bind to the DNA terminus together with other proteins and to be involved in cell cycle checkpoints and DNA repair. Therefore, it may be an important test item to measure the activity of DNA-PK together with ATM to determine the resistance of the irradiated patient to radiation prior to radiation therapy. As the test sample at this time, cells cultured from the skin of a patient or a lesion such as a cancer can be used, and the activity before and after irradiation is measured.
  • the present invention provides a method for measuring not only the kinase activity but also the phosphatase activity on a substrate peptide phosphorylated by a phosphorylase selected from the group consisting of DNA-PK, ATM, and ATR. Also provide.
  • the method for measuring phosphatase activity according to the present invention includes the following steps (a) and (b).
  • the same substrate peptide as that used for the measurement of the kinase activity can be used by phosphoric acid in advance.
  • the phosphorylation of the substrate peptide is obtained by treating the substrate peptide with a phosphorylating enzyme selected from the group consisting of DNA-PK, ATM, and ATR under the conditions that allow phosphorylation. be able to.
  • a phosphorylating enzyme selected from the group consisting of DNA-PK, ATM, and ATR under the conditions that allow phosphorylation. be able to.
  • the phosphorylation substrate peptide necessary for measuring the phosphatase activity not only enzymatically synthesized peptide but also chemically synthesized one having the same structure can be used. it can.
  • the same antibody as described above can be used.
  • a method for evaluating the phosphorylation level of a substrate peptide based on the immunoassay can be carried out based on the same principle as described above. The only difference is that the relationship between the magnitude of the signal derived from the labeled substrate peptide (or labeled antibody) in the phosphatase activity and the magnitude of the enzyme activity to be measured is reversed.
  • phosphatase for proteins phosphorylated by kinases selected from the group consisting of DNA-PK, ATM, and ATR in human organisms No protein has been identified. However, it can be a measurement system for measuring the total protein phosphatase activity contained in tissue extracts, cell extracts, and the like.
  • any sample whose presence is suspected can be measured.
  • the phosphatase activity found in each fraction is useful as an indicator of enzyme purification.
  • the method for measuring the activity of a phosphatase or a phosphatase according to the present invention can be used for screening of an inhibitor or a promoter of a phosphatase or a phosphatase, respectively. That is, the present invention relates to a phosphorylase, The present invention relates to a method for screening a compound that inhibits or promotes the activity of a dephosphorylating enzyme. In the present invention, these compounds that inhibit or promote enzyme activity are collectively referred to as compounds that regulate enzyme activity.
  • a method for screening a compound that inhibits or promotes a phosphoenzyme activity according to the present invention includes the following steps (a) to (c).
  • the contact between the kinase and the substrate peptide and the evaluation of the phosphorylation level of the substrate peptide can be performed in the same manner as in the method for measuring the kinase activity described above. As a result, if the detection amount of the phosphate group bound to the serine residue of the substrate peptide decreases in the absence of the test compound, the test compound used in the screening promotes the activity of the kinase. Then it is determined.
  • the phosphoenzyme used in the screening according to the present invention not only natural DNA-PK, ATM or ATR but also an enzyme protein obtained as a recombinant can be used.
  • an enzyme protein obtained as a recombinant not only those having the same amino acid sequence as the natural enzyme, but also an enzyme fragment comprising only the kinase region can be used.
  • the expression product can be made smaller, and as a result, a larger amount of enzyme protein can be easily obtained as a recombinant.
  • the method of screening for a compound that inhibits or promotes dephosphorylation enzyme activity according to the present invention includes the following steps (a) to (c).
  • test compounds used in these screening methods include, but are not limited to, peptides (including proteins), synthetic low molecular weight compounds, cell extracts of animals, plants and bacteria, cell culture supernatants, and the like.
  • the dephosphorylating enzyme for example, Escherichia coli alkaline phosphatase, bovine small intestine alkaline phosphatase, and protein phosphatases such as human Cdc25 and Cdcl4 can be used.
  • the contact of the phosphatase with the phosphorylated substrate peptide and the evaluation of the phosphorylation level of the substrate peptide can be carried out in the same manner as in the method for detecting the phosphatase activity described above.
  • the phosphate group bound to the serine residue of the substrate peptide was detected in the absence of the test compound (control)
  • the detected amount of phosphate group is increased, use it for screening.
  • the test compound was determined to inhibit phosphatase activity.
  • the test compound used for screening is determined to promote the activity of phosphatase. .
  • a cell extract of animals or plants or bacteria, a cell culture supernatant, or the like when used as the test compound, these can be obtained by methods known to those skilled in the art (eg, various types of chromatography). By fractionating and detecting each, it is possible to finally identify a single compound that inhibits the activity of a phosphorylating (or dephosphorylating) enzyme.
  • phosphorylating (or dephosphorylating) enzyme By fractionating and detecting each, it is possible to finally identify a single compound that inhibits the activity of a phosphorylating (or dephosphorylating) enzyme.
  • Compounds that inhibit or promote the activities of phosphorylase and dephosphorylation enzyme isolated by these screenings are particularly useful as candidate compounds for cancer therapeutics and antifungal antibiotics.
  • the present invention relates to a kit containing an antibody capable of discriminating a phosphorylation state, which is used for the above-mentioned measurement method or screening.
  • the kit of the present invention comprises, for example, a substrate peptide, a buffer, or the like, in addition to the antibody.
  • a phosphorylated substrate peptide When used for detection of phosphatase activity, it is composed of a phosphorylated substrate peptide and a buffer in addition to the above antibody.
  • a phosphorylase or phosphatase is further combined. Either the substrate peptide or the antibody can be labeled as described above, and the other can be immobilized.
  • the kit can be combined with an enzyme standard / substrate / peptide standard for assaying the activity of the kinase (or phosphatase) and the assay system itself.
  • Other components for stabilization and the like can be added to these samples and the antibody.
  • FIG. 1 is a diagram showing the control of the cell cycle by a DNA damage checkpoint.
  • FIG. 2 is a diagram showing the reactivity of antiphospho p53-S15.
  • FIG. 3 shows the reactivity of antiphospho p53-S33.
  • FIG. 4 is a diagram showing the reactivity of antiphospho p53-S37.
  • FIG. 5 is a diagram showing the phosphorylating enzyme activity of recombinant ATM detected by the anti-phospho P53-S15 antibody.
  • FIG. 6 is a diagram showing the activity of a phosphorylating enzyme of recombinant ATR detected by an anti-phospho p53-S15 antibody.
  • FIG. 7 is a diagram showing DNA-PK phosphorylating enzyme activity detected by an anti-phospho p53 site-specific antibody. '' Best mode for carrying out the invention
  • Phospho P53-S15 SVEPPLS (p) QETFSDC (SEQ ID NO: 4)
  • P53-S15 SVEPPLSQETFSDC (SEQ ID NO: 5)
  • Phospho P53-S33 PENNVLS (p) PLPSQAC (SEQ ID NO: 6)
  • P53-S33 PENNVLSPLPSQAC (SEQ ID NO: 7)
  • Phospho p53-S37 VLSPLPS (p) QAMDDLC (SEQ ID NO: 8)
  • P53-S37 VLSPLPSQA DDLC (SEQ ID NO: 9)
  • the above-mentioned peptide sequences are represented by one-letter code in the direction from the amino terminal to the carboxy terminal.
  • S (p) indicates a phosphorylated serine residue. It was confirmed by HPLC that the purity was 90% or more.
  • Phospho p53-S15 and p53_S15 are the ninth to 21st of human p53, phospho p53-S33 and p53-S33 are the 27th to 39th, and phospho p53-S37 and p53-S37 are the 31st.
  • the carboxy-terminal cysteine residue of all peptides was introduced to covalently attach the peptide to the carrier protein.
  • Phosphorylated peptides (phospho p53-S15, -S33, or -S37) were each covalently linked to a carrier protein, keyhole limpet hemocyanin (KLH), to serve as an immunogen.
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • MFS m-maleimide benzoyl-N-hydroxysuccinimide ester
  • Equal amounts of KLH and peptide were cross-linked. This peptide-KLH was used as the immunogen.
  • the carrier protein KLH and the peptide bound thereto (peptide-KLH) 20 / ig (100 AiL) were used as a persimmon and 10 / g (100 / L) as an immunogen per mouse. 1.
  • 100 M 1 Freund's complete adjuvant and peptide-KLH (100 ⁇ l each) were mixed using a 1 ml syringe and 21 gauge needle until complete emulsification.
  • mice (Balb / c) were injected intraperitoneally with phospho-p53-S15-KLH or phospho-p53-S33-KLH and an emulsion of adjuvant using a 26 gauge needle (immunization). Immunization was performed once a week, for a total of four times. At the time of the fourth immunization, in order to check the antibody titer, 50 to 100 ⁇ l of blood was collected from the intraocular vein of the mouse, and the antibody titer was confirmed by ELISA.
  • phospho-p53-S37-KLH and the adjuvant emalzion were subcutaneously subcutaneously rearward of the egret (Japanese white) at 8 places from 7 capsules, and immunized using a 26 gauge injection needle. Immunization was performed once a week, for a total of five times. At the time of the fifth immunization, several milliliters of blood were collected from the earlobe vein of the egret to check the antibody titer, and the antibody titer was confirmed by ELISA.
  • the spleen was excised from the mouse, and fused with Myeoma cells using polyethylene glycol.
  • Hybridomas were selected by HAT (hypoxanthine, aminolatelin, thymidine: hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hypoxanthine, aminolatelin, thymidine: hypoxanthine, aminopterin, thymidine.
  • the ELISA method using the culture supernatant of the hybridoma revealed that the non-phosphorylated peptide (p53-S15, p53-S33) was more reactive with the phosphorylated peptide (phospho p53-S15, phospho p53-S33) than the non-phosphorylated peptide (p53-S15, p53-S33). High clones were screened.
  • the hybridoma clone obtained by the limiting dilution method was cultured in a 75 cm 2 flask, and then injected into the peritoneal cavity of a mouse. Mice were injected with 1 ml 10 days prior to hybridoma injection and 0.5 tnl pristane (Sigma) 3 days prior to injection. One to two weeks later, ascites was collected while observing the condition of the mouse. Ammonium sulfate was added to ascites to a final concentration of 50 50, and the mixture was stirred at 4 ° C for 1 hour or more. The precipitate was collected by high-speed centrifugation.
  • the collected blood was allowed to stand at 4 ° C for coagulation, and the serum was separated. The final concentration of serum separated and recovered is 0.1 /.
  • Sodium azide was added and stored at 4 ° C.
  • ammonium sulfate was added to the collected serum to a final concentration of 50%, and the mixture was stirred at 4 ° C for 1 hour or more.
  • the precipitate was collected by high-speed centrifugation. After completely dissolving the precipitate with a minimum of pure water, it was dialyzed against PBS using a dialysis membrane. After completely equilibrating with PBS, the antibody fraction was applied to a column to purify the antibody.
  • the anti-phospho P53-S37 antibody fraction eluted from the specification column was passed through an absorption column and a p53-S37 Sepharose 4B column.
  • the antibody Antibodies that also react with non-phosphopeptides present in the fractions were absorbed on the absorption column.
  • Anti-phosphorylated peptide-specific antibody does not adsorb to the column and passes through the column.
  • the absorption column was washed with PBS-0.1% Tween 20, and the anti-non-phosphorylated peptide antibody adsorbed on the column was eluted with 0.1 M glycine-HC1 (pH 3.0). After elution, the column was again equilibrated with PBS-0.1% Tween 20.
  • the antibody fraction was repeatedly passed through the absorption column until the non-phosphorylated peptide antibody was almost completely absorbed. The progress of absorption was confirmed by ELISA using a non-phosphorylated peptide-sensitized plate.
  • the phosphorylated peptide (phospho p53-S15, phospho p53-S33, or phospho p53-S37) sensitized plate prepared as described above can be used to measure antibody titer and absorb anti-phosphorylated serine residue specific antibody. It was used to confirm the specificity of the anti-phosphopeptide antibody.
  • the non-phosphorylated peptide (p53-S15, p53-S33, or p53-S37) -sensitized plate was used to confirm the absorption of the nonspecific antibody by the column.
  • Serum and antibodies were diluted as necessary with 0.1% Tween 20-PBS.
  • the diluted samples were added at 100 per well of the sensitized plate and left at room temperature for 1 hour (primary reaction). After the primary reaction, each panil was thoroughly washed four times or more with PBS using a washing bottle.
  • the anti-phospho p53-S15 specific antibody, anti-phospho p53_S33 specific antibody and anti-phospho P53-S37 specific antibody were diluted, and their specificity was confirmed using each peptide-sensitized plate (Fig. 2-4).
  • hATM-Fl and hATM-R1 primers were set up.
  • hATR-F1 and hATR-R1 primers were set to amplify the cDNA sequence encoding the kinase region of human ATR (2305 to 2644, SEQ ID NO: 3).
  • Reverse primer 1 (hATM-R1); 5'-GCG CTC GAG CAC CCA AGC TTT CCA TCC TGG-3 '(SEQ ID NO: 11) (3 bases on the 5' side (GCG) are treated with restriction enzymes smoothly.
  • the 4th to 9th (CTCGAG) on the 5 'side is a restriction enzyme Xhol site.
  • Reverse primer (hATR-R1); 5'-GCG CTC GAG CAT ATA TGG AGT CCA ACC AAG-3 '(SEQ ID NO: 13) (3 bases on the 5' side (GCG) facilitate smooth treatment with restriction enzymes 4th to 9th (CTCGAG) on the 5 'side are restriction enzyme Xhol sites.)
  • Human breast cancer-derived ZR75-1 cell cDNA was used as type I for amplifying the kinase regions of the ATM and ATR genes by PCR.
  • cDNA total RNA was extracted and purified from ZR75-1 cells using the phenol-guanidine thiocyanate method (Futan Gene, IS0GEN).
  • CDNA was synthesized from the extracted total RNA using oligo dT or oligo random primer (reverse transcription reaction).
  • the PCR reaction was performed under the following three stages.
  • hATM-FU The PCR product amplified with the hATM-Rl primer set was digested with EcoRI and Xhol, and the PCR product amplified with the MTR-Fl and hATR-Rl primer set was digested with BamHI and Xhol.
  • the restriction enzyme-digested DNA was subjected to agarose gel electrophoresis and purified by Geneclean (manufactured by BIOIOI).
  • the purified DNA was ligated to pcDNA3-6myc, an expression vector previously digested with the same restriction enzymes BamHI or EcoRI and Xhol as the both ends of the PCR product.
  • plasmid DNA was purified from each single colony.
  • the base sequence of the insert DNA was determined by auto sequencing based on the Sanger method.
  • the sequence of the insert DNA was compared with the sequence published on the database to confirm that it was the cDNA sequence of ATM and ATR.
  • ATM and ATR are known to phosphorylate the 15th serine residue of human p53. Therefore, a cDNA sequence encoding amino acids 1 to 99 of human p53 was incorporated into an expression vector pGEX and transformed into Escherichia coli.
  • GST-p53 (1-99) a fusion protein with glutathione-S-transferase (GST) expressed in Escherichia coli, was used as a substrate for measuring the activity of ATM and ATR.
  • the recombinant protein is made as a fusion protein with GST.
  • GST enzyme's affinity for glutathione (GSH) the recombinant protein was purified.
  • the cells were suspended in 1% Tween 20-PBS and disrupted by sonication. After high-speed centrifugation, the supernatant was used as a soluble fraction containing the recombinant protein.
  • the soluble fraction was passed through a GSH-Sepharose 4B column (Pharmacia), and GST-p53 (1-99) protein was adsorbed on the column.
  • Plasmid DNA having ATM or ATR as an insert was transfected into human 293T cells using Trans IT-LT1 (Mirus). Two days later, HGN buffer wash ivy cells with ice-cold PBS [lOmM HEPES ( ⁇ 7 ⁇ 5 ), 10% glycerol, 150ra NaCl l% Tween20, lOmM j3 - glycerin port phosphate, ImM NaF, 0. ImM NaV0 4 , 2 ⁇ g / ml pepstatin 5 / zg / ml leptin, lO / zg / ml aprochen, 2 mM benzamidine, ImM PMSF, ImM DTT]. The supernatant after centrifugation was used as a cell extract.
  • An anti-myc tag antibody and protein A sepharose were added to the cell extract to immunoprecipitate 6rayc-ATM protein or 6myc-ATR protein.
  • the immunoprecipitate was washed with lOOra Tris (pH 7.5) and 0.5M LiCl, and then 1x ATM / ATR buffer [10raM HEPES (pH 7.5), 50m] 3-glycerophosphate, 50mM NaCl, lOmM MgCl 2, lOraM MnCl 2, 5raM ATP, washed with ImM DTT].
  • the washed immunoprecipitate was kept at 30 ° C.
  • the insert was excised with EcoRI and Xhol for ATM and BamHI and Xhol for ATR, and subcloned into pFASTBACHT vector-1 (GIBC0 BRL).
  • the plasmid clone of pFASTBACHT was transformed into E.
  • DH10BAC DH10BAC strain
  • One ton Lia agar plate
  • lOg / L peptone 5g / L yeast extract tract, 10g / L NaCl, 12g / L agar, 200 / ig / ml X-Gal, 40 ⁇ g / ml IPTG, lO ⁇ g / ml tetracycline, 7 g / ral gentamicin, 50 / ig / ml kanamycin.
  • the expression cassette in pFASTBACHT is transferred to bacmid DNA by site-specific transposition. Recombinant bacmid DNA was purified from a single white colony in which metastasis occurred. Recombinant bactnid DNA was transformed into Sf9 cells using CELLFECTIN (GIBCO BRL).
  • the culture solution was centrifuged after about one week, and the supernatant was used as the virus solution.
  • the above operation was basically performed using a BAC-TO-BAC Baculovirus Expression System (GIBCO BRL).
  • Sf9 cells were cultured in a 75 cm 2 flask to almost confluence, and a recombinant baculovirus solution was added to the culture. Three to four days after the infection, the cells were suspended in ice-cold PBS and centrifugally washed. The cells were suspended in HGN buffer (-DTT) and sonicated with ice cooling. Subsequently, centrifugation was performed, and the obtained supernatant was used as a soluble fraction for purification. In the expression cassette of the pFASTBACHT vector, six His residues (6xHis) are added to the N-terminal side. After Western blotting was performed using a part of the extract, protein expression was confirmed with an anti-5xHis antibody (GIAGEN).
  • GAAGEN anti-5xHis antibody
  • the soluble fraction was passed through a Ni-chelating Sepharose column (Pharmacia), and the recombinant protein was adsorbed to the column via 6xHis-Tag.
  • 6xHis-Tag is to form the Ni 2+ complexes
  • recombinant protein is adsorbed on the Ni 2+ column.
  • HGN buffer HGN buffer
  • the recombinant protein was eluted with an elution buffer (50 mM to 1 M imidazole, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.9). Elution was carried out by changing the concentration of imidazole step by step to 10 mM, 25 mM, 50 mM, 100 mM, 250 raM, 500 raM, and 1 M.
  • the dialyzed sample was passed through a MonoQ column (Pharmacia).
  • the protein adsorbed using FPLC was eluted with 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing 0 to 1 M NaCl, IraM DTT, and 10% glycerin while applying a concentration gradient.
  • the fraction containing the recombinant protein detected by the anti-5xHis antibody in the Western blot was dialyzed against the dialysate.
  • Protein phosphatase activity was measured for the dialyzed fraction containing the recombinant protein.
  • 0. 5 ra Bae flop tides 0. IraM ATP (185 kBq of gamma - 32 P- containing ATP) I x ATM / ATR reaction buffer containing was prepared and kept at 30 ° C. for 10 minutes. Then spotted The reaction was over P81 Fosufose cellulose filter paper (Whatman, Inc.), and washed filter paper in 75mM H 3 P0 4. After washing for 20 minutes three times, the filter paper was dried, and the radioactivity of 32 P incorporated into the peptide was measured by a Cherenkov method using a scintillation counter (manufactured by Beckman).
  • DNA-PK peptide Protnega for measuring the activity of ATM and ATR
  • Kemptide Promega
  • Casein Kinase II Peptide NEB
  • a buffer for lxATM / ATR reaction containing recombinant ATM or ATR was prepared and added to the wells of the GST-p53 (l-99) sensitized plate at 50 ⁇ l each (protein phosphorylation reaction). After incubation predetermined time 30 ° C, the 75ra H 3 P0 4 solution 200 [mu] 1 and the reaction was stopped by adding to each Ueru. Each cell was thoroughly washed 4 times or more with PBS.
  • the primary antibody (anti-phospho P53-S15 monoclonal antibody) was diluted to 0.5 mg / ml with an antibody dilution buffer. Diluted with Ffa (1% BSA, 0. 1% NaN 3), and allowed to stand at room temperature for 1 hour was added by 100 beta 1 on each Ueru after washing (primary reaction). After the primary reaction, it was washed with PBS in the same manner. 0.05%
  • HRP-labeled goat anti-mouse antibody manufactured by MBL
  • Triton X100-PBS Triton X100-PBS
  • HRP substrate was added at 100 mu 1 each Uweru and developed with 37 ° C. 1.
  • 5N P0 4 was stopped adding color reaction by 100 mu 1, using a microtiter first plate reader one, the absorbance was measured at 450 nm.
  • Lx DNA-PK reaction buffer one containing DNA-PK (Proraega Co.) and GST- p53 (1-99) (25 m HEPES pH7. 5, 75 mM KC1, 10 raM MgCl 2, IraM DTT, 0. 2 mM EGTA, 0.25 ra ATP, 10 / xg / ml sonicated double-stranded DNA, 50 mM-glycerol phosphate) was incubated at 30 ° C, and a portion of the reaction solution was added to an equivalent volume over time. The reaction was stopped by mixing with XSDS buffer. The reaction product over time was subjected to SDS-PAGE, and a Western blot was performed.
  • Primary antibody (anti-phospho p53-S15 monoclonal antibody, anti-phospho p53-S33 monoclonal antibody or phospho p53-S37 monoclonal antibody) should be diluted to 0.5 ⁇ g / ml with antibody dilution buffer (PBS, 1% BSA, 0%). It was diluted with 1% NaN 3 ) before use. After the primary antibody reaction, the membrane was washed with ⁇ . 05% Triton X100-PBS.
  • antibody dilution buffer PBS, 1% BSA, 0%
  • a lx DNA-PK kinase reaction buffer containing DNA-PK was prepared, and 50 ⁇ l each was added to a well of a GST-p53 Nter-sensitized plate (protein phosphate reaction). After incubation predetermined time 30 ° C, a 200 mu 1 of 75raM H 3 P0 4 solution was added to stop the reaction in each Ueru. Each well was thoroughly washed 4 times or more with PBS. Dilute the primary antibody (anti-phospho p53-S15 monoclonal antibody or anti-phospho p53-S37 polyclonal antibody) with 0.5 ⁇ g / ml antibody dilution buffer (1% BSA, 0.1% NaN 3 ).
  • the protein kinase activity of DNA-PK, ATM, and ATR could be measured by ELISA using an anti-phosphorylated peptide-specific antibody.
  • radioisotope 32 P with labeled ⁇ - 32 ⁇ - in order to use the ATP, and required procedures and special facilities ⁇ such treatment of the waste.
  • radioactivity isotope is not used in the activity measurement systems shown in the examples, various chemically synthesized substances, cells and bacterial extracts, culture supernatants, etc. are used during the enzymatic reaction of these measurement systems. The addition allows simple and rapid search for inhibitors in normal laboratories.
  • DNA-PK, ATM, and ATR are serine / threonine protein kinases with similar primary structures, and both belong to the PI3K family.However, as shown in the Examples, phosphorylation of Ser53 of p53, p53 By examining the phosphorylation of Ser37, it is possible to distinguish between the enzymatic activities of DNA-PK, ATM, and ATR. This embodiment can provide an opportunity to generate a molecular probe for each enzyme.

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Description

明細書 リン酸化酵素活性の測定方法 技術分野
本発明は、 リン酸化状態を識別する抗体を利用した、 リン酸化酵素活性、 ある いは脱リン酸化酵素活性の測定方法、 リン酸ィヒ酵素あるいは脱リン酸化酵素の阻 害剤もしくは促進剤のスクリーユング方法、 並びにこれら測定およびスクリ一二 ングのためのキットに関する。 景技
DNA依存性プロテインキナーゼ （以下 DNA- PK と省略する）、 ATM (AT mutated)、 および ATR (ATM and rad3 related) は、 いずれもガン抑制遺伝子の発現産物であ る p53のリン酸化を通じて細胞周期に密接に関連するセリン Zトレオニンリン酸 化酵素である。
細胞は増殖する際、 そのゲノム DNAを複製し、 娘細胞へ均等に分配した後に分 裂するという過程を周期的に繰り返す。 このような周期は細胞周期と呼ばれてい る。細胞周期は G1期（DNA合成準備期）、 S期（DNA合成期）、 G2期（分裂準備期）、 M期 （分裂期） に分けることができ、 各段階を順番に経て細胞は分裂する。
紫外線照射、 電離放射線照射、 薬剤などにより DNAが損傷を受けると、 その損 傷を修復するために、 哺乳動物細胞は通常 G1期， S期または G2/M期で停止する。 この現象はチェックボイントと呼ばれ、 その情報伝達経路は図 1のように示すこ とができる。 DNA損傷に応答して p53は転写活性化され、 P21CIP1/WAF1や 14-3 - 3 σを発現誘導する (S. J. Elledge . Science Vol 274, pl664， 1996、 Paul Nurse. Cell Vol 91, p865, 1997)。 p21CIPl/WAFlは Gl期の進行に必要な Cycl in E-Cdk2、 Cyclin D - Cdk4、 6 と結合してそのタンパク質リン酸化酵素としての活性を阻害する (S. J. El ledge . Science Vol 274， 1996、 D. 0. Morgan . Nature Vol 374， pl31, 1995)。 この機構によって Gl期阻止が達成される。
一方 14- 3-3 σは、 Chklまたは Chk2により リン酸ィヒされた Cdc25C (フォスフォ セリン 216)に結合し、 核外移行させることにより Cdc25C を不活性化する（Paul Nurse. Cel l Vol 91, p865, 1997)。 G2/M期の進行に必要な活性型 Cyclin B- Cdc2複 合体は Weel キナーゼにより リン酸化されて不活性化され、 不活性型 Cyclin B-Cdc2 (フォスフォチ口シン 15) は Cdc25Cプロテインフォスファターゼにより 脱リン酸化されて活性化される（Paul Nurse . Cel l Vol 91， p865, 1997)。 したがつ て、 14- 3-3 σタンパク質の発現誘導により G2期阻止が達成される。 また、 S期阻 止は DNA損傷に伴って活性化された Chk2キナーゼを経て達成される（S. Matsuoka et al. Science Vol 282, pl893， 1998)。
ヒ ト の遺伝病と して知られる AT (毛細管拡張性運動失調 ： ataxia telangiectasia)の原因遺伝子 ATM (AT mutated)は細胞が電離放射線照射を受けた 際に活性ィヒされ、 p53 の Serl5 をリン酸化する（S. Banin et al. Science Vol 281， pl674， 1998、 C. E. Canraan et al. Science Vol 281, pl677， 1998)。 また、 細胞 の紫外線照射により活性化される ATR (ATM and rad3 related) も p53の Serl5を リン酸化する（ E. Canraan et al. Science Vol 281, pl677, 1998)。 DNA二本鎖切断 によって活性化される DNA- PK は p53 の Serl5 および Ser37 をリン酸化する (S. P. LEES-MILLER et al. Mol. Cel l. Biol. Vol 12, p5041, 1992) 0 DNA-PK、 ATM、 お よび ATR というセリン/トレオニンタンパク質リン酸化酵素による癌抑制遺伝子 p53の 15番目のセリン残基のリン酸化は、 p53からの Mdm2の解離を引き起こす (S. Shieh et al. Cel l Vol 91， p325, 1997)。 Mdm2タンパク質を介したュビキチン- プロテアソ一ム系による分解が妨げられる結果、 15番目のセリン残基のリン酸化 により p53タンパク質の半減期が延び、 上記のような DNA損傷に伴う p53を介し たチェックポイントシグナルが伝達される。
癌治療では放射線療法、 化学療法、 免疫療法が行われているが、 放射線療法に おいて癌細胞の DNA損傷のチェックポイントを欠如または機能低下させる薬剤が 存在すれば、 癌細胞を選択的に殺 ことが可能になると推定される。 また、 正常 細胞のチェックポイントを機能上昇させる薬剤も、 放射線治療の際に有効である と考えられる。 AT患者は電離放射線照射に対する感受性が正常の人の 3-4倍高い ことが知られている（ H. Westphal et al. Nat. Genet. Vol 16， p397， 1997)。 AT 患 者由来の細胞 （AT細胞） では電離放射線照射に伴う G1期， S期または G2/M期で の停止は認められない（K. Savitsky et al. Science Vol 268, pl749, 1995、 W. A. Cliby et al. EMBO J. Vol 17， pl59， 1998)。 しかしながら、 AT細胞は紫外線照射に対して 高感受性を示さない A. Cliby et al. EMBO J. Vol 17, pl59 , 1998)。 これらのこ とは、 ATM に真に特異的な阻害剤は、 細胞の電離放射線に対する感受性を著しく 高め、 紫外線照射によるチェックポイントには影響のない薬剤となることを示唆 している。 ATM に真に特異的な阻害剤があれば、 低線量での放射線治療も可能に なることが予想される。
リン酸化活性の測定系は ATMに対する薬剤のスクリ一ニングに有用なだけでな く、 ATRおよび DNA- PKに対する薬剤開発においても有効なスクリーニング系を提 供することになる。 DNA - PK、 ATR、 あるいは ATMといったリン酸化酵素は、 p53を はじめとして、 c_Abl、 PHAS-I, I κ Β α , RPA、 および c- Junといった他のタンパ ク質のリン酸ィヒを行うことが知られている。 c - Abl は、 慢性骨髄性白血病の 90% 以上で活性化が観察されるガン原遺伝子の一つである。 PHAS-I (phosphorylated heat and acid stable protein regulated by insulin)は、 MAPKの ¾貪となる翻 訳調節因子である。 I /c B aは、転写調節因子である NF- κ Βの活性制御に関与する タンパク質である。 RPA (replication protein Α)は、 1本鎖 DNA結合タンパク質 で DNAの修復や組み換えに関与している。 そして c-Junは、 転写因子 APIの構成 成分となる核内ガン遺伝子である。 したがって、 ATM、 ATR、 あるいは DNA- PKのリ ン酸化酵素活性を把握することができる簡便な測定原理は、 細胞周期を解明する 研究において重要な意味を持つ。 しかしこれまでは、 タンパク質リン酸化酵素の活性測定においては、 放射性同 位元素である 32Pで標識された，/ -32P-ATPを用いるため、実施にあたっては特殊な 設備が必要とされていた。
また、 PI3Kファミリ一に属する DNA- PK、 ATM, および ATRは一次構造が類似し たセリン Zトレオニンリン酸化酵素であるため、 従来はこれらの酵素活性を区別 して測定することはできなかった。 したがって、 簡便なリン酸化酵素活性測定系 の開発が求められていた。
他方、 リン酸化酵素活性の簡便な測定方法として、 PKAや PKCの活性測定方法 が実用化されている。 この方法は、 PSペプチドと呼ばれる合成ペプチドを基質と して用い、その酵素的なリン酸化を、 リン酸化された PSペプチドを認識する抗体 によって検出することによって、 リン酸化酵素活性を測定している（T. Yano et al. Peptide Chemistry A. Suzuki (Ed)： 293 - 298， 1991)。 しかしこの方法において 基質ぺプチドとなる PSぺプチドは、 p53のリン酸化酵素である DNA- PK、 ATM, あ るいは ATRの基質とならない。 更に、 この方法で用いられているリン酸化の程度 を検出するための抗体は、 リン酸化された P53を認識するものではないため p53 のリン酸化酵素活性の測定には利用することができない。 リン酸ィヒ p53を認識す る抗体は公知（ E. Canman et al. Science, Vol. 281， 1677, 1998)であるが、 これら の抗体を用いて p53のリン酸化酵素活性が測定可能なことは知られていない。 発明の開示
本発明は、 p53等をリン酸化する酵素である DNA-PK、 ATM, および ATRの活性測 定方法、 あるいはこれらのリン酸ィヒ酵素の作用によってリン酸ィ匕された p53等に 対する脱リン酸化酵素活性の測定方法の提供を課題とする。 また、 本発明は、 DN A- PK、 ATM,および ATRのリン酸化酵素活性を制御することができる化合物のスク リ一ニング方法の提供を課題とする。 更に本発明は、 単にこれらのリン酸化酵素 活性を測定することのみならず、 複数のリン酸化酵素が共存する試料における各 リン酸ィヒ酵素の活性を個別に把握することができる測定方法の提供を課題とする c 加えて本発明は、 これら測定方法ゃスクリーニング方法のためのキットの提供を 課題とする。
本発明者らは、 上記課題を解決するために、 DNA- PK、 ATM, および ATRによって リン酸化される基質ぺプチドを用い、基質ぺプチドのリン酸化のレベルの変化を、 免疫学的に測定することによってリン酸ィヒ酵素活性の把握が可能なのではないか と考えた。 そして p53等の SQモチーフ、 あるいは SQEモチーフを構成するセリン 残基がこれらのリン酸化酵素によるリン酸化および脱リン酸化の標的になること に着目し、 鋭意研究を行った。 その結果、 リン酸化 P53に対する抗体を利用する ことにより、 簡便に基質ぺプチドのリン酸化レベルの評価が可能であることを見 出した。 さらに、 本発明者らは、 該抗体を利用することにより、 酵素作用による 基質ぺプチドのリン酸化や脱リン酸化を阻害もしくは促進する化合物のスクリ一 ニングが可能であることを見出し、 本発明を完成した。
すなわち本発明は、 以下のリン酸化酵素活性測定方法、 脱リン酸化酵素活性測 定方法、 ならびにこれらの測定方法に基づくリン酸化酵素ゃ脱リン酸化酵素の活 性を調整する化合物のスクリーニング方法に関する。
〔1〕 次の工程を含む、 試料中のタンパク質リン酸化酵素活性の測定方法であつ て、 タンパク質リン酸化酵素が、 DNA- PK、 ATM, および ATRで構成される群から選 択されることを特徴とする方法。
(a)前記リン酸化酵素によってリン酸ィヒされる基質ぺプチドと試料とを、リン酸ィ匕 酵素によるリン酸化反応に必要な条件下で接触させる工程
(b)基質ぺプチドのリン酸ィヒレベルの変化を、前記基質ぺプチドのリン酸化状態を 識別しうる抗体との反応性の変化に基づ 、て検出する工程
〔2〕 以下の工程を含む、 タンパク質リン酸ィヒ酵素活性を阻害もしくは促進する 化合物のスクリーニング方法であって、 タンパク質リン酸化酵素が、 DNA- PK、 AT M、 および ATRで構成される群から選択されることを特徴とする方法。 (a) DNA- PK、 ATM、 および ATRで構成される群から選択されるいずれかのリン酸ィ匕 酵素、 およびこのリン酸化酵素によってリン酸ィヒされる基質ペプチドとを、 被検 化合物の存在下、 リン酸化反応に必要な条件下で接触させィンキュベートするェ 程
(b)基質ぺプチドのリン酸化レベルの変化を、前記基質ぺプチドのリン酸化状態を 識別しうる抗体との反応性の変化に基づいて検出する工程
(c)被検化合物の非存在下における基質ぺプチドのリン酸化のレベルと比較して、 基質ぺプチドのリン酸化のレベルの変化を低下もしくは上昇させる化合物を選択 する工程
〔3〕 以下の工程を含む、 試料中のリン酸化されたタンパク質の脱リン酸ィヒ酵素 活性の測定方法であって、 前記リン酸化されたタンパク質が、 DM- PK、 ATM, およ び ATRで構成される群から選択されるリン酸ィヒ酵素によってリン酸化されたもの である方法。
(a)リン酸化されたタンパク質の少なくともリン酸化部位を含む基質ぺプチドと 試料とを、 脱リン酸化反応に必要な条件下で接触させインキュベー卜する工程
(b)基質ぺプチドのリン酸ィヒレベルの変化を、前記基質ぺプチドのリン酸化状態を 識別しうる抗体との反応性の変化に基づいて検出する工程
〔4〕 以下の工程を含む、 リン酸化されたタンパク質に対する脱リン酸化酵素活 性を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニング方法であって、 前記リン酸化 されたタンパク質が、 DNA- PK、 ATM, および ATRで構成される群から選択されるリ ン酸化酵素によってリン酸化されたものである方法。
(a)前記リン酸化されたタンパク質に対する脱リン酸化酵素、およびリン酸化され たタンパク質の少なくともリン酸化部位を含む基質べプチドを、 被検化合物の存 在下、 脱リン酸化反応に必要な条件下で接触させインキュベートする工程
(b)基質べプチドの脱リン酸化レベルの変化を、前記基質ぺプチドのリン酸ィヒ状態 を識別しうる抗体との反応性の変化に基づいて検出する工程 (c)被検化合物の非存在下における基質ぺプチドの脱リン酸ィ匕のレベルと比較し て、 基質ぺプチドの脱リン酸化のレベルの変化を低下もしくは増加させる化合物 を選択する工程
[ 5 ] 基質ペプチドが、 SQモチーフ、 または SQEモチーフを構成するアミノ酸配 列を含むものである 〔1〕 一 〔4〕 のいずれかに記載の方法。
〔6〕 リン酸化状態を識別することができる抗体が、 そのリン酸化部位を識別し うるものであり、 異なる部位をリン酸化する複数のリン酸化酵素が共存する試料 に含まれるリン酸化酵素の活性を個別に測定する 〔1〕 の方法。
〔7〕 リン酸化酵素が、 ATMまたは ATRであり、 抗体が p53の 15位セリンを含む SQEモチーフのリン酸化状態を識別しうるものである 〔6〕 の方法。
[ 8 ] リン酸化酵素が、 DNA- PKであり、 抗体が p53の 37位セリンを含む SQモチ —フのリン酸ィヒ状態を識別しうるものである 〔6〕 の方法。
〔9〕 以下の工程を含む、 DNA- PK活性の測定方法。
(a) 2本鎖 DNAの不存在下で 〔1 ] の方法を実施することによって、試料中のリン 酸化酵素活性を測定する工程
(b) 2本鎖 DNAの存在下で〔1〕 の方法を実施することによって試料中のリン酸化 酵素活性を測定する工程
(c) (a)と（b)の結果を比較することによって、 DNA-PKに由来するリン酸化酵素活 性を求める工程
〔 1 0〕 抗体が、 リン酸ィヒされていない基質ペプチドよりも、 リン酸ィヒされた基 質ペプチドとの反応性が高いものである 〔1〕 _ 〔4〕のいずれかに記載の方法。
〔1 1〕 抗体が、 リン酸ィ匕された基質ペプチドよりも、 リン酸化されていない基 質ペプチドとの反応性が高いものである 〔1〕 一 〔4〕 のいずれかに記載の方法。
〔 1 2〕基質べプチドが標識されている、 〔 1〕—〔 4〕のいずれかに記載の方法。
〔 1 3〕 基質ペプチドが固相化されている、 〔1〕 一 〔4〕 のいずれかに記載の方 法。 〔1 4〕 抗体が標識されている、 〔1〕 一 〔4〕 のいずれかに記載の方法。
〔1 5〕 基質ペプチドのリン酸ィヒレベルの評価を ELIS^法により行う、 〔1〕 — 〔4〕 のいずれかに記載の方法。
〔1 6〕 〔2〕 に記載のスクリーニング方法により単離することができる、 DNA依 存性プロティンキナーゼ、 ATM、および ATRからなる群から選択されるタンパク質 リン酸化酵素の活性を調整する化合物。
〔1 7〕 〔4〕 に記載のスクリーニング方法により単離することができる、 DNA依 存性プロティンキナーゼ、 ATM、および ATRからなる群から選択されるタンパク質 リン酸化酵素によってリン酸化されたタンパク質に対する脱リン酸化酵素の活性 を調整する化合物。
〔1 8〕 天然由来である、 〔1 6〕 または 〔1 7〕 のいずれかに記載の化合物。 〔1 9〕 〔1〕 _ 〔4〕 に記載のいずれかの方法に用いるための、 基質ペプチドの リン酸化状態を識別する抗体。
〔2 0〕 基質ペプチドのリン酸化状態を識別する抗体を含む、 〔1〕 一 〔4〕 に記 載のいずれかの方法のためのキット。
なお、 本発明において 「ペプチド」 とは、 2個以上のアミノ酸がペプチド結合 により結合した化合物を指し、 その鎖長は問わない。 従って、 タンパク質もまた 本発明における 「ペプチド」 に含まれる。 本発明で測定の対象としているリン酸 化酵素は、 DNA-PK、 ATM,および ATRで構成される群から選択される。測定対象は、 ヒ ト組織に由来する天然の酵素の他、 それをコードする遺伝子を適当な発現系で 発現させることによって得ることができるリコンビナントであっても良い。また、 酵素の由来は、 ヒ トに限定されず、 他の脊椎動物や、 微生物におけるホモログで あることができる。 更に、 天然の酵素タンパク質と同一のアミノ酸配列を持つ酵 素のみならず、 その酵素活性の発現を支える領域 （キナーゼ領域） のみで構成さ れる変異体、あるいはこの領域を他のタンパク質と融合させた融合タンパク質等、 本質的に同じ酵素活性を持つ酵素タンパク質は、 いずれも本発明によるリン酸化 酵素活性の測定方法の対象とすることができる。
本発明は、 第一に DNA- PK、 ATM, および ATRによってリン酸化される基質ぺプ チドに特異的に結合する抗体を利用したリン酸化酵素活性の測定方法に関する。 より具体的には、 次の工程 （a ) および （b ) を含む測定方法である。
( a ) 前記リン酸化酵素によってリン酸化される基質ペプチドと試料とを、 リン 酸化酵素によるリン酸ィヒ反応に必要な条件下で接触させる工程
( b ) 基質ぺプチドのリン酸化レベルの変化を、 前記基質べプチドのリン酸化状 態を識別しうる抗体との反応性の変化に基づいて検出する工程
本発明に用いる基質ぺプチドは、 DNA- PK、 AT , および ATRによってリン酸化さ れるぺプチドであれば特に制限はない。 具体的には、 たとえば以下のァミノ酸配 列からなる SQモチーフを含むぺプチドは、これらのリン酸化酵素によってリン酸 化されるセリン残基 (S)を持つことが知られている。
SQモチーフ ：
X_n · · . X_4 X X-2 X - 1 ° Q 入 +2 +3 +4
ここで、 リン酸ィヒ部位のセリン残基を 0としたとき、 それよりも n個ァミノ末 端側の任意のァミノ酸残基 Xを x-n、 n個カルボキシル末端側のァミノ酸残基を X+ n、 と表記する。 このモチーフを含むペプチドは、 一般に Sの位置においてリン酸 化を受けるとされている。 Xのアミノ酸の違いによってリン酸化酵素との Kmが変 動するので、 より Kmの低いァミノ酸配列を持った基質ぺプチドを利用すれば、 よ り高い感度でリン酸化酵素の測定を行うことができる。 たとえば ATMおよび ATR では、 SQモチーフの中でも、 特に 2の位置が Eである場合にはリン酸化を受け やすいと推定されている。 SQEモチーフと呼ばれるこのようなアミノ酸配列は、 A TMや ATRの活性測定を目的とする場合に望ましい基質ぺプチドとなる。
SQEモチーフ ：
Χ_π . . . X— 3 X-2 X-i Q E +3 X+4 X+5 · . · A+n
このほか基質ペプチドとして利用可能な生体に由来するタンパク質としては、 例えば以下のタンパク質を示すことができる。
p53 (L. J. K and C. Prives. Genes and Dev. Vol 10， pl054, 1996、 A丄 Levine. Cel l Vol. 88, p323, 1997)
c-Abl (S. Kharbanda et al. Science Vol 386， p732， 1997)
PHAS-I (C. Hu et al. Proc. Nat l. Acad. Sci. USA Vol 91, p3730, 1994, G. J. Brunn et al. Science Vol 277， p99, 1997、 S. Banin et al. Science Vol 281, pl674, 1998) I K B a (A. A. Beg and A. S. Baldwin Jr. Genes & Dev. Vol 7, p2064)
RPA (R. G. Shao et al. EMBO J. Vol 18, pl397, 1999)
c-Jun (T. Sraeal et al. ol. Cell. Biol. Vol 12, p3507, 1992)
基質ペプチドは、 天然のもの、 遺伝子組換え技術を利用して調製されたもの、 合 成ぺプチドのいずれであることもできる。 ぺプチドの精製を容易にする目的で他 のぺプチド（例えば、 グルタチオン- S -トランスフェラ一ゼ）と融合されていても よレ、。 基質ペプチドは、 予想される酵素活性に対して十分な量で使用する。 たと えばある基質濃度でリン酸化反応を行ったときに、 基質ペプチドの大部分がリン 酸化されるような場合は、 基質ペプチドが不足する心配がある。 このようなケー スでは、 基質濃度を高める、 あるいは試料の希釈等によって、 基質ペプチドの相 対濃度を上げることが望まれる。
本発明において、 基質ぺプチドは前記リン酸化酵素によるリン酸化が可能な条 件下で試料と接触させられる。 リン酸化が可能な条件とは、 目的とするリン酸ィ匕 酵素の活性の維持に必要な pHを与える反応媒体中で、基質べプチドとともに反応 に必要な成分の存在下、 適切な反応温度でィンキュベートすることを意味する。 反応に必要な成分としては、 リン酸化反応に必要なリン酸基を供給する基質、 リ ン酸化反応物を保護する目的で添加するフォスファタ一ゼ阻害剤等が挙げられる。 リン酸基を供給する基質には、一般にアデノシン 3リン酸（以下 ATPと省略する） 等が用いられ、フォスファターゼ阻害剤としては i3 -グリセロリン酸等が用いられ る。 この他、 DNA-PKのリン酸化酵素活性を測定する場合には、 基質ペプチド以外 の成分として断片化 2本鎖 DNAが挙げられ、 ATMまたは ATRのリン酸化酵素活性 を測定する場合には、 Mnイオンが挙げられる。 本発明において用いられるリン酸 化反応のための緩衝液として、 次の組成からなる ATM/ATR用反応バッファ一を示 すことができる。
ATM/ATR用反応バッファー：
lOm HEPES (pH7. 5)
50mM ]3 -グリセロリン酸
50mM NaCl、 10mM MgCl2
lOmM MnCl,
5mM ATP
lraM DTT
DNA-PK反応バッファー：
25tnM HEPES pH7. 5
75mM KC1
lOmM gCl2
ImM DTT
0. 2mM EGTA
0. 25raM ATP
10 μ g/ral超音波処理 2本鎖 DNA
50raM 3 -グリセロリン酸
望ましいインキュベーション条件を与えれば、 試料中に基質ぺプチドに対する リン酸化酵素が存在する場合、その活性に応じて基質ぺプチドはリン酸化される。 ここで、 特定の成分が各酵素のリン酸ィヒ反応を支えていることを利用して、 それ ぞれに特異的な活性測定法を構築することができる。たとえば DNA- PKは、活性発 現に 2本鎖 DNA断片を要求する（T. Carter et al. , Mol. Cel. Biol. Vol 10, p64 60 - 6471 (1990) )ので、 反応液中の 2本鎖 DNA断片の有無によるリン酸化酵素活性 の違いに基づいて、 DNA- PKに由来するリン酸化酵素活性を知ることができる。 本発明では、 リン酸化された基質べプチドは、 基質ぺプチドのリン酸化状態を 識別することができる抗体との免疫学的な反応によって、 そのリン酸化のレベル が評価される。 本発明において、 リン酸化のレベルとは、 基質ペプチドに占める リン酸化べプチドの割合のみならず、 基質べプチド分子上のリン酸化の程度を意 味する用語として用いる。 したがって、 たとえば基質ペプチドのリン酸ィヒレベル の上昇とは、 リン酸化ペプチドの割合が増大する状態、 あるいは基質ペプチド上 のリン酸化部位が増大する状態のいずれをも意味する。
一方本発明に用いるリン酸化状態を識別しうる抗体とは、 リン酸化の有無によ り基質ペプチドとの反応性が変化する抗体を意味する。 具体的には、 リン酸ィヒさ れた基質ぺプチドに対する反応性が、 リン酸化されていない基質べプチドに対す る反応性よりも大きレ、 （または小さい） 抗体を示すことができる。 たとえば DNA- ΡΚによってリン酸化された ρ53を特異的に認識する抗体は公知である（S-Y. Shieh et al. Cel l Vol 91， p325， 1997)。 同様の抗体は、 当業者に公知の方法 （例えば、 細胞工学 別冊 抗ペプチド抗体実験プロトコール 1 9 9 4年 秀潤社、 B. M. Tu rner and G. Fellows, Eur. J. Biochera. 179, 131-139, 1989, S. Muller et al. Molecu lar Immunology Vol 24, 779-789, 1987、 Pfeffer, U. , Ferrari, N. and Vidali, G. J. Bio. Chera. 261, 2496-2498, 1986) により調製することができる。 抗体としては、 モ ノクロ一ナル抗体であっても、 ポリクロ一ナル抗体であってもよい。
たとえばリン酸化べプチド特異的なポリク口ーナル抗体は、 リン酸化べプチド で免疫することによって得た抗血清から、 非リン酸化ペプチドカラム （非特異反 応抗体吸収用カラム） やリン酸化ペプチドカラム （特異抗体精製用カラム） を用 いて精製することが可能である。 あるいはリン酸化ペプチドで免疫した動物の抗 体産生細胞から樹立したハイプリ ドーマから、 特異抗体を産生するものをスクリ 一二ングすることによって、 モノクローナル抗体を産生するハイブリ ドーマをク ローニングすることができる。 スクリーニングは、 培養上清の非リン酸化べプチ ドゃリン酸化べプチドに対する反応性を ELISA法により調べ、 リン酸化べプチド に対して反応性の高いクローンを選択することにより行う。 クローニングされた ハイプリ ドーマを培養すれば、 必要なモノクローナル抗体を培養上清や腹水から 精製することができる。
本発明の望ましい実施態様においては、 単にリン酸化状態を識別しうるのみな らず、 基質ぺプチドを構成するアミノ酸配列までも含めた構造の相違を認識する ことができる抗体に基づいた測定方法が提供される。 リン酸化酵素は、 必ずしも 基質ぺプチドの同じ部分をリン酸化するわけではない。 たとえば、 DNA- PKが p53 をリン酸化する場合、 15位と 37位の 2力所のセリン残基を中心としてリン酸化 が進行する。 一方、 ATMや ATRは同じ p53のリン酸化であっても、 主たるリン酸 化部位は 15位のセリン残基である。 したがって、 これらリン酸化されるセリン残 基を含むァミノ酸配列を認識する抗体を利用すれば、 DNA-PKによるリン酸化と、 ATMや ATRによるリン酸化とを区別して評価することができる。 すなわち本発明 は、 複数のリン酸化酵素が共存する可能性のある試料を用い、 個々のリン酸化酵 素活性を独立して把握することができる測定方法を提供する。
基質ぺプチドと抗体との反応は、 公知のィムノアツセィの原理を利用して検出 することができる。 一般的には、 基質ペプチドと抗体のいずれかを固相化した状 態で用いることにより、 未反応成分との分離を容易に行うことができる。 基質ぺ プチドゃ抗体を固相化する方法は公知である。 たとえば基質ぺプチドゃ抗体は、 化学結合や物理吸着によって固相に直接固定できる。 また基質ぺプチドをビォチ ン化しておけば、 ス トレブトアビジンを感作した固相に捕捉し間接的に固相化す ることができる。 一般的に、 基質ペプチドを固定化する場合には、 タンパク質の 担体への吸着が飽和する条件で行われる。 この場合、 ピオチン化した基質べプチ ドの固相化は、 試料との接触前、 接触後、 あるいは接触と同時等、 任意のタイミ ングで行うことができる。 更に、 互いに親和性を有する組み合わせであれば、 ァ ビジン一ピオチン系以外でも本発明に適用することができる。 たとえば、 基質ぺ プチドを適当な抗原性物質との接合体としておき、 この抗原性物質に対する抗体 を感作した固相を利用して基質ぺプチドの捕捉が可能である。
本発明において、 基質ぺプチドゃ抗体を固定化するための固相としては、 反応 容器の内壁、 粒子状担体、 あるいはビーズ状担体など、 一般的に固相として利用 されているものを利用することができる。 その素材についても、 一般にタンパク 質の物理吸着や化学結合に利用されているものを利用することができる。 具体的 には、 ポリスチレン製のマイクロタイタ一プレート等が利用される。
本発明において、 リン酸化のレベルの変化をィムノアツセィの原理に基づいて 評価するとき、 基質ペプチドと抗体とは、 そのいずれかを標識しておくことによ り、 簡便な操作を実現できる。 標識としては、 検出可能な感度を有すれば特に制 P艮はなく、 例えば、 ペルォキシダーゼ、 3 - D-ガラク トシダーゼ、 アルカリフォス ファターゼ、グルコース- 6-リン酸脱水素酵素、ァセチルコリンエステラーゼなど の酵素標識、 デルフィニゥムなどの蛍光標識、 放射標識などを用いることが可能 である。 また直接標識のみならず、 該抗体と特異的に結合する物質、 例えば、 二 次抗体、 プロテイン A、 プロテイン G， プロテイン AZG (Aと Gの融合タンパ ク質） などを標識する、 いわゆる間接標識系を利用することもできる。
基質ぺプチドのリン酸ィヒレベルの評価は、 抗体の特異性と上記標識に応じて当 業者に公知の方法で行うことができる （例えば、 超高感度酵素免疫測定法 石川 榮治著 学会出版センタ一 （1993) 参照）。 すなわち、 リン酸化された基質ぺプ チドとの反応性を持つ抗体を標識した基質べプチドと組み合わせて利用する場合 には、 抗体と反応した標識基質べプチドに由来するシグナルの大きさがリン酸化 活性に比例する。 逆に、 リン酸化されない基質ペプチドとの反応性を持つ抗体を 用いれば、 シグナルの大きさはリン酸ィヒ活性と逆比例することになる。 リン酸化 レベルは、 リン酸ィヒレベルが判明している基質ぺプチドを標準試料として予め作 成した検量線に基づいて定量化することができる。 あるいは、 リン酸化酵素活性 フリ一の試料を対照として、 定性的な比較を行うこともできる。 本発明によるリン酸化酵素活性の測定方法は、 DNA- PK、 ATM, および ATRの存在 が疑われるあらゆる試料を対象とすることができる。 代表的な試料としては、 ヒ トゃ非ヒ ト動物に由来する組織、 各種培養細胞の抽出液およびその抽出物、 細胞 の培養上清、 血液、 尿、 体液、 汗、 唾液、 母乳などの分泌物等を示すことができ る。 特に DNA-PKでは、 核抽出液中に含まれる DNA- PKのリン酸化酵素活性を先に 述べた 2本鎖 DNA断片の有無を利用して測定することにより、 細胞周期や免疫機 能と関連する様々な事象と DNA-PKとの関連を明らかにする上で有用な情報を提 供するものと期待される。
マウスにおける DNA - PKの欠損は SCIDマウスと呼ばれる免疫不全個体となるこ とが知られており、機能的に DNA- PKの活性は免疫という生体防御と密接な関係が ある。免疫担当細胞の分化の場である胸腺、骨髄での DNA-PK活性を測定すること は、 移植後におきる拒絶力を推定したり、 何らかの理由で免疫抑制剤を投与され た患者の予後の回復力を推定するのに役立つものと考えられる。 さらに DNA-PK は、 DNA末端に他のタンパク質とともに結合し、 細胞周期チェックポイントや DN A修復にも関与していることが知られている。 このため、 放射線治療に先立ち、 照射を受ける患者の放射線に対する抵抗力を知るために DNA- PKの活性測定を ATM とともに行うことは、 重要な検査項目となる可能性が考えられる。 このときの検 査試料は、 患者の皮膚などから培養された細胞や、 ガンなどの病巣を用いること ができ、 放射線照射前後における活性を測定する。
本発明は、 リン酸化酵素活性のみならず、 DNA - PK、 ATM, および ATRで構成され る群から選択されるリン酸化酵素によってリン酸化された基質べプチドに対する 脱リン酸化酵素活性の測定方法をも提供する。 本発明に基づく脱リン酸化酵素活 性の測定方法は、 以下の工程 （a ) および （b ) を含む。
( a ) リン酸化されたタンパク質の少なくともリン酸化部位を含む基質ぺプチド と試料とを、 脱リン酸ィヒ反応に必要な条件下で接触させインキュベートする工程 ( b ) 基質ぺプチドのリン酸化レベルの変化を、 前記基質べプチドのリン酸化状 態を識別しうる抗体との反応性の変化に基づいて検出する工程
基質ぺプチドとしては、 リン酸化酵素活性の測定のために用いたものと同じ基 質ぺプチドを予めリン酸ィヒして利用することができる。 基質ぺプチドのリン酸ィ匕 は、 前記リン酸化が可能な条件下で、 DNA - PK、 ATM, および ATRで構成される群か ら選択されるリン酸化酵素によって基質ペプチドを処理することによって得るこ とができる。 脱リン酸化酵素活性の測定に必要なリン酸化基質べプチドには、 酵 素的に合成されたもののみならず、 同じ構造を持つものであれば化学的に合成さ れたものを用いることもできる。
脱リン酸化酵素活性の測定に用いる、 基質べプチドのリン酸化状態を識別しう る抗体とは、 先に述べたものと同じ抗体を利用することができる。 また、 ィムノ アツセィに基づく基質ぺプチドのリン酸化レベルの評価方法も、 先に述べたのと 同様の原理に基づいて実施することができる。 ただし、 脱リン酸化酵素活性にお ける標識基質ペプチド （あるいは標識抗体） に由来するシグナルの大きさと、 測 定すべき酵素活性の大きさの関係が逆になる点のみが相違する。
現在のところ、 ヒ トの生体内で DNA-PK、 ATM、 および ATRで構成される群から 選択されるリン酸化酵素によってリン酸ィヒされたタンパク質の脱リン酸化酵素と して機能しているタンパク質は同定されていない。 しかし組織抽出液、 細胞抽出 液中等に含まれるトータルプロティンフォスファターゼ活性を測定するという測 定系となりうる。
本発明の脱リン酸化酵素活性の測定方法は、 リン酸化酵素活性の測定方法と同 様に、 その存在が疑われるあらゆる試料を測定対象とすることができる。 たとえ ば、 抽出液中に含まれる脱リン酸化酵素の精製を試みようとする場合、 各画分に 見出される脱リン酸化酵素活性は、 酵素の精製の指標として有用である。
本発明に基づく リン酸化酵素、 あるいは脱リン酸化酵素活性の測定方法は、 そ れぞれリン酸化酵素、 あるいは脱リン酸化酵素の阻害剤もしくは促進剤のスクリ 一二ングに利用することができる。 すなわち本発明は、 リン酸化酵素、 あるいは 脱リン酸ィヒ酵素の活性を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニング方法に関 する。 本発明において、 これらの酵素活性を阻害、 あるいは促進する化合物を総 称して酵素活性を調整する化合物と呼ぶ。
本発明に基づく リン酸ィヒ酵素活性を阻害もしくは促進する化合物のスクリー二 ング方法は、 以下の工程 （a ) — （c ) を含む。
( a ) DNA- PK、 ATM, および ATRで構成される群から選択されるいずれかのリン酸 化酵素、 およびこのリン酸化酵素によってリン酸化される基質ペプチドとを、 被 検化合物の存在下、 リン酸化反応に必要な条件下で接触させィンキュベートする 工程
( b ) 基質ぺプチドのリン酸化レベルの変化を、 前記基質ぺプチドのリン酸化状 態を識別しうる抗体との反応性の変化に基づいて検出する工程
( c ) 被検化合物の非存在下における基質ペプチドのリン酸化のレベルと比較し て、 基質ペプチドのリン酸化のレベルを低下もしくは上昇させる化合物を選択す る工程
リン酸化酵素と基質ぺプチドとの接触、 および基質ぺプチドのリン酸化レベル の評価は、 上記のリン酸化酵素活性の測定方法と同様に行うことができる。 その 結果、 被検化合物の非存在下で基質べプチドのセリン残基に結合しているリン酸 基の検出量が低下すれば、 スクリーニングに用いた被検化合物は、 リン酸化酵素 の活性を促進すると判定される。
本発明によるスクリ一ニングに用いるリン酸ィヒ酵素には、天然の DNA- PK、ATM、 あるいは ATRのみならず、 リコンビナントとして得られる酵素タンパク質を利用 することができる。 また天然の酵素と同じァミノ酸配列を持つもののみならず、 そのキナ一ゼ領域のみからなる酵素断片を用いることもできる。 キナーゼ領域の みを用いることにより、 発現生成物を小さくすることができ、 その結果としてリ コンビナントとしてより多量の酵素タンパク質を容易に得ることができる。 たと えば、 ヒ ト ATMでは全長ァミノ酸 3056残基のうち 2695番目から 3056番目（配列 番号： 2 ) のみで、 またヒ ト ATRでは全長アミノ酸 2644残基のうち 2305番目力 ら 2644番目（配列番号： 3 ) のみでリン酸化活性を発現することが明らかにされ ている。 ヒ ト DNA-PKでは、 全長アミノ酸 4127残基のうち 3730番目から 4127番 目のアミノ酸配列が、 ヒ ト ATMや ATRのキナーゼ領域のァミノ酸配列と相同性が 高く、 この領域 (配列番号： 1 ) がキナーゼ領域に相当していると推測される。 一方、 本発明に基づく脱リン酸ィヒ酵素活性を阻害する、 もしくは促進する化合 物のスクリーニング方法は、 以下の工程 （a ) - ( c ) を含む。
( a ) 前記リン酸化されたタンパク質に対する脱リン酸化酵素、 およびリン酸化 されたタンパク質の少なくともリン酸化部位を含む基質ぺプチドを、 被検化合物 の存在下、 脱リン酸化反応に必要な条件下で接触させインキュベートする工程
( b ) 基質ぺプチドの脱リン酸化レベルの変化を、 前記基質ぺプチドのリン酸化 状態を識別しうる抗体との反応性の変化に基づいて検出する工程
( c ) 被検化合物の非存在下における基質ペプチドの脱リン酸化のレベルと比較 して、 基質ぺプチドの脱リン酸化のレベルを低下もしくは増加させる化合物を選 択する工程
これらのスクリーニング方法において用いられる被検化合物としては、例えば、 ペプチド （タンパク質を含む）、 合成低分子化合物、 動植物や細菌の細胞抽出物、 細胞培養上清などが用いられるが、 これらに制限されない。 また、 脱リン酸化酵 素としては、 例えば、 大腸菌アルカリフォスファターゼ、 牛小腸アルカリフォス ファタ一ゼ、ならびにヒ ト Cdc25、 Cdcl4等のプロティンフォスファタ一ゼ等を用 いることができる。
脱リン酸化酵素とリン酸ィヒされた基質べプチドとの接触、 および基質べプチド のリン酸化レベルの評価は、 上記の脱リン酸ィヒ酵素活性の検出方法と同様に行う ことができる。 その結果、 被検化合物の非存在下で基質ぺプチドのセリン残基に 結合しているリン酸基を検出した場合 （対照） と比較して、 基質ペプチドのセリ ン残基に結合しているリン酸基の検出量が増加していれば、 スクリ一ニングに用 いた被検化合物は、 脱リン酸化酵素の活性を阻害すると判定される。 逆に、 基質 ぺプチドのセリン残基に結合しているリン酸基の検出量が低下していれば、 スク リーニングに用いた被検化合物は、 脱リン酸化酵素の活性を促進すると判定され る。
これら本発明のスクリーニング方法において、 被検化合物として、 動植物や細 菌の細胞抽出物、 細胞培養上清などを用いた場合には、 当業者に公知の方法 （例 えば、 各種クロマトグラフィー） によりこれらを分画して、 それぞれ検出を行う ことにより、 リン酸化 （または脱リン酸化） 酵素の活性を阻害する単一の化合物 を最終的に特定することが可能である。 これらスクリーニングにより単離された リン酸化酵素および脱リン酸ィ匕酵素の活性を阻害もしぐは促進する化合物は、 特 に、 癌治療薬や抗真菌抗生物質の候補化合物として有用である。
加えて本発明は、 上記測定方法、 またはスクリーニングに用いる、 リン酸化状 態を識別することができる抗体を含むキットに関する。 本発明のキットは、 リン 酸化酵素活性の検出に用いる場合には、 前記抗体以外に、 例えば基質ペプチドや 緩衝液等で構成される。 また、 脱リン酸化酵素活性の検出に用いる場合には、 前 記抗体以外に、 リン酸化された基質ペプチドや緩衝液で構成される。 これら酵素 の活性を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニングに用いる場合には、 さら にリン酸化酵素 （あるいは脱リン酸化酵素） を組み合わせる。 基質ペプチド、 あ るいは前記抗体のいずれかは、 上記のような標識を付与することができ、 他方を 固相化しておくことができる。
キットには、 リン酸化酵素 （あるいは脱リン酸化酵素） の活性や、 測定系その ものの検定のために、酵素標品ゃ基質ぺプチド標品を組み合わせることができる。 これらの標品や、 前記抗体には、 安定化などのための他の成分を加えることがで きる。 例えば、 1 %程度の BSA、 および終濃度 0. 2〜10% (好ましくは 1 %) のシ ュ一クローズ、 フルク トースなどのポリオ一ノレ類を、 標品中に凍結乾燥後のタン パク質変性防止剤として添加することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 DNA損傷チェックポイントによる細胞周期の制御を示す図である。 図 2は、 抗フォスフォ p53- S15の反応性を示す図である。
図 3は、 抗フォスフォ p53- S33の反応性を示す図である。
図 4は、 抗フォスフォ p53- S37の反応性を示す図である。
図 5は、 抗フォスフォ P53-S15抗体により検出される組換え ATMのリン酸化酵 素活性を示す図である。
図 6は、 抗フォスフォ p53- S15抗体により検出される組換え ATRのリン酸化酵 素活性を示す図である。
図 7は、抗フォスフォ p53部位特異的抗体により検出される DNA-PKのリン酸化 酵素活性を示す図である。 ' 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。
[実施例 1 ]抗リン酸化べプチド抗体の作製
1)免疫原の作製
1. ぺプチドの作製
リン酸化部位として報告されたヒ ト p53のアミノ酸 15番目、 33番目と 37番目 のセリン残基をそれぞれ含む以下の 6本のべプチドを、 ぺプチド合成機を用いて 作製した。
フォスフォ P53-S15 ： SVEPPLS (p) QETFSDC (配列番号： 4 )
P53-S15 ： SVEPPLSQETFSDC (配列番号： 5 )
フォスフォ P53-S33： PENNVLS (p) PLPSQAC (配列番号： 6 )
P53-S33： PENNVLSPLPSQAC (配列番号： 7 )
フォスフォ p53- S37： VLSPLPS (p) QAMDDLC (配列番号： 8 ) P53-S37： VLSPLPSQA DDLC (配列番号： 9 )
上記のぺプチド配列は一文字表記で、 ァミノ末端からカルボキシ末端方向に記 した。 S (p)はリン酸化セリン残基を示す。 90%以上の純度であることが HPLCによ り確認された。フォスフォ p53- S15と p53_S15はヒ ト p53の 9番目から 21番目ま での、 フォスフォ p53 - S33と p53-S33は 27番目から 39番目までの、 そしてフォ スフォ p53- S37と p53-S37は 31番目から 43番目までのアミノ酸配列に相当する。 全てのぺプチドのカルボキシ末端のシスティン残基は、 ぺプチドをキヤリァータ ンパク質に共有結合させるために導入した。
2. ペプチドのキャリアータンパク質への結合
免疫原とするため、 リン酸化べプチド（フォスフォ p53-S15、 - S33、または- S37) をそれぞれキャリアータンパク質であるキーホール ' リンペッ ト 'へモシァニン (keyhole limpet hemocyanin： KLH) と共有結合させた。 これらのぺプチドと KLH との結合には m -マレイ ミ ドベンゾィル -N-ヒ ドロキシスクシニミ ドエステル (MBS)を架橋物質として用いた。等量の KLHとペプチドを架橋した。 このペプチド - KLHを免疫原として使用した。
3. 免疫原の調製と免疫方法
キャリアータンパク質 KLH とそれに結合したペプチド （ペプチド- KLH) 20 /i g (100 Ai l)をゥサギの、 10 / g (100 / l)をマウスの 1回あたりの免疫原として用い た。 1. 5ralチューブで、 100 M 1のフロイント完全アジュバントとぺプチド- KLH (各 100 μ 1) を 1mlシリンジと 21ゲージ注射針を用いて、完全にェマルジヨン化する まで混合した。
マウス （Balb/c) に対し、 腹腔にフォスフォ p53- S15- KLH またはフォスフォ p53-S33- KLHとアジュバントのェマルジョンを 26ゲージ注射針を使用して注射し た （免疫)。 免疫は 1週間ごとに 1回、 合計 4回行った。 4回目の免疫の際、 抗体 力価をチェックするため、 マウスの眼下静脈蒼より 50〜100 μ 1 採血し、 ELISA 法により抗体力価の確認を行った。 また、 フォスフォ p53- S37- KLH とアジュバン トのェマルジヨンをゥサギ (Japanese white)の背後部皮下に 7カゝら 8ケ所に分け、 26ゲージ注射針を使用し て免疫した。 免疫は 1週間ごとに 1回、 合計 5回行った。 5回目の免疫の際、 抗 体力価をチヱックするため、 ゥサギの耳朶静脈より数 ml採血し、 ELISA法により 抗体力価を確認した。
2) 抗フォスフォ p53 - S15モノクローナゾレ抗体および抗フォスフォ p53- S33モノ クローナル抗体の作成
1. ハイブリ ドーマの作成
十分な抗体力価の確認後、 マウスより脾臓を摘出し、 ポリエチレングリコール を用いてミエ口一マ細胞と細胞融合させた。 ハイブリ ドーマの選別は HAT (ヒポ キサンチン、ァミノァテリン、チミジン： hypoxanthine, aminopterin, thymidine) 選択で行った。 ハイプリ ドーマの培養上清を用いた ELISA法により、 非リン酸ィ匕 ペプチド （p53- S15、 p53-S33) よりもリン酸化ペプチド （フォスフォ p53- S15、 フォスフォ p53 - S33) に対して反応性の高いクローンのスクリ一二ングを行った。
2. 腹水の取得と抗体の精製
限界希釈法により得られたハイプリ ド一マクローンを 75cm2フラスコで培養し た後、 マウスの腹腔に注射した。 ハイブリ ドーマを注射する 10日前に 1mlの、 3 日前に 0. 5tnlのプリスタン （Sigma) をマウスに注射しておいた。 1〜2週間後に マウスの状態を見ながら腹水の採取を行った。 腹水に終濃度 50 ¾になるように硫 安を添カ卩し、 4°Cで一時間以上攪拌した。 高速遠心によりその沈澱を回収した。 最 小限の純水で沈澱を完全に溶解後、 透析膜を用いて PBSに対して透析した。 完全 に PBS に平衡化させた後、 protein Aセファロース （フアルマシア社製） と複合 体を形成させた。 最後に protein Aセファロースから抗体を溶出させた。
3) 抗フォスフォ p53- S37ポリクローナル抗体の作成
1. ゥサギからの本採血
十分な抗体力価の確認後、 翌週より 1週間ごと採血、 休息、 免疫の計 3週間を 1サイクルとして、それを 4回繰り返した。採血は抗体力価の確認の際と同様に、 耳朶静脈より行われた。 1回の採血あたり、 おおよそ 60〜70 mlの血液を採取し た。 5 サイクル目の採血において、 カテーテルを用いて心臓より可能なかぎりの 血液を回収した。
2. ゥサギ血清の回収、 保存及び抗体分画の分離
採取した血液を 4°Cにー晚静置し凝固させ、 血清を分離した。 分離回収された 血清に終濃度 0. 1 /。になるようァジ化ナトリゥムを添加し、 4°Cで保存した。 抗体分画を分離、 濃縮するため、 回収した血清に終濃度 50 %になるように硫安 を添加し、 4°Cで一時間以上、 攪拌した。 高速遠心によりその沈澱を回収した。 最 小限の純水で沈澱を完全に溶解後、 透析膜を用いて PBSに対して透析した。 完全 に PBSに平衡ィヒした後、 この抗体分画をカラムにかけ、 抗体の精製を行った。
3. 特異化カラム及び吸収用カラムの作製
5〜10 mlの 0. 1M炭酸バッファ一中で 1〜2 gの CNBr活性化セファロース 4Bと ペプチド 1 mgをローテ一ターを用いて、 4°Cでー晚混和することによって、 セフ ァロース 4Bにぺプチドを結合させた。翌日、セファロース 4Bをカラムに充填し、 力ラム体積の 4〜10倍量の PBSでセファロース 4Bを洗浄した。洗浄後、 1M Tris-HCl (PH7. 0)でカラムを平衡ィ匕し、 セファロ一ス 4B表面に残っている活性基をプロッ キングするため、 そのまま 1時間以上 30°Cに放置した。 ブロッキング後、 PBSで 洗浄、 平衡化し使用した。 特異化カラム作製にはフォスフォ P53- S37を、 吸収用 カラム作製には P53-S37をそれぞれ用いた。
4. 特異化カラム及び吸収用カラムによる抗フォスフォ P53-S37抗体の精製 抗リン酸化べプチド抗体を精製するため、 抗フォスフォ P53-S37抗体分画を特 異化カラムに通した。 PBS- 0. 1% Tween 20 で洗浄後、 カラムに吸着している抗リ ン酸化べプチド抗体を 0. 1M グリシン- HC1 (pH3. 0)で溶出した。
特異化カラムより溶出された抗フォスフォ P53-S37抗体分画を、吸収用カラム、 p53- S37セファロ一ス 4Bカラムに通した。 吸収用カラムに通すことにより、抗体 画分中に存在する非リン酸ィヒぺプチドとも反応する抗体を吸収用カラムに吸収さ せた。 抗リン酸化ペプチド特異抗体はカラムに吸着せず、 カラムを素通りする。 吸収用カラムは PBS- 0. l%Tween 20で洗浄され、カラムに吸着している抗非リン酸 化ペプチド抗体は 0. 1M グリシン- HC1 (pH3. 0)で溶出された。 溶出後、 カラムは 再び PBS- 0. 1% Tween 20で平衡化された。 非リン酸化ペプチド抗体がほぼ完全に 吸収されるまで、 抗体分画を繰り返し吸収用カラムに通した。 吸収の進み具合は 非リン酸化ぺプチド感作プレートを用いた ELISA法によって確認された。
吸収用カラムで吸収した抗体 （抗リン酸化べプチド特異抗体） を PBSに対して 透析した後、 リン酸化ペプチド感作プレートを用いた ELISA法によって、 そのリ ン酸化べプチドに対する特異性を最終的に確認した。
4) 抗体の検定
1. 抗体力価及び抗体の特異化検定用 ELISA法プレートの作製及び使用 ぺプチドを 10 μ g/ralになるように PBSに溶かし、 ELISA法用マイクロタイタ 一プレートに 1 ゥエルあたり 50 μ 1ずつ分注して、 4°Cでー晚感作した。 感作後、 ぺプチド溶液を除き、 1 % BSA-0. 1% Tween 20- PBSを 1ゥエルあたり 200 1ずつ 分注して、 室温で 1時間以上ブロッキングをおこなつた。
上記のようにして調製したリン酸化ペプチド （フォスフォ p53- S15、 フォスフ ォ p53- S33、 またはフォスフォ p53-S37) 感作プレートは、 抗体力価の測定、 抗リ ン酸化セリン残基特異抗体の吸収、 抗リン酸化べプチド抗体の特異性の確認に用 いた。 また、 非リン酸化ペプチド （p53- S15、 p53- S33、 または p53- S37) 感作プ レートはカラムによる非特異抗体の吸収の確認に用いた。
血清や抗体を 0. 1% Tween 20- PBSで必要に応じて希釈した。 希釈したそれらの サンプルを感作プレ一ト 1ゥエルあたり 100 添加し、室温に 1時間静置した（一 次反応)。 一次反応後、 洗浄瓶を用いて、 各ゥニルを PBSで 4回以上、 十分に洗浄 した。 0. 1% Tween 20- PBSで 3000倍希釈したホースラディッシュ ·ペルォキシダ —ゼ （Horseradish Peroxidase： HRP) 標識ャギ抗ゥサギ IgG (H+L)抗体（MBL社製 458)を各ゥエルに 100 / lずつ分注し、 室温に 1時間静置した （二次反応)。 二次 反応後、 同様に、 で洗浄した後、 0. 8 mM TMB (テトラメチルベンジジン： Tetramethylbenzidine)溶液を 1 ゥュルあたり 100 μ 1添加し、 30°Cで 5〜20分間 発色させた （発色反応）。 1. 5N H3P04を 1ゥエルあたり 100 ずつ加えて発色反 応を停止させ、 マイクロタイタ一プレートリーダ一を用いて、 450nm における吸 光度を測定した。
2. 特異性の確認
抗フォスフォ p53- S 15特異抗体、 抗フォスフォ p53_S33特異抗体及び抗フォス フォ P53-S37特異抗体を希釈し、 各ぺプチド感作プレートを用いてそれらの特異 性を確認した （図 2— 4 )。
[実施例 2 ]リコンビナント ATM及び ATRの作製
1) PCR法による ATM及び ATRの cDNA単離
1. ATM及び ATR増幅用プライマーの設定
ヒ ト ATMのキナーゼ領域 （2695番目から 3056番目、 配列番号： 2 ) をコード する cDNA配列を増幅するため、以下に示す hATM-Flと hATM- R1プライマ一を設定 した。 同じくヒ ト ATRのキナーゼ領域 （2305番目から 2644番目、 配列番号： 3 ) をコードする cDNA配列を増幅するため、以下に記す hATR- F1と hATR - R1プライマ —を設定した。
< ATM増幅用プライマ一〉
フォヮ一ドプライマ一（hATM- F1) ； 5' -GCG AAT TCA GGT GTA AAT TTA CCA AAA ATA- 3' (配列番号： 1 0 ) (5'側 2つの塩基 (GC)は制限酵素処理を円滑におこなわせるた めのもの。 5'側 3番目から 8番目（GMTTC)は制限酵素 EcoRI部位。 )
リバースプライマ一（hATM- R1) ； 5' -GCG CTC GAG CAC CCA AGC TTT CCA TCC TGG- 3' (配列番号： 1 1 ) (5'側 3つの塩基 (GCG)は制限酵素処理を円滑におこなわせる ためのもの。 5'側 4番目から 9番目（CTCGAG)は制限酵素 Xhol部位。）
く ATR増幅用プライマ一〉 フォワードプライマー（hATR- F1) ； 5' -GCG GGA TCC TCT CTT CAG AAA CCA AAG MG - 3' (配列番号： 1 2 ) (5'側 3つの塩基 (GCG)は制限酵素処理を円滑におこなわせる ためのもの。 5'側 4番目から 9番目（GGATCC)は制限酵素 BamHI部位。 )
リバースプライマー（hATR- R1) ； 5' -GCG CTC GAG CAT ATA TGG AGT CCA ACC AAG- 3' (配列番号： 1 3 ) (5'側 3つの塩基 (GCG)は制限酵素処理を円滑におこなわせる ためのもの。 5'側 4番目から 9番目（CTCGAG)は制限酵素 Xhol部位。）
2. 鏵型 DNAの調製
ATM及び ATR遺伝子のキナーゼ領域を PCR法で増幅するための铸型として、 ヒ ト乳癌由来の ZR75- 1細胞の cDNAを用いた。 まず、 cDNAを作製するため、 ZR75-1 細胞よりフエノール-チォシアン酸グァニジン法（二ツボンジーン、 IS0GEN) を用 いて全 RNAを抽出、精製した。抽出した全 RNAをもとにオリゴ dTまたはオリゴラ ンダムプライマーを用いて cDNAを合成した （逆転写反応）。
3. PCR反応の条件
PCR反応は以下の 3段階の条件で行った。
1 ； 95°C 5分間 （変性）、 52°C 1分間 （ァニール）、 72°C 2分間 （伸長） を 1サ イタル
2 ； 94°C 30秒間 （変性）、 62°C 30秒間 （ァニール)、 72°C 2分間 （伸長） を 35 サイクル
3 ； 72°C 10分を 1サイクル
4. 発現ベクターへのクローニング
hATM-FU hATM-Rlプライマーセットで増幅された PCR産物を EcoRIおよび Xhol で、 MTR-Fl, hATR-Rlプライマ一セットで増幅された PCR産物を BamHI と Xholで それぞれ消化した。 制限酵素消化 DNA はァガロースゲル電気泳動に供した後、 Geneclean (BIOIOI社製） で精製した。 精製 DNAを、 予め PCR産物の両末端と同 じ制限酵素 BamHI あるいは EcoRI と Xhol により消化された発現べクタ一 pcDNA3-6myc へライゲーシヨンした。 発現べクタ一 pcDNA3- 6rayc ベクタ一では N 末端側に 6xmyc tagを付与するので 6myc- ATMまたは 6myc- ATRタンパク質として 細胞内で発現する。 ライゲーシヨン後は 「Molecular Cloning (Sambrook et al. , ニ版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)」 の方法に従って大腸菌 （DH5 a ) 株を形質転換し、複数のシングルコロニーを取得 した。
5. 塩基配列の確認
「Molecular Cloning (前記）」 の方法に従い、 各シングルコロニーからプラス ミ ド DNAを精製した。 そのィンサート DNAの塩基配列をサンガー法に基づき、 ォ -トシークェンサ一で決定した。 インサ一ト DNAの配列とデータベース上に公開 されている配列とを比較し、 ATMおよび ATRの cDNA配列であることを確認した。 2) cDNAクローンがコードする ATM、 ATRタンパク質の酵素活性の測定
1. 活性測定用基質の作製
ATMおよび ATRはヒ ト p53の 15番目のセリン残基をリン酸化することが知られ ている。 そこで、 ヒ ト p53のアミノ酸 1番目から 99番目をコードする cDNA配列 を発現ベクター pGEXに組み込み、 大腸菌内に形質転換した。 この大腸菌で発現さ れるグルタチオン- S-トランスフェラーゼ （GST ) との融合タンパク質 GST-p53 (l-99)を、 ATMおよび ATRの活性測定用基質として使用した。
pGEXベクターではリコンビナントタンパク質は GSTとの融合タンパク質として 作られる。 この GST酵素がグルタチオン （GSH) に対してァフィ二ティ一を持って いることを利用して、 リコンビナントタンパク質の精製を行った。 リコンビナン トタンパク質の発現を確認した後、 その菌体を 1% Tween 20 - PBSに懸濁後、 超 音波処理により菌体を破砕した。 高速遠心後、 上清をリコンビナントタンパク質 を含む可溶性分画とした。 この可溶性分画を GSH - セファロース 4B カラム (Pharmacia社製） に通し、 GST-p53 (1-99)タンパク質をカラムに吸着させた。 力 ラムを WEバッファー（lO raM 2-メルカプトエタノール、 2 mM MgCl2、 20 raM Tris- HC1 pH7. 5)で洗浄後、 リコンビナントタンパク質を G ノくッファー（10 raM GSH、 50 m Tris-HCl pH9. 6)を用いて溶出した。 溶出された GST-p53 ( 1-99)タンパク質は PBS に対して透析した。
2. ヒ ト 293T細胞へのトランスフエクシヨンと活性測定
ATMまたは ATRをィンサートに持つプラスミ ド DNAを Trans IT-LT1 (Mirus社 製） を用いてヒ ト 293T細胞へトランスフエク トした。 その 2日後、氷冷 PBSで洗 つた細胞を HGNバッファー [lOmM HEPES (ρΗ7· 5)、 10%グリセリン、 150ra NaCl l% Tween20、 lOmM j3 -グリセ口リン酸、 ImM NaF, 0. ImM NaV04, 2 μ g/ml ぺプスタチ ン 5 /z g/mlロイぺプチン、 lO /z g/mlァプロチェン、 2mMベンズアミジン、 ImM PMSF、 ImM DTT] に懸濁した。 遠心分離後の上清を細胞抽出液とした。
細胞抽出液を SDS-ポリアクリルアミ ド電気泳動 （PAGE)に供した後、 ゥエスタ ンブロットを行ない、 抗 rayc tag抗体 （MBL社製） でタンパク質の発現を確認し た。
細胞抽出液に抗 myc tag抗体とプロテイン Aセファロース （Pharmacia社製） を加えて 6rayc- ATMタンパク質または 6myc- ATRタンパク質を免疫沈降した。 免疫 沈降物は lOOra Tris (pH7. 5)、 0. 5M LiClで洗つた後、 さらに 1 x ATM/ATR反応用 バッファ一 [10raM HEPES (pH7. 5)、50m ]3 -グリセロリン酸、 50mM NaCl、 lOmM MgCl2、 lOraM MnCl2、 5raM ATP、 ImM DTT]で洗った。洗浄後の免疫沈降物を 370kBqの γ - 32Ρ- ΑΤΡ、 1 /z gの GST- p53 (1-99)を添加したキナーゼ反応バッファー中に 30°C30分間保温し た。反応液を SDS- PAGEに供し、乾燥ゲルのォートラジオグラフをとることで基質 に用いた GST- p53 (l-99)に32 Pが取り込まれたことを確認した。
3) Spodoptera frugiperda (Sf9)細胞からのリコンビナントタンパク質の精製
1. リコンビナントバキュロウィルス液の調製
GST- p53 (l-99)を 32 P標識した cDNAクローンについて、 そのインサートを ATM については EcoRIと Xholで、 ATRについては BamHIと Xholで切り出し、 pFASTBACHT ベクタ一 （GIBC0 BRL社製） にサブクローニングした。 pFASTBACHTのプラスミ ド クローンを大腸菌（DH10BAC株） へトランスフォーメーションし、 ルリア寒天プレ 一ト（Luria agar plate) [lOg/Lぺプトン、 5g/L酵母エキス トラク ト、 10g/L NaCl、 12g/L 寒天、 200 /i g/ml X-Gal、 40 μ g/ml IPTG、 lO ^ g/ml テトラサイクリン、 7 g/ral ゲンタマイシン、 50 /i g/ml カナマイシン]上で生育させた。 DH10BAC内で は部位特異的トランスポジションによって、 pFASTBACHT 内の発現カセッ トが bacmid DNAへ転移する。 転移の起きたシングルの白色コロニーからリコンビナン ト bacmid DNAを精製した。 リコンビナント bactnid DNAを CELLFECTIN (GIBCO BRL) を用いて Sf 9細胞に形質転換した。
リコンビナントバキュロウィルスは培養液中に産生されるので、 約 1週間後に 培養液を遠心分離し、 その上清をウィルス液とした。 以上の操作は基本的に BAC-TO-BAC Baculovirus Expression System (GIBCO BRL社製） により行った。
2. リコンビナントタンパク質の精製
Sf9細胞を 75cm2のフラスコにほぼコンフルェントな状態にまで培養し、その培 養液にリコンビナントバキュロウィルス液を加えた。 感染後 3〜4日目に細胞を 氷冷 PBSに懸濁し、遠心洗浄を行った。細胞を HGNバッファー（- DTT) に懸濁し、 氷冷しながら超音波処理を行った。 続いて遠心分離を行い、 得られた上清を可溶 性画分として精製に用いた。 pFASTBACHTベクタ一の発現カセットでは N末端側に 6つの His残基 （6xHis)が付加される。 抽出液の一部を用いてウェスタンブロッ トを行った後、抗 5xHis抗体（GIAGEN社製）によりタンパク質の発現を確認した。 可溶性分画を Ni-キレーティングセファロースカラム（Pharmacia社製） に通し、 6xHis-Tag を介して組換えタンパク質をカラムに吸着させた。 6xHis-Tag は Ni2+ と錯体を形成するため、 カラムの Ni2+にリコンビナントタンパク質が吸着する。 カラムを HGNバッファー（- DTT)で洗浄した後、 リコンビナントタンパク質を溶出 バッファー（50 mM 〜1 M ィミダゾール、 0. 5 M NaCl、 20 mM Tris-HCl pH7. 9)で 溶出した。 その際のイミダゾ一ルの濃度は 10mM、 25mM、 50 mM, 100 mM、 250 raM、 500raM、 1 Mと段階的に変化させて溶出を行った。
各イミダゾ一ル画分について、 ウェスタンブロッ トで抗 5xHis抗体により検出 されるリコンビナントタンパク質が存在する画分を透析液 [50mM HEPES (pH7. 5)、 IraM DTT、 ImM EDTA (pH8. 0)、 50% グリセリン] に対してー晚透析した。
透析後のサンプルを MonoQカラム（Pharmacia社製）に通した。 FPLC (Pharmacia 社製）を用いて吸着されたタンパク質を、 0〜1M NaClを含む 10mM Tris-HCl (pH7. 5)、 IraM DTT、 10%グリセリンで濃度勾配をかけながら溶出させた。 ウェスタンブロッ トで抗 5xHis抗体により検出されたリコンビナントタンパク質が存在する画分に ついて透析液に対して透析を行った。
3. 精製リコンビナントタンパク質のタンパク質リン酸化酵素としての純度検 定
リコンビナントタンパク質を含む透析後の画分についてタンパク質リン酸化酵 素活性を測定した。 透析後の濃縮サンプルのうち 2〜 5raiを用いて、 0. 5 ra ぺプ チド、 0. IraM ATP (185 kBqの γ - 32P- ATPを含む） を含む I x ATM/ATR反応用バッ ファーを調製し、 30°Cに 10分間保温した。 次に、 その反応液を P81フォスフォセ ルロース濾紙 （Whatman社製）上にスポットし、 濾紙を 75mM H3P04中で洗浄した。 20分間の洗浄を 3回行った後、 濾紙を乾燥させ、 ペプチドに取り込まれた32 Pの 放射能をシンチレーシヨンカウンタ— （Beckman 社製） を用いてチェレンコフ法 で測定した。
ATM, ATRの活性測定には DNA-PKペプチド（Protnega社製） を、 PKAの活性測定 用には Kempt ide (Promega社製）、 カゼィン 'キナーゼ IIの活性測定には Casein Kinase II Peptide (NEB社製） を用いた。 その結果、 精製リコンビナント ATM、 ATRに PKAとカゼィン · キナーゼ IIの活性は認められなかった。
4. リコンピナント ATM、 ATRのリン酸ィ匕部位特異性の確認
上記精製リコンビナント ATMまたは ATRおよび GST-p53 (l- 99)を含む Ix ATM/ATR 反応用バッファーを 30°Cに保温し、 経時的にその反応液の一部を当量の 2 X SDS 化バッファーと混合して反応を停止した。その経時的な反応物を SDS- PAGEに供し、 ウェスタンブロットを行った。 一次抗体 （抗フォスフォ p53-S15モノクローナル 抗体、 抗フォスフォ p53-S33モノクローナル抗体またはフォスフォ p53- S37モノ クロ一ナル抗体） は 0.5 / g/ml となるよう抗体希釈用バッファー （1%BSA、 0. 1% NaN3)で希釈して使用した。一次抗体反応後、メンブレンを 0.05%Triton X100- PBS で洗浄した。 0.05%Triton X100-PBSで 3000倍に希釈した HRP標識ャギ抗マウス 抗体 (MBL社製）または 2000倍に希釈した HRP標識ャギ抗ゥサギ抗体 (MBL社製）を 室温で 1時間抗原抗体反応させた （二次反応）。 0.05% Triton X100-PBSでメンブ レンを洗浄後、 ECL検出キッ ト （Araershara社製）でリン酸化部位の検出を行った。 その結果、 リコンビナント ATMおよび ATRは GST- p53 (1-99) の S15残基をリン 酸化するが、 S33残基と S37残基をリン酸ィヒしないことが確認された。 このこと から、 リコンビナント ATMおよび ATRは、 SQE配列を部位特異的にリン酸化する ことが確認された。
[実施例 3 ]DNA-PK、 ATM, および ATRの活性測定系
1) ATMまたは ATRの活性測定用 ELISA法の構築
1. GST-p53( 1-99)感作プレートの作製
GST-p53(l- 99)を 20 g/ralになるように PBSに溶かし、 ELISA法用マイクロタ イタ一プレー卜に 1ゥエルあたり 50 μ 1ずつ分注して、 4°Cでー晚感作した。感作 後、 GST - p53(l- 99)溶液を除き、 1% BSA - 0. 1% Tween 20 - PBSを 1 ウエノレあた り 200 1ずつ分注して、 室温で 1時間以上ブロッキングした。
2. リコンピナント ATMまたは ATRの活性測定手順
リコンビナントタンパク質 GST- p53(l- 99)を固相化したゥエル中でタンパク質 リン酸化反応を行った後、 同じゥエルで連続して ELISA法を行った。
リコンビナント ATMまたは ATRを含む lxATM/ATR反応用バッファーを調製し、 50 μ 1ずつ GST-p53(l - 99)感作プレートのゥエルに添加した（タンパク質リン酸化 反応）。 30°Cで一定時間保温した後、 200μ 1 の 75ra H3P04溶液を各ゥエルに添加 して反応を停止した。 各ゥュルを PBSで 4回以上十分に洗浄した。 一次抗体 （抗 フォスフォ P53-S15モノクローナル抗体） を 0.5 M g/ml となるよう抗体希釈用バ ッファー （1% BSA、 0. 1% NaN3) で希釈し、 洗浄後の各ゥエルに 100 β 1ずつ添加 して室温で 1時間静置した（一次反応）。一次反応後、同様に PBSで洗浄した。 0. 05%
Tri ton X100- PBSで 3000倍に希釈した HRP標識ャギ抗マウス抗体 (MBL社製）を各 ゥエルに 100 μ 1ずつ添加し、 さらに室温で 1時間静置した （二次反応）。 PBSで 洗浄後、 各ゥヱルに HRP基質液を 100 μ 1ずつ添加し、 37°Cで発色させた。 1. 5N P04を 100 μ 1ずつ加え発色反応を停止させ、 マイクロタイタ一プレートリーダ 一を用いて、 450 nmにおける吸光度を測定した。
3. 測定結果
上記 ELISA法を用いて、 リコンビナント ATM、 ATRのタンパク質リン酸化酵素活 性を測定した結果を示した （図 5、 図 6 )。 ATM (図 5 )、 および ATR (図 6 ) のい ずれの酵素も、酵素濃度依存的に吸光度の上昇が確認された。本発明に基づいて、 これらの酵素活性を測定できることが示された。
2) DNA-PK活性測定用 ELISA法の構築
1. DNA-PKのリン酸化部位特異性の確認
DNA-PK (Proraega社製） および GST- p53 ( 1-99) を含む lx DNA-PK反応バッファ 一 (25 m HEPES pH7. 5、 75 mM KC1、 10 raM MgCl2、 IraM DTT、 0. 2 mM EGTA、 0. 25 ra ATP、 10 /x g/ml超音波処理 2本鎖 DNA、 50mM -グリセ口リン酸） を 30°Cに保 温し、 経時的にその反応液の一部を当量の 2 X SDS化バッファーと混合して反応 を停止した。その経時的な反応物を SDS- PAGEに供し、 ウェスタンブロットを行つ た。一次抗体（抗フォスフォ p53- S 15モノクローナル抗体、抗フォスフォ p53- S33 モノクローナル抗体またはフォスフォ p53-S37 モノクローナル抗体） は 0. 5 μ g/mlとなるよう抗体希釈用バッファー （PBS、 1% BSA、 0. 1% NaN3) で希釈して使 用した。一次抗体反応後、メンブレンを◦. 05%Tri ton X100-PBSで洗浄した。 0. 05% Triton X100-PBSで 3000倍に希釈した HRP標識ャギ抗マウス抗体 (MBL社製）また は 2000倍に希釈した HRP標識ャギ抗ゥサギ抗体 (MBL社製）を室温で 1時間抗原抗 体反応させた （二次反応）。 0. 05 %Tri ton X100-PBS でメンブレンを洗浄後、 ECL 検出キット （Amershara社製） でリン酸化部位の検出を行った。 その結果、 DNA- PK は GST- P53 (1-99) の S15残基と S37残基をリン酸化する力 S、 S33残基はリン酸化 しないことが確認された。 このことから、 DNA- PKは SQ配列を部位特異的にリン 酸ィヒすることが確認された。
2. GST-p53 (1-99)感作プレートの作製
GST- p53 (l - 99)を 20 g/mlになるように PBSに溶力 し、 ELISA法用マイクロタ イタ一プレートに 1ゥエルあたり 50 μ 1ずつ分注して、 4°Cでー晚感作した。感作 後、 GST- p53 Nter溶液を除き、 1% BSA - 0. 1% Tween 20 - PBSを 1ゥエルあたり 200 ^ 1ずつ分注して、 室温で 1時間以上ブロッキングした。
3. DNA-PKの活性測定手順
リコンビナントタンパク質 GST- p53 (l- 99)を固相化したゥエル中でタンパク質 リン酸化反応を行った後、 同じゥエルで連続して ELISA法を行った。
DNA-PKを含む lx DNA-PKキナーゼ反応バッファ一を調製し、 50 μ 1ずつ GST-p53 Nter感作プレートのゥエルに添加した （タンパク質リン酸ィヒ反応)。 30°Cで一定 時間保温した後、 200 μ 1の 75raM H3P04溶液を各ゥエルに添加して反応を停止した。 各ゥエルを PBSで 4回以上十分に洗浄した。 一次抗体 （抗フォスフォ p53- S15モ ノクローナル抗体または抗フォスフォ p53- S37 ポリクローナル抗体） を 0. 5 μ g/ml となるよう抗体希釈用バッファー （1% BSA、 0. 1% NaN3) で希釈し、 洗浄後 の各ゥエルに 100 μ 1ずつ添加して室温で 1時間静置した （一次反応)。 一次反応 後、 同様に PBSで洗浄した。 0. 05%Triton X100- PBSで 3000倍に希釈した HRP標 識ャギ抗マウス抗体 (MBL社製）または 2000倍に希釈した HRP標識ャギ抗ゥサギ抗 体 (MBL社製）を各ゥエルに 100 μ 1ずつ添加し、 さらに室温で 1時間静置した（二 次反応）。 PBSで洗浄後、 各ゥエルに HRP基質液を 100 / 1ずつ添加し、 37°Cで発 色させた。 1. 5N H3P04を 100 /i 1ずつ加え発色反応を停止させ、 マイクロタイタ —プレートリ一ダ一を用いて、 450 nmにおける吸光度を測定した。
4. 測定結果 上記 ELISA法を用いて、 DNA-PKのタンパク質リン酸化酵素活性を測定した （図 7 )。 DNA- PKの酵素濃度依存的に吸光度の上昇が確認された。本発明に基づいて、 DNA-PKの酵素活性を測定できることが示された。 産業上の利用の可能性
実施例に示したように、 抗リン酸化べプチド特異抗体を用いた ELISA法によつ て、 DNA- PK、 ATM, および ATRのタンパク質リン酸化酵素活性を測定することがで きた。 これまではタンパク質リン酸化酵素の活性測定では、 放射性同位元素 32 P で標識された γ -32Ρ - ATP を用いるために、 廃液の処理といった手続きや特別な施 設等を必要とした。 し力ゝし、 実施例に示した活性測定系では放射性同位元素を使 用しないため、 これらの測定系の酵素反応中に各種の化学合成物質や細胞及び細 菌抽出液、 培養上清などを添加することによって、 簡便で迅速な阻害物質の検索 を通常の実験室で行うことが可能である。
また、 DNA- PK、 ATM, および ATRは一次構造が類似したセリン/トレオニンタン パク質リン酸化酵素であり、 ともに PI3Kファミリーに属するが、実施例に示した ように p53の Serl5のリン酸化、 p53の Ser37のリン酸化を調べることで、 DNA- PK、 ATM,および ATRの酵素活性を区別することが可能である。本実施例により各酵素 のモレキュラープローブを生み出す機会を提供することが可能である。

Claims

請求の範囲 . 次の工程を含む、 試料中のタンパク質リン酸化酵素活性の測定方法であつ て、 タンパク質リン酸ィヒ酵素が、 DNA依存性プロテインキナーゼ、 ATM、 および ATRで構成される群から選択されることを特徴とする方法。
( a ) 前記リン酸化酵素によってリン酸ィヒされる基質ペプチドと試料とを、 リ ン酸化酵素によるリン酸化反応に必要な条件下で接触させる工程
( b ) 基質ぺプチドのリン酸化レベルの変化を、 前記基質ぺプチドのリン酸化 状態を識別しうる抗体との反応性の変化に基づいて検出する工程
. 以下の工程を含む、 タンパク質リン酸化酵素活性を阻害もしくは促進する 化合物のスクリーニング方法であって、 タンパク質リン酸化酵素が、 DNA依存 性プロテインキナーゼ、 ATM、 および ATRで構成される群から選択されること を特徴とする方法。
( a ) DNA依存性プロテインキナーゼ、 ATM、 および ATRで構成される群から選 択されるいずれかのリン酸化酵素、およびこのリン酸ィヒ酵素によってリン酸化 される基質ペプチドとを、 被検化合物の存在下、 リン酸化反応に必要な条件下 で接触させインキュベートする工程
( b ) 基質ぺプチドのリン酸化レベルの変化を、 前記基質ぺプチドのリン酸化 状態を識別しうる抗体との反応性の変化に基づいて検出する工程
( c )被検化合物の非存在下における基質ペプチドのリン酸化のレベルと比較 して、 基質ぺプチドのリン酸化のレベルの変化を低下もしくは上昇させる化合 物を選択する工程
以下の工程を含む、 試料中のリン酸化されたタンパク質の脱リン酸化酵素 活性の測定方法であって、 前記リン酸ィヒされたタンパク質が、 DNA依存性プロ ティンキナ一ゼ、 ATM、 および ATRで構成される群から選択されるリン酸化酵 素によってリン酸化されたものである方法。 ( a ) リン酸化されたタンパク質の少なくともリン酸ィヒ部位を含む基質べプチ ドと試料とを、脱リン酸化反応に必要な条件下で接触させインキュべ一トする 工程
( b ) 基質ぺプチドのリン酸ィヒレベルの変化を、 前記基質ぺプチドのリン酸ィヒ 状態を識別しうる抗体との反応性の変化に基づいて検出する工程
. 以下の工程を含む、 リン酸化されたタンパク質に対する脱リン酸ィヒ酵素活 性を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニング方法であって、前記リン酸 化されたタンパク質が、 DNA依存性プロテインキナーゼ、 ATM、 および ATRで構 成される群から選択されるリン酸化酵素によってリン酸化されたものである 方法。
( a ) 前記リン酸ィヒされたタンパク質に対する脱リン酸化酵素、 およびリン酸 化されたタンパク質の少なくともリン酸化部位を含む基質ペプチドを、被検化 合物の存在下、脱リン酸ィヒ反応に必要な条件下で接触させインキュべ一トする 工程
( b ) 基質ぺプチドの脱リン酸ィヒレベルの変化を、 前記基質べプチドのリン酸 化状態を識別しうる抗体との反応性の変化に基づレ、て検出する工程
( c )被検化合物の非存在下における基質ぺプチドの脱リン酸化のレベルと比 較して、基質ぺプチドの脱リン酸ィヒのレベルの変化を低下もしくは増加させる 化合物を選択する工程
. 基質ペプチドが、 SQモチーフ、 または SQEモチーフを構成するアミノ酸配 列を含むものである請求項 1一 4のいずれかに記載の方法。
リン酸化状態を識別することができる抗体が、 そのリン酸ィヒ部位を識別し うるものであり、 異なる部位をリン酸化する複数のリン酸化酵素が共存する試 料に含まれるリン酸化酵素の活性を個別に測定する請求項 1の方法。
リン酸化酵素が、 ATMまたは ATRであり、 抗体が p53の 15位セリンを含む SQEモチーフのリン酸化状態を識別しうるものである請求項 6の方法。
8. リン酸化酵素が、 DNA依存性プロテインキナーゼであり、 抗体が p53の 37 位セリンを含む SQモチーフのリン酸化状態を識別しうるものである請求項 6 の方法。
9. 以下の工程を含む、 DNA依存性プロテインキナーゼ活性の測定方法。
(a) 2本鎖 DNAの不存在下で請求項 1の方法を実施することによって、 試料 中のリン酸化酵素活性を測定する工程
(b) 2本鎖 DNAの存在下で請求項 1の方法を実施することによって試料中の リン酸化酵素活性を測定する工程
(c) (a) と （b) の結果を比較することによって、 DNA依存性プロテインキ ナーゼに由来するリン酸ィヒ酵素活性を求める工程
10. 抗体が、 リン酸化されていない基質ペプチドよりも、 リン酸化された基質 ぺプチドとの反応性が高いものである請求項 1—4のいずれかに記載の方法。
1 1. 抗体が、 リン酸ィヒされた基質ペプチドよりも、 リン酸化されていない基質 ぺプチドとの反応性が高いものである請求項 1—4のいずれかに記載の方法。
1 2. 基質ペプチドが標識されている、 請求項 1一 4のいずれかに記載の方法。
1 3. 基質ペプチドが固相化されている、請求項 1—4のいずれかに記載の方法。
14. 抗体が標識されている、 請求項 1一 4のいずれかに記載の方法。
1 5. 基質ぺプチドのリ ン酸ィヒレベルの評価を ELISA法により行う、 請求項 1― 4のいずれかに記載の方法。
1 6. 請求項 2に記載のスクリーニング方法により単離することができる、 DNA 依存性プロテインキナーゼ、 ATM、 および ATRからなる群から選択されるタン パク質リン酸化酵素の活性を調整する化合物。
1 7. 請求項 4に記載のスクリーニング方法により単離することができる、 DNA 依存性プロテインキナーゼ、 ATM、 および ATRからなる群から選択されるタン パク質リン酸化酵素によってリン酸化されたタンパク質に対する脱リン酸化 酵素の活性を調整する化合物。
1 8. 天然由来である、 請求項 1 6または 1 7のいずれかに記載の化合物。
1 9. 請求項 1—4に記載のいずれかの方法に用いるための、 基質ペプチドのリ ン酸化状態を識別する抗体。
20. 基質ペプチドのリン酸化状態を識別する抗体を含む、 請求項 1一 4に記載 のいずれかの方法のためのキット。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8062887B2 (en) 2005-04-01 2011-11-22 National University Corporation, Hokkaido University Monoclonal antibody specifically recognizing modification site after translation of p53 and kit for assaying modification site containing the same
WO2012145382A2 (en) * 2011-04-20 2012-10-26 Traxxsson, Llc Measurement of pka for cancer characterization

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1489177A4 (en) * 2002-03-12 2006-09-13 Japan Science & Tech Agency Cdc7-ASK KINASE COMPLEX, SUBSTRATE OF THE KINASE COMPLEX, FOR THE SUBSTRATE OF SPECIFIC ANTIBODIES AND THESE USES OF THE METHOD FOR SCREENING A COMPOUND CAPABLE OF INHIBITING THE Cdc7 ASK KINASE
US20040106216A1 (en) 2002-07-02 2004-06-03 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Method of measuring drug-metabolizing enzyme activity, method of evaluating inhibition of drug-metabolizing enzyme activity, and composition for these methods
AU2003293303A1 (en) * 2002-09-11 2004-05-04 Novartis Ag Screening assay for identifying agents that modulate pak kinase or cd45 tyrosine phosphatase activity
WO2004070062A2 (en) * 2003-02-04 2004-08-19 Wyeth Compositions and methods for diagnosing and treating cancers
AU2003242033A1 (en) * 2003-06-04 2005-01-04 Hokkaido Technology Licensing Office Co., Ltd. Method of diagnosing cancer and method of judging cancer risk
US7973134B2 (en) 2004-07-07 2011-07-05 Cell Signaling Technology, Inc. Reagents for the detection of protein phosphorylation in anaplastic large cell lymphoma signaling pathways
US7935790B2 (en) 2004-10-04 2011-05-03 Cell Singaling Technology, Inc. Reagents for the detection of protein phosphorylation in T-cell receptor signaling pathways
US7807789B2 (en) 2004-12-21 2010-10-05 Cell Signaling Technology, Inc. Reagents for the detection of protein phosphorylation in EGFR-signaling pathways
WO2007027906A2 (en) 2005-08-31 2007-03-08 Cell Signaling Technology, Inc. Reagents for the detection of protein phosphorylation in leukemia signaling pathways
WO2007102507A1 (ja) * 2006-03-06 2007-09-13 The University Of Tokyo タンパク質リン酸化インディケーター
US7939636B2 (en) 2006-08-11 2011-05-10 Cell Signaling Technology, Inc. Reagents for the detection of protein phosphorylation in c-Src signaling pathways
EP1975184A3 (en) * 2007-03-26 2008-11-26 Cell Signaling Technology, Inc. Serine or threonine phosphorylation sites
US7977462B2 (en) 2007-04-19 2011-07-12 Cell Signaling Technology, Inc. Tyrosine phosphorylation sites
WO2009047567A1 (en) * 2007-10-10 2009-04-16 University Of Sheffield Assay for identifying agents which inhibit the atr and/or dna-pk pathways
KR100895256B1 (ko) * 2008-04-30 2009-04-29 재단법인서울대학교산학협력재단 Ａｔｍ／ａｔｒ을 이용한 세포사멸 조절제 스크리닝 방법
ES2605493T3 (es) 2010-12-23 2017-03-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Detección de un polipéptido modificado post-traduccionalmente mediante un agente ligante bivalente
EP2655413B1 (en) 2010-12-23 2019-01-16 F.Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
CN103384681B (zh) 2010-12-23 2018-05-18 霍夫曼-拉罗奇有限公司 结合剂
US9644037B2 (en) 2013-10-18 2017-05-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antibodies that specifically bind ataxia telangiectasia-mutated and RAD3-related kinase phosphorylated at position 1989 and their use
AU2023217975A1 (en) * 2022-02-14 2024-09-12 Quince Therapeutics S.P.A. Variants of the human atm protein for the treatment of diseases related to at least one mutation of the atm gene

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04504171A (ja) * 1989-03-03 1992-07-23 ロシユ・ダイアグノステイツクス・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング チロシン燐酸化及び脱燐酸化活性を測定するための方法及びキツト
JPH1048217A (ja) * 1996-08-05 1998-02-20 Igaku Seibutsugaku Kenkyusho:Kk プロテインキナーゼのリン酸化酵素活性の測定法及び測定キット

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9714971D0 (en) * 1997-07-16 1997-09-24 Cancer Res Campaign Tech Assays,therapeutic methods and means
CA2280675A1 (en) * 1998-08-26 2000-02-26 Nehama I. Smorodinsky Enhanced phosphorylation of p53 by atm in response to dna damage
US6348311B1 (en) * 1999-02-10 2002-02-19 St. Jude Childre's Research Hospital ATM kinase modulation for screening and therapies

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04504171A (ja) * 1989-03-03 1992-07-23 ロシユ・ダイアグノステイツクス・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング チロシン燐酸化及び脱燐酸化活性を測定するための方法及びキツト
JPH1048217A (ja) * 1996-08-05 1998-02-20 Igaku Seibutsugaku Kenkyusho:Kk プロテインキナーゼのリン酸化酵素活性の測定法及び測定キット

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C.E. CANMAN ET AL.: "Activation of the ATM kinase by ionizing radiation and phosphorylation of p53", SCIENCE, vol. 281, no. 11, 1998, pages 1677 - 1679, XP002931786 *
S. BANIN ET AL.: "Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage", SCIENCE, vol. 281, no. 11, 1998, pages 1677 - 1679, XP002931787 *
See also references of EP1184665A4 *
SUSAN P. LESS-MILLER ET AL.: "Human DNA-activated protein kinase phosphorylates serines 15 and 37 in the amino-terminal transactivation domain of human p53", MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, November 1992 (1992-11-01), pages 5041 - 5049, XP002931788 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8062887B2 (en) 2005-04-01 2011-11-22 National University Corporation, Hokkaido University Monoclonal antibody specifically recognizing modification site after translation of p53 and kit for assaying modification site containing the same
WO2012145382A2 (en) * 2011-04-20 2012-10-26 Traxxsson, Llc Measurement of pka for cancer characterization
WO2012145382A3 (en) * 2011-04-20 2013-02-07 Traxxsson, Llc Measurement of pka for cancer characterization

Also Published As

Publication number Publication date
EP1184665A4 (en) 2005-01-19
JP2000325086A (ja) 2000-11-28
EP1184665A1 (en) 2002-03-06

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