JPH04504171A - チロシン燐酸化及び脱燐酸化活性を測定するための方法及びキツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 チロシン燐酸化及び脱燐酸化活性を測定するための方法及びキット詳細な説明 ロジンを含むポリペプチド、及び夫々燐酸塩源又は燐酸受容体と接触させ、次い で燐酸化ポリペプチドを分析することにより、該物質のチロシン燐酸化又はホス ホチロシン脱燐酸化活性を測定するための方法に関する。

特に生物学的物質のチロシンの燐酸化又はホスホチロシンの脱燐酸化活性の測定 は、診断及び予防の目的に、更に研究の目的に極めて重要である。即ちチロシン の燐酸化は成長因子及び腫瘍遺伝子の作用のような多数の生物学的過程に対する 重要な応答機構である［Ｙ、ヤーデン（Ｙａｒｄｅｎ）Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、　５７％　４４３−４７８（１９８８）；Ｔ、ハンター（Ｈｕｎ ｔｅｒ）、Ｊ、’Ａ、クーパー（Ｃｏｏｐｅｒ）、Ｔｈｅ　Ｅｎｚｘｙｍｅ（Ｐ 、　Ｄ、ボイヤー（Ｂｏｙｅｒ）及びＥ、　Ｇ、クレーブス（Ｋｒｅｂｓ）編、 １７巻、１９１−２４６頁、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ ｓｓ、オーランド（Ｏｒｌａｎｄｏ）、Ｆｌ、　（１９８６）所載］。例えば乳 癌細胞及び又他の堅い腫瘍においては、腫瘍遺伝子及び成長因子受容体の発現は 著しくチロシンキナーゼ活性の増大をもたらすようにみえるが、良性の腫瘍では それ程顕著な増大は認められない［Ｈ，ヘニプマン（Ｈｅｎｎｉｐｍａｎ）等、 Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ−５ｅａｒｃｈＳ４９．５１６−５２１（１９８９）］、白 血病性貧血の場合にはチロシンホスファターゼ活性の減退、即ち、ホスホチロシ ンの脱燐酸化の減退が報告されている［Ｄ、＾、フランク（Ｆｒａｎｋ）及びＡ 、Ｃ，サルトレリ（Ｓａｒｔｏｒｅｌｌｉ）、Ｃａｎ−ｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４８ ．５２−５８（１９８８）］　、実験された系において特異的なチロシンホスフ ァターゼ阻害剤の添加は細胞の悪性の退化を起こすことができることも示された ［Ｊ、　Ｋ、クラ−ランド（Ｋｌａｒｌｕｎｄ）、Ｃｅ１ｌ　４１．７０７−７ １７（１従って細胞成長の偏異を検出し、そしてその性質を測定するために、チ ロシンキナーゼ活性又はチロシンホスファターゼ活性の測定のための信頼性のあ る、且つ有効な方法の必要性が存在する。

試料をチロシン含有ポリペプチド及び放射性燐（３２Ｐ−ＡＴＰ）で標識された アデノシン三燐酸と反応させ、次いでポリペプチド中に取り込まれた放射性標識 を測定することによる乳房組織画分のチロシンキナーゼ活性の測定は既知である ［■、ヘニプマン、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４９．５１６−５１２ （１９８９）］。

この方法は常時放射能分析と関連しているという欠点を有する、即ち放射能分析 は面倒であり、安全に対する注意が必要であり、且つ大量に連続して行うことは 容易ではない。更に放射性標識されたＡＴＰの使用は測定媒体中のＡＴＰの濃度 を最適状態に選択できないという欠点を有している。更に蛋白質中のセリン残基 のように、試料中に存在し、及び測定には不適当である他の物質の燐酸化により 形成されるかなりなバックグラウンド信号が認められ、そしてこのため結果が変 動し易く、且つしばしば不適切な検出限界をもたらす。

上記のような不都合及び欠点を持たない方法が新規に見出された。この方法は簡 単に及び安全上の危険を冒すことなく実行でき、著しくノイズ及びバックグラウ ンド信号が少なく、従ってそれに対する補正も殆ど必要とせず、既知の方法と全 く同じ感度及び活性、又はそれ以上の感度及び活性を有している。

本文の前段に記載されたチロシンの燐酸化又はホスホチロシンの脱燐酸化を測定 する方法は、ホスホチロシン含有ポリペプチドに対する抗体を使用することによ る燐酸化されたポリペプチドを測定することを特徴としている。

本発明による方法で使用されるホスホチロシンを含むポリペプチドに対する抗体 は、単クローン性又は多クローン性であることができる。単クローン性又は多ク ローン性抗体は記載されている［Ｊ、　Ｙ、　Ｊ、ワンプ（ｆａｎｇ）、Ａｎａ ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１７２．１−７（１９８８）の綜説を参照のこと］。

既知のように多クローン性抗体は特異性が小さく再現性に乏しいという欠点を有 する。

しかし例えばチラミンカラムによるクロマトグラフィーを用いて多クローン性ホ スホチロシン抗体を精製することは可能であり、そのためその作用上挙クローン 性抗体の性質に近い特異的な抗体が得られる。使用される抗体は単一特異性であ ることが好ましい。例えばマウス中で増殖されたホスホチロシンに対する単クロ ーン性抗体、例えばＩＯ２［バーン（Ｈｕｈｎ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ ｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、靭、４４０８−４４１２（１９８７）］が記載さ れており、こうした抗体は商業的に入手することができる。少なくとも５種の異 なった型の免疫原がこれまで単クローン性及び多クローン性抗体を誘発するのに 使用された。これらの型の３種はキャリャアー蛋白質に結合したホスホチロシン の同族体、即ち、ｐ−アゾベンジルホスフェート、ブロモアセチル−〇−ホスホ チラミン及びホスホチロシンそれ自身である。四番目の型の免疫原はホスホチロ シンを含む合成ポリペプチドを含んでおり、及び二番目の型はチロシン残基に燐 酸化された天然源の蛋白質により形成されている。得られる抗体は例えば固定化 されたホスホチラミンによる免疫アフィニティクロマトグラフィーにより精製さ れ、そしていずれの場合も活性及び特異性に関しては同等である［Ｊ、　ＹＪ、 ワンプ、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７２．１−７（１９８８）コ。

ホスホチロシンを含む蛋白質及び抗体との間のような免疫反応を行う方法はそれ 自身既知である［Ｊ、　Ｙ、　Ｊ、ワンプ、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　１７ ２．１−７（１９８８）］。免疫複合体は抗体が例えば＋２５１のような放射性 同位元素（ＲＴＡ）、例えばセイヨウカラシペルオキシダーゼのような酵素（Ｅ ＬＩＺＡ）、発光物質、金粒子、ビオチン等のような標識を備えている場合に測 定できる。免疫複合体を検出する他の好適な方法は免疫原、即ち千ロジン残基を 含むポリペプチドに、抗体を標識する代わりに、上記のような標識、好適には酵 素を含む免疫原を与えることである。他方、免疫複合体は第一の抗体に対する第 二の抗体を用いて測定できる。第一の抗体がマウスの抗ホスホチロシンの場合は 、第二の抗体は例えば、山羊により産生された抗マウス抗体である。該第二の抗 体は類似の標識が付与されていることが好ましい。

既に述べたように酵素標識、放射性標識を有するビオチン、プロティンＡ等のよ うな既知の標識物質は総て原理的に標識として適当である。

金で標識された抗体はその検出が極めて高感度であるから、本発明による方法に おいて都合良（使用できることが見出された。更に銀で信号を増強することによ り一層の感度の増大が達成できる。免疫金（ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ）測定方法及 び銀増強方法の使用はＭ、モアマンズ（Ｍｏｅｒｅｍａｎｓ）等、Ｊ、　Ｉｍｍ −ｕｎｏ、　Ｍｅｔｈ、　７４．３５３−３６０（１９８４）に記載されている 。適当な全標識抗体は商業的に入手することができ、増強に適当な銀試薬も同様 である。（銀）全信号はデンシトメトリーによって定量することができる。

本発明による方法は特に細胞成長の研究及び診断の体系内のチロシンキナーゼの 燐酸化活性を測定するのに都合良（使用することができる。

特に、本方法は蛋白質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）　、即ち、蛋白質基質内のチ ロシンの燐酸化を触媒する酵素の活性の測定に関する。

チロシンを燐酸化するためには燐酸塩源、通常はアデノシン三燐酸塩（ＡＴＰ） 又はグアノシン三燐酸塩（ＧＴＰ）が必要である。これらの燐酸塩、特にＡＴＰ は又本発明による方法に好適に使用される。ＡＴＰの量及び濃度は実際的な必要 量に適応することができ、”Ｐ−ＡＴＰを用いる既知の測定法で得られる量より もかなり高い（例えば１ｍＭ）。

燐酸化反応の基質はチロシン単位を含み、そしてそれに対して燐酸化された形態 で抗体が誘発される任意のポリペプチドであることができる。

ポリペプチドは又チロシン以外のアミノ酸残基、例えばグルタミン酸、アスパラ ギン酸、アラニン等の残基を含むことが好ましい。ランダムなアミノ酸配列を有 し、そしてチロシン残基以外にグルタミン酸残基を含むポリペプチドが容易に燐 酸化され、及び従って抗体により複合体化する（認識される）ことが見出された 。使用し易いポリペプチドは例えばランダム構造を有するポリＧｌｕＮａ／Ｔｙ ｒ　（４：　１）（ＰＧＴ）である。

本発明による方法は、例えば白血病の場合の細胞成長の不規則性の発生に関連し ている可能性がある、チロシンホスファターゼの脱燐酸化活性を測定するために も使用できる。ホスホチロシンの脱燐酸化のための燐酸塩受容体は例えばアデノ シン三燐酸塩（ＡＤＰ）又はグアノシン三燐酸塩（ＧＤＰ）であってもよいが、 水又は他の物質も通常測定媒体中に存在する。燐酸化の場合に環境を維持する際 に、ホスファターゼ反応の基質はそれに対して抗体を誘発できる任意のホスホチ ロシンを含むポリペプチドであってもよい。この目的のためには、キナーゼ測定 に使用できるチロシンを含むポリペプチドで、そのチロシン残基の少なくとも幾 分かが燐酸化されているポリペプチド、例えばグルタミン酸及びホスホチロシン を含む合成ポリペプチドが使用できる。キナーゼ又はホスファターゼの測定は標 準的な媒体中で、及びこうした分析には標準的な条件下で行うことができる。燐 酸化反応は試料、基質及び培地成分の混合物にＡＴＰを添加することにより開始 できる。反応はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び／又はエチレングリコ ールヒス−（２−アミノエチルエーテル）Ｎ、　Ｎ、　Ｎ”　、　Ｎ’−四酢酸 （ＥＧＴＡ）のような阻害剤を添加することにより停止することができる。

次いで燐酸化されたポリペプチドは膜のような固体キャリヤーに付着させること ができ、そして抗体と接触させることができ、その後で免疫複合体が定性的に又 は定Ｉ的に測定される。その代わりに、酵素反応が行われる前にポリペプチド基 質を固体キャリヤーに付着させ、その後で更に上記のような方法に従って測定が 行われる。燐酸化されたポリペプチドを含む混合物は固定化された抗体と接触さ せることができ、次いで第二の抗体で処理され、そして分析される。前述のよう に抗体の代わりにポリペプチドを標識して、固定化された抗体と反応させること も可能である。

本発明による方法を実行するために、追加的抗原配列を組み込んでいるポリペプ チドを利用することもできる。前記の追加抗原に対する追加抗体を使用すること により、免疫複合体のための他の固定法の可能性が得られる。

試験される試料の測定に先立って、既知の活性を有する酵素を用いて得られる結 果から、又はホスホチロシン含量が既知であるホスホチロシン含有ポリペプチド を標準として校正曲線を描くことができる。

本発明は上記の方法で使用するのに適当な試薬の組み合わせ（“キット”）に関 する。本発明によるキットは少なくとも一種のチロシン含有ポリペプチド又はホ スホチロシン含有ポリペプチド及びホスホチロシン抗体を含む蛋白質を含んでい る。該抗体は好適には単一特異性であり、そして例えば単クローン性のマウスの 抗ホスホチロシンである。抗体は例えば全標識により標識することもできる。キ ットは又第−の抗体に対する第二の抗体、及びでき得れば更に全標識の増強剤と しての銀等のような免疫複合体を測定するための試薬を含んでいてもよい。

更にキットはその中で測定を行うことができる緩衝媒体及び燐酸化（脱燐酸化） 反応の阻害剤をも含むことが好都合である。更にキットはポリペプチドを固定化 するためのキャリヤー、例えばポリ弗化ビニリデン膜を含むこともできる。

キットはキナーゼ活性を測定するために極めて適当であり、チロシン含有ポリペ プチド及び又ＡＴＰのような燐酸塩供与体を含んでいる。キットは又ホスファタ ーゼ活性の測定を目的としていてもよ（、その場合はホスホチロシン含有ポリペ プチドを含んでいる。

好適にはキットは上記の方法を実行するための取扱い説明書も含んでいる。

実施例１ 物質： ポリ二弗化ビニリデン（ＰＶＤＦ）移動膜［インモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ ）コはミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）［ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）、 Ｍ＾、ＵＳ＾］から購入した：牛血清アルブミン（ＢＳＡ）及び２８，５００の 平均分子量を有するポリグルタメート−チロシン（ＰＧＴ）はシグマ（Ｓｉｇｍ ａ）［セントルイス（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ）、ＭＯ１ＵＳＡ］から入手した。［ ７−３２Ｐ］　ＡＴＰ　（１０−４ＱＣｉ／ｍモル）はニューイングランド・ニ ュクレア（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）　［バークレー（Ｂａｒｋ ｅｌｅｙ）、ＣＡ、ＵＳＡ］製であり、未標識のＡＴＰはベーリンガ−（Ｂｏｅ ｈｒｉｎｇｅｒ）　［７ンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ＦＲＧ］製であった。

銀増強法を用いる免疫全染色法の試薬はジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）　［ベー ルス（Ｂｅｅｒｓｅ）、ベルギー］製であった。ホスホチロシン残基に対する単 クローン性抗体（モノクロナールＩＧ２）はオンコジーン・サイエンス（Ｏｎ− ｃｏｇｅｎｅ　５ｃｆｅｎｃｅ）　［ｖンハセット（Ｍａｎｈａｓｓｅｔ）、Ｎ Ｙ、　ＵＳＡ］製であった。

総ての他の試薬は分析用の純度のものであった。

プロティンキナーゼ（ＰＴＫ）活性の原料：正常なヒトの乳房組織、良性の乳房 腫瘍及び悪性の乳癌の細胞質ゾル抽出物をＰＴＫ活性の原料として使用した。肥 大を有する若い患者からの乳房組織試料は、乳房縮小形成術を行う際に得られた 。組織学的検査と見なされた。手術後に得られた生検材料は直ちに一８０℃に冷 却され、使用されるまで貯蔵された。細胞質ゾル抽出物は０．２５Ｍスクロース 、１０ｍＭＭｇＣｌ□、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭジイソプロピルフルオロホス フェート、１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオライド、１ｍＭジチオトレイ トール及び０．５ｍｇ／ｍＩアプロチニンを含むｐＨ７，４の１０ｍＭトリス− ＨＣｌ中で、腫瘍細胞をホモゲナイズすることにより製造された。砕片及び核は ４℃で１０分間８００ｇで遠心することにより除去された。細胞質ゾルは超遠心 （１５０，０００ｇ、３０分間４℃）により単離されて、分析の際にＰＴＫ活性 の原料として使用された。

トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いる濾紙分析によるＰＴＫ活性の測定：は５０ｍ Ｍ）リス／ＨＣＬ　ｐＨ７，５，２０ｍＭ酢酸Ｍｇ、５ｍＭＮａＦ、０．２ｍＭ 　ＥＤＴＡ、０．８ｍＭ　ｘチレンジオキシービス（エチレンニトリロ）四酢酸 （ＥＧＴＡ）　、３０μｍ　Ｎａ５ＶＯ４，１ｍＭジチオトレイトール、１６７ μｍＰＧＴ　（５ｍＭチロシン残基に相当）及び３μｇの試料蛋白質を含む合計 ６４μｍの容積中で２０℃で測定された。反応は０．７５Ｃｉ／ｍモルの比放射 能を有する５０μＭの［３２Ｐ］　ＡＴＰを添加することにより開始された。１ ２分後に１７．５ｍＭＡｔＰ及び７０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む２５μｍの溶液を添 加することにより反応を停止させた。反応の停止後、混合物のアリコートをワッ トマン（Ｗｈａｔｍａｎｎ）　３　ＭＭ濾紙上に置き、ＴＣＡで沈澱させ、１０ ％のＴＣＡ及び１００ｍＭ　ＰＰ、で徹底的に洗浄した。濾紙円板をエタノール ／エーテル（１／１）　、及び次いでエーテル中で洗浄し、空気中で乾燥した。

標識の取り込みは液体シチレーション計数により定量的に測定された。

チロシンキナーゼ活性は、ＰＧＴ基質の不存在の時に上記のようにして測定され た内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）蛋白質のバックグラウンド燐酸化を差し引く ことにより計算された。ＰＴＫ活性はｐモルＡＴＰ／分／ｍｇ蛋白質として表示 された。蛋白質含量はローリ−（Ｌｏｖｒｙ）等［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩ ｌｌ。

燐酸化されたＰＧＴ標準物は１．６ｍｇＰＧＴ及び５００ｇＭＡＴＰを含む乳癌 から得られた細胞質ゾル蛋白質２００μｇを、１．２ｍ］の容積のチロシンキナ ーゼ緩衝液（上記参照）中で４℃で２２時間インキュベートすることにより製造 された。燐酸化は２５ｍＭのＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ　（最終濃度）を添加すること により停止させた。混合物を小さいアリコートに分割し、標準物として使用され る時まで一７０℃で貯蔵された。

［γ−３２Ｐ］　ＡＴＰでの燐酸化反応は、ＴＣＡ濾紙測定法（上記参照）に従 って取り込まれた燐酸塩を定量的に測定するために、同一条件下で平行して行わ れた。取り込みは１モルのチロシル残基当たり３．５ｍモルとして計算された。

本発明によるＰＴＫ活性の測定［斑点プロット（ｄａｔ−ｂｌｏｔ）分析：ＰＴ Ｋ活性は、５０ｍＭ　トリス／ＭＣＩ、ｐＨ７，５，２０ｍＭ酢酸Ｍｇ、５ｍＭ 　ＮａＦ、０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．８ｍＭ　ＥＧＴＡ。

３０　ａｍ　Ｎ　ａ　３ＶＯａ、３００ｇＭ　ＡＴＰ、５０μｍＰＧＴ　（１， ８ｍＭＴｙｒ残基に相当）及び３μｇの試料蛋白質を含む３０μｍの混合物中で 測定された。３７℃で１時間インキュベート後、１７５ｍＭＥＤＴＡ及び１７５ ｍＭ　ＥＧＴＡの溶液を５μｍ添加して反応を停止させた。混合物を１４０μｌ の水で希釈し、その後２５μｌの量の混合物を斑点プロット装置［バイオ−ドツ ト（Ｂｉｏ−Ｄｏｔ）装置、バイオラド（Ｂｉｏ−ｒａｄ）、リッチモンド、Ｃ Ａ、　ＵＳＡ］を利用してＰＶＤＦ膜上に置いた。次いでホスホチロシン残基が 免疫金−銀染色法を用いて検出された。占有されなかった膜の結合部位をブロッ クし、第一抗体（ＩＧ２抗ホスホチロシン、２μｇ／ｍｌ）で精査し、夫々の試 薬の製造者（ジャンセン、ベルギー）の説明書に従って全標識第二抗体（山羊抗 マウスＩｇＧ）の銀増強が行われた。膜を空気中で乾燥し、ベックマン（Ｂｅｃ ｋｍａｎ）　ＣＤ　Ｓ　２００デンントメーター中で５２０ｇｍで斑点を走査す ることにより、免疫金−銀信号を定量的に測定した。ＰＴＫ活性は燐酸化された ＰＧＴの標準校正曲線から計算された。活性はｐモルＡＴＰ／分／ｍｇ蛋白質と して表示された。

結果： ホスホチロシル残基校正曲線は、燐酸化されていないＰＧＴ及び燐酸化されたＰ ＧＴを種々の比率で混合することによって得られた。合計で５．７μｇの（Ｐ） −ＰＧＴを含む５μＩの量がＰｖＤＦ膜上に置かれるが、これらの量はＰＫＴ測 定に使用された量と対応するものである。

免疫全標識の銀染色及びデンシトメトリーによる定量的測定は、少な（とも２０ μモルのホスホチロシンまでは直線的な対応を与えている（図１）。燐酸化され ていないＰＧＴのバックグラウンド信号は認められなかった。本方法の感度は１ ．０μモル以下のホスホチロシンの定量的測定が可能な程度である。

図１に示された校正曲線は時間及び試料蛋白質の関数として乳癌の細胞質ゾル画 分のＰＴＫ活性を定量的に測定するために使用された。図２は反応が２．５時間 までは直線的な変化を有することを示している。対照試験では、ＥＤＴＡ／ＥＧ ＴＡ　（各々２５ｍＭ）の存在において試験が行われた。実際に何等の信号も得 られず、燐酸化反応がこれらの試薬の添加によって完全に遮断されることを示し た。

試料蛋白質の量の変化は一回の分析光たり最高的５μｇの試料蛋白質までは酵素 活性と直線的な変化を有することを示した（図３）。試料の量がそれより多いと 、信号は横ばい状態になり始める。信号が添加されたＰＧＴの燐酸化から発する ものか、又はチロシンが燐酸化された内因性蛋白質から出るものか、又は免疫金 −銀染色中の非特異的吸着によるかを決定するために、ＰＧＴの不存在において 平行して対照試験が行われた。大量の試料蛋白質を用いた場合（−回の分析当た り〉１０μｇ）のみ顕著なバックグラウンド染色が認められており、これは信号 における内因性蛋白質の燐酸化及び非特異的吸着の双方の寄与が定量的に無視で きることを示している。

乳癌に由来する酵素による動力学的研究を基礎として最適な基質濃度が測定され た。Ｋｍを測定するために、ＰＧＴ校正曲線が：未燐酸化ＰＧＴと共に合計の（ Ｐ）−ＰＧＴ量を調節することなく燐酸化されたＰＧＴ標準物の量のみを変える ：という他の方式で描かれた。この方法で得られた校正曲線は本質的に図１に示 された曲線と同一であり、このことから基質に対する膜の結合的性質はこれらの 試験において決定的な影響を与えるものではないことが明らかである。酵素はＡ ＴＰ及びＰＧＴの両者に対して、ＡＴＰの場合に、＝７５±１３μｍ及びＰＧＴ の場合に、＝１７５±３９μｍ（チロゾル残基の濃度として表示）を有し、通常 のミカエリス−メンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ）動力学を示した 。従って分析の場合、３００μＭ　ＡＴＰ及び１．８ｍＭ　Ｔｙｒ　（５０μＭ のＰＧＴに相当）が最適な濃度として選択された。

引き続く一連の実験において、慣用の濾紙分析を本発明による新斑点プロット分 析と比較した。細胞質ゾル画分を正常な乳房組織（ｒ＋＝２）、良性の乳房腫瘍 （ｎ＝３）及び悪性の乳癌（ｎ＝５）から調製し、ＰＴＫ活性について研究した 。二種の測定方法の比較は図６に示されている。

０．９８の相関係数を有する直線的相関が得られた。本発明の方法により測定さ れた活性は濾紙分析の場合よりも約４倍高かった。この差は主としてインキュベ ーション温度の差によるものであり、基質濃度の差には僅かしかよらない（結果 は示されていない）。実際的な理由として［３２Ｐｌ　ＡＴＰを用いるインキュ ベーションは２０℃で行われ、−力木発明の方法によるインキュベーションは３ ７℃で行われた。両分析法の低濃度検出限界は同程度である。しかし濾紙分析法 の感度は内因性蛋白質の（恐らく主としてセリン残基による）バックグラウンド 燐酸化の程度に大きく依存した。上記のように、本発明による測定においてはバ ックグラウンド信号は認められなかった。

実施例２ チロシンホスファターゼ活性の測定 ヒトの顆粒球から得られた２００μｇの細胞質ゾル蛋白質を０．５ｍｇのＰＧＴ 及びＱ、５ｍＭのＡＴＰと共に１．２ｍｌの容積のチロシンキナーゼ緩衝液（実 施例１参照）中で２０℃で２２時間インキュベートした。１１０μｌの６Ｍ　Ｔ ＣＡを添加することにより燐酸化を停止させた。４℃で１時間後、生成した蛋白 質の沈澱を遠心して（５分間、１２、　ＯＯＯＸ　ｇ）除去した。ペレットを更 に０．６Ｍ　ＴＣＡで三回洗浄した。最終的なペレットを１００μｌのｌＮ　Ｎ ａＯＨ中に溶解し、その後２５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭ のヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、ｐＨ７，０、で２ｍｌとした。取り込まれた燐酸塩を 測定するために、［”Ｐ］　ＡＴＰを用いる燐酸化反応がＴＣＡ濾紙法（実施例 １参照）に従って同一の条件下で平行して行われた。取り込みはチロシル残基１ モル当たり０．８ｍモルと計算された。

試料のチロシンホスファターゼ活性（例えば白血病細胞の全体的な細胞抽出物） は５０ｍＭのヘベス、ｐＨ７，０，２５ｍＭβ−メルカプトエタノール、及び１ ５μｇの燐酸化されたＰＧＴ　（２０μモルホスホチロシル残基に相当）を含む ３０μｍの混合物中で測定された。反応は３７℃で３０分間内に利用可能なホス ホチロシル残基の量の３／４以内を脱燐酸化できる量の試料蛋白質を添加するこ とによって開始された。

３７°Ｃで３０分間インキュベーション後、０．２５ｍＭのＮａ３ＶＯ４の溶液 ５μｍを添加することによって反応を停止させた。５μＩの量の混合物をＰＶＤ Ｆ膜に移し、実施例１によるＰＴＫ測定法に記載されたようにしてホスホチロシ ン残基の量を定量した。

ホスホナロシン　（ｐモーｆし） 補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成３年９月２日

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．被検物質を夫々チロシン又はホスホチロシンを含むポリペプチド及び夫々燐 酸塩源又は燐酸塩受容体と接触させ、次いで燐酸化されたポリペプチドを分析す ることによる物質のチロシン燐酸化又はホスホチロシン脱燐酸化活性を測定する 方法において、燐酸化されたポリペプチドがホスホチロシンを含むポリペプチド に対する抗体を使用することにより測定されることを特徴とする方法。
2. ２．抗体が単一特異性であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. ３．抗体が標識されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
4. ４．燐酸化されたポリペプチドを分析するために、第二の標識された抗体も使用 されることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
5. ５．標識された抗体が金で標識され、その除金標識抗体の信号が随意銀で増強さ れることを特徴とする請求項３又は４に記載の方法。
6. ６．チロシン又はホスホチロシンを含むポリペプチドが好適には酵素で標識され ることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
7. ７．一種又は多種の蛋白質のチロシンキナーゼの燐酸化活性が測定されることを 特徴とする請求項１−６に記載の方法。
8. ８．アデノシン三燐酸塩が燐酸源として使用されていることを特徴とする請求項 １−７に記載の方法。
9. ９．チロシン含有ポリペプチドが合成ポリペプチドであることを特徴とする請求 項７又は８に記載の方法。
10. １０．ポリペプチドが又グルタミン酸残基を含むことを特徴とする請求項９に記 載の方法。
11. １１．ポリペプチドがランダムなアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項 ９又は１０に記載の方法。
12. １２．一種又は多種のチロシンホスファターゼの脱燐酸化活性が測定されること を特徴とする請求項１−６のいずれかの項に記載の方法。
13. １３．少なくとも一つのチロシン含有ポリペプチド及び／又はホスホチロシン含 有ポリペプチド、及びホスホチロシンを含むポリペプチドに対する抗体を含む、 被検物質のチロシン燐酸化又はホスホチロシン脱燐酸化活性を測定するためのキ ット。
14. １４．抗体が単一特異性であることを特徴とする請求項１３に記載のキット。
15. １５．ポリペプチド又は抗体のいずれかが標識物質を備えていることを特徴とす る請求項１３又は１４に記載のキット。
16. １６．ホスホチロシンを含むポリペプチドヘの抗体に対する標識された抗体をも 含むことを特徴とする請求項１３又は１４に記載のキット。
17. １７．チロシン又はホスホチロシンを含有するポリペプチドが合成ポリペプチド であることを特徴とする請求項１３−１６のいずれかの項に記載のキット。
18. １８．ポリペプチドが又グルタミン酸を含むことを特徴とする請求項１７に記載 のキット。
19. １９．ポリペプチドがランダムなアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項 １７又は１８に記載のキット。
20. ２０．ポリペプチド及び／又は抗体を固定化するためのキャリヤーをも含んでい ることを特徴とする請求項１１−１９のいずれかの項に記載のキット。
21. ２１．チロシン含有ポリペプチド及び又ＡＴＰのような燐酸塩源をも含んでいる ことを特徴とする請求項１１−２０のいずれかの項に記載のキット。
22. ２２．測定を行うのに適当な培地及び阻害剤のような他の成分をも含んでいるこ とを特徴とする請求項１１−２１のいずれかの項に記載のキット。
23. ２３．請求項１−１２のいずれかの項に記載の方法を実行するための説明書をも 含んでいることを特徴とする請求項１１−２２のいずれかの項に記載のキット。