EA004880B1

EA004880B1 - Набор для анализа обратной транскриптазы и его применение

Info

Publication number: EA004880B1
Application number: EA200101191A
Authority: EA
Inventors: Клас Келландер; Ингвар Петтерссон; Симон Гроновитз
Original assignee: Кавиди Тек Аб
Priority date: 1999-06-24
Filing date: 2000-06-16
Publication date: 2004-08-26
Also published as: CN1218047C; WO2001001129A2; EP1185705A2; WO2001001129A3; BRPI0011812B1; AU6150300A; BRPI0011812A; DE60013124T2; SE9902410D0; DE60013124D1; ES2225179T3; BRPI0011812B8; ATE274070T1; AU764566B2; US6849406B1; JP2003503073A; MXPA01012951A; JP4808345B2; EA200101191A1; PT1185705E

Abstract

Описан набор для анализа обратной транскриптазы (ОТ) в биологических образцах, включающий связанную(ые) с твердой фазой матрицу (матрицы), представляющую(ие) собой полирибоадениловую кислоту (prA) и/или полидезоксиадениловую кислоту (pdA), приготавливаемую(ые) путем приведения в контакт твердой фазы на основе полистирола со связывающим раствором, содержащим 1-метилимидазол; и адаптированные к типу ОТ компоненты анализа, выбранные из буфера, иона двухвалентного металла, хелатирующего агента, полиамина, ингибитора РНКазы, восстанавливающего агента, соли, стабилизирующего агента и детергента, а также дезоксинуклеотидтрифосфата, праймера, защитного агента и концентрированного буфера для отмывания; а также, возможно, лиофилизированный эталонный фермент (ферменты) и, возможно, моноклональное анти-BrdU-антитело, конъюгированное со щелочной фосфатазой, буфер для субстрата щелочной фосфатазы и субстрат щелочной фосфатазы, а также письменные инструкции по применению этого набора для анализа. Раскрыто применение набора для анализа для качественного и количественного анализа активности ОТ в биологическом образце, возможно, с последующей оценкой статуса расстройства или заболевания, связанного с активностью ОТ, на основании результата анализа активности ОТ.

Description

Настоящее изобретение относится к набору для анализа обратной транскриптазы (ОТ) для анализа активности ОТ в биологических образцах. Изобретение также относится к применению набора для анализа ОТ для качественного и количественного анализа активности ОТ в биологическом образце, возможно с последующей оценкой статуса расстройства или заболевания, связанного с активностью ОТ, на основании результата анализа активности ОТ.

Предпосылки изобретения

Обратная транскриптаза (ОТ) является ключевым ферментом, ответственным за синтез ДНК с вирусной РНК, для всех ретровирусов, включая вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) (ВаШтоте - 70, Тетш - 70, Ватге-8шои881 с! а1. - 83). В этот процесс вовлечены три различные ферментативные активности: синтез первой нити ДНК, деградация нити вирусной РНК в ДНК/РНК-гибриде и синтез второй нити ДНК (для обзора см. ОоГГ).

Ретровирусы могут существовать либо в экзогенной или в эндогенной форме, либо в обеих формах. Главное различие состоит в том, что эндогенный ретровирус проник в зародышевую линию и, следовательно, его ДНК присутствует во всех клетках организма, в противоположность экзогенному ретровирусу, который способен проникать только в клетки с подходящим рецептором для данного специфичного вируса. Эндогенные ретровирусы (еибодеиоик ге1гоуйи5С5. ЕКУ) у людей называют НЕКУ. Интегрированная провирусная форма эндогенного ретровируса имеет такую же фундаментальную структуру, как форма экзогенного ретровируса. Считают, что интеграция некоторых НЕКУ в зародышевую линию произошла от 35 до 45 миллионов лет назад. Эти ретровирусные последовательности составляют 1% генома млекопитающих и, следовательно, также генома человека. Таким образом, они присутствуют во всех клетках человека и наследуются в соответствии с обычными законами Менделя.

В человеческом геноме присутствует множество семейств НЕКУ. Число копий НЕКУ на гаплоидный геном человека варьирует между одной копией и тысячами копий для различных семейств. Самая высокая консервативность нуклеотидной последовательности обнаружена в гене ро1. Этот признак использовали для того, чтобы установить взаимосвязь между семействами НЕКУ. Хотя многие НЕКУ и их открытые рамки считывания (ОКЕ) являются дефектными, в нескольких типах тканей обнаружены транскрипты мРНК из большинства семейств НЕКУ (обзор приведен в ХУПкткоо е! а1. 1994, ЬеШМбксй апб 8е1Гаг111 1996). Кроме того, вирионные частицы с активностью полимеразы и протеазы наблюдали в нормальных человеческих плацентах, ооцитах, тератокарциномах, тканях карциномы молочной железы и в слюнных железах некоторых аутоиммунных пациентов (об зор приведен в ХУПкткоо е! а1. 1994, Игиоуйг апб Митрйу 1996, Тофек е! а1., 1997). Стрессовые состояния, подобные гипоксии и УФоблучению, также могут индуцировать экспрессию НЕКУ, как наблюдали для инфекционных ретровирусов (обзор приведен Эиу1с 1995).

Несколько НЕКУ были локализованы в точечных разрывах хромосомы в пределах генома (Όί СпкЮГаоо е! а1., 1995, Мееке е! а1., 1996). Рекомбинация между последовательностями НЕКУ, локализованных в различных хромосомных сайтах, может вызывать геномные перестройки, включая транслокации, инсерции, дупликации и делеции. Такие рекомбинационные события ответственны за генерирование геномной нестабильности, которая является важным признаком эволюции. Кроме того, для многих опухолей характерны специфичные геномные перестройки, которые, как считают, играют ключевую роль в образовании опухолей. Эта взаимосвязь между присутствием инфекционных ретровирусов и развитием опухолей у хозяина позволяет предположить, что НЕКУ связаны с раком. Вирионные частицы и антигены, относящиеся к ретровирусам, часто обнаруживают в первичных образцах опухолей также в отсутствие инфекционных вирусов (\Уе188 1 984, ЕаГГ е! а1., 1992). Кроме того, антитела, направленные на ретровирусные белки, были обнаружены в сыворотках пациентов, больных раком (\Уе188 1 984). Более того, обнаружено, что последовательности НЕКУ являются высоко экспрессирующими в определенных клеточных линиях опухолевого происхождения (обзор приведен в Ьо^ет е! а1. 1996).

Эндогенные провирусы могут также рекомбинировать с экзогенными вариантами (МатбиеШ е! а1. 1990). Новые рекомбинанты получают измененный фенотип. Это может вносить вклад в быструю эволюцию новых инфекционных ретровирусов. Главным образом подвергается воздействию ген еиу, поскольку мутации в других участках могут быть разрушительными и несовместимыми с образованием частицы. Обнаружено, что некоторые ретровирусные штаммы являются симбиотическими у одного вида и патогенными у другого. Эти открытия указывают на сложную проблему при ксенотрансплантациях. Симбиотические ЕКУ, предоставляемые трансплантированными тканями, могут быть патогенными у нового хозяина. Они могут обладать способностью взаимодействовать с рецепторами клеточной поверхности, необходимыми для ретровирусного слияния, присутствующими на клетках нового хозяина. Кроме того, в пределах генома реципиента ткани может происходить рекомбинация с эндогенными ретровирусными последовательностями и создавать новые инфекционные ретровирусы, которые могут распространяться в популяции. Как эндогенные, так и экзогенные ретровирусы могут вносить вклад в вертикальную и горизон3 тальную передачу генетического материала в пределах вида и между видами и обеспечивать механизмы для эволюции новых патогенных агентов.

Обнаружено, что как инфекционные ретровирусы, так и ЕКУ проявляют иммунорегуляторные функции (обзор приведен в Кпед е! а1. 1992). Эти эффекты изучены главным образом у мышей, но имеются некоторые наблюдения, которые подтверждают существование подобных механизмов для НЕКУ. Если последовательности НЕКУ могут нарушать регуляцию иммунного ответа, они могут вызывать аутоиммунные заболевания. Эти эффекты могут либо прямо модулироваться белками НЕКУ, либо косвенно посредством воздействия на экспрессию молекул, вовлеченных в иммунный ответ. Белки НЕКУ могут быть экспонированы на клеточной поверхности. Потеря аутотолерантности по отношению к этим белковым последовательностям может вызывать аутоиммунные реакции против клеток, представляющих эти белки. Антитела, продуцируемые вслед за ретровирусной инфекцией, могут перекрестно реагировать с белками, кодируемыми НЕКУ, и быть ответственными за потерю толерантности. Этот феномен наблюдали у трансгенных мышей (ΖίπΕο паде1 е! а1. 1990). Кроме того, потерю толерантности к епу-белкам, кодируемым ЕКУ, наблюдали у мышей, у которых спонтанно развивался аутоиммунный гломерулонефрит (обзор приведен в Кпед е! а1. 1990 и 1992). Некоторые наблюдения на людях могут подтвердить существование перекрестно-реактивных антител между эндогенными и экзогенными ретровирусными белками. Антитела против ретровирусных белков обнаружены в сыворотках аутоиммунных пациентов (обзор приведен в Кпед е! а1. 1992, υτηονίΐζ апй МигрЬу 1996). В некоторых случаях было обнаружено, что сыворотки реагировали также с экзогенными ретровирусами. Ретровирусные инфекции были связаны с началом аутоиммунных заболеваний (обзор приведен в Кпед е! а1. 1990 и 1992). Кроме того, инфекционные ретровирусные белки проявляют частичное сходство с аутоантигенами, которые являются частыми мишенями для аутоантител (обзор приведен в Кпед е! а1. 1992). Они могут запускать аутоиммунные ответы, направленные на такие мишени, механизм, называемый молекулярной мимикрией. Однако сходства белков НЕКУ с известными аутоантигенами еще не обнаружено.

Анализы на активность ОТ стали общепринятыми методиками обнаружения и количественного определения ретровирусов в клеточных культурах. Вместе с анализами на антиген р24 их используют в качестве подтверждающих тестов для выделения ВИЧ (1аск§оп - 88, Оир1а 87). ОТ также представляет собой одну из главных мишеней при попытке найти эффективные антивирусные агенты против ВИЧ. Общеприня тый анализ активности ОТ проводят, используя анализ растворимого фермента с применением искусственной конструкции матрица - праймер и меченного тритием дезоксинуклеотидтрифосфата в качестве нуклеотидного субстрата (Ва1йшоге - 71, Бее е! а1. - 87). Эта прежняя система была основана на обнаружении включения радиоактивности в РНК/ДНК-гибриды, осаждаемые трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Применение испускающих бета-излучение нуклеотидов требует использования сцинтилляционных жидкостей для обнаружения радиоактивности, что часто приводит в результате к плохому воспроизведению вследствие проблем гашения. Этот способ является относительно трудоемким, и его нелегко адаптировать к широкомасштабному скринингу большого числа образцов. Он также является весьма чувствительным к воздействиям мешающих факторов в образцах.

В течение последнего десятилетия интенсивного исследования на ВИЧ анализ ОТ усовершенствовался путем использования различных методик. Введение субстрата, меченого I¹²⁵, привело к повышенной чувствительности и исключило гашение и использование сцинтилляционных жидкостей (№ити11ег е! а1. - 90). Введение матриц или праймеров, сшитых с твердыми фазами, упростило разделение между субстратом и продуктом, исключило необходимость осаждения ТХУ и привело к «анализу ОТ в одной пробирке» (ΟΐΌηο\νίΙζ е! а1. - 90, ЕР 0447442 В1).

В последнее время использование радиоактивности в качестве метки в анализе ОТ исключено благодаря использованию модифицированных нуклеотидных оснований, содержащих либо антигенные эпитопы, либо структуры с высоким сродством к желаемым лигандам. Наличие этих эпитопов или структур во вновь синтезированном РНК/ДНК-гибриде затем используют для связывания антител или лигандов, конъюгированных, например, с ферментами иммуноферментного твердофазного анализа (ЕЫ8А, еηζуте-1^ηкеά 1ттипо8ОгЬеп! апа1у818). Количество связанных ферментов ЕЫ8А затем определяют во вторичном ферментативном анализе.

Рог81тапп е! а1. 1991 использовали 5бромдезоксиуридинтрифосфат (Вгйи) в качестве нуклеотидного субстрата в анализе ОТ. Количество включенного ВгйиМР определяют на второй стадии в иммунологическом анализе, используя моноклональные анти-Вгйиантитела, конъюгированные со щелочной фосфатазой.

ЕЬег1е и К. 8е1Ь1 1992 измеряли включение дУТФ (дезоксиуридинтрифосфата), меченного дигоксигенином, во вновь синтезированную

ДНК вместо радиоактивно меченного дТТФ (дезокситимидинтрифосфата). Чтобы иметь возможность осуществить отделение не включенных нуклеотидов от вновь синтезированной

ДНК, в реакционную смесь добавляют также дУТФ, меченный биотином. После обратной транскрипции вновь синтезированную дважды меченую ДНК иммобилизуют на лунках ЕЫ8А, покрытых стрептавидином, и оценивают фотометрическим способом путем связывания антидигоксигенин-антител, конъюгированных с пероксидазой. Эта методика составила основу набора для анализа ОТ, который имеется в продаже от Воейпидет Маиийет.

игаЬе с1 а1. 1994 разработали нерадиоактивный анализ ОТ, основанный на включении биотин-дУТФ в иммобилизованную конструкцию обТ/ргА. Количество включенного нуклеотидного субстрата измеряют фотометрическим способом после добавления щелочной фосфатазы, конъюгированной со стрептавидином. Ближайший аналог для настоящего изобретения разработали Еккйаиб е1 а1. 1996. В данном анализе полирибоадениловая кислота (поли(гА)), ковалентно связанная с лунками 96-луночного титрационного микропланшета, служит в качестве матрицы для включения ВгбУМФ во время стадии обратной транскрипции. Количество ВгбУМФ, включенного в ДНК, затем определяют иммунологически согласно методике, подобной использованной Ройкшаии е1 а1. 1991. Этот способ доступен в виде наборов для определения ОТ от Сау1б1 Теей, иррка1а, 8\\'ебеп.

Другим принципом для определения активности ОТ, разработанным для продажи ΝΕΝ (№\ν Еид1аиб Лис1еаг, И8А), является использование специфичных для последовательности зондов для обнаружения вновь синтезированной кДНК. В этой ферментативной реакции используют гетерополимерную молекулу РНК с олигонуклеотидным праймером из 20 оснований, комплементарным последовательностям РНК вблизи 5'-конца. Полная нить кДНК продуцируется во время реакции обратной транскрипции. После гидролиза РНК-матрицы кДНК гибридизуют с двумя различными олигонуклеотидными зондами, зондом захвата и зондом обнаружения. Зонд захвата используют для связывания кДНК с лункой микропланшета. Зонд обнаружения конъюгируют с пероксидазой хрена, которая после отмывки для удаления неиспользованного нуклеотидного субстрата и свободных зондов дает цветную реакцию.

Чувствительность обнаружения в этом последнем типе анализа можно повысить путем полимеразной цепной реакции амплификации кДНК, продуцируемой реакцией ОТ. После этого амплифицированную ДНК можно обнаружить различными типами меченых зондов (811усг 93, Неиете 1995, И85817457, И85849494).

Для некоторых применений изучения активности ОТ в биологических образцах желательным является использование анализа ОТ, дающего количественные результаты. Такие применения включают в себя мониторинг заболевания или расстройства, в котором нужно сравнивать результаты анализа ОТ из измерений, сделанных в различные промежутки времени, и диагностику заболеваний или расстройств, где уровень активности ОТ по сравнению со стандартными уровнями показывает, находится ли пациент в группе риска или действительно страдает рассматриваемым заболеванием или расстройством.

В некоторых случаях желательно использовать анализ, который является чувствительным, насколько возможно, то есть обладает способностью измерять настолько малые количества активности ОТ, насколько возможно, в биологических образцах, так чтобы наличие и величину активности ОТ можно было соотнести с расстройствами и заболеваниями на ранней стадии.

Описание изобретения

В настоящем изобретении предложен анализ ОТ, который является простым в использовании для целей скрининга и который является очень чувствительным к активности ОТ.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к набору для анализа обратной транскриптазы (ОТ), который включает в себя одну или несколько упаковок, содержащих связанную(ые) с твердой фазой матрицу (матрицы), представляющую(ие) собой полирибоадениловую кислоту (ргА) и/или полидезоксиадениловую кислоту (рбА), приготавливаемую(ые) путем приведения в контакт твердой фазы на основе полистирола со связывающим раствором, содержащим 1-метилимидазол и ргА и/или рбА, с последующими инкубацией, промывкой буфером для отмывания, высушиванием и упаковкой. Этот набор содержит также адаптированные к типу ОТ отдельно упакованные компоненты анализа, выбранные из группы, состоящей из смеси, или взятых по отдельности, буфера, рН^7-8, иона двухвалентного металла, хелатирующего агента, полиамина, ингибитора РНКазы, восстанавливающего агента, соли, стабилизирующего агента и детергента, а также из смеси, или взятых по отдельности, лиофилизированного дезоксинуклеотидтрифосфата, праймера, защитного агента и концентрированного буфера для отмывания; а также письменные инструкции по применению этого набора для анализа. Возможно, этот набор содержит лиофилизированный эталонный фермент (ферменты). Возможно, этот набор дополнительно содержит компоненты системы обнаружения, содержащей лиофилизированное моноклональное анти-Вгби-антитело, конъюгированное со щелочной фосфатазой, буфер для субстрата щелочной фосфатазы и субстрат щелочной фосфатазы, такой как таблетки п-НФФ (паранитрофенилфосфата).

В предпочтительном воплощении набора для анализа ОТ согласно настоящему изобретению упакованная(ые) связанная(ые) с твердой фазой матрица (матрицы) представляет(ют) соΊ бой связанную(ые) с титрационным микропланшетом матрицу (матрицы), приготавливаемую(ые) путем приведения в контакт каждой лунки планшета с аликвотой связывающего раствора, который содержит 100 мМ 1метилимидазола, рН=5-7, и 0,5-2 мг/мл ргА и/или рбА, с последующими инкубацией при температуре 10-60°С в течение 0,5-10 ч и промывкой каждой лунки для удаления 1метилимидазола буфером для отмывания, который содержит бис-трис-пропан, рН=5-7, с последующими высушиванием и упаковкой планшетов.

В особенно предпочтительном воплощении набора для анализа ОТ согласно настоящему изобретению упакованная(ые) связанная(ые) с титрационным микропланшетом матрица (матрицы) представляет(ют) собой матрицу (матрицы), приготавливаемую(ые) путем приведения в контакт в каждой лунки планшета со 100 мкл связывающего раствора, который содержит 100 мМ 1-метилимидазола, рН=6,25, и 1 мг/мл ргА и/или рбА, с последующими инкубацией при комнатной температуре в течение =2 ч, промывкой каждой лунки 2x300 мкл буфера для отмывания, который содержит 10 мМ бистрис-пропана, рН=6,25, высушиванием планшетов при 37°С в течение =25 мин и помещением этих планшетов в пакеты из фольги и вакуумным запаиванием этих пакетов.

В еще одном воплощении набора для анализа ОТ согласно настоящему изобретению компоненты анализа выбраны из группы, состоящей из буферов Трис и Нерек, рН=7-8, ионов двухвалентных металлов Мд²⁺ и Мп²⁺, хелатирующих агентов этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и этиленгликоль-бис(в-аминоэтиловый эфир)-^^№,№-тетрауксусной кислоты (ЭГТА) и полиаминов спермина и спермидина, ингибиторов РНКазы гепаринсульфата и декстрансульфата, восстанавливающих агентов дитиотреитола (ДТТ), дитиоэритритола (ДТЭ) и глутатиона, солей Ν;·ιΟ1 и КС1, стабилизирующих агентов сыворотки новорожденных телят (СНТ) и бычьего сывороточного альбумина БСА, детергентов Твин 20 и Тритон Х-100, дезоксинуклеотидтрифосфата ВгбИТР, праймера олиго бТ или олиго 6Ν, где N представляет собой иной аналог Т, чем и, и защитных агентов АТФ, ГТФ и ЦТФ.

Настоящее изобретение также относится к применению набора для анализа согласно настоящему изобретению для качественного и количественного анализа активности ОТ в биологическом образце, например в биологическом образце, который выбран из клеточных экстрактов и биологических жидкостей, таких как плазма, сыворотка, спинномозговая жидкость, синовиальная жидкость и плевральная жидкость.

В предпочтительном воплощении вслед за применением согласно настоящему изобретению следует оценка статуса расстройства или заболевания, связанных с активностью ОТ, на основании результата анализа активности ОТ.

Далее настоящее изобретение будет проиллюстрировано ссылкой на графические материалы и более подробным описанием воплощений, но эти воплощения не следует рассматривать как ограничивающие объем защиты, определенный в прилагаемой формуле изобретения.

Краткое описание графических материалов

Фиг.1. Активность ОТ определяли в среде из культуры клеточной линии РК15 двумя способами. Полученные значения поглощения наносили на график против количества среды, добавленной к реакционной смеси.

Фиг.2. Прямое определение ОТ в образцах синовиальной жидкости, отобранных у пациентов, страдающих ревматоидным артритом. Нанесенные на график значения получили из 1 мкл образцов и реакции ОТ в течение ночи.

Фиг.3. Активность ОТ определяли в экстракте из раковой опухоли молочной железы двумя способами. Полученные значения поглощения наносили на график против количества экстракта, добавленного к реакционной смеси.

Фиг.4. Прямое определение ОТ в экстрактах из биопсий раковой опухоли молочной железы. Значения поглощения, нанесенные на график против концентрации белка в каждом образце, получили из 1 мкл экстракта и реакции ОТ в течение ночи.

Фиг.5. Активность ОТ в А) среде культуры клеток, трансформированных НТБУ1, и Б) среде из культуры, инфицированной ВЬУ, определяли двумя способами. Полученные значения поглощения наносили на график против количества образца, добавленного к реакционной смеси.

Фиг.6. Прямое определение активности ОТ в сыворотке от макак, инфицированных 81У. Значения поглощения, полученные в 4-часовом анализе ОТ, наносили на график против суток взятия образца сыворотки.

Подробное описание воплощений изобретения

Набор для анализа ОТ по настоящему изобретению содержит три различных типа компонентов, а именно

1) Матрицу, состоящую из полирибоадениловой кислоты (ргА) или полидезоксиадениловой кислоты (рбА), присоединенную к твердой фазе.

2) Реакционные смеси, которые дают возможность ферментам полимеризовать новую нить ДНК праймер-зависимым способом, используя присоединенный матричный полинуклеотид.

3) Компоненты системы обнаружения для иммунологического обнаружения синтезированной ίη νίίτο нити ДНК.

1) Матрица, связанная с твердой фазой.

Разработан способ, посредством которого ргА или рбА можно присоединить к определенным типам титрационных микропланшетов методом, который дает возможность полинуклеотидам служить в качестве матриц для праймерзависимого включения дезоксинуклеотидтрифосфата (дНТФ) вирусными и клеточными РНК- и ДНК-зависимыми ДНК-полимеразами (обратными транскриптазами, ОТ). Показано, что способ работает на двух имеющихся в продаже титрационных микропланшетах, Соуа1Ьшк™ и ЫискоНик™ от Ыа1де Ыипс 1п!егпа!юпа1. Титрационные микропланшеты, связанные с ргА, используемые для наборов для анализа согласно настоящему изобретению, получают из полос от ЫискоЬшк™. Методика и буферы описаны в табл. 1. Механизм связывания неизвестен, так как методика не соответствует способам, рекомендуемым или предложенным изготовителем или подробно описанным в литературе. В возможный механизм реакции вовлечены реактивные группы, введенные в процессе производства, но иные, чем те, которые трансплантированы для известного и рекомендуемого применения данной конкретной поверхности. Ожидают, что подобные результаты будут получены с другими титрационными микропланшетами на основе полистирола из других коммерческих источников. Способ химической активации полистирола для получения поверхности со свойствами, равными свойствам планшетов Соуа1Ьшк™, опубликован (2ашшайео е! а1. - 96). Некоторые другие способы присоединения полинуклеотидов к пластиковым поверхностям также опубликованы (2ашшайео е! а1. - 96, Огедогшв е! а1. - 95, Νίνе1еаи е! а1. - 93, Вавтиввеп е! а1. - 91, Ойовй апб Мивво - 87).

2) Реакционные смеси, адаптированные к типу ОТ.

Общие условия для получения включения нуклеотида РНК- и ДНК-зависимыми ДНКполимеразами в растворимых системах с использованием очищенных ферментов, являются простыми и хорошо известными. Они включают в себя буфер, поддерживающий рН около 7,5, ион двухвалентного металла, Мд²' или иногда Мп²⁺, соль для регулирования ионной силы, для некоторых ферментов восстанавливающий агент и немного детергента. В условиях этого простого реакционного буфера ферменты будут обладать способностью к утилизации добавленной матрицы, праймера и дезоксинуклеотидтрифосфатов для синтеза нити ДНК. Эта общая концепция не учитывает различия в оптимальных или особенно адаптированных условиях реакции, которые являются необходимыми, между различными классами или типами обратных транскриптаз. Другим важным аспектом является желаемая способность реакционной смеси выдерживать добавление необработанных биологических жидкостей или клеточных экстрактов в качестве источника ферментативной активности ОТ.

Систематическое тестирование при использовании как неочищенных образцов, таких как супернатанты клеточных культур, так и очищенных ферментов позволило выявить другие компоненты реакции, которые использовали для создания реакционных смесей, оптимизированных или особенно адаптированных для конкретных обратных транскриптаз.

Табл. 2 содержит список компонентов, используемых для составления реакционных смесей, адаптированных к индивидуальному типу ОТ. Составы типичных реакционных смесей представлены в табл. 3.

Способ анализа обратной транскриптазы по настоящему изобретению осуществляют, как описано ниже. На первой стадии анализа в каждую лунку ргА-связанного титрационного микропланшета добавляют 100 мкл реакционной смеси с последующей преинкубацией при 33°С в течение 20-60 мин. Затем образец, содержащий обратную транскриптазу, добавляют в 50 мкл буфера с получением конечного объема анализа 150 мкл, а затем титрационный микропланшет инкубируют при 33°С. Каждый образец добавляют в два экземпляра титрационных микропланшетов, что дает возможность проведения двух периодов анализа, стандартизированных для 3 ч и в течение ночи, что означает 16-20 ч. Постадийная методика приведена в письменных инструкциях или в руководстве для пользователя, включенных в каждый набор. Он содержит предложения или инструкции о том, как адаптировать общие компоненты анализа обратной транскриптазы для некоторых или для всех из следующих применений: 1) количественный анализ активности ОТ; 2) скрининг активности ОТ в клеточных экстрактах, клеточных супернатантах и/или биологических жидкостях, включая, но не ограничиваясь ими, плазму, сыворотку, спинномозговую жидкость, синовиальную жидкость и плевральную жидкость;

3) определение антитела, блокирующего активность ОТ; 4) определение значений 1С₅₀ веществ, ингибирующих активность ОТ.

Используя эти реакционные смеси и матрицы, связанные с твердой фазой, авторы изобретения разработали заявленные анализы, которые либо являются более чувствительными при прямых измерениях активности ОТ, чем другие ранее описанные анализы на основе матриц, связанных с твердой фазой, либо дают возможность обнаружения ранее неизвестных активностей обратных транскриптаз.

3. Иммунологическое обнаружение нити

ДНК, синтезированной ίη тбго.

Полимераза в образце синтезирует нить

ДНК, используя бромдезоксиуридинтрифосфат (ВгбиТР), обеспечиваемый реакционной смесью.

Включенный ВтбИМР обнаруживают с помощью моноклонального антитела, связывающего ВтбИ, конъюгированного со щелочной фосфатазой. Активность щелочной фосфатазы связанного антитела затем определяют количественно путем добавления раствора субстрата, содержащего паранитрофенилфосфат, п-НФФ. Раствор субстрата становится желтым, когда пНФФ расщепляется щелочной фосфатазой. Оптическую плотность (ΟΌ) измеряют в стандартном аппарате для считывания планшетов для ЕЫ8А при длине волны 405 нм. Значение ΟΌ, скорректированное по отношению к фону, пропорционально активности ОТ в образце.

Стадию обнаружения осуществляют, как описано ниже. Постадийная методика приведена в письменных инструкциях или в руководстве для пользователя, включенных в каждый набор. Составы буферных растворов приведены в табл. 4.

После анализа обратной транскриптазы титрационный микропланшет отмывают, либо используя одну из имеющихся в продаже отмывок для планшетов ЕЬГ8А, либо с помощью серийного погружения планшета в сосуды с буфером для отмывания. Конъюгированное антитело возможно предлагается в наборе в лиофилизированной форме. После растворения 1%-ным тритоном Х-100 в дважды дистиллированной воде 100 мкл раствора антитела добавляют в каждую лунку, и титрационный микропланшет инкубируют при 33°С в течение 90 мин. Чтобы удалить избыток антитела, планшет последовательно отмывают тем же способом второй раз. Раствор субстрата готовят из буфера и таблеток п-НФФ, возможно предложенных в наборе. Затем измеряют значения ΟΌ через соответствующие интервалы времени.

Линейная зависимость между количеством связанного фермента щелочной фосфатазы и концентрацией продукта желтого цвета нарушается при высоких значениях ΟΌ. Измеряя ΟΌ через различные промежутки времени, возможно получить действительные значения, то есть значения ΟΌ в пределах линейного диапазона считывания конкретного инструмента, для образцов как с высокими, так и с низкими количествами продукта, образованного во время стадии анализа обратной транскриптазы. Эталонные ферменты ОТ, возможно включенные в некоторые, но не во все наборы, калибруют для получения кривых титрования с действительными значениями ΟΌ, когда ΟΌ измеряют через 30 мин, 2 ч и 16-20 ч, то есть в течение ночи.

Усовершенствованные показатели, полученные с использованием наборов для анализа ОТ по настоящему изобретению, продемонстрированы в табл. 5. Кривые титрования ОТ Н1У1 получили с использованием ранее известного набора ОТ Ьепй от Сау1б1 Теей АВ и с использованием набора для анализа по настоящему изобретению. Значения ΟΌ можно нанести на график против концентрации фермента ОТ и подогнать до прямой линии, используя метод наименьших квадратов. Значения к в табл. 6 представляют собой отклонения от вычисленных прямых линий и являются мерой чувствительности анализа. Можно видеть, что наборы для анализа по настоящему изобретению имеют значения к, которые на порядок выше. В практическом отношении это означает действительные измерения от образцов, содержащих значительно более низкую концентрацию обратной транскриптазы НГУ-1 и/или экономию времени. Более короткие периоды времени анализа обратной транскриптазы и/или более короткие периоды времени считывания щелочной фосфатазы означают более короткое время оборота для пользователей наборов по настоящему изобретению.

Типичные компоненты набора по настоящему изобретению

A. Два 96-луночных титрационных микропланшета с присоединенными ргА и/или рбА.

Б. Буфер для разведения образца и реакционный буфер, содержащий адаптированную к типу ОТ смесь компонентов Г-ГХ, список которых приведен в табл. 2.

B. Лиофилизированные компоненты реакции Х-ХГГ, смешанные или поставляемые в отдельных флаконах.

Г. Лиофилизированный эталонный фермент либо рекомбинантных, очищенных природных, либо вирусных частиц.

Д. Концентрированный буфер для отмывания.

Е. Лиофилизированное моноклональное анти-Вгби-антитело, конъюгированное со щелочной фосфатазой, обозначенное «ВТ Ргобис! Тгасег» (индикатор продукта ОТ).

Ж. Буфер для субстрата щелочной фосфатазы и таблетки п-НФФ.

3. Письменные инструкции или Руководство.

Примеры

Пример 1. Усовершенствованное обнаружение ОТ РЕВУ (эндогенного ретровируса свиньи, ротсше еибодеиоик ге1гоу|ги5) в клеточных супернатантах.

Известно, что линия клеток свиньи РК-15 (свиные почки) постоянно продуцирует малые количества РЕВУ. Делали серийные разведения супернатантов из культуры клеток РК-15. Тестировали способность анализа ОТ С-типа от Сау1б1 Тесй АВ и Мп²⁺-анализа по настоящему изобретению обнаруживать активность ОТ при каждом разведении. Данные, представленные на фиг.1, получены в результате анализа ОТ в течение ночи.

Набор для анализа по настоящему изобретению демонстрирует чувствительность, увеличенную приблизительно в 25 раз по сравнению с одним из анализов предшествующего уровня техники. Было невозможно использовать боль13 шее количество образца, чтобы компенсировать различие в чувствительности обнаружения, поскольку анализ С-типа допускал повышенные уровни фона и отклонения от линейности со временем и/или количеством образца при более высоких концентрациях супернатанта (>2 мкл/лунку).

Набор для анализа по настоящему изобретению можно использовать в исследованиях, рассматривающих возможный перенос экзогенного ретровируса и/или активацию эндогенного ретровируса в связи с ксенотрансплантацией.

Пример 2. Прямое измерение обратной транскриптазы в синовиальных жидкостях.

Недавние эксперименты по гибридизации ДНК позволили предположить взаимосвязь между некоторыми ревматическими расстройствами и присутствием последовательностей, связанных с ретровирусами. Замороженные образцы синовиальных жидкостей от пациентов с ревматоидным артритом получили с кафедры Ревматологии Катойпзка уикйизе!, Б1оскНо1т, Елтебеп. Эти образцы очищали от клеток и дебриса путем низкоскоростного центрифугирования перед замораживанием. Образцы оттаивали, делали серийные разведения и исследовали на активность ОТ.

Полученные активности пересчитывали на ОЭ₄₀₅/ч. На фиг.2 представлены активности ОТ, обнаруженные при использовании 1 мкл образца и ферментативной реакции в течение ночи в анализе ОТ по настоящему изобретению в синовиальной жидкости. Ни в одном из образцов, исследованных с помощью анализа ОТ Ьепб или анализа ОТ С-типа от ί,’ονίάί ТесН АВ, не было обнаружено активности ОТ.

Пример 3. Обнаружение активности ОТ в экстрактах из раковой опухоли молочной железы человека.

В этиологию рака молочной железы человека вовлечен экзогенный или эндогенный человеческий аналог ММТУ (вирус опухоли молочной железы мыши, тоизе таттагу 1итог νϊηΐδ). Используя ОТ рекомбинантного ММТУ для оптимизации условий анализа, можно обнаружить активность ОТ в экстрактах из раковой опухоли молочной железы без предварительного концентрирования или очистки. Замороженные экстракты из раковой опухоли молочной железы получили с кафедры онкологии АсабетЬка уиНизе!, Ирр8а1а, Ешебеп. Опухолевую ткань гомогенизировали и суспендировали в стандартном буфере (рН 7,4). Супернатанты собирали после очистки путем низкоскоростного центрифугирования. Образцы оттаивали, делали серийные разведения и исследовали на наличие активности ОТ в Мд²⁺-анализе ОТ по настоящему изобретению и в анализе ОТ Ьепб или анализе ОТ С-типа от Сау1б1 ТесН АВ.

На фиг. 3 показан репрезентативный пример результатов, полученных с использованием реакции ОТ в течение ночи, объединенной с 2 часовой реакцией со щелочной фосфатазой (АР). Различие в чувствительности обнаружения между Мд²⁺-анализом ОТ по настоящему изобретению и анализом ОТ Ьепб или анализом ОТ С-типа от Сау1б1 ТесН АВ составляло примерно в 400 раз. Никакой активности не обнаружили в анализе ОТ С-типа от Сау1б1 ТесН АВ.

На фиг.4 проиллюстрирована разновидность активностей ОТ, обнаруженных с помощью Мд²⁺-анализа ОТ в опухолевых экстрактах от различных пациентов.

Набор для анализа по настоящему изобретению можно использовать в исследованиях, рассматривающих возможную роль экзогенных или эндогенных ретровирусов в этиологии рака молочной железы, а также его можно использовать для диагностических целей.

Пример 4. Обнаружение вирусов, подобных НТЬУ (вирус лейкемии Т-клеток человека, Нитап Т-се11з 1еикет1а νίιυδ), в супернатантах из клеточных культур.

У некоторых индивидуумов, инфицированных НТЬУ, продолжается развитие онкологических или миелопатических расстройств. В некоторых частях Японии и Южной Азии впервые описано заболевание, связанное с Тклеточной лейкемией взрослых. Неврологическое расстройство, тропический спастический парапарез, впервые описано у пациентов из района Карибского бассейна. Способы, способные обнаружить контакт с вирусом и/или продолжительное присутствие низких уровней вирусной активности, являются желательными.

Близкородственный бычий вирус, вирус лейкемии быков (ВЬУ, όονίικ 1еикет1а νίιυδ), представляет собой патоген у коров, имеющий значительные экономические последствия для молочной и скотоводческой промышленности. ВЬУ также использовали для оптимизации анализа на ВЬУ/НТЬУ-активности ОТ.

На фиг.5А проиллюстрировано различие в чувствительности обнаружения между набором для анализа по настоящему изобретению и Ьепб анализом ОТ от Са\зб| ТесН АВ. Делали серийные разведения супернатантов клеточных культур из клеточной линии МТ-2, трансформированной НТЬУ-1, и использовали два анализа ОТ для определения количества активности ОТ в каждом образце. Использованное время реакции ОТ составляло время в течение ночи (14 ч).

На фиг. 5Б показаны соответствующие данные из серии разведения супернатантов из клеток РБК-ВБУ. (Эта клеточная линия хронически инфицирована ВЬУ).

Общее увеличение чувствительности обнаружения составило приблизительно в 25 раз для фермента НТЬУ ив 30 раз для фермента

ВЬУ, соответственно. Повышение чувствительности было существенным для получения значимого сигнала от супернатанта клеток МТ-2.

Пример 5. Прямое определение активности ОТ в неочищенной сыворотке от макак, инфицированных 81У.

Количественное определение активности ОТ можно использовать для обнаружения вирусной репликации в течение острой лентивирусной инфекции. Активность ОТ в сыворотке впоследствии подавляется продуцированием антитела, ингибирующего ОТ.

Группу из четырех макак супото1ди§ (Масаса Га5С1си1ап5). подвергнутых клиническим исследованиям в качестве необработанных контролей, инфицировали десятью инфекционными для обезьян дозами (ΜΙΌ50) §1У§т. Образцы сыворотки, отобранные через указанные промежутки времени после инфицирования, серийно разводили и анализировали на активность ОТ, используя Ьепб анализ ОТ по настоящему изобретению. Пять мкл образца сыворотки включали в четырехчасовую реакцию ОТ, и полученные значения поглощения пересчитывали на ОЭ.-_|05/ч и наносили на график против суток после инфицирования, см. фиг.6.

Ьепб анализ ОТ по настоящему изобретению является достаточно чувствительным для обнаружения вирусной репликации путем анализа образцов сыворотки, отобранных в течение острой стадии инфекции. Тесты, используемые в настоящее время для скрининга на положительный анализ ВИЧ среди людей-доноров крови, основаны на обнаружении антител, направленных на белки Н1У-1, и не способны обнаружить инфицированных лиц в течение острой стадии инфекции. В некоторых странах эти тесты дополнены обнаружением вирусного антигена с помощью ЕЫ8А или вирусного генома с помощью ПЦР. Оба типа тестов могут оказаться неспособными обнаружить отклоняющиеся формы вирусных штаммов вследствие большой генетической и иммунологической вариабельности среди вирусов ВИЧ. ОТ обладает необходимой функцией для репликации всех ретровирусов, и настоящий анализ предлагает привлекательную альтернативу для обнаружения острых инфекций.

Таблица 1

Методика получения титрационных микропланшетов, покрытых ргА,

Мис!еоНпк™

Связывающий раствор	100 мМ 1 мг/мл	1-метилимидазол рН 6,25 полирибоадениловая кислота
Буфер для отмывания	10 мМ	бис-трис-пропан рН 6,25

Добавить 100 мкл связывающего раствора в каждую лунку.

Инкубировать планшеты при комнатной температуре в течение 2 ч.

Отмыть каждую лунку 2x300 мкл буфера для отмывания.

Высушить планшеты при 37°С в течение 25 мин.

Поместить планшеты в пакеты из фольги и запаять их под вакуумом.

Хранить при -20°С.

Таблица 2

Компоненты, используемые для составления анализов обратной транскриптазы, адаптированных к типу ОТ

Компонент

I Буфер

II Ион двухвалентного металла

III Хелатирующий агент

IV Полиамин

Вещество

Трис, ΗΕΡΕδ

Мд²*, Мп²*

ЭДТА, ЭГГА

Спермин, спермидин

Диапазон действительной концентрации в конечной реакционной смеси 10-100 мМ; рН 7,0-8,0 0-20 мМ

0-0,5 мМ

0-20 мМ

0-100 мкг/м;

0-5 мМ

V Ингибитор РНКазы Гепаринсульфат, декстрансульфат

VI Восстанавливающий ДТТ, ДТЭ, глутатион агент

VII Соль	ΝθΟΙ, КС1	0-100 мМ
VIII Стабилизирующий	СНТ, БСА	0-1 мг/мл
агент
IX Детергент	Твин 20, Тритон Х-100	0-1,0%
X Дезоксинуклеотид-	ВсйиТР	1-50 мкМ
трифосфат
XI Праймер	Олиго с!Т	5-100 нг/мл
XII Защитный агент	АТФ, ГТФ, ЦТФ	0-5 мМ

Сокращения:

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;

ЭГТА - этиленгликоль-бисф-аминоэтиловый эфир)-Ы,Х,Х',Х'-тетрауксусная кислота;

ДТТ - дитиотреитол;

ДТЭ - дитиоэритритол;

СНТ - сыворотка новорожденных телят;

БСА - бычий сывороточный альбумин.

Таблица 3

Компоненты в оптимизированном анализе обратной транскриптазы 1_епИ по настоящему изобретению

Компонент

Вещество

I Буфер

II Ион двухвалентного металла

Концентрация в конечной реакционной смеси 10 мМ; рН 7,6 мМ

НЕРЕ5-НС1

МдС1₂

ЭГТА

III

Хелатирующий агент

Полиамин

0,2 мМ мМ

IV мкг/мл агент

V

VI

Ингибитор РНКазы

Восстанавливающий

Спермин

Декстрансульфат

VII Соль
VIII Стабилизирующий	БСА	0,5 мг/мп
агент
IX Детергент	Тритон Х-100	0,5%
X Дезоксинуклеотид-	ВгсЮТР	16 мкМ
трифосфат
XI Праймер	Олиго 6Т	80 нг/мл
XII Защитный агент	ГТФ	0,5 мМ
Консервант	ΝβΝ₃	1.92 мМ

анализе обратной транскриптазы

Таблица 3 (продолжение)

Компоненты в оптимизированном

ΒΙ_ν/ΗΤΙ_ν по настоящему изобретению

Компонент	Вещество	Концентрация в конечной реакционной смеси
I Буфер	НЕРЕЗ-НС!	10 мМ; рН 7,8
II Ион двухвалентного	МдС1₂	8 мМ
металла
III Хелатирующий	ЭГТА	0,2 мМ
агент
IV Полиамин	Спермидин	1 мМ
V Ингибитор РНКазы	Декстрансульфат	2 мкг/мл
VI Восстанавливающий	Глутатион	0,6 мМ
агент
VII Соль
VIII Стабилизирующий	БСА	0,5 мг/мл
агент	СНТ	0,5%
IX Детергент	Тритон Х-100	0,5%
X Дезоксинуклеотид-	ВгсШТР	16 мкМ
трифосфат XI Праймер	Олиго 6Т	80 нг/мл

XII Защитный агент	ГТФ	0,5 мМ
Консервант	ΝθΝ₃	1,92 мМ

Компоненты в оптимизированном Мд²⁺анализе обратной транскриптазы по настоящему изобретению

Компонент	Вещество	Концентрация в конечной
		реакционной смеси
I Буфер	ΗΕΡΕδ-ΗΟΙ	10 мМ; рН 7,6
II Ион двухвалентного	МдС1₂	25 мМ
металла
III Хелатирующий	ЭГТА	2,5 мМ
агент
IV Полиамин	Спермин	0,15 мМ
	Спермидин	3 мМ
V Ингибитор РНКазы
VI Восстанавливающий	Глутатион	1 мМ
агент
VII Соль
VIII Стабилизирующий	БСА	0,5 мг/мл
агент	СНТ	0,25%
IX Детергент	Тритон Х-100	0,5%
X Дезоксинуклеотид-	Вгаитр	16 мкМ
трифосфат
XI Праймер	Олиго 8Т	80 нг/мл
XII Защитный агент	АТФ, ГТФ	0,5 мМ
Консервант	ΝθΝ3	1,92 мМ

Таблица 3 (продолжение)

Компоненты в оптимизированном Мл²*-анализе обратной транскриптазы

по настоящему изобретению
Компонент	Вещество	Концентрация в конечной
		реакционной смеси
I Буфер	НЕРЕ8-НС1	10мМ;рН 7,5
II Ион двухвалентного	МпС1₂	6 мМ
металла
III Хелатирующий агент	ЭДТА	0,3 мМ
IV Полиамин	Спермидин	12 мМ
V Ингибитор РНКазы
VI Восстанавливающий	Глутатион	4 мМ
агент
VII Соль
VIII Стабилизирующий	БСА	0,2 мг/мл
агент
IX Детергент	Тритон Х-100	0,5%
X Дезоксинуклеотид-	Вгритр	16 мкМ
трифосфат
XI Праймер	Олиго с5Т	80 нг/мл
XII Защитный агент	ГТФ	0,5 мМ
Консервант	№Ν₃	1,92 мМ

Компоненты в анализе обратной транскриптазы синовиальной жидкости по настоящему изобретению

Компонент	Вещество	Концентрация в конечной
		реакционной смеси
I Буфер	НЕРЕ8-НС1	10 мМ; рН 7,6
II Ион двухвалентного	МлС1₂	1,2 мМ
металла
III Хелатирующий агент	ЭДТА	0,13 мМ
IV Полиамин	Спермидин	8 мМ
V Ингибитор РНКазы	Декстрансульфат	17 мкг/мл

VI Восстанавливающий	Глутатион	0,3 мМ
агент
VII Соль	КС!	20 мМ
VIII Стабилизирующий	БСА	0,3 мг/мл
агент
IX Детергент	Тритон Х-100	0,5%
X Дезоксинуклеотид-	вгйитр	16 мкМ
трифосфат
XI Праймер	Олиго άΤ	80 нг/мл
XII Защитный агент	ГТФ	0,5 мМ
Консервант	ΝθΝ₃	1,92 мМ

Таблица 4

Компоненты в системе обнаружения

Буфер для отмывания

3 мМ	Трис-НС1, рН 8,6
0,01%	Твин-20
0,75%	Тритон Х-100

Буфер для моноклонального анти-ВгсЮТР-антитела

25 мМ	бис-трис-пропан рН 8,9
250 мг/мл	Обезжиренное сухое молоко
0,01%	Твин-20
1%	Тритон Х-100
1,92 мМ	№Ν₃

Раствор субстрата щелочной фосфатазы

200 мМ Трис-НС1, рН 9,8 мМ МдС1₂

0,5 мг/мл л-НФФ

3,9 мМ №Ν₃

Таблица 5

Корреляция между концентрацией фермента ОТ и значениями ОО, полученными с использованием анализа 1епй ОТ от СаугсН ТесЬ и с использованием усовершенствованного анализа по настоящему изобретению.

	Анализ Ьепб ОТ от Οθνίφ ТесИ	Усовершенствованный анализ
пг/мл	3 час ОТ/ЗО мин ЩФ	3 час ОТ/ЗО мин ЩФ
1240	1,274	нд
551	0,594	НД
245	0,332	9,999
109	0,175	1,837
48,4	0,108	0,989
21,5	0,070	0,525
9,6	0,052	0,264
4,25	0,046	0,174
1,89	0,054	0,121
0,839	0,041	0,101
0,373	0,042	0,091
0,166	0,040	0,081
0,074	нд	0,075
0,033	нд	0,075
0	0,042	0,078
пг/мл	ОТ в течение ночи/2 час ЩФ	ОТ в течение ночи/2 час ЩФ
1240	9,999	нд
551	9,999	нд
245	9,999	9,999
109	9,999	9,999
48,4	1,91	9,999
21,5	0,961	9,999
9,6	0,55	9,999
4,25	0,267	2,283

1,89	0,148	1,134
0,839	0,094	0,6
0,373	0,075	0,334
0,166	0,056	0,198
0,074	НД	0,144
0.033	НД	0,124
0	0,048	0,094
пг/мл	ОТ в течение ночи/ЩФ в	ОТ в течение ночи/ЩФ в
	течение ночи	течение ночи
1240	9,999	НД
551	9,999	нд
245	9,999	9,999
109	9,999	9,999
48,4	9,999	9,999
21,5	9,999	9,999
9,6	9,999	9,999
4,25	2,217	9,999
1,89	1,155	9,999
0,839	0,595	9,999
0,373	0,403	2,289
0,166	0,191	1,171
0.074	НД	0,701
0,033	НД	0,577
0	0,115	0,251

нд = не делали

Таблица 6

Значения к, полученные при анализе 1_еп1> ОТ от Οδνίάί Тес1з и при усовершенствованном анализе Ι_βηΐί ОТ по настоящему изобретению

Анализ Ьеп!) ОТ от Οβνίάί ТесЬ Усовершенствованный анализ

	значение к		значение к
3 час ОТ/ЗО мин ЩФ	0,0012	3 час ОТ/ЗО мин ЩФ	0,0165
ОТ в течение ночи/2 час	0,0432	ОТ в течение ночи/2	0,5145
ЩФ		час ЩФ
ОТ в течение ночи/ЩФ в	0,5453	ОТ в течение ночи/ЩФ	5,2827
течение ночи		в течение ночи

Ссылки

ВаШтоге Б. (1970) КДЛ-бсрспбсп1 ΌΝΆ ро1утегазе ίη νίτίοηκ оГ ΚΝΆ !итоиг у1гизез. Να!иге 226: 1209-1211.

ВаШтоге Б., 8то1ег Б. (1971) Рбтег гсс.|шгстсп1 апб 1етр1а1е зреабсНу оГ 111с ΌΝΆ ро1утегазе оГ ΚΝΆ 1итог убизез. ΡΝΆ8 68, 1507-11.

Вагге-81поизз1 Р., Сбегтапп 1. С, Кеу Р., Шдеуге Μ. Т., Сбатаге! 8., Огиез! 1., Баибие! С, Ах1ег-В1т С., УсхтсЬВгип Р., Коихюих С, Ко/спЬаит У., Моп1адшег Ь. (1983). 18о1абоп оГ а Т-1утрко1гор1с гебоубиз Ггот а рабеп! а! Г18к Гог ас.|шгеб 1ттипе бейаепсу зупбготе (Л1Б8). 8с1епсе 220 (4599): 868-71.

В1гб К. Е., Сбапд-Уеп А. (1996). Ме!бобз апб кйк Гог бе!есбпд νίτηΙ !гапзспр1азе асбубу т а затр1е изтд ап ас1бк рН ог ап е1еуа!еб !етрега!иге. И85817457.

Б1 СпйоГапо А., 8йахи11о М., Ьопдо Ь., Ьа Мапба О. (1995) Сбагаскб/абоп апб депотк тарртд оГ !бе ΖΝΡ80 1осиз: ехргеззюп оГ Ибз хбю-Ппдсг депе 1з бпуеп Ьу а зо1багу ЬТК оГ ЕКУ9 епбодепоиз гс!гоу1га1 Гатбу. Шскк Ас1бз Кез 23 (15): 2823-30.

Биу1с М. (1995) Нитап 1ттипобейскпсу νίπ.15 апб !бе зкт: зе1ес1еб сопйоуегзкз. 1. 1пуез!.

Бегта!о1. 105 (1 8ирр1): 1178-1218.

ЕЬег1е 1., апб К. 8е1Ь1. (1992) А пете те!боб Гог теазиппд гсуегзе !гапзсбр1азе асбубу Ьу ЕЫ8А. 1. У1го1. Ме!бобз 40: 347-356.

Екзбапб Б. Н. Ь, Атеаб К. к-К., Ка11апбег С. Р. К. Апб Сгопо\\бх 1. 8. (1996) А зепзбгуе аззау Гог !бе бе!есбоп апб диапбйсабоп оГ КТ асбубу, Ьазеб оп !бе изе оГ сагбег Ьоипб !етр1а!е апб поп-габюасбуе ргобис! бе!есбоп, тебб зреаа1 геГегепсе !о Н1У 1зо1абоп. Вю!есбпо1оду апб АррИеб Вюсбетзбу, 23, 95-105.

РаГГ О., Миггау А. В., 8сбт1б! 1., Ье1ЬМозсб С., ЕгЙе У., Неб1тапп К., Тбе1еп К., Ьотеег 1., Кийб К. (1992). Кебоубиз-бке рагбс1ез Ггот !бе битап Т47Б се11 1ше аге гс1а!еб !о тоизе таттагу !итоиг у1гиз апб аге оГ битап епбодепоиз обдш. 1. Оеп. Убо1. 73: 1087-97.

Обозб 8. 8., Миззо О. Р. (1987) Соуа1еп! абасбтеп! оГ обдопискоббез !о зобб зирройз. М1с1ск Ас1бз Кез 15 (13): 5353-72.

ОоГГ 8. Р. (1990) Кебоубиз гсуегзе бапзсбр!азе: 8уп!без1з, 8!гис!иге апб Рипсбоп. Кеукте. 1. Асдшг. 1тт. Бейс. 8упбг. 3: 817-31.

Огсдобиз К., Моигбзеп 8., Е1зпег Н. I. (1995) Нубгосоабпд: а пете те!боб Гог соирбпд Ь1ото1еси1ез !о зобб рбазез. 1. 1ттипо1. Ме!бобз. 181 (1): 65-73.

Сгопо\\бх 1. 8., №ити11ег М., Ееппегзбапб 1., Вб1каЬаба1 К., Ипде Т., Уебтап Н & Ка11апбег С. Р. К. (1991) Сагбег Ьоипб !етр1а!ез Гог зтд1е !иЬе гсуегзе бапзсбр!азе аззауз апб Гог сотЬтеб рипйсабоп апб асбубу апа1узез, тебб зрес1а1 геГегепсе !о Н1У. Вю!есб. Арр1. Вюскет. 13: 127-142.

Оир!а Р., Ва1асбапбгап, Огоуб К., УеЬз!ег Б., апб К1па1бо С. (1987). 1. С1т. МкгоЬюк 25, 1122-1125.

Непете У., Уатато!о 8., 8\\бхсг У. М., 8рба Т. 1., Ро1кз Т. М. (1995). Бе!есбоп оГ геуегзе бапзсбр1азе Ьу а Ыдб1у зепзбгуе аззау т зега Ггот регзопз 1пкес!еб тебб битап 1ттипобейскпсу У1гиз !уре 1. 1 1пГсс1 Б1з 171: 1210-1216.

Непете У., Ро1кз Т. М., Тботаз М., 8тебхег У. М., Уатато!о 8. (1995) Ме!бобз Гог зепзбгуе бе!есбоп оГ геуегзе бапзсбр!азе. И85849494.

1аскзоп В., 8аппегиб К., Кбате Р., Тзапд К. Апб Вабоиг Н. Н. (1987). Б1адп. МкгоЬюк 1пГес!. Б18. 7, 185-192.

Кбед А. М., 8!етЬегд А. Б. (1990) Ке!гоу1гизез апб аи!о1ттипбу. 1. Аи!о1ттип. 3(2): 13766.

Кбед А. М., Ооиг1еу М. Р., Рег1 А. (1992).

Епбодепоиз гсйоубизсз: ро!епба1 ебо1одк адеп!з т аи!о1ттипбу. РА8ЕВ 1 6 (8): 2537-44.

Ка11апбег С. Р. К., Сгопо\\бх 1. 8., №ити11ег М., Каг1з!гот К. А., Еапдзбот-Регззоп и. М.

(1988). Ме!боб Гог ро1утегазе асбубу бе!егттабоп. 8уепзк ра!еп! по 8804344-3, ЕР 0447442 В1.

Ьее М., 8апо К., Мога1ез Р. Е. апб Ό. Т. 1тадауа (1987) 8епз1йуе геуегзе йапзспр!азе аззау !о бе1ес1 апб циап111а1е Нитап 1ттипобейс1епсу У1гиз. 1. Сйп. М1сгоЫо1. 25: 1717-21.

Ье1Ь-МозсН С. апб 8ейайН (1996) Еуо1ийоп апб Ью1од1са1 з1дшйсапсе ой Нитап ге!гое1етеп!з. У1гиз депез 11: 133-145.

Ьоуег К., Ьоуег 1., Кийй К. (1996) ТНе νίгизез ш а11 ой из: сНагас!епзйсз апб Ыо1од1са1 з1дшйсапсе ой Нитап епбодепоиз гейоуйиз зесщепсез. Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8с1 И8А 93 (11): 517784.

МагйпеШ 8. С, Сойй 8. Р. (1990) Кар1б бе1есйоп ой а бе1ейоп ти1айоп ш Мо1опеу тшгпе 1еикет1а уйиз Ьу гесотЫпайоп уНН а с1озе1у ге1а1еб епбодепоиз ргоуйиз. У1го1оду 174 (1): 135-44.

Меезе Е., Сойей Е., 2апд К. Ό., 8аи1ег М., 8сНоттег 8., Мие11ег-йап1хзсН N. (1996) Нитап епбодепоиз ге!гоу1га1 е1етеп1 к10 (НЕКУ-К10): сНготозота1 1осаН/айоп Ьу зотайс НуЬпб тарршд апб йиогезсепсе ш зйи НуЬпб1/айоп. Су!одепе! Се11 депе! 72 (1): 40-2.

№ити11ег М., Кайзйот К. А., КаПапбег С.

Р. К., апб С. 8. СгопоуНх. (1990) 1тргоуеб аззауз йог ^NΑ-ро1уте^^ζ^пд епζутез Ьу !Не изе ой епζутайса11у зупΐΗейζеб 5-(¹²⁵1)юбо-2'беохушгбше 1прНозрНа!е, 111из!га!еб Ьу б1гес! диапй!айоп ой апй-Н1У геуегзе !гапзспр!азе апйЬобу апб Ьу зегит ΌΝΑ ро1утегазе апа1узез. Вю!есН. Арр1. ВюсНет. 12: 34-56.

№уе1еаи А., 8аде Ό., Кеупаиб С., Вгипо С., Ьедаз!е1о1з 8., ТНотаз У., Эап1е К. (1993) Соуа1еп1 Нпктд ой Нар!епз, рго!ешз апб пис1ею ас1бз !о а тобШеб ро1уз!угепе зиррой. 1ттипо1. Ме!Нобз 159 (1-2): 177-87.

Ройзтапп Т., Ме1ззпег К., С1азег К., Эоре1

8.-Н., апб С. 8убо\у. (1991) А зепзйгуе поп табюасНуе аззау зресйю йог Н1У аззос1а!еб геуегзе йапзспр!азе. 1. УНоН Ме!Н. 31: 181-188.

Казтиззеп 8. К., Ьагзеп М. К., Казтиззеп 8. Е. (1991) Соуа1еп! пптоЬШ/аНоп ой ^NΑ оп!о ро1уз!угепе ткгоуе11з: !Не то1еси1ез аге оп1у Ьоипб а! !Не 5' епб. Апа1. ВюсНет. 198 (1): 13842.

8буег 1., Маибги Т., Еир1а К., апб Керазке К. (1993) Ап КТ-РСК аззау йог !Не епζуте асНтНу ой геуегзе йапзспр!азе сараЬ1е ой бе!есйпд зшд1е νίτί». №1с1ею Ас1бз Кез 21: 3593-3594.

Тетш Н. М., М|/и1аш 8. (1970) ^Аберепбеп! ^NΑ ро1утегазе ш утопз ой Коиз загсота уйиз. №1иге 226: 1211-1213.

Топ)ез К. К., ВоПег К., ЫтЬасН С, Ьидей К., КиПН К. СНагасЮпхайоп ой Нитап епбодепоиз гейоу1гиз !уре К У1гиз-Нке рагйс1ез депега!еб йот гесотЫпап! Ьаси1оу1шзез (1997) У1го1оду 233 (2): 280-91.

ИгаЬе Т., 8апо К., Nакапо Т., Обауага Р., 1ее М. Н., О!аке Т, е! а1. (1994) Пййегепйайоп Ье!уееп Нитап 1ттипобейс1епсу узгиз !уре 1 (Н1У-1) апб Н1У-2 1зо1а!ез Ьу попгабю1зо!орю геуегзе !гапзспр1азе-1уртд аззау. 1 Сйп МюгоЬю1; 32: 1870-75.

итоуЦх Н. В. апб МигрНу Н. (1996) Нитап епбодепоиз геИоуйизез: М-Ииге, оссигепсе апб сйшса1 1трйсайопз ш Нитап б1зеазе. Сйп. М1сгоЪю1. Кеу. 9: 72-99.

\Уе1зз К. ТНе зеагсН йог Нитап ^А !итог упизез. 1п К. \Уе1зз, Ν. ТеюН, Н. Уагтиз, апб 1. Соййп (ебз) ^А Титог У1гизез (2^пб еб. νо1. 1) 1205-1281. Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргезз, Со1б 8рппд НагЬог, №у Уогк, 1984.

ХУбктзоп Ό. А., Мадег Ό. Ь., апб Ьеопд ЕА. (1994) Епбодепоиз Нитап тейоупизез. 1п «ТНе КеЛоушбае» (1. А. Ьеуу, Еб), уо1. 3, рр 465-535. 3 уо1з Р1епит Ргезз, №у Уогк.

2аттайео Ν., СНагбеаих С, Эе 1 Го где Ό., Рйеаих 1. 1., Кетас1е 1. (1996) Атшайоп ой ро1уз!угепе ткгоуеНз: аррйсайоп !о !Не соуа1еп! дгаййпд ой ^NΑ ргоЬез йог ΗуЬ^^б^ζайоп аззауз. Апа1. ВюсНет. 236 (1): 85-94.

21пкетаде1 К. М., Соорег 8., СНатЬегз 1., каххапш К. А., Непдайпег Н., АтНеНег Н. (1990) У1гиз-тбисеб аи!оапйЬобу гезропзе !о а йапздешс У1га1 апйдеп. №1Шге 345: 68-71.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Набор для анализа обратной транскриптазы (ОТ), включающий в себя одну или несколько упаковок, содержащих связанную(ые) с твердой фазой матрицу (матрицы), представляющую(ие) собой полирибоадениловую кислоту (ргА) и/или полидезоксиадениловую кислоту (рбА), приготавливаемую (ые) путем приведения в контакт твердой фазы на основе полистирола со связывающим раствором, содержащим 1метилимидазол и ргА и/или рбА, с последующими инкубацией, промывкой буфером для отмывания, высушиванием и упаковкой; адаптированные к типу ОТ отдельно упакованные компоненты анализа, выбранные из группы, состоящей из смеси или взятых по отдельности буфера, рН^7-8, иона двухвалентного металла, хелатирующего агента, полиамина, ингибитора РНКазы, восстанавливающего агента, соли, стабилизирующего агента и детергента, а также из смеси или взятых по отдельности лиофилизированного дезоксинуклеотидтрифосфата, праймера, защитного агента и концентрированного буфера для отмывания; а также, возможно, лиофилизированный эталонный фермент (ферменты) и, возможно, компоненты системы обнаружения, содержащей лиофилизированное моноклональное антибромдезоксиуридинтрифосфат (анти-Вгби) антитело, конъюгированное со щелочной фосфатазой, буфер для субстрата щелочной фосфатазы и субстрат щелочной фосфатазы, а также письменные инструкции по применению этого набора для анализа.
2. Набор для анализа ОТ по п.1, где упакованная(ые) связанная(ые) с твердой фазой матрица (матрицы) представляет(ют) собой связан ную(ые) с титрационным микропланшетом матрицу (матрицы), приготавливаемую(ые) путем приведения в контакт каждой лунки планшета с аликвотой связывающего раствора, который содержит 100 мМ 1-метилимидазола, рН=5-7, и 0,5-2 мг/мл ргА и/или рбА, с последующими инкубацией при температуре 10-60°С в течение 0,5-10 ч и промывкой каждой лунки для удаления 1-метилимидазола буфером для отмывания, который содержит бис-трис-пропан, рН=5-7, с последующими высушиванием и упаковкой планшетов.
3. Набор для анализа ОТ по п.2, где упакованная(ые) связанная(ые) с титрационным микропланшетом матрица (матрицы) представляет собой матрицу (матрицы), приготавливаемую(ые) путем приведения в контакт каждой лунки планшета со 100 мкл связывающего раствора, который содержит 100 мМ 1-метилимидазола, рН=6,25, и 1 мг/мл ргА и/или рбА, с последующими инкубацией при комнатной температуре в течение =2 ч, промывкой каждой лунки 2x300 мкл буфера для отмывания, который содержит 10 мМ бис-трис-пропана, рН=6,25, высушиванием планшетов при 37°С в течение =25 мин и помещением этих планшетов в пакеты из фольги и вакуумным запаиванием этих пакетов.
4. Набор для анализа ОТ по любому из пп.1-3, где компоненты анализа выбраны из группы, состоящей из буферов Трис и Нерек, рН=7-8, ионов двухвалентных металлов Мд²' и Мп²⁺, хелатирующих агентов этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и этиленгликольбисф-аминоэтиловый эфир)-М,Х,Х,^гЫ'-тетрауксусной кислоты (ЭГТА) и полиаминов спермина и спермидина, ингибиторов РНКазы гепаринсульфата и декстрансульфата, восстанавливающих агентов дитиотреитола (ДТТ), дитиоэритритола (ДТЭ) и глутатиона, солей ЫаС1 и КС1, стабилизирующих агентов сыворотки новорожденных телят (СНТ) и бычьего сывороточного альбумина (БСА), детергентов Твин 20 и Тритон Х-100, дезоксинуклеотидтрифосфата ВтбИТР, праймера олиго 6Т и защитного агента (агентов) АТФ, ГТФ и ЦТФ.
5. Применение набора для анализа по любому из пп.1-4 для качественного и количественного анализа активности ОТ в биологическом образце.
6. Применение по п.5, где биологический образец выбран из биологических жидкостей и клеточных экстрактов.
7. Применение по п.6, где биологическая жидкость выбрана из плазмы, сыворотки, спинно-мозговой жидкости, синовиальной жидкости и плевральной жидкости.
8. Применение по любому из пп.5-7 с последующей оценкой статуса расстройства или заболевания, связанного с активностью ОТ, на основании результата анализа активности ОТ.