MXPA01012951A - Juego de ensayo de transcriptasa inversa, uso del mismo y metodo para analizar la actividad de la transcriptasa inversa en muestras biologicas. - Google Patents

Abstract

Se describe un juego de ensayo de transcriptasa inversa (RT) para el análisis de la actividad de la transcriptasa inversa en muestras biologicas. El juego comprende plantilla (s) de ácido polirriboadenílico (prA) y/o ácido polidesoxiadenílico ligadas a fase solida obtenibles poniendo en contacto una fase solida basada en poliestireno con una solucion de acoplamiento que comprende 1-metilimidazol, y componentes de ensayo adaptados al tipo de transcriptasa inversa seleccionados entre un regulador, ion de metal divalente, quelante, poliamina, inhibidor de RNasa, agente reductor, sal, agente estabilizante, y detergente, y trifosfato desoxinucleotido, cebador, agente protector y un regulador de lavado concentrado, y opcionalmente enzima (s) de referencia liofilizadas, y opcionalmente anticuerpo monoclonal anti-BrdU conjugado con fosfatasa alcalina liofilizada, regulador de sustrato de fosfatasa alcalina y sustrato de fosfatasa alcalina, e instrucciones por escrito para el uso del juego de ensayo. Además se describe un método y un uso del juego de ensayo para el análisis cualitativo y cuantitativo de la actividad RT en una muestra biologica, opcionalmente seguido por la evaluacion del estado del padecimiento o enfermedad relacionada con la actividad de la transcriptasa inversa basada en el resultado del análisis de la actividad de la transcriptasa inversa.

Description

JUEGO DE ENSAYO DE TRANSCRIPTASA INVERSA, USO DEL MISMO Y MÉTODO PARA ANALIZAR LA ACTIVIDAD DE LA TRANSCRIPTASA INVERSA EN MUESTRAS BIOLÓGICAS La presente invención se relaciona con un juego de ensayo de transcriptasa inversa (RT) para el análisis de la actividad de la transcriptasa inversa en muestras biológicas. La invención también se relaciona con un método y un uso del juego de ensayo de la transcriptasa inversa para el análisis cualitativo y cuantitativo de la actividad de la transcriptasa inversa en una muestra biológica, opcionalmente seguida por la evaluación del estado de un padecimiento o enfermedad relacionada con la actividad de la transcriptasa inversa basada en el resultado del análisis de la actividad de la transcriptasa inversa. Antecedentes de la invención La transcriptasa inversa (RT) es la enzima crucial responsable de la síntesis del ADN a partir del ARN viral para todos los retrovirus, incluyendo el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) (Baltimore-70, Temin-70, Barre-Sinoussi y colaboradores -83) . Este proceso implica tres actividades enzimáticas diferentes: síntesis de la primera cadena de ADN, degradación de la cadena de ARN viral en el híbrido de ADN/ARN, y síntesis de la segunda cadena de ADN (por una explicación véase Goff) .

Los retrovirus pueden existir ya sea en forma exógena o endógena o ambas. La principal diferencia es que un retrovirus endógeno ha entrado a la linea de germen y de este modo el ADN está presente en todas las células del organismo, por el contrario a un retrovirus exógeno que sólo es capaz de inducirse en células con el receptor adecuado para ese virus especifico. Los retrovirus endógenos (ERV) en los humanos se conocen como HERV. La forma proviral integrada de un retrovirus endógeno tiene la misma estructura fundamental que la de un retrovirus exógeno. La integración de algunos retrovirus endógenos humanos en la linea de germen se piensa que ha ocurrido desde hace 35 a 45 millones de años. Las secuencias retrovirales constituyen el 1 por ciento del genoma de mamífero y por lo tanto también del genoma humano. De este modo, están presentes en todas las células humanas y se heredan de acuerdo con los leyes de Méndel ordinarias. Muchas familias de retrovirus endógenos humanos están presentes en el genoma humano. El número de copias por genoma humano haploide del retrovirus endógeno humano varía entre una sola copia y miles de copias para diferentes familias. La conservación de secuencia de nucleótidos más alta se encuentra en el gen pol. Esta característica se ha usado para derivar la relación entre las familias de retrovirus endógenos humanos. Aunque muchos de los retrovirus endógenos humanos y sus ORF son defectuosos, las transcripciones de ARNm han sido detectadas para la mayoría de las familias de retrovirus endógenos humanos en varios tipos de tejidos (revisado en Wiikinson y colaboradores, 1994, Leib-Mosch y Seifarth 1996) . Además, las partículas de viriones con polimerasa y actividad proteasa se han observado en placentas humanas, oocitos, teratocarcinomas, tejidos de carcinoma mamario y en glándulas salivales de varios pacientes autoinmunes (revisado en Wiikinson y colaboradores, 1994, Urnovitz y Murphy 1996, Tónjes y colaboradores, 1997) . Condiciones de tensión tales como anoxia e irradiación con luz ultravioleta podrían también inducir la expresión de retrovirus endógenos humanos como se ha observado para retrovirus infecciosos (revisado por Duvic 1995) . Varios retrovirus endógenos humanos se han localizado en puntos de rompimiento cromosomales dentro del genoma (Di Cristofano y colaboradores, 1995, Méese y colaboradores, 1996) . La recombinación entre secuencias de retrovirus endógenos humanos localizados en diferentes sitios cromosomales puede causar re-arreglos genómicos que incluyen translocaciones, inversiones, duplicaciones y supresiones. Estos eventos recombinatorios son responsables de generar inestabilidad genómica que es una característica importante de la evolución. Además, muchos tumores se caracterizan por re-arreglos genómicos específicos que se piensa que representan un papel crucial en la tumorogénesis . La relación entre la presencia de retrovirus infeccioso y el desarrollo de tumores en el anfitrión sugiere que los retrovirus endógenos humanos se asocien con cáncer. Las partículas de viriones y los antígenos relacionados con retrovirus frecuentemente se observan en muestras de tumores primarios también en ausencia de virus infecciosos (Weiss 1984, Faff y colaboradores, 1992) . Además, los anticuerpos dirigidos a proteínas retrovirales se han mostrado en el suero de pacientes con cáncer (Weiss 1984). Más aún, se encuentra que secuencias de retrovirus endógenos humanos se expresan mucho en ciertas líneas celulares derivadas de tumores (revisado en Lower y colaboradores, 1996) . Los provirus endógenos también se pueden recombinar con variantes exógenas (Martinelli y colaboradores, 1990) . Los recombinantes novedosos reciben un fenotipo alterado. Esto puede contribuir a la evolución rápida de nuevos retrovirus infecciosos . El gen env principalmente se afecta ya que las mutaciones en otras partes puede ser perjudicial y no compatible con la formación de partícula. Algunas cepas retrovirales se encuentra que son simbióticas en una especie y patógenas en otras. Estos resultados indican un problema severo en los xenotransplantes . Los retrovirus endógenos simbióticos proporcionados por tejidos transplantados podrían ser patógenos en el nuevo anfitrión. Podrían ser capaces de interactuar con receptores de superficie celular necesarios para la fusión retroviral presentes en células del nuevo anfitrión. Además, la recombinación con secuencias retrovirales endógenas dentro del genoma del receptor de tejido puede presentarse y crear nuevos retrovirus infecciosos que podrían diseminarse en la población. Tanto los retrovirus endógenos como exógenos pueden contribuir a la transmisión vertical y horizontal de material genético dentro y entre especies para proporcionar mecanismos para la evolución de nuevos agentes patógenos. Tanto los retrovirus infecciosos como los retrovirus endógenos se ha encontrado que exhiben funciones inmuno-reguladoras (revisado en Krieg y colaboradores, 1992) . Estos efectos principalmente se han estudiado en ratones pero hay algunas observaciones que apoyan la existencia de mecanismos similares para retrovirus endógenos humanos. Si la secuencia de retrovirus endógenos humanos pueden desregular una respuesta inmune pueden causar enfermedades autoinmunes. Estos efectos podrían modularse directamente por proteínas de retrovirus endógenos humanos o indirectamente influenciando la expresión de moléculas involucradas en la respuesta inmune. Las proteínas de los retrovirus endógenos humanos pueden exponerse sobre la superficie celular. La pérdida de auto-tolerancia hacia estas secuencias de proteínas podría causar reacciones autoinmunes contra las células a las que se exponen. Los anticuerpos producidos después de la infección retroviral podrían tener reacción cruzada con proteínas codificadas por retrovirus endógenos humanos y ser responsables de pérdida de tolerancia. Este fenómeno se ha observado en ratones transgénicos (Zinkernagel y colaboradores, 1990) . Además, la pérdida de tolerancia en las proteínas env codificadas por retrovirus endógeno fue observado en ratones que espontáneamente desarrollaron una glomerulonefritis auto inmune (revisado en Krieg y colaboradores, 1990 y 1992) . Algunas observaciones en humanos podrían apoyar la existencia de anticuerpos de reacción cruzada entre proteínas retrovirales endógenas y exógenas. Los anticuerpos contra proteínas retrovirales se han detectado en sueros de pacientes autoinmunes (revisado en Krieg y colaboradores, 1992, Urnovitz y Murphy 1996) . En ciertos casos, se encontró que los sueros reaccionaban también con retrovirus exógenos. Las infecciones retrovirales se han asociado con el brote de enfermedades autoinmunes (revisado en Krieg y colaboradores, 1990 y 1992) . Más aún, las proteínas retrovirales infecciosas muestran similitud parcial a los autoantígenos que frecuentemente son objetivos de los autoanticuerpos (revisado en krieg y colaboradores, 1992). Estos podrían disparar respuestas autoinmunes hacia esos objetivos, un mecanismo conocido como mimetismo molecular. Sin embargo, las similitudes de proteínas de retrovirus endógenos humanos con autoantígenos conocidos todavía no ha sido detectada. Los ensayos de la actividad de transcriptasa inversa han sido técnicas aceptadas para la detección y cuantificación de retrovirus en cultivos celulares. Están junto con ensayos de antígeno p24 usados como pruebas confirmatorias de aislamientos del VIH (Jackson -88, Guta-87) . La transcriptasa inversa es uno de los muchos objetivos del intento para encontrar antivirales eficientes contra el VIH. Un ensayo de actividad de transcriptasa inversa convencional se realiza usando un ensayo de enzima soluble con una construcción de plantilla-cebador artificial y trifosfato desoxinucleótido tritiado como sustrato de nucleótido (Baltimore-71, Lee y colaboradores -87) . Este sistema anterior se basó en la detección de la incorporación de radioactividad en ácido tricloroacético (TCA) híbridos ARN/ADN precipitables . El uso de nucleótidos que emiten beta requiere el uso de fluidos centellantes para la detección de radioactividad, que frecuentemente da como resultado una baja reproducibilidad debido a problemas de amortiguamiento. Este método es relativamente estorboso y no se adapta fácilmente al análisis a gran escala de un gran número de muestras. También es muy sensible a los efectos de factores perturbadores en las muestras. Durante la década pasada de investigación intensa sobre el VIH, el ensayo de transcriptasa inversa se ha mejorado usando diferentes técnicas. La introducción del sustrato etiquetado con I125 dio una sensibilidad aumentada y eliminó el amortiguamiento y el uso de fluidos centelleantes (Neumüller y colaboradores -90) . La introducción de plantillas o cebadores enlazados a fases sólidas simplificó la separación entre sustrato y producto, eliminó la necesidad de precipitaciones de ácido tricloroacético y dio como resultado un "ensayo de transcriptasa inversa de un tubo" (Gronowitz y colaboradores -90, EP 0 447 442 Bl) . Más recientemente el uso de radioactividad como etiqueta en ensayos de transcriptasa inversa se ha eliminado mediante el uso de bases de nucleótidos modificados que contienen ya sea epítopes antigénicos o estructuras con alta afinidad a ligandos definidos. La presencia de estos epítopes o estructuras en el recientemente sintetizado híbrido de ARN / ADN se usa entonces para enlazar anticuerpos o ligandos conjugados con enzimas del ensayo inmonosorbente de enzima enlazada (ELISA) . La cantidad de enzimas enlazadas del ensayo inmunológico de enzima enlazada se determina entonces en un ensayo de enzimas secundario. Porstmann y colaboradores, 1991 utiliza el trifosfato de 5-bromo-desoxiuridina (BrdU) como sustrato de nucleótidos en el ensayo de transcriptasa inversa. La cantidad de BrdUMP incorporado se determina en un paso secundario en un inmunoensayo usando anticuerpos anti-BrdU monoclonales conjugados con fosfatasa alcalina. Eberle y R. Seibl 1992 miden la incorporación de dUTP etiquetada con digoxigenina en ADN recientemente sintetizado en vez de dTTP etiquetada radioactivamente. Para ser capaz de realizar la separación de nucleótidos no incorporados del ADN recientemente sintetizado, dUTP etiquetado con biotina también se añade a la mezcla de la reacción. Después de la transcripción inversa, el ADN doblemente etiquetado recientemente sintetizado se inmoviliza en pozos del ensayo inmunológico de enzima enlazada recubiertos con estreptavidina y se evalúan fotométricamente mediante enlace de anticuerpos anti-digoxigenina conjugados con peroxidasa. Este procedimiento ha sido la base para el ensayo de transcriptasa inversa en juego el cual está disponible comercialmente en Boehringer Mannheim. Urabe y colaboradores, 1994 ha desarrollado un ensayo de transcriptasa inversa no radioactiva basada en la incorporación dUTP biotina en una construcción de odT/prA inmovilizada. La cantidad de sustrato de nucleótido incorporado se mide fotométricamente después de la adición de fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina. La técnica anterior más cercana a la presente invención fue desarrollada por Ekstrand y colaboradores, 1996. En ese ensayo poli (rA) covalentemente ligada a los pozos de una placa de microtitulación de 96 pozos que sirve como plantilla para la incorporación de BrdUMP durante el paso de transcripción inversa. La cantidad de BrdUMP incorporada en ADN se determina entonces inmunológicamente de acuerdo con un procedimiento similar como el usado por Porstmann y colaboradores, 1991. El método está disponible como los juegos de determinación de transcriptasa inversa en Cavidi Tech, Uppsala, Suecia. Otro principio para la detección de la actividad de la transcriptasa inversa, comercialmente explotado por NEN (New England Nuclear, EUA) , es el uso de sondas específicas de secuencia para la detección de ADNc recientemente sintetizado. La reacción enzimática utiliza una molécula de ARN heteropolimérica con un cebador de oligonucleótido de 20 bases complementario con la secuencia de ARN cerca del extremo 5' . Una cadena de ADNc completa se produce durante la reacción de transcriptasa inversa. Después de la hidrólisis de la ARN de plantilla el ADNc se hibridiza con dos diferentes sondas de oligonucleótidos, la captura y la sonda de captura y de detección. La sonda de captura se usa para enlazar en ADNc a un pozo de microplaca. La sonda de detección se conjuga con peroxidasa de rábano, la cual después de lavarse para remover el sustrato de nucleótido no usado y las sondas libres, produce una reacción de color. La detección de sensibilidad en el último tipo de ensayo se puede aumentar mediante amplificación de reacción de cadena de polimerasa del ADNc producida por la reacción de transcriptasa inversa. El ADN amplificado puede después de eso ser detectado con diferentes tipos de sondas etiquetadas (Silver 93, Heneine 1995, US5817457, US5849494) . Para algunas aplicaciones del conocimiento de la actividad de transcriptasa inversa en muestras biológicas es deseable el uso del ensayo de transcriptasa inversa dando resultados cuantitativos. Estas aplicaciones comprenden supervisión de padecimiento o enfermedad en donde los resultados del ensayo de transcriptasa inversa de mediciones hechas en diferentes momentos se van a comparar, y el diagnóstico de padecimientos o enfermedades en donde el nivel de la actividad de transcriptasa inversa comparado con niveles normales indica que el paciente tiene riesgo o se considera que está padeciendo la enfermedad o padecimiento en cuestión. En algunos casos es deseable usar un ensayo que sea sensible tanto como sea posible, es decir, sea capaz de medir cantidades tan pequeñas de actividad de transcriptasa inversa como sea posible, en muestras biológicas, de manera que la presencia y magnitud de la actividad de la transcriptasa inversa se pueda relacionar con padecimientos y enfermedades en una etapa temprana. Descripción de la invención La presente invención proporciona un ensayo de transcriptasa inversa que sea fácil de usar para propósitos de análisis y el cual sea muy sensible a la actividad de la transcriptasa inversa. Más precisamente, la presente invención se dirige a un juego de ensayo de transcriptasa inversa (RT) que comprende uno o varios paquetes que contienen fase sólida enlazada ácido polirriboadenílico (prA) y/o plantillas de ácido polidesoxiadenílico (pdA) obtenibles poniendo en contacto una fase sólida basada en poliestireno con una solución de acoplamiento que comprende 1-metilimidazol, y prA y/o pdA, seguido por la incubación, el lavado con regulador de lavado, secado y empacado. El juego comprende también componentes de ensayo empacados por separado adaptados tipo transcriptasa inversa seleccionados del grupo que consiste en una mezcla de o por separado un regulador, pH = 7-8, ion de metal divalente, quelador, poliamina, inhibidor de RNasa, agente reductor, sal, agente estabilizante, y detergente, y una mezcla de o por separado trifosfato desoxinucleótido liofilizado, cebador, agente protector y regulador de lavado concentrado, e instrucciones por escrito para el uso del juego de ensayo. Opcionalmente el juego comprende enzimas de referencia liofilizadas. Opcionalmente, el juego además comprende componentes de un sistema de detección que comprende anticuerpo monoclonal anti-BrdU conjugado con fosfatasa alcalina liofilizada, regulador de sustrato de fosfatasa alcalina y sustrato de fosfatasa alcalina, tal como tabletas de pNPP . En una modalidad preferida del juego de ensayo de transcriptasa inversa de acuerdo con la invención, la fase sólida es una placa de microtitulación, y un alícuota de la solución de acoplamiento, que comprende 100 mM de 1-metilimidazol, pH = 5-7, y 0.5 - miligramos/mililitro de prA y/o pdA, se añade a cada pozo, seguido por la incubación a una temperatura de 10 -60°C durante 0.5 - 10 horas, y lavando cada pozo para la remoción del 1-metilimidazol con el regulador de lavado, que comprende Bis-Tris propano, pH ? 5-7. En una modalidad particularmente preferida del juego de ensayo de transcriptasa inversa de acuerdo con la invención, 100 microlitros de la solución de acoplamiento, que comprende 100 mM 1-metilimidazol, pH = 6.25, y 1 miligramo/mililitro de prA y/o pdA, se añade a cada pozo, seguido por la incubación a temperatura ambiente durante = 2 horas, lavando cada pozo con 2 x 300 microlitros de regulador de lavado, el cual comprende 10 mM Bis-Tris propano, pH = 6.25, secando las placas a 37°C durante = 25 minutos y poniendo las placas en bolsas de aluminio y sellando al vacío las bolsas. En otra modalidad del juego de ensayo de transcriptasa inversa de acuerdo con la invención, los componentes del ensayo se seleccionan del grupo que consiste en los reguladores Tris y Hepes, pH = 7-8, los iones de metal divalentes Mg2+ y Mn2+, los queladores de ácido etilenodia inotetra-acético (EDTA) y etilenglicol-bis (ß-aminoetil éter) de ácido N,N, N' , N' tetracético (EGTA) y, las poliaminas espermina y espermidina, los inhibidores de RNasa sulfato de heparina y sulfato de dextrán, los agentes reductores ditiotretiol (DTT), ditioeritritol (DTE), y glutationa, las sales NaCl y KCl, los agentes estabilizantes de suero de becerro neonato (NCS) y albúmina de suero bovino (BSA) los detergentes Tween 20 y Tritón X-100, el desoxinucleótido trifosfato de BrdUTP, el cebador oligo dT u oligo dN en donde N es otro análogo de T tal como U, y los agentes protectores ATP, GTP y CTP. La presente invención también se dirige al uso de un juego de ensayo de acuerdo con la invención para el análisis cualitativo y cuantitativo de la actividad de la transcriptasa inversa en una muestra biológica, por ejemplo una muestra biológica que se selecciona entre extractos de células y fluidos biológicos, tales como plasma, suero, fluido espinal, fluido sinovial y fluido pleural. En una modalidad preferida el uso de acuerdo con la invención es seguido por la evaluación del estado de la actividad de la transcriptasa inversa relacionada con el padecimiento o enfermedad basado en el resultado del análisis de la actividad de transcriptasa inversa. Adicionalmente, la presente invención se dirige a un método de análisis cualitativo y cuantitativo de la actividad de la transcriptasa inversa en una muestra biológica que comprende los pasos de usar y seguir las instrucciones por escrito del juego de ensayo de la transcriptasa inversa de acuerdo con la invención para la determinación de la actividad de la transcriptasa inversa en la muestra biológica, por ejemplo una muestra biológica que se selecciona entre extractos celulares y fluidos biológicos, tales como plasma, suero, fluido espinal, fluido sinovial, y fluido pleural. En una modalidad preferida el método de acuerdo con la invención se sigue por la evaluación del estado del padecimiento o enfermedad relacionado con la actividad de la transcriptasa inversa basándose en el resultado del análisis de la actividad de la transcriptasa inversa. La presente invención se ilustrará ahora haciendo referencia a los dibujos y a una descripción más detallada de las modalidades, pero estas modalidades no deberán considerarse limitantes del alcance de la protección definida en las reivindicaciones anexas. Breve descripción de los dibujos Figura 1. La actividad de la transcriptasa inversa se determinó en un medio a partir de un cultivo de la línea celular PK 15 con dos métodos. Los valores de absorbancia obtenidos se graficaron contra la cantidad de medio añadido a la mezcla de la reacción. Figura 2. La determinación de transcriptasa inversa directa en muestras de fluido sinovial recolectado de pacientes que sufren de artritis reumatoide. Los valores graficados se obtuvieron de muestras de 1 microlitro y una reacción de la transcriptasa inversa durante la noche. Figura 3. La actividad de la transcriptasa inversa se determinó en un extracto a partir de cáncer mamario con dos métodos. Los valores de absorbancia obtenidos se graficaron contra la cantidad de extracto añadido a la mezcla de la reacción. Figura 4. Determinación directa de la actividad de transcriptasa inversa en extractos de biopsias de cáncer mamario. Los valores de absorbancia se grafican contra la concentración de proteína en cada muestra obtenida de 1 microlitro de extracto y una reacción de transcriptasa inversa durante la noche. Figura 5. La actividad de transcriptasa inversa en: (A) un medio de un cultivo de HTLV-1 de células transformadas y (B) un medio de un cultivo infectado con BLV se determinó con dos métodos. Los valores de absorbancia obtenidos se graficaron contra la cantidad de muestra añadida a la mezcla de la reacción. Figura 6. Determinación directa de la actividad de transcriptasa inversa en suero a partir de macacos infectados con VIS. Los valores de absorbancia obtenidos en un ensayo de transcriptasa inversa de 4 horas se graficaron contra el tiempo del muestreo de suero. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES DE LA INVENCIÓN El juego de ensayo de transcriptasa inversa de la invención comprende tres diferentes tipos de componentes, a saber 1) Una plantilla que consiste en ácido polirriboadenílico (prA) o ácido polidesoxiadenílico (pdA) unido a una fase sólida. 2) Mezclas de la reacción que permiten que las enzimas polimericen una nueva cadena de ADN de una manera dependiente del cebador usando el polinucleótido de la plantilla anexada. 3) Componentes de un sistema de detección para la detección inmunológica de la cadena de ADN sintetizada in vi tro . 1) Plantilla de enlace de fase sólida Se ha desarrollado un método en donde prA o pdA se pueden unir a ciertos tipos de placas de microtitulación de una manera que permite que los polinucleótidos sirvan como plantillas para la incorporación de dNTP dependiente del cebador mediante polimerasas de ADN dependientes del ARN y ADN celular y viral (transcriptasas inversas, RT) . Se ha demostrado trabajar en dos placas de microtitulación disponibles comercialmente, CovaLink® y NucleoLink® de Nalge Nunc International. El prA acoplado a placas de microtitulación usadas para los juegos de ensayo de acuerdo con la invención se produjeron en tiras de NucleoLink®. El procedimiento y los reguladores se describen en la Tabla 1. El mecanismo del enlace no se conoce ya que el procedimiento no corresponde a los métodos recomendados o sugeridos por el fabricante o establecidos explícitamente en la literatura. El mecanismo de reacción posible involucra grupos reactivos introducidos durante el procedimiento de fabricación pero distintos de los insertados del uso conocido y pretendido de esa superficie específica. Resultados similares se espera que se obtengan con otras placas de microtitulación basadas en poliestireno de otras fuentes comerciales. Un método para activar químicamente el poliestireno para obtener una superficie con propiedades iguales a las de las placas CovaLink® ha sido publicada (Zammatteo y colaboradores -96) . Varios otros métodos para unir polinucleótidos a superficies de plástico se han publicado (Zammatteo y colaboradores -96, Gregorius y colaboradores -95, Niveleau y colaboradores -93, Rasmussen y colaboradores -91, Ghosh y Musso -87) . 2) Tipo de transcriptasa inversa adaptada a las mezclas de reacción Las condiciones generales para obtener la incorporación de nucleótido mediante polimerasas de ADN dependientes de ARN y ADN en sistemas solubles usando enzimas purificadas son simples y muy conocidas. Incluyen un regulador que mantiene el pH alrededor de 7.5, un ion de metal divalente, Mg2+ u ocasionalmente Mn2+, una sal para ajustar la fuerza iónica, para algunas enzimas un agente reductor y un poquito de detergente. Proporcionado con este regulador simple de reacción las enzimas serán capaces de utilizar la plantilla añadida, cebador y trifosfatos de desoxinucleótido para sintetizar una cadena de ADN. Este concepto general no toma en cuenta las diferencias en condiciones de reacción óptimas o especialmente adaptadas que se requieren entre diferentes tipos clásicos de transcriptasas inversas. Otro aspecto importante es la capacidad deseada de la mezcla de la reacción para tolerar la adición de fluidos biológicos no tratados o extractos celulares como fuente de actividad enzimática de la transcriptasa inversa. Las pruebas sistemáticas usando tanto muestras crudas como sobrenadantes de cultivos celulares y enzimas purificadas revelaron otros componentes de reacción que se usaron para crear mezclas de reacción optimizadas o especialmente adaptadas para transcriptasas inversas específicas . La Tabla 2 contiene un resumen de los componentes usados para componer las mezclas de reacción adaptadas al tipo de transcriptasa inversa individual. Las composiciones de mezclas de reacción típicas se presentan en la Tabla 3. El método de ensayo de transcriptasa inversa de la invención se realiza como se describe más adelante. El primer paso en el ensayo es añadir 100 microlitros de mezcla de la reacción a cada pozo de una placa de microtitulación acoplado con prA, seguido por 20-60 minutos de preincubación a 33°C. La muestra que contiene la transcriptasa inversa se añade entonces en 50 microlitros de regulador, dando un volumen de ensayo final de 150 microlitros, y la placa de microtitulación se incuba a 33°C. Cada muestra se añade a placas de microtitulación por duplicado para permitir dos veces de ensayo, estandarizados a 3 horas y durante la noche, promediando 16-20 horas. Se proporciona un procedimiento paso a paso en las instrucciones por escrito o en el manual del usuario incluido con cada juego. Contiene sugerencias o instrucciones de cómo adaptar los componentes de ensayo de transcriptasa inversa genéricos a algunas o a todas las siguientes aplicaciones: 1) Cuantificación de la actividad de transcriptasa inversa. 2) Selección de la actividad de transcriptasa inversa en extractos celulares, sobrenadantes celulares y/o fluidos biológicos incluyendo pero sin limitarse a plasma, suero, fluido espinal, fluido sinovial, y fluido pleural. 3) Determinación del anticuerpo que bloquea la actividad de transcriptasa inversa. 4) Determinación de los valores de IC50 de las sustancias que inhiben la actividad de transcriptasa inversa. Usando estas mezclas de reacción y las plantillas de enlace de fase sólida diseñamos los ensayos reclamados que son más sensibles en mediciones directas de la actividad de transcriptasa inversa que otros ensayos previamente descritos basados en plantillas de enlace de fase sólida o de la detección permitida de actividades de transcriptasa inversa previamente desconocida. 3. Detección inmunológica de la cadena de ADN sintetizada in vi tro . La polimerasa en la muestra sintetiza una cadena de ADN usando el trifosfato de bromo-desoxiuridina (BrdUTP) proporcionado en la mezcla de la reacción. El trifosfato de bromo-desoxiuridina incorporado se detecta mediante el anticuerpo monoclonal que enlaza con BrdU conjugado con fosfatasa alcalina. La actividad de la fosfatasa alcalina del anticuerpo ligado se cuantifica entonces añadiendo una solución de sustrato que contiene fosfato de para-nitro fenilo, pNPP . La solución del sustrato se vuelve amarilla cuando el pNPP es disociado por la fosfatasa alcalina. La densidad óptica (OD) se mide en un lector del ensayo inmunológico de enzima enlazada estándar a una longitud de onda de 405 nm. El valor de densidad óptica corregido para el fondo es proporcionar a la actividad de transcriptasa inversa en la muestra. El paso de detección se realiza como se describe más adelante. Se proporciona un procedimiento paso a paso en las instrucciones por escrito o el manual del usuario incluido con cada juego. Las composiciones en las soluciones reguladoras se dan en la Tabla 4. Después del ensayo de transcriptasa inversa, la placa de microtitulación se lava ya sea usando una de los lavadores de placa del ensayo inmunológico de enzima enlazada disponibles comercialmente o mediante sumergir en serie la placa en cubetas con el regulador de lavado. El anticuerpo conjugado se proporciona opcionalmente en el juego en forma liofilizada. Después de la reconstitución con 1 por ciento de Tritón X-100 en agua doblemente destilada 100 microlitros de la solución del anticuerpo se añade a cada pozo y la placa de microtitulación se incuba a 33°C durante 90 minutos. Para remover el anticuerpo excedente, la placa se lava subsecuentemente de la misma manera una segunda vez. La solución del sustrato se prepara a partir de regulador y tabletas de pNPP opcionalmente proporcionadas con el juego. Los valores de densidad óptica se miden entonces en intervalos de tiempo convenientes.

La relación lineal entre la cantidad de enzima de fosfatasa alcalina enlazada y la concentración del producto amarillo se descompone con valores de densidad óptica altos. Midiendo la densidad óptica en diferentes momentos es posible obtener valores útiles, es decir valores de densidad óptica dentro del rango de lectura lineal del instrumento particular, para muestras tanto con cantidades altas y bajas del producto formado durante el paso de ensayo de transcriptasa inversa. Las enzimas de transcriptasa inversa de referencia opcionalmente incluidas en algunos pero no todos los juegos se calibran para dar curvas de titulación con valores de densidad óptica útiles cuando la densidad óptica se mide después de 30 minutos, 2 horas y 16-20 horas, es decir durante la noche. El desempeño mejorado obtenido con los juegos de ensayo de transcriptasa inversa de la invención se demuestra en la Tabla 5. Las curvas de titulación de transcriptasa inversa del VIH-1 se obtuvieron con el juego Lenti RT conocido anteriormente de Cavidi Tech AB y con el juego de ensayo de la presente invención. Los valores de densidad óptica se pueden graficar contra la concentración de enzima de transcriptasa inversa y se ajustan a la línea recta usando ajuste por mínimos cuadrados. Los k valores de la Tabla 6 son las pendientes de las rectas calculadas y son una medida de la sensibilidad del ensayo. Se puede ver que los juegos de ensayo de la invención tienen k valores que están en orden de magnitud mayor. En términos prácticos esto se traduce a mediciones útiles para muestras que contienen una concentración mucho más baja de transcriptasa inversa del VIH-1 y/o ahorrar tiempo. Los tiempos de ensayo de transcriptasa inversa más cortos y/o un tiempo de lectura más corto de fosfatasa alcalina significa un tiempo de espera más corto para los usuarios de los juegos de la presente invención. COMPONENTES TÍPICOS DEL JUEGO DE LA INVENCIÓN A. Dos placas de microtitulación de 96 pozos con prA y/o pdA anexado. B. Una dilución muestra y regulador de reacción que contiene un tipo de transcriptasa inversa adaptado en mezcla de componentes I-IX enlistados en la Tabla 2. C. Componentes de la reacción liofilizada X-XII mezclados o proporcionados en frascos separados. D. Enzima de referencia liofilizada ya sea recombinante, natural purificada o partículas virales. E. Regulador de lavado concentrado. F. Anticuerpo monoclonal anti-BrdU conjugado con fosfatasa alcalina liofilizada, denotado "Rastreador de Producto RT". G. Regulador de sustrato de fosfatasa alcalina y tabletas de pNPP.

H. Instrucciones por escrito o manual. EJEMPLOS Ejemplo 1 Detección mejorada de PERV (retrovirus endógeno porcino) transcriptasa inversa en sobrenadantes celulares. La línea de célula porcina PK-15 (riñon porcino) se sabe que continuamente produce pequeñas cantidades de retrovirus endógeno porcino. Sobrenadantes de un cultivo de células PK15 se diluyeron en serie. Se probó la capacidad del ensayo de transcriptasa inversa tipo C del Cavidi tech AB y del ensayo Mn2+ de la presente invención para detectar la actividad de transcriptasa inversa en cada dilución. Los datos mostrados en la Figura 1 se originan de un ensayo de transcriptasa inversa durante la noche. El juego de ensayo de la invención exhibe una sensibilidad aumentada aproximadamente 25 veces en comparación con una de la técnica anterior. No fue posible usar más muestra para compensar la diferencia en sensibilidad de detección, ya que el ensayo tipo C sufrió de niveles de fondo aumentado y desviaciones de la linealidad con el tiempo y/o la cantidad de muestra en concentraciones de sobrenadante más altas (>2 microlitros/pozo) . El juego de ensayo de la invención se puede usar en estudios con respecto a la transferencia posible de retrovirus exógeno y/o la activación de retrovirus endógeno junto con xenotransplantes . Ejemplo 2 Medición directa de la transcriptasa directa en los fluidos sinoviales . Experimentos recientes de la hibridización de ADN han sugerido la asociación entre ciertos desórdenes reumáticos y la presencia de secuencias asociadas con retrovirus. Muestras congeladas de fluidos sinoviales de pacientes con artritis reumatoide se obtuvieron del departamento de Reumatología en Karolinska sjukhuset, Estocolmo, Suecia. Las muestras habían sido aclaradas de células y residuos mediante centrifugación a baja velocidad antes de la congelación. Las muestras se descongelaron, se diluyeron en serie y se investigaron para determinar la actividad de transcriptasa inversa. Las actividades obtenidas fueron recalculadas para densidad óptica 405/hora. La Figura 2 presenta las actividades de transcriptasa inversa encontradas usando 1 microlitro de muestra y una reacción de enzima durante la noche en fluido sinovial del ensayo de transcriptasa inversa de la invención. No se detectó actividad de transcriptasa inversa en ninguna de las muestras investigadas por el ensayo Lenti o de transcriptasa inversa tipo C de Cavidi Tech AB. Ejemplo 3 Detección de la actividad de transcriptasa inversa en extractos de cáncer mamario humano. Una contraparte humana endógena o exógena al MMTV (virus de tumor mamario de ratón) se implicó en la etiología del cáncer mamario humano. Usando transcriptasa inversa del MMTV para optimizar las condiciones del ensayo, la actividad de transcriptasa inversa podría detectarse en extractos de cánceres mamarios sin la previa concentración ni purificación. Los extractos congelados de cánceres mamarios humano se obtuvieron del departamento de Oncología en Akademiska sjuhuset, Uppsala, Suecia. El tejido de tumor ha sido homogenizado y suspendido en un regulador estándar (pH 7.4). Los sobrenadantes se recolectaron después de la clarificación mediante centrifugación a baja velocidad. Las muestras se descongelaron, se diluyeron en serie y se investigaron para determinar la presencia de actividad de transcriptasa inversa en el ensayo de transcriptasa inversa Mg2+ de la invención y el ensayo Lenti o tipo C de transcriptasa inversa de Cavidi Tech AB. La Figura 3 muestra un ejemplo representativo de los resultados obtenidos usando una reacción de transcriptasa inversa durante la noche combinada con una reacción AP de 2 horas. La diferencia en la sensibilidad de detección entre el ensayo de transcriptasa inversa de Mg2+ de la invención y el ensayo de transcriptasa inversa Lenti de Cavidi Tech AB fue de aproximadamente 400 veces. No se detectó actividad en el ensayo de transcriptasa inversa tipo C de Cavidi Tech AB. La Figura 4 ilustra la variación de las actividades de transcriptasa inversa detectadas por el ensayo de transcriptasa inversa de Mg2+ en extractos de tumor de diferentes pacientes. El juego de ensayo de la invención se puede usar en estudios con respecto al papel posible de retrovirus endógenos o exógenos en la etiología del cáncer mamario así como usarse para propósitos de diagnóstico. Ejemplo 4 Detección de virus parecidos a HTLV (virus de leucemia de células T humanas) en sobrenadantes de cultivos celulares. Algunos individuos infectados con HTLV desarrollan padecimientos oncológicos o mielopáticos . En ciertas partes de Japón y Asia del Sur se describió primero la leucemia de células T de adultos asociado con enfermedad. Un desorden neurológico, paraparesis espástica del trópico, se describió inicialmente en pacientes del Caribe. Los métodos capaces de detectar la exposición al virus y/o la presencia continua de bajos niveles de actividad viral es deseable. Un virus bovino muy relacionado, el virus de leucemia bovina (BLV) es un patógeno en vacas con grandes consecuencias económicas para las industrias de lácteos y de criadero de ganado. El BLV se usó para optimizar un ensayo para la actividad de transcriptasa inversa de BLV/HTLV.

La Figura 5A ilustra la diferencia en sensibilidad de detección entre el juego de ensayo de la invención y el ensayo de transcriptasa inversa de Lenti de Cavidi Tech AB. Los sobrenadantes de cultivo celular de la línea celular transformada del HTLV 1 MT-2 se diluyó en serie y se usaron dos ensayos de transcriptasa inversa para determinar la cantidad de actividad de transcriptasa inversa en cada muestra. El tiempo de la reacción de la transcriptasa inversa usado fue durante la noche (14 horas) . La Figura 5B muestra los datos correspondientes de un conjunto de diluciones de sobrenadantes de células FLK-BLV. (Esta línea celular está infectada crónicamente con BLV) . La ganancia total en sensibilidad de detección fue de aproximadamente 25 veces para la enzima del HTLV respectivamente. El aumento de sensibilidad fue esencial para obtener una señal significativa del sobrenadante de las células MT-2. Ejemplo 5. Determinación directa de la actividad de la transaminasa inversa en suero crudo de macacos infectados con VIS. La cuantificación de la actividad de la transcriptasa inversa en el suero se puede usar para la detección de la réplica de virus durante la infección aguda de virus lenti. La actividad de la transcriptasa inversa en suero después se amortigua mediante la producción de anticuerpo inhibitorio de la transcriptasa inversa. Un grupo de cuatro macacos cinomolgus {Macaca fasciculari s) ocupados como controles sin tratamiento en un estudio de tratamiento fueron infectados con diez dosis infecciosas para mono (MID50) de VISsm. El suero se muestreó en tiempos indicados después de que la infección se diluyó en serie y se probó para determinar la actividad de la transcriptasa inversa usando el ensayo de transcriptasa inversa de Lenti de la invención. Se incluyeron muestras de cinco microlitros en una reacción de transcriptasa inversa de cuatro horas, y los valores de absorbancia obtenidos se volvieron a calcular en densidad óptica OD405/h y se graficaron contra días después de la infección, véase la Figura 6. El ensayo de transcriptasa inversa de Lenti de la invención es lo suficientemente sensible para detectar réplica de virus mediante el análisis de suero muestreado durante la infección en etapa aguda. Las pruebas actualmente usadas para analizar la positividad del VIH entre donadores de sangre humana se basa en la detección de anticuerpos hacia las proteínas del VIH-1 y fallan en detectar a las personas infectadas durante la etapa aguda de la infección. Estas pruebas en algunos países se suplementan mediante la detección de antígeno viral mediante el ensayo de inmunosorbencia de enzima enlazada o genoma viral mediante reacción de cadena de polimerasa. Ambos tipos de pruebas pueden fallar en detectar cepas de virus desviantes debido a gran variación genética e inmunológica entre los virus VIH. La transcriptasa inversa tiene una función indispensable para la réplica de todos los retrovirus y el actual ensayo ofrece una alternativa atractiva para la detección de infecciones agudas .

Tabla 1 Añadir 100 microlitros de solución de acoplamiento a cada pozo. Incubar placas a temperatura ambiente durante 2 horas . Lavar cada pozo con 2x300 microlitros de regulador de lavado. Secar las placas a 37 °C durante 25 minutos. Poner las placas en bolsas de hoja de aluminio y sellarlas al vacío. Almacenar a -20°C.

Tabla 2 Componente Sustancia Rango de concentración útil en la mezcla de la reacción final I Regulador Tris, Hepes 10-100 mM; pH 7.0-8.0 II Ion de metal Mg2+, Mn2+ 0-20 mM divalente III Quelante EDTA, EGTA 0-0.5 mM IV Poliamina Espermina 0-20 mM Espermidina V Inhibidor de Sulfato de heparina 0-100 µg/ml RNasa Sulfato de dextrán VI Agente reductor DTT, DT, 0-5 mM Glutationa VII Sal NaCl, KCl 0-100 mM VIII Agente NCS, BSA 0-1 mg/ml estabilizante IX Detergente Tween 20, 0-1.0% Tritón X-100 X Trifosfato BrdUTP 1-50 uM desoxinucleótido XI Cebador oligo dT 5-100 ng/ml XII Agente protector ATP, GTP, CTP 0-5 M Abreviaturas : EDTA Acido etilenodiaminatetra-acético EGTA Acido N,N,N' ,N' -tetra-acético etilenglicol-bis (ß-aminoetil éter) DTT Ditiotretiol DTE Ditioeritritol NCS Suero de becerro neonato BSA Albúmina de suero bovino Tabla 3 Componentes en ensayo de transcriptasa inversa de Lenti optimizado de la invención Componente Sustancia Concentración en la mezcla de la reacción final I Regulador Hepes-HCl 10 mM; pH 7.6 II Ion de metal divalente MgCl2 4 mM III Quelante EGTA 0.2 mM IV Poliamina Espermina 2 pM V Inhibidor de RNasa Sulfato de dextrán 50 µg/ml VI Agente reductor VII Sal VIII Agente estabilizante BSA 0.5 mg/ml IX Detergente Tritón X-100 0.5% X Trifosfato BrdUTP 16 µM desoxinucleótido XI Cebador oligo dT 80 ng/ml XII Agente protector GTP 0.5 p Preservativo NaN3 1.92 mM Componentes en ensayo de transcriptasa inversa BLV/HTLV optimizada Componente Sustancia Concentración en la mezcla de la reacción final I Regulador Hepes-HCl 10 mM; pH 7.8 II Ion de metal divalente MgCl2 8 mM III Quelante EGTA 0.2 mM IV Poliamina Espermidina 1 mM V Inhibidor de PNasa Sulfato de dextrán 2 µg/ml VI Agente reductor Glutationa 0.6 mM VII Sal VIII Agente estabilizante BSA 0.5 mg/ml NCS 0.5% IX Detergente Tritón X-100 0.5% X Trifosfato BrdUTP 16 µM desoxinucleótido XI Cebador oligo dT 80 ng/ml XII Agente protector GTP 0.5 mM Preservativo NaN3 1.92 mM 2+ Componentes en el ensayo de transcriptasa inversa Mg optimizada de la invención Componente Sustancia Concentración en la mezcla de la reacción final I Regulador Hepes-HCl 10 irM; pH 7.6 II Ion de metal divalente MgCl2 25 pM III Quelante EGTA 2.5 irM IV Poliamina Espermina 0.15 irM Espermidina 3 mM V Inhibidor de RNasa VI Agente reductor Glutationa 1 M VII Sal VIII Agente estabilizante BSA 0.5 mg/ml NCS 0.25% IX Detergente Tritón X-100 0.5% X Trifosfato BrdUTP 16 µM desoxinucleótido XI Cebador oligo dT 80 ng/ml XII Agente protector ATP, GTP 0.5 mM Preservativo NaN3 1.92 mM 2+ Componentes en el ensayo de transcriptasa inversa Mn optimizada de la invención Componente Sustancia Concentración en la mezcla de la reacción final I Regulador Hepes-HCl 10 mM; pH 7.5 II Ion de metal divalente MhCl2 6 M III Quelante EDTA 0.3 mM IV Poliamina Espermidina 12 pM V Inhibidor de RNasa VI Agente reductor Glutationa 4 mM VII Sal VIII Agente estabilizante BSA 0.2 mg/ml IX Detergente Tritón X-100 0.5% X Trifosfato BrdUTP 16 µM desoxinucleótido XI Cebador oligo dT 80 ng/ml XII Agente protector GTP 0.5 mM Preservativo NaN3 1.92 mM Componentes en el ensayo de transcriptasa inversa de fluido sinovial de la invención Componente Sustancia Concentración en la mezcla de la reacción final I Regulador Hepes-HCl 10 mM; pH 7.6 II Ion de metal divalente MhCl2 1.2 pM III Quelante EDTA 0.13 mM IV Poliamina Espermidina 8 mM V Inhibidor de RNasa Sulfato de dextrán 17 µg/ml VI Agente reductor Glutationa 0.3 mM VII Sal KCl 20 M VIII Agente estabilizante BSA 0.3 mg/ml IX Detergente Tritón X-l00 0.5% X Trifosfato BrdUTP 16 µM desoxinucleótido XI Cebador oligo dT 80 ng/ml XII Agente protector GTP 0.5 mM Preservativo NaN3 1.92 mM Tabla 4 Componentes en el sistema de detección Regulador de lavado 3 mM Tris-HCl, pH 8.6 0.01% Tween-20 0.75% Tritón X-100 Regulador para el anticuerpo monoclonal anti-BrdUTP 25 mM Bis-Tris propano pH 8.9 250 mg/ml Leche seca sin grasa 0.01% Tween-20 1% Tritón X-100 1.92 mM NaN3 Solución de sustrato de fosfatasa alcalina 200 mM Tris-HCl, pH 9.8 1 mM MgC12 0.5 mg/ml pNPP 3.9 mM NaN3 Tabla 5 Correlación entre la concentración de enzima RT y los valores OD obtenidos con el ensayo de RT de Lenti de Cavidi Tech y el ensayo mejorado de la invención Ensayo de RT de Ensayo mejorado Lenti de Cavidi Tech pg/ml 3 hr RT/30 min AP 3 hr RT/30 min AP 1240 1.274 nd 551 0.594 nd 245 0.332 9.999 109 0.175 1.837 48.4 0.108 0.989 21.5 0.070 0.525 9.6 0.052 0.264 4.25 0.046 0.174 1.89 0.054 0.121 0.839 0.041 0.101 0 . 373 0.042 0.091 0 . 166 0.040 0.081 0 . 074 nd 0.075 0 . 033 nd 0.075 0 0 . 042 0 . 078 pg/ml de noche RT/2 hr AP de noche RT/2 hr AP 1240 9.999 nd 551 9.999 nd 245 9.999 9.999 109 9.999 9.999 48.4 1.91 9.999 21.5 0.961 9.999 9.6 0.55 9.999 4.25 0.267 2.283 1.89 0.148 1.134 0.839 0.094 0.6 0.373 0.075 0.334 0.166 0.056 0.198 0.074 nd 0.144 0.033 nd 0.124 0 0.048 0.094 pg/ml de noche RT/- de noche RT de noche AP de noche AP 1240 9.999 nd 551 9.999 nd 245 9.999 9.999 109 9.999 9.999 48.4 9.999 9.999 21.5 9.999 9.999 9.6 9.999 9.999 4.25 2.217 9.999 1.89 1.155 9.999 0.839 0.595 9.999 0.373 0.403 2.289 0.166 0.191 1.171 0.074 nd 0.701 0.033 nd 0.577 0 0.115 0.251 dn = no hecho Tabla 6 k valores obtenidos con el ensayo de RT de Lenti de Cavidi Tech y el ensayo RT de Lenti mejorado de la invención Ensayo de RT Lenti de Cavidi Tech Ensayo mejorado valor k valor k 3hr RT/30 min AP 0.0012 3 hr RT/30 min AP 0.0165 de noche RT/2hr AP 0.0432 de noche RT/2hr AP 0.5145 de noche RT/- 0.5453 de noche RT/- 5.2827 de noche AP de noche AP Referencias Baltimore D. (1970) RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature 226:1209-12.. • Baltimore D, Smoler D (1971) Primer require ent and 5 témplate specificity of the DNA polymerase of RNA tumor viruses. PNAS 68, 1507-11. Barre-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, Nugeyre MT, Chamaret S, Gruest J, Dauguet C, Axler-Blin C, Vezinet-Brun F, Rouzioux C, Rozenbaum W, Montagnier L (1983) . Isolation 10 of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for €> acquired immune deficiency syndrome (AIDS) . Science 200 (4599) :868-71. Bird RE, Chang-Yeh A. (1996) Methods and kits for detecting viral transcriptase activity in a sample using an 15 acidic pH or an elevated temperature. US581 7457. Di Cristofano A, Strazullo M, Longo L, La Mantia G (1995) Characterization and genomic mapping of the ZNF80 locus: expression of this zinc-finger gene is driven by a solitary LTR of ERV9 endogenous retroviral family. Nucleic Acids Res 23(15:2823-30. Duvic M (1995) Human immunodeficiency virus and the skin: selected controversies . J Invest Dermatol 105(1 Suppl) :117S-121S. Eberle J, and R. Seibl . (1992) A new method for 25 measuring reverse transcriptase activity by ELISA. J. Virol .

Methods 40:347-356. Ekstrand D.H.L., Awad R.J-K., Kállander C.F.R. and Gronowitz J.S. (1996) A sensitive assay for the detection and quantification of RT activity, based on the use of carrier bound témplate and non-radioactive product detection, with special referencia to HIV isolation. Biotechnology and Appli ed Biochemistry. 23, 95-105. Faff O, Murray AB, Schmidt J, Leib-Mosch C, Erfle V, Hehlmann R, Thelen K, Lówer J, Kurth R (1992) . Retrovirus-like particles from the human T47D cell line are related to mouse mammary tumour virus and are of human endogenous origin. J Gen Virol 73:1087-97. Ghosh SS, Musso GF (1987) Covalent attachment of oligonucleotides to solid supports. Nucleic Acids Res 15(13) : 5353-72. Goff S.P. (1990) Retrovirus reverse transcriptase: Synthesis, Structure and Function. Review. J. Acquir. Imm . Defi c . Syndr. 3:817-31. Gregorius K, Mouritsen S, EIsner Hl (1995) Hydrocoating: a new method for coupling biomolecules to solid phases. J Immunol Methods 181 (1) : 65-73. Gronowitz JS . , Neumüller M., Lennerstrand J., Bhikabahai R., Unge T., Weltman H & Kállander CFR. (1991) Carrier bound templates for single tube reverse transcriptase assays and for combined purification and activity analyses, with special reference to HIV. Biotech . Appl . Bi ochem 13:127- 142. Gupta, P., Balachandran, Grovit, K., Webster, D., and Rinaldo. C. (1987) J. Clin . Microbiol . 25, 1122-1125. Heneine W, Yamamoto S, Switzer WM, Spira TJ, Folks TM. (1995) Detection of reverse transcriptase by a highiy sensitive assay in sera from persons infected with human immunodeficiency virus type 1. J Infect Dis 171:1210-1216. Heneine W, Folks; Thomas M, Switzer W M, Yamamoto S. (1995) Methods for sensitive detection of reverse transcriptase. US5849494 . Jackson, B., Sannerud, K., Rhame, F., Tsang, R., and Balfour, H.H. (1987) Diagn . Microbiol . Infect . Dis . 7,185-192. Krieg AM, Steinberg AD (1990) Retroviruses and autoimmunity. J Autoimmun. 3(2):137-66. Krieg AM, Gourley MF, Perl A (1992) Endogenous retroviruses: potential etiologic agents in autoimmunity. FASEB J 6(8): 2537-44. Kállander CFR, Gronowitz JS, Neumüller TM, Karlstróm RA, Langstróm-Persson UM. (1998) . Method for polymerase activity determination. Svensk patent no 8804344-3, EP 0 447 442 Bl . Lee M., Sano K., Morales F.E., and D.T. Imagawa. (1987) Sensitive reverse transcriptase assay to detect and quantitate human immunodeficiency virus. J. Clin . Microbiol . 25:1717-21. Leib-Mósch C and Seifarth W (1996) Evolution and biological significance of human retroelements . Virus genes 11:133-145. Lower R, Lower J, Kurth R (1996) The viruses in all of us: characteristics and biological significance of human endogenous retrovirus sequences. Proc Nati Acad Sci U S 93(11) :5177-84. Martinelli SC, Goff SP (1990) Rapid reversión of a deletion mutation in Moloney murine leukemia virus by recombination with a closely related endogenous provirus. Virology 174 ( 1) : 135-44. Méese E, Gottert E, Zang KD, Sauter M, Schommer S, Mueller-Lantzsch N (1996) Human endogenous retroviral element klO (HERV-K10) : chromosomal localization by somatic hybrid mapping and fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet 72 (1) :40-2. Neumüller M., Karlstróm A.R., Kállander C.F.R., and J.S. Gronowitz. (1990) Improved assays for DNA-polymerizing enzymes by the use of enzymatically synthetized 5- (125I) iodo-2' deoxyuridine triphosphate, illustrated by direct quantitation of anti-HIV reverse transcriptase antibody and by serum DNA polymerase analyses. Bi otech . Appl . Bi ochem. 12:34-56.

Niveleau A, Sage D, Reynaud C, Bruno C, Legastelois S, Thomas V, Dante R (1993) Covalent linking of haptens, proteins and nucleic acids to a modified polystyrene support. Im unol Methods 159 (1-2) : 177-87. Porstmann T,, Meissner K., Glaser R., Dópel S-H., and G. Sydow. (1991) A sensitive non radioactive assay specific for HIV associated reverse transcriptase. J. Virol . Meth . 31:181-188. Rasmussen SR, Larsen MR, Rasmussen SE (1991) Covalent immobilization of DNA onto polystyrene microwells: the molecules are only bound at the 5' end. Anal Biochem 198 (1) :138-42. Silver J, Maudru T, Fujita K and Repaske R. (1993) An RT-PCR assay for the enzyme activity of reverse transcriptase capable of detecting single virions. Nucleic Acids Res 21:3593-3594. Temin HM, Mizutani S. (1970) RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus. Na t ure 226:1211-1213. Tónjes RR, Boller K, Limbach C, Lugert R, Kurth R.

Characterization of human endogenous retrovirus type K virus-like particles generated from recombinant baculoviruses . (1997) Virol ogy 233 (2) :280-91. Urabe T, Sano K, Nakano T, Odawara F, Lee MH, Otake T, et al. (1994) Differentiation between human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and HIV-2 isolates by nonradioisotopic reverse transcriptase-typing assay. J Clin Microbiol ; 32:1870-75. Urnovitz HB, and Murphy WH (1996) Human endogenous retroviruses: Nature, occurrence, and clinical implications in human disease. Clin Microbiol Rev 9:72-99. Weiss R: The search for human RNA tumor viruses. In R Weiss, N Teich, H Varmus, and J Coffin (eds) RNA Tumor viruses (2nd ed vol 1) 1205 1281. Cold Spring Harbor Laboratory Press., Cold Spring Harbor, New York, 1984. Wiikinson DA Mager DL and Leong J-A (1994) . Endogenous human retroviruses. In "The Retroviridae" (JA Levy, Ed) , vol 3, pp 465-535, 3 vols Plenum Press, New York. Zammatteo N, Girardeaux C, Delforge D, Pireaux JJ, Remacle J (1996) Amination of polystyrene microwells: application to the covalent grafting of DNA probes for hybridization assays. Anal Biochem 236 (1) : 85-9 . Zinkernagel RM, Cooper S, Chambers J, Lazzarini RA, Hengartner H, Arnheiter H (1990) Virus-induced autoantibody response to a transgenic viral antigen. Nature 345:68-71.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES 1. Juego de ensayo de transcriptasa inversa (RT) que comprende uno o varios paquetes que contienen plantilla (s) de ácido polirriboadenílico (prA) y/o ácido polidesoxiadenílico ligados a una fase sólida obtenibles poniendo en contacto una fase sólida basada en poliestireno con una solución de acoplamiento que comprende 1-metilimidazol, y prA y/o pdA, seguido por incubación, lavado con un regulador de lavado, secado y empaque, componentes de ensayo empacados por separado adaptados tipo transcriptasa inversa seleccionados del grupo que consiste en una mezcla o por separado de un regulador pH aproximadamente 7-8, ion de metal divalente, quelante, poliamina, inhibidor de RNasa, agente reductor, sal, agente estabilizante, y detergente, y una mezcla de o por separado, trifosfato desoxinucléotido liofilizado, cebador, agente protector y un regulador de lavado concentrado, y opcionalmente enzima (s) de referencia liofilizadas, y opcionalmente componentes de un sistema de detección que comprende anticuerpo monoclonal anti-BrdU conjugado con fosfatasa alcalina liofilizada, regulador de sustrato de fosfatasa alcalina y sustrato de fosfatasa alcalina, e instrucciones por escrito para el uso del juego de ensayo .
2. 2. Juego de ensayo de transcriptasa inversa de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la fase sólida es una placa de microtitulación y una alícuota de la solución de acoplamiento, que comprende 100 mM de 1-metilimidazol, pH aproximadamente 5-7, y 0.5-2 mg/ml prA y/o pdA, se añade a cada pozo, seguido por la incubación a una temperatura de 10- 60 °C durante 0.5 -10 horas, y lavando cada pozo para la remoción del 1-metilimidazol con el regulador de lavado, que comprende Bis-Tris propano, pH aproximadamente 5-7, y secar y empacar las placas.
3. 3. Juego de ensayo de transcriptasa inversa de acuerdo con la reivindicación 2, en donde 100 microlitros de la solución de acoplamiento, la cual compende 100 mM de 1-metilimidazol, pH aproximadamente 6.25, y 'l mg/ml prA y/o pdA, se añade a cada pozo, seguido por la incubación a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas, lavado de cada pozo con 2x300 microlitros del regulador de lavado, que comprende 10 mM Bis-Tris propano, pH aproximadamente 6.25, secar las placas a 37°C durante aproximadamente 25 minutos y colocar las placas en bolsas de hoja de aluminio y sellar al vacío las bolsas.
4. 4. Juego de ensayo de transcriptasa inversa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde los componentes del ensayo se seleccionan del grupo que consiste en los reguladores Tris y Hepes, pH aproximadamente 7-8, los iones de metal divalente Mg2+ y Mn2+, los quelantes ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) y etilenglicol-bis (beta-aminoetiléter) ácido N, N, N' , N' -tetracético (EGTA) y, las poliaminas espermina y espermidina, los inhibidores de RNasa sulfato de heparina y sulfato de dextrán, los agentes reductores ditiotretiol (DTT) , ditioeritritol (DTE) y glutatione, las sales NaCl y KCl, los agentes estabilizantes suero de becerro neonato (NCS) y albúmina de suero bovino (BSA) , el cebador oligo dT, y el agente protector agentes ATP, GTP y CTP.
5. 5. El uso de un juego de ensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para el análisis cualitativo y cuantitativo de la actividad de transcriptasa inversa en una muestra biológica.
6. 6. El uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el fluido biológico se selecciona fluidos biológicos y extractos de células.
7. 7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el fluido biológico se selecciona entre plasma, suero, fluido espinal, fluido sinovial y fluido pleural.
8. 8. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-7 seguido por la evaluación del estado de un padecimiento o enfermedad relacionados con una actividad de transcriptasa inversa
9. 9. Método de análisis cualitativo y cuantitativo de actividad de transcriptasa inversa en una muestra biológica que comprende los pasos de usar y seguir las instrucciones por escrito para el juego de ensayo de transcriptasa inversa de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-4 para la determinación de la actividad de transcriptasa inversa en la muestra biológica.
10. 10. Método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la muestra biológica se selecciona entre fluidos biológicos y extractos de células.
11. 11. Método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el fluido biológico se selecciona entre plasma, suero, fluido espinal, fluido sinovial y fluido pleural.
12. 12. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-11 seguido por la evaluación del estado de un padecimiento o enfermedad relacionada con la actividad de la transcriptasa inversa basado en el resultado del análisis de la actividad de la transcriptasa inversa.