ES2153807T3 - Secuencias de acido nucleico que se pueden utilizar como cebadores y sondas en la amplificacion y deteccion de todos los subtipos de vih-1. - Google Patents
Secuencias de acido nucleico que se pueden utilizar como cebadores y sondas en la amplificacion y deteccion de todos los subtipos de vih-1.Info
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Abstract
Un oligonucleótido sustancialmente complementario a una secuencia de la región LTR de una secuencia de ácido nucleico de un genoma del VIH, teniendo dicho oligonucleótido 10-50 nucleótidos de longitud y comprendiendo al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consta de: SEC ID 1: G GGC GCC ACT GCT AGA GA SEC ID 2: G TTC GGG CGC CAC TGC TAGA SEC ID 3: CGGGCGCCACTGCTA SEC ID 4: CTG CTT AAA GCC TCA ATA AA SEC ID 5: CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA SEC ID 12: GAT GCA TGC TCA ATA AAG CTT GCC TTG AGT SEC ID 6: TCT GGT AAC TAG AGA TCC CTC SEC ID 7: TAG TGT GTG CCC GTC TGT SEC ID 8: AGT GTG TGC CCG TCT GTT o la secuencia complementaria de las mismas.
Description
Secuencias de ácido nucleico que se pueden
utilizar como cebadores y sondas en la amplificación y detección de
todos los subtipos de VIH-1.
La presente invención se refiere a secuencias de
ácido nucleico que se pueden utilizar en el campo del diagnóstico de
virus, más específicamente en el diagnóstico de infecciones con el
Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) que causa el SIDA.
Si bien el diagnóstico de virus convencional se
ha basado predominantemente en la detección de antígenos víricos o
anticuerpos específicos de ellos, en los últimos años la atención se
ha desplazado hacia métodos para la detección directa del genoma de
virus o secuencias de ácido nucleico derivadas del mismo, tanto ARN
como ADN. Estos métodos se basan generalmente en la hibridación de
ácido nucleico. La hibridación de ácido nucleico se basa en la
capacidad de dos hebras de ácido nucleico que contienen secuencias
complementarias de anelarse entre sí en condiciones apropiadas,
formando así una estructura trenzada doble. Cuando se etiqueta la
hebra complementaria, se puede detectar la etiqueta y es indicativa
de la presencia de la secuencia diana. Especialmente en combinación
con métodos para la amplificación de secuencias de ácido nucleico,
estos métodos se han convertido en una importante herramienta de
diagnóstico vírico, en particular para la detección de virus de
inmunodeficiencia humana (VIH).
Las técnicas de amplificación de ácido nucleico
son especialmente útiles como técnica adicional en los casos en los
que los métodos serológicos ofrecen resultados dudosos o en los
casos en los que puede existir un período de tiempo considerable
entre la infección y el desarrollo de los anticuerpos para el
virus. Con VIH, normalmente, la seroconversión se puede producir
unos 3 a 6 meses después de la exposición al virus. Por tanto,
aunque no se detecten anticuerpos con los inmunoensayos
convencionales, pueden ser detectables ADN provírico o ARN vírico
circulante. Asimismo, en terapia antivírica de seguimiento, los
métodos basados en la amplificación de ácido nucleico presentan
varias ventajas con respecto a los métodos serológicos.
Especialmente, los métodos de amplificación cuantitativa
proporcionan una poderosa herramienta para valorar los cambios en
la cantidad de virus presentes antes y durante la terapia.
La elección de los oligonucleótidos que se han de
utilizar como cebadores y sondas en la amplificación y detección de
secuencias de ácido nucleico es crítica para la sensibilidad y
especificidad del ensayo. Normalmente, la secuencia que se ha de
ampliar está presente únicamente en una muestra (por ejemplo en una
muestra de sangre obtenida de un enfermo que supuestamente padece
la infección vírica) en cantidades diminutas. Los cebadores deberán
ser suficientemente complementarios de la secuencia diana como para
permitir una amplificación eficaz del ácido nucleico vírico presente
en la muestra. Si los cebadores no se anelan de forma apropiada
(debido a un emparejamiento deficiente de las bases de los
nucleótidos en ambas hebras) con la secuencia diana, la
amplificación se verá seriamente dañada. Esto afectará a la
sensibildiad del ensayo y puede tener como resultado unos resultados
de ensayo negativos falsos. Debido a la heterogeneidad de genomas
víricos, se pueden obtener resultados de ensayo negativos falsos
cuando los cebadores y las sondas son capaces de reconocer las
secuencias presentes solamente en parte de las variantes del virus.
El virus VIH presenta una alta heterogeneidad. Se ha demostrado la
variabilidad genética entre aislados de diferentes continentes,
pero también entre distintos individuos y entre diferentes estadios
de la enfermedad. En función del análisis de secuencia, se han
identificado dos grupos dentro de VIH-1: el grupo M
(M de "major" - principal), y el grupo O (O de "outlier"
anexo). Dentro del grupo M, se han asignado subtipos
(A-H), que constituyen cada uno de ellos un grupo
de secuencias por separado filogenético, y se están identificando
otros adicionales. Esta variación de secuencia no está uniformemente
distribuida en todo el genoma. El genoma VIH-1, al
igual que todos los genomas retrovíricos, consiste de forma
aproximada en las siguientes regiones: el gen gag del genoma
VIH-1 es la región que codifica las proteínas de
núcleo del virus (por ejemplo, p24); el gen env codifica una
proteína de precursor grande, gp 160, que es procesada para
convertirse en las proteínas de envuelta gp 120 y gp41. El gen
pol codifica la polimerasa del virus (transcriptasa
inversa). Las regiones de Repetición Terminal Larga (LTR) son las
regiones en el genoma vírico que participan en la integración del
virus con la célula huésped y en la regulación de la transcripción
de genes víricos. Algunas regiones son más propensas a la variación
de secuencia que otras. Sobre todo, en la secuencia de dominio
env, la variación puede alcanzar hasta un 30% entre miembros
de diferentes subtipos. De forma ideal, la selección del cebador se
deberá basar en la información sobre la variabilidad entre una cepa
y otra en secuencias de cebador candidato y las consecuencias de
emparejamiento deficiente en sedes de cebador. McCutcheon y cols.,
J. AIDS, 4, 1241-1250, 1991, utiliza PCR para
realizar una comparación genética de diferentes aislados de
VIH-1. Utilizando PCR anclada (se utilizaron
cebadores de varios sentidos con un cebador antisentido constante;
se seleccionaron cebadores de regiones relativamente conservadas en
gag, env y LTR). Se investigó el efecto del emparejamiento
deficiente de cebador en la cantidad de producto de PCR obtenido.
El emparejamiento deficiente en el extremo 3' del cebador disminuyó
la cantidad del producto a veces en más de
100 veces.
100 veces.
La detección de todos los subtipos de
VIH-1 conocidos actualmente es de una importancia
enorme, sobre todo en lo que se refiere a la gestión del paciente,
la seguridad de la sangre y los productos sanguíneos y los estudios
clínicos y epidemiológicos. Los ensayos actuales para la
amplificación y la posterior detección de secuencias de ácido
nucleico derivadas de VIH-1 se basan normalmente en
la amplificación de secuencias en la región gag del genoma
vírico. Estos ensayos han sido desarrollados para detectar el
subtipo B, que es el principal subtipo en países europeos y en los
Estados Unidos. Sin embargo, la presencia de otros subtipos, que
estaban antes confinados geográficamente, está aumentando debido a
los frecuentes desplazamientos entre estos países y, por ejemplo,
países africanos. Por lo tanto, se necesitan ensayos sensibles con
los que se puedan detectar tantas variantes de virus
VIH-1 como sea posible (preferiblemente todas).
La investigación dirigida a la identificación de
grupos de cebadores adecuados para una amplificación fiable de
secuencias de ácido nucleico derivadas de VIH-1 ha
estado en curso durante los años pasados. Engelbrecht y cols., J.
Virol. Meth., 55, 391-400, 1995, describen un
estudio dirigido al desarrollo de un protocolo de PCR específico y
sensible utilizando pares de cebadores env, gag y LTR para
detectar subtipos presentes en el Cabo Oeste, Sudáfrica. Se
analizaron 24 cepas que, según se sabía, pertenecían a los subtipos
B, C y D. Se observó que el comportamiento de los pares de cebador
dependía en gran medida de la optimización de las condiciones de
reacción para los diferentes pares de cebador. Únicamente cuando se
utilizaron condiciones menos estrictas (por ejemplo, con el par de
cebador LTR, se necesitaron un aumento del tiempo de ciclo y
temperaturas de anelación inferiores) se pudieron detectar estas
cepas de VIH en particular con suficiente sensibilidad y
reproducibilidad con todos los pares de cebador.
Zazzi y cols. J. Med. Virol., 38,
172-174, 1992, desarrolló una reacción de PCR en dos
etapas (utilizando cebadores anidados) para detectar ADN de
VIH-1 en muestras clínicas. Los cebadores utilizados
para la amplificación se derivaron del gen gag y de la
región LTR. Los enfermos sometidos a ensayo en este estudio fueron
todos ellos de zonas colindantes, lo que hace probable que
representaran solamente un número limitado de diferentes cepas
víricas. En EP-A-0.617.132;
US-5.629.413 y
EP-A-0.331.939 se exponen otros
ejemplos de cebadores de PCR para la detección de VIH.
Vener y cols., en Bio Techniques, 21,
248-255, 1996 describen un método de PCR
cuantitativo en el que se utilizan cebadores anidados derivados de
LTR. Este procedimiento fue ensayado solamente en células
mononucleares de sangre periférica (PBMC), infectadas con
VIH-1_{MN}. Por lo tanto, no se puede decir nada
de la adecuación de los cebadores utilizados para la detección de
diferentes subtipos de virus.
Con la presente invención, se proporcionan
secuencias de nucleótido que se pueden utilizar como cebadores y
sondas en la amplificación y detección de ácido nucleico de
VIH-1. Las secuencias de oligonucleótido que
proporciona la presente invención están localizadas en la parte LTR
del genoma vírico de VIH. Se ha observado que al utilizar las
secuencias de la presente invención en métodos para la amplificación
y detección de ácidos nucleicos se puede obtener una detección
sensible y específica de VIH-1. El beneficio de las
secuencias de la presente invención reside principalmente en el
hecho de que, con la ayuda de cebadores y sondas que comprenden las
secuencias según la invención, se puede detectar el ácido nucleico
de todos los subtipos de VIH-1 conocidos
actualmente, con una alta precisión y sensibilidad. Hasta ahora, no
se ha desarrollado ningún par de cebador o sondas de hibridación que
permitiera la detección de dicha amplia gama de variantes de
VIH-1.
Las secuencias de oligonucleótido según la
presente invención son especialmente útiles en los métodos para la
amplificación de ácido nucleico.
Se conocen varias técnicas para la amplificación
de ácidos nucleicos dentro de la especialidad. Un ejemplo de una
técnica para la amplificación de un segmento diana de ADN es la
llamada "reacción en cadena de polimerasa" (PCR). Con la
técnica de PCR, se aumenta exponencialmente el número de copias de
un segmento diana en particular con una serie de ciclos. Se utiliza
un par de cebadores y, en cada ciclo, se anela un cebador de ADN con
el lateral 3' de cada una de las dos hebras de la secuencia diana de
ADN de doble hebra. Se extienden los cebadores con una ADN
polimerasa en presencia de los distintos mononucleótidos para
generar ADN de doble hebra de nuevo. Se separan las hebras del ADN
de doble hebra entre sí por desnaturalización térmica y cada hebra
sirve como plantilla para la anelación del cebador y la posterior
elongación en un ciclo posterior. El método de PCR ha sido descrito
por Saiki y cols., Science 230, 135, 1985, y en las patentes
europeas nº EP 200362 y EP 201184.
Otra técnica para la amplificación de ácidos
nucleicos es el llamado sistema de amplificación basado en
transcripción (TAS). El método TAS se describe en la solicitud de
patente internacional Nº WO 88/10315. Las técnicas de amplificación
basadas en la transcripción incluyen normalmente el tratamiento del
ácido nucleico diana con dos oligonucleótidos, incluyendo uno de
ellos una secuencia promotora, para generar una plantilla que
incluye un promotor funcional. Se transcriben múltiples copias de
ARN desde dicha plantilla que pueden servir como base para una
posterior amplificación.
Un método de amplificación basado en la
transcripción continua isotérmica es el llamado proceso NASBA
("NASBA"), tal como se describe en la patente europea nº EP
329822. NASBA incluye el uso de ARN polimerasa T7 para transcribir
múltiples copias de ARN a partir de una plantilla que incluye un
promotro T7. En EP 408295 se describen otras técnicas de
amplificación basadas en la transcripción. EP 408295 se refiere
principalmente a un método de amplificación basado en la
tanscripción de dos enzimas. Los métodos de amplificación basados en
la transcripción, por ejemplo el método NASBA descrito en EP 329822,
se emplean normalmente con un grupo de oligonucleótidos,
proporcionándose en uno de ellos una secuencia de promotor que es
reconocida por una ARN polimerasa dependiente de ADN como, por
ejemplo polimerasa T7. Dentro de la técnica se conocen varias
modificaciones de las técnicas basadas en la transcripción. Dichas
modificaciones incluyen por ejemplo el uso de oligonucleótidos
bloqueados (en los que se puede incorporar una secuencia de
promotor). Estos oligonucleótidos están bloqueados para inhibir una
reacción de extensión a partir de ellos (US5554516). Se pueden
utilizar uno o más "cebadores promotor" (oligonucleótidos
equipados con una secuencia de promotor) en técnicas de
amplificación basadas en la transcripción, combinadas opcionalmente
con el uso de uno o más oligonucleótidos que no están equipados con
una secuencia de promotor. Para la amplificación de ARN, la
tecnología preferible es una técnica de amplificación basada en la
transcripción. La amplificación mediante el uso de PCR, se puede
basar también en una plantilla de ARN. La PCR real requiere ser
precedida de una etapa de transcripción inversa para copiar el ARN
en ADN (RT-PCR). Sin embargo, si se utiliza
RT-PCR para la detección de transcriptos víricos,
es necesaria la diferenciación de productos de PCR derivados de
mARN y ADN. Se puede aplicar el tratamiento de ADNsa antes de
RT-PCR (Bitsch, A. y cols., J. Infect. Dis 167,
740-743., 1993; Meyer, T. y cols., Mol. Cell
Probes. 8, 261-271, 1994), pero a veces no es eficaz
en la eliminación del ADN contaminante de forma suficiente (Bitsch,
A. y cols., 1993).
En contraposición a RT-PCR,
NASBA, que se basa en la transcripción de ARN mediante ARN
polimerasa T7 (Kievits y cols., 1991; Compton, 1991) no requiere
diferenciación entre productos de amplificación derivados de ARN y
ADN ya que utiliza ARN como su principal diana. NASBA permite una
amplificación específica de dianas de ARN incluso en un entorno de
ADN.
El uso de los oligonucleótidos según la invención
no está limitado a ninguna técnica de amplificación en particular ni
modificación concreta de la misma. Es evidente que los
oligonucleótidos según la invención encuentran aplicación en muchas
técnicas de amplificación de ácido nucleico diferentes, así como
diversos métodos para detectar la presencia de ácido nucleico
(ampliado) de VIH. Los oligonucleótidos de la presente invención se
pueden utilizar igualmente en métodos de amplificación cuantitativa.
En EP 525882 se describe un ejemplo de dicho métodos
cuantitativo.
El término "oligonucleótido" tal como se
utiliza aquí se refiere a una molécula que consiste en dos o más
desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos. Dichos oligonucleótidos se
pueden utilizar como cebadores y sondas.
Naturalmente, basándose en las secuencias de los
oligonucleótidos de la presente invención, se pueden preparar
también análogos de oligonucleótidos. Dichos análogos pueden
constituir estructuras alternativas como "PNA" (moléculas con
una estructura de tipo péptido en lugar de la estructura de azúcar
de fosfato del ácido nucleico normal) o similares. Es evidente que
estas estructuras alternativas, que representan las secuencias de la
presente invención forman parte de la presente invención
igualmente.
El término "cebador" tal como se utiliza
aquí se refiere a un oligonucleótido que se da tanto de forma
natural (v.g., como fragmento de restricción) o es producido
sintéticamente, que es capaz de actuar como punto de inicio de la
síntesis de un producto de extensión de cebador que es
complementario de la hebra de ácido nucleico (plantilla o secuencia
diana) cuando se coloca en las condiciones adecuadas (v.g., tampón,
sal, temperatura y pH) en presencia de nucleótidos y un agente para
la polimerización de ácido nucleico, como por ejemplo polimerasa
dependiente de ARN o dependiente de ADN. Un cebador debe ser
suficientemente largo como para cebar la síntesis de productos de
extensión en presencia de un agente para la polimerización. Un
cebador típico contiene al menos aproximadamente 10 nucleótidos de
longitud de una secuencia sustancialmente complementaria u homóloga
de la secuencia diana, aunque se prefieren cebadores algo más
largos. Normalmente, los cebadores contienen aproximadamente
15-26 nucleótidos, si bien se pueden emplear
cebadores más largos, sobre todo cuando los cebadores contienen
secuencias adicionales como, por ejemplo, una secuencia de promotor
para una polimerasa en particular.
Normalmente, un grupo de cebadores consistirá en
al menos dos cebadores, uno "corriente arriba" y otro cebador
"corriente abajo" que definen conjuntamente el amplificato (la
secuencia que será amplificada mediante el uso de dichos
cebadores).
Principalmente, para el uso en técnicas de
amplificación basada en transcripción, los oligonucleótidos según la
invención se pueden unir también a una secuencia de promotor. El
término "secuencia de promotor" define una región de una
secuencia de ácido nucleico que es reconocida específicamente por
una ARN polimerasa que se une a una secuencia reconocida e inicia el
proceso de transcripción a través del cual se produce el transcripto
de ARN. En principio, se puede emplear cualquier secuencia de
promotor para la que se conozca y sea asequible una polimerasa que
sea capaz de reconocer la secuencia de iniciación. Los promotores
conocidos y útiles son aquellos que son reconocidos por determinadas
ARN polimerasas bacteriofagas como, por ejemplo, bactariofagos T3,
T7 o SP6. Los oligonucleótidos unidos a una secuencia de promotor se
denominan comúnmente "cebadores de promotor". No obstante, su
función como cebador, v.g., el punto de partida para una reacción de
elongación, se puede bloquear, tal como se ha mencionado antes, o
estar ausente en algunos modos de realización de las reacciones de
amplificación basadas en la transcripción.
Un oligonucleótido según la presente invención es
sustancialmente complementario de una secuencia de la región de LTR
de una secuencia de ácido nucleico de un genoma VIH, siendo dicho
oligonucleótido de 10-50 nucleótidos de longitud y
comprendiendo, al menos un fragmento de 10 nucleótidos, de una
secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
SEQ ID 1: G GGC GCC ACT GCT AGA GA
SEQ ID 2: G TTC GGG CGC CAC TGC TAG A
SEQ ID 3: CGGGCGCCACTGCTA
SEQ ID 4: CTG CTT AAA GCC TCA ATA AA
SEQ ID 5: CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA
SEQ ID 6: TCT GGT AAC TAG AGA TCC CTC
SEQ ID 7: TAG TGT GTG CCC GTC TGT
SEQ ID 8: AGT GTG TGC CCG TCT GTT
SEQ ID 12: GAT GCA TGC TCA ATA AAG CTT GCC TTG
AGT
o secuencia complementaria de las mismas.
Debe entenderse que los oligonucleótidos que
consisten en las secuencias de la presente invención pueden contener
supresiones, adiciones y/o sustituciones menores de bases de ácido
nucleico, en un grado en el que dichas alteraciones no afecten
negativamente al rendimiento del producto obtenido en ningún grado
significativo. Cuando se utilizan los oligonucleótidos según la
presente invención como sondas, las alteraciones no deberán tener
como resultado la reducción de la eficacia de hibridación de la
sonda. Por ejemplo, en el caso de técnicas de amplificación basadas
en la transcripción, en las que se puede incorporar en uno o más de
los cebadores una secuencia de promotor, la introducción de una
secuencia de hibridación rica en purina (=G ó A), inmediatamente
después e la secuencia de promotor, puede proporcionar un efecto
positivo en la transcripción (cuando hay C's y T's se puede producir
una transcripción abortiva). Si no está disponible dicha secuencia
en el ácido nucleico diana, se puede insertar una secuencia rica en
purina en el oligonucleótido inmediatamente después de los últimos
tres radicales G de la secuencia promotor. Las secuencias de la
presente invención se reflejan como secuencias de ADN. Los
equivalentes de ARN de estas secuencias forman igualmente parte de
la presente invención.
Los oligonucleótidos preferibles según la
presente invención son oligonucleótidos que consisten esencialmente
en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
SEQ ID 1: G GGC GCC ACT GCT AGA GA
SEQ ID 2: G TTC GGG CGC CAC TGC TAG A
SEQ ID 3: CGGGCGCCACTGCTA
SEQ ID 4: CTG CTT AAA GCC TCA ATA AA
SEQ ID 5: CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA
SEQ ID 6: TCT GGT AAC TAG AGA TCC CTC
SEQ ID 7: TAG TGT GTG CCC GTC TGT
SEQ ID 8: AGT GTG TGC CCG TCT GTT
SEQ ID 9: aat tct aat acg act cac tat agg gAG AGG
GGC GCC ACT GCT AGA GA
SEQ ID 10: aat tct aat acg act cac tat agg gAG
AGG TTC GGG CGC CAC TGC TAG A
SEQ ID 11: aat tct aat acg act cac tat agg
gCGGGCGCCACTGCTA
SEQ ID 12: GAT GCA TGC TCA ATA AAG CTT GCC TTG
AGT
SEQ ID 9-11: incluyen en realidad
la secuencia tal como reflejan SEQ ID 1-3. En la SEQ
ID 9-11, las secuencias de la SEQ ID
1-3 están operativamente unidas a una secuencia de
promotor (la secuencia de promotor T7). Esto hace que las secuencias
sean especialmente adecuadas para su uso como cebador corriente
arriba en una técnica de amplificación basada en transcripción como,
por ejemplo, NASBA.
Un modo de realización preferible de la presente
invención es el que consiste en un combinación de dos
oligonucleótidos según la invención, para su uso como grupo en la
amplificación de ácido nucleótido.
Dicho par de oligonucleótidos, para su uso como
grupo en la amplificación de una secuencia diana localizada dentro
de la región LTR del genoma de VIH-1, consiste en un
primer oligonucleótido de 10-50 nucleótidos de
longitud y que comprende, al menos un fragmento de 10 nucleótidos,
de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
SEQ ID 1: G GGC GCC ACT GCT AGA GA
SEQ ID 2: G TTC GGG CGC CAC TGC TAG A
SEQ ID 3: CGGGCGCCACTGCTA
y un segundo oligonucleótido de
10-50 nucleótidos de longitud y que comprende al
menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia seleccionada
del grupo que consiste en:
SEQ ID 4: CTG CTT AAA GCC TCA ATA AA
SEQ ID 5: CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA
SEQ ID 12: GAT GCA TGC TCA ATA AAG CTT GCC TTG
AGT
Uno de los oligonucleótidos puede servir como
"oligonucleótido corriente arriba", es decir un cebador
corriente arriba, mientras que el segundo oligonucleótido sirve
como "oligonucleótido corriente abajo", es decir cebador
corriente abajo, en la reacción de amplificación. La localización en
el genoma VIH (o la secuencia complementaria del mismo) con la que
se pueden anelar los dos oligonucleótidos comprendidos en dicho par
según la invención, definirá conjuntamente la secuencia del ácido
nucleico que se amplifica. La secuencia amplificada está localizada
entre los "sitios de unión de cebador" dentro de la región de
LTR del genoma VIH. Se ha observado que, utilizando un par de
oligonucleótidos según la invención en la reacción de amplificación,
se puede conseguir una amplificación precisa y fiable del ácido
nucleico derivado de todos los subtipos de VIH conocidos
actualmente.
Un par de oligonucleótidos sobre todo preferible
según la invención consistirá en un primer cebador que comprende la
SEQ ID NO 1 y un segundo cebador con la secuencia de SEQ ID NO 5.
Para su uso en un método de amplificación basado en transcripción,
es preferible el oligonucleótido con la SEQ ID NO 9, en combinación
con un oligonucleótido con la secuencia de SEQ ID NO 5.
Parte de los oligonucleótidos según la invención
son particularmente adecuados para su uso como sonda en la detección
de ácido nucleico amplificado con un par de oligonucleótidos según
la invención. Cuando se utilizan como sonda, se puede incorporar en
dichos oligonucleótidos una etiqueta detectable. Los
oligonucleótidos según la invención que son especialmente adecuados
como sonda consisten esencialmente en la secuencia:
SEQ ID 6: TCT GGT AAC TAG AGA TCC CTC
SEQ ID 7: TAG TGT GTG CCC GTC TGT ó
SEC ID 8: AGT GTG TGC CCG TCT GTT
equipadas con una etiqueta detectable. Un
oligonucleótido preferible sobre todo en este sentido es un
oligonucleótido con una secuencia tal como se representa en SEQ ID
6.
Dentro de la especialidad se conocen varias
fracciones de etiquetado. Dicha fracción puede ser por ejemplo un
compuesto radiactivo, una enzima detectable (v.g., peroxidasa de
rábano de caballo (HRP)), un hapteno como biotina, o cualquier otra
fracción capaz de generar una señal detectable como, por ejemplo,
colorimétrica, fluorescente, quimioluminiscente o
electroquimioluminiscente. También se pueden detectar híbridos entre
oligonucleótidos según la invención y ácido nucleico diana
(amplificado) a través de otros métodos conocidos entre los
especialistas en la técnica. Evidentemente, los métodos para la
amplificación de ácido nucleico, al igual que los que se han
mencionado anteriormente, mediante el uso de los oligonucleótidos
según la presente invención también forman parte de la presente
invención.
La presente invención proporciona asimismo
equipos de ensayo para la amplificación y detección de ácido
nucleico de VIH. El uso de estos equipos de ensayo permite la
detección selectiva precisa y sensible de muestras que supuestamente
contienen ácido nucleico derivado de VIH. Dichos equipos de ensayo
pueden contener un par de oligonucleótidos según la invención y,
opcionalmente, también un oligonucleótido según la invención que se
puede utilizar como sonda para la detección del material
amplificado. Por otra parte, el equipo de ensayo puede contener
reactivos de amplificación adecuados. Dichos reactivos son por
ejemplo las enzimas adecuadas para llevar a cabo la reacción de
amplificación. Un equipo, adaptado para su uso con NASBA, por
ejemplo, puede contener cantidades adecuadas de transcriptasa
inversa, RNasa H y ARN polimerasa T7. Dichas enzimas pueden estar
presentes en el equipo en una solución tamponada, aunque se pueden
proporcionar igualmente como una composición liofilizada, por
ejemplo, partículas esféricas liofilizadas. Dichas partículas
liofilizadas han sido descritas anteriormente en la solicitud PCT Nº
EP95/01268. El equipo puede estar equipado además con composiciones
de tampón, adecuadas para llevar a cabo una reacción de
amplificación. Dichos tampones se pueden optimizar para la técnica
de amplificación en particular para la que esté destinado el equipo,
así como para el uso con los oligonucleótidos en particular que se
proporcionan en el equipo. En las técnicas de amplificación basadas
en transcripción, como por ejemplo NASBA, dichos tampones pueden
contener, por ejemplo, DMSO, que potencia la reacción de
amplificación (tal como se describe en la solicitud PCT Nº US
90/04733).
Por otra parte, se puede incluir en el equipo un
control interno como mecanismo de comprobación del procedimiento de
amplificación y para prevenir que se produzcan resultados de ensayo
negativos falsos como consecuencia de fallos en el procedimiento de
amplificación. El uso de controles internos en las técnicas de
amplificación basadas en la transcripción se describe en la
solicitud PCT Nº EP 93/02248. La secuencia de control óptima se
selecciona para que no compita con el ácido nucleico diana en la
reacción de amplificación. Los equipos pueden contener también
reactivos para el aislamiento de ácido nucleico de un especimen
biológico antes de la amplificación. En EP 389063 se describe un
método adecuado para el aislamiento de ácido nucleico.
Figura
1
Productos de amplificación tras el manchado y
detección por quimioluminiscencia potenciada obtenidos tras la
amplificación en presencia (panel A) o ausencia (panel B) de ARN de
VIH-1 utilizando los siguientes pares de cebadores.
Banda 1: SEQ ID 9-SEQ ID 10, banda 2: SEQ ID
9-SEC ID 5, banda 3: SEQ ID 10-SEQ
ID 4, banda 4: SEQ ID 10-SEQ ID 5, banda 5: SEQ ID
3-SEQ ID 12.
Se aplicaron los siguientes procedimientos para
amplificar y detectar ARN genómico de VIH-1 de
muestras, tal como se describe en los siguientes ejemplos.
Se llevó a cabo el aislamiento de ácidos
nucleicos con arreglo a Boom y cols., 1990, Journal of Clinical
Microbiology 28, 495-503 y la patente europea nº EP
0389063. Brevemente: se añadió un volumen de 200 \mul de plasma
agrupado de donantes sanos (negativos para HBsAg,
anti-HIV y anti HCV) a 900 \mul de tampón de lisis
(Tris-HCl 47 mM, pH 7,2, EDTA 20 mM, Trition
X-100 al 1,2%, tiocianato de guanidina 4,7 M
(GusSCN, Fluka, Buchs, Suiza). Después de remover en torbellino y
del centrifugado (30 segundos, 13.000 rpm) se añadió una serie de
diluciones de ARN de VIH-1 subtipo B patrón,
caracterizada y descrita por Layne y cols., 1992, Virology 189,
695-714 o especímenes VIH-1
positivos. Tras la adición de 50 \mul de silicio activado
(suspensión 0,4 g/ml en HCl 0,1 N), se incubó la suspensión
durante 10 minutos a temperatura ambiente con removido en torbellino
regular. Tras el centrifugado (30-60 segundos,
13.000 rpm), se lavó dos veces el conglomerado de silicio con 1 ml
de tampón de lavado (GuSCN 5,25 M, Tris-HCl 50 mM,
pH 6,4), seguido de dos lavados con etanol al 70% y una etapa de
lavado con acetona. A continuación, se secó el conglomerado de
silicio durante diez minutos en un bloque de calentamiento a 56ºC.
Se eluyeron los ácidos nucleicos en silicio añadiendo 50 \mul de
tampón de elución (Tris-HCl 1,0 mM, pH 8,5) y se
incubaron a 56ºC durante 10 minutos. A continuación, se tomaron 5
\mul del eluato del conglomerado para su posterior uso en la
reacción de amplificación. Se almacenó el resto del eluato a
-70ºC.
Se llevaron a cabo amplificaciones en un volumen
de reacción de 20 \mul compuesto de 10 \mul de mezcla de
cebador, 5 \mul (aislado) de ácidos nucleicos y 5 \mul de
mezcla de enzimas. Se obtuvo la mezcla de cebador por reconstitución
de una acusfera liofilizada en 50 \mul de diluyente de acusfera,
51,6 \mul de agua, 8,4 \mul de KCl 2M y 5 \mul de cada cebador
(10 \muM). A continuación, se removió en torbellino a fondo la
mezcla antes de su uso. De esta primera mezcla de cebador, se
añadieron 10 \mul a 5 \mul del ARN de VIH-1
(aislado) (patrón). Se incubó la mezcla durante 5 minutos a 65ºC y
después se incubó a 41ºC durante otros 5 minutos. Después de estas
incubaciones, se añadieron 5 \mul de la mezcla de enzima y se
incubó durante 5 minutos a 41ºC. Se transfirieron los tubos a la
zona de detección y se incubaron durante 90 minutos a 41ºC. Después
de la reacción de amplificación, se almacenaron los tubos a -20ºC
hasta su uso posterior.
La reacción de amplificación contenía los
siguientes reactivos:
40 mM Tris-HCl, pH 8,5
12 mM MgCl_{2}
70 mM KCl
15% v/v sulfóxido de dimetilo
5 mM ditiotreitol
1 mM de cada trifosfato desoxinucleosida
2 mM de los nucleósidos rATP, rCTP, rUTP
1,5 mM rGTP
0,5 mM ITP
0,105 \mug/\mul BSA
0,08 unidades RNasaH
32 unidades, ARN polimerasa T7
6,4 unidades transcriptasa inversas de virus de
mieloblastosis avícola (Seikagaku, EE.UU.)
0,2 \muM de cada cebador
375 mM sorbitol
45,6 mM sacarosa
28,5 mM manita
0,13 mM dextrano T40
Se analizó la presencia de productos amplificados
utilizando un gel de agarosa (100 ml de Pronarose al 2% y 0,5
\mug/ml de bromuro de etidio) y utilizando 1^{*}TAE (40 mM
Tris-acetato, 1 mM EDTA, pH 8,0) como tampón de
desplazamiento. Se llevó a cabo la electroforesis a 100 voltios
durante aproximadamente 30 minutos. Se visualizaron las bandas
manchadas con bromuro de etidio de los productos amplificados
utilizando radiación UV. Se hibridó la mancha con sonda de biotina
(3 \muM) en una mezcla de hibridación (750 mM NaCl, 75 mM citrato
sódico, 20 mM Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} (pH 6,7), 10*
Denhardts) incubando la mancha durante 4 horas a 50ºC. Después de
la hibridación se lavó la mancha dos veces durante 5 minutos a 50ºC
con NaCl 450 mM, citrato sódico 45 mM, pH 6,4 (2* SSPE) y solución
de dodecil sulfato sódico al 1% (SDS) y una vez durante 10 minutos
con 20 mM de Na_{2}HPO_{4}, pH 7,4, Na 360 mM, EDTA 2 mM y SDS
al 0,1% a temperatura ambiente. A continuación, se incubó la mancha
durante 30 minutos, con 2 \mul de estreptavidina/solución de
peroxidasa de rábano de caballo (500 U/ml del equipo de detección
por quimioluminiscencia potenciada de Amersham Life Science) en 10
ml de Na_{2}HPO_{4} 50 mM, NaCl 900 mM, EDTA 5 mM, pH 7,4 y SDS
al 0,5%. Después de los lavados, respectivamente dos veces durante 5
minutos en 2*SSPE, SDS al 0,1% y una vez durante 10 minutos en
2*SSPE a temperatura ambiente, se secó la mancha entre tejidos, se
reveló y se expuso a una película según el protocolo de equipo de
Amersham.
Se diluyeron los productos de amplificación dos
veces en diluyente de detección (Tris/HCl 1,0 mM, pH 8,5 y 0,2 g/l
de HCl 2-metilisotiazolona). A continuación, se
incubaron 5 \mul del producto de amplificación diluido durante 30
minutos a 41ºC con 0,084 \mum de la sonda de biotina específica de
VIH-1 unida a 5 \mug de perlas magnéticas
revestidas con estreptavidina (tamaño medio 28 \mum \pm 0,2
\mum, Dynal, Great Neck, NY, E.E.UU.) y 2*10^{11} moléculas de
una sonda etiquetada con complejo ECL
(Tris(2,2-bipiridina]rutenio[II],
en un volumen total de 25 \mul, NaCl 750 mM, citrato sódico, 75
mM, pH 6,4 (5*SSC). Como controles negativos, se incubó también el
diluyente de detección con la sonda - perla y las mezclas de
ECL-sonda. Durante la incubación, se agitaron los
tubos cada 10 minutos para mantener las perlas en suspensión. A
continuación, se añadieron 300 \mul de la solución de tampón de
ensayo (100 mM de tripropilamina, pH 7,5) y se colocaron los tubos
en un instrumento de detección ECL (NASBA QR-system
de Organon Teknika BV) para la lectura de las señales ECL
emitidas.
Se sometieron a ensayo los siguientes pares de
cebadores en 10^{4} copias (tal como se determina por
espectrofotometría a 260 nm) del patrón ARN de
VIH-1. Se añadió el ARN directamente en la
amplificación. Se llevó a cabo el análisis de los productos
amplificados por electroforesis en gel tal como se ha descrito en
el ejemplo 1. En la figura 1 se muestran los resultados.
Todos los pares de cebadores y sondas de la
presente invención fueron capaces de amplificar y detectar ARN de
VIH-1 de subtipo B en un grado similar. Se muestra
la sensibilidad analítica para dos pares de cebadores (SEQ ID 9/SEQ
ID 5 y SEQ ID 11/SEQ ID 5) utilizando una serie de dilución del
patrón ARN de VIH-1 que tiene una concentración
inicial de 5,5^{*}10^{9} copias /ml. Se llevó a cabo la
detección con sondas que tenían las secuencias representadas en SEQ
ID 7 y SEQ ID 6. Se llevó a cabo la amplificación y detección tal
como se ha descrito en el ejemplo 1. En la tabla 1 se muestran los
resultados obtenidos con ambos pares de cebadores.
Ambos pares de cebadores tienen aproximadamente
la misma sensibilidad para el patrón ARN de VIH-1,
respectivamente, un índice de detección de 70% para el par de
cebador SEQ ID 9/SEQ ID 5 y un índice de detección de 63% para el
par cebador SEQ ID 3/SEQ ID 5.
En este ejemplo, se sometió a ensayo el par
cebador SEQ ID 9/SEQ ID 5 y una sonda con la secuencia SEQ ID 7 en
una serie de dilución del patrón ARN VIH-1 en
presencia de un control interno (ic-)ARN. El ic-ARN
es un transcripto in vitro que contiene parte de la
secuencia LTR de HXB-2 de VIH-1 y
se añaden10^{4} copias (tal como se determina por
espectrofotometría a 260 nm) antes del aislamiento de ácidos
nucleicos. Se llevó a cabo el aislamiento, la amplificación y la
detección ECL tal como se ha descrito en el ejemplo 1. Con fines
comparativos, se llevó a cabo una amplificación y detección por
separado utilizando un par de cebador localizado en la región
gag de VIH-1 (P1/P2) anteriormente descrita
por Van Gemen y cols., 1993, Journal of Virological Methods 43,
177-188. Las sondas utilizadas para detectar los
productos de amplificación generados por el par de cebador basado en
gag fueron:
| Sonda de biotina: | 5'-TGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGA |
| Sonda ECL: | 5'-GAATGGGATAGAGTGCATCCAGTG |
En la tabla 2 se muestran los resultados.
Tanto el par de cebadores LTR de este ejemplo
como el par de cebadores gag fueron capaces de detectar una
cantidad similar de ARN VIH-1 en un ensayo
controlado por un ARN producido in vitro que fue añadido
antes del aislamiento de ácidos nucleicos.
En este ejemplo, se analizaron 40 muestras
VIH-1 positivas de varias localizaciones geográficas
para detectar la presencia de ARN de VIH-1. Se
aislaron todas las muestras a través del método de aislamiento de
ácidos nucleicos descrito en el ejemplo 1. Se llevó a cabo la
amplificación y detección tal como se ha descrito en el ejemplo 1
utilizando un par cebador SEQ ID 9/SEQ ID 5 y sonda con la
secuencia SEQ ID 7 o sonda con la secuencia de SEQ ID 8.
Con fines comparativos, se llevó a cabo la
amplificación y detección por separado utilizando el par cebador
gag y sondas tal como se ha descrito en el ejemplo 3. Se
detectó la presencia de productos amplificados por hibridación de
sonda ECL con arreglo al método del ejemplo 1. En la tabla 3 se
muestran los resultados.
Las dos combinaciones de sonda - cebador
derivadas de la región LTR del VIH-1 descritas en
este ejemplo fueron capaces de detectar VIH-1 de
todas las muestras sometidas a ensayo. En contraste, la combinación
de la sonda - cebador del ensayo gag no detectó ARN genómico
de VIH-1 de un gran número de muestras.
En este ejemplo, se sometieron a ensayo 33
muestras que contenían ARN de VIH-1 de subtipos de
tipo envuelta conocidos. Las muestras se originan de virus
subtipificados propagados en cultivos celulares. Se clavaron
muestras de sobrenadantes de cultivo celular de ambas variantes de
los subtipos del grupo M de A a H y las variantes del grupo O en un
plasma humano VIH-1 negativo y se trataron con
arreglo al método del ejemplo 1. Se llevó a cabo la amplificación y
detección como en el ejemplo 4 esencialmente. En la tabla 4 se
muestran los resultados como un número de muestras de cada tipo del
que se detectó ARN VIH-1 del número total de cada
tipo ensayado.
Se detectó ARN VIH-1 de las 33
muestra VIH-1 utilizando el par cebador LTR SEQ ID
9/SEQ ID 5 y la sonda con la secuencia SEQ ID 7. En contraste, el
ensayo en el que se usó la combinación de sondas cebador gag
tal como se ha descrito en el ejemplo 3 no sirvió para detectar el
subtipo A y el subtipo E de cada una de las muestras y todas las
muestras que contenían ARN VIH-1 de los miembros del
grupo O.
En este ejemplo, se sometieron a ensayo 7
muestras obtenidas de pacientes seropositivos de origen africano,
sudamericano y asiático para determinar la presencia de ARN genómico
VIH-1. A pesar del hecho de que las muestras de
sangre de estos enfermos son positivos a anticuerpo
anti-p24 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) y la
mancha de Western (Genelabs), se puntuaron todos los especímenes
negativos mediante el ensayo QL ARN VIH-1 NASBA
(Organon Teknika BV) en el que se emplea la combinación de sonda par
cebador gag del ejemplo 3 y solamente se detectó una muestra
única (R9612222) y se determinó cuantitativamente (29.500 copias de
ARN /ml) mediante el ensayo Quantiplex ARN VIH-1 2,0
(Chiron) utilizando un volumen de muestra de 50 \mul. En
contraste, utilizando un volumen de muestra igual, el par de cebador
SEQ ID 9/SEQ ID 5 y la sonda con la secuencia SEQ ID 7 detectaron
cuatro de cada siete muestras (Tabla 5).
| Código de muestra | País | SEQ ID 9/SEQ ID 5 (LTR) |
| R9610155 | Tailandia | positivo |
| R9612222 | Ghana | positivo |
| R9600062 | Brasil | negativo |
| R9612218 | Zaire | negativo |
| R9611710 | Liberia | positivo |
| R9610718 | Antillas | positivo |
| R9607884 | Ruanda | negativo |
Las muestras perdidas por la combinación de sonda
cebador LTR no se detectan debido a una carga vírica baja por debajo
del nivel de detección, ya que al usar un volumen de muestra de 1
ml, el ensayo Quantiplex ARN VIH-1 2,0 (Chiron)
determinó cuantitativamente niveles de ARN VIH-1 de
30 o por debajo de 30 copias de ARN VIH-1 por cada
50 \mul de estas muestras.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- AUTOR DE LA SOLICITUD
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: AKZO NOBEL N.V.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Velperweg 76
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Amhem
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Países Bajos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (C.P.): 6824 BM
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Secuencias de ácido nucleico que se pueden utilizar como cebadores y sondas en la amplificación y detección de todos los subtipos de VIH-1.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 12
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SOPORTE INFORMÁTICO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: Patentin edición #1,0, versión #1,25 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares básicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGCGCCACT GCTAGAGA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares básicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTCGGGCGC CACTGCTAGA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares básicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGGCGCCAC TGCTA
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares básicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGCTTAAAG CCTCAATAAA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares básicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCAATAAAG CTTGCCTTGA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares básicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTGGTAACT AGAGATCCCT C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares básicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAGTGTGTGC CCGTCTGT
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares básicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTGTGTGCC CGTCTGTT
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 47 pares básicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGAGG GGCGCCASCTG CTAGAGA
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 pares básicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGAGG TTCGGGCGCC ACTGCTAGA
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares básicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGCGGGC GCCACTGCTA
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares básicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATGCATGCT CAATAAAGCT TGCCTTGAGT
\hfill30
Claims (10)
1. Par de oligonucleótidos, para su uso como
grupo en la amplificación de una secuencia diana localizada dentro
de la región LTR del genoma de VIH-1, consistiendo
dicho par en un primer oligonucleótido de 10 a 50 nucleótidos de
longitud y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos, de
una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
SEQ ID 1: G GGC GCC ACT GCT AGA GA
SEQ ID 2: G TTC GGG CGC CAC TGC TAG A
SEQ ID 3: CGGGCGCCACTGCTA
y un segundo oligonucleótido de 10
a 50 nucleótidos de longitud y que comprende al menos un fragmento
de 10 nucleótidos, de una secuencia seleccionada del grupo que
consiste
en:
SEQ ID 4: CTG CTT AAA GCC TCA ATA AA
SEQ ID 5: CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA
SEQ ID 12: GAT GCA TGC TCA ATA AAG CTT GCC TTG
AGT
2. Par de oligonucleótidos según la
reivindicación 1, que consiste en un primer oligonucleótido de 10 a
50 nucleótidos de longitud y que comprende al menos un fragmento de
10 nucleótidos de la secuencia
SEQ ID 1: G GGC GCC ACT GCT AGA GA y un segundo
oligonucleótido que es de 10 a 50 nucleótidos de longitud y que
comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de la
secuencia
SEQ ID 5: CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA
3. Par de oligonucleótidos según la
reivindicación 1 ó 2, incorporándose en el primer oligonucleótido
una secuencia de promotor reconocida por una ARN polimerasa
dependiente de ADN.
4. Par de oligonucleótidos según la
reivindicación 3 que consiste en un primer oligonucleótido que
consiste esencialmente en la secuencia
SEQ ID 9. aat tct aat acg act cac tat agg gAG AGG
GGC GCC ACT GCT AGA GA
y un secundo oligonucleótido que consiste
esencialmente en la secuencia
SEQ ID 5: CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA.
5. Método para la detección de ácido nucleico de
VIH-1 en una muestra, sometiéndose la muestra a una
reacción de amplificación de ácido nucleico utilizando un par de
oligonucleótidos según las reivindicaciones 1-4 y
reactivos de amplificación adecuados, detectándose la presencia de
los ácidos nucleicos amplificados.
6. Método según la reivindicación 5, en el que la
detección de los ácidos nucleicos amplificados se lleva a cabo
haciendo reaccionar la muestra con uno o más oligonucleótidos que
tienen (a) secuencias seleccionadas del grupo que consiste en:
SEQ ID 6: TCT GGT AAC TAG AGA TCC CTC
SEQ ID 7: TAG TGT GTG CCC GTC TGT ó
SEQ ID 8: AGT GTG TGC CCG TCT GTT
incorporándose en uno o más de
ellos una etiqueta detectable en condiciones de hibridación
adecuadas y detectándose la presencia de la etiqueta en los híbridos
formados entre la secuencia amplificada y la
sonda.
7. Método según la reivindicación 5, en el que la
técnica de amplificación utilizada es una técnica de amplificación
basada en transcripción.
8. Equipo de ensayo para la detección de
VIH-1 en una muestra que incluye:
un par de oligonucleótidos según la
reivindicación 1,
uno o más oligonucleótidos que incluyen una
secuencia de ácido nucleico sustancialmente complementaria de al
menos parte de la secuencia de ácido nucleico amplificado, equipada
con una etiqueta detectable
reactivos de amplificación adecuados.
9. Equipo de ensayo para la detección de
VIH-1 en una muestra que comprende un par de
oligonucleótidos según la reivindicación 4, junto con reactivos de
amplificación adecuados y medios de detección del ácido nucleico
amplificado.
10. Uso de un par de oligonucleótidos según la
reivindicación 1 como grupo de cebadores en la amplificación de una
secuencia diana localizada dentro de la región LTR del genoma de
VIH-1.
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