ES2153807T3 - Secuencias de acido nucleico que se pueden utilizar como cebadores y sondas en la amplificacion y deteccion de todos los subtipos de vih-1. - Google Patents

Secuencias de acido nucleico que se pueden utilizar como cebadores y sondas en la amplificacion y deteccion de todos los subtipos de vih-1.

Info

Publication number
ES2153807T3
ES2153807T3 ES98943872T ES98943872T ES2153807T3 ES 2153807 T3 ES2153807 T3 ES 2153807T3 ES 98943872 T ES98943872 T ES 98943872T ES 98943872 T ES98943872 T ES 98943872T ES 2153807 T3 ES2153807 T3 ES 2153807T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
hiv
amplification
baselineskip
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES98943872T
Other languages
English (en)
Other versions
ES2153807T1 (es
Inventor
Jaap Goudsmit
Pieter Oudshoorn
Suzanne Jurriaans
Vladimir Vladimirovich Lukashov
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux BV
Original Assignee
Biomerieux BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8228630&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2153807(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biomerieux BV filed Critical Biomerieux BV
Publication of ES2153807T1 publication Critical patent/ES2153807T1/es
Application granted granted Critical
Publication of ES2153807T3 publication Critical patent/ES2153807T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Un oligonucleótido sustancialmente complementario a una secuencia de la región LTR de una secuencia de ácido nucleico de un genoma del VIH, teniendo dicho oligonucleótido 10-50 nucleótidos de longitud y comprendiendo al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consta de: SEC ID 1: G GGC GCC ACT GCT AGA GA SEC ID 2: G TTC GGG CGC CAC TGC TAGA SEC ID 3: CGGGCGCCACTGCTA SEC ID 4: CTG CTT AAA GCC TCA ATA AA SEC ID 5: CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA SEC ID 12: GAT GCA TGC TCA ATA AAG CTT GCC TTG AGT SEC ID 6: TCT GGT AAC TAG AGA TCC CTC SEC ID 7: TAG TGT GTG CCC GTC TGT SEC ID 8: AGT GTG TGC CCG TCT GTT o la secuencia complementaria de las mismas.

Description

Secuencias de ácido nucleico que se pueden utilizar como cebadores y sondas en la amplificación y detección de todos los subtipos de VIH-1.
La presente invención se refiere a secuencias de ácido nucleico que se pueden utilizar en el campo del diagnóstico de virus, más específicamente en el diagnóstico de infecciones con el Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) que causa el SIDA.
Si bien el diagnóstico de virus convencional se ha basado predominantemente en la detección de antígenos víricos o anticuerpos específicos de ellos, en los últimos años la atención se ha desplazado hacia métodos para la detección directa del genoma de virus o secuencias de ácido nucleico derivadas del mismo, tanto ARN como ADN. Estos métodos se basan generalmente en la hibridación de ácido nucleico. La hibridación de ácido nucleico se basa en la capacidad de dos hebras de ácido nucleico que contienen secuencias complementarias de anelarse entre sí en condiciones apropiadas, formando así una estructura trenzada doble. Cuando se etiqueta la hebra complementaria, se puede detectar la etiqueta y es indicativa de la presencia de la secuencia diana. Especialmente en combinación con métodos para la amplificación de secuencias de ácido nucleico, estos métodos se han convertido en una importante herramienta de diagnóstico vírico, en particular para la detección de virus de inmunodeficiencia humana (VIH).
Las técnicas de amplificación de ácido nucleico son especialmente útiles como técnica adicional en los casos en los que los métodos serológicos ofrecen resultados dudosos o en los casos en los que puede existir un período de tiempo considerable entre la infección y el desarrollo de los anticuerpos para el virus. Con VIH, normalmente, la seroconversión se puede producir unos 3 a 6 meses después de la exposición al virus. Por tanto, aunque no se detecten anticuerpos con los inmunoensayos convencionales, pueden ser detectables ADN provírico o ARN vírico circulante. Asimismo, en terapia antivírica de seguimiento, los métodos basados en la amplificación de ácido nucleico presentan varias ventajas con respecto a los métodos serológicos. Especialmente, los métodos de amplificación cuantitativa proporcionan una poderosa herramienta para valorar los cambios en la cantidad de virus presentes antes y durante la terapia.
La elección de los oligonucleótidos que se han de utilizar como cebadores y sondas en la amplificación y detección de secuencias de ácido nucleico es crítica para la sensibilidad y especificidad del ensayo. Normalmente, la secuencia que se ha de ampliar está presente únicamente en una muestra (por ejemplo en una muestra de sangre obtenida de un enfermo que supuestamente padece la infección vírica) en cantidades diminutas. Los cebadores deberán ser suficientemente complementarios de la secuencia diana como para permitir una amplificación eficaz del ácido nucleico vírico presente en la muestra. Si los cebadores no se anelan de forma apropiada (debido a un emparejamiento deficiente de las bases de los nucleótidos en ambas hebras) con la secuencia diana, la amplificación se verá seriamente dañada. Esto afectará a la sensibildiad del ensayo y puede tener como resultado unos resultados de ensayo negativos falsos. Debido a la heterogeneidad de genomas víricos, se pueden obtener resultados de ensayo negativos falsos cuando los cebadores y las sondas son capaces de reconocer las secuencias presentes solamente en parte de las variantes del virus. El virus VIH presenta una alta heterogeneidad. Se ha demostrado la variabilidad genética entre aislados de diferentes continentes, pero también entre distintos individuos y entre diferentes estadios de la enfermedad. En función del análisis de secuencia, se han identificado dos grupos dentro de VIH-1: el grupo M (M de "major" - principal), y el grupo O (O de "outlier" anexo). Dentro del grupo M, se han asignado subtipos (A-H), que constituyen cada uno de ellos un grupo de secuencias por separado filogenético, y se están identificando otros adicionales. Esta variación de secuencia no está uniformemente distribuida en todo el genoma. El genoma VIH-1, al igual que todos los genomas retrovíricos, consiste de forma aproximada en las siguientes regiones: el gen gag del genoma VIH-1 es la región que codifica las proteínas de núcleo del virus (por ejemplo, p24); el gen env codifica una proteína de precursor grande, gp 160, que es procesada para convertirse en las proteínas de envuelta gp 120 y gp41. El gen pol codifica la polimerasa del virus (transcriptasa inversa). Las regiones de Repetición Terminal Larga (LTR) son las regiones en el genoma vírico que participan en la integración del virus con la célula huésped y en la regulación de la transcripción de genes víricos. Algunas regiones son más propensas a la variación de secuencia que otras. Sobre todo, en la secuencia de dominio env, la variación puede alcanzar hasta un 30% entre miembros de diferentes subtipos. De forma ideal, la selección del cebador se deberá basar en la información sobre la variabilidad entre una cepa y otra en secuencias de cebador candidato y las consecuencias de emparejamiento deficiente en sedes de cebador. McCutcheon y cols., J. AIDS, 4, 1241-1250, 1991, utiliza PCR para realizar una comparación genética de diferentes aislados de VIH-1. Utilizando PCR anclada (se utilizaron cebadores de varios sentidos con un cebador antisentido constante; se seleccionaron cebadores de regiones relativamente conservadas en gag, env y LTR). Se investigó el efecto del emparejamiento deficiente de cebador en la cantidad de producto de PCR obtenido. El emparejamiento deficiente en el extremo 3' del cebador disminuyó la cantidad del producto a veces en más de
100 veces.
La detección de todos los subtipos de VIH-1 conocidos actualmente es de una importancia enorme, sobre todo en lo que se refiere a la gestión del paciente, la seguridad de la sangre y los productos sanguíneos y los estudios clínicos y epidemiológicos. Los ensayos actuales para la amplificación y la posterior detección de secuencias de ácido nucleico derivadas de VIH-1 se basan normalmente en la amplificación de secuencias en la región gag del genoma vírico. Estos ensayos han sido desarrollados para detectar el subtipo B, que es el principal subtipo en países europeos y en los Estados Unidos. Sin embargo, la presencia de otros subtipos, que estaban antes confinados geográficamente, está aumentando debido a los frecuentes desplazamientos entre estos países y, por ejemplo, países africanos. Por lo tanto, se necesitan ensayos sensibles con los que se puedan detectar tantas variantes de virus VIH-1 como sea posible (preferiblemente todas).
La investigación dirigida a la identificación de grupos de cebadores adecuados para una amplificación fiable de secuencias de ácido nucleico derivadas de VIH-1 ha estado en curso durante los años pasados. Engelbrecht y cols., J. Virol. Meth., 55, 391-400, 1995, describen un estudio dirigido al desarrollo de un protocolo de PCR específico y sensible utilizando pares de cebadores env, gag y LTR para detectar subtipos presentes en el Cabo Oeste, Sudáfrica. Se analizaron 24 cepas que, según se sabía, pertenecían a los subtipos B, C y D. Se observó que el comportamiento de los pares de cebador dependía en gran medida de la optimización de las condiciones de reacción para los diferentes pares de cebador. Únicamente cuando se utilizaron condiciones menos estrictas (por ejemplo, con el par de cebador LTR, se necesitaron un aumento del tiempo de ciclo y temperaturas de anelación inferiores) se pudieron detectar estas cepas de VIH en particular con suficiente sensibilidad y reproducibilidad con todos los pares de cebador.
Zazzi y cols. J. Med. Virol., 38, 172-174, 1992, desarrolló una reacción de PCR en dos etapas (utilizando cebadores anidados) para detectar ADN de VIH-1 en muestras clínicas. Los cebadores utilizados para la amplificación se derivaron del gen gag y de la región LTR. Los enfermos sometidos a ensayo en este estudio fueron todos ellos de zonas colindantes, lo que hace probable que representaran solamente un número limitado de diferentes cepas víricas. En EP-A-0.617.132; US-5.629.413 y EP-A-0.331.939 se exponen otros ejemplos de cebadores de PCR para la detección de VIH.
Vener y cols., en Bio Techniques, 21, 248-255, 1996 describen un método de PCR cuantitativo en el que se utilizan cebadores anidados derivados de LTR. Este procedimiento fue ensayado solamente en células mononucleares de sangre periférica (PBMC), infectadas con VIH-1_{MN}. Por lo tanto, no se puede decir nada de la adecuación de los cebadores utilizados para la detección de diferentes subtipos de virus.
Con la presente invención, se proporcionan secuencias de nucleótido que se pueden utilizar como cebadores y sondas en la amplificación y detección de ácido nucleico de VIH-1. Las secuencias de oligonucleótido que proporciona la presente invención están localizadas en la parte LTR del genoma vírico de VIH. Se ha observado que al utilizar las secuencias de la presente invención en métodos para la amplificación y detección de ácidos nucleicos se puede obtener una detección sensible y específica de VIH-1. El beneficio de las secuencias de la presente invención reside principalmente en el hecho de que, con la ayuda de cebadores y sondas que comprenden las secuencias según la invención, se puede detectar el ácido nucleico de todos los subtipos de VIH-1 conocidos actualmente, con una alta precisión y sensibilidad. Hasta ahora, no se ha desarrollado ningún par de cebador o sondas de hibridación que permitiera la detección de dicha amplia gama de variantes de VIH-1.
Las secuencias de oligonucleótido según la presente invención son especialmente útiles en los métodos para la amplificación de ácido nucleico.
Se conocen varias técnicas para la amplificación de ácidos nucleicos dentro de la especialidad. Un ejemplo de una técnica para la amplificación de un segmento diana de ADN es la llamada "reacción en cadena de polimerasa" (PCR). Con la técnica de PCR, se aumenta exponencialmente el número de copias de un segmento diana en particular con una serie de ciclos. Se utiliza un par de cebadores y, en cada ciclo, se anela un cebador de ADN con el lateral 3' de cada una de las dos hebras de la secuencia diana de ADN de doble hebra. Se extienden los cebadores con una ADN polimerasa en presencia de los distintos mononucleótidos para generar ADN de doble hebra de nuevo. Se separan las hebras del ADN de doble hebra entre sí por desnaturalización térmica y cada hebra sirve como plantilla para la anelación del cebador y la posterior elongación en un ciclo posterior. El método de PCR ha sido descrito por Saiki y cols., Science 230, 135, 1985, y en las patentes europeas nº EP 200362 y EP 201184.
Otra técnica para la amplificación de ácidos nucleicos es el llamado sistema de amplificación basado en transcripción (TAS). El método TAS se describe en la solicitud de patente internacional Nº WO 88/10315. Las técnicas de amplificación basadas en la transcripción incluyen normalmente el tratamiento del ácido nucleico diana con dos oligonucleótidos, incluyendo uno de ellos una secuencia promotora, para generar una plantilla que incluye un promotor funcional. Se transcriben múltiples copias de ARN desde dicha plantilla que pueden servir como base para una posterior amplificación.
Un método de amplificación basado en la transcripción continua isotérmica es el llamado proceso NASBA ("NASBA"), tal como se describe en la patente europea nº EP 329822. NASBA incluye el uso de ARN polimerasa T7 para transcribir múltiples copias de ARN a partir de una plantilla que incluye un promotro T7. En EP 408295 se describen otras técnicas de amplificación basadas en la transcripción. EP 408295 se refiere principalmente a un método de amplificación basado en la tanscripción de dos enzimas. Los métodos de amplificación basados en la transcripción, por ejemplo el método NASBA descrito en EP 329822, se emplean normalmente con un grupo de oligonucleótidos, proporcionándose en uno de ellos una secuencia de promotor que es reconocida por una ARN polimerasa dependiente de ADN como, por ejemplo polimerasa T7. Dentro de la técnica se conocen varias modificaciones de las técnicas basadas en la transcripción. Dichas modificaciones incluyen por ejemplo el uso de oligonucleótidos bloqueados (en los que se puede incorporar una secuencia de promotor). Estos oligonucleótidos están bloqueados para inhibir una reacción de extensión a partir de ellos (US5554516). Se pueden utilizar uno o más "cebadores promotor" (oligonucleótidos equipados con una secuencia de promotor) en técnicas de amplificación basadas en la transcripción, combinadas opcionalmente con el uso de uno o más oligonucleótidos que no están equipados con una secuencia de promotor. Para la amplificación de ARN, la tecnología preferible es una técnica de amplificación basada en la transcripción. La amplificación mediante el uso de PCR, se puede basar también en una plantilla de ARN. La PCR real requiere ser precedida de una etapa de transcripción inversa para copiar el ARN en ADN (RT-PCR). Sin embargo, si se utiliza RT-PCR para la detección de transcriptos víricos, es necesaria la diferenciación de productos de PCR derivados de mARN y ADN. Se puede aplicar el tratamiento de ADNsa antes de RT-PCR (Bitsch, A. y cols., J. Infect. Dis 167, 740-743., 1993; Meyer, T. y cols., Mol. Cell Probes. 8, 261-271, 1994), pero a veces no es eficaz en la eliminación del ADN contaminante de forma suficiente (Bitsch, A. y cols., 1993).
En contraposición a RT-PCR, NASBA, que se basa en la transcripción de ARN mediante ARN polimerasa T7 (Kievits y cols., 1991; Compton, 1991) no requiere diferenciación entre productos de amplificación derivados de ARN y ADN ya que utiliza ARN como su principal diana. NASBA permite una amplificación específica de dianas de ARN incluso en un entorno de ADN.
El uso de los oligonucleótidos según la invención no está limitado a ninguna técnica de amplificación en particular ni modificación concreta de la misma. Es evidente que los oligonucleótidos según la invención encuentran aplicación en muchas técnicas de amplificación de ácido nucleico diferentes, así como diversos métodos para detectar la presencia de ácido nucleico (ampliado) de VIH. Los oligonucleótidos de la presente invención se pueden utilizar igualmente en métodos de amplificación cuantitativa. En EP 525882 se describe un ejemplo de dicho métodos cuantitativo.
El término "oligonucleótido" tal como se utiliza aquí se refiere a una molécula que consiste en dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos. Dichos oligonucleótidos se pueden utilizar como cebadores y sondas.
Naturalmente, basándose en las secuencias de los oligonucleótidos de la presente invención, se pueden preparar también análogos de oligonucleótidos. Dichos análogos pueden constituir estructuras alternativas como "PNA" (moléculas con una estructura de tipo péptido en lugar de la estructura de azúcar de fosfato del ácido nucleico normal) o similares. Es evidente que estas estructuras alternativas, que representan las secuencias de la presente invención forman parte de la presente invención igualmente.
El término "cebador" tal como se utiliza aquí se refiere a un oligonucleótido que se da tanto de forma natural (v.g., como fragmento de restricción) o es producido sintéticamente, que es capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis de un producto de extensión de cebador que es complementario de la hebra de ácido nucleico (plantilla o secuencia diana) cuando se coloca en las condiciones adecuadas (v.g., tampón, sal, temperatura y pH) en presencia de nucleótidos y un agente para la polimerización de ácido nucleico, como por ejemplo polimerasa dependiente de ARN o dependiente de ADN. Un cebador debe ser suficientemente largo como para cebar la síntesis de productos de extensión en presencia de un agente para la polimerización. Un cebador típico contiene al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud de una secuencia sustancialmente complementaria u homóloga de la secuencia diana, aunque se prefieren cebadores algo más largos. Normalmente, los cebadores contienen aproximadamente 15-26 nucleótidos, si bien se pueden emplear cebadores más largos, sobre todo cuando los cebadores contienen secuencias adicionales como, por ejemplo, una secuencia de promotor para una polimerasa en particular.
Normalmente, un grupo de cebadores consistirá en al menos dos cebadores, uno "corriente arriba" y otro cebador "corriente abajo" que definen conjuntamente el amplificato (la secuencia que será amplificada mediante el uso de dichos cebadores).
Principalmente, para el uso en técnicas de amplificación basada en transcripción, los oligonucleótidos según la invención se pueden unir también a una secuencia de promotor. El término "secuencia de promotor" define una región de una secuencia de ácido nucleico que es reconocida específicamente por una ARN polimerasa que se une a una secuencia reconocida e inicia el proceso de transcripción a través del cual se produce el transcripto de ARN. En principio, se puede emplear cualquier secuencia de promotor para la que se conozca y sea asequible una polimerasa que sea capaz de reconocer la secuencia de iniciación. Los promotores conocidos y útiles son aquellos que son reconocidos por determinadas ARN polimerasas bacteriofagas como, por ejemplo, bactariofagos T3, T7 o SP6. Los oligonucleótidos unidos a una secuencia de promotor se denominan comúnmente "cebadores de promotor". No obstante, su función como cebador, v.g., el punto de partida para una reacción de elongación, se puede bloquear, tal como se ha mencionado antes, o estar ausente en algunos modos de realización de las reacciones de amplificación basadas en la transcripción.
Un oligonucleótido según la presente invención es sustancialmente complementario de una secuencia de la región de LTR de una secuencia de ácido nucleico de un genoma VIH, siendo dicho oligonucleótido de 10-50 nucleótidos de longitud y comprendiendo, al menos un fragmento de 10 nucleótidos, de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
SEQ ID 1: G GGC GCC ACT GCT AGA GA
SEQ ID 2: G TTC GGG CGC CAC TGC TAG A
SEQ ID 3: CGGGCGCCACTGCTA
SEQ ID 4: CTG CTT AAA GCC TCA ATA AA
SEQ ID 5: CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA
SEQ ID 6: TCT GGT AAC TAG AGA TCC CTC
SEQ ID 7: TAG TGT GTG CCC GTC TGT
SEQ ID 8: AGT GTG TGC CCG TCT GTT
SEQ ID 12: GAT GCA TGC TCA ATA AAG CTT GCC TTG AGT
o secuencia complementaria de las mismas.
Debe entenderse que los oligonucleótidos que consisten en las secuencias de la presente invención pueden contener supresiones, adiciones y/o sustituciones menores de bases de ácido nucleico, en un grado en el que dichas alteraciones no afecten negativamente al rendimiento del producto obtenido en ningún grado significativo. Cuando se utilizan los oligonucleótidos según la presente invención como sondas, las alteraciones no deberán tener como resultado la reducción de la eficacia de hibridación de la sonda. Por ejemplo, en el caso de técnicas de amplificación basadas en la transcripción, en las que se puede incorporar en uno o más de los cebadores una secuencia de promotor, la introducción de una secuencia de hibridación rica en purina (=G ó A), inmediatamente después e la secuencia de promotor, puede proporcionar un efecto positivo en la transcripción (cuando hay C's y T's se puede producir una transcripción abortiva). Si no está disponible dicha secuencia en el ácido nucleico diana, se puede insertar una secuencia rica en purina en el oligonucleótido inmediatamente después de los últimos tres radicales G de la secuencia promotor. Las secuencias de la presente invención se reflejan como secuencias de ADN. Los equivalentes de ARN de estas secuencias forman igualmente parte de la presente invención.
Los oligonucleótidos preferibles según la presente invención son oligonucleótidos que consisten esencialmente en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
SEQ ID 1: G GGC GCC ACT GCT AGA GA
SEQ ID 2: G TTC GGG CGC CAC TGC TAG A
SEQ ID 3: CGGGCGCCACTGCTA
SEQ ID 4: CTG CTT AAA GCC TCA ATA AA
SEQ ID 5: CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA
SEQ ID 6: TCT GGT AAC TAG AGA TCC CTC
SEQ ID 7: TAG TGT GTG CCC GTC TGT
SEQ ID 8: AGT GTG TGC CCG TCT GTT
SEQ ID 9: aat tct aat acg act cac tat agg gAG AGG GGC GCC ACT GCT AGA GA
SEQ ID 10: aat tct aat acg act cac tat agg gAG AGG TTC GGG CGC CAC TGC TAG A
SEQ ID 11: aat tct aat acg act cac tat agg gCGGGCGCCACTGCTA
SEQ ID 12: GAT GCA TGC TCA ATA AAG CTT GCC TTG AGT
SEQ ID 9-11: incluyen en realidad la secuencia tal como reflejan SEQ ID 1-3. En la SEQ ID 9-11, las secuencias de la SEQ ID 1-3 están operativamente unidas a una secuencia de promotor (la secuencia de promotor T7). Esto hace que las secuencias sean especialmente adecuadas para su uso como cebador corriente arriba en una técnica de amplificación basada en transcripción como, por ejemplo, NASBA.
Un modo de realización preferible de la presente invención es el que consiste en un combinación de dos oligonucleótidos según la invención, para su uso como grupo en la amplificación de ácido nucleótido.
Dicho par de oligonucleótidos, para su uso como grupo en la amplificación de una secuencia diana localizada dentro de la región LTR del genoma de VIH-1, consiste en un primer oligonucleótido de 10-50 nucleótidos de longitud y que comprende, al menos un fragmento de 10 nucleótidos, de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
SEQ ID 1: G GGC GCC ACT GCT AGA GA
SEQ ID 2: G TTC GGG CGC CAC TGC TAG A
SEQ ID 3: CGGGCGCCACTGCTA
y un segundo oligonucleótido de 10-50 nucleótidos de longitud y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
SEQ ID 4: CTG CTT AAA GCC TCA ATA AA
SEQ ID 5: CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA
SEQ ID 12: GAT GCA TGC TCA ATA AAG CTT GCC TTG AGT
Uno de los oligonucleótidos puede servir como "oligonucleótido corriente arriba", es decir un cebador corriente arriba, mientras que el segundo oligonucleótido sirve como "oligonucleótido corriente abajo", es decir cebador corriente abajo, en la reacción de amplificación. La localización en el genoma VIH (o la secuencia complementaria del mismo) con la que se pueden anelar los dos oligonucleótidos comprendidos en dicho par según la invención, definirá conjuntamente la secuencia del ácido nucleico que se amplifica. La secuencia amplificada está localizada entre los "sitios de unión de cebador" dentro de la región de LTR del genoma VIH. Se ha observado que, utilizando un par de oligonucleótidos según la invención en la reacción de amplificación, se puede conseguir una amplificación precisa y fiable del ácido nucleico derivado de todos los subtipos de VIH conocidos actualmente.
Un par de oligonucleótidos sobre todo preferible según la invención consistirá en un primer cebador que comprende la SEQ ID NO 1 y un segundo cebador con la secuencia de SEQ ID NO 5. Para su uso en un método de amplificación basado en transcripción, es preferible el oligonucleótido con la SEQ ID NO 9, en combinación con un oligonucleótido con la secuencia de SEQ ID NO 5.
Parte de los oligonucleótidos según la invención son particularmente adecuados para su uso como sonda en la detección de ácido nucleico amplificado con un par de oligonucleótidos según la invención. Cuando se utilizan como sonda, se puede incorporar en dichos oligonucleótidos una etiqueta detectable. Los oligonucleótidos según la invención que son especialmente adecuados como sonda consisten esencialmente en la secuencia:
SEQ ID 6: TCT GGT AAC TAG AGA TCC CTC
SEQ ID 7: TAG TGT GTG CCC GTC TGT ó
SEC ID 8: AGT GTG TGC CCG TCT GTT
equipadas con una etiqueta detectable. Un oligonucleótido preferible sobre todo en este sentido es un oligonucleótido con una secuencia tal como se representa en SEQ ID 6.
Dentro de la especialidad se conocen varias fracciones de etiquetado. Dicha fracción puede ser por ejemplo un compuesto radiactivo, una enzima detectable (v.g., peroxidasa de rábano de caballo (HRP)), un hapteno como biotina, o cualquier otra fracción capaz de generar una señal detectable como, por ejemplo, colorimétrica, fluorescente, quimioluminiscente o electroquimioluminiscente. También se pueden detectar híbridos entre oligonucleótidos según la invención y ácido nucleico diana (amplificado) a través de otros métodos conocidos entre los especialistas en la técnica. Evidentemente, los métodos para la amplificación de ácido nucleico, al igual que los que se han mencionado anteriormente, mediante el uso de los oligonucleótidos según la presente invención también forman parte de la presente invención.
La presente invención proporciona asimismo equipos de ensayo para la amplificación y detección de ácido nucleico de VIH. El uso de estos equipos de ensayo permite la detección selectiva precisa y sensible de muestras que supuestamente contienen ácido nucleico derivado de VIH. Dichos equipos de ensayo pueden contener un par de oligonucleótidos según la invención y, opcionalmente, también un oligonucleótido según la invención que se puede utilizar como sonda para la detección del material amplificado. Por otra parte, el equipo de ensayo puede contener reactivos de amplificación adecuados. Dichos reactivos son por ejemplo las enzimas adecuadas para llevar a cabo la reacción de amplificación. Un equipo, adaptado para su uso con NASBA, por ejemplo, puede contener cantidades adecuadas de transcriptasa inversa, RNasa H y ARN polimerasa T7. Dichas enzimas pueden estar presentes en el equipo en una solución tamponada, aunque se pueden proporcionar igualmente como una composición liofilizada, por ejemplo, partículas esféricas liofilizadas. Dichas partículas liofilizadas han sido descritas anteriormente en la solicitud PCT Nº EP95/01268. El equipo puede estar equipado además con composiciones de tampón, adecuadas para llevar a cabo una reacción de amplificación. Dichos tampones se pueden optimizar para la técnica de amplificación en particular para la que esté destinado el equipo, así como para el uso con los oligonucleótidos en particular que se proporcionan en el equipo. En las técnicas de amplificación basadas en transcripción, como por ejemplo NASBA, dichos tampones pueden contener, por ejemplo, DMSO, que potencia la reacción de amplificación (tal como se describe en la solicitud PCT Nº US 90/04733).
Por otra parte, se puede incluir en el equipo un control interno como mecanismo de comprobación del procedimiento de amplificación y para prevenir que se produzcan resultados de ensayo negativos falsos como consecuencia de fallos en el procedimiento de amplificación. El uso de controles internos en las técnicas de amplificación basadas en la transcripción se describe en la solicitud PCT Nº EP 93/02248. La secuencia de control óptima se selecciona para que no compita con el ácido nucleico diana en la reacción de amplificación. Los equipos pueden contener también reactivos para el aislamiento de ácido nucleico de un especimen biológico antes de la amplificación. En EP 389063 se describe un método adecuado para el aislamiento de ácido nucleico.
Breve descripción de las figuras
Figura 1
Productos de amplificación tras el manchado y detección por quimioluminiscencia potenciada obtenidos tras la amplificación en presencia (panel A) o ausencia (panel B) de ARN de VIH-1 utilizando los siguientes pares de cebadores. Banda 1: SEQ ID 9-SEQ ID 10, banda 2: SEQ ID 9-SEC ID 5, banda 3: SEQ ID 10-SEQ ID 4, banda 4: SEQ ID 10-SEQ ID 5, banda 5: SEQ ID 3-SEQ ID 12.
Ejemplos Ejemplo 1 Amplificación y detección de ARN genómico de VIH-1
Se aplicaron los siguientes procedimientos para amplificar y detectar ARN genómico de VIH-1 de muestras, tal como se describe en los siguientes ejemplos.
Preparación de muestra y aislamiento de ácido nucleico
Se llevó a cabo el aislamiento de ácidos nucleicos con arreglo a Boom y cols., 1990, Journal of Clinical Microbiology 28, 495-503 y la patente europea nº EP 0389063. Brevemente: se añadió un volumen de 200 \mul de plasma agrupado de donantes sanos (negativos para HBsAg, anti-HIV y anti HCV) a 900 \mul de tampón de lisis (Tris-HCl 47 mM, pH 7,2, EDTA 20 mM, Trition X-100 al 1,2%, tiocianato de guanidina 4,7 M (GusSCN, Fluka, Buchs, Suiza). Después de remover en torbellino y del centrifugado (30 segundos, 13.000 rpm) se añadió una serie de diluciones de ARN de VIH-1 subtipo B patrón, caracterizada y descrita por Layne y cols., 1992, Virology 189, 695-714 o especímenes VIH-1 positivos. Tras la adición de 50 \mul de silicio activado (suspensión 0,4 g/ml en HCl 0,1 N), se incubó la suspensión durante 10 minutos a temperatura ambiente con removido en torbellino regular. Tras el centrifugado (30-60 segundos, 13.000 rpm), se lavó dos veces el conglomerado de silicio con 1 ml de tampón de lavado (GuSCN 5,25 M, Tris-HCl 50 mM, pH 6,4), seguido de dos lavados con etanol al 70% y una etapa de lavado con acetona. A continuación, se secó el conglomerado de silicio durante diez minutos en un bloque de calentamiento a 56ºC. Se eluyeron los ácidos nucleicos en silicio añadiendo 50 \mul de tampón de elución (Tris-HCl 1,0 mM, pH 8,5) y se incubaron a 56ºC durante 10 minutos. A continuación, se tomaron 5 \mul del eluato del conglomerado para su posterior uso en la reacción de amplificación. Se almacenó el resto del eluato a -70ºC.
Amplificación NASBA
Se llevaron a cabo amplificaciones en un volumen de reacción de 20 \mul compuesto de 10 \mul de mezcla de cebador, 5 \mul (aislado) de ácidos nucleicos y 5 \mul de mezcla de enzimas. Se obtuvo la mezcla de cebador por reconstitución de una acusfera liofilizada en 50 \mul de diluyente de acusfera, 51,6 \mul de agua, 8,4 \mul de KCl 2M y 5 \mul de cada cebador (10 \muM). A continuación, se removió en torbellino a fondo la mezcla antes de su uso. De esta primera mezcla de cebador, se añadieron 10 \mul a 5 \mul del ARN de VIH-1 (aislado) (patrón). Se incubó la mezcla durante 5 minutos a 65ºC y después se incubó a 41ºC durante otros 5 minutos. Después de estas incubaciones, se añadieron 5 \mul de la mezcla de enzima y se incubó durante 5 minutos a 41ºC. Se transfirieron los tubos a la zona de detección y se incubaron durante 90 minutos a 41ºC. Después de la reacción de amplificación, se almacenaron los tubos a -20ºC hasta su uso posterior.
La reacción de amplificación contenía los siguientes reactivos:
40 mM Tris-HCl, pH 8,5
12 mM MgCl_{2}
70 mM KCl
15% v/v sulfóxido de dimetilo
5 mM ditiotreitol
1 mM de cada trifosfato desoxinucleosida
2 mM de los nucleósidos rATP, rCTP, rUTP
1,5 mM rGTP
0,5 mM ITP
0,105 \mug/\mul BSA
0,08 unidades RNasaH
32 unidades, ARN polimerasa T7
6,4 unidades transcriptasa inversas de virus de mieloblastosis avícola (Seikagaku, EE.UU.)
0,2 \muM de cada cebador
375 mM sorbitol
45,6 mM sacarosa
28,5 mM manita
0,13 mM dextrano T40
Detección de los productos amplificados A. Electroforesis de gel
Se analizó la presencia de productos amplificados utilizando un gel de agarosa (100 ml de Pronarose al 2% y 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio) y utilizando 1^{*}TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA, pH 8,0) como tampón de desplazamiento. Se llevó a cabo la electroforesis a 100 voltios durante aproximadamente 30 minutos. Se visualizaron las bandas manchadas con bromuro de etidio de los productos amplificados utilizando radiación UV. Se hibridó la mancha con sonda de biotina (3 \muM) en una mezcla de hibridación (750 mM NaCl, 75 mM citrato sódico, 20 mM Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} (pH 6,7), 10* Denhardts) incubando la mancha durante 4 horas a 50ºC. Después de la hibridación se lavó la mancha dos veces durante 5 minutos a 50ºC con NaCl 450 mM, citrato sódico 45 mM, pH 6,4 (2* SSPE) y solución de dodecil sulfato sódico al 1% (SDS) y una vez durante 10 minutos con 20 mM de Na_{2}HPO_{4}, pH 7,4, Na 360 mM, EDTA 2 mM y SDS al 0,1% a temperatura ambiente. A continuación, se incubó la mancha durante 30 minutos, con 2 \mul de estreptavidina/solución de peroxidasa de rábano de caballo (500 U/ml del equipo de detección por quimioluminiscencia potenciada de Amersham Life Science) en 10 ml de Na_{2}HPO_{4} 50 mM, NaCl 900 mM, EDTA 5 mM, pH 7,4 y SDS al 0,5%. Después de los lavados, respectivamente dos veces durante 5 minutos en 2*SSPE, SDS al 0,1% y una vez durante 10 minutos en 2*SSPE a temperatura ambiente, se secó la mancha entre tejidos, se reveló y se expuso a una película según el protocolo de equipo de Amersham.
B. Hibridación de sonda por electroquimioluminiscencia (ECL)
Se diluyeron los productos de amplificación dos veces en diluyente de detección (Tris/HCl 1,0 mM, pH 8,5 y 0,2 g/l de HCl 2-metilisotiazolona). A continuación, se incubaron 5 \mul del producto de amplificación diluido durante 30 minutos a 41ºC con 0,084 \mum de la sonda de biotina específica de VIH-1 unida a 5 \mug de perlas magnéticas revestidas con estreptavidina (tamaño medio 28 \mum \pm 0,2 \mum, Dynal, Great Neck, NY, E.E.UU.) y 2*10^{11} moléculas de una sonda etiquetada con complejo ECL (Tris(2,2-bipiridina]rutenio[II], en un volumen total de 25 \mul, NaCl 750 mM, citrato sódico, 75 mM, pH 6,4 (5*SSC). Como controles negativos, se incubó también el diluyente de detección con la sonda - perla y las mezclas de ECL-sonda. Durante la incubación, se agitaron los tubos cada 10 minutos para mantener las perlas en suspensión. A continuación, se añadieron 300 \mul de la solución de tampón de ensayo (100 mM de tripropilamina, pH 7,5) y se colocaron los tubos en un instrumento de detección ECL (NASBA QR-system de Organon Teknika BV) para la lectura de las señales ECL emitidas.
Ejemplo 2 Amplificación y detección de ARN genómico de VIH-1
Se sometieron a ensayo los siguientes pares de cebadores en 10^{4} copias (tal como se determina por espectrofotometría a 260 nm) del patrón ARN de VIH-1. Se añadió el ARN directamente en la amplificación. Se llevó a cabo el análisis de los productos amplificados por electroforesis en gel tal como se ha descrito en el ejemplo 1. En la figura 1 se muestran los resultados.
Todos los pares de cebadores y sondas de la presente invención fueron capaces de amplificar y detectar ARN de VIH-1 de subtipo B en un grado similar. Se muestra la sensibilidad analítica para dos pares de cebadores (SEQ ID 9/SEQ ID 5 y SEQ ID 11/SEQ ID 5) utilizando una serie de dilución del patrón ARN de VIH-1 que tiene una concentración inicial de 5,5^{*}10^{9} copias /ml. Se llevó a cabo la detección con sondas que tenían las secuencias representadas en SEQ ID 7 y SEQ ID 6. Se llevó a cabo la amplificación y detección tal como se ha descrito en el ejemplo 1. En la tabla 1 se muestran los resultados obtenidos con ambos pares de cebadores.
TABLA 1
1
Ambos pares de cebadores tienen aproximadamente la misma sensibilidad para el patrón ARN de VIH-1, respectivamente, un índice de detección de 70% para el par de cebador SEQ ID 9/SEQ ID 5 y un índice de detección de 63% para el par cebador SEQ ID 3/SEQ ID 5.
Ejemplo 3 Amplificación y detección de ARN de VIH-1 en presencia de un control interno
En este ejemplo, se sometió a ensayo el par cebador SEQ ID 9/SEQ ID 5 y una sonda con la secuencia SEQ ID 7 en una serie de dilución del patrón ARN VIH-1 en presencia de un control interno (ic-)ARN. El ic-ARN es un transcripto in vitro que contiene parte de la secuencia LTR de HXB-2 de VIH-1 y se añaden10^{4} copias (tal como se determina por espectrofotometría a 260 nm) antes del aislamiento de ácidos nucleicos. Se llevó a cabo el aislamiento, la amplificación y la detección ECL tal como se ha descrito en el ejemplo 1. Con fines comparativos, se llevó a cabo una amplificación y detección por separado utilizando un par de cebador localizado en la región gag de VIH-1 (P1/P2) anteriormente descrita por Van Gemen y cols., 1993, Journal of Virological Methods 43, 177-188. Las sondas utilizadas para detectar los productos de amplificación generados por el par de cebador basado en gag fueron:
Sonda de biotina: 5'-TGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGA
Sonda ECL: 5'-GAATGGGATAGAGTGCATCCAGTG
En la tabla 2 se muestran los resultados.
TABLA 2
2
Tanto el par de cebadores LTR de este ejemplo como el par de cebadores gag fueron capaces de detectar una cantidad similar de ARN VIH-1 en un ensayo controlado por un ARN producido in vitro que fue añadido antes del aislamiento de ácidos nucleicos.
Ejemplo 4 Detección de ARN VIH-1 en muestras VIH-1 positivas
En este ejemplo, se analizaron 40 muestras VIH-1 positivas de varias localizaciones geográficas para detectar la presencia de ARN de VIH-1. Se aislaron todas las muestras a través del método de aislamiento de ácidos nucleicos descrito en el ejemplo 1. Se llevó a cabo la amplificación y detección tal como se ha descrito en el ejemplo 1 utilizando un par cebador SEQ ID 9/SEQ ID 5 y sonda con la secuencia SEQ ID 7 o sonda con la secuencia de SEQ ID 8.
Con fines comparativos, se llevó a cabo la amplificación y detección por separado utilizando el par cebador gag y sondas tal como se ha descrito en el ejemplo 3. Se detectó la presencia de productos amplificados por hibridación de sonda ECL con arreglo al método del ejemplo 1. En la tabla 3 se muestran los resultados.
TABLA 3
3
Las dos combinaciones de sonda - cebador derivadas de la región LTR del VIH-1 descritas en este ejemplo fueron capaces de detectar VIH-1 de todas las muestras sometidas a ensayo. En contraste, la combinación de la sonda - cebador del ensayo gag no detectó ARN genómico de VIH-1 de un gran número de muestras.
Ejemplo 5 Amplificación y detección de ARN de VIH-1 con subtipos definidos
En este ejemplo, se sometieron a ensayo 33 muestras que contenían ARN de VIH-1 de subtipos de tipo envuelta conocidos. Las muestras se originan de virus subtipificados propagados en cultivos celulares. Se clavaron muestras de sobrenadantes de cultivo celular de ambas variantes de los subtipos del grupo M de A a H y las variantes del grupo O en un plasma humano VIH-1 negativo y se trataron con arreglo al método del ejemplo 1. Se llevó a cabo la amplificación y detección como en el ejemplo 4 esencialmente. En la tabla 4 se muestran los resultados como un número de muestras de cada tipo del que se detectó ARN VIH-1 del número total de cada tipo ensayado.
TABLA 4
4
Se detectó ARN VIH-1 de las 33 muestra VIH-1 utilizando el par cebador LTR SEQ ID 9/SEQ ID 5 y la sonda con la secuencia SEQ ID 7. En contraste, el ensayo en el que se usó la combinación de sondas cebador gag tal como se ha descrito en el ejemplo 3 no sirvió para detectar el subtipo A y el subtipo E de cada una de las muestras y todas las muestras que contenían ARN VIH-1 de los miembros del grupo O.
Ejemplo 6 Amplificación y detección de muestras clínicas de VIH-1
En este ejemplo, se sometieron a ensayo 7 muestras obtenidas de pacientes seropositivos de origen africano, sudamericano y asiático para determinar la presencia de ARN genómico VIH-1. A pesar del hecho de que las muestras de sangre de estos enfermos son positivos a anticuerpo anti-p24 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) y la mancha de Western (Genelabs), se puntuaron todos los especímenes negativos mediante el ensayo QL ARN VIH-1 NASBA (Organon Teknika BV) en el que se emplea la combinación de sonda par cebador gag del ejemplo 3 y solamente se detectó una muestra única (R9612222) y se determinó cuantitativamente (29.500 copias de ARN /ml) mediante el ensayo Quantiplex ARN VIH-1 2,0 (Chiron) utilizando un volumen de muestra de 50 \mul. En contraste, utilizando un volumen de muestra igual, el par de cebador SEQ ID 9/SEQ ID 5 y la sonda con la secuencia SEQ ID 7 detectaron cuatro de cada siete muestras (Tabla 5).
TABLA 5
Código de muestra País SEQ ID 9/SEQ ID 5 (LTR)
R9610155 Tailandia positivo
R9612222 Ghana positivo
R9600062 Brasil negativo
R9612218 Zaire negativo
R9611710 Liberia positivo
R9610718 Antillas positivo
R9607884 Ruanda negativo
Las muestras perdidas por la combinación de sonda cebador LTR no se detectan debido a una carga vírica baja por debajo del nivel de detección, ya que al usar un volumen de muestra de 1 ml, el ensayo Quantiplex ARN VIH-1 2,0 (Chiron) determinó cuantitativamente niveles de ARN VIH-1 de 30 o por debajo de 30 copias de ARN VIH-1 por cada 50 \mul de estas muestras.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
AUTOR DE LA SOLICITUD
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: AKZO NOBEL N.V.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Velperweg 76
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Amhem
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Países Bajos
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (C.P.): 6824 BM
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Secuencias de ácido nucleico que se pueden utilizar como cebadores y sondas en la amplificación y detección de todos los subtipos de VIH-1.
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 12
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
SOPORTE INFORMÁTICO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA INFORMÁTICO: Patentin edición #1,0, versión #1,25 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares básicos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGCGCCACT GCTAGAGA 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares básicos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTTCGGGCGC CACTGCTAGA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 pares básicos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGGCGCCAC TGCTA 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares básicos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGCTTAAAG CCTCAATAAA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares básicos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCAATAAAG CTTGCCTTGA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares básicos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCTGGTAACT AGAGATCCCT C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares básicos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAGTGTGTGC CCGTCTGT 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares básicos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGTGTGTGCC CGTCTGTT 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 47 pares básicos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGAGG GGCGCCASCTG CTAGAGA 
\hfill
47 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 49 pares básicos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGAGG TTCGGGCGCC ACTGCTAGA 
\hfill
49 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40 pares básicos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGCGGGC GCCACTGCTA 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares básicos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATGCATGCT CAATAAAGCT TGCCTTGAGT 
\hfill
30

Claims (10)

1. Par de oligonucleótidos, para su uso como grupo en la amplificación de una secuencia diana localizada dentro de la región LTR del genoma de VIH-1, consistiendo dicho par en un primer oligonucleótido de 10 a 50 nucleótidos de longitud y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos, de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
SEQ ID 1: G GGC GCC ACT GCT AGA GA
SEQ ID 2: G TTC GGG CGC CAC TGC TAG A
SEQ ID 3: CGGGCGCCACTGCTA
y un segundo oligonucleótido de 10 a 50 nucleótidos de longitud y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos, de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
SEQ ID 4: CTG CTT AAA GCC TCA ATA AA
SEQ ID 5: CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA
SEQ ID 12: GAT GCA TGC TCA ATA AAG CTT GCC TTG AGT
2. Par de oligonucleótidos según la reivindicación 1, que consiste en un primer oligonucleótido de 10 a 50 nucleótidos de longitud y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de la secuencia
SEQ ID 1: G GGC GCC ACT GCT AGA GA y un segundo oligonucleótido que es de 10 a 50 nucleótidos de longitud y que comprende al menos un fragmento de 10 nucleótidos de la secuencia
SEQ ID 5: CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA
3. Par de oligonucleótidos según la reivindicación 1 ó 2, incorporándose en el primer oligonucleótido una secuencia de promotor reconocida por una ARN polimerasa dependiente de ADN.
4. Par de oligonucleótidos según la reivindicación 3 que consiste en un primer oligonucleótido que consiste esencialmente en la secuencia
SEQ ID 9. aat tct aat acg act cac tat agg gAG AGG GGC GCC ACT GCT AGA GA
y un secundo oligonucleótido que consiste esencialmente en la secuencia
SEQ ID 5: CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA.
5. Método para la detección de ácido nucleico de VIH-1 en una muestra, sometiéndose la muestra a una reacción de amplificación de ácido nucleico utilizando un par de oligonucleótidos según las reivindicaciones 1-4 y reactivos de amplificación adecuados, detectándose la presencia de los ácidos nucleicos amplificados.
6. Método según la reivindicación 5, en el que la detección de los ácidos nucleicos amplificados se lleva a cabo haciendo reaccionar la muestra con uno o más oligonucleótidos que tienen (a) secuencias seleccionadas del grupo que consiste en:
SEQ ID 6: TCT GGT AAC TAG AGA TCC CTC
SEQ ID 7: TAG TGT GTG CCC GTC TGT ó
SEQ ID 8: AGT GTG TGC CCG TCT GTT
incorporándose en uno o más de ellos una etiqueta detectable en condiciones de hibridación adecuadas y detectándose la presencia de la etiqueta en los híbridos formados entre la secuencia amplificada y la sonda.
7. Método según la reivindicación 5, en el que la técnica de amplificación utilizada es una técnica de amplificación basada en transcripción.
8. Equipo de ensayo para la detección de VIH-1 en una muestra que incluye:
un par de oligonucleótidos según la reivindicación 1,
uno o más oligonucleótidos que incluyen una secuencia de ácido nucleico sustancialmente complementaria de al menos parte de la secuencia de ácido nucleico amplificado, equipada con una etiqueta detectable
reactivos de amplificación adecuados.
9. Equipo de ensayo para la detección de VIH-1 en una muestra que comprende un par de oligonucleótidos según la reivindicación 4, junto con reactivos de amplificación adecuados y medios de detección del ácido nucleico amplificado.
10. Uso de un par de oligonucleótidos según la reivindicación 1 como grupo de cebadores en la amplificación de una secuencia diana localizada dentro de la región LTR del genoma de VIH-1.
ES98943872T 1997-08-08 1998-08-05 Secuencias de acido nucleico que se pueden utilizar como cebadores y sondas en la amplificacion y deteccion de todos los subtipos de vih-1. Expired - Lifetime ES2153807T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP97202455 1997-08-08
EP97202455 1997-08-08

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ES2153807T1 ES2153807T1 (es) 2001-03-16
ES2153807T3 true ES2153807T3 (es) 2005-06-16

Family

ID=8228630

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10183902T Expired - Lifetime ES2438578T3 (es) 1997-08-08 1998-08-05 Secuencias de ácidos nucleicos que se pueden usar como cebadores y sondas en la amplificación y detección de todos los subtipos del VIH-1
ES04077617.1T Expired - Lifetime ES2479065T3 (es) 1997-08-08 1998-08-05 Métodos de uso de secuencias de ácido nucleico como cebadores y sondas en la amplificación y detección de todos los subtipos de VIH-1
ES98943872T Expired - Lifetime ES2153807T3 (es) 1997-08-08 1998-08-05 Secuencias de acido nucleico que se pueden utilizar como cebadores y sondas en la amplificacion y deteccion de todos los subtipos de vih-1.

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10183902T Expired - Lifetime ES2438578T3 (es) 1997-08-08 1998-08-05 Secuencias de ácidos nucleicos que se pueden usar como cebadores y sondas en la amplificación y detección de todos los subtipos del VIH-1
ES04077617.1T Expired - Lifetime ES2479065T3 (es) 1997-08-08 1998-08-05 Métodos de uso de secuencias de ácido nucleico como cebadores y sondas en la amplificación y detección de todos los subtipos de VIH-1

Country Status (13)

Country Link
US (9) US6881537B1 (es)
EP (3) EP2336367B1 (es)
JP (1) JP3689333B2 (es)
KR (1) KR100615407B1 (es)
AT (1) ATE282720T1 (es)
AU (1) AU736503B2 (es)
CA (1) CA2299275C (es)
DE (2) DE1002138T1 (es)
ES (3) ES2438578T3 (es)
GR (1) GR20010300012T1 (es)
ID (1) ID25877A (es)
WO (1) WO1999007898A1 (es)
ZA (1) ZA987091B (es)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1002138T1 (de) 1997-08-08 2001-06-07 Akzo Nobel N.V., Arnhem Nukleinsäuresequenzen als primer und sonden zur amplifizierung und erkennung von allen hiv-1 subtypen
DE19836559A1 (de) * 1998-08-12 2000-03-23 Antigen Gmbh Gefäß zur Entnahme von Blut
DE19850186A1 (de) * 1998-10-30 2000-05-25 Roche Diagnostics Gmbh Neue Primer und Sonden zum Nachweis von HIV
EP1187939B9 (en) 1999-07-09 2009-08-12 Gen-Probe Incorporated Detection of hiv-1 by nucleic acid amplification
DE60040874D1 (de) * 2000-09-01 2009-01-02 Gen Probe Inc Amplifizierung von hiv-1 sequenzen zur detektion ven einhergehen
US6582920B2 (en) 2000-09-01 2003-06-24 Gen-Probe Incorporated Amplification of HIV-1 RT sequences for detection of sequences associated with drug-resistance mutations
US20090050492A1 (en) * 2005-08-02 2009-02-26 Board Of Trustees Of Michigan State University Nanoporous silicon-based electrochemical nucleic acid biosensor
JPWO2007055260A1 (ja) * 2005-11-11 2009-04-30 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 人免疫不全ウイルス−１遺伝子検出又は定量用材料，検出又は定量方法，治療用遺伝子断片，及び治療方法
US8227590B2 (en) * 2006-11-21 2012-07-24 Jawaharlal Nehru Centre For Advanced Scientific Research High sensitivity assay for molecular typing of biological sample, probes and a kit thereof
CA2580589C (en) * 2006-12-19 2016-08-09 Fio Corporation Microfluidic detection system
GB0701253D0 (en) * 2007-01-23 2007-02-28 Diagnostics For The Real World Nucleic acid amplification and testing
CA2682826C (en) 2007-04-02 2013-08-13 Fio Corporation System and method of deconvolving multiplexed fluorescence spectral signals generated by quantum dot optical coding technology
CA2692259C (en) 2007-06-22 2012-07-31 Fio Corporation Systems and methods for manufacturing quantum dot-doped polymer microbeads
EP2174115B1 (en) * 2007-07-09 2013-08-28 Fio Corporation Systems and methods for enhancing fluorescent detection of target molecules in a test sample
WO2009012585A1 (en) * 2007-07-23 2009-01-29 Fio Corporation A method and system for collating, storing, analyzing and enabling access to collected and analyzed data associated with biological and environmental test subjects
CA2702367C (en) * 2007-10-12 2012-08-21 Fio Corporation Flow focusing method and system for forming concentrated volumes of microbeads, and microbeads formed further thereto
US9873723B2 (en) * 2008-01-04 2018-01-23 The University Of Melbourne Diagnostic and therapeutic methods for EFMR (epilepsy and mental retardation limited to females)
CA2729023C (en) 2008-06-25 2013-02-26 Fio Corporation Bio-threat alert system
US9459200B2 (en) 2008-08-29 2016-10-04 Fio Corporation Single-use handheld diagnostic test device, and an associated system and method for testing biological and environmental test samples
EP2337852A4 (en) * 2008-09-30 2012-03-14 Univ Northwestern METHOD AND COMPOSITIONS FOR ISOLATING NUCLEIC ACIDS
EP2387721A4 (en) 2009-01-13 2014-05-14 Fio Corp PORTABLE DIAGNOSTIC TEST DEVICE AND METHOD FOR USE WITH AN ELECTRONIC DEVICE AND TEST CARTRIDGE FOR QUICK DIAGNOSTIC TESTS
KR101007903B1 (ko) * 2009-05-15 2011-01-14 (주)대영오앤이 관절 구조가 개선된 스탠드 장치
JP5461459B2 (ja) * 2011-03-01 2014-04-02 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 薬剤耐性突然変異と関連する配列検出のためのｈｉｖ−１配列の増幅
JP5461460B2 (ja) * 2011-03-01 2014-04-02 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 薬剤耐性突然変異と関連する配列検出のためのｈｉｖ−１配列の増幅
JP2012105648A (ja) * 2011-12-12 2012-06-07 Gen Probe Inc 薬剤耐性突然変異と関連する配列検出のためのｈｉｖ−１配列の増幅
AT513660B1 (de) 2012-11-30 2014-09-15 Anton Paar Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Untersuchung von Proben
KR101605524B1 (ko) 2014-02-13 2016-03-24 대한민국 Hiv-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자 염기서열 분석을 위한 프라이머 세트
JP6641305B2 (ja) 2014-06-26 2020-02-05 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． 微小管結合タンパク質タウに特異的に結合する抗体及び抗原結合断片
ZA201608812B (en) 2014-06-26 2019-08-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Antibodies and antigen-binding fragments that specifically bind to microtubule-associated protein tau
CN104911277B (zh) * 2015-04-14 2018-02-06 广州海力特生物科技有限公司 一种检测干血斑标本中人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒及其检测方法
CN108998570B (zh) * 2018-08-14 2021-11-02 首都医科大学附属北京佑安医院 可覆盖多亚型的hiv-1总dna定量检测引物对、探针及检测试剂盒
CN109517806B (zh) * 2018-12-14 2022-05-20 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种罗非鱼湖病毒强毒株及其rpa检测引物和方法
CN118497421B (zh) * 2024-05-30 2025-02-18 中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心 基于数字pcr的hiv-1检测方法

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK171161B1 (da) 1985-03-28 1996-07-08 Hoffmann La Roche Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5333675C1 (en) * 1986-02-25 2001-05-01 Perkin Elmer Corp Apparatus and method for performing automated amplification of nucleic acid sequences and assays using heating and cooling steps
US4772547A (en) * 1986-02-03 1988-09-20 Hoffmann-La Roche Inc. HTLV-III envelope peptides
IL86724A (en) 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
US5306631A (en) * 1987-08-21 1994-04-26 University Of Colorado Foundation, Inc. Compositions and method for inhibition of HIV production
US4963532A (en) * 1987-11-25 1990-10-16 Hem Research, Inc. dsRNA-based prevention of viral escape
EP0331939B1 (en) 1988-02-16 2001-11-14 Greatbatch Gen-Aid, Ltd Modified cells having resistance to retroviral infection
CA1340807C (en) 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
US5622820A (en) * 1988-03-10 1997-04-22 City Of Hope Method for amplification and detection of RNA and DNA sequences
US5221610A (en) * 1988-05-26 1993-06-22 Institut Pasteur Diagnostic method and composition for early detection of HIV infection
JP3276955B2 (ja) * 1988-09-30 2002-04-22 ジーン−トラック・システムス Ｒｎａの鋳型の末端に結合したプローブ構造およびその使用方法
NL8900725A (nl) 1989-03-23 1990-10-16 Az Univ Amsterdam Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur.
IE64040B1 (en) * 1989-06-15 1995-06-28 Akzo Nv Method for determining nucleic acid
US5856088A (en) * 1989-07-11 1999-01-05 Gen-Probe Incorporated Detection of human immunodeficiency virus type 1
DE69028257T2 (de) 1989-07-11 1997-01-09 Gen Probe Inc Verfahren zur Vervielfältigung von Nukleinsäuresequenzen
US5122457A (en) * 1989-10-19 1992-06-16 Schering Corporation Expression systems utilizing bacteriophage t7 promoters, gene sequences, and t7 rna polymerase
WO1991008308A1 (en) 1989-11-30 1991-06-13 Pharmacia Genetic Engineering, Inc. A new method for detecting a specific nucleic acid sequence in a sample of cells
DE69131596T2 (de) * 1990-01-10 1999-12-23 Chiron Diagnostics Corp., East Walpole Dns-abhängige rns-polymerase-transkripte als reportermoleküle zur signalverstärkung in nukleinsäure-hybridisierungsuntersuchungen
DE4027616A1 (de) * 1990-08-31 1992-03-05 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur bestimmung von polymerase-aktivitaet
US5474796A (en) * 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
DK173091D0 (da) 1991-10-11 1991-10-11 Schleroseforeningen The Danish Biologisk materiale
AU681082B2 (en) 1992-05-06 1997-08-21 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit
US5770428A (en) * 1993-02-17 1998-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Chimeric retrovial expression vectors and particles containing a simple retroviral long terminal repeat, BLV or HIV coding regions and cis-acting regulatory sequences, and an RNA translational enhancer with internal ribsome entry site
CA2159103C (en) * 1993-03-26 2002-03-12 Sherrol H. Mcdonough Detection of human immunodeficiency virus type 1
US5403707A (en) * 1993-05-14 1995-04-04 Eastman Kodak Company Diagnostic compositions, elements, methods and test kits for amplification and detection of retroviral DNA using primers having matched melting temperatures
JPH09501562A (ja) * 1993-07-19 1997-02-18 ジェン−プローブ・インコーポレイテッド ヒト・免疫不全ウイルスに対する活性を有するオリゴヌクレオチド
US6025124A (en) * 1994-03-03 2000-02-15 The Regents Of The University Of California Marker, method and an assay for detection and monitoring of latency and activation of human immunodeficiency virus
US5576176A (en) 1994-03-03 1996-11-19 The Regents Of The University Of California Marker and an assay for detection and monitoring of human immunodeficiency virus latency and activation
US5622827A (en) * 1995-02-07 1997-04-22 Gen-Probe Incorporated Amplification primers and nucleic acid probes targeted to coccidioides immitis nucleic acid
US5599662A (en) 1995-02-17 1997-02-04 Hoffmann-La Roche Inc. Oliconucleotide primers and probes for the detection of HIV-1
US5798542A (en) * 1996-10-08 1998-08-25 Eastman Kodak Company Image sensor having ITO electrodes with overlapping color filters for increased sensitivity
US6001558A (en) 1997-06-25 1999-12-14 Ortho Clinical Diagnostics, Inc. Amplification and detection of HIV-1 and/or HIV 2
DE1002138T1 (de) * 1997-08-08 2001-06-07 Akzo Nobel N.V., Arnhem Nukleinsäuresequenzen als primer und sonden zur amplifizierung und erkennung von allen hiv-1 subtypen
US9004733B2 (en) 2012-04-05 2015-04-14 Corning Cable Systems Llc Optical fiber installation tool having a passive illumination feature

Also Published As

Publication number Publication date
US9074262B2 (en) 2015-07-07
AU9161198A (en) 1999-03-01
US6881537B1 (en) 2005-04-19
EP1002138A1 (en) 2000-05-24
US20050239118A1 (en) 2005-10-27
JP2001512701A (ja) 2001-08-28
ID25877A (id) 2000-11-09
ES2479065T3 (es) 2014-07-23
EP2336367A1 (en) 2011-06-22
KR100615407B1 (ko) 2006-08-25
JP3689333B2 (ja) 2005-08-31
US20060228699A1 (en) 2006-10-12
EP1568787A1 (en) 2005-08-31
ES2153807T1 (es) 2001-03-16
EP1568787B1 (en) 2014-04-30
US20060223057A1 (en) 2006-10-05
WO1999007898A1 (en) 1999-02-18
ZA987091B (en) 1999-02-26
CA2299275C (en) 2009-07-07
US20170137900A1 (en) 2017-05-18
US20060223056A1 (en) 2006-10-05
ES2438578T3 (es) 2014-01-17
DE69804464T2 (de) 2005-09-08
DE69804464D1 (de) 2005-05-04
US8697352B2 (en) 2014-04-15
US20150292043A1 (en) 2015-10-15
EP1002138B1 (en) 2004-11-17
CA2299275A1 (en) 1999-02-18
ATE282720T1 (de) 2004-12-15
EP2336367B1 (en) 2013-11-27
KR20010022730A (ko) 2001-03-26
GR20010300012T1 (en) 2001-04-30
DE1002138T1 (de) 2001-06-07
US20140199687A1 (en) 2014-07-17
US20170145524A1 (en) 2017-05-25
AU736503B2 (en) 2001-07-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2153807T3 (es) Secuencias de acido nucleico que se pueden utilizar como cebadores y sondas en la amplificacion y deteccion de todos los subtipos de vih-1.
JP5205346B2 (ja) Ｈｉｖ−１の増幅及び検出試薬
US5688637A (en) Nucleotide sequences derived from the genome of retroviruses of the HIV-1, HIV-2 and SIV type, and their uses in particular for the amplification of the genomes of these retroviruses and for the in vitro diagnosis of the disease due to these viruses
Mulder et al. Rapid and simple PCR assay for quantitation of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma: application to acute retroviral infection
ES2445495T3 (es) Cebadores de ácido nucleico y sondas para detectar VIH-1 y VIH-2
KR100257438B1 (ko) 인간 면역결핍 바이러스 1형 검출용 프라이머
US7022814B1 (en) Nucleotide sequences derived from the genome of retroviruses of the HIV-1, HIV-2 and SIV type, and their uses in particular for the amplification of the genomes of these retroviruses and for the in vitro diagnosis of the diseases due to these viruses
Holodniy Clinical application of reverse transcription-polymerase chain reaction for HIV infection
AU772821B2 (en) Method and kit for detecting resistance to antiviral drugs
EP0879894A2 (en) Sample preparation for nucleic acid based diagnostic tests
JPH10327898A (ja) 核酸ベースの診断試験のための試料調製