KR101605524B1 - Hiv-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자 염기서열 분석을 위한 프라이머 세트 - Google Patents

Hiv-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자 염기서열 분석을 위한 프라이머 세트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PCR에 의해 증폭된, HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자의 염기서열을 분석하기 위한 DNA 시퀀싱용 프라이머 세트 및, 상기 DNA 시퀀싱용 프라이머 세트를 이용하여 HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자의 염기서열을 분석하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 DNA 시퀀싱용 프라이머 세트 및 이를 이용한 HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자의 염기서열을 분석하는 방법을 이용함으로써 PCR 증폭된 HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자 관련 염기서열의 보다 확장된 영역을 효율적으로 분석할 수 있다.

Description

HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자 염기서열 분석을 위한 프라이머 세트 {A primer set for analyzing a base sequence of an antiretroviral drug-resistant gene derived from HIV-1-infected individuals}
본 발명은 PCR에 의해 증폭된, HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자의 염기서열을 분석하기 위한 DNA 시퀀싱용 프라이머 세트 및, 상기 DNA 시퀀싱용 프라이머 세트를 이용하여 HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자의 염기서열을 분석하는 방법에 관한 것이다.
HIV-1 감염인 및 에이즈환자에 대한 항레트로바이러스제 병합요법의 치료경과 모니터링에 있어, 항레트로바이러스제 내성검사 결과는 유용한 지침으로 활용되고 있다. 과거 스탠포드 대학이 확립한 "인 하우스(in house)" 방법(Stanford's Center for AIDS Research laboratory protocol: Journal of AIDS, 2008;49:237-242)을 활용한 항레트로바이러스제 내성검사가 국립보건연구원에서 수행되고 있으며, 이외에도 바이로시퀀스 키트(ViroSeq kit)가 일부 대학병원 또는 임상검사센터에서 이용되고 있다.
하지만, 기존에 사용되고 있는 "인 하우스" 방법의 경우 실험자의 능숙도에 따라 PCR이 원활히 수행되지 않아 실험의 재현성에 대한 문제가 발생할 수 있으며, 샘플에 따라 검출되는 빈도에 차이가 발생할 수 있다. 이에 반해, 상용화된 키트는 높은 단가의 문제로 민간의료기관에서의 검사에 폭넓은 활용에는 아직은 용이하지 않다는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 기존의 인 하우스 방법보다 검출률 및 재현성이 높고 상용화된 키트에 비해 검사비용 절감 효과가 큰 HIV-1 내성유전자 증폭 및 증폭된 유전자의 염기서열 분석을 위한 DNA 시퀀싱 프라이머를 개발하였다. 본 발명에 따른 DNA 시퀀싱 프라이머는 gag - pol 유전자 부위를 포함하는 내성 유전자에 대한 염기서열 분석에 이용될 수 있다.
본 발명의 목적은 PCR 프리믹스 조성물에 의해 증폭된, HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자의 염기서열을 분석하기 위한 DNA 시퀀싱용 프라이머 세트, 및 상기 DNA 시퀀싱용 프라이머 세트를 이용한 염기서열 분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, 일 구체예에서, 서열번호 1 및 서열번호 2에 의해 제시된 RT-PCR용 프라이머 세트에 의해 증폭된 HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자의 염기서열을 분석하기 위한, DNA 시퀀싱용 프라이머 세트로서, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 제시된 정방향 프라이머 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 제시된 역방향 프라이머를 포함하는 것인, DNA 시퀀싱용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 일 구체예에서, 서열번호 3 및 서열번호 4에 의해 제시된 cDNA 증폭용 2차 PCR 프라이머 세트에 의해 증폭된 HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자의 염기서열을 분석하기 위한, DNA 시퀀싱용 프라이머 세트로서, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 제시된 정방향 프라이머 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 제시된 역방향 프라이머를 포함하는 것인, DNA 시퀀싱용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 일 구체예에서, 서열번호 1 및 서열번호 2에 의해 제시된 RT-PCR용 프라이머 세트, 및 서열번호 3 및 서열번호 4에 의해 제시된 cDNA 증폭용 2차 PCR 프라이머 세트를 포함하는 PCR 프리믹스 조성물에 의해 증폭된 HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자의 염기서열을 분석하기 위한, DNA 시퀀싱용 프라이머 세트로서, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 제시된 정방향 프라이머 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 제시된 역방향 프라이머를 포함하는 것인, DNA 시퀀싱용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 (i) 서열번호 1 및 서열번호 2에 의해 제시된 RT-PCT용 프라이머 세트로 cDNA를 합성하는 단계; (ii) 서열번호 3 및 서열번호 4에 의해 제시된 2차 PCR 프라이머 세트로 목적유전자를 증폭하는 단계; 및 (iii) 상기 (ii) 단계의 증폭 생성물을, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 제시된 정방향 프라이머 및, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 제시된 역방향 프라이머로 각각 시퀀싱하는 단계를 포함하는, HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자의 염기서열을 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예의 HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자의 염기서열을 분석하는 방법은, 상기 (iii) 단계에서 시퀀싱한 각각의 염기서열을 하나의 염기서열로 배열하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예의 HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자의 염기서열을 분석하는 방법에 있어서, 상기 cDNA 합성 단계는 50℃에서 30분간 실시하고, 사전-변성은 94℃에서 10분간 실시하며, 어닐링 단계는 55℃에서 20초간 실시할 수 있다.
본 발명의 일실시예의 HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자의 염기서열을 분석하는 방법에 있어서, 상기 목적 유전자의 증폭 단계는 1차 RT-PCR 생성물 2㎕를 사용하고, 어닐링 단계는 60℃ 또는 65℃에서 30초간 실시할 수 있다.
또한, 본 발명은 일 구체예에서, 상기 HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자의 염기서열을 분석하는 방법에 따라 염기서열을 분석하여, 항레트로바이러스제에 대한 내성 분석용 시료를 제공하는 방법을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 항레트로바이러스제라 함은 단백질분해효소억제제, 핵산계열의 역전사효소억제제 및 비핵산계열의 역전사효소억제제를 포함하며, 이들 항레트로바이러스제들은 단독 또는 혼합 사용에 따라 분석 목적에 맞게 내성 유전자의 염기서열 분석이 가능하다. 또한, 본 발명의 일 구체예에서, 상기 항레트로바이러스제에 대한 내성유전자는 gag-pol 유전자 부위를 포괄할 수 있다.
본 발명에 따른 DNA 시퀀싱용 프라이머 세트를 이용함으로써 PCR에 의해 증폭된 HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자의 더 확장된 부위의 염기서열을 효율적으로 분석할 수 있다.
도 1은 HIV-1 감염 환자로부터 채취한 시료에 대하여 기존의 인 하우스 방법에 의한 결과 및 본 발명에 따른 프리믹스를 이용함으로써 기존의 방법으로는 검출되지 않은 7개 샘플 중 4개가 검출됨을 보여준다.
도 2는 기존의 인 하우스 방법에 의한 RT-PCR 산물을 사용하여 본 발명에 따른 2nd PCR을 수행한 결과로서, 목적유전자가 일부(4, 5번, 1.5Kb)에서만 약하게 증폭될 뿐, 7개 샘플 모두 제대로 증폭되지 못한다는 것을 보여준다.
도 3은 각각 3개의 정방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 분석한 목적유전자의 염기서열을 정렬(alignment)하여 밝혀낸 목적 유전자의 전체 염기 서열이다. 밑줄 친 부분은 본원발명에 따른 시퀀싱 프라이머를 사용하여 추가로 얻은 서열이다.
실시예
실시예 1
환자 유래 HIV-1으로부터 HIV-1 목적 유전자의 증폭
HIV-1에 감염된 환자의 시료(혈장) 중에서 기존의 인 하우스 방법으로 목적 유전자가 증폭되지 않았던 시료를 선별하였다. 시료로부터 HIV-1 RNA를 추출하기 위해서, Abbott 사의 m2000sp 시스템(m2000sp; Abbott molecular Inc., Des Plaines, IL, USA) 또는 QIAamp Viral RNA mini kit (QIAGEN, USA)를 사용하여 제조자의 매뉴얼에 따라 시료로부터 핵산을 분리하였다. RT-PCR(서열번호 1 및 2) 및 2nd PCR(서열번호 3 및 4)에 사용한 프라이머의 서열은 하기 표 2에 나타내었다.
표 1. 프라이머 서열(기존 인하우스)
Figure 112014014176110-pat00001
표 2. 프라이머 서열(본원발명)
Figure 112014014176110-pat00002
RT-PCR(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) 및 2nd PCR 반응은 KNIH-OJ One-step RT PCR (HIV-1)키트 및 KNIH-OJ One-step PCR (HIV-1)키트를 사용하여 하기 표 3 내지 표6의 조건에 따라 수행하였다.
표 3. One-step RT-PCR 반응 조건
Figure 112014014176110-pat00003
표 4. One-step RT PCR 반응 조성
Figure 112014014176110-pat00004
표 5. 2nd PCR 반응 조건
Figure 112014014176110-pat00005
표 6. 2nd PCR 반응 조성
Figure 112014014176110-pat00006
상기와 표 3 내지 표 6에 따라 RT PCR 및 2nd PCR을 수행하여 도 1(M: 1kb ladder, 1-7: 임상주 샘플, N: 음성대조군)과 같은 결과를 수득하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 기존의 인 하우스 방법으로는 목적 유전자 1.3kb가 증폭되지 않았지만, 본원 발명의 변경된 프라이머(목적 유전자 1.5kb)를 활용하여 제작된 프리믹스를 활용하면, 기존의 방법으로는 검출되지 않은 7개 샘플 중 4개가 증폭됨을 확인하였다. 또한, 기존의 인 하우스 방법으로 RT-PCR을 수행하고 난 후, 합성된 cDNA에 대하여 2nd PCR을 수행하였으며, 7개 시료에서 목적 유전자의 대부분이 제대로 증폭되지 못함을 확인하였다(도 1 및 2).
하기의 표 7은 기존의 인 하우스 방법과 본원 발명의 방법을 비교한 것이다.
표 7
기존 인하우스 방법과 본원 발명의 비교
Figure 112014014176110-pat00007

실시예 2
증폭된 HIV-1 목적 유전자의 염기서열 분석
(1) DNA 시퀀싱
PCR로 증폭된 DNA 단편을 주형으로 하여, BigDye® Terminator Sequencing Kit(Invitrogen Life Science Technologies사)을 사용하여 시퀀싱 반응을 수행하였다. 시퀀싱 반응은, 주형 DNA를 2.7㎕, 프라이머(10pmol/㎕)를 0.3㎕, pre-mix를 2㎕로 하고, 총용량을 5㎕로 하였다. 시퀀싱 반응조건은, 96℃에서 1분간의 초기 변성단계, 계속해서, 96℃에서 10초간의 변성단계, 50℃에서 5초간의 어닐링 단계 및 60℃에서 4분간의 신장단계로 이루어진 사이클을 25회 수행하고, 정제 과정이 준비되기까지 4℃로 유지하였다. 증폭된 sequencing PCR 산물 5㎕와 초순수정제수 15㎕에 3M 소듐 아세테이트 및 에탄올을 0.1:2의 부피비가 되도록 넣어주어 총용량 50㎕가 되게 준비하였다. 15,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리 후 상층액을 버리고, 70% 에탄올 500㎕를 넣어주고 다시 15,000 rpm, 4℃에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 버린후, 여분의 에탄올이 날아가도록 상온에서 시료를 건조시켜 시료 준비 후 시퀀싱을 수행하였다.
(2) DNA 시퀀싱에 사용한 프라이머의 명칭 및 염기서열
상기 (1)에서 사용한 프라이머에 대한 명칭 및 염기서열을 하기 표 8에 수록하였다. 표 9는 인하우스방법 시퀀싱 프라이머 서열을 나타낸 것이다. 각각의 시퀀싱 프라이머들을 사용한 염기서열 조합 결과 예시는 아래와 같다.
표 8
Figure 112014014176110-pat00008
표 9
Figure 112014014176110-pat00009
(3) 항레트로바이러스제에 대한 내성 유전자 염기서열 분석
정방향 3개 및 역방향 3개, 총 6 개의 시퀀싱 프라이머들을 사용한 염기서열 조합 결과(약 1,400 bp)를 Stanford sequence database (이하 Stanford DB, http://hivdb.stanford.edu/)에 입력하면 예측된 약제내성정도를 각 계열별 항레트로바이러스제에 따라 총 5구간 (susceptible/potential-low level/low level/intermediate-level/high-level resistance) 또는 3구간 (SIR; susceptible/intermediate/resistant)으로 구분하여 해석할 수 있다. 이와 더불어 약제내성과 직접적인 연관이 있는 돌연변이 위치 및 내성과 직접적 연관은 없지만 표준주 대비 변화된 돌연변이 위치, 이들과 관련된 약제별 돌연변이 스코어링 누계, 아형(subtype) 등이 제시되어 해당 감염인의 항레트로바이러스제 병합요법에 사용하는 약제의 변경 또는 유지 등을 위한 참고자료로 활용이 된다.
지금까지 예시적인 실시예을 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명의 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시예로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Korea <120> A primer set for analyzing a base sequence of an antiretroviral drug-resistant gene derived from HIV-1-infected individuals <130> 50748 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-OJF-Outer <400> 1 tggctgaagc aatgagccaa gt 22 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-OJR-Outer <400> 2 tgcttctgta tttctgctat taag 24 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OJF-Inner <400> 3 aaagggctgt tggaaatgtg g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OJR-Inner <400> 4 tctctctgtt ttctgccagt t 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JHF1 <400> 5 tcagaagcag gagccgatag 20 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JHF2 <400> 6 gatggcccaa aagttaaaca atggcc 26 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JHF3 <400> 7 gggatggaaa ggatcaccag c 21 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JHF4 <400> 8 ctgttttctg ccagttctag ctctgc 26 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JHF5 <400> 9 tctggatttt gttttctaaa aggctc 26 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JHF6 <400> 10 tcctggcttt aattttactg gtacag 26

Claims (11)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2에 의해 제시된 RT-PCR용 프라이머 세트에 의해 증폭된 HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자인 gag-pol 유전자의 염기서열을 분석하기 위한, DNA 시퀀싱용 프라이머 세트로서, 상기 DNA 시퀀싱용 프라이머 세트는 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 제시된 정방향 프라이머 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 제시된 역방향 프라이머로 구성되는 것인, DNA 시퀀싱용 프라이머 세트.
  2. 서열번호 3 및 서열번호 4에 의해 제시된 cDNA 증폭용 2차 PCR 프라이머 세트에 의해 증폭된 HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자인 gag-pol 유전자의 염기서열을 분석하기 위한, DNA 시퀀싱용 프라이머 세트로서, 상기 DNA 시퀀싱용 프라이머 세트는 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 제시된 정방향 프라이머 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 제시된 역방향 프라이머로 구성되는 것인, DNA 시퀀싱용 프라이머 세트.
  3. 서열번호 1 및 서열번호 2에 의해 제시된 RT-PCR용 프라이머 세트 및, 서열번호 3 및 서열번호 4에 의해 제시된 cDNA 증폭용 2차 PCR 프라이머 세트를 포함하는 PCR 프리믹스 조성물에 의해 증폭된 HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자인 gag-pol 유전자의 염기서열을 분석하기 위한, DNA 시퀀싱용 프라이머 세트로서, 상기 DNA 시퀀싱용 프라이머 세트는 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 제시된 정방향 프라이머 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 제시된 역방향 프라이머로 구성되는 것인, DNA 시퀀싱용 프라이머 세트.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항레트로바이러스제가 단백질분해효소억제제, 핵산계열의 역전사효소억제제 또는 비핵산계열의 역전사효소억제제인, DNA 시퀀싱용 프라이머 세트.
  5. 삭제
  6. (ⅰ) 서열번호 1 및 서열번호 2에 의해 제시된 RT-PCT용 프라이머 세트로 cDNA를 합성하는 단계;
    (ⅱ) 서열번호 3 및 서열번호 4에 의해 제시된 2차 PCR 프라이머 세트로 목적유전자를 증폭하는 단계; 및
    (ⅲ) 상기 (ⅱ) 단계의 증폭 생성물을, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 제시된 정방향 프라이머 및, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 제시된 역방향 프라이머로 각각 시퀀싱하는 단계를 포함하는, HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자인 gag-pol 유전자의 염기서열을 분석하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, (ⅲ) 단계에서 시퀀싱한 각각의 염기서열을 하나의 염기서열로 배열하는 단계를 추가로 포함하는, HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자인 gag-pol 유전자의 염기서열을 분석하는 방법.
  8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 항레트로바이러스제가 단백질분해효소억제제, 핵산계열의 역전사효소억제제 또는 비핵산계열의 역전사효소억제제인, HIV-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자인 gag-pol 유전자의 염기서열을 분석하는 방법.
  9. 삭제
  10. 제 6항 또는 제 7항의 HIV-1 감염인 유래 항래트로바이러스제 내성 유전자인 gag-pol 유전자의 염기서열을 분석하는 방법에 따라 염기서열을 분석하고, 항래트로바이러스제 내성 유전자 염기서열 데이터베이스에 입력하여 항레트로바이러스제에 대한 약제 내성 정도를 예측하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 항레트로바이러스제가 단백질분해효소억제제, 핵산계열 역전사효소억제제 또는 비핵산계열의 역전사효소억제제인 것인, 항레트로바이러스제에 대한 약제내성정도를 예측하는 방법.
KR1020140016551A 2014-02-13 2014-02-13 Hiv-1 감염인 유래 항레트로바이러스제 내성유전자 염기서열 분석을 위한 프라이머 세트 KR101605524B1 (ko)

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