JPWO2007055260A1 - 人免疫不全ウイルス−1遺伝子検出又は定量用材料,検出又は定量方法,治療用遺伝子断片,及び治療方法 - Google Patents
人免疫不全ウイルス−1遺伝子検出又は定量用材料,検出又は定量方法,治療用遺伝子断片,及び治療方法 Download PDFInfo
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- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
Abstract
【課題】現在知られているHIV-1のうち少なくとも2種類以上のサブタイプのウイルスを検出又は定量可能な、プライマー及びプローブ,それらを含む検出又は定量キット,及びそれらを用いた、HIV-1遺伝子の検出又は定量方法,当該プローブ配列を用いた、治療用遺伝子断片,遺伝子治療方法等を提供すること。【解決手段】配列番号2〜9から選択されるポリヌクレオチドの一種からなる、人免疫不全ウイルス−1遺伝子検出又は定量用プライマー,及び配列番号10〜11から選択されるポリヌクレオチドの一種からなる、人免疫不全ウイルス−1遺伝子検出又は定量用プローブ等によって達成される。【選択図】図1
Description
本発明は、人免疫不全ウイルスの検出又は定量方法,当該検出又は定量に用いるキット,当該キットに用いられるプライマー及びプローブ,及び治療用遺伝子断片,並びに遺伝子治療方法に関するものである。
人免疫不全ウイルス:Human Immunodefeciency Virus(以下、HIVと記載する。)とは、後天性免疫不全症候群(AIDS)の原因となるウイルスである。このHIVとしては、HIV-1及びHIV-2の2つの群が同定されており、特に、世界中で流行しているHIV-1は、更にA,B,C,D,F,G,H,J,K等の9種類のサブタイプからなるグループM(Main)と、グループO(Outlier),グループN(New),更には、サブタイプAの組み換え流行株である、CRF01_AE等に分類されている。
日本においては、HIV-1のサブタイプBが大多数であったが、感染経路の多様化等によって、B以外のサブタイプ,特にHIV-1のCRF01_AE等が増加の傾向にある。
従って、AIDSの検査方法においては、一度にできるだけ多くのタイプのHIV遺伝子を検出又は定量できることが好ましく、特に、HIV-1の重要なサブタイプの全てについて検出又は定量することが求められている。
ところで、HIVの検出方法としては、従来HIV抗体検査が主流であったが、感染初期には検出が困難である等の理由から、近年では、HIV遺伝子検出による検査のニーズが高まっている。
一方、近年の核酸増幅等の技術の進歩により、微量の検体からも、HIV遺伝子が、簡単・確実に検出できるようになってきている。
核酸増幅法としては、例えば、PCR法(ポリメラーゼ連鎖反応法,Polymerase
Chain Reaction,EP200362等参照)やNASBA法(EP329822等参照),TAS法(WO88/10315等参照)のほか、等温遺伝子増幅法(ICAN法:Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids,タカラバイオ社)等が挙げられる。
Chain Reaction,EP200362等参照)やNASBA法(EP329822等参照),TAS法(WO88/10315等参照)のほか、等温遺伝子増幅法(ICAN法:Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids,タカラバイオ社)等が挙げられる。
HIV遺伝子の検出には、これらのうち、主にPCR法が用いられているが、PCR法にも、色々な種類が開発されている。
(1)治療過程での感染ウイルス遺伝子の量的な変化を追跡可能なリアルタイム−PCR法,
(2)感染ウイルス遺伝子(DNA,RNA,プロウイルス等)を、一旦PCRで増幅した後に、更に別のプライマー対によってPCRを行う、nested-PCR法,
(3)nested-PCR法とリアルタイムPCR法を組み合わせたnested-リアルタイムPCR法(二度目のPCRをリアルタイムPCR法で行う方法),
及び、これらに、PCR法の実施前にウイルスRNAを逆転写する逆転写工程(Reverse Transcription :
RT)を組み合わせた方法等が開発されている。
尚、リアルタイムPCR法には、二本鎖DNAに結合することで蛍光を発する試薬(インターカレーター)を用いるインターカレーター法や、プローブの一端に蛍光物質が,他端に消光物質(クエンチャー)が結合したTaqManタイプのプローブを用いるTaqManプローブ法,DNAとRNAのキメラプローブを用いる、サイクリングプローブ法等がある。
(1)治療過程での感染ウイルス遺伝子の量的な変化を追跡可能なリアルタイム−PCR法,
(2)感染ウイルス遺伝子(DNA,RNA,プロウイルス等)を、一旦PCRで増幅した後に、更に別のプライマー対によってPCRを行う、nested-PCR法,
(3)nested-PCR法とリアルタイムPCR法を組み合わせたnested-リアルタイムPCR法(二度目のPCRをリアルタイムPCR法で行う方法),
及び、これらに、PCR法の実施前にウイルスRNAを逆転写する逆転写工程(Reverse Transcription :
RT)を組み合わせた方法等が開発されている。
尚、リアルタイムPCR法には、二本鎖DNAに結合することで蛍光を発する試薬(インターカレーター)を用いるインターカレーター法や、プローブの一端に蛍光物質が,他端に消光物質(クエンチャー)が結合したTaqManタイプのプローブを用いるTaqManプローブ法,DNAとRNAのキメラプローブを用いる、サイクリングプローブ法等がある。
これらのPCR法においては、確実に標的HIV遺伝子(DNA,RNA,プロウイルス等)を定量し、感染の有無やウイルス量の変化、又は治療効果を正確に把握するために、ミスマッチの無い、プライマーやプローブの設計が非常に重要な要素となる。
特に、プライマーには
(1)標的遺伝子に安定してアニーリングできること(Tm値が適切な範囲である),
(2)プライマー内部やプライマー間に相補的な配列が無く、PCRの反応効率が良いこと,
(3)特異性が高く、鋳型DNA上にミスプライミングする部位がないこと
等が求められる。
そのため、適切なプライマーを選択することは、容易では無い。
(1)標的遺伝子に安定してアニーリングできること(Tm値が適切な範囲である),
(2)プライマー内部やプライマー間に相補的な配列が無く、PCRの反応効率が良いこと,
(3)特異性が高く、鋳型DNA上にミスプライミングする部位がないこと
等が求められる。
そのため、適切なプライマーを選択することは、容易では無い。
2対のプライマーを入れ子状(nested)に設定する必要があるnested-リアルタイムPCR法の場合には、プライマー,プローブの設定は、尚更困難である。
しかも、HIVは変異の修復機構を持たないウイルスであり、このウイルスの遺伝子は、非常に変異が起こりやすい。一方、変異の起こり難い、いわゆる保存性の高い領域も存在する。変異のし易い領域にプライマーやプローブを設計すると標的遺伝子とのミスマッチが頻繁に出現し、HIV遺伝子を確実に増幅・検出することができず、誤った検査結果を導く危険性がある。その為、できるだけ多くのサブタイプを、確実に検出するためには、サブタイプ内,サブタイプ間の、いずれにおいても保存性が高い領域を見出し、その領域内にPCR及びリアルタイムPCRに適したプライマーやプローブを設計する事が必要となる。
本発明者等は、既にリアルタイムPCR法やnested-リアルタイムPCR法によって、HIV-1DNA定量法の検討を進めてきており、例えばサブタイプBについて検出又は定量可能なプライマー及びプローブ配列を特定することに成功している。
しかしながら、下記非特許文献1〜3のプライマー及びプローブは、いずれもサブタイプBのみの遺伝子配列をもとに設計されたものである。しかも非特許文献3においては、サブタイプBの「薬剤耐性変異の出現が疑われた、HAART施行中のHIV-1感染症患者10症例」という小さい母集団において、変異の生じていない領域を見出して、プライマー,プローブを設計したものにすぎない。
従って、上記非特許文献1〜3によって開示されたプライマーやプローブは、様々なサブタイプの、しかも治療前(即ち、薬剤耐性変異が生じる前)の、感染HIVウイルスを検査するためのものとして適しているとは言えない。
また、上記特許文献1では、全てのサブタイプのHIV-1の検出が可能なプライマー,プローブに関する発明が記載されているが、本願のプライマー,プローブとは、設計のもととなるHIV-1遺伝子上の領域が異なり、またこれらを用いた遺伝子検出においては、検出感度が十分とは言えず、まして定量に使用できるようなものではなかった。
Journal of Virological Methods 124(2005) 157-165(Hiromi Nagai , Tsuguhio Kaneda, et al.)
Microbiol Immunol 48(10), 767-772, 2004(Kaoru Wada, Hiromi Nagai, Tsuguhio Kaneda, et al.)
日本エイズ学会誌(季刊)2002年,vol.4,No.4,一般演題No.61(永井裕美,金田次弘ら)
特表2001−512701号公報
一方、様々なサブタイプの患者からの遺伝子サンプルを入手すること自体、かなり困難な作業である。従って、プライマーやプローブの設計の実験の多くが、過去に公表された遺伝子配列をもとに行われているのが実状であり、実際に、あらゆるサブタイプの遺伝子配列を調査した上で、適切なプライマーやプローブを設計している例は、殆ど見られないのが現状である。
本発明者等は、日本で初めて様々なサブタイプについて、各サブタイプ毎に多数のHIV-1感染患者の血漿を入手し、そこからRNAを抽出し、それらの遺伝子配列を実際に比較検討することによって、サブタイプ内や、サブタイプ間でも遺伝子配列が良く保存されている領域を見出すことに成功し、本発明に到達したものであって、その目的とするところは、現在知られているHIV-1のうち少なくとも2種類以上のサブタイプのウイルスを検出又は定量可能な、プライマー及びプローブ,それらを含む検出又は定量キット,及びそれらを用いた、HIV-1遺伝子の検出又は定量方法,当該プローブ配列を用いた、治療用遺伝子断片,遺伝子治療方法等を提供するにある。
上述の目的は、下記(第1の発明)乃至(第9の発明)等によって達成される。
(第1の発明)
下記の配列番号1のポリヌクレオチドからなる、人免疫不全ウイルス−1遺伝子の検出又は定量用プライマー及び/又はプローブ配列の選択用塩基配列。
配列番号1
(第2の発明)
下記(ア)又は(イ)から選択されるポリヌクレオチドの一種からなる、人免疫不全ウイルス−1遺伝子検出又は定量用プライマー。
(ア)配列番号2〜9から選択されるポリヌクレオチドの一種
(イ)配列番号3,5,7,9のいずれかのポリヌクレオチドの、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド。
(第3の発明)
下記グループ(I)又は(II)に属するポリヌクレオチドの一種と、下記グループ(III)又は(IV)に属するポリヌクレオチドの一種からなる、人免疫不全ウイルス−1遺伝子検出又は定量用プライマー対。
(第4の発明)
下記(1)又は(2)からなるポリヌクレオチドを構成要素として含む、人免疫不全ウイルス−1遺伝子検出又は定量用プローブ。
(1)下記グループ(V)又は(VI)から選択されるポリヌクレオチドの一種
(2)一端に蛍光物質,他端に消光物質を結合された下記グループ(V)又は(VI)から選択されるポリヌクレオチドの一種
(第5の発明)
下記(A)乃至(C)の少なくともいずれか一つを含むことを特徴とする、人免疫不全ウイルス−1遺伝子検出又は定量用キット。
(A)第2の発明に記載のプライマーの少なくとも一種
(B)第3の発明に記載のプライマー対の少なくとも一種
(C)第4の発明に記載のプローブの少なくとも一種
(第6の発明)
下記(A)乃至(D)の少なくともいずれか一つを用いることを特徴とする、人免疫不全ウイルス−1遺伝子の検出又は定量方法。
(A)第2の発明に記載のプライマーの少なくとも一種
(B)第3の発明に記載のプライマー対の少なくとも一種
(C)第4の発明に記載のプローブの少なくとも一種
(D)第5の発明に記載の検出又は定量用キット
(第7の発明)
下記(A)乃至(D)の少なくともいずれか一つを用い、下記(a)乃至(d)のいずれかの方法を用いることを特徴とする、人免疫不全ウイルス−1遺伝子の検出又は定量方法。
(A)第2の発明に記載のプライマーの少なくとも一種
(B)第3の発明に記載のプライマー対の少なくとも一種
(C)第4の発明に記載のプローブの少なくとも一種
(D)第5の発明に記載の検出又は定量用キット
(a)PCR法
(b)Nested-PCR法
(c)リアルタイムPCR法
(d)nested-リアルタイムPCR法
(第8の発明)
下記グループ(I)乃至(VI)に属するポリヌクレオチドの一種からなる、人免疫不全症候群治療用遺伝子断片。
(第9の発明)
下記グループ(I)乃至(VI)に属するポリヌクレオチドの一種を用いることを特徴とする、人免疫不全症候群の治療方法。
グループ(I):配列番号2,3,又は配列番号3の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(II):配列番号4,5,又は配列番号5の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(III):配列番号6,7,又は配列番号7の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(IV):配列番号8,9,又は配列番号9の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(V):配列番号10,11,又は配列番号11の、5’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(VI):グループ(V)の相補体
配列番号1:cctagaactt taaatgcatg ggtaaaagta gtagaagaga aggctttcag cccagaagtg atacccatgt tttcagcatt atcagaagga gccaccccac aagatttaaa caccatgcta aacacagtgg ggggacatca agcagccatg caaatgttaa aagagaccat caatgaggaa gctgcagaat gggatagagt
配列番号2:ncnannncnn tnaatncnnn ggt
配列番号3:cctagaactt taaatgcatg ggt
配列番号4:ccnnanntna tnccnatgtt
配列番号5:ccagaagtga tacccatgtt
配列番号6:ttnannatnn gcanngnngc
配列番号7:tttaacattt gcatggctgc
配列番号8:antnnnnngn ntcntcnntn at
配列番号9:attctgcagc ttcctcattg at
配列番号10:atcnnnnngn nnnnnnccnt nngnnanngc
配列番号11:atcttgtggg gtggctcctt ctgataatgc
(第1の発明)
下記の配列番号1のポリヌクレオチドからなる、人免疫不全ウイルス−1遺伝子の検出又は定量用プライマー及び/又はプローブ配列の選択用塩基配列。
配列番号1
(第2の発明)
下記(ア)又は(イ)から選択されるポリヌクレオチドの一種からなる、人免疫不全ウイルス−1遺伝子検出又は定量用プライマー。
(ア)配列番号2〜9から選択されるポリヌクレオチドの一種
(イ)配列番号3,5,7,9のいずれかのポリヌクレオチドの、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド。
(第3の発明)
下記グループ(I)又は(II)に属するポリヌクレオチドの一種と、下記グループ(III)又は(IV)に属するポリヌクレオチドの一種からなる、人免疫不全ウイルス−1遺伝子検出又は定量用プライマー対。
(第4の発明)
下記(1)又は(2)からなるポリヌクレオチドを構成要素として含む、人免疫不全ウイルス−1遺伝子検出又は定量用プローブ。
(1)下記グループ(V)又は(VI)から選択されるポリヌクレオチドの一種
(2)一端に蛍光物質,他端に消光物質を結合された下記グループ(V)又は(VI)から選択されるポリヌクレオチドの一種
(第5の発明)
下記(A)乃至(C)の少なくともいずれか一つを含むことを特徴とする、人免疫不全ウイルス−1遺伝子検出又は定量用キット。
(A)第2の発明に記載のプライマーの少なくとも一種
(B)第3の発明に記載のプライマー対の少なくとも一種
(C)第4の発明に記載のプローブの少なくとも一種
(第6の発明)
下記(A)乃至(D)の少なくともいずれか一つを用いることを特徴とする、人免疫不全ウイルス−1遺伝子の検出又は定量方法。
(A)第2の発明に記載のプライマーの少なくとも一種
(B)第3の発明に記載のプライマー対の少なくとも一種
(C)第4の発明に記載のプローブの少なくとも一種
(D)第5の発明に記載の検出又は定量用キット
(第7の発明)
下記(A)乃至(D)の少なくともいずれか一つを用い、下記(a)乃至(d)のいずれかの方法を用いることを特徴とする、人免疫不全ウイルス−1遺伝子の検出又は定量方法。
(A)第2の発明に記載のプライマーの少なくとも一種
(B)第3の発明に記載のプライマー対の少なくとも一種
(C)第4の発明に記載のプローブの少なくとも一種
(D)第5の発明に記載の検出又は定量用キット
(a)PCR法
(b)Nested-PCR法
(c)リアルタイムPCR法
(d)nested-リアルタイムPCR法
(第8の発明)
下記グループ(I)乃至(VI)に属するポリヌクレオチドの一種からなる、人免疫不全症候群治療用遺伝子断片。
(第9の発明)
下記グループ(I)乃至(VI)に属するポリヌクレオチドの一種を用いることを特徴とする、人免疫不全症候群の治療方法。
グループ(I):配列番号2,3,又は配列番号3の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(II):配列番号4,5,又は配列番号5の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(III):配列番号6,7,又は配列番号7の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(IV):配列番号8,9,又は配列番号9の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(V):配列番号10,11,又は配列番号11の、5’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(VI):グループ(V)の相補体
配列番号1:cctagaactt taaatgcatg ggtaaaagta gtagaagaga aggctttcag cccagaagtg atacccatgt tttcagcatt atcagaagga gccaccccac aagatttaaa caccatgcta aacacagtgg ggggacatca agcagccatg caaatgttaa aagagaccat caatgaggaa gctgcagaat gggatagagt
配列番号2:ncnannncnn tnaatncnnn ggt
配列番号3:cctagaactt taaatgcatg ggt
配列番号4:ccnnanntna tnccnatgtt
配列番号5:ccagaagtga tacccatgtt
配列番号6:ttnannatnn gcanngnngc
配列番号7:tttaacattt gcatggctgc
配列番号8:antnnnnngn ntcntcnntn at
配列番号9:attctgcagc ttcctcattg at
配列番号10:atcnnnnngn nnnnnnccnt nngnnanngc
配列番号11:atcttgtggg gtggctcctt ctgataatgc
本発明のプライマー,プローブあるいはそれらを含むキットを用いた本発明の検出又は定量方法によって、少なくともHIV-1遺伝子のサブタイプA,B,C,D,サブタイプの組換え流行株CRF01_AEは、確実に増幅,検出又は定量することができ、世界で感染が流行しているかなりの部分が検出又は定量可能となる。特に、本発明のプライマーを2対用いた、nested-PCR法やnested-リアルタイムPCR法によれば、極めて低コピーのHIV-1遺伝子でも、特異的にかつ正確に測定ができる。実に、2コピー/106細胞という驚異的な感度を達成することができる。
本発明において、ポリヌクレオチドとは、アデニン(A),グアニン(G)等のプリン塩基や、チミン(T),ウラシル(U),シトシン(C)等のピリミジン塩基やそれらの修飾塩基を構成要素として含むものであり、一本鎖又は二本鎖のDNA,一本鎖又は二本鎖のRNA,一本鎖DNAと一本鎖RNAからなるハイブリッド体,RNAとDNAが結合して一本鎖となったキメラ体をも含むものである。通常、プライマーやプローブとしては、核酸分子の安定性の点等から、DNAが適しているが、等温遺伝子増幅法(ICAN法)にはキメラプライマー,リアルタイムPCR法のうち一種のサイクリングプローブ法には、キメラプローブが用いられる。また、本発明のAIDS治療用遺伝子断片が、アンチセンス試薬,RNA干渉用試薬として用いる場合には、DNAの他、RNAも好適に使用される。
本発明において、「相補体」とは、あるポリヌクレオチドと同じ塩基数であって、それと完全に相補的なものを意味する。
尚、本件において、塩基配列中にTと記載しているのは、便宜的に示したものであって、ポリヌクレオチドがRNAの場合には、Uを意味する。また、配列表において、Sequence Typeを「DNA or RNA」と記載しているように、本発明のポリヌクレオチドは、DNAの他、RNA,DNAとRNAのキメラの場合も含むものである。同様に、配列表において一本鎖として表示されているものを、相補的な鎖とともに、二本鎖として用いる場合もあり、これにはDNAとRNAのハイブリッドも含まれる。
これらのポリヌクレオチドやその相補体は、常法に従い、DNA合成装置等を用いて人工的に合成する,天然に存在するポリヌクレオチドを抽出する,天然からの抽出ポリヌクレオチドの塩基の一部を欠失,置換,付加する,目的とする配列と相補的な配列を用い、逆転写酵素やDNAポリメラーゼ,RNAポリメラーゼ等によって目的の配列のものを合成させる,これらの方法で得られたポリヌクレオチドの塩基を修飾する等の方法によって製造することができる。
《HIV-1遺伝子検出又は定量用プライマー及び/又はプローブ配列の選択用塩基配列》
本発明の、HIV-1遺伝子検出又は定量用プライマー及び/又はプローブ配列の選択用塩基配列は、配列番号1のポリヌクレオチドからなるものである。この領域は、実験用HIV-1遺伝子(HXB2)のgag領域にある、1234〜1423番目の配列に相当する。gag領域は、HIV-1遺伝子の生存に欠かせない領域であることから、もともと変異が少なく、あらゆるサブタイプのHIV-1遺伝子を検出又は定量するための共通指標として適している。しかしながら、gag領域内にも、変異が無い訳では無い。
本発明の、HIV-1遺伝子検出又は定量用プライマー及び/又はプローブ配列の選択用塩基配列は、配列番号1のポリヌクレオチドからなるものである。この領域は、実験用HIV-1遺伝子(HXB2)のgag領域にある、1234〜1423番目の配列に相当する。gag領域は、HIV-1遺伝子の生存に欠かせない領域であることから、もともと変異が少なく、あらゆるサブタイプのHIV-1遺伝子を検出又は定量するための共通指標として適している。しかしながら、gag領域内にも、変異が無い訳では無い。
一方、HIV-1遺伝子の検出又は定量に用いるプライマーやプローブは、プライマーやプローブとしての本来の目的を達するためには、DNAポリメラーゼによって認識されるように、少なくとも3’末端において、ミスマッチ無く標的HIV-1遺伝子と結合することが必要である。つまり、プライマーやプローブとして選択する領域は、プライマーやプローブとして選択する領域のうち少なくとも3’末端からの数塩基分が、HIV-1遺伝子のあらゆる変異体においても変異の無い領域に設定されることが重要となる。しかも、プライマーだけであればともかく、プライマーを2対選択する場合や、同時にプローブも選択しなければならない場合には、それらのそれぞれについて、変異のない領域に設定しなくてはならない。このため、プライマーやプローブの配列を決定することは、かなり困難な作業を伴うものである。
本発明者等は、このgag領域において、あらゆるサブタイプ間やサブタイプ内で安定して保存されている領域(変異の無い領域)を多く含み、しかも2対のプライマーやプローブも同時に特定できる適度な長さの領域を特定することに成功し、この配列番号1の約200塩基の領域を、複数のプライマーやプローブ等を同時に選定するのに適している選択用塩基配列とした。
《HIV遺伝子》
現在知られているHIVは、HIV-1とHIV-2の二種に大別される。HIV-1ゲノムとは、9719塩基からなる、直鎖状の一本鎖RNAである。HIV-1遺伝子の遺伝情報は、約10kbのRNAに含まれている。この中に、レトロウイルスに共通の構造遺伝子として、gag 、pol 、env の3種類の遺伝子があるが、この他に調節遺伝子も数種類コードされている。これらの調節遺伝子の違いで、HIV-2と区別される。
現在知られているHIVは、HIV-1とHIV-2の二種に大別される。HIV-1ゲノムとは、9719塩基からなる、直鎖状の一本鎖RNAである。HIV-1遺伝子の遺伝情報は、約10kbのRNAに含まれている。この中に、レトロウイルスに共通の構造遺伝子として、gag 、pol 、env の3種類の遺伝子があるが、この他に調節遺伝子も数種類コードされている。これらの調節遺伝子の違いで、HIV-2と区別される。
尚、本発明で言う“HIV-1遺伝子”とは、ウイルス粒子中のHIV-1ゲノムの本体である全長HIV-1メッセンジャーRNA(mRNA)の他、下記の(1)〜(5)をも意味するものである。
(1)逆転写されつつある一本鎖DNA
(2)逆転写が完了した、インサート前の二重鎖DNA
(3)環状二重鎖DNA
(4)ヒトDNA中にインサートされたプロウイルス
(5)プロウイルスから転写された、mRNA(ゲノムに利用される全長mRNAとアクセサリー遺伝子由来のmRNA)
(1)逆転写されつつある一本鎖DNA
(2)逆転写が完了した、インサート前の二重鎖DNA
(3)環状二重鎖DNA
(4)ヒトDNA中にインサートされたプロウイルス
(5)プロウイルスから転写された、mRNA(ゲノムに利用される全長mRNAとアクセサリー遺伝子由来のmRNA)
但し、(1)は、本発明のプライマー,プローブ等に対応する領域の合成が終了している段階にあるもののみが検出又は定量されることとなる。
尚、AIDSの診断としては、このうち、(2)〜(5)が重要であり、特に(4)、(5)の測定が重要である。HIV-1遺伝子が、プロウイルスとして宿主細胞のゲノムに取り込まれない限りは、AIDS発症に至らないと考えられるからである。
《サブタイプ》
HIVには、様々なサブタイプがある。サブタイプとは、塩基配列が、遺伝子系統樹上、独立した一つのクラスターを形成するもので遺伝学的に相互にほぼ等距離(equidistant)にあるものを言う。尚、HIVのサブタイプ間で遺伝子組換えが起こったウイルスが、地域流行株となったものを、CRFs
( circulating recombinant forms;組換え流行株)と言う。
HIV-1としては、A,B,C,D,F,G,H,J,K等の9種類のサブタイプからなるグループM(Main)と、グループO(Outlier),グループN(New),更には、組換え流行株である、CRF01_AE,CRF02_AG,CRF03_AB,CRF04_cpx,CRF05_DF,CRF06_cpx,CRF07_BC,CRF08_BC,CRF09_cpx,CRF10_CD,CRF11_cpx,CRF12_BF,CRF13_cpx,CRF14_BG,CRF15_01B, CRF16_A2D等が知られている。
HIVには、様々なサブタイプがある。サブタイプとは、塩基配列が、遺伝子系統樹上、独立した一つのクラスターを形成するもので遺伝学的に相互にほぼ等距離(equidistant)にあるものを言う。尚、HIVのサブタイプ間で遺伝子組換えが起こったウイルスが、地域流行株となったものを、CRFs
( circulating recombinant forms;組換え流行株)と言う。
HIV-1としては、A,B,C,D,F,G,H,J,K等の9種類のサブタイプからなるグループM(Main)と、グループO(Outlier),グループN(New),更には、組換え流行株である、CRF01_AE,CRF02_AG,CRF03_AB,CRF04_cpx,CRF05_DF,CRF06_cpx,CRF07_BC,CRF08_BC,CRF09_cpx,CRF10_CD,CRF11_cpx,CRF12_BF,CRF13_cpx,CRF14_BG,CRF15_01B, CRF16_A2D等が知られている。
本発明のプライマー,プローブ,キット,又は本発明の検出又は定量方法を使用した場合には、HIV-1のサブタイプBは勿論のこと、従来法では定量PCRができていない(つまりリアルタイムPCRでPCRの立ち上がりサイクル数が極めて遅い事がフルオログラムで示される)他のサブタイプのHIV-1のうち少なくともA,C,D,CRF01_AE等についても、リアルタイムPCRのPCR立ち上がりサイクル数が小さく、かつシグモイド曲線を描くことができることが本発明者等によって今回確認された。
つまり、本発明のプライマー,プローブの基礎となった遺伝子領域は、サブタイプの違いを超えて、しかもサブタイプ内の変異等の影響も受けずに保存されており、HIV-1ウイルスの生存にとって重要な役割を担っていることが予想される。従って、本発明のプライマー,プローブは、HIV-1のあらゆるサブタイプの検出又は定量にも有用であると考えられる。
《プライマー》
プライマーとは、ポリヌクレオチドを酵素的に複製(又は増幅)する際に使われる20〜30塩基の短いポリヌクレオチド断片を言う。主にPCR法やICAN法等の核酸増幅方法において、DNAやRNA等のポリヌクレオチドを増やすときに使われ、増やしたい部分の両端に相補的に結合する塩基配列を持つものである。PCR法において用いられるプライマーには、PCR増幅反応時、一方のポリヌクレオチド鎖の3'側に結合するプライマーと、他方の鎖の3'側に結合するプライマーがあり、各々をフォワード側プライマー(センスプライマーとも言う。),リバース側プライマー(アンチセンスプライマーとも言う。)等と言うことがある。
プライマーとは、ポリヌクレオチドを酵素的に複製(又は増幅)する際に使われる20〜30塩基の短いポリヌクレオチド断片を言う。主にPCR法やICAN法等の核酸増幅方法において、DNAやRNA等のポリヌクレオチドを増やすときに使われ、増やしたい部分の両端に相補的に結合する塩基配列を持つものである。PCR法において用いられるプライマーには、PCR増幅反応時、一方のポリヌクレオチド鎖の3'側に結合するプライマーと、他方の鎖の3'側に結合するプライマーがあり、各々をフォワード側プライマー(センスプライマーとも言う。),リバース側プライマー(アンチセンスプライマーとも言う。)等と言うことがある。
《本発明のプライマーグループ》
本発明のプライマーは、下記より選択されるポリヌクレオチドの一種からなるものである。
グループ(I):配列番号2,3,又は配列番号3の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(II):配列番号4,5,又は配列番号5の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(III):配列番号6,7,又は配列番号7の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(IV):配列番号8,9,又は配列番号9の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
本発明のプライマーは、下記より選択されるポリヌクレオチドの一種からなるものである。
グループ(I):配列番号2,3,又は配列番号3の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(II):配列番号4,5,又は配列番号5の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(III):配列番号6,7,又は配列番号7の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(IV):配列番号8,9,又は配列番号9の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
尚、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドの中でも、プライマーとしての一般的な設計条件である、下記の条件の少なくともいずれか一つを満たすものが好ましい。
(1)3’末端の5塩基にはGまたはCが2塩基以下である
(2)GC%を40〜50%にする
(3)配列中にGの4連鎖を含まない
(4)プライマー内部に相補的な配列が少なく、ヘアピン構造を作りにくい
(5)プライマー間に相補的な配列が少なく、PCRの反応効率が良い
(6)Tmが50〜60℃である
(1)3’末端の5塩基にはGまたはCが2塩基以下である
(2)GC%を40〜50%にする
(3)配列中にGの4連鎖を含まない
(4)プライマー内部に相補的な配列が少なく、ヘアピン構造を作りにくい
(5)プライマー間に相補的な配列が少なく、PCRの反応効率が良い
(6)Tmが50〜60℃である
尚、配列番号2,4,6,8のポリヌクレオチドは、実際の患者のHIV-1遺伝子において、変異の実例があった箇所をn(nとは、a,t(u),g,cのいずれの塩基であっても良いことを示す。)としたものである。つまりn以外の固定した箇所は、本発明者等が調査したあらゆる患者のHIV-1遺伝子に変異が無かった箇所である。従って、これらを固定した配列番号2,4,6,8のポリヌクレオチドは、あらゆるサブタイプの患者のHIV-1遺伝子を検出又は定量できる可能性が高い。尚、これらのポリヌクレオチドの中でも、上記(1)〜(6)の条件の少なくともいずれか一つを満たすものが好ましい。
《グループ(I)プライマー》
グループ(I)は、通常のPCR法においてプライマーとして用いることができる他、nested-リアルタイムPCR法においては、pre-quantification用のプライマーとして好適に用いられる。
グループ(I)の配列は、HIV-1実験室株であるHXB2の1234〜1256番目の塩基配列と、ほぼ同一の配列となるように設計された配列,およびその、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであり、様々なサブタイプのHIV-1感染患者の血漿中RNAにおいて見られるポリヌクレオチドをもとに設計されたものである。
このグループ(I)は全て、3’側から3塩基が鋳型となるHXB2遺伝子と同じ配列であり、複数のサブタイプにおいても、良く保存されている。この特徴により、PCR法のスタート試料となる二本鎖DNAのうち、鋳型となるHXB2遺伝子配列と相補的な配列を有する遺伝子鎖に確実にハイブリダイズし、耐熱性DNAポリメラーゼによって、このプライマーが確実に認識され、DNAの増幅反応が進行する。
好ましいプライマーは配列番号3,又はその3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであって上記(1)〜(6)の少なくともいずれか一つの条件を満たすものであり、特に好ましいプライマーは配列番号3の配列を有するポリヌクレオチドからなるプライマーである。
《グループ(II)プライマー》
グループ(II)は、通常のPCR法において、プライマーとして用いることができる他、nested-リアルタイムPCR法において、pre-quantification後の、リアルタイムPCRにおけるプライマーとして好適に用いられる。
グループ(II)の配列は、HIV-1実験室株であるHXB2の1285〜1304番目の塩基配列と、ほぼ同一の配列となるように設計された配列,およびその、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであり、様々なサブタイプのHIV-1感染患者の血漿中RNAにおいて見られるポリヌクレオチドをもとに設計されたものである。このグループ(II)は全て、3’側から3塩基が鋳型となるHXB2遺伝子と同じ配列であり、複数のサブタイプにおいても、良く保存されている。この特徴により、PCR法のスタート試料となる二本鎖DNAのうち、鋳型となるHXB2遺伝子配列と相補的な配列を有する遺伝子鎖に確実にハイブリダイズし、耐熱性DNAポリメラーゼによって、このプライマーが確実に認識され、DNAの増幅反応が進行する。
好ましいプライマーは配列番号5,又はその3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであって上記(1)〜(6)の少なくともいずれか一つの条件を満たすものであり、特に好ましいプライマーは配列番号5の配列を有するポリヌクレオチドからなるプライマーである。
《グループ(III)プライマー》
グループ(III)は、通常のPCR法において、プライマーとして用いることができる他、nested-リアルタイムPCR法において、pre-quantification後のリアルタイムPCRにおける、プライマーとして好適に用いられる。
グループ(III)は、通常のPCR法において、プライマーとして用いることができる他、nested-リアルタイムPCR法において、pre-quantification後のリアルタイムPCRにおける、プライマーとして好適に用いられる。
グループ(III)の配列は、HIV-1実験室株であるHXB2の1375〜1394番目の塩基配列に、ほぼ相補的となるように設計された配列,およびその、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであり、様々なサブタイプのHIV-1感染患者の血漿中RNAにおいて見られるポリヌクレオチドをもとに設計されたものである。3’側から3塩基は鋳型となるHXB2遺伝子と同じ配列であり、複数のサブタイプにおいても、良く保存されている。この特徴により、PCR法のスタート試料となる二本鎖DNAのうち、HIV-1遺伝子と同じ配列を有する遺伝子鎖に確実にハイブリダイズし、耐熱性DNAポリメラーゼによって、このプライマーが確実に認識さDNAの増幅反応が進行する。
好ましいプライマーは配列番号7,又はその3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであって上記(1)〜(6)の少なくともいずれか一つの条件を満たすものであり、特に好ましいプライマーは配列番号7の配列を有するポリヌクレオチドからなるプライマーである。
《グループ(IV)プライマー》
グループ(IV)は、通常のPCR法においてプライマーとして用いることができる他、nested-リアルタイムPCR法においては、pre-quantification用のプライマーとして好適に用いられる。
グループ(IV)の配列は、HIV-1実験室株であるHXB2の1402〜1423番目の塩基配列に、ほぼ相補的となるように設計された配列,およびその、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであり、様々なサブタイプのHIV-1感染患者の血漿中RNAにおいて見られるポリヌクレオチドをもとに設計されたものである。3’側から3塩基は鋳型となるHXB2遺伝子と同じ配列であり、複数のサブタイプにおいても、良く保存されている。この特徴により、PCR法のスタート試料となる二本鎖DNAのうち、HIV-1遺伝子と同じ配列を有する遺伝子鎖に確実にハイブリダイズし、耐熱性DNAポリメラーゼによって、このプライマーが確実に認識され、DNAの増幅反応が進行する。
好ましいプライマーは配列番号9,又はその3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであって上記(1)〜(6)の少なくともいずれか一つの条件を満たすものであり、特に好ましいプライマーは配列番号9の配列を有するポリヌクレオチドからなるプライマーである。
《プローブ》
プローブとは、日本語で検索子とも言い、相補的な塩基同士の結合により目的遺伝子と共に二本鎖構造を形成するポリヌクレオチドであって、目的遺伝子を探り出す為に用いる核酸断片に、必要に応じて蛍光物質等の標識を結合させたものである。
プローブとは、日本語で検索子とも言い、相補的な塩基同士の結合により目的遺伝子と共に二本鎖構造を形成するポリヌクレオチドであって、目的遺伝子を探り出す為に用いる核酸断片に、必要に応じて蛍光物質等の標識を結合させたものである。
《TaqManタイププローブ》
本発明のHIV-1遺伝子検出又は定量用プローブのうち、一端に蛍光物質,他端に消光物質を結合されたポリヌクレオチドの一種からなるプローブは、一般に「TaqManタイププローブ」と呼ばれるタイプに属するものである。TaqManタイププローブとは、「TaqManプローブTM」に代表される構造をとるプローブとして広く用いられている用語で、主にリアルタイムPCR法に適したプローブである。
本発明のHIV-1遺伝子検出又は定量用プローブのうち、一端に蛍光物質,他端に消光物質を結合されたポリヌクレオチドの一種からなるプローブは、一般に「TaqManタイププローブ」と呼ばれるタイプに属するものである。TaqManタイププローブとは、「TaqManプローブTM」に代表される構造をとるプローブとして広く用いられている用語で、主にリアルタイムPCR法に適したプローブである。
《本発明のプローブグループ》
本発明のTaqManタイププローブに用いられるポリヌクレオチドの塩基配列の長さは、通常20〜40、好ましくは22〜40である。具体的な配列としては下記のグループ(V)又は(VI)のものが挙げられる。
本発明のTaqManタイププローブに用いられるポリヌクレオチドの塩基配列の長さは、通常20〜40、好ましくは22〜40である。具体的な配列としては下記のグループ(V)又は(VI)のものが挙げられる。
グループ(V):配列番号10,11,又は配列番号11の、5’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(VI):グループ(V)の相補体
グループ(VI):グループ(V)の相補体
尚、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドの中でも、プローブとしての一般的な設計条件である、下記の条件の少なくともいずれか一つを満たすものが好ましい。
(1)3’末端の5塩基にはGまたはCが2塩基以下である
(2)GC%が40〜50%である
(3)プローブ内部に相補的な配列が少なく、ヘアピン構造を作りにくい
(4)プライマーとの間に相補的な配列が少なく、PCRの反応効率が良い
(5)Tmが68〜70℃である
(6)全長は40塩基よりも短い。
(1)3’末端の5塩基にはGまたはCが2塩基以下である
(2)GC%が40〜50%である
(3)プローブ内部に相補的な配列が少なく、ヘアピン構造を作りにくい
(4)プライマーとの間に相補的な配列が少なく、PCRの反応効率が良い
(5)Tmが68〜70℃である
(6)全長は40塩基よりも短い。
尚、配列番号10のポリヌクレオチドは、実際の患者のHIV-1遺伝子において、変異の実例があった箇所をn(nとは、a,t(u),g,cのいずれの塩基であっても良いことを示す。)としたものである。つまりn以外の固定した箇所は、本発明者等が調査したあらゆる患者のHIV-1遺伝子に変異が無かった箇所である。従って、これらを固定した配列番号10のポリヌクレオチドは、あらゆるサブタイプの患者のHIV-1遺伝子を検出できる可能性が高い。尚、これらのポリヌクレオチドの中でも、上記(1)〜(6)の条件の少なくともいずれか一つを満たすものが好ましい。
このグループ(V)の配列は、HIV-1実験室株であるHXB2遺伝子の1309〜1338番目の塩基配列に、ほぼ相補的となるように設計された配列,およびその、5’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであり、様々なサブタイプのHIV-1感染患者の血漿中RNAにおいて見られるポリヌクレオチドをもとに設計されたものである。このグループ(V)は、全て、少なくとも5’側(対応するHXB2遺伝子上では3’側)からの3塩基は、鋳型となるHIV-1のあらゆるサブタイプで保存されている配列と相補的であるという特徴を有している。この特徴により、グループ(V)又は(VI)から選択されるポリヌクレオチドの一種を用いたプローブは、例えばTaqDNAポリメラーゼ等の耐熱性ポリメラーゼ活性を有する酵素が、確実にTaqManプローブを認識し、エキソヌクレアーゼ活性によって、プローブの5’側(対応するHXB2遺伝子上では3’側)から1塩基ずつ分解し、蛍光物質と消光物質を分離させることができる。
好ましいプローブは配列番号11,又はその5’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであって上記(1)〜(6)の少なくともいずれか一つの条件を満たすもの,又はそれらの相補体であり、特に好ましいプローブは配列番号11の配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ又はその相補体である。
《蛍光物質,消光物質》
蛍光物質は、レポーター蛍光物質と呼ばれることがある。また、消光物質は、クエンチャー物質等と呼ばれることがある。これらの物質の、プローブへの結合位置は特に限定されないが、通常、プローブのオリゴヌクレオチド部の一端(好ましくは5’末端)にレポーター蛍光物質が、他端にクエンチャー蛍光物質が結合される。
蛍光物質は、レポーター蛍光物質と呼ばれることがある。また、消光物質は、クエンチャー物質等と呼ばれることがある。これらの物質の、プローブへの結合位置は特に限定されないが、通常、プローブのオリゴヌクレオチド部の一端(好ましくは5’末端)にレポーター蛍光物質が、他端にクエンチャー蛍光物質が結合される。
プローブに蛍光物質を結合させる方法としては、公知の方法を採用することができ、例えば、Noble et al., (1984) .Nucleic Acids Res. 12:3387-3403及びIyer et al., (1990) J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254 に記載されている方法等を用いることができる。
TaqManタイプのプローブは、一端に結合した蛍光物質が、他端に結合している消光物質の近傍に存在する際には、励起光を照射しても蛍光共鳴エネルギー転移により、発光が抑制されている。
しかし、アニーリングのステップにおいて、標的遺伝子に特異的にハイブリダイズした後、プライマー側から、DNA鎖の伸長反応が開始されると、TaqDNAポリメラーゼのもつ5’→3’方向のエキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたTaqManタイププローブは、5’側から順に分解される。つまり、蛍光物質と消光物質が遊離し、消光物質による抑制が解除されて蛍光が発せられるのである。
一方、標的配列とプローブの間の相補性が不完全である場合,例えばプローブの5’側からの3塩基にミスプライミングがある場合等には、後述するTaqDNAポリメラーゼがTaqManタイププローブを認識できない恐れがあるため、プローブの分解も起こらず、レポーター物質の発光は抑制されたままとなり、増幅された目的遺伝子の検出又は定量の量に誤りが生じる可能性がある。
つまり、少なくともTaqDNAポリメラーゼに認識される程度に、鋳型にハイブリダイズし得るプローブを用いた場合にのみ、発光量が遺伝子増幅量を正確に反映していることになる。別の見方をすれば、正しく増幅された標的遺伝子にハイブリダイズした場合にのみ、発光が起こる。そして、この発光量の経時的な変化を観察することによって、リアルタイムに、標的配列の増幅の様子を検査することができるのである。
これらの蛍光物質や消光物質としては、市販のリアルタイムPCR用キットに含まれているものを用いることができるが、具体的には、下記のようなものが挙げられる。
蛍光物質(レポーター蛍光物質)としては、FAM(6−カルボキシフルオレセイン)のようなフルオレセイン系蛍光色素等の、蛍光色素等が挙げられる。
消光物質(クエンチャー物質)としては、TAMRA(6−カルボキシテトラメチルローダミン)のようなローダミン系蛍光色素等の、蛍光色素等が挙げられる。
《HIV-1遺伝子の検出又は定量方法》
本発明のHIV-1遺伝子の検出又は定量方法としては、公知の遺伝子検出又は定量方法において、プライマー,プローブ,それらを使用したキット等として、上記の本発明のプライマー,プローブ,キット等を用いる方法が挙げられる。
使用可能な公知の遺伝子検出又は定量方法としては、具体的には、PCR法(EP200362等参照)やNASBA法(EP329822等参照),TAS法(WO88/10315等参照)、LAMP法(Nucleic Acids Research, 2000, Vol.28, NO.12,栄研化学株式会社),TRC法(Analytical Biochemistry 314 (2003) 77−86,東ソー株式会社)等のほか、DNA鎖の置換活性と鋳型交換活性を有するDNAポリメラーゼ(BcaBESTTM DNAポリメラーゼ)、RNAとDNAの混成二本鎖のRNA鎖のみを特異的に切断するリボヌクレアーゼH(RNase H)の2種類の酵素と、RNA部分とDNA部分からなるキメラプライマーを用いて行う等温遺伝子増幅法(ICAN法:Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids,タカラバイオ社)等の、核酸増幅法が挙げられる。
更に、改良型のPCR法として、リアルタイム−PCR法,nested-PCR法,nested-リアルタイムPCR法(高感度リアルタイムPCR),及びこれらに、PCR法の実施前に、ウイルスRNAをcDNAに逆転写する工程を組合せた方法等が挙げられる。
また、リアルタイムPCR法としては、二本鎖DNAに結合することで蛍光を発する試薬(インターカレーター)を用いるインターカレーター法や、プローブの一端に蛍光物質,他端に消光物質(クエンチャー)が結合したTaqManタイプのプローブを用いるTaqManプローブ法,DNAとRNAのキメラプローブを用いる、サイクリングプローブ法等がある。
本発明のHIV-1遺伝子の検出又は定量方法においては、リアルタイムPCR法としてTaqManプローブ法を用いたnested−リアルタイムPCR法が、検出・定量感度等の点で最適である。
本発明のHIV-1遺伝子の検出又は定量方法としては、公知の遺伝子検出又は定量方法において、プライマー,プローブ,それらを使用したキット等として、上記の本発明のプライマー,プローブ,キット等を用いる方法が挙げられる。
使用可能な公知の遺伝子検出又は定量方法としては、具体的には、PCR法(EP200362等参照)やNASBA法(EP329822等参照),TAS法(WO88/10315等参照)、LAMP法(Nucleic Acids Research, 2000, Vol.28, NO.12,栄研化学株式会社),TRC法(Analytical Biochemistry 314 (2003) 77−86,東ソー株式会社)等のほか、DNA鎖の置換活性と鋳型交換活性を有するDNAポリメラーゼ(BcaBESTTM DNAポリメラーゼ)、RNAとDNAの混成二本鎖のRNA鎖のみを特異的に切断するリボヌクレアーゼH(RNase H)の2種類の酵素と、RNA部分とDNA部分からなるキメラプライマーを用いて行う等温遺伝子増幅法(ICAN法:Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids,タカラバイオ社)等の、核酸増幅法が挙げられる。
更に、改良型のPCR法として、リアルタイム−PCR法,nested-PCR法,nested-リアルタイムPCR法(高感度リアルタイムPCR),及びこれらに、PCR法の実施前に、ウイルスRNAをcDNAに逆転写する工程を組合せた方法等が挙げられる。
また、リアルタイムPCR法としては、二本鎖DNAに結合することで蛍光を発する試薬(インターカレーター)を用いるインターカレーター法や、プローブの一端に蛍光物質,他端に消光物質(クエンチャー)が結合したTaqManタイプのプローブを用いるTaqManプローブ法,DNAとRNAのキメラプローブを用いる、サイクリングプローブ法等がある。
本発明のHIV-1遺伝子の検出又は定量方法においては、リアルタイムPCR法としてTaqManプローブ法を用いたnested−リアルタイムPCR法が、検出・定量感度等の点で最適である。
《PCR法》
PCR法とは、公知の方法であって、特定のDNA領域をはさんだ2種類のプライマーと、DNAポリメラーゼによるDNA増幅反応の試験管内による繰り返しで、その特定DNA領域を短時間に簡便に数千万〜億倍に増幅する方法である。
PCR法とは、公知の方法であって、特定のDNA領域をはさんだ2種類のプライマーと、DNAポリメラーゼによるDNA増幅反応の試験管内による繰り返しで、その特定DNA領域を短時間に簡便に数千万〜億倍に増幅する方法である。
《nested-PCR法》
nested-PCR法とは、公知の方法である。
nested-PCR法とは、2対のプライマー対を使って、2段階のPCRを行う方法である。
2対とは、
(1)標的遺伝子領域を増幅するためのPCRに用いるプライマー対(フォワード側プライマー及びリバース側プライマーのセットで1対)と、
(2)最初の標的遺伝子領域の増幅に使用したプライマー位置より、更に内側にフォワード側プライマー及びリバース側プライマーを設定し、一段階目で増幅されたDNAを更に特異的に増幅するプライマー対
である。
この2段階のPCRに基づく増幅により、最初のPCR反応で増幅されたPCR産物(標的遺伝子+非特異的産物)から、より特異的に標的遺伝子内の特異配列DNAのみを増幅する事が可能である。
nested-PCR法とは、公知の方法である。
nested-PCR法とは、2対のプライマー対を使って、2段階のPCRを行う方法である。
2対とは、
(1)標的遺伝子領域を増幅するためのPCRに用いるプライマー対(フォワード側プライマー及びリバース側プライマーのセットで1対)と、
(2)最初の標的遺伝子領域の増幅に使用したプライマー位置より、更に内側にフォワード側プライマー及びリバース側プライマーを設定し、一段階目で増幅されたDNAを更に特異的に増幅するプライマー対
である。
この2段階のPCRに基づく増幅により、最初のPCR反応で増幅されたPCR産物(標的遺伝子+非特異的産物)から、より特異的に標的遺伝子内の特異配列DNAのみを増幅する事が可能である。
《リアルタイムPCR法》
リアルタイムPCR法とは、PCR増幅産物の増加をリアルタイムでモニタリングし指数関数的増幅領域で定量を行う、公知の遺伝子増幅方法であり、具体的には上述の「非特許文献2」Microbiol Immunol 48(10), 767-772, 2004(Kaoru Wada, Hiromi Nagai, Tsuguhio Kaneda, et al.)や、「タカラバイオ リアルタイムPCR実践ガイド はじめてのリアルタイムPCR 0412V20」等に記載されている。
リアルタイムPCR法とは、PCR増幅産物の増加をリアルタイムでモニタリングし指数関数的増幅領域で定量を行う、公知の遺伝子増幅方法であり、具体的には上述の「非特許文献2」Microbiol Immunol 48(10), 767-772, 2004(Kaoru Wada, Hiromi Nagai, Tsuguhio Kaneda, et al.)や、「タカラバイオ リアルタイムPCR実践ガイド はじめてのリアルタイムPCR 0412V20」等に記載されている。
TaqManタイププライマーを用いたリアルタイムPCR法の反応は、次のようにして行う。
(1)DNA増幅を行うサーマルサイクラーと、増幅DNAをモニタリングする分光蛍光光度計を一体化した、リアルタイムPCR専用装置を用いる。
(2)PCRのプローブとして、上述のTaqManタイプのプローブを予め添加しておく。
(3)Taq DNAポリメラーゼ等の耐熱性DNAポリメラーゼを反応させ、5’→3’方向のエキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたTaqManタイププローブを分解することで、蛍光を発生させる。この時、プローブのハイブリダイズが不完全である遺伝子増幅物(つまり、標的遺伝子以外のもの)の場合には、DNAポリメラーゼがTaqManタイププローブを認識できず、プローブの分解も起こらないために、レポーター物質の発光は抑制されたままとなる。
(4)増幅産物をリアルタイムでモニタリングし、増幅曲線を表示する。増幅曲線とは、PCRでは、1サイクルの反応により、DNA量は、指数関数的に増幅(2n乗)し、やがてプラトーに達する様子を、サイクル数を横軸に、蛍光強度を縦軸に表したものである(図3等参照)。
(5)この際、DNA濃度が予め分かっているβ2ミクログロブリン(β2M)等のコントロール溶液,及び、DNA濃度が予め分かっているHIV-1遺伝子溶液を、各々段階希釈し、それぞれ増幅曲線を描いておく。尚、初期のDNA量が多いと、少ないサイクル数で蛍光強度が検出可能な量となるため、増幅曲線は、早く立ち上がる。
(6)適当な閾値(蛍光強度)における、各コントロール濃度とPCRサイクル数の間の直線関係から、コントロール及びHIV-1遺伝子の各々の検量線(図2参照)を作製する。閾値と増幅曲線が交わる点をCt値(Threshold Cycle)(LightCycler LC Fast-start kit (Roche)においては、この値(Ct値)は、Cp値(Crossing point)として表示されている。)と言う。
(7)この検量線から、標的遺伝子のCt値をもとに、標的遺伝子の初期の量が算出できる。
(1)DNA増幅を行うサーマルサイクラーと、増幅DNAをモニタリングする分光蛍光光度計を一体化した、リアルタイムPCR専用装置を用いる。
(2)PCRのプローブとして、上述のTaqManタイプのプローブを予め添加しておく。
(3)Taq DNAポリメラーゼ等の耐熱性DNAポリメラーゼを反応させ、5’→3’方向のエキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたTaqManタイププローブを分解することで、蛍光を発生させる。この時、プローブのハイブリダイズが不完全である遺伝子増幅物(つまり、標的遺伝子以外のもの)の場合には、DNAポリメラーゼがTaqManタイププローブを認識できず、プローブの分解も起こらないために、レポーター物質の発光は抑制されたままとなる。
(4)増幅産物をリアルタイムでモニタリングし、増幅曲線を表示する。増幅曲線とは、PCRでは、1サイクルの反応により、DNA量は、指数関数的に増幅(2n乗)し、やがてプラトーに達する様子を、サイクル数を横軸に、蛍光強度を縦軸に表したものである(図3等参照)。
(5)この際、DNA濃度が予め分かっているβ2ミクログロブリン(β2M)等のコントロール溶液,及び、DNA濃度が予め分かっているHIV-1遺伝子溶液を、各々段階希釈し、それぞれ増幅曲線を描いておく。尚、初期のDNA量が多いと、少ないサイクル数で蛍光強度が検出可能な量となるため、増幅曲線は、早く立ち上がる。
(6)適当な閾値(蛍光強度)における、各コントロール濃度とPCRサイクル数の間の直線関係から、コントロール及びHIV-1遺伝子の各々の検量線(図2参照)を作製する。閾値と増幅曲線が交わる点をCt値(Threshold Cycle)(LightCycler LC Fast-start kit (Roche)においては、この値(Ct値)は、Cp値(Crossing point)として表示されている。)と言う。
(7)この検量線から、標的遺伝子のCt値をもとに、標的遺伝子の初期の量が算出できる。
このリアルタイムPCR法は、従来の、反応終了後にPCR増幅産物を確認する方法に比べて、
(i)DNAやRNAの正確な定量ができること、
(ii)電気泳動が不要であるため、迅速かつ簡便に解析でき、コンタミネーションの危険性も小さいこと(タカラバイオ リアルタイムPCR実践ガイド はじめてのリアルタイムPCR 0412V20より引用)
など多くの利点がある。
(i)DNAやRNAの正確な定量ができること、
(ii)電気泳動が不要であるため、迅速かつ簡便に解析でき、コンタミネーションの危険性も小さいこと(タカラバイオ リアルタイムPCR実践ガイド はじめてのリアルタイムPCR 0412V20より引用)
など多くの利点がある。
《nestedリアルタイム-PCR法》
nestedリアルタイム-PCR法とは、公知の方法であり、最初のPCRによって増幅された遺伝子を、リアルタイムPCR法により定量する方法である。詳細は、例えば上述の「非特許文献1」Journal of Virological Methods 124(2005) 157-165(Hiromi Nagai , Tsuguhio Kaneda, et al.)等に記載されている。この方法も、nested-PCR法の一種であるため、(1)定量前の遺伝子増幅(pre-quantification)のためのPCRに用いるプライマー対と、(2) 定量前の遺伝子増幅に使用したプライマー位置より、更に内側に設定した、定量前増幅後の遺伝子量を決定するためのPCR(リアルタイムPCR法)用のプライマー対が必要である。また、検出又は定量用プローブとしては、上述のTaqManタイププローブを用いる。
nestedリアルタイム-PCR法とは、公知の方法であり、最初のPCRによって増幅された遺伝子を、リアルタイムPCR法により定量する方法である。詳細は、例えば上述の「非特許文献1」Journal of Virological Methods 124(2005) 157-165(Hiromi Nagai , Tsuguhio Kaneda, et al.)等に記載されている。この方法も、nested-PCR法の一種であるため、(1)定量前の遺伝子増幅(pre-quantification)のためのPCRに用いるプライマー対と、(2) 定量前の遺伝子増幅に使用したプライマー位置より、更に内側に設定した、定量前増幅後の遺伝子量を決定するためのPCR(リアルタイムPCR法)用のプライマー対が必要である。また、検出又は定量用プローブとしては、上述のTaqManタイププローブを用いる。
nedted-リアルタイムPCR法を用いたHIV-1遺伝子の定量は、具体的には、例えば下記の手順に従って行うことができる(図2参照)。
(1)検体から細胞を分離する。
(2)分離細胞からDNAを抽出する。
(3)定量前遺伝子増幅(pre-quantification)を行う前に、コントロールであるβ2M量を、リアルタイムPCR法により定量する。
(4)定量前遺伝子増幅(pre-quantification)反応により、HIV-1遺伝子とβ2M遺伝子を同時に増幅する。
(5)定量前遺伝子増幅(pre-quantification)反応後の、HIV-1遺伝子とβ2M遺伝子の遺伝子量を、それぞれ、リアルタイムPCR法により定量する。
(6)β2Mについて、(5)の量を(3)の量でわり算することにより、遺伝子増幅率を算出する。尚、HIV-1遺伝子単独の場合と、HIV-1遺伝子をβ2M遺伝子と同時にPCR法にかけた場合とでは、HIV-1遺伝子の増幅量に変化が無く、β2MのPCRによる、HIV-1遺伝子のPCRに対する干渉作用が認められないことは、本発明者によって、既に確認済である(平成12〜14年度 厚生労働科学研究費補助金 エイズ対策研究事業,HIVの検査法と検査体制を確立するための研究,12.HIV-1DNAの検出と定量に関する研究,12−(2).高感度リアルタイムPCRによるHIV-1 DNA定量法の確立(金田次弘)に掲載の図4参照)。
(7)(6)の遺伝子増幅率は、HIV-1遺伝子にも共通する値であることから、HIV-1遺伝子の(5)の量を、この増幅率でわり算することによって、もとのHIV-1遺伝子量を算出できる。
(2)分離細胞からDNAを抽出する。
(3)定量前遺伝子増幅(pre-quantification)を行う前に、コントロールであるβ2M量を、リアルタイムPCR法により定量する。
(4)定量前遺伝子増幅(pre-quantification)反応により、HIV-1遺伝子とβ2M遺伝子を同時に増幅する。
(5)定量前遺伝子増幅(pre-quantification)反応後の、HIV-1遺伝子とβ2M遺伝子の遺伝子量を、それぞれ、リアルタイムPCR法により定量する。
(6)β2Mについて、(5)の量を(3)の量でわり算することにより、遺伝子増幅率を算出する。尚、HIV-1遺伝子単独の場合と、HIV-1遺伝子をβ2M遺伝子と同時にPCR法にかけた場合とでは、HIV-1遺伝子の増幅量に変化が無く、β2MのPCRによる、HIV-1遺伝子のPCRに対する干渉作用が認められないことは、本発明者によって、既に確認済である(平成12〜14年度 厚生労働科学研究費補助金 エイズ対策研究事業,HIVの検査法と検査体制を確立するための研究,12.HIV-1DNAの検出と定量に関する研究,12−(2).高感度リアルタイムPCRによるHIV-1 DNA定量法の確立(金田次弘)に掲載の図4参照)。
(7)(6)の遺伝子増幅率は、HIV-1遺伝子にも共通する値であることから、HIV-1遺伝子の(5)の量を、この増幅率でわり算することによって、もとのHIV-1遺伝子量を算出できる。
このnestedリアルタイム-PCR法は、上述の、nested-PCR法と、リアルタイム-PCR法の利点を併せ持っている。
従って、本発明のHIV-1遺伝子検出又は定量方法に使用可能な公知の遺伝子検出又は定量方法としては、上述の検出又は定量方法の中でも、PCR法が好ましく、中でも、nested-PCR法,nested-リアルタイムPCR法が好ましく、特にnested-リアルタイムPCR法が好ましい。
《HIV-1遺伝子検出又は定量用キット》
本発明のキットには、本発明のプライマー,プライマー対,又はプローブが少なくとも一種類含まれる。PCR法の場合には、少なくとも1対のプライマーが必要である。特に、nested-リアルタイムPCR法等のnested-PCR法の場合には、2対のプライマーを用いることが必要である。しかし、このプライマー対は、必ずしも本発明のプライマー対である必要は無く、プライマー対のうちの一つが、本発明のプライマーである場合も含まれる。また、本発明のプローブを用いる場合には、プライマーが本発明のプライマーで無くとも良い。
本発明のキットには、本発明のプライマー,プライマー対,又はプローブが少なくとも一種類含まれる。PCR法の場合には、少なくとも1対のプライマーが必要である。特に、nested-リアルタイムPCR法等のnested-PCR法の場合には、2対のプライマーを用いることが必要である。しかし、このプライマー対は、必ずしも本発明のプライマー対である必要は無く、プライマー対のうちの一つが、本発明のプライマーである場合も含まれる。また、本発明のプローブを用いる場合には、プライマーが本発明のプライマーで無くとも良い。
《プライマー対の組合せ》
本発明のプライマーを、一対のみ用いる際には、上記グループ(I)又は(II)に属するポリヌクレオチドの一種と、上記グループ(III)又は(IV)に属するポリヌクレオチドの一種を用いることが出来、いずれの組合せでも良い。
本発明のプライマーを、一対のみ用いる際には、上記グループ(I)又は(II)に属するポリヌクレオチドの一種と、上記グループ(III)又は(IV)に属するポリヌクレオチドの一種を用いることが出来、いずれの組合せでも良い。
但し、nested-リアルタイムPCR法等のnested-PCR法の場合には、二対のプライマー対が必要である。即ち、第一段階として、標的となる遺伝子配列を予めPCRで増幅する際に用いるプライマー対と、第二段階であるリアルタイムPCRに用いるプライマー対である。第一段階のPCRでは、第二段階で増幅したい標的遺伝子配列よりも、広い領域で増幅しておくことが必要である。従って、第一段階用の一対は、グループ(I)の一種とグループ(IV)の一種からなるプライマー対とし,第二段階用のもう一対は、グループ(II)の一種とグループ(III)の一種からなるプライマー対であることが好ましい。本発明におけるグループ(I)〜(IV)は、HIV-1遺伝子の領域の5‘→3’の順に順次対応させた遺伝子領域をモデルとして設計されたものである(図1参照)。よって、グループ(I),(IV)は、HIV-1遺伝子上、グループ(II),(III)よりも外側の領域をもとに設計されている。
本発明のキットには、上記プライマーやプローブの他、耐熱性ポリメラーゼ活性を有する酵素や、緩衝液を含ませることもできる。
《耐熱性ポリメラーゼ活性を有する酵素》
耐熱性ポリメラーゼ活性を有する酵素としては、例えばTaqDNAポリメラーゼ等が好適なものとして挙げられる。TaqDNAポリメラーゼとは、1976年に米国イエローストーン国立公園の温泉から採取されたThermus aquaticus TY1株から精製された酵素である。この酵素の最大の特徴は反応指摘温度が70〜80度である。そのためPCR法に適した酵素として広く用いられている。このTaqDNAポリメラーゼは、一本鎖DNAを鋳型にして、逆向きの鎖を5’から3’に向かって合成する作用を有している。また、TaqDNAポリメラーゼの特徴として、ポリメラーゼ活性と同時に、エキソヌクレアーゼ活性を有することが挙げられる。このため、TaqDNAポリメラーゼは、単なるPCR法による増幅反応の他、TaqManタイプのプローブを用いるリアルタイムPCR法,nested-リアルタイムPCR法等においても、重要な役割を果たすことができる。但し、耐熱性ポリメラーゼ活性を有する酵素は、これに限られるものでは無く、他のテルムス菌種、例えば,テルムス・テルモフィラス(Thermus thermophilus),テルムス・フィリフォルミス(Thermus filiformis)およびテルムス・フラブス(Thermus flavus)等から得られるものも使用可能である。また、この他、テルモコッカス・リテラリス(Thermococcus literalis),ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus),テルモトガ種(Thermotoga sp.)等から得られるものであっても良い。
耐熱性ポリメラーゼ活性を有する酵素としては、例えばTaqDNAポリメラーゼ等が好適なものとして挙げられる。TaqDNAポリメラーゼとは、1976年に米国イエローストーン国立公園の温泉から採取されたThermus aquaticus TY1株から精製された酵素である。この酵素の最大の特徴は反応指摘温度が70〜80度である。そのためPCR法に適した酵素として広く用いられている。このTaqDNAポリメラーゼは、一本鎖DNAを鋳型にして、逆向きの鎖を5’から3’に向かって合成する作用を有している。また、TaqDNAポリメラーゼの特徴として、ポリメラーゼ活性と同時に、エキソヌクレアーゼ活性を有することが挙げられる。このため、TaqDNAポリメラーゼは、単なるPCR法による増幅反応の他、TaqManタイプのプローブを用いるリアルタイムPCR法,nested-リアルタイムPCR法等においても、重要な役割を果たすことができる。但し、耐熱性ポリメラーゼ活性を有する酵素は、これに限られるものでは無く、他のテルムス菌種、例えば,テルムス・テルモフィラス(Thermus thermophilus),テルムス・フィリフォルミス(Thermus filiformis)およびテルムス・フラブス(Thermus flavus)等から得られるものも使用可能である。また、この他、テルモコッカス・リテラリス(Thermococcus literalis),ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus),テルモトガ種(Thermotoga sp.)等から得られるものであっても良い。
《緩衝液》
本発明のHIV-1遺伝子検出又は定量用キットに用いられる緩衝液としては、Taq DNAポリメラーゼ(製品番号 1 146 165, Roche)等に使用されているものを用いることができる。具体的な緩衝液の組成としては、10mM Tris-HCl, pH8.3, 1.5mM MgCl2, 50mM KCl 等が挙げられる(非特許文献1の2.materials and methods
の2.1.2 Nested real-time PCR等参照)
本発明のHIV-1遺伝子検出又は定量用キットに用いられる緩衝液としては、Taq DNAポリメラーゼ(製品番号 1 146 165, Roche)等に使用されているものを用いることができる。具体的な緩衝液の組成としては、10mM Tris-HCl, pH8.3, 1.5mM MgCl2, 50mM KCl 等が挙げられる(非特許文献1の2.materials and methods
の2.1.2 Nested real-time PCR等参照)
《HIV遺伝子検出又は定量用検体》
本発明のプライマー,プローブ,又はキットによって測定可能な検体としては、血漿、血清、全血、脳脊髄液、精液等の体液の他、細胞や組織等が挙げられる。血漿中においては、HIVはRNAとして検出又は定量される。細胞を用いた検出又は定量では、HIVウイルス自身が有する逆転写酵素によって逆転写されたcDNAや、そのcDNAが細胞内のゲノムに取り込まれたプロウイルス,或いはプロウイルスが転写されたmRNAを測定することによって、HIVが検出又は定量される。本発明の実施例においては、例として細胞内の、逆転写されたcDNA及びプロウイルスのトータル量を測定している。
本発明のプライマー,プローブ,又はキットによって測定可能な検体としては、血漿、血清、全血、脳脊髄液、精液等の体液の他、細胞や組織等が挙げられる。血漿中においては、HIVはRNAとして検出又は定量される。細胞を用いた検出又は定量では、HIVウイルス自身が有する逆転写酵素によって逆転写されたcDNAや、そのcDNAが細胞内のゲノムに取り込まれたプロウイルス,或いはプロウイルスが転写されたmRNAを測定することによって、HIVが検出又は定量される。本発明の実施例においては、例として細胞内の、逆転写されたcDNA及びプロウイルスのトータル量を測定している。
HIVが感染すると以下のステップにより宿主標的細胞内に侵入し、後天性免役不全症候群(AIDS)の一因になりうる。
(1)HIVが、感染者自身の細胞内に侵入するステップ
(2)逆転写酵素によって、cDNAとなるステップ
(3)そのcDNAが細胞内のゲノムに組み込まれ、プロウイルスとなるステップ
(4)プロウイルスがヒト転写機構によりmRNAに転写されるステップ
(5)転写されたmRNAから翻訳によってウイルスタンパク質を合成するステップ
(6)HIVウイルス粒子が複製され、感染細胞から出芽していくステップ
を経て初めて、HIVウイルスの増殖が繰り返し起こり、約10年という長い年月を経て,AIDSの発症へと進展して行く。
(1)HIVが、感染者自身の細胞内に侵入するステップ
(2)逆転写酵素によって、cDNAとなるステップ
(3)そのcDNAが細胞内のゲノムに組み込まれ、プロウイルスとなるステップ
(4)プロウイルスがヒト転写機構によりmRNAに転写されるステップ
(5)転写されたmRNAから翻訳によってウイルスタンパク質を合成するステップ
(6)HIVウイルス粒子が複製され、感染細胞から出芽していくステップ
を経て初めて、HIVウイルスの増殖が繰り返し起こり、約10年という長い年月を経て,AIDSの発症へと進展して行く。
従って、単に血中のHIV遺伝子量が多くても、細胞内にHIVウイルスが取り込まれたり、増殖するとは限らない。つまり、血中のHIV遺伝子量の測定では、AIDSの発症や進行の有無を正確に判定することが難しいと考えられている。
従来、血中のウイルスRNA量とCD4陽性Tリンパ球数で病態の把握を行ってきたが、現時点ではウイルスRNA量に加えて細胞内のプロウイルスを測定することや、プロウイルスから転写された細胞内mRNA量を測定することが、より、病気の進行程度を的確にとらえることができる。このことにより、過剰な投薬・治療を防止できる指標となりうると思われる。
抗HIV薬多剤併用療法により、血漿中のHIV-1 RNAが検出又は定量感度(血中ウイルス量<50コピー/ml血漿)以下に抑えられた症例では、血中ウイルスRNA量の測定だけでは治療効果を評価することは無理である。これに対し、感染細胞内の残存プロウイルスの量を定量し、かつそれが産生する全長mRNA量を定量することができればプロウイルス1つあたりの転写能力が評価でき、治療効果の評価と治療中断の可否を決定するエビデンスになると思われる。
本発明の検出又は定量方法は、細胞内の少量のcDNAやプロウイルスを測定するのに好適な方法である。特に、本発明のプライマー,プローブ,又はキット等を用い、nested-リアルタイムPCR法で測定した場合、検出限界が、2コピー未満/106細胞という、驚異的な感度を達成できる。
《人免疫不全症候群治療用遺伝子断片》
本発明のグループ(I)〜(VI)に属するポリヌクレオチドの一種からなる、人免疫不全症候群治療用遺伝子断片は、アンチセンス試薬やsmall interfering RNA(siRNA)を用いたRNA干渉(RNAi)のための部分構造等として、AIDSの遺伝子治療用に用いることができる。
本発明のグループ(I)〜(VI)に属するポリヌクレオチドの一種からなる、人免疫不全症候群治療用遺伝子断片は、アンチセンス試薬やsmall interfering RNA(siRNA)を用いたRNA干渉(RNAi)のための部分構造等として、AIDSの遺伝子治療用に用いることができる。
治療用遺伝子断片の遺伝子形態としては、DNAの他、RNA,プラスミド,ウイルスベクター等が使用可能であり、一本鎖であっても二本鎖であっても良い。この際、siRNAを作るベクターに、DNAを組み込んで用いることもできる。プラスミドを用いる場合、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法(DNAワクチン法)、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にDNAワクチン法、リポソーム法が好ましい。ウイルスベクターを用いる場合、(日経サイエンス,1994年4月号,20−45頁、月刊薬事,36(1),23−48(1994)、実験医学増刊,12(15),(1994)、およびこれらの引用文献等)等に記載されているように、ウイルスに、目的とする遺伝子を組み込むことによって行うことができる。ウイルスベクターに用いるウイルスとしては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のDNAウイルス又はRNAウイルスが挙げられる。ウイルスの中では、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等が好ましく、特にアデノウイルスが好ましい。
《人免疫不全症候群の治療方法》
遺伝子を実際に医薬として作用させ、治療するには、当該遺伝子を直接体内に導入する「in vivo法」の他、ヒトかから採集した細胞に当該遺伝子を導入し、その後、遺伝子導入細胞を体内に戻すという、「ex vivo法」等がある[日経サイエンス,1994年4月号,20−45頁、月刊薬事,36(1),23−48(1994)、実験医学増刊,12(15),(1994)、およびこれらの引用文献等]が、in vivo法は費用や手間が少なく、簡便である点で好ましく、ex vivo法は、遺伝子の細胞内への導入効率が良いという点で好ましい。「in vivo法」により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択することができる。投与経路としては、例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等が挙げられる。「in vivo法」によって投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとることができる。一般的には遺伝子を含有する注射剤等の形態が好ましく、必要に応じて、注射剤等に常用されている各種の成分等を加えることもできる。また、遺伝子を含有するリポソームまたは膜融合リポソーム(センダイウイルス(HVJ)−リポソーム等)においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態として用いることができる。
遺伝子を実際に医薬として作用させ、治療するには、当該遺伝子を直接体内に導入する「in vivo法」の他、ヒトかから採集した細胞に当該遺伝子を導入し、その後、遺伝子導入細胞を体内に戻すという、「ex vivo法」等がある[日経サイエンス,1994年4月号,20−45頁、月刊薬事,36(1),23−48(1994)、実験医学増刊,12(15),(1994)、およびこれらの引用文献等]が、in vivo法は費用や手間が少なく、簡便である点で好ましく、ex vivo法は、遺伝子の細胞内への導入効率が良いという点で好ましい。「in vivo法」により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択することができる。投与経路としては、例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等が挙げられる。「in vivo法」によって投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとることができる。一般的には遺伝子を含有する注射剤等の形態が好ましく、必要に応じて、注射剤等に常用されている各種の成分等を加えることもできる。また、遺伝子を含有するリポソームまたは膜融合リポソーム(センダイウイルス(HVJ)−リポソーム等)においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態として用いることができる。
以下、本発明のプライマー(配列番号5,配列番号7),プローブの有用性(配列番号11)を、公知のサブタイプB用に開発された、プライマー,プローブと比較するため、サブタイプA,B,C,D,組換え流行株CRF01_AEに属する患者のHIV-1遺伝子の検出又は定量を実施した結果を示すが、それに先だって、実施例で用いた実験方法及び実験材料について説明する。
《実験方法》
上述の《nestedリアルタイム-PCR法》を使用する。尚、《nestedリアルタイム-PCR法》については、下記[1]〜[6]のようにして行った。
上述の《nestedリアルタイム-PCR法》を使用する。尚、《nestedリアルタイム-PCR法》については、下記[1]〜[6]のようにして行った。
[1]《nestedリアルタイム-PCR法》の検体から細胞を分離する方法
[CD4 陽性Tリンパ球の分離(StemSep Negative Cell Selection)]
(StemSep)
StemSepとは、除去を目的とする細胞の表面に発現しているタンパク質を標的とし、それに対する抗体と磁性コロイドを結合させて、磁石にセットしたカラムにトラップさせ、細胞溶液中から不要な細胞を除去し、目的とする細胞のみを濃縮回収する方法である。
[CD4 陽性Tリンパ球の分離(StemSep Negative Cell Selection)]
(StemSep)
StemSepとは、除去を目的とする細胞の表面に発現しているタンパク質を標的とし、それに対する抗体と磁性コロイドを結合させて、磁石にセットしたカラムにトラップさせ、細胞溶液中から不要な細胞を除去し、目的とする細胞のみを濃縮回収する方法である。
(StemSep試薬)
StemSep試薬とは、除去したい細胞に結合させる抗体および磁気コロイドの試薬セットである。ヒトの細胞用のStemSep試薬としては、Tetrameric Antibody Complex(四量体抗体複合物)のカクテルと磁気コロイドのセットを用いる。
StemSep試薬とは、除去したい細胞に結合させる抗体および磁気コロイドの試薬セットである。ヒトの細胞用のStemSep試薬としては、Tetrameric Antibody Complex(四量体抗体複合物)のカクテルと磁気コロイドのセットを用いる。
(1)へパリン又はEDTA (ethylene-diamine-tetraacetic acid)添加全血を400×G(1200rpm) 15分間遠心し、血球層、バフィーコート(白血球層)及び血漿に分離する。
(2)バフィーコート層を採取する。
(3)赤血球溶血用塩化アンモニウム溶液(150mmol/l NH4Cl、10mmol/l KHCO3、81μmol/l EDTA 4Na)を10ml添加し20分間反応させ赤血球を溶血させる。
(4)遠心(400×G(1200rpm)、5分)後、上清除去する。細胞沈査は10mlのリン酸緩衝化食塩水(PBS)にウシ胎児血清(Fetal Calf Serum、FCS)を2%加えた緩衝液(PBS+2%FCS)でピペッティングにより再懸濁を行う。
(5)遠心((400×G(1200rpm)、5分)後、上清除去する。
(6)細胞沈査に1mlのPBS+2%FCSを加え、再懸濁後、1.5mlのDNase・RNaseフリーチューブに移す。
(7)1.5ml DNase・RNaseフリーのチューブに移したバフィーコート1mlにCD4+エンリッチメントカクテル (一次抗体、STS-14052 (StemSep、ベリタス社製) )を100μl添加し、転倒混和する。
(8)室温で15分間抗原抗体反応(氷中の場合は30分間)を行う。
(9)反応後、マグネット抗体を60μl添加し、転倒混和し室温で15分間抗原抗体反応を行う(氷中の場合は30分間)。
(10)抗原抗体反応を続行させているかたわら、別途並行してカラム(STS-12031(StemSep、ベリタス社製))をセットし、PBS+2%FCS緩衝液でカラムを洗浄する。
(11)抗原抗体反応後、サンプルをカラムに添加し重力により目的細胞を落下させ、目的細胞を回収する。
(12)回収後、400×G(1200rpm)、10分間遠心し、上清を除去する。
(13)細胞沈査にPBS 液を加え再懸濁する。
(2)バフィーコート層を採取する。
(3)赤血球溶血用塩化アンモニウム溶液(150mmol/l NH4Cl、10mmol/l KHCO3、81μmol/l EDTA 4Na)を10ml添加し20分間反応させ赤血球を溶血させる。
(4)遠心(400×G(1200rpm)、5分)後、上清除去する。細胞沈査は10mlのリン酸緩衝化食塩水(PBS)にウシ胎児血清(Fetal Calf Serum、FCS)を2%加えた緩衝液(PBS+2%FCS)でピペッティングにより再懸濁を行う。
(5)遠心((400×G(1200rpm)、5分)後、上清除去する。
(6)細胞沈査に1mlのPBS+2%FCSを加え、再懸濁後、1.5mlのDNase・RNaseフリーチューブに移す。
(7)1.5ml DNase・RNaseフリーのチューブに移したバフィーコート1mlにCD4+エンリッチメントカクテル (一次抗体、STS-14052 (StemSep、ベリタス社製) )を100μl添加し、転倒混和する。
(8)室温で15分間抗原抗体反応(氷中の場合は30分間)を行う。
(9)反応後、マグネット抗体を60μl添加し、転倒混和し室温で15分間抗原抗体反応を行う(氷中の場合は30分間)。
(10)抗原抗体反応を続行させているかたわら、別途並行してカラム(STS-12031(StemSep、ベリタス社製))をセットし、PBS+2%FCS緩衝液でカラムを洗浄する。
(11)抗原抗体反応後、サンプルをカラムに添加し重力により目的細胞を落下させ、目的細胞を回収する。
(12)回収後、400×G(1200rpm)、10分間遠心し、上清を除去する。
(13)細胞沈査にPBS 液を加え再懸濁する。
[2]《nestedリアルタイム-PCR法》の分離細胞からDNAを抽出する方法分離した細胞からの、DNAの抽出は、常法により行うことができるが、例えば、(QIAamp DNA Blood mini kit(QIAGEN)を用い、このキットに添付されている説明書に記載の方法を用い、説明書の、最後のDNA回収の段階で、Buffer AEに代えて、60μlのDDW(double distilled water)を用い、6000×g(8000rpm) 1分で遠心することにより、DNAを回収することができる。
[3]β2ミクログロブリン(β2M)の定量抽出したDNA中のβ2M遺伝子コピー数を定量する事により、DNA抽出時(定量前PCR前)の細胞数を算出する。
《実験材料》
[コントロールβ2M用プライマー]
リアルタイムPCRプライマー:
β2M-F:配列番号12
5’-cagcaaggac tggtctttct atctct-3’
β2M-R: 配列番号13
5’-accccactta actatcttgg-3’
リアルタイムPCRプライマー:
β2M-F:配列番号12
5’-cagcaaggac tggtctttct atctct-3’
β2M-R: 配列番号13
5’-accccactta actatcttgg-3’
[コントロールβ2M用TaqManプローブ]
リアルタイムTaqManプローブ:
β2M-T: 配列番号14
5’-6FAM-cactgaaaaa gatgagtatg cctgccgtgt-TAMRA-3’
リアルタイムTaqManプローブ:
β2M-T: 配列番号14
5’-6FAM-cactgaaaaa gatgagtatg cctgccgtgt-TAMRA-3’
Standard plasmid:
pGEM-β2M (1010コピー/μlが10μlずつ分注)
pGEM-β2M (1010コピー/μlが10μlずつ分注)
[Standard 希釈液調整]
1010コピー/μl液を2倍に希釈。その後、10倍に段階希釈。使用は2μl。
1010コピー/μl液を2倍に希釈。その後、10倍に段階希釈。使用は2μl。
[リアルタイムPCR法:LightCycler LC Fast-start kit (Roche)]
PCR Mixture
PCR Mixture
リアルタイムPCR法のPCR反応液の組成を表1に示す。
108,107,106,105,104,103,102,101コピー/2μlとなるように段階希釈したpGEM-B2M
Standard plasmidを定量時のコントロールとして使用する。
Standard plasmidを定量時のコントロールとして使用する。
[リアルタイムPCRプログラム]
95℃ 10分間: Denature
95℃ 10秒、60℃ 30秒 45サイクル: PCR+蛍光強度測定
40℃ 30秒間: Cooling
95℃ 10分間: Denature
95℃ 10秒、60℃ 30秒 45サイクル: PCR+蛍光強度測定
40℃ 30秒間: Cooling
《結果》
β2Mコピー数測定の結果記入シート例を表2に示す。
B2M-Q:B2M測定値
B2M:B2M×25 抽出されたDNA中の総β2Mコピー数
Total cells:B2M/2 抽出されたDNAの総細胞数を算出
B2M:B2M×25 抽出されたDNA中の総β2Mコピー数
Total cells:B2M/2 抽出されたDNAの総細胞数を算出
[4]定量前増幅反応(HIV-1 DNA-β2M同時増幅法)
[プライマー]
β2M 増幅プライマー:
β2M-F2: 配列番号12
5’-cagca aggac tggtc tttct atctc t-3’
β2M-R : 配列番号13
5’-acccc actta actat cttgg-3’
[プライマー]
β2M 増幅プライマー:
β2M-F2: 配列番号12
5’-cagca aggac tggtc tttct atctc t-3’
β2M-R : 配列番号13
5’-acccc actta actat cttgg-3’
HIV-1 DNA増幅プライマー:
Pre-quantification forward: 配列番号3
5’-cctagaactt taaatgcatg ggt-3’
Pre-quantification reverse: 配列番号9
5’-attctgcagc ttcctcattg at-3’
Pre-quantification forward: 配列番号3
5’-cctagaactt taaatgcatg ggt-3’
Pre-quantification reverse: 配列番号9
5’-attctgcagc ttcctcattg at-3’
[DNA量]
定量前増幅反応に使用するDNA量記入シート例を表3に示す。
DNA 使用量:定量前PCR反応に用いたDNA volume(μl)
Water vol:Sample量を60μlに調整する為のDDW量(μl)
Water vol:Sample量を60μlに調整する為のDDW量(μl)
PCR Mixtureを表4に示す。
[定量前増幅PCRプログラム #56−20]
94℃ 1分間: Denature
94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分 20サイクル: PCR
72℃ 8分間: 伸長反応
4℃: cooling
94℃ 1分間: Denature
94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分 20サイクル: PCR
72℃ 8分間: 伸長反応
4℃: cooling
[5]β2ミクログロブリン(β2M)の定量 2回目
定量前増幅反応後のβ2Mコピー数を定量し、PCR増幅率を算出する。
定量前増幅反応後のβ2Mコピー数を定量し、PCR増幅率を算出する。
[プライマー及びTaqManプローブ−(3)の反応と同じ]
リアルタイムPCRプライマー:
β2M-F2: 配列番号12
5’-cagcaaggac tggtctttct atctct-3’
β2M-R: 配列番号13
5’-accccactta actatcttgg-3’
リアルタイムTaqManプローブ:
β2M-T: 配列番号14
5’-6FAM-cactgaaaaa gatgagtatg cctgccgtgt-TAMRA-3’
リアルタイムPCRプライマー:
β2M-F2: 配列番号12
5’-cagcaaggac tggtctttct atctct-3’
β2M-R: 配列番号13
5’-accccactta actatcttgg-3’
リアルタイムTaqManプローブ:
β2M-T: 配列番号14
5’-6FAM-cactgaaaaa gatgagtatg cctgccgtgt-TAMRA-3’
Standard plasmid:
pGEM-β2M (1010コピー/μlが10μlずつ分注)
検量線:1010,108,106,105,104,103,102,101コピー/2μlのpGEM-B2M
Standard plasmidを定量時のコントロールとして使用する。
pGEM-β2M (1010コピー/μlが10μlずつ分注)
検量線:1010,108,106,105,104,103,102,101コピー/2μlのpGEM-B2M
Standard plasmidを定量時のコントロールとして使用する。
《リアルタイムPCR法:LightCycler LC Fast-start kit (Roche)使用》
反応液組成等は(3)と同じ。
反応液組成等は(3)と同じ。
PCR Mixtureを表5に示す。
[リアルタイムPCRプログラム]
95℃ 10分間: Denature
95℃ 10秒、60℃ 30秒 45サイクル: PCR+蛍光強度測定
40℃ 30秒間: Cooling
95℃ 10分間: Denature
95℃ 10秒、60℃ 30秒 45サイクル: PCR+蛍光強度測定
40℃ 30秒間: Cooling
[結果]
定量前増幅反応後β2Mコピー数測定の結果記入シート例を表6に示す。
使用細胞数:Total cells(増幅PCR前)×DNA使用量/50
使用B2Mコピー数:使用細胞数×2
B2M-ampQ:定量前PCR後B2Mコピー数測定値
Total B2M-amp:B2M-ampQ×50 定量前PCRによって増幅したB2M遺伝子の総数
増幅率:Total B2M amp/使用B2Mコピー数
使用B2Mコピー数:使用細胞数×2
B2M-ampQ:定量前PCR後B2Mコピー数測定値
Total B2M-amp:B2M-ampQ×50 定量前PCRによって増幅したB2M遺伝子の総数
増幅率:Total B2M amp/使用B2Mコピー数
[6]定量前増幅反応後HIV-1 DNAの定量
[プライマー及びTaqManプローブ]
リアルタイムPCRプライマー:
Real-time forward: 配列番号5
5’-ccagaagtga tacccatgtt-3’
Real-time forward: 配列番号7
5’-tttaacattt gcatggctgc-3’
リアルタイムPCRプライマー:
Real-time forward: 配列番号5
5’-ccagaagtga tacccatgtt-3’
Real-time forward: 配列番号7
5’-tttaacattt gcatggctgc-3’
リアルタイムTaqManプローブ:
TaqMan probe: 配列番号11
5’-6FAM-atcttgtggg gtggctcctt ctgataatgc-TAMRA-3’
TaqMan probe: 配列番号11
5’-6FAM-atcttgtggg gtggctcctt ctgataatgc-TAMRA-3’
Standard plasmid:
pUC-IIIB (5×1010コピー/μlが10μlずつ分注)
pUC-IIIB (5×1010コピー/μlが10μlずつ分注)
[Standard 希釈液調整]
5×1010コピー/μl 液を10倍ずつに段階希釈
使用は2μl
5×1010コピー/μl 液を10倍ずつに段階希釈
使用は2μl
108,107,106,105,104,103,102,101コピー/2μlとなるように段階希釈したpGEM-B2M
Standard plasmidを定量時のコントロールとして使用する。
Standard plasmidを定量時のコントロールとして使用する。
[リアルタイムPCR法:LightCycler LC Fast-start kit (Roche)使用]
β2M測定法と同じ
β2M測定法と同じ
PCR Mixtureを表7に示す。
[リアルタイムPCRプログラム]
95℃ 10分間: Denature
95℃ 10秒、60℃ 30秒 45サイクル: PCR+蛍光強度測定
40℃ 30秒間: Cooling
95℃ 10分間: Denature
95℃ 10秒、60℃ 30秒 45サイクル: PCR+蛍光強度測定
40℃ 30秒間: Cooling
[結果]
定量前増幅反応後HIV-1 DNAコピー数測定の結果記入シート例を表8に示す。
HIV-ampQ:定量前PCR後HIVコピー数測定値
HIV-1 DNA amp:HIV-ampQ×50 定量前PCRによって増幅したHIV-1 DNAの総数
Original HIV-1 DNA:HIV-1 DNA/増幅率 抽出したDNA中にもともと存在したHIV-1 DNAコピー数
HIV-1 DNA:Original HIV-1 DNA×1000000/used cells 106細胞中のHIV-1 DNAコピー数
HIV-1 DNA amp:HIV-ampQ×50 定量前PCRによって増幅したHIV-1 DNAの総数
Original HIV-1 DNA:HIV-1 DNA/増幅率 抽出したDNA中にもともと存在したHIV-1 DNAコピー数
HIV-1 DNA:Original HIV-1 DNA×1000000/used cells 106細胞中のHIV-1 DNAコピー数
[実施例1,比較例1(HIV-1遺伝子サブタイプAの検出及び定量)]
本発明のプライマー,プローブの有用性(実施例1)を、公知のサブタイプB用に開発された、プライマー,プローブと比較する(比較例1)ため、サブタイプAに属する患者のHIV-1遺伝子の検出及び定量を実施した結果を示す。
本発明のプライマー,プローブの有用性(実施例1)を、公知のサブタイプB用に開発された、プライマー,プローブと比較する(比較例1)ため、サブタイプAに属する患者のHIV-1遺伝子の検出及び定量を実施した結果を示す。
i)まず、各々のプライマー,プライマーを用い、サブタイプAの検体でリアルタイムPCR反応が、理論通りに起こっているかについて検討した。
尚、用いた検体は、下記の3種類である。
(サブタイプA検体情報)
A1:DNA濃度 49ng/μl
A2:DNA濃度 45ng/μl
A3:DNA濃度 45ng/μl
DNAの塩基数:453 bp
(スタンダード)
サブタイプBのHIV-1であるIIIB 実験室株をpUC118プラスミドに挿入したスタンダードプラスミド(pUC-IIIB)
(サブタイプA検体情報)
A1:DNA濃度 49ng/μl
A2:DNA濃度 45ng/μl
A3:DNA濃度 45ng/μl
DNAの塩基数:453 bp
(スタンダード)
サブタイプBのHIV-1であるIIIB 実験室株をpUC118プラスミドに挿入したスタンダードプラスミド(pUC-IIIB)
(実施内容)
a)サブタイプAの検体を10倍ずつ段階希釈し、反応液あたり108から10コピー加えたPCR反応液を作成。
b)本発明のプライマー,プローブを用いた発明法(Pan-HIV-1法)と、公知のサブタイプB用に開発されたプライマー,プローブを用いた公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayのリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。
c)Pan-HIV-1法でサブタイプAの検体を正確に定量できるか否かの確認。
d)Sub-B法でサブタイプAの検体を正確に定量できか否かの確認。
a)サブタイプAの検体を10倍ずつ段階希釈し、反応液あたり108から10コピー加えたPCR反応液を作成。
b)本発明のプライマー,プローブを用いた発明法(Pan-HIV-1法)と、公知のサブタイプB用に開発されたプライマー,プローブを用いた公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayのリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。
c)Pan-HIV-1法でサブタイプAの検体を正確に定量できるか否かの確認。
d)Sub-B法でサブタイプAの検体を正確に定量できか否かの確認。
(実験結果の判定方法)
発明法(Pan-HIV-1法)と公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayのリアルタイム PCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。
発明法(Pan-HIV-1法)と公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayのリアルタイム PCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。
〈検体:サブタイプA-A1〉
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図3に示す。
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図3に示す。
(2)公知文献法(Sub-B法)による結果を図4に示す。
(結果)
Pan-HIV-1法とSub-B法とではPCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例えば、検体A1のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では30サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。
Pan-HIV-1法とSub-B法とではPCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例えば、検体A1のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では30サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。
〈検体:サブタイプA-A2〉
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図5に示す。
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図5に示す。
(2)公知文献法(Sub-B法)による結果を図6に示す。
(結果)
Pan-HIV-1法とSub-B法とではPCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例えば、検体A1のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では30サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。
Pan-HIV-1法とSub-B法とではPCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例えば、検体A1のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では30サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。
〈検体:サブタイプA-A3〉
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図7に示す。
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図7に示す。
(2)公知文献法(Sub-B法)による結果を図8に示す。
(結果)
Pan-HIV-1法とSub-B法とではPCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例えば、検体A1のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では30サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。
Pan-HIV-1法とSub-B法とではPCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例えば、検体A1のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では30サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。
ii)Pan-HIV-1法でサブタイプAの検体を正確に定量できている事を確認した。
スタンダード: pUC-IIIB
スタンダード: pUC-IIIB
〈検体: サブタイプA-A1〉
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表9及び図9に示す。
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表9及び図9に示す。
〈検体: サブタイプA-A2〉
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表10及び図10に示す。
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表10及び図10に示す。
〈検体: サブタイプA-A3〉
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表11及び図11に示す。
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表11及び図11に示す。
表中のAve.は、5回の平均値,SDは、5回の測定値のばらつき(標準偏差),Cv(変動係数=平均値/標準偏差×100(%))は、測定値の再現性を示す。
また、図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサブタイプA検体のコピー数を示す。
また、図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサブタイプA検体のコピー数を示す。
《Pan-HIV-1法:定量結果》
〈検体:サブタイプA-A1〉
〈検体:サブタイプA-A1〉
(Pan-HIV-1法によるサブタイプA-A1検体の測定結果)
(結果)
10コピーでは期待値の50%であったが、それ以上のコピー数の実験では71%から109%の値を示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好である。
10コピーでは期待値の50%であったが、それ以上のコピー数の実験では71%から109%の値を示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好である。
〈検体:サブタイプA-A2〉
(Pan-HIV-1法によるサブタイプA-A2検体の測定結果)
(結果)
10コピーでは期待値の62%であったが、それ以上のコピー数の実験では90%から106%の値を示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好である。
10コピーでは期待値の62%であったが、それ以上のコピー数の実験では90%から106%の値を示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好である。
〈検体:サブタイプA-A3〉
(Pan-HIV-1法によるサブタイプA-A3検体の測定結果)
(結果)
10コピーでは期待値の50%であったが、それ以上のコピー数の実験では73%から106%の値を示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好である。
10コピーでは期待値の50%であったが、それ以上のコピー数の実験では73%から106%の値を示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好である。
iii)Sub-B法でサブタイプAの検体を正確に定量できるか否かの検証を行った。
スタンダード: pUC-IIIB
スタンダード: pUC-IIIB
〈検体: サブタイプA-A1〉
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表12及び図12に示す。
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表12及び図12に示す。
〈検体: サブタイプA-A2〉
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表13及び図13に示す。
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表13及び図13に示す。
〈検体: サブタイプA-A3〉
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表14及び図14に示す。
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表14及び図14に示す。
また、図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサブタイプA検体のコピー数を示す。
《Sub-B法:定量結果》
〈サブタイプA-A1検体〉
〈サブタイプA-A1検体〉
(Sub-B法によるサブタイプA-A1検体の測定結果)
(結果)
期待値に比べ1/106程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。
期待値に比べ1/106程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。
〈サブタイプA-A2検体〉
(Sub-B法によるサブタイプA-A2検体の測定結果)
(結果)
期待値に比べ1/106程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。
期待値に比べ1/106程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。
〈サブタイプA-A3〉
(Sub-B法によるサブタイプA-A3検体の測定結果)
(結果)
期待値に比べ1/106程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。
期待値に比べ1/106程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。
《まとめ》
1.発明法(Pan-HIV-1法)と公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayのリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定したところ、サブタイプAの検体3例全てにおいてPCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例えば、反応に加えたDNAコピー数が108コピーの場合、本発明の方法では10サイクル目に立ち上がったが、従来の方法では30サイクル目であった。これはPCRの回数で220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。
1.発明法(Pan-HIV-1法)と公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayのリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定したところ、サブタイプAの検体3例全てにおいてPCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例えば、反応に加えたDNAコピー数が108コピーの場合、本発明の方法では10サイクル目に立ち上がったが、従来の方法では30サイクル目であった。これはPCRの回数で220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。
2.本発明法(Pan-HIV-1法)を用いた108から10コピーのサブタイプA検体を定量した結果をまとめる。
(Pan-HIV-1法によるサブタイプA検体の測定結果のまとめを表15に示す)
10コピーでは期待値の54%であったが、それ以上のコピー数の実験では87%から103%の値を示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好である。
3.従来法(Sub-B法)を用いた108から10コピーのサブタイプA検体を定量した結果をまとめる。
(Sub-B法によるサブタイプA検体の測定結果のまとめを表16に示す)
(結果)
期待値に比べ1/106程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。この結果は、リアルタイムPCRの立ち上がりから得られる結果とも一致する。
期待値に比べ1/106程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。この結果は、リアルタイムPCRの立ち上がりから得られる結果とも一致する。
(プライマー,プローブ配列の検証)
本実施例,比較例で用いたプライマー,プローブの設計のもととなったHXB2遺伝子上の対応する領域と、HIV-1遺伝子のサブタイプAの患者遺伝子の該当領域を比較対照した図を、図15に示す。
本実施例,比較例で用いたプライマー,プローブの設計のもととなったHXB2遺伝子上の対応する領域と、HIV-1遺伝子のサブタイプAの患者遺伝子の該当領域を比較対照した図を、図15に示す。
リバース側プライマーが結合する配列の5’側3塩基目(リバースプライマーの3’側3塩基目に相当する領域)にA→Gの変異があるため、プライマーと鋳型が結合しにくい状態になり、ポリメラーゼの認識が困難となっていたと考えられる。そのため、リアルタイムPCR画面上で見られた反応開始サイクルの大幅な遅延及び、それによりPCR反応物の減少が生じたと思われる。
[実施例2,比較例2(HIV-1遺伝子サブタイプBの検出及び定量)]
本発明のプライマー,プローブの有用性(実施例2)を、公知のサブタイプB用に開発された、プライマー,プローブと比較する(比較例2)ため、サブタイプBに属する患者のHIV-1遺伝子の検出及び定量を実施した結果を示す。
本発明のプライマー,プローブの有用性(実施例2)を、公知のサブタイプB用に開発された、プライマー,プローブと比較する(比較例2)ため、サブタイプBに属する患者のHIV-1遺伝子の検出及び定量を実施した結果を示す。
i)まず、各々のプライマー,プライマーを用い、サブタイプBの検体でリアルタイムPCR反応が、理論通りに起こっているかについて検討した。
尚、用いた検体は、下記の2種類である。
(サブタイプB検体情報)
B1:DNA濃度 31ng/μl
B2:DNA濃度 20ng/μl
DNAの塩基数: 453 bp
(スタンダード)
サブタイプBのHIV-1であるIIIB 実験室株をpUC118プラスミドに挿入したスタンダードプラスミド(pUC-IIIB)
(サブタイプB検体情報)
B1:DNA濃度 31ng/μl
B2:DNA濃度 20ng/μl
DNAの塩基数: 453 bp
(スタンダード)
サブタイプBのHIV-1であるIIIB 実験室株をpUC118プラスミドに挿入したスタンダードプラスミド(pUC-IIIB)
(実施内容)
a)サブタイプB-B1の検体を10倍ずつ段階希釈し、反応液あたり108から10コピー加えたPCR反応液を作成。
b)本発明のプライマー,プローブを用いた発明法(Pan-HIV-1法)と、公知のサブタイプB用に開発されたプライマー,プローブを用いた公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayのリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。
c)Pan-HIV-1法でサブタイプBの検体を正確に定量できるか否かの確認。
d)Sub-B法でサブタイプBの検体を正確に定量できるか否かの確認。
a)サブタイプB-B1の検体を10倍ずつ段階希釈し、反応液あたり108から10コピー加えたPCR反応液を作成。
b)本発明のプライマー,プローブを用いた発明法(Pan-HIV-1法)と、公知のサブタイプB用に開発されたプライマー,プローブを用いた公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayのリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。
c)Pan-HIV-1法でサブタイプBの検体を正確に定量できるか否かの確認。
d)Sub-B法でサブタイプBの検体を正確に定量できるか否かの確認。
(実験結果の判定方法)
本発明法(Pan-HIV-1法)と公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayについて、同時にリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。
本発明法(Pan-HIV-1法)と公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayについて、同時にリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。
〈検体:サブタイプB-B1〉
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図16に示す。
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図16に示す。
(2)公知文献法(Sub-B法)による結果を図17に示す。
(結果)
Pan-HIV-1法とSub-B法はPCRの立ち上がりの位置がほぼ同じであった。サブタイプBの検体ではPan-HIV-1法、Sub-B法ともに同じような値で測定可能であると思われる。これは、Sub-B法が、サブタイプBの検出又は定量用に開発されたプライマー,プローブを用いる方法であるため、当然の結果とも言える。
Pan-HIV-1法とSub-B法はPCRの立ち上がりの位置がほぼ同じであった。サブタイプBの検体ではPan-HIV-1法、Sub-B法ともに同じような値で測定可能であると思われる。これは、Sub-B法が、サブタイプBの検出又は定量用に開発されたプライマー,プローブを用いる方法であるため、当然の結果とも言える。
〈検体:サブタイプB-B2〉
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図18に示す。
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図18に示す。
(2)公知文献法(Sub-B法)による結果を図19に示す。
(結果)
Pan-B法とSub-B法はPCRの立ち上がりの位置がほぼ同じであった。サブタイプBの検体ではPan-B法、Sub-B法ともに同じような値で測定可能であると思われる。これも、Sub-B法が、サブタイプBの検出又は定量用に開発されたプライマー,プローブを用いる方法であるため、当然の結果と言える。
Pan-B法とSub-B法はPCRの立ち上がりの位置がほぼ同じであった。サブタイプBの検体ではPan-B法、Sub-B法ともに同じような値で測定可能であると思われる。これも、Sub-B法が、サブタイプBの検出又は定量用に開発されたプライマー,プローブを用いる方法であるため、当然の結果と言える。
ii)Pan-HIV-1法でサブタイプBの検体を正確に定量できている事を確認した。
スタンダード:pUC-IIIB
スタンダード:pUC-IIIB
〈検体: サブタイプB-B1〉
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表17及び図20に示す。
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表17及び図20に示す。
〈検体: サブタイプB-B2〉
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表18及び図21に示す。
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表18及び図21に示す。
図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサブタイプB検体のコピー数を示す。
《Pan-HIV-1法:定量結果》
〈検体:サブタイプB-B1〉
〈検体:サブタイプB-B1〉
(Sub-B法によるサブタイプB-B1検体の測定結果)
(結果)
108〜10コピーまで、期待値の88〜118%までと極めて良好に、また、Cv値も1.5〜16%までと再現性良く測定することができた。
108〜10コピーまで、期待値の88〜118%までと極めて良好に、また、Cv値も1.5〜16%までと再現性良く測定することができた。
〈検体:サブタイプB-B2〉
(Sub-B法によるサブタイプB-B2検体の測定結果)
(結果)
10コピーでは期待値の60%であったが、それ以上のコピー数の実験では74%から104%の値を示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好である。
10コピーでは期待値の60%であったが、それ以上のコピー数の実験では74%から104%の値を示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好である。
iii)公知文献法(Sub-B法)でサブタイプBの検体を正確に定量できるか否かの検証を行った。
スタンダード: pUC-IIIB
スタンダード: pUC-IIIB
〈検体:サブタイプB-B1〉
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表19及び図22に示す。
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表19及び図22に示す。
〈検体:サブタイプB-B2〉
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表20及び図23に示す。
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表20及び図23に示す。
図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサブタイプB検体のコピー数を示す。
《Sub-B法:定量結果》
〈サブタイプB-B1検体〉
〈サブタイプB-B1検体〉
(結果)
非常に良好な正確性をもち、かつ再現性良くサブタイプBの検体を測定することができた。
非常に良好な正確性をもち、かつ再現性良くサブタイプBの検体を測定することができた。
〈サブタイプB-B2検体〉
(結果)
非常に良好な正確性をもち、かつ再現性良くサブタイプBの検体を測定することができた。
非常に良好な正確性をもち、かつ再現性良くサブタイプBの検体を測定することができた。
《まとめ》
サブタイプBの検体はPan-HIV-1法、Sub-B法とも極めて良好な正確性、及び再現性を有し測定することが可能であった。
サブタイプBの検体はPan-HIV-1法、Sub-B法とも極めて良好な正確性、及び再現性を有し測定することが可能であった。
(プライマー,プローブ配列の検証)
本実施例,比較例で用いたプライマー,プローブの設計のもととなったHXB2遺伝子上の対応する領域と、HIV-1遺伝子のサブタイプBの患者遺伝子の該当領域を比較対照した図を、図24に示す。
本実施例,比較例で用いたプライマー,プローブの設計のもととなったHXB2遺伝子上の対応する領域と、HIV-1遺伝子のサブタイプBの患者遺伝子の該当領域を比較対照した図を、図24に示す。
Pan-HIV-1法、Sub-B法ともに、プライマー及びプローブの結合領域にPCR反応に影響を及ぼすような変異は見られなかった。結果、両測定法とも再現性良く正確に測定できたと考えられる。
[実施例3,比較例3(HIV-1遺伝子サブタイプCの検出及び定量)]
本発明のプライマー,プローブの有用性(実施例3)を、公知のサブタイプB用に開発された、プライマー,プローブと比較する(比較例3)ため、サブタイプCに属する患者のHIV-1遺伝子の検出及び定量を実施した結果を示す。
本発明のプライマー,プローブの有用性(実施例3)を、公知のサブタイプB用に開発された、プライマー,プローブと比較する(比較例3)ため、サブタイプCに属する患者のHIV-1遺伝子の検出及び定量を実施した結果を示す。
i)まず、各々のプライマー,プライマーを用い、サブタイプCの検体でリアルタイムPCR反応が、理論通りに起こっているかについて検討した。
尚、用いた検体は、下記の2種類である。
(サブタイプA検体情報)
C1:DNA濃度 24ng/μl
C2:DNA濃度 51ng/μl
DNAの塩基数:453 bp
(スタンダード)
サブタイプBのHIV-1であるIIIB 実験室株をpUC118プラスミドに挿入したスタンダードプラスミド(pUC-IIIB)
(サブタイプA検体情報)
C1:DNA濃度 24ng/μl
C2:DNA濃度 51ng/μl
DNAの塩基数:453 bp
(スタンダード)
サブタイプBのHIV-1であるIIIB 実験室株をpUC118プラスミドに挿入したスタンダードプラスミド(pUC-IIIB)
(実施内容)
a)サブタイプCの検体を10倍ずつ段階希釈し、反応液あたり108から10コピー加えたPCR反応液を作成。
b)本発明のプライマー,プローブを用いた発明法(Pan-HIV-1法)と、公知のサブタイプB用に開発されたプライマー,プローブを用いた公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayのリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。
c)Pan-HIV-1法でサブタイプCの検体を正確に定量できるか否かの確認。
d)Sub-B法でサブタイプCの検体を正確に定量できるか否かの確認。
a)サブタイプCの検体を10倍ずつ段階希釈し、反応液あたり108から10コピー加えたPCR反応液を作成。
b)本発明のプライマー,プローブを用いた発明法(Pan-HIV-1法)と、公知のサブタイプB用に開発されたプライマー,プローブを用いた公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayのリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。
c)Pan-HIV-1法でサブタイプCの検体を正確に定量できるか否かの確認。
d)Sub-B法でサブタイプCの検体を正確に定量できるか否かの確認。
(実験結果の判定方法)
本発明法(Pan-HIV-1法)と公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayについて、同時にリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。
本発明法(Pan-HIV-1法)と公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayについて、同時にリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。
〈検体:サブタイプC-C1〉
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図25に示す。
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図25に示す。
(2)公知文献法(Sub-B法)による結果を図26に示す。
(結果)
Pan-HIV-1法とSub-B法とではPCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例えば、検体C1のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では30サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。
Pan-HIV-1法とSub-B法とではPCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例えば、検体C1のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では30サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。
〈検体:サブタイプC-C2〉
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図27に示す。
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図27に示す。
(2)公知文献法(Sub-B法)による結果を図28に示す。
(結果)
Pan-HIV-1法とSub-B法とではPCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例えば、検体C2のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では30サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。
Pan-HIV-1法とSub-B法とではPCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例えば、検体C2のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では30サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。
ii)Pan-HIV-1法でサブタイプCの検体を正確に定量できている事を確認した。
スタンダード:pUC-IIIB
スタンダード:pUC-IIIB
〈検体: サブタイプC-C1〉
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表21及び図29に示す。
〈検体: サブタイプC-C2〉
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表22及び図30に示す。
図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサブタイプC検体のコピー数を示す。
《Pan-HIV-1法:定量結果》
〈検体:サブタイプC-C1〉
〈検体:サブタイプC-C1〉
(結果)
非常に良好な正確性をもち、かつ再現性良くサブタイプCの検体を測定することができた。
非常に良好な正確性をもち、かつ再現性良くサブタイプCの検体を測定することができた。
〈検体:サブタイプC-C2〉
(結果)
非常に良好な正確性をもち、かつ再現性良くサブタイプCの検体を測定することができた。
非常に良好な正確性をもち、かつ再現性良くサブタイプCの検体を測定することができた。
iii)公知文献法(Sub-B法)でサブタイプCの検体を正確に定量できるか否かの検証を行った。
スタンダード: pUC-IIIB
スタンダード: pUC-IIIB
〈検体:サブタイプC-C1〉
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表23及び図31に示す。
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表23及び図31に示す。
〈検体:サブタイプC-C2〉
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表24及び図32に示す。
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表24及び図32に示す。
図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサブタイプC検体のコピー数を示す。
(Sub-B法によるサブタイプC-C1検体の測定結果)
(結果)
期待値に比べ1/105程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。
期待値に比べ1/105程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。
〈サブタイプC-C2検体〉
(Sub-B法によるサブタイプC-C2検体の測定結果)
《まとめ》
1.サブタイプCの検体ではSub-B法でリアルタイムPCRを行った際、PCRの立ち上がりサイクル数が極端に大きく、これは、Pan-HIV-1法と比べ約20サイクルの違いを示した。
2.これはPCRの回数で220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。
3.実際の定量値で見てみると、Sub-B法では期待値に比べ1/105程度の量として算定されたにすぎなかった。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。
4.一方、Pan-HIV-1法を用いた場合、10コピー時の場合、C1検体で期待値の72%、C2期待値の130%であったが、それ以外のコピー数ではC1検体で88%から126%の値をC2検体で83〜124%示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好であった。
5.今まで測定できなかったサブタイプCの検体も本発明法であるPan-HIV-1法で正確にまた、再現性良く測定できるようになった事が示された。
1.サブタイプCの検体ではSub-B法でリアルタイムPCRを行った際、PCRの立ち上がりサイクル数が極端に大きく、これは、Pan-HIV-1法と比べ約20サイクルの違いを示した。
2.これはPCRの回数で220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。
3.実際の定量値で見てみると、Sub-B法では期待値に比べ1/105程度の量として算定されたにすぎなかった。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。
4.一方、Pan-HIV-1法を用いた場合、10コピー時の場合、C1検体で期待値の72%、C2期待値の130%であったが、それ以外のコピー数ではC1検体で88%から126%の値をC2検体で83〜124%示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好であった。
5.今まで測定できなかったサブタイプCの検体も本発明法であるPan-HIV-1法で正確にまた、再現性良く測定できるようになった事が示された。
(プライマー,プローブ配列の検証)
本実施例,比較例で用いたプライマー,プローブの設計のもととなったHXB2遺伝子上の対応する領域と、HIV-1遺伝子のサブタイプCの患者遺伝子の該当領域を比較対照した図を、図33に示す。
本実施例,比較例で用いたプライマー,プローブの設計のもととなったHXB2遺伝子上の対応する領域と、HIV-1遺伝子のサブタイプCの患者遺伝子の該当領域を比較対照した図を、図33に示す。
Sub-B法ではリバース側プライマーの5’側3塩基目(リバースプライマーの3’側3塩基目に相当する領域)にA→G変異が入っており、この変異のため、プライマー結合及び伸長反応が効率よく行われず、PCR反応が開始時サイクルの極端な遅れが発生し、それによりPCR反応物の減少が生じたと思われる。
[実施例4(HIV-1遺伝子サブタイプDの検出及び定量)]
発明したプライマー、プローブの有用性の有用性(実施例4)を、公知のサブタイプB用に開発された、プライマー,プローブと比較する(比較例4)ため、サブタイプDに属する患者のHIV-1遺伝子の検出及び定量を実施した結果を示す。
発明したプライマー、プローブの有用性の有用性(実施例4)を、公知のサブタイプB用に開発された、プライマー,プローブと比較する(比較例4)ため、サブタイプDに属する患者のHIV-1遺伝子の検出及び定量を実施した結果を示す。
i)まず、各々のプライマー,プライマーを用い、サブタイプDの検体でリアルタイムPCR反応が、理論通りに起こっているかについて検討した。
尚、用いた検体は、下記の2種類である。
(サブタイプD検体情報)
D1:DNA濃度 25ng/μl
D2:DNA濃度 38ng/μl
DNAの塩基数:453 bp
(スタンダード)
サブタイプBのHIV-1であるIIIB 実験室株をpUC118プラスミドに挿入したスタンダードプラスミド(pUC-IIIB)
(サブタイプD検体情報)
D1:DNA濃度 25ng/μl
D2:DNA濃度 38ng/μl
DNAの塩基数:453 bp
(スタンダード)
サブタイプBのHIV-1であるIIIB 実験室株をpUC118プラスミドに挿入したスタンダードプラスミド(pUC-IIIB)
(実施内容)
a)サブタイプDの検体を10倍ずつ段階希釈し、反応液あたり108から10コピー加えたPCR反応液を作成。
b)本発明のプライマー,プローブを用いた発明法(Pan-HIV-1法)と、公知のサブタイプB用に開発されたプライマー,プローブを用いた公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayのリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。
c)Pan-HIV-1法でサブタイプDの検体を正確に定量できるか否かの確認。
d)Sub-B法でサブタイプDの検体を正確に定量できか否かの確認。
a)サブタイプDの検体を10倍ずつ段階希釈し、反応液あたり108から10コピー加えたPCR反応液を作成。
b)本発明のプライマー,プローブを用いた発明法(Pan-HIV-1法)と、公知のサブタイプB用に開発されたプライマー,プローブを用いた公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayのリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。
c)Pan-HIV-1法でサブタイプDの検体を正確に定量できるか否かの確認。
d)Sub-B法でサブタイプDの検体を正確に定量できか否かの確認。
(実験結果の判定方法)
発明法(Pan-HIV-1法)と公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayについて、同時にリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。
発明法(Pan-HIV-1法)と公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayについて、同時にリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。
〈検体:サブタイプD−D1〉
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図34に示す。
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図34に示す。
(2)公知文献法(Sub-B法)による結果を図35に示す。
(結果)
Pan-HIV-1法とSub-B法とではPCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例えば、検体D1のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では22サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で212違うことを意味し、PCR生成物で換算すると4000倍の差となる。
Pan-HIV-1法とSub-B法とではPCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例えば、検体D1のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では22サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で212違うことを意味し、PCR生成物で換算すると4000倍の差となる。
〈検体:サブタイプD-D2〉
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図36に示す。
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図36に示す。
(2)公知文献法(Sub-B法)による結果を図37に示す。
(結果)
Pan-HIV-1法とSub-B法とではPCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例えば、検体D2のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では30サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。
Pan-HIV-1法とSub-B法とではPCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例えば、検体D2のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では30サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。
ii)Pan-HIV-1法でサブタイプDの検体を正確に定量できている事を確認した。
スタンダード:pUC-IIIB
スタンダード:pUC-IIIB
〈検体: サブタイプD-D1〉
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表25及び図38に示す。
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表25及び図38に示す。
〈サブタイプD-D2〉
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表26及び図39に示す。図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサブタイプD検体のコピー数を示す。
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表26及び図39に示す。図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサブタイプD検体のコピー数を示す。
《Pan-HIV-1法:定量結果》
〈検体:サブタイプD-D1〉
〈検体:サブタイプD-D1〉
(Pan-HIV-1法によるサブタイプD-D1検体の測定結果)
(結果)
非常に良好な正確性をもち、かつ再現性良くサブタイプDの検体を測定することができた。
非常に良好な正確性をもち、かつ再現性良くサブタイプDの検体を測定することができた。
〈検体:サブタイプD-D2〉
(Pan-HIV-1法によるサブタイプD-D2検体の測定結果)
(結果)
非常に良好な正確性をもち、かつ再現性良くサブタイプDの検体を測定することができた。
非常に良好な正確性をもち、かつ再現性良くサブタイプDの検体を測定することができた。
iii)Sub-B法でサブタイプDの検体を正確に定量できるか否かの検証を行った。
スタンダード: pUC-IIIB
スタンダード: pUC-IIIB
〈検体:サブタイプD-D1〉
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表27及び図40に示す。
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表27及び図40に示す。
〈検体:サブタイプD-D2〉
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表28及び図41に示す。
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表28及び図41に示す。
図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサブタイプD検体のコピー数を示す。
《Sub-B法 定量結果》
〈サブタイプD-D1検体〉
〈サブタイプD-D1検体〉
(Sub-B法によるサブタイプD-D1検体の測定結果)
(結果)
期待値に比べ1/103程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。
期待値に比べ1/103程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。
〈サブタイプD-D2検体〉
(Sub-B法によるサブタイプD-D2検体の測定結果)
(結果)
期待値に比べ1/105程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。
期待値に比べ1/105程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。
《まとめ》
1.サブタイプDの検体では個体間でその差はあったもののSub-B法でリアルタイムPCRを行った際、PCRの立ち上がりサイクル数が極端に大きかった。(108コピーのサンプルがD1では22サイクル目、D2では30サイクルで立ち上がり始めた)
2.Pan-HIV-1法と比べてみると、PCRの回数に例えるとD1検体では212違うことを意味し、PCR生成物で換算すると4000倍の差となる。D2では220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。
3.実際の定量値で見てみると、Sub-B法で定量を行った際、期待値と比べD1検体で1/103程度の量、D2検体で1/105程度の量は算定されたにすぎなかった。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。
4.一方、Pan-HIV-1法を用いた場合、10コピー時の場合、D1検体で期待値の180%、D2期待値の70%であったが、それ以外のコピー数ではD1検体で89%から127%の値をD2検体で78〜122%示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好であった。
5.今まで測定できなかったサブタイプDの検体も本発明法であるPan-HIV-1法で正確にまた、再現性良く測定できるようになった事が示された。
1.サブタイプDの検体では個体間でその差はあったもののSub-B法でリアルタイムPCRを行った際、PCRの立ち上がりサイクル数が極端に大きかった。(108コピーのサンプルがD1では22サイクル目、D2では30サイクルで立ち上がり始めた)
2.Pan-HIV-1法と比べてみると、PCRの回数に例えるとD1検体では212違うことを意味し、PCR生成物で換算すると4000倍の差となる。D2では220違うことを意味し、PCR生成物で換算すると1000000倍の差となる。
3.実際の定量値で見てみると、Sub-B法で定量を行った際、期待値と比べD1検体で1/103程度の量、D2検体で1/105程度の量は算定されたにすぎなかった。すなわち、正確な定量ができなかったことを意味する。
4.一方、Pan-HIV-1法を用いた場合、10コピー時の場合、D1検体で期待値の180%、D2期待値の70%であったが、それ以外のコピー数ではD1検体で89%から127%の値をD2検体で78〜122%示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好であった。
5.今まで測定できなかったサブタイプDの検体も本発明法であるPan-HIV-1法で正確にまた、再現性良く測定できるようになった事が示された。
(プライマー,プローブ配列の検証)
本実施例,比較例で用いたプライマー,プローブの設計のもととなったHXB2遺伝子上の対応する領域と、HIV-1遺伝子のサブタイプDの患者遺伝子の該当領域を比較対照した図を、図42に示す。
本実施例,比較例で用いたプライマー,プローブの設計のもととなったHXB2遺伝子上の対応する領域と、HIV-1遺伝子のサブタイプDの患者遺伝子の該当領域を比較対照した図を、図42に示す。
リバース側プライマーの5’側3塩基目(リバースプライマーの3’側3塩基目に相当する領域)にA→Gの変異があるため、プライマーと鋳型が結合しにくい状態になっていたと考えられる。そのため、リアルタイムPCR画面上で見られた反応開始サイクルの大幅な遅延及び、それによりPCR反応物の減少が生じたと思われる。
[実施例5(HIV-1遺伝子サブタイプ組換え流行株,CRF01_AEの検出及び定量)]
発明したプライマー、プローブの有用性の有用性(実施例5)を、公知のサブタイプB用に開発された、プライマー,プローブと比較する(比較例5)ため、サブタイプ組換え流行株CRF01_AEに属する患者のHIV-1遺伝子の検出及び定量を実施した結果を示す。
発明したプライマー、プローブの有用性の有用性(実施例5)を、公知のサブタイプB用に開発された、プライマー,プローブと比較する(比較例5)ため、サブタイプ組換え流行株CRF01_AEに属する患者のHIV-1遺伝子の検出及び定量を実施した結果を示す。
i)まず、各々のプライマー,プライマーを用い、サブタイプ組換え流行株CRF01_AEの検体でリアルタイムPCR反応が理論通りに起こっているかについて検討した。
尚、用いた検体は、下記の2種類である。
(CRF01_AE検体情報)
CRF01_AE1:DNA濃度 54ng/μl
CRF01_AE2:DNA濃度 35ng/μl
DNAの塩基数:453 bp
(スタンダード)
サブタイプBのHIV-1であるIIIB 実験室株をpUC118プラスミドに挿入したスタンダードプラスミド(pUC-IIIB)
(CRF01_AE検体情報)
CRF01_AE1:DNA濃度 54ng/μl
CRF01_AE2:DNA濃度 35ng/μl
DNAの塩基数:453 bp
(スタンダード)
サブタイプBのHIV-1であるIIIB 実験室株をpUC118プラスミドに挿入したスタンダードプラスミド(pUC-IIIB)
(実施内容)
a)CRF01_AEの検体を段階希釈し、反応液あたり108から10コピー加えたPCR反応液を作成
b)発明法(Pan-HIV-1法)と公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayのリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。
c)Pan-B法でCRF01_AEの検体を正確に定量できるか否かの確認。
d)Sub-B法でCRF01_AEの検体を正確に定量できか否かの確認。
a)CRF01_AEの検体を段階希釈し、反応液あたり108から10コピー加えたPCR反応液を作成
b)発明法(Pan-HIV-1法)と公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayのリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。
c)Pan-B法でCRF01_AEの検体を正確に定量できるか否かの確認。
d)Sub-B法でCRF01_AEの検体を正確に定量できか否かの確認。
(実験結果の判定方法)
発明法(Pan-HIV-1法)と公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayについて、同時にリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。
発明法(Pan-HIV-1法)と公知文献法(Sub-B法)を用い、108から10コピー/assayについて、同時にリアルタイムPCRを行い、PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。
〈検体:組換え流行株CRF01_AE-AE1〉
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図43に示す。
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図43に示す。
(2)公知文献法(Sub-B法)による結果を図44に示す。
(結果)
Pan-HIV-1法とSub-B法とではPCRの立ち上がりの位置は3サイクルしか違わなかった。例えば、検体AE1のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では13サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で23違うことを意味し、PCR生成物で換算すると8倍の差となる。
Pan-HIV-1法とSub-B法とではPCRの立ち上がりの位置は3サイクルしか違わなかった。例えば、検体AE1のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では13サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で23違うことを意味し、PCR生成物で換算すると8倍の差となる。
〈検体:組換え流行株CRF01_AE-AE2〉
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図45に示す。
(1)発明法(Pan-HIV-1法)による結果を図45に示す。
(2)公知文献法(Sub-B法)による結果を図46に示す。
(結果)
Sub-B法とではPan-HIV-1法に比べPCRの立ち上がりが12サイクル遅くなっていた。例えば、検体AE2のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では22サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で212違うことを意味し、PCR生成物で換算すると4000倍の差となる。
Sub-B法とではPan-HIV-1法に比べPCRの立ち上がりが12サイクル遅くなっていた。例えば、検体AE2のコピー数が108コピーの時、Pan-HIV-1法では10サイクル目に立ち上がっていたが、Sub-B法では22サイクル目での立ち上がりであった。これはPCRの回数で212違うことを意味し、PCR生成物で換算すると4000倍の差となる。
ii)Pan-HIV-1法で組換え流行株CRF01_AEの検体を正確に定量できている事を確認した。
スタンダード:pUC-IIIB
スタンダード:pUC-IIIB
〈検体: 組換え流行株CRF01_AE-AE1〉
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表29及び図47に示す。
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表29及び図47に示す。
〈検体: 組換え流行株CRF01_AE-AE2〉
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表30及び図48に示す。
発明法(Pan-HIV-1法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表30及び図48に示す。
図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字が組換え流行株CRF01_AE検体のコピー数を示す。
《Pan-HIV-1法:定量結果》
〈検体:組換え流行株CRF01_AE-AE1〉
〈検体:組換え流行株CRF01_AE-AE1〉
(Pan-HIV-1法によるCRF01_AE-AE1検体の測定結果)
(結果)
10コピーでは期待値の165%であったが、それ以上のコピー数の実験では78%から111%の値を示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好である。
10コピーでは期待値の165%であったが、それ以上のコピー数の実験では78%から111%の値を示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好である。
〈検体:組換え流行株CRF01_AE-AE2〉
(Pan-HIV-1法によるCRF01_AE-AE2検体の測定結果)
(結果)
10コピーでは期待値の50%であったが、それ以上のコピー数の実験では71%から104%の値を示した。リアルタイムPCRの結果としては良好である。
10コピーでは期待値の50%であったが、それ以上のコピー数の実験では71%から104%の値を示した。リアルタイムPCRの結果としては良好である。
iii)Sub-B法で組換え流行株CRF01_AEの検体を正確に定量できるか否かの検証を行った。
スタンダード: pUC-IIIB
スタンダード: pUC-IIIB
〈検体:組換え流行株CRF01_AE-AE1〉
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表31及び図49に示す。
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表31及び図49に示す。
〈検体:組換え流行株CRF01_AE-AE2〉
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表32及び図50に示す。
公知文献法(Sub-B法)により複数回(5回)測定を行った結果を、表32及び図50に示す。
図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサブタイプCRF01_AE検体のコピー数を示す。
《Sub-B法:定量結果》
〈組換え流行株CRF01_AE-AE1検体〉
〈組換え流行株CRF01_AE-AE1検体〉
(Sub-B法によるCRF01_AE-AE1検体の測定結果)
(結果)
10コピーの検体は16コピーと高値を示したが、後の検体は期待値の1/4程度のコピー数として算出され、その正確性は21〜47%と低いものであった。よって、Sub-B法のプライマーセット、プローブを用いCRF01_AEの検体を正確に測定することは困難であるといえる。
10コピーの検体は16コピーと高値を示したが、後の検体は期待値の1/4程度のコピー数として算出され、その正確性は21〜47%と低いものであった。よって、Sub-B法のプライマーセット、プローブを用いCRF01_AEの検体を正確に測定することは困難であるといえる。
〈組換え流行株CRF01AE-AE2検体〉
(Sub-B法によるCRF01_AE-AE2検体の測定結果)
(結果)
全ての検体において期待値の1/1000〜1/100程度のコピー数としてしか算出されなかった。よって、Sub-B法のプライマーセット、プローブを用いCRF01_AEの検体を正確に測定することは困難であるといえる。
全ての検体において期待値の1/1000〜1/100程度のコピー数としてしか算出されなかった。よって、Sub-B法のプライマーセット、プローブを用いCRF01_AEの検体を正確に測定することは困難であるといえる。
《まとめ》
1.CRF01_AEの検体の場合、Sub-B法でリアルタイムPCRを行った際、PCRの立ち上がりサイクル数が極端に異なっていた。(108コピーのサンプルがAE1では13サイクル目、AE2では22サイクルで立ち上がり始めた)
2.Pan-HIV-1法と比較すると、PCRの回数に例えるとAE1検体ではで23違うことを意味し、PCR生成物で換算すると8倍の差となる。一方、AE2では212違うことを意味し、PCR生成物で換算すると4000倍の差となる。
3.実際の定量値で見てみると、Sub-B法で定量を行った際、期待値と比べAE1検体で1/4程度の誤差であったが、AE2検体では、予想通り期待値の1/1000程度の量しか測定されなかった。すなわち、Sub-B法では正確な定量が難しいことを意味する。
4.一方、Pan-HIV-1法を用いた場合、10コピー時の場合、AE1検体で期待値の165%、AE2検体で期待値の50%であったが、それ以外のコピー数ではAE1検体で78%から111%の値をAE2検体で71%から104%を示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好であった。
5.今まで測定できなかったCRF01_AEの検体も本発明法であるPan-HIV-1法で正確にまた、再現性良く測定できるようになった事が示された。
1.CRF01_AEの検体の場合、Sub-B法でリアルタイムPCRを行った際、PCRの立ち上がりサイクル数が極端に異なっていた。(108コピーのサンプルがAE1では13サイクル目、AE2では22サイクルで立ち上がり始めた)
2.Pan-HIV-1法と比較すると、PCRの回数に例えるとAE1検体ではで23違うことを意味し、PCR生成物で換算すると8倍の差となる。一方、AE2では212違うことを意味し、PCR生成物で換算すると4000倍の差となる。
3.実際の定量値で見てみると、Sub-B法で定量を行った際、期待値と比べAE1検体で1/4程度の誤差であったが、AE2検体では、予想通り期待値の1/1000程度の量しか測定されなかった。すなわち、Sub-B法では正確な定量が難しいことを意味する。
4.一方、Pan-HIV-1法を用いた場合、10コピー時の場合、AE1検体で期待値の165%、AE2検体で期待値の50%であったが、それ以外のコピー数ではAE1検体で78%から111%の値をAE2検体で71%から104%を示した。リアルタイムPCRの結果としては極めて良好であった。
5.今まで測定できなかったCRF01_AEの検体も本発明法であるPan-HIV-1法で正確にまた、再現性良く測定できるようになった事が示された。
(プライマー,プローブ配列の検証)
本実施例,比較例で用いたプライマー,プローブの設計のもととなったHXB2遺伝子上の対応する領域と、HIV-1遺伝子のサブタイプ組換え流行株CRF01_AEの患者遺伝子の該当領域を比較対照した図を、図51に示す。
本実施例,比較例で用いたプライマー,プローブの設計のもととなったHXB2遺伝子上の対応する領域と、HIV-1遺伝子のサブタイプ組換え流行株CRF01_AEの患者遺伝子の該当領域を比較対照した図を、図51に示す。
リバース側プライマーの5’側3塩基目(リバースプライマーの3’側3塩基目に相当する領域)にA→Gの変異があるため、プライマーと鋳型が結合しにくい状態になっていたと考えられる。そのため、リアルタイムPCR画面上で見られた反応開始サイクルの大幅な遅延及び、それによりPCR反応物の減少が生じたと思われる。
(実施例の考察)
以上の結果から、本発明のプライマー,プローブ等を用いる本発明法(Pan-HIV-1法)は、従来可能であったサブタイプBの1種類だけでなく、サブタイプA,C,D,及びサブタイプ組換え流行株CRF01_AE等についても、同時に検出及び定量可能であることが判明した。このことは、サブタイプ等の違いによる検出漏れを防ぐという意味で、本発明の検出又は定量方法が、実用上極めて優れていることを意味している。また、本発明のプライマー,プローブ等を用いる本発明法(Pan-HIV-1法)が、濃度既知の10コピー/assay程度まで、HIV-1遺伝子の検出及び定量も正確にできたという上記の結果は、本発明のプライマー,プローブ等を用いる本発明法(Pan-HIV-1法)が、微量なHIV-1遺伝子の測定に適したnested−リアルタイムPCR法を用いた際に、特にその有用性を発揮し得ることを示している。
本発明のプライマー,プローブあるいはそれらを含むキットを用いた本発明の検出又は定量方法によって、少なくともHIV-1遺伝子のサブタイプA,B,C,D,サブタイプの組換え流行株CRF01_AEは、確実に増幅,検出又は定量することができ、世界で感染が流行しているかなりの部分が検出又は定量可能となる。特に、本発明のプライマーを2対用いた、nested-PCR法やnested-リアルタイムPCR法によれば、極めて低コピーのHIV-1遺伝子でも、特異的にかつ正確に測定ができる。実に、2コピー/106細胞という驚異的な感度を達成することができる。
Claims (9)
- 下記の配列番号1のポリヌクレオチドからなる、人免疫不全ウイルス−1遺伝子の検出又は定量用プライマー及び/又はプローブ配列の選択用塩基配列。
配列番号1:cctagaactt taaatgcatg ggtaaaagta gtagaagaga aggctttcag cccagaagtg atacccatgt tttcagcatt atcagaagga gccaccccac aagatttaaa caccatgcta aacacagtgg ggggacatca agcagccatg caaatgttaa aagagaccat caatgaggaa gctgcagaat gggatagagt - 下記(ア)又は(イ)から選択されるポリヌクレオチドの一種からなる、人免疫不全ウイルス−1遺伝子検出又は定量用プライマー。
(ア)配列番号2〜9から選択されるポリヌクレオチドの一種
(イ)配列番号3,5,7,9のいずれかのポリヌクレオチドの、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド。
配列番号2:ncnannncnn tnaatncnnn ggt
配列番号3:cctagaactt taaatgcatg ggt
配列番号4:ccnnanntna tnccnatgtt
配列番号5:ccagaagtga tacccatgtt
配列番号6:ttnannatnn gcanngnngc
配列番号7:tttaacattt gcatggctgc
配列番号8:antnnnnngn ntcntcnntn at
配列番号9:attctgcagc ttcctcattg at - 下記グループ(I)又は(II)に属するポリヌクレオチドの一種と、下記グループ(III)又は(IV)に属するポリヌクレオチドの一種からなる、人免疫不全ウイルス−1遺伝子検出又は定量用プライマー対。
グループ(I):配列番号2,3,又は配列番号3の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(II):配列番号4,5,又は配列番号5の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(III):配列番号6,7,又は配列番号7の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(IV):配列番号8,9,又は配列番号9の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド - 下記(1)又は(2)からなるポリヌクレオチドを構成要素として含む、人免疫不全ウイルス−1遺伝子検出又は定量用プローブ。
(1)下記グループ(V)又は(VI)から選択されるポリヌクレオチドの一種
(2)一端に蛍光物質,他端に消光物質を結合された下記グループ(V)又は(VI)から選択されるポリヌクレオチドの一種
グループ(V):配列番号10,11,又は配列番号11の、5’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(VI):グループ(V)の相補体
配列番号10:atcnnnnngn nnnnnnccnt nngnnanngc
配列番号11:atcttgtggg gtggctcctt ctgataatgc - 下記(A)乃至(C)の少なくともいずれか一つを含むことを特徴とする、人免疫不全ウイルス−1遺伝子検出又は定量用キット。
(A)請求項2に記載のプライマーの少なくとも一種
(B)請求項3に記載のプライマー対の少なくとも一種
(C)請求項4に記載のプローブの少なくとも一種 - 下記(A)乃至(D)の少なくともいずれか一つを用いることを特徴とする、人免疫不全ウイルス−1遺伝子の検出又は定量方法。
(A)請求項2に記載のプライマーの少なくとも一種
(B)請求項3に記載のプライマー対の少なくとも一種
(C)請求項4に記載のプローブの少なくとも一種
(D)請求項5に記載の検出又は定量用キット - 下記(A)乃至(D)の少なくともいずれか一つを用い、下記(a)乃至(d)のいずれかの方法を用いることを特徴とする、人免疫不全ウイルス−1遺伝子の検出又は定量方法。
(A)請求項2に記載のプライマーの少なくとも一種
(B)請求項3に記載のプライマー対の少なくとも一種
(C)請求項4に記載のプローブの少なくとも一種
(D)請求項5に記載の検出又は定量用キット
(a)PCR法
(b)Nested-PCR法
(c)リアルタイムPCR法
(d)nested-リアルタイムPCR法 - 下記グループ(I)乃至(VI)に属するポリヌクレオチドの一種からなる、人免疫不全症候群治療用遺伝子断片。
グループ(I):配列番号2,3,又は配列番号3の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(II):配列番号4,5,又は配列番号5の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(III):配列番号6,7,又は配列番号7の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(IV):配列番号8,9,又は配列番号9の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(V):配列番号10,11,又は配列番号11の、5’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(VI):グループ(V)の相補体 - 下記グループ(I)乃至(VI)に属するポリヌクレオチドの一種を用いることを特徴とする、人免疫不全症候群の治療方法。
グループ(I):配列番号2,3,又は配列番号3の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(II):配列番号4,5,又は配列番号5の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(III):配列番号6,7,又は配列番号7の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(IV):配列番号8,9,又は配列番号9の、3’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(V):配列番号10,11,又は配列番号11の、5’末端の3塩基を除く他の塩基のうち、1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ(VI):グループ(V)の相補体
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