JP5328010B2 - ノロウイルスの簡易高感度検出法 - Google Patents

Description

本発明は、食品中のノロウイルス遺伝子の検出法に関する。

ウイルス性食中毒の原因のほとんどがノロウイルスによるものであり、該中毒は年々増加傾向が見られ、如何にしてこれを予防するかが大きな課題となっている。そして、該ノロウイルスによる食中毒予防のため、食品のノロウイルスの検出は遺伝子増幅法を用いて行われている。

一般に、ノロウイルスの遺伝子増幅法としては、ＲＴ−ＰＣＲ法及び株式会社シーエムシーが発行した雑誌バイオインダストリー２００５年３月号第６５頁に記載されている如く、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法による方法が開発されているが、用途は一般的に糞便の中のノロウイルスの検出に使用されている。

しかし、ＲＴ−ＰＣＲ法（特許文献１）、ＲＴ−ＬＡＭＰ法（特許文献２）、ＴＲＣ法（特許文献３、特許文献４）、ＮＡＳＢＡ法（特許文献５）は、微量のノロウイルスしか存在しない食品の中のノロウイルスの検出ができない。そのため、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法では、食品の中に微量なノロウイルスが存在しているのにかかわらず、検査結果がノロウイルス検出せずとなるため誤判断されてしまい、そのためにウイルス性食中毒の被害が拡がっていく危険性があった。ここで、「ＲＴ」なる用語は、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する逆転写反応を意味し、「ＲＴ−ＬＡＭＰ法」なる用語は、逆転写反応をプラスしたＬＡＭＰ法を意味する。
特開昭６１−２７４９７ 特許３３１３３５８ 特許３１８９０００ 特許３５７２３４０ 特許２６５０１５９

そこで、食品中のノロウイルスの検出法については、厚生労働省からの通達（非特許文献１）に記載されているＲＴ−nestedＰＣＲ法を用いることが知られており、使用されている。該ＲＴ−nestedＰＣＲ法の使用方法については該通達に別添されてある「ノロウイルスの検査法」（非特許文献２）に記載されている。
「ノロウイルスの検出法について」 食安監発第１１０５００１号 平成１５年１１月５日付 ［非特許文献１］の別添資料である表題「ノロウイルスの検出法」の文献

本発明において、「ＲＴ−nestedＰＣＲ法」なる用語は、厚生労働省通達別添（非特許文献２）の記載と同一で、ＲＴ反応、１ｓｔＰＣＲ、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲをすべて含んだ方法を意味する。

該ＲＴ−nestedＰＣＲ法の概要ステップを、該通達の別添「ノロウイルスの検査法」に基づいて記すと、
工程１ 貝類の中腸腺を取り出し、リン酸緩衝液にて１０倍乳剤にして、ポリエチレングリコール６０００で濃縮する。
工程２ ＱＩＡamp Viral RNA Mini キット（キアゲン社）によるノロウイルスＲＮＡを抽出する。
工程３ 逆転写反応によりＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。
工程４ １回目のＰＣＲ実施によりノロウイルス遺伝子を増幅する。
工程５ ２回目のＰＣＲ実施によりノロウイルス遺伝子を増幅する。
工程６ 電気泳動を行う。
工程７ ハイブリダイゼーションにより、ノロウイルス遺伝子を同定する。
であり、工程３〜工程６のノロウイルス遺伝子を増幅するのに要する時間が約７〜８時間で、さらに工程７のノロウイルス遺伝子を同定するまでに要する時間を加えると、工程３のノロウイルス遺伝子増幅開始から工程７の判定結果判明までに要する時間は約１６〜１８時間要する。したがって、迅速に食品中のノロウイルス検査を完了できないという問題があった。

本発明において、「cＤＮＡ」なる用語は、Ｃomplementary ＤＮＡの略で、相補的ＤＮＡを意味する。また、「ｃＤＮＡ」の用語は、「英和・和英 微生物用語集（第５版） 日本細菌学会用語委員会編 株式会社菜根出版」に記載されている。

本発明の目的は、食品のノロウイルスの検出において、厚生労働省通達に基づくＲＴ−nestedＰＣＲ法と同等の感度を有し、該ＲＴ−nestedＰＣＲ法より、判定までの作業が迅速に行え、かつ判定が容易にできるノロウイルスの簡易高感度検出法を提供することにある。

本発明において、「ＮＡＳＢＡ法」なる用語は、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎの略で、株式会社カイノスが製造販売している遺伝子増幅試薬を使用する遺伝子増幅法を意味する。

次に、本発明において、「ＲＴ−ＬＡＭＰ法」なる用語は、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｌｏｏｐ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ の略で、栄研化学株式会社が製造販売している遺伝子増幅試薬を使用する遺伝子増幅法を意味する。

そして、本発明において「ＮＡＳＢＡ−ＲＴ−ＬＡＭＰ法」なる用語は、ＮＡＳＢＡ法とＲＴ−ＬＡＭＰ法を組み合わせたノロウイルス遺伝子検出法を意味し、該ノロウイルス遺伝子検出法が本発明のノロウイルスの簡易高感度検出法である。
また、本発明において「感度」なる用語は、ノロウイルスを検出できる程度までにノロウイルス遺伝子を増幅できる能力を意味する。

発明者は、厚生労働省通達（非特許文献１）、「ノロウイルスの検査法」（非特許文献２）のＲＴ−nestedＰＣＲ法と同じ感度で、ＲＴ−nestedＰＣＲ法より迅速かつ容易に検出可能な検出方法を創出しようと、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法のそれぞれ単独では、食品の中の微量なノロウイルス遺伝子が検出できない方法をもとに試行錯誤をして、ＮＡＳＢＡ−ＲＴ−ＬＡＭＰ法を創出した。

ＮＡＳＢＡ−ＲＴ−ＬＡＭＰ法について説明する。

まず、ＮＡＳＢＡ−ＲＴ−ＬＡＭＰ法のフロー図を図１に記す。
食品試料を準備し（１）、ＲＮＡを抽出する（２）。そして、ＮＡＳＢＡ法（Ａ）による核酸を１次増幅させる。該１次増幅のフローは、まず１本のマイクロチューブを準備する（３）。そして、ＮＡＳＢＡ反応液、ノロウイルスの遺伝子グループであるジェノグループI（ＧI）とジェノグループII（ＧII）遺伝子検出用プライマー、試料から抽出したＲＮＡを添加し（４）、所定の温度で加温後（５）、ＮＡＳＢＡ酵素液を添加し（６）、さらに所定の温度で加温すると（７）、増幅産物（８）ができる。

次に、ＲＴ―ＬＡＭＰ法（Ｂ）で核酸を２次増幅させる。該２次増幅フローは、ノロウイルスの遺伝子グループであるジェノグループI（ＧI）用とジェノグループII（ＧII）用のマイクロチューブを準備する（９）。そして、試薬、プライマー、ＮＡＳＢＡ増幅産物を添加し（１０）、所定温度で加温すると（１１）、２次増幅させた増幅産物（１２）ができる。このとき、ノロウイルス遺伝子の増幅の有無は反応液の色の目視又は濁度測定装置で確認する（１３）。

ノロウイルス遺伝子の増幅を開始する前の工程においては、ＲＴ−nestedＰＣＲ法と同じ作業を行う。例えば、カキ中腸腺を取り出し、リン酸緩衝液にて１０倍乳剤にしてポリエチレングリコール６０００で濃縮した後、ＱＩＡamp Viral RNA Mini キットによりノロウイルスＲＮＡを抽出する。なお、ノロウイルスＲＮＡを抽出する方法は、ＱＩＡamp Viral RNA Mini キットによるキットに限らない。

抽出したＲＮＡからノロウイルス遺伝子増幅の工程以降が、ＲＴ−nested ＰＣＲ法とは異なる作業を行う工程である。

請求項１に係るノロウイルスの簡易高感度検出法の発明は、試料中に微量に存在するノロウイルス遺伝子を特異的に増幅するための方法であって，試料中より抽出されたＲＮＡから所定の温度下で核酸を増幅できる第１の方法であるＮＡＳＢＡ法による相補的な１本鎖核酸を得る工程と、第１の方法であるＮＡＳＢＡ法による増幅産物を所定の温度下で核酸を増幅できる第２の方法であるＲＴ−ＬＡＭＰ法により，さらに核酸を増幅する工程と、を含む工程からなることを特徴とする。

請求項２に係るノロウイルスの簡易高感度検出法の発明は、請求項１において、ＮＡＳＢＡ法を用いる工程において、大別されるノロウイルスの遺伝子グループであるジェノグループI(GI)とジェノグループII（ＧII）の遺伝子を同時に同じマイクロチューブで増幅することを特徴とする。

請求項３に係るノロウイルスの簡易高感度検出法の発明は、請求項１の発明において、 ＲＴ−ＬＡＭＰ法を用いる工程において、ノロウイルスが増幅されたか否かを、核酸増幅工程で生じる白濁を目視で判定すること又は濁度を測定することを特徴とする。

請求項４に係るノロウイルスの簡易高感度検出法の発明は、試料から得た微量のＲＮＡを鋳型にして，ＮＡＳＢＡ法を用いて増幅産物として相補的な１本鎖ＲＮＡを得る工程と、得られた増幅産物を鋳型として，ＲＴ−ＬＡＭＰ法を用いて多量のＤＮＡを得る工程と，を含む工程からなることを特徴とする。

ＲＴ−ＬＡＭＰ法単独では、微量なノロウイルスしか存在しない食品からノロウイルス遺伝子を検出することができないため、ノロウイルスが存在する糞便を対象として、本発明であるＮＡＳＢＡ−ＲＴ−ＬＡＭＰ法とのノロウイルス遺伝子検出のための感度の比較を行った。

ＲＴ−ＬＡＭＰ法に使用する試薬は、Ｌｏｏｐａｍｐ ＲＮＡ増幅試薬キット（栄研化学株式会社）を使用し、該キットの使用方法は、該キット添付の使用説明書に準じて行った。

ＮＡＳＢＡ−ＲＴ−ＬＡＭＰ法に使用する試薬は、ＮＡＳＢＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ キット（株式会社カイノス社）とＬｏｏｐａｍｐ ＲＮＡ増幅試薬キット（栄研化学株式会社）を使用し、それぞれの該キットの使用方法は、それぞれの該キットに添付の使用説明書に準じて行った。

糞便の中のノロウイルス遺伝子検出感度を比較した結果を図2に表す。

図2において、ノロウイルスが検出されたことを示す陽性を「●」で示し、ノロウイルスが検出されなかったことを示す陰性を「○」で示している。

図2より、ＮＡＳＢＡ−ＲＴ−ＬＡＭＰ法の検出法の方が、ＲＴ−ＬＡＭＰ法の検出法より、感度が約１００倍高いことが認められた。

カキの中の微量なノロウイルス遺伝子検出感度について、ＮＡＳＢＡ−ＲＴ−ＬＡＭＰ法、ＲＴ−nested ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法の比較を行った。

ＮＡＳＢＡ−ＲＴ−ＬＡＭＰ法に使用する試薬は、ＮＡＳＢＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ キット（株式会社カイノス社）とＬｏｏｐａｍｐ ＲＮＡ増幅試薬キット（栄研化学株式会社）を使用し、それぞれの該キットの使用方法は、それぞれの該キットに添付の使用説明書に準じて行った。

ＲＴ−nested ＰＣＲ法に使用する機器は、プログラムコントロールシステムＰＣ−８１８Ａ（株式会社アステック）を使用した。そして、ＲＴ−nested ＰＣＲ法の作業は、「ノロウイルスの検出法」（非特許文献２）に準じて行った。

反応条件は、ＲＴ工程では３０°Ｃで１０分、４２°Ｃで６０分、そして９９°Ｃで５分の温度調節を行い、試薬は「PrimeScript RT regent Kit(Perfect Real Time)タカラバイオ株式会社」を用いた。該試薬とその添加量を以下に記す。
5 × PrimeScript buffer ４μl
PrimeScript RT Enzyme Mixl １μl
Oligo dT Primer(50μM) １μl
Random 6 mer(100μＭ) １μl
RNase free water ３μl
抽出ＲＮＡ 10μl 計 ２０μl

ＰＣＲ工程では、９４°Ｃで３分の後、９４°Ｃで１分、５０°Ｃで１分、７２°Ｃで１分という１サイクルを４０サイクル繰り返し、その後７２°Ｃで１５分温度調節をした。 nested PCR工程がＰＣＲ工程の繰り返しなので、ＰＣＲ工程における温度調節のサイクルを２回繰り返した。

なお、ＰＣＲに使用したプライマーや試薬は、厚生労働省からの「ノロウイルスの検出法」（非特許文献２）で記載されているものと同じものを使用した。

カキの中のノロウイルス遺伝子を検出した結果を図3と図4に表す。図3は、ジェノグループI（ＧI）を対象としたもので、図4は、ジェノグループII（ＧII）を対象としたものである。

図3と図4において、ノロウイルス遺伝子が検出されたことを示す陽性を「●」で示し、ノロウイルスが検出されなかったことを示す陰性を「○」で示している。
図3と図4より、ＲＴ−ＬＡＭＰ法単独では検査結果は陰性でカキの中のノロウイルスを検出することはできなかったが、ＲＴ−ＬＡＭＰ法の前の工程でＮＡＳＢＡ法を行ったＮＡＳＢＡ−ＲＴ−ＬＡＭＰ法では、ＲＴ−nested ＰＣＲ法と同等のノロウイルス遺伝子検出のための感度であることが得られた。

これにより、ＮＡＳＢＡ−ＲＴ−ＬＡＭＰ法は、厚生労働省通達（非特許文献１、非特許文献２）のＲＴ−nested ＰＣＲ法と、同等の感度を有するという効果が認められた。

カキの中のノロウイルス遺伝子検出において、ＮＡＳＢＡ−ＲＴ−ＬＡＭＰ法の作業に要した時間は、ＮＡＳＢＡ法の工程で１００分、ＲＴ−ＬＡＭＰ法の工程で９０分で、ノロウイルス遺伝子の増幅開始からノロウイルス有無判定完了までの時間は約１９０分であり約３時間である。

一方、ＲＴ−nested ＰＣＲ法における、ノロウイルス遺伝子の増幅開始からノロウイルス遺伝子有無判定完了までの時間は約１６〜１８時間である。

よって、ＮＡＳＢＡ−ＲＴ−ＬＡＭＰ法の方がＲＴ−nested ＰＣＲ法より、要した時間を１／５〜１／６に短縮させられるという大きな効果が認められた。

ＲＴ−nested ＰＣＲ法とＮＡＳＢＡ−ＲＴ−ＬＡＭＰ法とを比較して得られた効果は、ＮＡＳＢＡ−ＲＴ−ＬＡＭＰ法に限られるものでなく、２つの異なるノロウイルス遺伝子検出法を使用してノロウイルス遺伝子を増幅させ検出する場合にも同じ効果を有するものである。

したがって、請求項１に記載のノロウイルス遺伝子検出法は、２つの異なるノロウイルス遺伝子検出法を組み合わせた検出法であるので、ＲＴ−nested ＰＣＲ法と同じ感度を有し、ＲＴ−nested ＰＣＲ法に比較して、ノロウイルス遺伝子検出までに要する時間が短縮されるという効果を有する。

ＲＴ−nestedＰＣＲ法では、ＲＴの過程で３０°Ｃ、４２°Ｃそして９９°Ｃという温度調整が必要とされ、また、１回目のＰＣＲと２回目のＰＣＲの過程では、９４°Ｃ、５０°Ｃそして７２°Ｃの温度調節の１サイクルを合計８０サイクル繰り返して行うことが必要とされるため、高価な温度調整機器が必要である。これに対し、ＮＡＳＢＡ−ＲＴ−ＬＡＭＰ法では、ＮＡＳＢＡ法使用のときは６５°Ｃと４１°Ｃ、ＲＴ−ＬＡＭＰ法使用のときは６２°Ｃの一定温度を用いるため、安価な恒温機器であればよいというコスト面での効果と、温度調節回数が減じられ作業効率が向上するという効果が生じる。

したがって、請求項１に記載のノロウイルス遺伝子検出法は、ＲＴ−nested ＰＣＲ法と同じ感度を有し、ＲＴ−nested ＰＣＲ法に比較して、ノロウイルス遺伝子検出のために要する時間が短縮されるという効果を有するとともに、コスト面で安価であることと作業効率が向上するという効果がある。

ＲＴ−nestedＰＣＲ法では、１回目のＰＣＲのときに、大別されるノロウイルスの遺伝子グループであるジェノグループI（ＧI）とジェノグループII（ＧII）を、それぞれ別個のマイクロチューブに添加する。

これに対し、本発明においては、ＮＡＳＢＡ法を用いる工程において、大別されるノロウイルス遺伝子グループであるジェノグループI（ＧI）とジェノグループII（ＧII）を、同時に同じマイクロチューブで増幅することを特徴とするノロウイルス遺伝子検出法を用いる。

したがって、請求項２に記載のノロウイルス遺伝子検出法は、請求項１に記載の発明と同様に、ＲＴ−nested ＰＣＲ法と同じ感度を有し、ＲＴ−nested ＰＣＲ法に比較して、ノロウイルス遺伝子検出のために要する時間が短縮されるという効果を有し、コスト面で安価であることと作業効率が向上するを有するとともに、１回目のノロウイルス遺伝子増幅の際に、マイクロチューブを１つしか使用しなくてよいので、２つマイクロチューブを使用するわずわらしさがないという効果がある。

ＲＴ−nestedＰＣＲ法では、ノロウイルス遺伝子増幅工程後、ノロウイルス遺伝子の存在を確認するためには、電気泳動を行いハイブリダイゼーションによりノロウイルス遺伝子を同定する工程が必要である。

一方、ＮＡＳＢＡ−ＲＴ−ＬＡＭＰ法では、ノロウイルス遺伝子増幅工程後、マイクロチューブを取り出して反応液の色を目視ですぐ確認できるという効果がある。また、リアルタイム濁度測定装置（テラメックス株式会社）によってもリアルタイムでノロウイルス遺伝子の存在が確認できる。

よって、請求項３に記載のノロウイルス遺伝子検出法は、請求項１に記載の発明と同様に、ＲＴ−nested ＰＣＲ法と同じ感度を有し、ＲＴ−nested ＰＣＲ法に比較して、ノロウイルス遺伝子検出のために要する時間が短縮されるという効果を有し、コスト面で安価であることと作業効率が向上するという効果を有するとともに、容易に、簡易にノロウイルス遺伝子を確認できるという効果がある。

請求項４に記載のノロウイルス遺伝子検出法は、請求項１に記載の発明と同様に、ＲＴ−nested ＰＣＲ法と同じ感度を有し、ＲＴ−nested ＰＣＲ法に比較して、ノロウイルス遺伝子検出のために要する時間が短縮されるという効果を有する。

図１は、ＮＡＳＢＡ−ＲＴ−ＬＡＭＰ法のフロー図において、ＡはＮＡＳＢＡ法の工程、ＢはＲＴ−ＬＡＭＰ法の工程、１は食品の試料の準備の工程、２はＲＮＡの抽出工程、３はＧI用とＧII用を同じマイクロチューブにする工程、４はＮＡＳＢＡ液反応後、プライマー、試料から抽出したＲＮＡの添加工程、５は６５°Ｃで５分、４１°Ｃで５分加温の工程、６はＮＡＳＢＡ酵素液の添加工程、７は４１°Ｃで９０分加温の工程、８は１次増幅産物、９はＧI用とＧII用に別々のマイクロチューブの準備工程、１０は試薬、プライマー、ＮＡＳＢＡ増幅産物の添加工程、１１は６２°Ｃで９０分加温の工程、１２は２次増幅産物、１３は目視判定又は濁度測定の工程、である。

まず、カキの中腸腺を取り出す。取り出し方法は、平成１５年１１月５日付け厚生労働省食安監発１１０５００１号別添「ノロウイルスの検出法」２ページ〜３ページ記載の方法に準じる。

次に、ＱＩＡamp Viral RNA Mini キットを用いて、ノロウイルスＲＮＡを抽出する。抽出方法は、平成１５年１１月５日付け厚生労働省食安監発１１０５００１号別添「ノロウイルスの検出法」４ページ〜６ページ記載の方法に準じる。

そして、ＮＡＳＢＡ法でカキのノロウイルス遺伝子を１次増幅させる。このＮＡＳＢＡ法に使用する試薬は、ＮＡＳＢＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ キット（株式会社カイノス社）を使用する。

使用するマイクロチューブについては、ノロウイルスの遺伝子グループである ジェノグループI（ＧI）とジェノグループII（ＧII）を同時に同じマイクロチューブで増幅する。

ＮＡＳＢＡ法でのカキのノロウイルス遺伝子を一次増幅する方法は、ＮＡＳＢＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ キット（株式会社カイノス社）添付の使用説明書に準ずる。但し、ノロウイルスの遺伝子グループであるジェノグループI（ＧI）とジェノグループII（ＧII）を同時に同一のチューブで増幅すること、本発明の表１に記すプライマーを本発明の表１に記す濃度になるように添加すること、該使用説明書に記載されている構成試薬の一部であるＮＡＳＢＡコントロールプライマーを用いないことが、該使用説明書の記載内容と異なる。

表１の左欄に記したNo.1乃至No.11の配列は、本発明者が創出したものであり、No.12とNo.13の配列は、Journal of Virological Methods 100巻107ページ 2002年に記載されたものである。

０．２mLのマイクロチューブに、ＮＡＳＢＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ キット（カイノス株式会社）付属のNASBA試薬と該キット付属のNASBA溶解液からなるＮＡＳＢＡ反応液１０μLと表１に記載のNASBA用プライマーを表１に記載の最終濃度になるようにすべて添加する。

該マイクロチューブに、試料であるカキから抽出したRNAを５μLを添加する。ブロックヒーターにて６５°Ｃで５分間加温しＲＮＡの高次構造を解き、該加温後さらにブロックヒーターにて４１°Ｃで５分間加温してプライマーのアーニングを促進させる。その後、４１°Ｃに保持した状態で、NASBA酵素液５μLを添加し、混和した後、ブロックヒーターにて４１°Ｃで９０分間加温し、反応させる。

さらＮＡＳＢＡ法で１次増幅させたカキのノロウイルス遺伝子を、ＲＴ−ＬＡＭＰ法により２次増幅する。
ＲＴ−ＬＡＭＰ法に使用する試薬は、Ｌｏｏｐａｍｐ ＲＮＡ増幅試薬キット（栄研化学株式会社）を使用する。

ＲＴ−ＬＡＭＰ法でカキのノロウイルス遺伝子を２次増幅する方法は、Ｌｏｏｐａｍｐ ＲＮＡ増幅試薬キット（栄研化学株式会社）添付の使用説明書に準ずる。

但し、該キット添付の使用説明書において、コントロール反応用の試薬及びその用量が、ノロウイルスのであるジェノグループI（ＧI）とジェノグループII（ＧII）に対し同一であることが記載されているが、本発明ＲＴ−ＬＡＭＰ法ではＧI用とＧII用にそれぞれ表２、表３に記載する内容に変更する。

［表２］
（ＧI用試薬）
試薬 用量
２ × Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ．（ＲＭ） １２．５μＬ
ＲＴmate ２．５μＬ
Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ．（ＥＭ） １．０μＬ
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ（ＤＷ） ５．３μＬ

表２に記載した「ＲＴmate」は、ニッポンジーン株式会社の試薬であり、他の試薬はＬｏｏｐａｍｐ ＲＮＡ増幅試薬キット（栄研化学株式会社）添付の試薬である。

［表３］
（ＧII用試薬）
試薬 用量
２ × Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ．（ＲＭ） １２．５μＬ
ＲＴmate ２．５μＬ
Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ．（ＥＭ） １．０μＬ
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ（ＤＷ） ４．３μＬ

プライマーについては、表４に記載のプライマーを添加するが、表４右欄に記載の最終濃度になるように、ＧI用とＧII用のプライマーを添加する。

表４の右欄のNo.2とNo.11の配列は、Journal of Virological Method 100巻、107ページ、2002年に記載されており、No.1、No.3乃至No.10、No.12乃至No.22の配列は本発明者が、Journal of Clinical Microbiology 44巻、1376ページ、2006年で発表したものである。

ジェノグループI（ＧI）とジェノグループII（ＧII）用に準備したマイクロチューブに、ＮＡＳＢＡ法による増幅産物を２μＬずつ添加し、表２と表３に記載している試薬をそれぞれ添加し、表４に記載しているプライマーをそれぞれ最終濃度になるようにすべてのプライマーの添加量を調節する。

該試薬、該プライマー、該ＮＡＳＢＡ増幅産物を加えた後、６２°Ｃの一定温度で９０分間加温する。

該９０分加温後、マイクロチューブを取り出し、マイクロチューブ内の反応液の色がピロリン酸Ｍｇ生成によって透明色から白濁に変わっているかを観察する。ノロウイルス遺伝子が増幅されれば白濁に変化し、ノロウイルス遺伝子が増幅されなければ透明なので、容易にノロウイルス遺伝子の有無を判定することができる。

また、ノロウイルス遺伝子増幅の有無の判定にリアルタイム濁度測定装置（テラメックス株式会社）を用いることもできる。

次に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例により限定されるものでない。

養殖筏からカキを採取し、カキの中腸腺を取り出し、リン酸緩衝液にて１０倍乳剤にして、ポリエチレングリコール６０００で濃縮した後、ＱＩＡamp Viral RNA Mini キット（キアゲン社）によりノロウイルスＲＮＡを抽出した。

ＮＡＳＢＡ法でカキのノロウイルス遺伝子を１次増幅させた。該ＮＡＳＢＡ法の試薬は、ＮＡＳＢＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ キット（株式会社カイノス社）を使用した。

ＮＡＳＢＡ法でのカキのノロウイルスを１次増幅する方法は、ＮＡＳＢＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ キット（株式会社カイノス社）添付の使用説明書に準じて行った。

ノロウイルスの遺伝子グループであるジェノグループI（ＧI）とジェノグループII（ＧII）を同時に同じマイクロチューブで増幅させた。

０．２mLのマイクロチューブに、ＮＡＳＢＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ キット（カイノス株式会社）付属のNASBA試薬と該キット付属のNASBA溶解液からなるＮＡＳＢＡ反応液１０μL添加した。

表１に記載のNASBA用プライマーを表１の右欄に記載の最終濃度になるようにすべて添加した。

濃度が１００μＭのNASBA用プライマーを使用したので、添加するプライマー量は、Ｇ１Ｆ３Ｎ１、Ｇ１Ｆ３Ｎ２、Ｇ１Ｆ３Ｎ３、Ｇ１Ｆ３Ｎ４、Ｇ１Ｆ３Ｎ５、Ｇ１Ｆ３Ｎ６、Ｇ２Ｆ３Ｎ１、Ｇ２Ｆ３Ｎ２、Ｇ２Ｆ３Ｎ３、Ｇ２Ｆ３Ｎ４、
Ｇ２Ｆ３Ｎ５は１マイクロチューブ当り各０．０４μＬ、Ｇ１Ｂ３１Ｔ７、Ｇ２Ｂ３１Ｔ７は１マイクロチューブ当り各０．１μＬで１マイクロチューブ当り合計０．６４μＬを添加した。

該マイクロチューブに、試料であるカキから抽出したRNAを５μLを添加した。ブロックヒーターにて６５°Ｃで５分間加温しＲＮＡの高次構造を解き、該加温後さらにブロックヒーターにて４１°Ｃで５分間加温してプライマーのアーニングを促進させた。その後、４１°Ｃに保持した状態で、NASBA酵素液５μLを添加し、混和した後、ブロックヒーターにて４１°Ｃで９０分間加温し、反応させた。

また、温度調節用機器ブロックヒーターは、アルミブロック恒温槽 クールサーモユニット ＣＴＵ−Ｎ（タイテック株式会社）を使用した。

次に、ＲＴ−ＬＡＭＰ法によりカキのノロウイルス遺伝子を２次増幅させた。
ＲＴ−ＬＡＭＰ法に使用する試薬は、Ｌｏｏｐａｍｐ ＲＮＡ増幅試薬キット（ＲＴ−ＬＡＭＰ）（栄研化学株式会社）を使用した。

ＲＴ−ＬＡＭＰ法でカキのノロウイルス遺伝子を２次増幅方法は、Ｌｏｏｐａｍｐ ＲＮＡ増幅試薬キット（ＲＴ−ＬＡＭＰ）（栄研化学株式会社）添付の使用説明書に準じて行った。

ノロウイルスの遺伝子グループであるジェノグループI（ＧI）用のマイクロチューブとジェノグループII（ＧII）用のマイクロチューブを準備した。該マイクロチューブに、ＧIとＧII別に、それぞれ表２と表３に記す試薬を添加した。

表４に記載するプライマーを表４右欄に記載のそれぞれの最終濃度になるようにＧI用とＧII用のプライマーを添加した。

最終濃度にするために、１００μＭ濃度のプライマーを使用したので、加えるプライマー量は、プライマー別に表5の右欄に記載する量を添加した。

該マイクロチューブにＮＡＳＢＡ法による増幅産物を２μＬずつ添加した。

該試薬、該プライマー、該ＮＡＳＢＡ増幅産物を加えた後、６２°Ｃの一定温度で９０分間加温した。

該９０分加温後、マイクロチューブを取り出し、マイクロチューブ内の反応液の色がピロリン酸Ｍｇ生成によって透明色から白濁に変わっているかを観察した。結果、白濁に変化した場合は、採取したカキには、ノロウイルス遺伝子が含まれていることが確認された。また、ノロウイルス遺伝子の増幅の有無は、リアルタイム濁度測定装置（テラメックス株式会社）によってもノロウイルス遺伝子が確認された。

温度調節用機器ブロックヒーターは、アルミブロック恒温槽 クールサーモユニット ＣＴＵ−Ｎ（タイテック株式会社）を使用した。

食品の中の微量なノロウイルス遺伝子の検出方法として利用できる。

ＮＡＳＢＡ−ＲＴ−ＬＡＭＰ法のフロー図である。 糞便の中のノロウイルス検出結果図である。 カキの中のノロウイルス（ジェノグループI）検出結果である。 カキの中のノロウイルス（ジェノグループII）検出結果である。

Ａ ＮＡＳＢＡ法
Ｂ ＲＴ−ＬＡＭＰ法
１ 食品試料の準備
２ ＲＮＡの抽出工程
３ ＧI用とＧII用を同じマイクロチューブにする工程
４ ＮＡＳＢＡ反応液、プライマー、試料から抽出したＲＮＡの添加工程
５ ６５°Ｃで５分、４１°Ｃで５分加温
６ ＮＡＳＢＡ酵素液の添加工程
７ ４１°Ｃで９０分加温の工程
８ １次増幅産物
９ ＧI用とＧII用に別々のマイクロチューブの準備工程
１０ 試薬、プライマー、ＮＡＳＢＡ増幅産物の添加工程
１１ ６２°Ｃで９０分加温の工程
１２ ２次増幅産物
１３ 目視判定又は濁度測定の工程

Claims (4)

1. 試料中に微量に存在するノロウイルス遺伝子を特異的に増幅するための方法であって，試料中より抽出されたＲＮＡから所定の温度下で核酸を増幅できる第１の方法であるＮＡＳＢＡ法による相補的な１本鎖核酸を得る工程と、第１の方法であるＮＡＳＢＡ法による増幅産物を所定の温度下で核酸を増幅できる第２の方法であるＲＴ−ＬＡＭＰ法により，さらに核酸を増幅する工程と、を含む工程からなることを特徴とするノロウイルス遺伝子検出法。
2. ＮＡＳＢＡ法を用いる工程において、大別されるノロウイルスの遺伝子グループであるジェノグループI(GI)とジェノグループII（ＧII）の遺伝子を同時に同じマイクロチューブで増幅することを特徴とする請求項１に記載のノロウイルス遺伝子検出法。
3. ＲＴ−ＬＡＭＰ法を用いる工程において、ノロウイルスが増幅されたか否かを、核酸増幅工程で生じる白濁を目視で判定すること又は濁度を測定することを特徴とする請求項１に記載のノロウイルス遺伝子検出法。
4. 試料から得た微量のＲＮＡを鋳型にして，ＮＡＳＢＡ法を用いて増幅産物として相補的な１本鎖ＲＮＡを得る工程と、得られた増幅産物を鋳型として，ＲＴ−ＬＡＭＰ法を用いて多量のＤＮＡを得る工程と，を含む工程からなるノロウイルス遺伝子検出法。

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