WO2007055260A1 - 人免疫不全ウイルス－１遺伝子検出又は定量用材料，検出又は定量方法，治療用遺伝子断片，及び治療方法 - Google Patents

人免疫不全ウイルス－１遺伝子検出又は定量用材料，検出又は定量方法，治療用遺伝子断片，及び治療方法 Download PDF

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WO2007055260A1
WO2007055260A1 PCT/JP2006/322336 JP2006322336W WO2007055260A1 WO 2007055260 A1 WO2007055260 A1 WO 2007055260A1 JP 2006322336 W JP2006322336 W JP 2006322336W WO 2007055260 A1 WO2007055260 A1 WO 2007055260A1
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seq
hiv
bases
gene
polynucleotide
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PCT/JP2006/322336
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Tsuguhiro Kaneda
Hiromi Nagai
Yoshifumi Mizuno
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Japan Health Sciences Foundation
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV

Definitions

  • the present invention relates to a human immunodeficiency virus detection or quantification method, a kit used for the detection or quantification, primers and probes used in the kit, a therapeutic gene fragment, and a gene therapy method.
  • HIV Human Immunodefeciency Virus
  • HIV-1 subtype B is the majority.
  • the subtypes other than B, especially HIV-1 CRF01_AE, etc., tend to increase due to diversification of infection routes.
  • AIDS testing methods be able to detect or quantify as many types of HIV genes as possible at the same time, particularly to detect or quantify all of the important subtypes of HIV-1. It has been demanded.
  • HIV antibody testing has been the mainstream in the past. Due to the difficulty of detection in the early stages of infection, the number of tests using HIV gene detection has increased in recent years. ing.
  • the HIV gene can be easily and reliably detected from a very small amount of sample.
  • nucleic acid amplification methods examples include PCR (polymerase chain reaction, Polymerase
  • Infected viral genes (DNA, RNA, provirus, etc.) are amplified by PCR, and then PCR is performed using another primer pair.
  • Nested-real-time PCR method combining nested-PCR method and real-time PCR method (method of performing second PCR by real-time PCR method),
  • Real-time PCR methods include intercalator methods that use a reagent that emits fluorescence by binding to double-stranded DNA (inter-first force), a fluorescent substance at one end of the probe, and a quencher (taentia) at the other end.
  • inter-first force a reagent that emits fluorescence by binding to double-stranded DNA
  • fluorescent substance at one end of the probe
  • quencher quencher
  • Nested real-time PCR requires two pairs of primers to be nested In the case of the method, setting of primers and probes is still more difficult.
  • HIV is a virus that does not have a mutation repair mechanism, and the gene of this virus is very susceptible to mutation.
  • highly conserved regions where mutations are unlikely to occur. If primers and probes are designed in regions that are prone to mutation, mismatches with the target gene frequently appear, and the HIV gene cannot be reliably amplified and detected, leading to the risk of erroneous test results. Therefore, in order to reliably detect as many subtypes as possible, we found a highly conserved region within and between subtypes, and primers suitable for PCR and real-time PCR within that region. And designing the probe.
  • the present inventors have already studied the HIV-1 DNA quantification method by real-time PCR method or nested-real-time PCR method. For example, primers and probe sequences that can be detected or quantified for subtype B are used. I have succeeded in identifying.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 are all designed based on the gene sequence of subtype B only.
  • subtype B “10 cases of HIV-1 infection patients undergoing HAART suspected of the occurrence of drug resistance mutations”. It is just a design of a primer and probe that finds a region, and that a mutation has occurred.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 above test for infectious HIV viruses of various subtypes before treatment (ie before drug resistance mutation occurs). It's not a good thing to do.
  • Patent Document 1 describes an invention related to primers and probes capable of detecting all subtypes of HIV-1, but the primers and probes of the present application are the basis of design. Regions on the HIV-1 gene are different, and gene detection using these genes is not sufficient in detection sensitivity, and it has not been able to be used for quantification.
  • Non-Patent Document 1 Journal of Virological Methods 124 (2005) 157-165 (Hiromi Nagai, Tsu guhio Kaneda, et al.)
  • Non-Patent Document 2 Microbiol Immunol 48 (10), 767-772, 2004 (Kaoru Wada, Hiromi Nagai, Tsuguhio Kaneda, et al.)
  • Non-patent literature 3 Journal of Japan Society for AIDS (Quarterly) 2002, vol.4, No.4, general presentation No.61 (Hiromi Nagai, Tsujihiro Kanada et al.)
  • Patent Document 1 Japanese Translation of Special Publication 2001-512701
  • the present inventors obtained the plasma of a large number of HIV-1-infected patients for each subtype, extracted RNA from them, and determined their gene sequences. By actually comparing and studying, the inventors succeeded in finding a region in which gene sequences are well conserved within and between subtypes, and arrived at the present invention.
  • the object is to provide a gene detection or quantification method, a therapeutic gene fragment using the probe sequence, a gene therapy method, and the like.
  • A A kind of polynucleotide selected from SEQ ID NOs: 2-9
  • I One or several bases of the polynucleotide of any one of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, and 9 other than the 3 'terminal 3 bases were deleted, substituted, or added Polynucleotide
  • a primer pair for detecting or quantifying human immunodeficiency virus 1 gene which is also a kind of polynucleotide belonging to the following group (I) or (II) and a polynucleotide belonging to the following group (III) or (IV).
  • a probe for detecting or quantifying human immunodeficiency virus 1 gene comprising the following (1) or (2) powerful polynucleotide as a constituent element.
  • a kit for detecting or quantifying a human immunodeficiency virus 1 gene comprising at least one of the following (A) to (C):
  • a method for detecting or quantifying a human immunodeficiency virus 1 gene comprising using at least one of the following (A) to (D):
  • a gene fragment for treating human immunodeficiency syndromes which is also a kind of polynucleotide belonging to the following groups (I) to (VI).
  • a method for treating human immunodeficiency syndrome comprising using one of the polynucleotides belonging to the following groups (I) to (VI).
  • Group (I) a polynucleotide in which one or several bases of SEQ ID NO: 2, 3, or SEQ ID NO: 3 other than the 3′-terminal base except for 3 bases are deleted, substituted or added
  • Line number 8 antmmrmgn ntcntcnntn at
  • the detection or quantification method of the present invention using the primer, probe of the present invention or a kit containing them, at least the HIV-1 gene subtype A, B, C, D, subtype recombinant epidemic strain CRF01_AE can be reliably amplified, detected or quantified, and a significant part of the world where infection is prevalent can be detected or quantified.
  • the nested-PCR method and nested-real-time PCR method using two pairs of the primers of the present invention can specifically and accurately measure even a very low copy HIV-1 gene. Indeed, 2 copies of Z10 6 cells and V can achieve tremendous sensitivity.
  • the polynucleotide refers to purine bases such as adenine (A) and guanine (G), pyrimidine bases such as thymine (T), uracil (U) and cytosine (C), and modified bases thereof.
  • purine bases such as adenine (A) and guanine (G)
  • pyrimidine bases such as thymine (T)
  • modified bases thereof As a component, and is a single-stranded or double-stranded DNA, a single-stranded or double-stranded RNA, a hybrid composed of single-stranded DNA and single-stranded RNA, and RNA and DNA bound to each other. It also includes a single-stranded chimera.
  • DNA is suitable as a primer or probe because of the stability of the nucleic acid molecule, etc.
  • Chimeric primer is used for isothermal gene amplification (ICAN method), and a kind of cycling probe method is used for real-time PCR. Chimera Pro A probe is used.
  • RNA is also preferably used in addition to DNA.
  • the “complement” means the same number of bases as a certain polynucleotide and is completely complementary thereto.
  • T in the base sequence is shown for convenience, and means U when the polynucleotide is RNA.
  • Sequence Type is “DNA or RNA”
  • the polynucleotide of the present invention includes not only DNA but also RNA, DNA and RNA chimeras. Similarly, what is indicated as a single strand in the sequence listing may be used as a double strand together with a complementary strand, including a hybrid of DNA and RNA.
  • polynucleotides and their complements are synthesized by humans using a DNA synthesizer or the like in accordance with a conventional method, and a naturally occurring polynucleotide is extracted. Use these methods to delete, substitute, or add part of the base, use a sequence complementary to the target sequence, and synthesize the target sequence using reverse transcriptase, DNA polymerase, RNA polymerase, etc. It can be produced by a method such as modifying the base of the obtained polynucleotide.
  • the base sequence for selection of the HIV-1 gene detection or quantification primer and Z or probe sequence of the present invention consists of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1. This region corresponds to the sequence 1234 to 1423 in the gag region of the experimental HIV-1 gene (HXB2). Since the gag region is an indispensable region for the survival of the HIV-1 gene, it is suitable as a common indicator for detecting or quantifying HIV-1 genes of all subtypes that originally have few mutations. However, there are no mutations in the gag region.
  • a primer or probe used for detection or quantification of the HIV-1 gene is mismatched at least at the 3 'end so that it can be recognized by DNA polymerase in order to achieve its original purpose as a primer or probe. It is necessary to bind to the target HIV-1 gene.
  • the region to be selected as a primer or probe is the primer It is important that at least a few bases of 3 'terminal force in the region selected as a probe should be set in the region without any mutation, even in any variant of the HIV-1 gene.
  • two pairs of primers are selected if they are only primers, or if probes must be selected at the same time, each of them must be set to a non-mutated region. . For this reason, determining primer and probe sequences is a difficult and difficult task.
  • the present inventors include many regions (no mutations and regions) that are stably conserved between all subtypes or within subtypes, and two pairs of primer sets.
  • a selection base that succeeds in identifying a region of moderate length that can also identify lobes at the same time, and is suitable for selecting multiple primers, probes, etc. An array was used.
  • HIV-1 a linear single-stranded RNA consisting of 9719 bases.
  • the genetic information of the HIV-1 gene is contained in approximately lOkb of RNA.
  • gag a type of structural genes common to retroviruses
  • poll a type of structural genes common to retroviruses
  • env a type of structural genes common to retroviruses
  • regulatory genes are also encoded. These regulatory genes are differentiated from HIV-2.
  • HIV-1 gene refers to the full-length HIV-1 messenger RNA (mRNA) which is the main body of the HIV-1 genome in a virus particle, and the following (1) to (5 ) Also means
  • mRNA transcribed from provirus full-length mRNA used in genome and mRNA derived from accessory gene
  • (2) to (5) are important for the diagnosis of AIDS, and the measurements (4) and (5) are particularly important. This is because unless the HIV-1 gene is incorporated into the host cell genome as a provirus, AIDS is unlikely to develop.
  • Subtypes are those in which the base sequences form an independent cluster on the genetic lineage and are genetically equidistant from each other. Viruses that have undergone genetic alteration between HIV subtypes have become local epidemics.
  • HIV-1 includes group M (Main) consisting of 9 subtypes such as A, ⁇ , C, D, F, G, ⁇ , J, ⁇ , etc., Group 0 (Outlier), Group N (New) CRFOLAE, CRF02— AG, CRF03— AB, CRF04— cpx, CRF05— DF, CRF06— cpx, CRF07 — BC, CRF08— BC, CRF09— cpx, CRF10— CD, CRF11 — Cpx, CRF12—BF, CRF13—cpx, CRF14.BG, CRF15_01B, CRF16_A2D, etc. are known.
  • the gene region that is the basis of the primer and probe of the present invention is conserved beyond the differences in subtypes and without being affected by force or mutation within the subtypes. It is expected to play an important role in virus survival. Therefore, it is considered that the primer and probe of the present invention are useful for detection or quantification of all subtypes of HIV-1.
  • a primer is a short polynucleotide fragment of 20 to 30 bases used for enzymatically replicating (or amplifying) a polynucleotide.
  • Nucleic acid amplification methods mainly PCR and ICAN Is used to increase the number of polynucleotides such as DNA and RNA, and has a base sequence that complementarily binds to both ends of the portion to be increased.
  • Primers used in the PCR method include a primer that binds to the 3 ′ side of one polynucleotide strand and a primer that binds to the 3 ′ side of the other strand during the PCR amplification reaction. 1 (also called sense primer), reverse primer (also called antisense primer), etc.
  • the primer of the present invention is also a kind of polynucleotide selected from the following.
  • Tm 50-60 ° C
  • the polynucleotides of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, and 8 are n (where n is a, t (u), Either g or c base may be used It shows that. ).
  • fixed sites other than n are sites in which mutations have been disabled in the HIV-1 gene of every patient investigated by the present inventors. Therefore, it is highly possible that the polynucleotides of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, and 8 to which these are immobilized can detect or quantify the HIV-1 gene in patients of all subtypes.
  • those satisfying at least one of the conditions (1) to (6) are preferred.
  • Group (I) can be used as a primer in a normal PCR method, and can be suitably used as a primer for pre-quantification in a nested-real-time PCR method.
  • sequence of group (I) is a sequence designed to be almost the same as the nucleotide sequence 1234 to 1256 of HXB2 which is an HIV-1 laboratory strain, and its 3 'end Polynucleotides with one or several bases deleted, substituted, or added among other bases except 3 bases. Polynucleotides found in plasma RNA of various subtypes of HIV-1-infected patients. Designed on the basis of nucleotides.
  • All of this group (I) has the same sequence as the HXB2 gene, in which 3 bases from the 3 'side are in the form of a saddle, and are well conserved in multiple subtypes. This feature ensures that the double-stranded DNA that will be the starting sample for the PCR method will hybridize to a gene strand that has a complementary sequence to the HXB2 gene sequence that is a cocoon-shaped DNA. The primer is recognized and the DNA amplification reaction proceeds.
  • a preferred primer is a polynucleotide in which one or several bases are deleted, substituted or added among SEQ ID NO: 3 or other bases except the 3 'terminal 3' end, and the above (1 ) To (6) satisfying at least one of the conditions, and a particularly preferred primer is a primer comprising a polynucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Group (II) can be used as a primer in a normal PCR method, and can be suitably used as a primer in real-time PCR after pre-quantification in a nested-real-time PCR method.
  • the sequence of group (II) is the nucleotide sequence from positions 1285 to 1304 of HXB2 which is an HIV-1 laboratory strain And a polynucleotide in which one or several bases are deleted, substituted or added among the other bases except for the 3 'terminal 3 bases. Designed based on the polynucleotides found in plasma RNA of various subtypes of HIV-1-infected patients. All of these groups ( ⁇ ) have the same sequence as the HXB2 gene, in which 3 bases from the 3 'side are ⁇ -shaped, and are well conserved among multiple subtypes.
  • This feature ensures that the primer can be hybridized to the gene strand that has a complementary sequence to the HXB2 gene sequence, which is the saddle-shaped DNA, of the double-stranded DNA that will be the starting sample for PCR. Recognized reliably and DNA amplification reaction proceeds.
  • a preferred primer is a polynucleotide in which one or several bases are deleted, substituted or added among SEQ ID NO: 5 or other bases except for the 3 'terminal 3' end, and the above (1 ) To (6) satisfying at least one of the conditions, and a particularly preferred primer is a primer comprising a polynucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 5.
  • Group (III) can be used as a primer in a normal PCR method, as well as a primer in a nested real-time PCR method and in a real-time PCR after pre-quantification.
  • the sequence of group (III) is a sequence designed to be almost complementary to the 1375th to 1394th base sequence of HXB2 which is an HIV-1 laboratory strain, and its 3 'terminal 3 Polynucleotides with one or several bases deleted, substituted, or added among other bases except bases, which are polynucleotides found in plasma RNA of various subtypes of HIV-1-infected patients. It was originally designed.
  • the 3 bases from the 3 'side are the same sequence as the HXB2 gene, which is a saddle type, and are well conserved in multiple subtypes.
  • a preferred primer is a polynucleotide in which one or several bases are deleted, substituted or added among SEQ ID NO: 7 or other bases other than the 3 ′ base at the 3 ′ end.
  • a primer that satisfies at least one of the conditions (6) to (6) and that is particularly preferable is a primer comprising a polynucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 7.
  • Group (IV) can be used as a primer in a normal PCR method, and can be suitably used as a primer for pre-quantification in a nested-real-time PCR method.
  • the sequence of group (IV) is a sequence designed to be almost complementary to the nucleotide sequence from 1402 to 1423 of HXB2 which is an HIV-1 laboratory strain, and its 3 'terminal 3 Polynucleotides with one or several bases deleted, substituted, or added among other bases except bases, which are polynucleotides found in plasma RNA of various subtypes of HIV-1-infected patients. It was originally designed.
  • the 3 bases from the 3 'side are the same sequence as the HXB2 gene, which is a saddle type, and are well conserved in multiple subtypes. This characteristic ensures that the double-stranded DNA that is the starting sample for PCR will hybridize to the gene strand that has the same sequence as the HIV-1 gene, and this primer will be recognized by the thermostable DNA polymerase.
  • the DNA amplification reaction proceeds.
  • a preferred primer is a polynucleotide in which one or several bases of SEQ ID NO: 9 or other bases other than the 3 ′ terminal 3 base are deleted, substituted, or added. ) To (6) satisfying at least one of the conditions, and a particularly preferred primer is a primer comprising a polynucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 9.
  • a probe also called a searcher in Japanese, is a polynucleotide that forms a double-stranded structure with the target gene through the joining of complementary bases. It is necessary for the nucleic acid fragment used to search for the target gene. Accordingly, a label such as a fluorescent substance is bound.
  • TaqMan type probe is a term widely used as a probe with a structure represented by "TaqMan probe TM”. Therefore, it is a probe suitable mainly for real-time PCR.
  • the length of the base sequence of the polynucleotide used for the TaqMan type probe of the present invention is usually 20-40, preferably 22-40. Specific examples include the following groups (V) or (VI).
  • Group (V) One or several bases of SEQ ID NO: 10, 11, or SEQ ID NO: 11 other than 3 bases at the 5 ′ end are deleted, substituted or added.
  • polynucleotides in which one or several bases have been deleted, substituted or added those that satisfy at least one of the following conditions, which are general design conditions for probes: preferable.
  • the total length is shorter than 40 bases.
  • the polynucleotide of SEQ ID NO: 10 is a region where there is an example of mutation in the HIV-1 gene of an actual patient, where n is any of a, t (u), g, c It indicates that it may be a base.) In other words, fixed sites other than n are sites in which mutations have been disabled in the HIV-1 gene of all patients investigated by the present inventors. Therefore, it is highly possible that the polynucleotide of SEQ ID NO: 10 to which these are immobilized can detect the HIV-1 gene in patients of all subtypes. Of these polynucleotides, those satisfying at least one of the above conditions (1) to (6) are preferred.
  • the sequence of this group (V) is a sequence designed to be almost complementary to the nucleotide sequence from 1309 to 1338 of the HXB2 gene, which is an HIV-1 laboratory strain, and its 5 'end.
  • the other bases excluding these 3 bases, it is a polynucleotide in which one or several bases are deleted, substituted or added, and is found in plasma RNA of various subtypes of HIV-1-infected patients. It is designed based on the polynucleotide.
  • all 3 bases from at least 5 '(3' on the corresponding HXB2 gene) are conserved in all subtypes of HIV-1 If it is complementary to the sequence, it has the same characteristics.
  • a probe using one of the polynucleotides selected from the group (V) or (VI) recognizes the TaqMan probe reliably with an enzyme power having thermostable polymerase activity such as TaqDNA polymerase, By exonuclease activity, the fluorescent substance and the quenching substance can be separated by decomposing one base at a time from the 5 'side of the probe (3' side on the corresponding HXB2 gene).
  • a preferred probe is a polynucleotide in which one or several bases of SEQ ID NO: 11 or other bases other than 3 bases at the 5 'end are deleted, substituted or added, and the above (1 ) Those satisfying at least one of the conditions (6) to (6), or their complements, and particularly preferably, the probe is a probe comprising a polynucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 11 or its complement.
  • the fluorescent material is sometimes referred to as a reporter fluorescent material.
  • the quenching substance is sometimes called a Taentia substance or the like.
  • the binding position of these substances to the probe is not particularly limited, but usually the reporter fluorescent substance force S is attached to one end (preferably the 5, end) of the oligonucleotide part of the probe and the quencher fluorescent substance is attached to the other end.
  • the TaqMan type probe emits light by fluorescence resonance energy transfer even when irradiated with excitation light when the fluorescent substance bound to one end is present in the vicinity of the quenching substance bound to the other end. It is suppressed.
  • the annealing step after the specific hybridization to the target gene, when the DNA strand elongation reaction is initiated from the primer side, the 5 ' ⁇ 3' exonuclease of TaqDNA polymerase.
  • TaqMan type hybridized in a cage shape by activity Eve probes are disassembled in order of 5 'side force. That is, the fluorescent substance and the quenching substance are released, and the suppression by the quenching substance is released, and the fluorescence is emitted.
  • the amount of luminescence accurately reflects the amount of gene amplification.
  • luminescence occurs only when hybridized to a correctly amplified target gene. Then, by observing the change in the amount of light emitted over time, the state of amplification of the target sequence can be examined in real time.
  • fluorescent substances and quenching substances those which can be used in commercially available real-time PCR kits. Specific examples include the following.
  • fluorescent substance examples include fluorescent dyes such as fluorescein fluorescent dyes such as FAM (6-carboxyfluorescein).
  • quenching substance examples include fluorescent dyes such as rhodamine fluorescent dyes such as TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine).
  • the primers, probes, kits, etc. of the present invention described above are used as primers, probes, kits using them in known gene detection or quantification methods. A method is mentioned.
  • PCR method see EP2003 62 etc.
  • NASBA method see EP329822 etc.
  • TAS method see WO88 / 10315 etc.
  • LAMP method Nucleic Acids Research, 2000, Vol.28, NO.12, Eiken Chemical Co., Ltd.
  • TRC method Analytical Biochemistry 314 (2003) 77-86, Tosoh Corporation
  • DNA polymerase with exchange activity BcaBEST TM DNA polymerase
  • RNase H RNase H (RNas that specifically cleaves only double-stranded RNA strand mixed with RNA and DNA e H) 2 types of enzymes and a chimeric primer that has both RNA and DNA partial strength etc.
  • 1ZS 10 amplification method ICAN method: Isothermal and Cnimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids, Takarabio
  • nucleic acid amplification method see EP2003 62 etc.
  • NASBA method see EP329822 etc.
  • TAS method see WO88 /
  • improved PCR methods include real-time PCR, nested-PCR, nested-real-time PCR (high-sensitivity real-time PCR), and reverse transcription of viral RNA into cDNA prior to PCR.
  • the method etc. which combined the process are mentioned.
  • Real-time PCR methods include an intercalator method that uses a reagent that emits fluorescence by binding to double-stranded DNA (intercalator), or a fluorescent substance at one end of the probe and a quencher (taentia) at the other end.
  • intercalator a reagent that emits fluorescence by binding to double-stranded DNA
  • quencher quencher
  • TaqMan probe method using TaqMan type probe cycling probe method using DNA and RNA chimeric probe, etc.
  • TaqMan probe method is used as a real-time PCR method. Nested real-time PCR is optimal in terms of detection and quantitative sensitivity.
  • the PCR method is a well-known method, and it repeats in vitro a DNA amplification reaction with two kinds of primers sandwiching a specific DNA region and a DNA polymerase, and the specific DNA region can be easily converted to several thousand in a short time. It is a method of amplifying 10,000 to 100 million times.
  • the nested-PCR method is a known method.
  • Nested-PCR is a method of performing two-step PCR using two primer pairs.
  • Primer pair used for PCR to amplify the target gene region one pair of forward primer and reverse primer set
  • a primer pair that further specifically amplifies the DNA amplified in the first step by setting a forward primer and a reverse primer inside the primer position used for amplification of the first target gene region.
  • This two-step PCR-based amplification makes it possible to more specifically amplify only the specific sequence DNA in the target gene from the PCR product (target gene + non-specific product) amplified in the first PCR reaction. is there.
  • Real-time PCR is a known gene amplification method that monitors the increase in PCR amplification products in real time and performs quantification in the exponential function amplification region.
  • Non-Patent Document 2 Microbiol Immunol 48 (10), 767-772, 2004 (Kaoru Wada, Hiromi Nagai, Tsuguhio Kaneda, et al.) And “Takara Bio Real-Time PCR Practice Guide First Real-Time PCR 0412V20J”.
  • thermostable DNA polymerase such as Taq DNA polymerase
  • a thermostable DNA polymerase such as Taq DNA polymerase
  • the DNA polymerase cannot recognize the TaqMan type probe and the probe does not decompose. The luminescence of the reporter substance remains suppressed.
  • a control solution such as ⁇ 2 microglobulin ( ⁇ 2 ⁇ ) with a pre-partitioned DNA concentration and an HIV-1 gene solution with a pre-participated DNA concentration are serially diluted. Then, draw an amplification curve for each. If the initial amount of DNA is large, the amplification intensity rises quickly because the fluorescence intensity becomes detectable in a small number of cycles.
  • the initial amount of the target gene can be calculated based on the Ct value of the target gene.
  • This real-time PCR method is compared to the conventional method of confirming a PCR amplification product after completion of the reaction.
  • the nested real-time PCR method is a known method, in which the gene amplified by the first PCR is quantified by the real-time PCR method. Details are described, for example, in the above-mentioned “Non-patent Document 1” Journal of Virological Methods 124 (2005) 157-165 (Hiromi Nagai, Tsuguhio Kaneda, et al.). Since this method is also a type of nested-PCR method, (1) a primer pair used for PCR for pre-quantification gene pre-quantification, and (2) a primer used for gene amplification before quantification. A primer pair for PCR (real-time PCR) is required to determine the amount of gene after pre-quantification amplification set further inside than the position. As the detection or quantification probe, the above TaqMan type probe is used.
  • Quantification of the HIV-1 gene using the nedted-real-time PCR method can be specifically performed according to the following procedure, for example (see Fig. 2).
  • the gene amplification rate of (7X6) is a value common to the HIV-1 gene, the amount of (1) of the HIV-1 gene is divided by this amplification rate to obtain the original HIV- 1 Gene amount can be calculated.
  • This nested real-time PCR method has the advantages of the above-described nested-PCR method and real-time PCR method.
  • the PCR method is preferred.
  • -PCR method and nested-real-time PCR method are preferred, especially nested-real-time PCR method.
  • the kit of the present invention contains at least one kind of the primer, primer pair, or probe of the present invention.
  • at least one pair of primers is required.
  • this primer pair does not necessarily have to be the primer pair of the present invention, and one of the primer pairs may be the primer of the present invention. included.
  • the primer may not be the primer of the present invention.
  • one kind of polynucleotide belonging to the group (I) or (II) and one kind of polynucleotide belonging to the group (III) or (IV) may be used. Yes, any combination is acceptable.
  • a nested-PCR method such as a nested-real-time PCR method
  • two primer pairs are required. That is, as a first step, a primer pair used when a target gene sequence is previously amplified by PCR and a primer pair used for real-time PCR as the second step.
  • a primer pair used for real-time PCR it is necessary to amplify in a wider region than the target gene sequence to be amplified in the second stage. Therefore, one pair for the first stage is a primer pair that is a kind of group (I) and one kind of group (IV), and another pair for the second stage is one kind of group (II) and group (III). It is preferable to be a kind of power primer pair!
  • Groups (I) to (IV) in the present invention are designed using gene regions that are sequentially matched in the order of 5 ′ ⁇ 3 ′ of the HIV-1 gene region (see FIG. 1). Therefore, the loops (I) and (IV) are designed based on the outer region of the HIV-1 gene than the groups ( ⁇ ) and (III).
  • the kit of the present invention may contain an enzyme having a thermostable polymerase activity and a buffer solution.
  • Taq DNA polymerase As an enzyme having thermostable polymerase activity, Taq DNA polymerase and the like are preferable.
  • TaqDNA polymerase is a purified enzyme from Thermus aquaticus TY1 strain collected from the hot springs of Yellowstone National Park in 1976. The biggest feature of this enzyme is a reaction indication temperature of 70-80 degrees. Therefore, it is widely used as an enzyme suitable for PCR.
  • This Taq DNA polymerase has a function of synthesizing single-stranded DNA into a cage and synthesizes the opposite strand by 5 'force or 3' force.
  • TaqDNA polymerase is characterized by having exonuclease activity simultaneously with polymerase activity. For this reason, TaqDNA Polymerase is a simple PCR amplification reaction.
  • thermostable polymerase activity include, but are not limited to, other Thermus species such as Thermus tnermophilus, Anrmus filiformis and Thermus flavis (Thermus flavus) is also available. In addition, it may be obtained from Thermococcus literalis, Pyrococcus foriosus, Thermotoga sp., Etc.
  • Non-Patent Document 1 As a buffer used in the kit for detecting or quantifying HIV-1 gene of the present invention, those used for Taq DNA polymerase (Product No. 1 146 165, Roche) and the like can be used. Specific buffer compositions include 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 1.5 mM MgC12, 50 mM KC1, etc. (Non-Patent Document 1, 2.materials and methods)
  • Samples that can be measured by the primer, probe, or kit of the present invention include body fluids such as plasma, serum, whole blood, cerebrospinal fluid, and semen, as well as cells and tissues.
  • body fluids such as plasma, serum, whole blood, cerebrospinal fluid, and semen
  • HIV is detected or quantified as RNA.
  • cDNA that has been reverse transcribed by the reverse transcriptase of HIV virus itself, provirus that has been incorporated into the genome of the cell, or mRNA that has been transcribed from provirus is used.
  • HIV is detected or quantified.
  • the total amount of reverse transcribed cDNA and provirus in the cell is measured as an example.
  • HIV When HIV is infected, it can enter host target cells by the following steps, which can contribute to acquired immune deficiency syndrome (AIDS).
  • AIDS acquired immune deficiency syndrome
  • the HIV virus has repeatedly proliferated, and after a long period of about 10 years,
  • the pathophysiology has been ascertained based on the amount of viral RNA in the blood and the number of CD4-positive T lymphocytes.
  • intracellular provirus is measured, and provirus is also available.
  • provirus is also available.
  • the detection or quantification method of the present invention is a suitable method for measuring a small amount of cDNA or provirus in a cell.
  • the primers of the present invention, a probe, or a kit or the like using, as measured by ne Sted- real time PCR method the detection limit is less than 2 copies / 10 6 will leave the cells, tremendous sensitivity can be achieved.
  • the gene fragment for treatment of human immunodeficiency syndrome which is also a kind of polynucleotide belonging to the groups (I) to (VI) of the present invention, is due to RNA interference (RNAi) using an antisense reagent or small interfering RNA (siRNA). It can be used for gene therapy of AIDS as a partial structure of [0097]
  • the gene form of the therapeutic gene fragment may be DNA, RNA, plasmid, virus vector, etc., and may be single-stranded or double-stranded. At this time, the DNA can be incorporated into a vector for producing siRNA.
  • a method of directly administering the expression plasmid into the muscle (DNA vaccine method), a ribosome method, a lipofectin method, a microinjection method, a calcium phosphate method, an electopore position method, etc. are exemplified.
  • the ribosome method is preferred.
  • virus used for the virus vector examples include retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, box virus, poliovirus, and simbis virus.
  • retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, vaccinia viruses, etc. are preferred, especially adenoviruses.
  • the gene In order to actually treat and treat a gene as a medicine, in addition to the “in vivo method” in which the gene is directly introduced into the body, the gene is introduced into a cell collected from a human, and then the gene-introduced cell.
  • the ex vivo method There is an “ ex vivo method” that returns the body to the body [Nikkei Science, April 1994, 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36 (1), 23-48 (1994), Experimental Medicine Extra Number, 12 ( 15), (1994), and their cited references, etc.] are preferred because the in vivo method is less expensive and easier, and the ex vivo method is more efficient in introducing genes into cells. This is preferable.
  • an appropriate route of administration can be selected according to the disease or symptom to be treated.
  • the administration route include vein, artery, subcutaneous, intradermal, intramuscular and the like.
  • it can be in the form of a preparation such as a liquid.
  • various components that are commonly used in injections and the like as required by the form of injections containing genes.
  • ribosomes or membrane fusion ribosomes containing genes such as Sendai virus (HVJ) —ribosomes
  • suspensions such as Sendai virus (HVJ) —ribosomes
  • freezing agents centrifugal concentrated freezing agents, etc. It can be used as a form of ribosome preparation.
  • StemSep targets proteins expressed on the surface of cells to be removed, binds antibodies against them to magnetic colloids, traps them on a column set in a magnet, and removes unwanted cells from the cell solution. In this method, only the target cells are concentrated and recovered.
  • StemSep reagent is a set of removed antibodies and magnetic colloids that bind to cells.
  • a StemSep reagent for human cells use a Tetrameric Antibody Complex cocktail and a magnetic colloid set.
  • Heparin or EDTA ethylene-diamine-tetraacetic acid
  • EDTA ethylene-diamine-tetraacetic acid
  • CD4 + enrichment cocktail primary antibody, STS-14052 (StemSep, manufactured by Veritas)
  • STS-14052 StemSep, manufactured by Veritas
  • Table 1 shows the composition of the PCR reaction solution of the real-time PCR method.
  • Standard piasmid is used as a control for quantification.
  • Table 2 shows an example of a sheet filled with the results of ⁇ 2 ⁇ copy number measurement.
  • B2M B2M X 25 Total j8 2M copy number in extracted DNA
  • HIV-1 DNA amplification primers [0121] HIV-1 DNA amplification primers:
  • Table 3 shows an example of a sheet for entering the amount of DNA used for the pre-quantification amplification reaction. [0124] [Table 3]
  • Amount of DNA used DNA volume / z used in the PCR reaction before quantification 1)
  • Water vol DDW amount for adjusting the sample amount to 60 ⁇ 1 1)
  • Table 4 shows the PCR Mixture.
  • Calibration curve ⁇ ⁇ /,,, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 1 copy / 2 ⁇ 1 pGEM- ⁇ 2 ⁇ Standard plasmid is used as a control for quantification.
  • the composition of the reaction solution is the same as (3).
  • Table 6 shows an example of a sheet filled in as a result of ⁇ 2 ⁇ copy number measurement after the pre-quantification amplification reaction.
  • Use B2M copy number Use cell number X 2
  • Total B2M-amp B2M-ampQ X 50
  • Total amplification rate of B2M gene amplified by PCR before quantification Total B2M amp / number of B2M copies used
  • TaqMan probe ⁇ ti column number 11
  • Standard piasmid is used as a control for quantification.
  • Table 8 shows an example of a sheet filled in as a result of HIV-1 DNA copy number measurement after amplification reaction before quantification.
  • HIV-ampQ Before quantification After PCR HIV copy number measurement
  • HIV-l DNA amp HIV-ampQ X 50 Total number of HIV-1 DNA amplified by PCR before quantification
  • Original HIV-l DNA HIV-l DNA / amplification rate HIV-1 DNA copy number originally present in extracted DNA HIV-1 DNA: Original HIV-1 DNAX 1000000 / used cells 10 6 HIV-1 DNA copies in 6 cells
  • Example 1 In order to compare the usefulness of the primer and probe of the present invention (Example 1) with the primer and probe developed for known subtype B (Comparative Example 1), HIV-1 of patients belonging to subtype A The result of having performed detection and quantification of a gene is shown.
  • A1 DNA concentration 49 ⁇ ⁇ / / ⁇ 1
  • A2 DNA concentration 45 ⁇ ⁇ / / ⁇ 1
  • A3 DNA concentration 45 ⁇ ⁇ / / ⁇ 1
  • Pan-HIV-1 method and Sub-B method had extremely different PCR starting positions. For example, when the copy number of specimen A1 was 10 8 copies, the Pan-HIV-1 method started at the 10th cycle, but the Sub-B method started at the 30th cycle. This means that 2 2Q differs by the number of PCRs, and when converted to PCR products, the difference is 1000000 times.
  • Pan-HIV-1 method and Sub-B method had extremely different PCR starting positions. For example, when the copy number of specimen A1 was 10 8 copies, the Pan-HIV-1 method started at the 10th cycle, but the Sub-B method started at the 30th cycle. This means that 2 2Q differs by the number of PCRs, and when converted to PCR products, the difference is 1000000 times.
  • Pan-HIV-1 method and Sub-B method had extremely different PCR starting positions. For example, when the copy number of specimen A1 was 10 8 copies, the Pan-HIV-1 method started at the 10th cycle, but the Sub-B method started at the 30th cycle. This means that 2 2Q differs by the number of PCRs, and when converted to PCR products, the difference is 1000000 times.
  • Table 10 and Fig. 10 show the results of the measurement performed multiple times (5 times) by the invention method (Pan-HIV-1 method).
  • Table 11 and FIG. 11 show the results of measurement performed multiple times (5 times) by the invention method (Pan-HIV-1 method).
  • Ave. in the table is the average value of 5 times
  • SD is the dispersion of the measured value of 5 times (standard deviation)
  • Table 12 and Fig. 12 show the results of multiple measurements (five times) by the known literature method (Sub-B method).
  • Table 13 and Fig. 13 show the results of measurements performed five times (five times) by the known literature method (Sub-B method).
  • Table 14 and Fig. 14 show the results of multiple measurements (5 times) by the known literature method (Sub-B method).
  • the number without an underline indicates the copy number of the standard, and the number with an underline indicates the copy number of the subtype A sample.
  • Example 2 In order to compare the usefulness of the primer and probe of the present invention (Example 2) with the primer and probe developed for known subtype B (Comparative Example 2), HIV-1 of patients belonging to subtype B The result of having performed detection and quantification of a gene is shown.
  • B1 DNA concentration 31 ⁇ ⁇ / / ⁇ 1
  • B2 DNA concentration 20 ⁇ ⁇ / / ⁇ 1
  • the present invention method (Pan-HIV-1 method) and known literature procedure (Sub-B method) using, with from 10 8 to 10 copies / assay, performed real-time PCR simultaneously judged rise of PCR reactions at a sigmoidal curve.
  • Pan-HIV-1 method and Sub-B method had almost the same starting position of PCR.
  • Sub-type B samples may be measured with similar values for both Pan-HIV-1 and Sub_B methods. This is a natural result because the Sub-B method uses a primer and a probe developed for detection or quantification of subtype B.
  • Pan-B method and Sub-B method had almost the same starting position of PCR.
  • Sub-type B samples may be measured with similar values for both Pan-B and Sub-B methods. This too
  • Sub-B method uses a primer and a probe developed for the detection or quantification of subtype B, it can be said that it is a natural result.
  • Table 17 and Fig. 20 show the results of measurement multiple times (5 times) by the inventive method (Pan-HIV-1 method).
  • Table 18 and Fig. 21 show the results of measurement multiple times (5 times) by the invention method (Pan-HIV-1 method).
  • the number without an underline indicates the copy number of the standard, and the number with an underline indicates the copy number of the subtype B sample.
  • Table 19 and Fig. 22 show the results of multiple measurements (five times) by the known literature method (Sub-B method).
  • Table 20 and Fig. 23 show the results of multiple measurements (five times) by the known literature method (Sub-B method).
  • the number without an underline indicates the copy number of the standard, and the number with an underline indicates the copy number of the subtype B sample.
  • Sub-type B specimens could be measured with extremely good accuracy and reproducibility in both Pan-HIV-1 and Sub-B methods.
  • the present invention method (Pan-HIV-1 method) and known literature procedure (Sub-B method) using, with from 10 8 to 10 copies / assay, performed real-time PCR simultaneously judged rise of PCR reactions at a sigmoidal curve.
  • Pan-HIV-1 method and Sub-B method had extremely different PCR starting positions. For example, when the number of copies of specimen C1 was 10 8 copies, the Pan-HIV-1 method started up at the 10th cycle, but the Sub-B method started up at the 30th cycle. This is the number of PCRs In means that different 2 2 °, the difference 1000000 times when converted by PCR products.
  • Pan-HIV-1 method and Sub-B method had extremely different PCR starting positions. For example, when the number of copies of specimen C2 was 10 8 copies, the Pan-HIV-1 method started up at the 10th cycle, but the Sub-B method started up at the 30th cycle. This means that 2 2Q differs by the number of PCRs, and when converted to PCR products, the difference is 1000000 times.
  • Table 21 and Fig. 29 show the results of measurement multiple times (5 times) by the invention method (Pan-HIV-1 method).
  • Table 22 and Fig. 30 show the results of the measurement performed multiple times (5 times) by the inventive method (Pan-HIV-1 method).
  • the number without an underline indicates the copy number of the standard, and the number with an underline indicates the copy number of the subtype C sample.
  • Subtype C specimens can be measured with very good accuracy and good reproducibility. Came.
  • Table 23 and Fig. 31 show the results of multiple measurements (five times) by the known literature method (Sub-B method).
  • Table 24 and Fig. 32 show the results of multiple measurements (5 times) by the known literature method (Sub-B method).
  • the number without an underline indicates the copy number of the standard, and the number with an underline indicates the copy number of the subtype C sample.
  • Pan-HIV-1 method and Sub-B method had extremely different PCR starting positions. For example, when the copy number of specimen D1 was 10 8 copies, the Pan-HIV-1 method started up at the 10th cycle, but the Sub-B method started up at the 22nd cycle. This means that there are 2 12 differences in the number of PCRs, which is 4000 times the difference in terms of PCR products.
  • Pan-HIV-1 method and Sub-B method had extremely different PCR starting positions. For example, when the number of copies of specimen D2 was 10 8 copies, the Pan-HIV-1 method started up at the 10th cycle, but the Sub-B method started up at the 30th cycle. This means that 2 2Q differs by the number of PCRs, and when converted to PCR products, the difference is 1000000 times.
  • Table 25 and Fig. 38 show the results of multiple (5) measurements using the inventive method (Pan-HIV-1 method).
  • Table 26 and Fig. 39 show the results of measurement multiple times (5 times) by the invention method (Pan-HIV-1 method).
  • the numbers without an underline indicate the copy number of the standard, and the numbers with an underline indicate the copy number of the subtype D specimen.
  • Table 27 and Fig. 40 show the results of multiple measurements (five times) by the known literature method (Sub-B method).
  • Table 28 and Fig. 41 show the results of multiple measurements (5 times) by the known literature method (Sub-B method).
  • the number without an underline indicates the number of copies of the standard, and the number with an underline indicates the number of copies of the subtype D sample.
  • Example 5 Detection and quantification of HIV-1 gene subtype recombinant endemic strain, CRF01_AE
  • the results of detection and quantification of the HIV-1 gene in patients belonging to the subtype yarn and reversible epidemic strain CRF01_AE are shown for comparison with the primers and probes developed in (Fig. 5).
  • CRF0LAE1 DNA concentration 54ng / ⁇ 1
  • CRF0LAE2 DNA concentration 35ng / ⁇ 1
  • the starting position of PCR was different by only 3 cycles. For example, when the number of copies of specimen AE1 was 10 8 copies, the Pan-HIV-1 method started at the 10th cycle, but the Sub-B method started at the 13th cycle. This means 2 3 different things with the number of P CR, the difference between 8 times in terms with PCR products.
  • the Sub-B method delayed the rise of PCR by 12 cycles. For example, when the number of copies of specimen AE2 was 10 8 copies, the Pan-HIV-1 method started at the 10th cycle, but the Sub-B method started at the 22nd cycle. This means that there are 2 12 differences in the number of PCRs, which is 4000 times the difference in terms of PCR products.
  • Table 29 and Fig. 47 show the results of measurement multiple times (5 times) by the invention method (Pan-HIV-1 method).
  • Table 30 and Fig. 48 show the results of multiple (5) measurements using the inventive method (Pan-HIV-1 method).
  • the number without an underline indicates the standard copy number
  • the underlined number indicates the copy number of the recombinant epidemic strain CRF01-AE.
  • Table 31 and Fig. 49 show the results of measurements performed five times (five times) by the known literature method (Sub-B method).
  • Table 32 and Fig. 50 show the results of multiple measurements (5 times) by the known literature method (Sub-B method).
  • the number without an underline indicates the copy number of the standard, and the number with an underline indicates the copy number of the subtype CRF01_AE sample.
  • Samples of 10 copies showed a high value of 16 copies, and samples after force were calculated as a copy number of about 1/4 of the expected value, and the accuracy was as low as 21 to 47%. Therefore, it can be said that it is difficult to accurately measure the CRF01_AE specimen using the Sub-B method primer set and probe.
  • the method of the present invention (Pan-HIV-1 method) using the primer, probe, etc. of the present invention is subtypes A, C, D, and subtype recombinant epidemic strain CRF01_AE, etc., were found to be simultaneously detectable and quantifiable. This means that the detection or quantification method of the present invention is extremely excellent in practice in the sense of preventing omissions due to differences in subtypes.
  • the method of the present invention (Pan-HIV-1 method) using the primer, probe, etc. of the present invention was able to accurately detect and quantify the HIV-1 gene up to about 10 copies / assay with known concentrations.
  • the detection or quantification method of the present invention using the primer, probe of the present invention or a kit containing them, at least a recombinant epidemic strain of subtype A, B, C, D, subtype of HIV-1 gene.
  • CRF01_AE can be reliably amplified, detected or quantified, and a significant part of the world where infection is prevalent can be detected or quantified.
  • the primer of the present invention The nested-PCR method and nested-real-time PCR method using two pairs can specifically and accurately measure even the extremely low-copy HIV-1 gene. Indeed, 2 copies of Z10 6 cells and V can achieve tremendous sensitivity.

Abstract

【課題】現在知られているHIV-1のうち少なくとも２種類以上のサブタイプのウイルスを検出又は定量可能な、プライマー及びプローブ，それらを含む検出又は定量キット，及びそれらを用いた、HIV-1遺伝子の検出又は定量方法，当該プローブ配列を用いた、治療用遺伝子断片，遺伝子治療方法等を提供すること。 【解決手段】配列番号２～９から選択されるポリヌクレオチドの一種からなる、人免疫不全ウイルス－１遺伝子検出又は定量用プライマー，及び配列番号１０～１１から選択されるポリヌクレオチドの一種からなる、人免疫不全ウイルス－１遺伝子検出又は定量用プローブ等によって達成される。

Description

明 細 書
人免疫不全ウィルス一 1遺伝子検出又は定量用材料，検出又は定量方 法，治療用遺伝子断片，及び治療方法
技術分野
[0001] 本発明は、人免疫不全ウィルスの検出又は定量方法，当該検出又は定量に用いる キット，当該キットに用いられるプライマー及びプローブ，及び治療用遺伝子断片，並 びに遺伝子治療方法に関するものである。
背景技術
[0002] 人免疫不全ウィルス： Human Immunodefeciency Virus (以下、 HIVと記載する。 )とは、 後天性免疫不全症候群 (AIDS)の原因となるウィルスである。この HIVとしては、 HIV- 1及び HIV-2の 2つの群が同定されており、特に、世界中で流行している HIV-1は、更 に A, B, C, D, F, G, H, J, K等の 9種類のサブタイプからなるグループ M (Main)と、 グループ 0 (Outlier) ,グループ N (New) ,更には、サブタイプ Aの組み換え流行株で ある、 CRF01_AE等に分類されている。
[0003] 日本においては、 HIV-1のサブタイプ Bが大多数であった力 感染経路の多様化等 によって、 B以外のサブタイプ，特に HIV-1の CRF01_AE等が増加の傾向にある。
[0004] 従って、 AIDSの検査方法においては、一度にできるだけ多くのタイプの HIV遺伝子を 検出又は定量できることが好ましぐ特に、 HIV-1の重要なサブタイプの全てについ て検出又は定量することが求められている。
[0005] ところで、 HIVの検出方法としては、従来 HIV抗体検査が主流であった力 感染初期 には検出が困難である等の理由から、近年では、 HIV遺伝子検出による検査の-一 ズが高まっている。
[0006] 一方、近年の核酸増幅等の技術の進歩により、微量の検体からも、 HIV遺伝子が、簡 単'確実に検出できるようになってきている。
[0007] 核酸増幅法としては、例えば、 PCR法 (ポリメラーゼ連鎖反応法， Polymerase
Chain Reaction, EP200362等参照）や NASBA法（EP329822等参照）， TAS法 (W088 /10315等参照）のほか、等温遺伝子増幅法（ICAN法： Isothermal and Chimeric prime r- initiated Amplification of Nucleic acids,タカラバィォ社）等が挙げられる。
[0008] HIV遺伝子の検出には、これらのうち、主に PCR法が用いられている力 PCR法にも、 色々な種類が開発されて ヽる。
(1)治療過程での感染ウィルス遺伝子の量的な変化を追跡可能なリアルタイム PC R法，
(2)感染ウィルス遺伝子（DNA, RNA,プロウィルス等）を、ー且 PCRで増幅した後に 、更に別のプライマー対によって PCRを行う、 nested-PCR法，
(3) nested- PCR法とリアルタイム PCR法を組み合わせた nested-リアルタイム PCR法（ 二度目の PCRをリアルタイム PCR法で行う方法），
及び、これらに、 PCR法の実施前にウィルス RNAを逆転写する逆転写工程（Reverse Transcription：
RT)を組み合わせた方法等が開発されて！、る。
尚、リアルタイム PCR法には、二本鎖 DNAに結合することで蛍光を発する試薬 (インタ 一力レーター）を用いるインターカレーター法や、プローブの一端に蛍光物質が，他 端に消光物質（タエンチヤー）が結合した TaqManタイプのプローブを用いる TaqMan プローブ法， DNAと RNAのキメラプローブを用いる、サイクリングプローブ法等がある
[0009] これらの PCR法においては、確実に標的 HIV遺伝子（DNA, RNA,プロウィルス等）を 定量し、感染の有無やウィルス量の変化、又は治療効果を正確に把握するために、 ミスマッチの無い、プライマーやプローブの設計が非常に重要な要素となる。
[0010] 特に、プライマーには
(1)標的遺伝子に安定してアニーリングできること (Tm値が適切な範囲である），
(2)プライマー内部やプライマー間に相補的な配列が無ぐ PCRの反応効率が良い こと，
(3)特異性が高ぐ铸型 DNA上にミスプライミングする部位がな 、こと
等が求められる。
そのため、適切なプライマーを選択することは、容易では無い。
[0011] 2対のプライマーを入れ子状 (nested)に設定する必要がある nested-リアルタイム PCR 法の場合には、プライマー，プローブの設定は、尚更困難である。
[0012] し力も、 HIVは変異の修復機構を持たないウィルスであり、このウィルスの遺伝子は、 非常に変異が起こりやすい。一方、変異の起こり難い、いわゆる保存性の高い領域も 存在する。変異のし易い領域にプライマーやプローブを設計すると標的遺伝子とのミ スマッチが頻繁に出現し、 HIV遺伝子を確実に増幅 '検出することができず、誤った 検査結果を導く危険性がある。その為、できるだけ多くのサブタイプを、確実に検出 するためには、サブタイプ内，サブタイプ間の、いずれにおいても保存性が高い領域 を見出し、その領域内に PCR及びリアルタイム PCRに適したプライマーやプローブを 設計する事が必要となる。
[0013] 本発明者等は、既にリアルタイム PCR法や nested-リアルタイム PCR法によって、 HIV- 1DNA定量法の検討を進めてきており、例えばサブタイプ Bについて検出又は定量可 能なプライマー及びプローブ配列を特定することに成功して 、る。
[0014] しかしながら、下記非特許文献 1〜3のプライマー及びプローブは、いずれもサブタイ プ Bのみの遺伝子配列をもとに設計されたものである。しかも非特許文献 3にお 、て は、サブタイプ Bの「薬剤耐性変異の出現が疑われた、 HAART施行中の HIV-1感染 症患者 10症例」 t 、う小さ 、母集団にぉ 、て、変異の生じて 、な 、領域を見出して、 プライマー，プローブを設計したものにすぎな 、。
[0015] 従って、上記非特許文献 1〜3によって開示されたプライマーやプローブは、様々な サブタイプの、しカゝも治療前 (即ち、薬剤耐性変異が生じる前)の、感染 HIVウィルス を検査するためのものとして適して 、るとは言えな 、。
[0016] また、上記特許文献 1では、全てのサブタイプの HIV-1の検出が可能なプライマー， プローブに関する発明が記載されているが、本願のプライマー，プローブとは、設計 のもととなる HIV-1遺伝子上の領域が異なり、またこれらを用いた遺伝子検出におい ては、検出感度が十分とは言えず、まして定量に使用できるようなものではな力つた。
[0017] 非特許文献 1： Journal of Virological Methods 124(2005) 157— 165(Hiromi Nagai , Tsu guhio Kaneda, et al.)
非特許文献 2 : Microbiol Immunol 48(10), 767-772, 2004(Kaoru Wada, Hiromi Nagai, Tsuguhio Kaneda, et al.) 非特許文献 3 :日本エイズ学会誌 (季刊） 2002年， vol.4, No.4,一般演題 No.61(永井 裕美，金田次弘ら）
特許文献 1 :特表 2001—512701号公報
[0018] 一方、様々なサブタイプの患者力 の遺伝子サンプルを入手すること自体、かなり困 難な作業である。従って、プライマーやプローブの設計の実験の多くが、過去に公表 された遺伝子配列をもとに行われているのが実状であり、実際に、あらゆるサブタイプ の遺伝子配列を調査した上で、適切なプライマーやプローブを設計して!/、る例は、 殆ど見られな 、のが現状である。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0019] 本発明者等は、 日本で初めて様々なサブタイプについて、各サブタイプ毎に多数の HIV-1感染患者の血漿を入手し、そこカゝら RNAを抽出し、それらの遺伝子配列を実 際に比較検討することによって、サブタイプ内や、サブタイプ間でも遺伝子配列が良 く保存されている領域を見出すことに成功し、本発明に到達したものであって、その 目的とするところは、現在知られている HIV-1のうち少なくとも 2種類以上のサブタイ プのウィルスを検出又は定量可能な、プライマー及びプローブ，それらを含む検出又 は定量キット，及びそれらを用いた、 HIV-1遺伝子の検出又は定量方法，当該プロ一 ブ配列を用いた、治療用遺伝子断片，遺伝子治療方法等を提供するにある。
課題を解決するための手段
[0020] 上述の目的は、下記 (第 1の発明）乃至 (第 9の発明）等によって達成される。
(第 1の発明）
下記の配列番号 1のポリヌクレオチド力もなる、人免疫不全ウィルス— 1遺伝子の検 出又は定量用プライマー及び Z又はプローブ配列の選択用塩基配列。
配列番号 1
(第 2の発明）
下記 (ァ）又は (ィ)力も選択されるポリヌクレオチドの一種力もなる、人免疫不全ウイ ルス 1遺伝子検出又は定量用プライマー。
(ァ）配列番号 2〜9から選択されるポリヌクレオチドの一種 (ィ）配列番号 3, 5, 7, 9のいずれかのポリヌクレオチドの、 3'末端の 3塩基を除く他 の塩基のうち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
(第 3の発明）
下記グループ (I)又は（II)に属するポリヌクレオチドの一種と、下記グループ (III)又は (IV)に属するポリヌクレオチドの一種力もなる、人免疫不全ウィルス 1遺伝子検出 又は定量用プライマー対。
(第 4の発明）
下記（1)又は（2)力 なるポリヌクレオチドを構成要素として含む、人免疫不全ウィル スー 1遺伝子検出又は定量用プローブ。
(1)下記グループ (V)又は (VI)から選択されるポリヌクレオチドの一種
(2)一端に蛍光物質，他端に消光物質を結合された下記グループ (V)又は (VI)から 選択されるポリヌクレオチドの一種
(第 5の発明）
下記 (A)乃至 (C)の少なくとも 、ずれか一つを含むことを特徴とする、人免疫不全ゥ ィルス 1遺伝子検出又は定量用キット。
(A)第 2の発明に記載のプライマーの少なくとも一種
(B)第 3の発明に記載のプライマー対の少なくとも一種
(C)第 4の発明に記載のプローブの少なくとも一種
(第 6の発明）
下記 (A)乃至 (D)の少なくとも 、ずれか一つを用いることを特徴とする、人免疫不全 ウィルス 1遺伝子の検出又は定量方法。
(A)第 2の発明に記載のプライマーの少なくとも一種
(B)第 3の発明に記載のプライマー対の少なくとも一種
(C)第 4の発明に記載のプローブの少なくとも一種
(D)第 5の発明に記載の検出又は定量用キット
(第 7の発明）
下記 (A)乃至（D)の少なくとも!/、ずれか一つを用い、下記（a)乃至（d)の!、ずれかの 方法を用いることを特徴とする、人免疫不全ウィルス 1遺伝子の検出又は定量方 法。
(A)第 2の発明に記載のプライマーの少なくとも一種
(B)第 3の発明に記載のプライマー対の少なくとも一種
(C)第 4の発明に記載のプローブの少なくとも一種
(D)第 5の発明に記載の検出又は定量用キット
(a) PCR法
(b) Nested- PCR法
(c)リアルタイム PCR法
(d) nested-リアルタイム PCR法
(第 8の発明）
下記グループ (I)乃至 (VI)に属するポリヌクレオチドの一種力もなる、人免疫不全症候 群治療用遺伝子断片。
(第 9の発明）
下記グループ (I)乃至 (VI)に属するポリヌクレオチドの一種を用いることを特徴とする、 人免疫不全症候群の治療方法。
グループ (I) :配列番号 2, 3,又は配列番号 3の、 3 '末端の 3塩基を除く他の塩基のう ち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（II)：配列番号 4, 5,又は配列番号 5の、 3 '末端の 3塩基を除く他の塩基の うち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド グループ (III)：配列番号 6, 7,又は配列番号 7の、 3'末端の 3塩基を除く他の塩基 のうち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド グループ (IV)：配列番号 8, 9,又は配列番号 9の、 3'末端の 3塩基を除く他の塩基 のうち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド グループ (V) :配列番号 10, 11,又は配列番号 11の、 5'末端の 3塩基を除く他の塩 基のうち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド グループ (VI)：グループ (V)の相補体
酉 C列备号 1： cctagaactt taaatgcatg ggtaaaagta gtagaagaga aggctttcag cccagaagtg atac ccatgt tttcagcatt atcagaagga gccaccccac aagatttaaa caccatgcta aacacagtgg ggggacat ca agcagccatg caaatgttaa aagagaccat caatgaggaa gctgcagaat gggatagagt
酉己列番号 2 : ncnanrmcrm tnaatncnnn ggt
酉己列番号 3 : cctagaactt taaatgcatg ggt
目列番号 4 : ccrmanntna tnccnatgtt
目己列！^号 5： ccagaagtga tacccatgtt
目列番号 6 :ttnannatrm gcanngnngc
酉己歹 U番 7 :tttaacattt gcatggctgc
目列番号 8 : antmmrmgn ntcntcnntn at
酉己歹 U番 9 : attctgcagc ttcctcattg at
酉己列番号 10 : atcmmrmgn nnnnnnccnt nngnnanngc
目己列！^号 l l： atcttgtggg gtggctcctt ctgataatgc
発明の効果
[0021] 本発明のプライマー，プローブあるいはそれらを含むキットを用いた本発明の検出又 は定量方法によって、少なくとも HIV-1遺伝子のサブタイプ A,B,C,D,サブタイプの組 換え流行株 CRF01_AEは、確実に増幅，検出又は定量することができ、世界で感染 が流行しているかなりの部分が検出又は定量可能となる。特に、本発明のプライマー を 2対用いた、 nested- PCR法や nested-リアルタイム PCR法によれば、極めて低コピー の HIV-1遺伝子でも、特異的にかつ正確に測定ができる。実に、 2コピー Z106細胞と V、う驚異的な感度を達成することができる。
発明を実施するための最良の形態
[0022] 本発明において、ポリヌクレオチドとは、アデニン (A) ,グァニン (G)等のプリン塩基や 、チミン (T) ,ゥラシル (U) ,シトシン (C)等のピリミジン塩基やそれらの修飾塩基を構 成要素として含むものであり、一本鎖又は二本鎖の DNA,—本鎖又は二本鎖の RNA ,一本鎖 DNAと一本鎖 RNAからなるハイブリッド体， RNAと DNAが結合して一本鎖と なったキメラ体をも含むものである。通常、プライマーやプローブとしては、核酸分子 の安定性の点等から、 DNAが適している力 等温遺伝子増幅法 (ICAN法）にはキメラ プライマー，リアルタイム PCR法のうち一種のサイクリングプローブ法には、キメラプロ ーブが用いられる。また、本発明の AIDS治療用遺伝子断片が、アンチセンス試薬， R NA干渉用試薬として用いる場合には、 DNAの他、 RNAも好適に使用される。
[0023] 本発明において、「相補体」とは、あるポリヌクレオチドと同じ塩基数であって、それと 完全に相補的なものを意味する。
[0024] 尚、本件において、塩基配列中に Tと記載しているのは、便宜的に示したものであつ て、ポリヌクレオチドが RNAの場合には、 Uを意味する。また、配列表において、 Seque nce Typeを「DNA or RNA」と記載しているように、本発明のポリヌクレオチドは、 DNA の他、 RNA, DNAと RNAのキメラの場合も含むものである。同様に、配列表において 一本鎖として表示されているものを、相補的な鎖とともに、二本鎖として用いる場合も あり、これには DNAと RNAのハイブリッドも含まれる。
[0025] これらのポリヌクレオチドやその相補体は、常法に従い、 DNA合成装置等を用いて人 ェ的に合成する，天然に存在するポリヌクレオチドを抽出する，天然力ゝらの抽出ポリ ヌクレオチドの塩基の一部を欠失，置換，付加する， 目的とする配列と相補的な配列 を用い、逆転写酵素や DNAポリメラーゼ， RNAポリメラーゼ等によって目的の配列の ものを合成させる，これらの方法で得られたポリヌクレオチドの塩基を修飾する等の方 法によって製造することができる。
[0026] 《HIV-1遺伝子検出又は定量用プライマー及び Z又はプローブ配列の選択用塩基 配列》
本発明の、 HIV-1遺伝子検出又は定量用プライマー及び Z又はプローブ配列の選 択用塩基配列は、配列番号 1のポリヌクレオチドからなるものである。この領域は、実 験用 HIV- 1遺伝子（HXB2)の gag領域にある、 1234〜1423番目の配列に相当する。 g ag領域は、 HIV-1遺伝子の生存に欠力せない領域であることから、もともと変異が少 なぐあらゆるサブタイプの HIV-1遺伝子を検出又は定量するための共通指標として 適している。し力しながら、 gag領域内にも、変異が無い訳では無い。
[0027] 一方、 HIV-1遺伝子の検出又は定量に用いるプライマーやプローブは、プライマー やプローブとしての本来の目的を達するためには、 DNAポリメラーゼによって認識さ れるように、少なくとも 3 '末端において、ミスマッチ無く標的 HIV-1遺伝子と結合する ことが必要である。つまり、プライマーやプローブとして選択する領域は、プライマー やプローブとして選択する領域のうち少なくとも 3'末端力 の数塩基分が、 HIV-1遺 伝子のあらゆる変異体にぉ 、ても変異の無 、領域に設定されることが重要となる。し カゝも、プライマーだけであればともかぐプライマーを 2対選択する場合や、同時にプ ローブも選択しなければならない場合には、それらのそれぞれについて、変異のない 領域に設定しなくてはならない。このため、プライマーやプローブの配列を決定する ことは、力なり困難な作業を伴うものである。
[0028] 本発明者等は、この gag領域において、あらゆるサブタイプ間やサブタイプ内で安定 して保存されて 、る領域 (変異の無 、領域)を多く含み、しかも 2対のプライマーゃプ ローブも同時に特定できる適度な長さの領域を特定することに成功し、この配列番号 1の約 200塩基の領域を、複数のプライマーやプローブ等を同時に選定するのに適し て ヽる選択用塩基配列とした。
[0029] 《HIV遺伝子》
現在知られている HIVは、 HIV-1と HIV-2の二種に大別される。 HIV-1ゲノムとは、 97 19塩基カゝらなる、直鎖状の一本鎖 RNAである。 HIV-1遺伝子の遺伝情報は、約 lOkb の RNAに含まれている。この中に、レトロウイルスに共通の構造遺伝子として、 gag、 p ol、 envの 3種類の遺伝子がある力 この他に調節遺伝子も数種類コードされている 。これらの調節遺伝子の違いで、 HIV-2と区別される。
[0030] 尚、本発明で言う" HIV-1遺伝子"とは、ウィルス粒子中の HIV-1ゲノムの本体である 全長 HIV-1メッセンジャー RNA (mRNA)の他、下記の (1)〜(5)をも意味するものである
(1)逆転写されつつある一本鎖 DNA
(2)逆転写が完了した、インサート前の二重鎖 DNA
(3)環状二重鎖 DNA
(4)ヒト DNA中にインサートされたプロウィルス
(5)プロウィルスから転写された、 mRNA (ゲノムに利用される全長 mRNAとアクセサリー 遺伝子由来の mRNA)
[0031] 但し、（1)は、本発明のプライマー，プローブ等に対応する領域の合成が終了している 段階にあるもののみが検出又は定量されることとなる。 [0032] 尚、 AIDSの診断としては、このうち、（2)〜(5)が重要であり、特に (4)、（5)の測定が重要 である。 HIV-1遺伝子が、プロウィルスとして宿主細胞のゲノムに取り込まれない限り は、 AIDS発症に至らないと考えられるからである。
[0033] 《サブタイプ》
HIVには、様々なサブタイプがある。サブタイプとは、塩基配列が、遺伝子系統榭上、 独立した一つのクラスターを形成するもので遺伝学的に相互にほぼ等距離 (equidista nt)にあるものを言う。尚、 HIVのサブタイプ間で遺伝子糸且換えが起こったウィルスが、 地域流行株となったものを、 CRFs
、 circulating recombinant forms；糸且換 流 ίτ株)と目つ。
HIV-1としては、 A, Β, C, D, F, G, Η, J, Κ等の 9種類のサブタイプからなるグループ M (Main)と、グループ 0 (Outlier) ,グループ N (New) ,更には、組換え流行株である 、 CRFOLAE, CRF02— AG, CRF03— AB, CRF04— cpx, CRF05— DF, CRF06— cpx, CRF07 — BC, CRF08— BC, CRF09— cpx, CRF10— CD, CRF11— cpx, CRF12— BF, CRF13— cpx, C RF14.BG, CRF15_01B, CRF16_A2D等が知られている。
[0034] 本発明のプライマー，プローブ，キット，又は本発明の検出又は定量方法を使用した 場合には、 HIV-1のサブタイプ Bは勿論のこと、従来法では定量 PCRができていない（ つまりリアルタイム PCRで PCRの立ち上がりサイクル数が極めて遅い事がフルォログラ ムで示される）他のサブタイプの HIV-1のうち少なくとも A, C, D, CRF01_AE等につい ても、リアルタイム PCRの PCR立ち上がりサイクル数が小さぐかつシグモイド曲線を描 くことができることが本発明者等によって今回確認された。
[0035] つまり、本発明のプライマー，プローブの基礎となった遺伝子領域は、サブタイプの 違いを超えて、し力もサブタイプ内の変異等の影響も受けずに保存されており、 HIV- 1ウィルスの生存にとって重要な役割を担っていることが予想される。従って、本発明 のプライマー，プローブは、 HIV-1のあらゆるサブタイプの検出又は定量にも有用で あると考えられる。
[0036] 《プライマー》
プライマーとは、ポリヌクレオチドを酵素的に複製 (又は増幅)する際に使われる 20〜 30塩基の短 、ポリヌクレオチド断片を言う。主に PCR法や ICAN法等の核酸増幅方法 において、 DNAや RNA等のポリヌクレオチドを増やすときに使われ、増やしたい部分 の両端に相補的に結合する塩基配列を持つものである。 PCR法において用いられる プライマーには、 PCR増幅反応時、一方のポリヌクレオチド鎖の 3'側に結合するブラ イマ一と、他方の鎖の 3'側に結合するプライマーがあり、各々をフォワード側プライマ 一（センスプライマーとも言う。），リバース側プライマー（アンチセンスプライマーとも售 う。）等と言うことがある。
[0037] 《本発明のプライマーグループ》
本発明のプライマーは、下記より選択されるポリヌクレオチドの一種力もなるものであ る。
グループ (I) :配列番号 2, 3,又は配列番号 3の、 3 '末端の 3塩基を除く他の塩基のう ち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド グループ（II)：配列番号 4, 5,又は配列番号 5の、 3 '末端の 3塩基を除く他の塩基の うち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド グループ (III)：配列番号 6, 7,又は配列番号 7の、 3'末端の 3塩基を除く他の塩基 のうち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド グループ (IV)：配列番号 8, 9,又は配列番号 9の、 3'末端の 3塩基を除く他の塩基 のうち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
[0038] 尚、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドの中でも、 プライマーとしての一般的な設計条件である、下記の条件の少なくともいずれか一つ を満たすものが好ましい。
(1) 3'末端の 5塩基には Gまたは Cが 2塩基以下である
(2) GC%を 40〜50%にする
(3)配列中に Gの 4連鎖を含まな 、
(4)プライマー内部に相補的な配列が少なぐヘアピン構造を作りにくい
(5)プライマー間に相補的な配列が少なぐ PCRの反応効率が良い
(6) Tmが 50〜60°Cである
[0039] 尚、配列番号 2, 4, 6, 8のポリヌクレオチドは、実際の患者の HIV-1遺伝子において 、変異の実例があった箇所を n (nとは、 a, t (u) , g, cのいずれの塩基であっても良い ことを示す。）としたものである。つまり n以外の固定した箇所は、本発明者等が調査し たあらゆる患者の HIV-1遺伝子に変異が無力つた箇所である。従って、これらを固定 した配列番号 2, 4, 6, 8のポリヌクレオチドは、あらゆるサブタイプの患者の HIV-1遺 伝子を検出又は定量できる可能性が高い。尚、これらのポリヌクレオチドの中でも、上 記 (1)〜（6)の条件の少なくとも 、ずれか一つを満たすものが好ま 、。
[0040] 《グループ (I)プライマー》
[0041] グループ (I)は、通常の PCR法においてプライマーとして用いることができる他、 nested -リアルタイム PCR法にお!、ては、 pre-quantification用のプライマーとして好適に用い られる。
[0042] グループ (I)の配列は、 HIV-1実験室株である HXB2の 1234〜1256番目の塩基配列と 、ほぼ同一の配列となるように設計された配列，およびその、 3'末端の 3塩基を除く 他の塩基のうち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチ ドであり、様々なサブタイプの HIV-1感染患者の血漿中 RNAにおいて見られるポリヌ クレオチドをもとに設計されたものである。
[0043] このグループ (I)は全て、 3'側から 3塩基が铸型となる HXB2遺伝子と同じ配列であり、 複数のサブタイプにおいても、良く保存されている。この特徴により、 PCR法のスター ト試料となる二本鎖 DNAのうち、铸型となる HXB2遺伝子配列と相補的な配列を有す る遺伝子鎖に確実にハイブリダィズし、耐熱性 DNAポリメラーゼによって、このプライ マーが確実に認識され、 DNAの増幅反応が進行する。
[0044] 好ましいプライマーは配列番号 3,又はその 3'末端の 3塩基を除く他の塩基のうち、 1 個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであって上記 (1) 〜(6)の少なくともいずれか一つの条件を満たすものであり、特に好ましいプライマー は配列番号 3の配列を有するポリヌクレオチドからなるプライマーである。
[0045] 《グループ (Π)プライマー》
[0046] グループ (II)は、通常の PCR法において、プライマーとして用いることができる他、 nest ed-リアルタイム PCR法において、 pre- quantification後の、リアルタイム PCRにおける プライマーとして好適に用いられる。
[0047] グループ (II)の配列は、 HIV-1実験室株である HXB2の 1285〜1304番目の塩基配列 と、ほぼ同一の配列となるように設計された配列，およびその、 3 '末端の 3塩基を除く 他の塩基のうち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチ ドであり、様々なサブタイプの HIV-1感染患者の血漿中 RNAにおいて見られるポリヌ クレオチドをもとに設計されたものである。このグループ (Π)は全て、 3'側から 3塩基が 铸型となる HXB2遺伝子と同じ配列であり、複数のサブタイプにおいても、良く保存さ れている。この特徴により、 PCR法のスタート試料となる二本鎖 DNAのうち、铸型とな る HXB2遺伝子配列と相補的な配列を有する遺伝子鎖に確実にハイブリダィズし、耐 熱性 DNAポリメラーゼによって、このプライマーが確実に認識され、 DNAの増幅反応 が進行する。
[0048] 好ましいプライマーは配列番号 5,又はその 3'末端の 3塩基を除く他の塩基のうち、 1 個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであって上記 (1) 〜(6)の少なくともいずれか一つの条件を満たすものであり、特に好ましいプライマー は配列番号 5の配列を有するポリヌクレオチドからなるプライマーである。
[0049] 《グループ (III)プライマー》
グループ (III)は、通常の PCR法において、プライマーとして用いることができる他、 nes ted-リアルタイム PCR法にお!、て、 pre- quantification後のリアルタイム PCRにおける、 プライマーとして好適に用いられる。
[0050] グループ (III)の配列は、 HIV-1実験室株である HXB2の 1375〜1394番目の塩基配列 に、ほぼ相補的となるように設計された配列，およびその、 3'末端の 3塩基を除く他 の塩基のうち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド であり、様々なサブタイプの HIV-1感染患者の血漿中 RNAにおいて見られるポリヌク レオチドをもとに設計されたものである。 3'側から 3塩基は铸型となる HXB2遺伝子と 同じ配列であり、複数のサブタイプにおいても、良く保存されている。この特徴により、 PCR法のスタート試料となる二本鎖 DNAのうち、 HIV-1遺伝子と同じ配列を有する遺 伝子鎖に確実にハイブリダィズし、耐熱性 DNAポリメラーゼによって、このプライマー が確実に認識さ DNAの増幅反応が進行する。
[0051] 好ましいプライマーは配列番号 7,又はその 3'末端の 3塩基を除く他の塩基のうち、 1 個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであって上記 (1) 〜(6)の少なくともいずれか一つの条件を満たすものであり、特に好ましいプライマー は配列番号 7の配列を有するポリヌクレオチドからなるプライマーである。
[0052] 《グループ (IV)プライマー》
[0053] グループ (IV)は、通常の PCR法においてプライマーとして用いることができる他、 nest ed-リアルタイム PCR法にお!、ては、 pre- quantification用のプライマーとして好適に用 いられる。
[0054] グループ (IV)の配列は、 HIV-1実験室株である HXB2の 1402〜1423番目の塩基配列 に、ほぼ相補的となるように設計された配列，およびその、 3'末端の 3塩基を除く他 の塩基のうち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド であり、様々なサブタイプの HIV-1感染患者の血漿中 RNAにおいて見られるポリヌク レオチドをもとに設計されたものである。 3'側から 3塩基は铸型となる HXB2遺伝子と 同じ配列であり、複数のサブタイプにおいても、良く保存されている。この特徴により、 PCR法のスタート試料となる二本鎖 DNAのうち、 HIV-1遺伝子と同じ配列を有する遺 伝子鎖に確実にハイブリダィズし、耐熱性 DNAポリメラーゼによって、このプライマー が確実に認識され、 DNAの増幅反応が進行する。
[0055] 好ましいプライマーは配列番号 9,又はその 3'末端の 3塩基を除く他の塩基のうち、 1 個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであって上記 (1) 〜(6)の少なくともいずれか一つの条件を満たすものであり、特に好ましいプライマー は配列番号 9の配列を有するポリヌクレオチドからなるプライマーである。
[0056] 《プローブ》
プローブとは、 日本語で検索子とも言い、相補的な塩基同士の結合により目的遺伝 子と共に二本鎖構造を形成するポリヌクレオチドであって、 目的遺伝子を探り出す為 に用いる核酸断片に、必要に応じて蛍光物質等の標識を結合させたものである。
[0057] 〈く TaqManタイププローブ》
本発明の HIV-1遺伝子検出又は定量用プローブのうち、一端に蛍光物質，他端に 消光物質を結合されたポリヌクレオチドの一種力 なるプローブは、一般に「TaqMan タイププローブ」と呼ばれるタイプに属するものである。 TaqManタイププローブとは、「 TaqManプローブ™」に代表される構造をとるプローブとして広く用いられている用語 で、主にリアルタイム PCR法に適したプローブである。
[0058] 《本発明のプローブグループ》
本発明の TaqManタイププローブに用いられるポリヌクレオチドの塩基配列の長さは、 通常 20〜40、好ましくは 22〜40である。具体的な配列としては下記のグループ (V) 又は（VI)のものが挙げられる。
[0059] グループ (V) :配列番号 10, 11,又は配列番号 11の、 5'末端の 3塩基を除く他の塩 基のうち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド グループ (VI)：グループ (V)の相補体
[0060] 尚、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドの中でも、 プローブとしての一般的な設計条件である、下記の条件の少なくともいずれか一つを 満たすものが好ましい。
(1) 3'末端の 5塩基には Gまたは Cが 2塩基以下である
(2) GC%が 40〜50%である
(3)プローブ内部に相補的な配列が少なぐヘアピン構造を作りにくい
(4)プライマーとの間に相補的な配列が少なぐ PCRの反応効率が良い
(5) Tmが 68〜70°Cである
(6)全長は 40塩基よりも短い。
[0061] 尚、配列番号 10のポリヌクレオチドは、実際の患者の HIV-1遺伝子において、変異 の実例があった箇所を n (nとは、 a, t (u) , g, cのいずれの塩基であっても良いことを 示す。）としたものである。つまり n以外の固定した箇所は、本発明者等が調査したあ らゆる患者の HIV-1遺伝子に変異が無力つた箇所である。従って、これらを固定した 配列番号 10のポリヌクレオチドは、あらゆるサブタイプの患者の HIV-1遺伝子を検出 できる可能性が高い。尚、これらのポリヌクレオチドの中でも、上記 (1)〜（6)の条件の 少なくとも 、ずれか一つを満たすものが好ま 、。
[0062] このグループ (V)の配列は、 HIV-1実験室株である HXB2遺伝子の 1309〜1338番目 の塩基配列に、ほぼ相補的となるように設計された配列，およびその、 5'末端の 3塩 基を除く他の塩基のうち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌ クレオチドであり、様々なサブタイプの HIV-1感染患者の血漿中 RNAにおいて見られ るポリヌクレオチドをもとに設計されたものである。このグループ (V)は、全て、少なくと も 5'側（対応する HXB2遺伝子上では 3'側）からの 3塩基は、铸型となる HIV-1のあら ゆるサブタイプで保存されて 、る配列と相補的であると 、う特徴を有して 、る。この特 徴により、グループ (V)又は (VI)から選択されるポリヌクレオチドの一種を用いたプロ一 ブは、例えば TaqDNAポリメラーゼ等の耐熱性ポリメラーゼ活性を有する酵素力 確 実に TaqManプローブを認識し、ェキソヌクレアーゼ活性によって、プローブの 5'側（ 対応する HXB2遺伝子上では 3'側)から 1塩基ずつ分解し、蛍光物質と消光物質を 分離させることができる。
[0063] 好ましいプローブは配列番号 11,又はその 5'末端の 3塩基を除く他の塩基のうち、 1 個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチドであって上記 (1) 〜(6)の少なくともいずれか一つの条件を満たすもの，又はそれらの相補体であり、特 に好まし 、プローブは配列番号 11の配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ 又はその相補体である。
[0064] 《蛍光物質，消光物質》
蛍光物質は、レポーター蛍光物質と呼ばれることがある。また、消光物質は、タエンチ ヤー物質等と呼ばれることがある。これらの物質の、プローブへの結合位置は特に限 定されないが、通常、プローブのオリゴヌクレオチド部の一端 (好ましくは 5，末端）に レポーター蛍光物質力 S、他端にクェンチヤ一蛍光物質が結合される。
[0065] プローブに蛍光物質を結合させる方法としては、公知の方法を採用することができ、 例えば、 Noble et al, (1984) .Nucleic Acids Res. 12:3387- 3403及び Iyer et al, (199 0) J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254に記載されている方法等を用いることができる
[0066] TaqManタイプのプローブは、一端に結合した蛍光物質が、他端に結合している消光 物質の近傍に存在する際には、励起光を照射しても蛍光共鳴エネルギー転移により 、発光が抑制されている。
[0067] しかし、アニーリングのステップにおいて、標的遺伝子に特異的にハイブリダィズした 後、プライマー側から、 DNA鎖の伸長反応が開始されると、 TaqDNAポリメラーゼのも つ 5 '→3 '方向のェキソヌクレアーゼ活性により、铸型にハイブリダィズした TaqManタ イブプローブは、 5'側力 順に分解される。つまり、蛍光物質と消光物質が遊離し、 消光物質による抑制が解除されて蛍光が発せられるのである。
[0068] 一方、標的配列とプローブの間の相補性が不完全である場合，例えばプローブの 5' 側からの 3塩基にミスプライミングがある場合等には、後述する TaqDNAポリメラーゼが TaqManタイププローブを認識できな!/、恐れがあるため、プローブの分解も起こらず、 レポーター物質の発光は抑制されたままとなり、増幅された目的遺伝子の検出又は 定量の量に誤りが生じる可能性がある。
[0069] つまり、少なくとも TaqDNAポリメラーゼに認識される程度に、铸型にハイブリダィズし 得るプローブを用いた場合にのみ、発光量が遺伝子増幅量を正確に反映しているこ とになる。別の見方をすれば、正しく増幅された標的遺伝子にハイブリダィズした場 合にのみ、発光が起こる。そして、この発光量の経時的な変化を観察することによつ て、リアルタイムに、標的配列の増幅の様子を検査することができるのである。
[0070] これらの蛍光物質や消光物質としては、市販のリアルタイム PCR用キットに含まれて いるものを用いることができる力 具体的には、下記のようなものが挙げられる。
[0071] 蛍光物質（レポーター蛍光物質）としては、 FAM (6—カルボキシフルォレセイン）のよ うなフルォレセイン系蛍光色素等の、蛍光色素等が挙げられる。
[0072] 消光物質（タエンチヤー物質）としては、 TAMRA (6—カルボキシテトラメチルローダミ ン）のようなローダミン系蛍光色素等の、蛍光色素等が挙げられる。
[0073] 《HIV-1遺伝子の検出又は定量方法》
本発明の HIV-1遺伝子の検出又は定量方法としては、公知の遺伝子検出又は定量 方法において、プライマー，プローブ，それらを使用したキット等として、上記の本発 明のプライマー，プローブ，キット等を用いる方法が挙げられる。
使用可能な公知の遺伝子検出又は定量方法としては、具体的には、 PCR法 (EP2003 62等参照）や NASBA法（EP329822等参照） , TAS法 (WO88/10315等参照）、 LAMP 法（Nucleic Acids Research, 2000, Vol.28, NO.12,栄研化学株式会社）， TRC法 (A nalytical Biochemistry 314 (2003) 77-86,東ソー株式会社）等のほ力 DNA鎖の置 換活性と铸型交換活性を有する DNAポリメラーゼ (BcaBEST™ DNAポリメラーゼ）、 R NAと DNAの混成二本鎖の RNA鎖のみを特異的に切断するリボヌクレアーゼ H (RNas e H)の 2種類の酵素と、 RNA部分と DNA部分力もなるキメラプライマーを用いて行う等 温遺 1ZS十増幅法 (ICAN法： Isothermal and Cnimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids,タカラバィォ社)等の、核酸増幅法が挙げられる。
更に、改良型の PCR法として、リアルタイム PCR法， nested- PCR法， nested-リアル タイム PCR法（高感度リアルタイム PCR) ,及びこれらに、 PCR法の実施前に、ウィルス RNAを cDNAに逆転写する工程を組合せた方法等が挙げられる。
また、リアルタイム PCR法としては、二本鎖 DNAに結合することで蛍光を発する試薬（ インターカレーター）を用いるインターカレーター法や、プローブの一端に蛍光物質， 他端に消光物質（タエンチヤー）が結合した TaqManタイプのプローブを用いる TaqMa nプローブ法， DNAと RNAのキメラプローブを用いる、サイクリングプローブ法等がある 本発明の HIV-1遺伝子の検出又は定量方法においては、リアルタイム PCR法として T aqManプローブ法を用 、た nested リアルタイム PCR法が、検出'定量感度等の点で 最適である。
[0074] 《PCR法》
PCR法とは、公知の方法であって、特定の DNA領域をはさんだ 2種類のプライマーと 、 DNAポリメラーゼによる DNA増幅反応の試験管内による繰り返しで、その特定 DNA 領域を短時間に簡便に数千万〜億倍に増幅する方法である。
[0075] 《nested—PCR法》
nested-PCR法とは、公知の方法である。
nested- PCR法とは、 2対のプライマー対を使って、 2段階の PCRを行う方法である。
2対とは、
(1)標的遺伝子領域を増幅するための PCRに用いるプライマー対 (フォワード側プライ マー及びリバース側プライマーのセットで 1対）と、
(2)最初の標的遺伝子領域の増幅に使用したプライマー位置より、更に内側にフォヮ ード側プライマー及びリバース側プライマーを設定し、一段階目で増幅された DNAを 更に特異的に増幅するプライマー対
である。 この 2段階の PCRに基づく増幅により、最初の PCR反応で増幅された PCR産物（標的 遺伝子 +非特異的産物）から、より特異的に標的遺伝子内の特異配列 DNAのみを 増幅する事が可能である。
[0076] 《リアルタイム PCR法》
リアルタイム PCR法とは、 PCR増幅産物の増加をリアルタイムでモニタリングし指数関 数的増幅領域で定量を行う、公知の遺伝子増幅方法であり、具体的には上述の「非 特許文献 2」 Microbiol Immunol 48(10), 767-772, 2004(Kaoru Wada, Hiromi Nagai, T suguhio Kaneda, et al.)や、「タカラバイオ リアルタイム PCR実践ガイド はじめてのリ アルタイム PCR 0412V20J等に記載されている。
[0077] TaqManタイププライマーを用いたリアルタイム PCR法の反応は、次のようにして行う。
(1) DNA増幅を行うサーマルサイクラ一と、増幅 DNAをモニタリングする分光蛍光光 度計を一体ィ匕した、リアルタイム PCR専用装置を用いる。
(2) PCRのプローブとして、上述の TaqManタイプのプローブを予め添加しておく。
(3) Taq DNAポリメラーゼ等の耐熱性 DNAポリメラーゼを反応させ、 5'→3'方向のェ キソヌクレアーゼ活性により、铸型にハイブリダィズした TaqManタイププローブを分解 することで、蛍光を発生させる。この時、プローブのハイブリダィズが不完全である遺 伝子増幅物（つまり、標的遺伝子以外のもの）の場合には、 DNAポリメラーゼが TaqM anタイププローブを認識できず、プローブの分解も起こらないために、レポーター物 質の発光は抑制されたままとなる。
(4)増幅産物をリアルタイムでモニタリングし、増幅曲線を表示する。増幅曲線とは、 P CRでは、 1サイクルの反応により、 DNA量は、指数関数的に増幅（2n乗）し、やがてプ ラトーに達する様子を、サイクル数を横軸に、蛍光強度を縦軸に表したものである（図 3等参照)。
(5)この際、 DNA濃度が予め分力つて 、る β 2ミクログロブリン ( β 2Μ)等のコントロー ル溶液，及び、 DNA濃度が予め分力ゝつている HIV-1遺伝子溶液を、各々段階希釈し 、それぞれ増幅曲線を描いておく。尚、初期の DNA量が多いと、少ないサイクル数で 蛍光強度が検出可能な量となるため、増幅曲線は、早く立ち上がる。
(6)適当な閾値 (蛍光強度）における、各コントロール濃度と PCRサイクル数の間の直 線関係から、コントロール及び HIV-1遺伝子の各々の検量線（図 2参照）を作製する。 閾値と増幅曲線が交わる点を Ct値（Threshold Cycle) (LightCycler LC Fast-start ki t (Roche)においては、この値 (Ct値)は、 Cp値（Crossing point)として表示されている 。）と言う。
(7)この検量線から、標的遺伝子の Ct値をもとに、標的遺伝子の初期の量が算出で きる。
[0078] このリアルタイム PCR法は、従来の、反応終了後に PCR増幅産物を確認する方法に 比べて、
(1) DNAや RNAの正確な定量ができること、
(ii)電気泳動が不要であるため、迅速かつ簡便に解析でき、コンタミネーシヨンの危 険性も小さいこと（タカラバイオ リアルタイム PCR実践ガイド はじめてのリアルタイム PCR 0412V20より引用）
など多くの利点がある。
[0079] 〈く nestedリアルタイム- PCR法》
nestedリアルタイム- PCR法とは、公知の方法であり、最初の PCRによって増幅された 遺伝子を、リアルタイム PCR法により定量する方法である。詳細は、例えば上述の「非 特許文献 l」Journal of Virological Methods 124(2005) 157- 165(Hiromi Nagai , Tsug uhio Kaneda, et al.)等に記載されている。この方法も、 nested-PCR法の一種であるた め、（1)定量前の遺伝子増幅（pre-quantification)のための PCRに用いるプライマー対 と、 (2)定量前の遺伝子増幅に使用したプライマー位置より、更に内側に設定した、 定量前増幅後の遺伝子量を決定するための PCR (リアルタイム PCR法)用のプライマ 一対が必要である。また、検出又は定量用プローブとしては、上述の TaqManタイプ プローブを用いる。
[0080] nedted-リアルタイム PCR法を用いた HIV-1遺伝子の定量は、具体的には、例えば下 記の手順に従って行うことができる（図 2参照)。
[0081] (1)検体から細胞を分離する。
(2)分離細胞から DNAを抽出する。
(3)定量前遺伝子増幅（pre- quantification)を行う前に、コントロールである β 2Μ量を 、リアルタイム PCR法により定量する。
(4)定量前遺伝子増幅（pre-quantification)反応により、 HIV-1遺伝子と β 2Μ遺伝子 を同時に増幅する。
(5)定量前遺伝子増幅（pre-quantification)反応後の、 HIV-1遺伝子と j8 2M遺伝子の 遺伝子量を、それぞれ、リアルタイム PCR法により定量する。
(6) |8 2Mについて、（5)の量を (3)の量でわり算することにより、遺伝子増幅率を算出す る。尚、 HIV-1遺伝子単独の場合と、 HIV-1遺伝子を |8 2M遺伝子と同時に PCR法に 力けた場合とでは、 HIV-1遺伝子の増幅量に変化が無ぐ β 2Μの PCRによる、 HIV- 1遺伝子の PCRに対する干渉作用が認められないことは、本発明者によって、既に確 認済である (平成 12〜14年度 厚生労働科学研究費補助金 エイズ対策研究事業， HIVの検査法と検査体制を確立するための研究， 12. HIV-1DNAの検出と定量に関 する研究， 12— (2).高感度リアルタイム PCRによる HIV-1 DNA定量法の確立（金田 次弘）に掲載の図 4参照)。
(7X6)の遺伝子増幅率は、 HIV-1遺伝子にも共通する値であることから、 HIV-1遺伝 子の (5)の量を、この増幅率でわり算することによって、もとの HIV-1遺伝子量を算出 できる。
[0082] この nestedリアルタイム- PCR法は、上述の、 nested- PCR法と、リアルタイム- PCR法の 利点を併せ持つている。
[0083] 従って、本発明の HIV-1遺伝子検出又は定量方法に使用可能な公知の遺伝子検出 又は定量方法としては、上述の検出又は定量方法の中でも、 PCR法が好ましぐ中で も、 nested- PCR法， nested-リアルタイム PCR法が好ましぐ特に nested-リアルタイム P CR法が好ましい。
[0084] 《HIV-1遺伝子検出又は定量用キット》
本発明のキットには、本発明のプライマー，プライマー対，又はプローブが少なくとも 一種類含まれる。 PCR法の場合には、少なくとも 1対のプライマーが必要である。特に 、 nested-リアルタイム PCR法等の nested- PCR法の場合には、 2対のプライマーを用 いることが必要である。しかし、このプライマー対は、必ずしも本発明のプライマー対 である必要は無ぐプライマー対のうちの一つが、本発明のプライマーである場合も 含まれる。また、本発明のプローブを用いる場合には、プライマーが本発明のプライ マーで無くとも良い。
[0085] 《プライマー対の組合せ》
本発明のプライマーを、一対のみ用いる際には、上記グループ (I)又は (II)に属する ポリヌクレオチドの一種と、上記グループ（III)又は（IV)に属するポリヌクレオチドの一 種を用いることが出来、いずれの組合せでも良い。
[0086] 但し、 nested-リアルタイム PCR法等の nested- PCR法の場合には、二対のプライマー 対が必要である。即ち、第一段階として、標的となる遺伝子配列を予め PCRで増幅す る際に用いるプライマー対と、第二段階であるリアルタイム PCRに用いるプライマー対 である。第一段階の PCRでは、第二段階で増幅したい標的遺伝子配列よりも、広い 領域で増幅しておくことが必要である。従って、第一段階用の一対は、グループ (I)の 一種とグループ (IV)の一種力 なるプライマー対とし，第二段階用のもう一対は、グ ループ（II)の一種とグループ（III)の一種力 なるプライマー対であることが好まし!/、。 本発明におけるグループ (I)〜（IV)は、 HIV-1遺伝子の領域の 5 '→3'の順に順次対 応させた遺伝子領域をモデルとして設計されたものである（図 1参照)。よって、ダル ープ (I), (IV)は、 HIV-1遺伝子上、グループ (Π), (III)よりも外側の領域をもとに設計さ れている。
[0087] 本発明のキットには、上記プライマーやプローブの他、耐熱性ポリメラーゼ活性を有 する酵素や、緩衝液を含ませることもできる。
[0088] 《耐熱性ポリメラーゼ活性を有する酵素》
耐熱性ポリメラーゼ活性を有する酵素としては、例えば TaqDNAポリメラーゼ等が好適 なものとして挙げられる。 TaqDNAポリメラーゼとは、 1976年に米国イェローストーン国 立公園の温泉力 採取された Thermus aquaticus TY1株力 精製された酵素である。 この酵素の最大の特徴は反応指摘温度が 70〜80度である。そのため PCR法に適し た酵素として広く用いられている。この TaqDNAポリメラーゼは、一本鎖 DNAを铸型に して、逆向きの鎖を 5'力も 3'に向力つて合成する作用を有している。また、 TaqDNA ポリメラーゼの特徴として、ポリメラーゼ活性と同時に、ェキソヌクレアーゼ活性を有す ることが挙げられる。このため、 TaqDNAポリメラーゼは、単なる PCR法による増幅反応 の他、 TaqManタイプのプローブを用いるリアルタイム PCR法， nested-リアルタイム PC R法等においても、重要な役割を果たすことができる。但し、耐熱性ポリメラーゼ活性 を有する酵素は、これに限られるものでは無ぐ他のテルムス菌種、例えば，テルムス •ァノレモフィフス (Thermus tnermophilus) , ァノレムス'フイリフオノレ ス (Thermus filiformi s)およびテルムス 'フラブス (Thermus flavus)等力 得られるものも使用可能である。 また、この他、テルモコッカス'リテラリス（Thermococcus literalis) ,ピロコッカス'フリオ サス（Pyrococcus foriosus) ,テルモトガ種（Thermotoga sp.)等から得られるものであ つても良い。
[0089] 《緩衝液》
本発明の HIV-1遺伝子検出又は定量用キットに用いられる緩衝液としては、 Taq DN Aポリメラーゼ (製品番号 1 146 165, Roche)等に使用されているものを用いることが できる。具体的な緩衝液の組成としては、 10mM Tris-HCl, pH8.3, 1.5mM MgC12, 50 mM KC1等が挙げられる（非特許文献 1の 2.materials and methods
の 2.1.2 Nested real-time PCR等参照）
[0090] 《HIV遺伝子検出又は定量用検体》
本発明のプライマー，プローブ，又はキットによって測定可能な検体としては、血漿、 血清、全血、脳脊髄液、精液等の体液の他、細胞や組織等が挙げられる。血漿中に おいては、 HIVは RNAとして検出又は定量される。細胞を用いた検出又は定量では、 HIVウィルス自身が有する逆転写酵素によって逆転写された cDNAや、その cDNAが 細胞内のゲノムに取り込まれたプロウィルス，或 、はプロウィルスが転写された mRNA を測定することによって、 HIVが検出又は定量される。本発明の実施例においては、 例として細胞内の、逆転写された cDNA及びプロウィルスのトータル量を測定して!/、る
[0091] HIVが感染すると以下のステップにより宿主標的細胞内に侵入し、後天性免役不全 症候群 (AIDS)の一因になりうる。
(1) HIVが、感染者自身の細胞内に侵入するステップ
(2)逆転写酵素によって、 cDNAとなるステップ
(3)その cDNAが細胞内のゲノムに組み込まれ、プロウィルスとなるステップ (4)プロウィルスがヒト転写機構により mRNAに転写されるステップ
(5)転写された mRNAから翻訳によってウィルスタンパク質を合成するステップ
(6) HIVウィルス粒子が複製され、感染細胞から出芽して!/、くステップ
を経て初めて、 HIVウィルスの増殖が繰り返し起こり、約 10年という長い年月を経て，
AIDSの発症へと進展して行く。
[0092] 従って、単に血中の HIV遺伝子量が多くても、細胞内に HIVウィルスが取り込まれたり
、増殖するとは限らない。つまり、血中の HIV遺伝子量の測定では、 AIDSの発症や進 行の有無を正確に判定することが難し 、と考えられて 、る。
[0093] 従来、血中のウィルス RNA量と CD4陽性 Tリンパ球数で病態の把握を行ってきたが、 現時点ではウィルス RNA量に加えて細胞内のプロウィルスを測定することや、プロウ ィルスカも転写された細胞内 mRNA量を測定することが、より、病気の進行程度を的 確にとらえることができる。このことにより、過剰な投薬'治療を防止できる指標となりう ると思われる。
[0094] 抗 HIV薬多剤併用療法により、血漿中の HIV-1 RNAが検出又は定量感度 (血中ウイ ルス量 < 50コピー/ ml血漿）以下に抑えられた症例では、血中ウィルス RNA量の測定 だけでは治療効果を評価することは無理である。これに対し、感染細胞内の残存プロ ウィルスの量を定量し、かつそれが産生する全長 mRNA量を定量することができれば プロウィルス 1つあたりの転写能力が評価でき、治療効果の評価と治療中断の可否を 決定するェビデンスになると思われる。
[0095] 本発明の検出又は定量方法は、細胞内の少量の cDNAやプロウィルスを測定するの に好適な方法である。特に、本発明のプライマー，プローブ，又はキット等を用い、 ne sted-リアルタイム PCR法で測定した場合、検出限界が、 2コピー未満/ 106細胞とい う、驚異的な感度を達成できる。
[0096] 《人免疫不全症候群治療用遺伝子断片》
本発明のグループ (I)〜(VI)に属するポリヌクレオチドの一種力もなる、人免疫不全 症候群治療用遺伝子断片は、アンチセンス試薬や small interfering RNA(siRNA)を 用いた RNA干渉 (RNAi)のための部分構造等として、 AIDSの遺伝子治療用に用いるこ とがでさる。 [0097] 治療用遺伝子断片の遺伝子形態としては、 DNAの他、 RNA,プラスミド，ウィルスべ クタ一等が使用可能であり、一本鎖であっても二本鎖であっても良い。この際、 siRNA を作るベクターに、 DNAを組み込んで用いることもできる。プラスミドを用いる場合、発 現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法 (DNAワクチン法）、リボソーム法、リポフエ クチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクト口ポレーシヨン法 等が挙げられ、特に DNAワクチン法、リボソーム法が好ましい。ウィルスベクターを用 いる場合、（日経サイエンス， 1994年 4月号， 20— 45頁、月刊薬事， 36 (1) , 23—4 8 (1994)、実験医学増刊， 12 (15) , (1994)、およびこれらの引用文献等)等に記 載されているように、ウィルスに、目的とする遺伝子を組み込むことによって行うことが できる。ウィルスベクターに用いるウィルスとしては、例えばレトロウイルス、アデノウィ ルス、アデノ関連ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウィルス、ボックスウィルス、 ポリオウイルス、シンビスウィルス等の DNAウィルス又は RNAウィルスが挙げられる。 ウィルスの中では、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウィルス、ワクシニアゥ ィルス等が好ましぐ特にアデノウイルスが好まし 、。
[0098] 《人免疫不全症候群の治療方法》
遺伝子を実際に医薬として作用させ、治療するには、当該遺伝子を直接体内に導入 する「in vivo法」の他、ヒトかから採集した細胞に当該遺伝子を導入し、その後、遺 伝子導入細胞を体内に戻すという、「ex vivo法」等がある [日経サイエンス， 1994 年 4月号， 20— 45頁、月刊薬事， 36 (1) , 23— 48 (1994)、実験医学増刊， 12 (15 ) , (1994)、およびこれらの引用文献等]が、 in vivo法は費用や手間が少なぐ簡 便である点で好ましぐ ex vivo法は、遺伝子の細胞内への導入効率が良いという点 で好ましい。「in vivo法」により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた 適当な投与経路を選択することができる。投与経路としては、例えば、静脈、動脈、 皮下、皮内、筋肉内等が挙げられる。「in vivo法」によって投与する場合は、例えば 、液剤等の製剤形態をとることができる。一般的には遺伝子を含有する注射剤等の 形態が好ましぐ必要に応じて、注射剤等に常用されている各種の成分等を加えるこ ともできる。また、遺伝子を含有するリボソームまたは膜融合リボソーム (センダイウイ ルス (HVJ)—リボソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等 のリボソーム製剤の形態として用いることができる。
実施例
[0099] 以下、本発明のプライマー（配列番号 5,配列番号 7) ,プローブの有用性 (配列番号 11)を、公知のサブタイプ B用に開発された、プライマー，プローブと比較するため、 サブタイプ A,B,C,D,組換え流行株 CRF01_AEに属する患者の HIV-1遺伝子の検出 又は定量を実施した結果を示すが、それに先だって、実施例で用いた実験方法及 び実験材料について説明する。
[0100] 《実験方法》
上述の〈く nestedリアルタイム- PCR法》を使用する。尚、〈く nestedリアルタイム- PCR法》に ついては、下記 [1]〜[6]のようにして行った。
[0101] [1]〈く nestedリアルタイム- PCR法》の検体から細胞を分離する方法
[CD4陽性 Tリンパ球の分離 (StemSep Negative Cell Selection)]
(Stembep)
StemSepとは、除去を目的とする細胞の表面に発現しているタンパク質を標的とし、そ れに対する抗体と磁性コロイドを結合させて、磁石にセットしたカラムにトラップさせ、 細胞溶液中から不要な細胞を除去し、目的とする細胞のみを濃縮回収する方法であ る。
[0102] (StemSep試薬）
StemSep試薬とは、除去した 、細胞に結合させる抗体および磁気コロイドの試薬セッ トである。ヒトの細胞用の StemSep試薬としては、 Tetrameric Antibody Complex (四量 体抗体複合物）のカクテルと磁気コロイドのセットを用いる。
[0103] (1)へパリン又は EDTA (ethylene- diamine- tetraacetic acid)添力卩全血を 400 X G(1200 rpm) 15分間遠心し、血球層、バフィ一コート（白血球層）及び血漿に分離する。
(2)パフィーコ一ト層を採取する。
(3)赤血球溶血用塩化アンモ-ゥム溶液 (150mmol/l NH4C1、 10mmol/l KHC03、 81 μ mol/1 EDTA 4Na)を 10ml添加し 20分間反応させ赤血球を溶血させる。
(4)遠心 (400 X G (1200rpm)、 5分)後、上清除去する。細胞沈查は 10mlのリン酸緩衝 化食塩水（PBS)にゥシ胎児血清 (Fetal Calf Serum, FCS)を 2%加えた緩衝液 (PBS+2 %FCS)でピペッティングにより再懸濁を行う。
(5)遠心 ( (400 X G ( 1200rpm)、 5分)後、上清除去する。
(6)細胞沈查に lmlの PBS+2%FCSを加え、再懸濁後、 1.5mlの DNase ' RNaseフリーチ ユーブに移す。
(7) 1.5ml DNase ' RNaseフリーのチューブに移したバフィ一コート lmlに CD4+エンリッチ メントカクテル（一次抗体、 STS-14052 (StemSep、ベリタス社製））を 100 μ 1添加し、転 倒混和する。
(8)室温で 15分間抗原抗体反応 (氷中の場合は 30分間)を行う。
(9)反応後、マグネット抗体を 60 1添加し、転倒混和し室温で 15分間抗原抗体反応を 行う（氷中の場合は 30分間)。
(10)抗原抗体反応を続行させているかたわら、別途並行してカラム（STS-12031 (Stem Sep,ベリタス社製)）をセットし、 PBS+2%FCS緩衝液でカラムを洗浄する。
(11)抗原抗体反応後、サンプルをカラムに添加し重力により目的細胞を落下させ、 目 的細胞を回収する。
(12)回収後、 400 X G(1200rpm)、 10分間遠心し、上清を除去する。
(13)細胞沈查に PBS液を加え再懸濁する。
[0104] [2]〈く nestedリアルタイム- PCR法》の分離細胞から DNAを抽出する方法分離した細胞 からの、 DNAの抽出は、常法により行うことができる力 例えば、（QIAamp DNA Blood mini kit (QIAGEN)を用い、このキットに添付されている説明書に記載の方法を用い 、説明書の、最後の DNA回収の段階で、 Buffer AEに代えて、 60 μ 1の DDW(double d istilled water)を用い、 6000 X g (8000rpm) 1分で遠心することにより、 DNAを回収す ることがでさる。
[0105] [3] β 2ミクログロブリン（ j8 2M)の定量抽出した DNA中の 13 2M遺伝子コピー数を定 量する事により、 DNA抽出時 (定量前 PCR前）の細胞数を算出する。
[0106] 《実験材料》
[0107] [コントローノレ β 2Μ用プライマー]
リアルタイム PCRプライマー：
j8 2M-F:配列番号 12 β 2M-R:配列番号 13
Figure imgf000030_0001
[0108] [コントローノレ β 2Μ用 TaqManプローブ]
リアルタイム TaqManプローブ：
β 2Μ-Τ:配列番号 14
5 -6FAM-cactgaaaaa gatgagtatg cctgccgtgt— i，AMRA— 3
[0109] Standard piasmid:
pGEM- β 2M (1010コピー/ 1が 10 1ずつ分注）
[0110] [Standard希釈液調整]
101Qコピー/;^液を 2倍に希釈。その後、 10倍に段階希釈。使用は 2 1。
[0111] [リアルタイム PCR法： LightCycler LC Fast-start kit (Roche) ]
PCR Mixture
[0112] リアルタイム PCR法の PCR反応液の組成を表 1に示す。
[0113] [表 1]
Sample 2 / 1
lOpmolZ/il β2Μ-Ρ2 Primer 1 μ,\ 0.5 fiM
lOpmolZ/il ^S2M-R Primer 1 fil 0.5 μΜ
4pmDl///l jS2M- TTaqMan^tT—ブ 2 μΐ ΟΑμΜ
lO Buffer m 2 βΐ
25mMMgf¾ 3.2 μΐ
Figure imgf000030_0002
[0114] ^^^/ 。。，^/，^^^^(^^コピー/^ μ 1となるように段階希釈した pGEM- Β2Μ
Standard piasmidを定量時のコントロールとして使用する。
[0115] [リアルタイム PCRプログラム]
95°C 10分間： Denature
95°C 10秒、 60°C 30秒 45サイクル： PCR+蛍光強度測定
40°C 30秒間： Cooling [0116] 《結果》
[0117] β 2Μコピー数測定の結果記入シート例を表 2に示す。
[0118] [表 2]
Figure imgf000031_0001
[0119] B2M- Q : B2M測定値
B2M : B2M X 25 抽出された DNA中の総 j8 2Mコピー数
Total cells : B2M/2抽出された DNAの総細胞数を算出
[0120] [4]定量前増幅反応（HIV-1 DNA- β 2Μ同時増幅法）
[プライマー]
β 2Μ増幅プライマー：
β 2M-F2:配列番号 12
5 — cagca aggac tggtc tttct atctc t-ύ
2M-R 配列番号 13
5 ' -acccc actta actat cttgg- 3 '
[0121] HIV-1 DNA増幅プライマー：
Pre- quantification forward:酉己列番号 3
5， -cctagaactt taaatgcatg ggt- 3，
Pre- quantification reverse:酉己列番号 9
5 ' - attctgcagc ttcctcattg at- 3
[0122] [DNA量]
[0123] 定量前増幅反応に使用する DNA量記入シート例を表 3に示す。 [0124] [表 3]
Figure imgf000032_0001
[0125] DNA使用量：定量前 PCR反応に用いた DNA volume /z 1) Water vol： Sample量を 60 μ 1に調整する為の DDW量 1) [0126] PCR Mixtureを表 4に示す。
[0127] [表 4]
Figure imgf000033_0001
[0128] [定量前増幅 PCRプログラム # 56— 20]
94°C 1分間： Denature
94°C 30秒、 55°C 30秒、 72°C 1分 20サイクル： PCR
72°C 8分間：伸長反応
4°C: cooling
[0129] [5] j8 2ミクログロブリン（j8 2M)の定量 2回目
定量前増幅反応後の IS 2Mコピー数を定量し、 PCR増幅率を算出する。
[0130] [プライマー及び TaqManプローブー(3)の反応と同じ]
リアルタイム PCRプライマー： β 2M-F2:配列番号 12
5 ' -cagcaaggac tggtctttct atctct- 3 '
β 2M-R:配列番号 13
5 ' -accccactta actatcttgg-3
リアルタイム TaqManプローブ：
β 2Μ-Τ:配列番号 14
5 -6FAM-cactgaaaaa gatgagtatg cctgccgtgt- i，AMRA— 3
[0131] Standard piasmid:
pGEM- β 2M (1010コピー/ μ 1が 10 μ 1ずつ分注）
検量線： κ κΛκΛκ/, ΙΟ , Ιί ΐΟ^ ΙΟ1コピー /2 μ 1の pGEM- Β2Μ Standard plasmidを定量時のコントロールとして使用する。
[0132] 《リアルタイム PCR法： LightCycler LC Fast-start kit (Roche)使用》
反応液組成等は (3)と同じ。
[0133] PCR Mixtureを表 5に示す。
[0134] [表 5]
N= :1
Sample 2 μΐ
10ρπ»1/ μ 1 J62M-F2 Primer 1 μΐ 0.5 μΜ
10ρπ»1/ μ 1 J62M-R Primer 1 μΐ 0.5 μΜ
4ρπ»1/ 1 j62M—T TaqManプロづ 2 μΐ 0.4 μΜ
10 Buffer 2 μΐ ΐ χ
3.2 μΐ
DDWQraiM水- PCR ifU—ド） 8.8 μΐ
Total 20.0 μΐ
[0135] [リアルタイム PCRプログラム]
95°C 10分間： Denature
95°C 10秒、 60°C 30秒 45サイクル： PCR+蛍光強度測定
40°C 30秒間： Cooling
[0136] [結果]
[0137] 定量前増幅反応後 β 2Μコピー数測定の結果記入シート例を表 6に示す。
[0138] [表 6] Total
Sample 細膽 B2M-ampQ
コピ一数 B2M-amp 率
1
2
3
NC
BC
[0139] 使用細胞数： Total cells (増幅 PCR前） X DNA使用量 /50
使用 B2Mコピー数：使用細胞数 X 2
B2M-ampQ：定量前 PCR後 B2Mコピー数測定値
Total B2M-amp： B2M- ampQ X 50 定量前 PCRによって増幅した B2M遺伝子の総 増幅率： Total B2M amp/使用 B2Mコピー数
[0140] [6]定量前増幅反応後 HIV-1 DNAの定量
[0141] [プライマー及び TaqManプローブ]
リアルタイム PCRプライマー：
Real-time forward:酉己列番 5
5 -ccagaagtga tacccatgtt— 3
Real-time forward:酉己列番 7
5， -tttaacattt gcatggctgc- 3，
[0142] リアルタイム TaqManプローブ：
TaqMan probe:酉 ti列番 11
5，— 6FAM— atcttgtggg gtggctcctt ctgataatgc— TAMRA— 3，
[0143] Standard piasmid:
pUC-IIIB (5 X 101。コピー/ 1が 10 1ずつ分注）
[0144] [Standard希釈液調整]
5 X 101Qコピー/ ; z l 液を 10倍ずつに段階希釈
使用は 2 1
[0145] ^^^ ，^ ^(^ ^^^^(^^^コピー/^ μ 1となるように段階希釈した pGEM- Β2Μ
Standard piasmidを定量時のコントロールとして使用する。
[0146] [リアルタイム PCR法： LightCycler LC Fast-start kit (Roche)使用 ] j8 2M測定法と同じ
[0147] PCR Mixtureを表 7に示す,
[0148] [表 7]
N ί=1
2 μΐ
lOpmol/ μ 1 real-tune forward primer 1 μΐ 0.5 μΜ
lOpmol/ μ 1 real-time reverse Primer 1 μΐ 0.5 μΜ
4pmol/ μ 1 TaqManプロ一ブ 2 μΐ 0.4 μΜ
10 x Buffer 2 μΐ ΐ χ
25mM Mgd2 3.2 μΐ
DDWQraiM水 · PCR ^fU -ド） 8.8 μΐ
Total 20.0 μΐ
[0149] [リアルタイム PCRプログラム]
95°C 10分間： Denature
95°C 10秒、 60°C 30秒 45サイクル： PCR+蛍光強度測定
40°C 30秒間： Cooling
[0150] [結果]
[0151] 定量前増幅反応後 HIV-l DNAコピー数測定の結果記入シート例を表 8に示す。
[0152] [表 8]
Figure imgf000036_0001
[0153] HIV-ampQ：定量前 PCR後 HIVコピー数測定値
HIV-l DNA amp : HIV-ampQ X 50 定量前 PCRによって増幅した HIV- 1 DNAの総数
Original HIV-l DNA: HIV-l DNA/増幅率 抽出した DNA中にもともと存在した HIV- 1 DNAコピー数 HIV- 1 DNA: Original HIV- 1 DNAX 1000000/used cells 106細胞中の HIV- 1 DNAコ ピー数
[0154] [実施例 1,比較例 1 (HIV-1遺伝子サブタイプ Aの検出及び定量) ]
本発明のプライマー，プローブの有用性 (実施例 1)を、公知のサブタイプ B用に開発 された、プライマー，プローブと比較する（比較例 1)ため、サブタイプ Aに属する患者 の HIV-1遺伝子の検出及び定量を実施した結果を示す。
[0155] 0まず、各々のプライマー，プライマーを用い、サブタイプ Aの検体でリアルタイム PCR 反応が、理論通りに起こって 、るかにっ 、て検討した。
[0156] 尚、用いた検体は、下記の 3種類である。
(サブタイプ A検体情報）
A1 : DNA濃度 49η§/ /ζ 1
A2 : DNA濃度 45η§/ /ζ 1
A3 : DNA濃度 45η§/ /ζ 1
DNAの塩基数： 453 bp
(スタンダード）
サブタイプ Bの HIV-1である ΠΙΒ実験室株を pUCl 18プラスミドに挿入したスタンダード プラスミド (pUC-IIIB)
[0157] (実施内容）
a)サブタイプ Aの検体を 10倍ずつ段階希釈し、反応液あたり 108から 10コピー加えた P CR反応液を作成。
b)本発明のプライマー，プローブを用いた発明法 (Pan- HIV-1法)と、公知のサブタイ プ B用に開発されたプライマー，プローブを用いた公知文献法 (Sub-B法)を用い、 108 力 10コピー/ assayのリアルタイム PCRを行い、 PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲 線で判定。
c) Pan-HIV_l法でサブタイプ Aの検体を正確に定量できるか否かの確認。
d) Sub-B法でサブタイプ Aの検体を正確に定量できか否かの確認。
[0158] (実験結果の判定方法）
発明法 (Pan-HIV-1法)と公知文献法 (Sub-B法)を用い、 108から 10コピー/ assayのリア ルタイム PCRを行い、 PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。
[0159] 〈検体：サブタイプ A-A1〉
(1)発明法 (Pan-HIV-1法)による結果を図 3に示す。
[0160] (2)公知文献法 (Sub-B法)による結果を図 4に示す。
[0161] (結果）
Pan- HIV-1法と Sub-B法とでは PCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例え ば、検体 A1のコピー数が 108コピーの時、 Pan- HIV-1法では 10サイクル目に立ち上が つていたが、 Sub-B法では 30サイクル目での立ち上がりであった。これは PCRの回数 で 22Q違うことを意味し、 PCR生成物で換算すると 1000000倍の差となる。
[0162] 〈検体：サブタイプ A-A2〉
(1)発明法 (Pan-HIV-1法)による結果を図 5に示す。
[0163] (2)公知文献法 (Sub-B法)による結果を図 6に示す。
[0164] (結果）
Pan- HIV-1法と Sub-B法とでは PCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例え ば、検体 A1のコピー数が 108コピーの時、 Pan- HIV-1法では 10サイクル目に立ち上が つていたが、 Sub-B法では 30サイクル目での立ち上がりであった。これは PCRの回数 で 22Q違うことを意味し、 PCR生成物で換算すると 1000000倍の差となる。
[0165] 〈検体：サブタイプ A-A3〉
(1)発明法 (Pan-HIV-1法)による結果を図 7に示す。
[0166] (2)公知文献法 (Sub-B法)による結果を図 8に示す。
[0167] (結果）
Pan- HIV-1法と Sub-B法とでは PCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例え ば、検体 A1のコピー数が 108コピーの時、 Pan- HIV-1法では 10サイクル目に立ち上が つていたが、 Sub-B法では 30サイクル目での立ち上がりであった。これは PCRの回数 で 22Q違うことを意味し、 PCR生成物で換算すると 1000000倍の差となる。
[0168] ii)Pan-HIV-l法でサブタイプ Aの検体を正確に定量できて!/、る事を確認した。
スタンダード： pUC-IIIB
[0169] 〈検体：サブタイプ A-A1〉 発明法 (Pan-HIV-1法)により複数回 (5回)測定を行った結果を、表 9及び図 9に示す。
[0170] 〈検体：サブタイプ A-A2〉
発明法 (Pan-HIV-1法)により複数回 (5回)測定を行った結果を、表 10及び図 10に示 す。
[0171] 〈検体：サブタイプ A-A3〉
発明法 (Pan-HIV-1法)により複数回 (5回)測定を行った結果を、表 11及び図 11に示 す。
[0172] 表中の Ave.は、 5回の平均値， SDは、 5回の測定値のばらつき (標準偏差）， Cv (変動 係数 =平均値/標準偏差 X 100(%))は、測定値の再現性を示す。
また、図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字 がサブタイプ A検体のコピー数を示す。
[0173] 〈く Pan-HIV-1法：定量結果》
〈検体:サブタイプ A-A1〉
[0174] (Pan-HIV-1法によるサブタイプ A-A1検体の測定結果）
[0175] [表 9]
Figure imgf000040_0001
[0176] (結果）
10コピーでは期待値の 50%であった力 それ以上のコピー数の実験では 71%から 109 %の値を示した。リアルタイム PCRの結果としては極めて良好である。
[0177] 〈検体：サブタイプ A-A2〉
[0178] (Pan-HIV-1法によるサブタイプ A-A2検体の測定結果）
[0179] [表 10] 期待使
100000000 10000000 1000000 100000 10000 1000 100 10 vcopies/assay)
接体 A2 Ave . 105500000 10610000 966000 30100 3880 1062 103 e
S 8800000 62190 40030 7310 803 62.6 13.7 2.7
Cv (ϊ) 8.3 0.6 4.1 8.8 8.1 5.3 13.1 43.5 正確性 (X) 105.5 106.1 se . e 30.1 38.8 106.2 103.0 62.0
[0180] (結果）
10コピーでは期待値の 62%であった力 それ以上のコピー数の実験では 90%から 106 %の値を示した。リアルタイム PCRの結果としては極めて良好である。
[0181] 〈検体:サブタイプ A-A3〉
[0182] (Pan-HIV-1法によるサブタイプ A-A3検体の測定結果）
[0183] [表 11]
Figure imgf000041_0001
[0184] (結果）
10コピーでは期待値の 50%であった力 それ以上のコピー数の実験では 73%から 106
%の値を示した。リアルタイム PCRの結果としては極めて良好である。
[0185] iii)Sub-B法でサブタイプ Aの検体を正確に定量できるか否かの検証を行った。
スタンダード： pUC-IIIB
[0186] 〈検体：サブタイプ A-A1〉
公知文献法 (Sub-B法)により複数回 (5回)測定を行った結果を、表 12及び図 12に示 す。
[0187] 〈検体：サブタイプ A-A2〉
公知文献法 (Sub-B法)により複数回 (5回)測定を行った結果を、表 13及び図 13に示 す。
[0188] 〈検体：サブタイプ A-A3〉
公知文献法 (Sub-B法)により複数回 (5回)測定を行った結果を、表 14及び図 14に示 す。
[0189] また、図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字 がサブタイプ A検体のコピー数を示す。
[0190] 〈く Sub-B法：定量結果》
〈サブタイプ A-A1検体〉
[0191] (Sub-B法によるサブタイプ A-A1検体の測定結果）
[0192] [表 12]
Figure imgf000042_0001
[0193] (結果）
期待値に比べ 1/106程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定 できな力つたことを意味する。
[0194] 〈サブタイプ A-A2検体〉
[0195] (Sub-B法によるサブタイプ A-A2検体の測定結果）
[0196] [表 13]
Figure imgf000042_0002
[0197] (結果）
期待値に比べ 1/106程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定 できな力つたことを意味する。
[0198] 〈サブタイプ A-A3〉
[0199] (Sub-B法によるサブタイプ A-A3検体の測定結果）
[0200] [表 14]
Figure imgf000043_0001
[0201] (結果）
期待値に比べ 1/106程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定量が できな力つたことを意味する。
[0202] 《まとめ》
1.発明法 (Pan- HIV-1法)と公知文献法 (Sub-B法)を用い、 108から 10コピー/ assayのリ アルタイム PCRを行い、 PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定したところ、サ ブタイプ Aの検体 3例全てにおいて PCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。 例えば、反応にカ卩えた DNAコピー数が 108コピーの場合、本発明の方法では 10サイク ル目に立ち上がった力 従来の方法では 30サイクル目であった。これは PCRの回数 で 22Q違うことを意味し、 PCR生成物で換算すると 1000000倍の差となる。
[0203] 2.本発明法（Pan- HIV-1法）を用いた 108から 10コピーのサブタイプ A検体を定量した 結果をまとめる。
[0204] (Pan-HIV-1法によるサブタイプ A検体の測定結果のまとめを表 15に示す）
[0205] [表 15]
Figure imgf000043_0002
[0206] 10コピーでは期待値の 54%であった力 それ以上のコピー数の実験では 87%から 103 %の値を示した。リアルタイム PCRの結果としては極めて良好である。
[0207] 3.従来法 (Sub-B法)を用いた 108から 10コピーのサブタイプ A検体を定量した結果を まとめる。
[0208] (Sub-B法によるサブタイプ A検体の測定結果のまとめを表 16に示す） [0209] [表 16]
Figure imgf000044_0001
[0210] (結果）
期待値に比べ 1/106程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定量が できなかったことを意味する。この結果は、リアルタイム PCRの立ち上がりから得られる 結果とも一致する。
[0211] (プライマー，プローブ配列の検証）
本実施例，比較例で用いたプライマー，プローブの設計のもととなった HXB2遺伝子 上の対応する領域と、 HIV-1遺伝子のサブタイプ Aの患者遺伝子の該当領域を比較 対照した図を、図 15に示す。
[0212] リバース側プライマーが結合する配列の 5，側 3塩基目（リバースプライマーの 3，側 3塩 基目に相当する領域）に A→Gの変異があるため、プライマーと铸型が結合しにくい 状態になり、ポリメラーゼの認識が困難となっていたと考えられる。そのため、リアルタ ィム PCR画面上で見られた反応開始サイクルの大幅な遅延及び、それにより PCR反 応物の減少が生じたと思われる。
[0213] [実施例 2,比較例 2 (HIV-1遺伝子サブタイプ Bの検出及び定量) ]
本発明のプライマー，プローブの有用性 (実施例 2)を、公知のサブタイプ B用に開発 された、プライマー，プローブと比較する（比較例 2)ため、サブタイプ Bに属する患者 の HIV-1遺伝子の検出及び定量を実施した結果を示す。
[0214] 0まず、各々のプライマー，プライマーを用い、サブタイプ Bの検体でリアルタイム PCR 反応が、理論通りに起こって 、るかにっ 、て検討した。
[0215] 尚、用いた検体は、下記の 2種類である。
(サブタイプ B検体情報）
B1 : DNA濃度 31η§/ /ζ 1 B2 : DNA濃度 20η§/ /ζ 1
DNAの塩基数： 453 bp
(スタンダード）
サブタイプ Bの HIV-1である ΠΙΒ実験室株を pUCl 18プラスミドに挿入したスタンダード プラスミド (pUC-IIIB)
[0216] (実施内容）
a)サブタイプ B-B1の検体を 10倍ずつ段階希釈し、反応液あたり 108から 10コピー加え た PCR反応液を作成。
b)本発明のプライマー，プローブを用いた発明法 (Pan- HIV-1法)と、公知のサブタイ プ B用に開発されたプライマー，プローブを用いた公知文献法 (Sub-B法)を用い、 108 力 10コピー/ assayのリアルタイム PCRを行い、 PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲 線で判定。
c) Pan-HIV_l法でサブタイプ Bの検体を正確に定量できるか否かの確認。
d) Sub-B法でサブタイプ Bの検体を正確に定量できるか否かの確認。
[0217] (実験結果の判定方法）
本発明法 (Pan-HIV-1法)と公知文献法 (Sub-B法)を用い、 108から 10コピー/ assayに ついて、同時にリアルタイム PCRを行い、 PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で 判定。
[0218] 〈検体:サブタイプ B-B1〉
(1)発明法 (Pan-HIV-1法)による結果を図 16に示す。
[0219] (2)公知文献法 (Sub-B法)による結果を図 17に示す。
[0220] (結果）
Pan- HIV-1法と Sub-B法は PCRの立ち上がりの位置がほぼ同じであった。サブタイプ Bの検体では Pan-HIV-1法、 Sub_B法ともに同じような値で測定可能であると思われる 。これは、 Sub-B法が、サブタイプ Bの検出又は定量用に開発されたプライマー，プロ ーブを用いる方法であるため、当然の結果とも言える。
[0221] 〈検体：サブタイプ B-B2〉
(1)発明法 (Pan-HIV-1法)による結果を図 18に示す。 [0222] (2)公知文献法 (Sub-B法)による結果を図 19に示す。
[0223] (結果）
Pan-B法と Sub-B法は PCRの立ち上がりの位置がほぼ同じであった。サブタイプ Bの 検体では Pan-B法、 Sub-B法ともに同じような値で測定可能であると思われる。これも
、 Sub-B法が、サブタイプ Bの検出又は定量用に開発されたプライマー，プローブを 用いる方法であるため、当然の結果と言える。
[0224] ii)Pan-HIV-l法でサブタイプ Bの検体を正確に定量できて!/、る事を確認した。
スタンダード： pUC-IIIB
[0225] 〈検体：サブタイプ B-B1〉
発明法 (Pan-HIV-1法)により複数回 (5回)測定を行った結果を、表 17及び図 20に示 す。
[0226] 〈検体：サブタイプ B-B2〉
発明法 (Pan-HIV-1法)により複数回 (5回)測定を行った結果を、表 18及び図 21に示 す。
[0227] 図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサ ブタイプ B検体のコピー数を示す。
[0228] 〈く Pan-HIV-1法：定量結果》
〈検体:サブタイプ B-B1〉
[0229] (Sub-B法によるサブタイプ B-B1検体の測定結果）
[0230] [表 17]
Figure imgf000046_0001
[0231] (結果）
108〜10コピーまで、期待値の 88〜118%までと極めて良好に、また、 Cv値も 1.5〜16% までと再現性良く測定することができた。 [0232] 〈検体：サブタイプ B-B2〉
[0233] (Sub-B法によるサブタイプ B-B2検体の測定結果)
[0234] [表 18]
Figure imgf000047_0002
[0235] (結果）
10コピーでは期待値の 60%であった力 それ以上のコピー数の実験では 74%から 104 %の値を示した。リアルタイム PCRの結果としては極めて良好である。
[0236] iii)公知文献法 (Sub-B法)でサブタイプ Bの検体を正確に定量できる力否かの検証を 行った。
スタンダード： pUC-IIIB
[0237] 〈検体：サブタイプ B-B1〉
公知文献法 (Sub-B法)により複数回 (5回)測定を行った結果を、表 19及び図 22に示 す。
[0238] 〈検体：サブタイプ B-B2〉
公知文献法 (Sub-B法)により複数回 (5回)測定を行った結果を、表 20及び図 23に示 す。
[0239] 図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサ ブタイプ B検体のコピー数を示す。
[0240] 〈く Sub-B法：定量結果》
〈サブタイプ B-B1検体〉
[0241] [表 19]
Figure imgf000047_0001
[0242] (結果）
非常に良好な正確性をもち、かつ再現性良くサブタイプ Bの検体を測定することがで きた。
[0243] 〈サブタイプ B-B2検体〉
[0244] [表 20]
Figure imgf000048_0001
[0245] (結果）
非常に良好な正確性をもち、かつ再現性良くサブタイプ Bの検体を測定することがで きた。
[0246] 《まとめ》
サブタイプ Bの検体は Pan-HIV-1法、 Sub-B法とも極めて良好な正確性、及び再現性 を有し測定することが可能であった。
[0247] (プライマー，プローブ配列の検証）
本実施例，比較例で用いたプライマー，プローブの設計のもととなった HXB2遺伝子 上の対応する領域と、 HIV-1遺伝子のサブタイプ Bの患者遺伝子の該当領域を比較 対照した図を、図 24に示す。
[0248] Pan- HIV-1法、 Sub-B法ともに、プライマー及びプローブの結合領域に PCR反応に影 響を及ぼすような変異は見られな力つた。結果、両測定法とも再現性良く正確に測定 できたと考えられる。
[0249] [実施例 3,比較例 3 (HIV-1遺伝子サブタイプ Cの検出及び定量) ]
本発明のプライマー，プローブの有用性 (実施例 3)を、公知のサブタイプ B用に開発 された、プライマー，プローブと比較する（比較例 3)ため、サブタイプ Cに属する患者 の HIV-1遺伝子の検出及び定量を実施した結果を示す。
[0250] 0まず、各々のプライマー，プライマーを用い、サブタイプ Cの検体でリアルタイム PCR 反応が、理論通りに起こって 、るかにっ 、て検討した。 [0251] 尚、用いた検体は、下記の 2種類である。
(サブタイプ A検体情報）
C1 : DNA濃度 24η§/ /ζ 1
C2 : DNA濃度 51η§/ /ζ 1
DNAの塩基数： 453 bp
(スタンダード）
サブタイプ Bの HIV-1である ΠΙΒ実験室株を pUCl 18プラスミドに挿入したスタンダード プラスミド (pUC-IIIB)
[0252] (実施内容）
a)サブタイプ Cの検体を 10倍ずつ段階希釈し、反応液あたり 108から 10コピー加えた P CR反応液を作成。
b)本発明のプライマー，プローブを用いた発明法 (Pan- HIV-1法)と、公知のサブタイ プ B用に開発されたプライマー，プローブを用いた公知文献法 (Sub-B法)を用い、 108 力 10コピー/ assayのリアルタイム PCRを行い、 PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲 線で判定。
c) Pan-HIV_l法でサブタイプ Cの検体を正確に定量できるか否かの確認。
d) Sub-B法でサブタイプ Cの検体を正確に定量できるか否かの確認。
[0253] (実験結果の判定方法）
本発明法 (Pan-HIV-1法)と公知文献法 (Sub-B法)を用い、 108から 10コピー/ assayに ついて、同時にリアルタイム PCRを行い、 PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で 判定。
[0254] 〈検体:サブタイプ C-C1〉
(1)発明法 (Pan-HIV-1法)による結果を図 25に示す。
[0255] (2)公知文献法 (Sub-B法)による結果を図 26に示す。
[0256] (結果）
Pan- HIV-1法と Sub-B法とでは PCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例え ば、検体 C1のコピー数が 108コピーの時、 Pan-HIV-1法では 10サイクル目に立ち上が つていたが、 Sub-B法では 30サイクル目での立ち上がりであった。これは PCRの回数 で 22°違うことを意味し、 PCR生成物で換算すると 1000000倍の差となる。
[0257] 〈検体：サブタイプ C- C2〉
(1)発明法 (Pan-HIV-1法)による結果を図 27に示す。
[0258] (2)公知文献法 (Sub-B法)による結果を図 28に示す。
[0259] (結果）
Pan- HIV-1法と Sub-B法とでは PCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例え ば、検体 C2のコピー数が 108コピーの時、 Pan-HIV-1法では 10サイクル目に立ち上が つていたが、 Sub-B法では 30サイクル目での立ち上がりであった。これは PCRの回数 で 22Q違うことを意味し、 PCR生成物で換算すると 1000000倍の差となる。
[0260] ii)Pan-HIV-l法でサブタイプ Cの検体を正確に定量できて!/、る事を確認した。
スタンダード： pUC-IIIB
[0261] 〈検体：サブタイプ C-C1〉
[0262] 発明法 (Pan-HIV-1法)により複数回 (5回)測定を行った結果を、表 21及び図 29に示 す。
[0263] 〈検体：サブタイプ C- C2〉
[0264] 発明法 (Pan-HIV-1法)により複数回 (5回)測定を行った結果を、表 22及び図 30に示 す。
[0265] 図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサ ブタイプ C検体のコピー数を示す。
[0266] 《Pan-HIV-l法：定量結果》
〈検体:サブタイプ C-C1〉
[0267] [表 21]
Figure imgf000050_0001
[0268] (結果）
非常に良好な正確性をもち、かつ再現性良くサブタイプ Cの検体を測定することがで きた。
[0269] 〈検体：サブタイプ C- C2〉
[0270] [表 22]
Figure imgf000051_0002
[0271] (結果）
非常に良好な正確性をもち、かつ再現性良くサブタイプ Cの検体を測定することがで きた。
[0272] iii)公知文献法 (Sub-B法)でサブタイプ Cの検体を正確に定量できる力否かの検証を 行った。
スタンダード： pUC-IIIB
[0273] 〈検体：サブタイプ C-C1〉
公知文献法 (Sub-B法)により複数回 (5回)測定を行った結果を、表 23及び図 31に示 す。
[0274] 〈検体：サブタイプ C- C2〉
公知文献法 (Sub-B法)により複数回 (5回)測定を行った結果を、表 24及び図 32に示 す。
[0275] 図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサ ブタイプ C検体のコピー数を示す。
[0276] (Sub-B法によるサブタイプ C-C1検体の測定結果）
[0277] [表 23]
Figure imgf000051_0001
[0278] (結果）
期待値に比べ 1/105程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定 できな力つたことを意味する。
[0279] 〈サブタイプ C- C2検体〉
[0280] (Sub-B法によるサブタイプ C- C2検体の測定結果）
[0281] [表 24]
Figure imgf000052_0001
[0282] 《まとめ》
1.サブタイプ Cの検体では Sub-B法でリアルタイム PCRを行った際、 PCRの立ち上が りサイクル数が極端に大きぐこれは、 Pan-HIV-1法と比べ約 20サイクルの違いを示し た。
2.これは PCRの回数で 22Q違うことを意味し、 PCR生成物で換算すると 1000000倍の差 となる。
3.実際の定量値で見てみると、 Sub-B法では期待値に比べ 1/105程度の量として算 定されたにすぎな力つた。すなわち、正確な定量ができな力つたことを意味する。
4.一方、 Pan-HIV-1法を用いた場合、 10コピー時の場合、 C1検体で期待値の 72% 、 C2期待値の 130%であった力 それ以外のコピー数では C1検体で 88%から 126% の値を C2検体で 83〜124%示した。リアルタイム PCRの結果としては極めて良好であ つた o
5.今まで測定できなかったサブタイプ Cの検体も本発明法である Pan- HIV-1法で正 確にまた、再現性良く測定できるようになった事が示された。
[0283] (プライマー，プローブ配列の検証）
本実施例，比較例で用いたプライマー，プローブの設計のもととなった HXB2遺伝子 上の対応する領域と、 HIV-1遺伝子のサブタイプ Cの患者遺伝子の該当領域を比較 対照した図を、図 33に示す。 [0284] Sub- B法ではリバース側プライマーの 5，側 3塩基目（リバースプライマーの 3，側 3塩基 目に相当する領域）〖こ A→G変異が入っており、この変異のため、プライマー結合及 び伸長反応が効率よく行われず、 PCR反応が開始時サイクルの極端な遅れが発生し 、それにより PCR反応物の減少が生じたと思われる。
[0285] [実施例 4 (HIV-1遺伝子サブタイプ Dの検出及び定量) ]
発明したプライマー、プローブの有用性の有用性 (実施例 4)を、公知のサブタイプ B 用に開発された、プライマー，プローブと比較する（比較例 4)ため、サブタイプ Dに属 する患者の HIV-1遺伝子の検出及び定量を実施した結果を示す。
[0286] 0まず、各々のプライマー，プライマーを用い、サブタイプ Dの検体でリアルタイム PCR 反応が、理論通りに起こって 、るかにっ 、て検討した。
[0287] 尚、用いた検体は、下記の 2種類である。
(サブタイプ D検体情報）
D1 : DNA濃度 25η§/ /ζ 1
D2 : DNA濃度 38η§/ /ζ 1
DNAの塩基数： 453 bp
(スタンダード）
サブタイプ Bの HIV-1である ΠΙΒ実験室株を pUCl 18プラスミドに挿入したスタンダード プラスミド (pUC-IIIB)
[0288] (実施内容）
a)サブタイプ Dの検体を 10倍ずつ段階希釈し、反応液あたり 108から 10コピー加えた P CR反応液を作成。
b)本発明のプライマー，プローブを用いた発明法 (Pan- HIV-1法)と、公知のサブタイ プ B用に開発されたプライマー，プローブを用いた公知文献法 (Sub-B法)を用い、 108 力 10コピー/ assayのリアルタイム PCRを行い、 PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲 線で判定。
c) Pan-HIV_l法でサブタイプ Dの検体を正確に定量できるか否かの確認。
d) Sub-B法でサブタイプ Dの検体を正確に定量できか否かの確認。
[0289] (実験結果の判定方法） 発明法 (Pan-HIV-1法)と公知文献法 (Sub-B法)を用い、 108から 10コピー/ assayについ て、同時にリアルタイム PCRを行い、 PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。
[0290] 〈検体：サブタイプ D— Dl〉
(1)発明法 (Pan-HIV-1法)による結果を図 34に示す。
[0291] (2)公知文献法 (Sub-B法)による結果を図 35に示す。
[0292] (結果）
Pan- HIV-1法と Sub-B法とでは PCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例え ば、検体 D1のコピー数が 108コピーの時、 Pan-HIV-1法では 10サイクル目に立ち上が つていたが、 Sub-B法では 22サイクル目での立ち上がりであった。これは PCRの回数 で 212違うことを意味し、 PCR生成物で換算すると 4000倍の差となる。
[0293] 〈検体：サブタイプ D- D2〉
(1)発明法 (Pan-HIV-1法)による結果を図 36に示す。
[0294] (2)公知文献法 (Sub-B法)による結果を図 37に示す。
[0295] (結果）
Pan- HIV-1法と Sub-B法とでは PCRの立ち上がりの位置が極端に異なっていた。例え ば、検体 D2のコピー数が 108コピーの時、 Pan-HIV-1法では 10サイクル目に立ち上が つていたが、 Sub-B法では 30サイクル目での立ち上がりであった。これは PCRの回数 で 22Q違うことを意味し、 PCR生成物で換算すると 1000000倍の差となる。
[0296] ii)Pan-HIV-l法でサブタイプ Dの検体を正確に定量できて!/、る事を確認した。
スタンダード： pUC-IIIB
[0297] 〈検体：サブタイプ D- Dl〉
発明法 (Pan-HIV-1法)により複数回 (5回)測定を行った結果を、表 25及び図 38に示 す。
[0298] 〈サブタイプ D-D2〉
発明法 (Pan-HIV-1法)により複数回 (5回)測定を行った結果を、表 26及び図 39に示 す。図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字が サブタイプ D検体のコピー数を示す。
[0299] 《Pan-HIV-l法：定量結果》 〈検体:サブタイプ D-D 1〉
[0300] (Pan-HIV-1法によるサブタイプ D-D1検体の測定結果)
[0301] [表 25]
Figure imgf000055_0001
[0302] (結果）
非常に良好な正確性をもち、かつ再現性良くサブタイプ Dの検体を測定することがで きた。
[0303] 〈検体：サブタイプ D- D2〉
[0304] (Pan-HIV-1法によるサブタイプ D-D2検体の測定結果）
[0305] [表 26]
Figure imgf000055_0002
[0306] (結果）
非常に良好な正確性をもち、かつ再現性良くサブタイプ Dの検体を測定することがで きた。
[0307] iii)Sub-B法でサブタイプ Dの検体を正確に定量できるか否かの検証を行った。
スタンダード： pUC-IIIB
[0308] 〈検体：サブタイプ D- Dl〉
公知文献法 (Sub-B法)により複数回 (5回)測定を行った結果を、表 27及び図 40に示 す。
[0309] 〈検体：サブタイプ D- D2〉
公知文献法 (Sub-B法)により複数回 (5回)測定を行った結果を、表 28及び図 41に示 す。
[0310] 図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサ ブタイプ D検体のコピー数を示す。
[0311] 〈く Sub-B法 定量結果》
〈サブタイプ D-D1検体〉
[0312] (Sub-B法によるサブタイプ D-D1検体の測定結果）
[0313] [表 27]
Figure imgf000056_0001
[0314] (結果）
期待値に比べ 1/103程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定 できな力つたことを意味する。
[0315] 〈サブタイプ D- D2検体〉
[0316] (Sub-B法によるサブタイプ D-D2検体の測定結果）
[0317] [表 28]
Figure imgf000056_0002
[0318] (結果）
期待値に比べ 1/105程度の量として算定されたにすぎない。すなわち、正確な定量が できな力つたことを意味する。
[0319] 《まとめ》
1.サブタイプ Dの検体では個体間でその差はあったものの Sub-B法でリアルタイム P CRを行った際、 PCRの立ち上がりサイクル数が極端に大き力つた。（108コピーのサン プルが D1では 22サイクル目、 D2では 30サイクルで立ち上がり始めた） 2. Pan-HIV-1法と比べてみると、 PCRの回数に例えると D1検体では 212違うことを意 味し、 PCR生成物で換算すると 4000倍の差となる。 D2では 22Q違うことを意味し、 PCR 生成物で換算すると 1000000倍の差となる。
3.実際の定量値で見てみると、 Sub-B法で定量を行った際、期待値と比べ D1検体で 1/103程度の量、 D2検体で 1/105程度の量は算定されたにすぎな力つた。すなわち、 正確な定量ができな力つたことを意味する。
4.一方、 Pan-HIV-1法を用いた場合、 10コピー時の場合、 D1検体で期待値の 180% 、 D2期待値の 70%であった力 それ以外のコピー数では D1検体で 89%から 127%の 値を D2検体で 78〜122%示した。リアルタイム PCRの結果としては極めて良好であつ た。
5.今まで測定できなかったサブタイプ Dの検体も本発明法である Pan-HIV-1法で正 確にまた、再現性良く測定できるようになった事が示された。
[0320] (プライマー，プローブ配列の検証）
本実施例，比較例で用いたプライマー，プローブの設計のもととなった HXB2遺伝子 上の対応する領域と、 HIV-1遺伝子のサブタイプ Dの患者遺伝子の該当領域を比較 対照した図を、図 42に示す。
[0321] リバース側プライマーの 5，側 3塩基目（リバースプライマーの 3，側 3塩基目に相当する 領域）に A→Gの変異があるため、プライマーと铸型が結合しにくい状態になっていた と考えられる。そのため、リアルタイム PCR画面上で見られた反応開始サイクルの大 幅な遅延及び、それにより PCR反応物の減少が生じたと思われる。
[0322] [実施例 5 (HIV-1遺伝子サブタイプ組換え流行株， CRF01_AEの検出及び定量) ] 発明したプライマー、プローブの有用性の有用性 (実施例 5)を、公知のサブタイプ B 用に開発された、プライマー，プローブと比較する（比較例 5)ため、サブタイプ糸且換え 流行株 CRF01_AEに属する患者の HIV-1遺伝子の検出及び定量を実施した結果を 示す。
[0323] 0まず、各々のプライマー，プライマーを用い、サブタイプ組換え流行株 CRF01_AEの 検体でリアルタイム PCR反応が理論通りに起こって 、るかにっ 、て検討した。
[0324] 尚、用いた検体は、下記の 2種類である。 (CRF01_AE検体情報）
CRF0LAE1： DNA濃度 54ng/ μ 1
CRF0LAE2： DNA濃度 35ng/ μ 1
DNAの塩基数： 453 bp
(スタンダード）
サブタイプ Bの HIV-1である ΠΙΒ実験室株を pUCl 18プラスミドに挿入したスタンダード プラスミド (pUC-IIIB)
[0325] (実施内容）
a) CRF01_AEの検体を段階希釈し、反応液あたり 108から 10コピー加えた PCR反応液 を作成
b)発明法 (Pan- HIV-1法)と公知文献法 (Sub-B法)を用い、 108から 10コピー/ assayのリ アルタイム PCRを行 、、 PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。
c) Pan-B法で CRF01_AEの検体を正確に定量できるか否かの確認。
d) Sub-B法で CRF01_AEの検体を正確に定量できか否かの確認。
[0326] (実験結果の判定方法）
発明法 (Pan-HIV-1法)と公知文献法 (Sub-B法)を用い、 108から 10コピー/ assayについ て、同時にリアルタイム PCRを行い、 PCR反応の立ち上がりをシグモイド曲線で判定。
[0327] 〈検体：組換え流行株 CRF01— AE- AE1〉
(1)発明法 (Pan-HIV-1法)による結果を図 43に示す。
[0328] (2)公知文献法 (Sub-B法)による結果を図 44に示す。
[0329] (結果）
Pan- HIV-1法と Sub-B法とでは PCRの立ち上がりの位置は 3サイクルしか違わなかつ た。例えば、検体 AE1のコピー数が 108コピーの時、 Pan-HIV-1法では 10サイクル目 に立ち上がっていたが、 Sub-B法では 13サイクル目での立ち上がりであった。これは P CRの回数で 23違うことを意味し、 PCR生成物で換算すると 8倍の差となる。
[0330] 〈検体：組換え流行株 CRF01— AE- AE2〉
(1)発明法 (Pan-HIV-1法)による結果を図 45に示す。
[0331] (2)公知文献法 (Sub-B法)による結果を図 46に示す。 [0332] (結果）
Sub-B法とでは Pan-HIV-1法に比べ PCRの立ち上がりが 12サイクル遅くなつていた。 例えば、検体 AE2のコピー数が 108コピーの時、 Pan-HIV-1法では 10サイクル目に立 ち上がっていたが、 Sub-B法では 22サイクル目での立ち上がりであった。これは PCR の回数で 212違うことを意味し、 PCR生成物で換算すると 4000倍の差となる。
[0333] ii)Pan-HIV-l法で組換え流行株 CRF01_AEの検体を正確に定量できている事を確認 した。
スタンダード： pUC-IIIB
[0334] 〈検体：組換え流行株 CRF01— AE- AE1〉
発明法 (Pan-HIV-1法)により複数回 (5回)測定を行った結果を、表 29及び図 47に示 す。
[0335] 〈検体：組換え流行株 CRF01— AE- AE2〉
発明法 (Pan-HIV-1法)により複数回 (5回)測定を行った結果を、表 30及び図 48に示 す。
[0336] 図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字が組 換え流行株 CRF01— AE検体のコピー数を示す。
[0337] 〈く Pan-HIV-1法：定量結果》
〈検体：組換え流行株 CRF01— AE- AE1〉
[0338] (Pan- HIV- 1法による CRF01_AE- AE1検体の測定結果）
[0339] [表 29]
Figure imgf000059_0001
[0340] (結果）
10コピーでは期待値の 165%であった力 それ以上のコピー数の実験では 78%から 1 11%の値を示した。リアルタイム PCRの結果としては極めて良好である。
[0341] 〈検体：組換え流行株 CRF01— AE- AE2〉 [0342] (Pan- HIV- 1法による CRF01_AE- AE2検体の測定結果)
[0343] [表 30]
Figure imgf000060_0001
[0344] (結果）
10コピーでは期待値の 50%であった力 それ以上のコピー数の実験では 71%から 10 4%の値を示した。リアルタイム PCRの結果としては良好である。
[0345] iii)Sub-B法で組換え流行株 CRF01_AEの検体を正確に定量できる力否かの検証を行 つ 7こ。
スタンダード： pUC-IIIB
[0346] 〈検体：組換え流行株 CRF01— AE- AE1〉
公知文献法 (Sub-B法)により複数回 (5回)測定を行った結果を、表 31及び図 49に示 す。
[0347] 〈検体：組換え流行株 CRF01— AE- AE2〉
公知文献法 (Sub-B法)により複数回 (5回)測定を行った結果を、表 32及び図 50に示 す。
[0348] 図中の値は、下線の無い数字がスタンダードのコピー数を、下線を施した数字がサ ブタイプ CRF01_AE検体のコピー数を示す。
[0349] 〈く Sub-B法:定量結果》
〈組換え流行株 CRF01_AE- AE1検体〉
[0350] (Sub-B法による CRF01_AE-AE1検体の測定結果）
[0351] [表 31]
期待值
100000000 10000000 1000000 100000 10000 1000 100 10 copies assay)
検体 AH Ave. 25690000 2821000 213300 24830 3353 282 47 16
SD 2230000 406000 26740 2782 70 n 3 e
Cv (X) 8.9 14.4 12 - 5 11 .2 2.1 7.5 35 - 0 正確性 CI) 25.7 2S.2 21 .3 24.9 33.6 2S .2 47.1 163.0 [0352] (結果）
10コピーの検体は 16コピーと高値を示した力 後の検体は期待値の 1/4程度のコピ 一数として算出され、その正確性は 21〜47%と低いものであった。よって、 Sub-B法 のプライマーセット、プローブを用い CRF01_AEの検体を正確に測定することは困難 であるといえる。
[0353] 〈組換え流行株 CRF01AE- AE2検体〉
[0354] (Sub-B法による CRF01_AE-AE2検体の測定結果）
[0355] [表 32]
Figure imgf000061_0001
[0356] (結果）
全ての検体において期待値の 1/1000〜1/100程度のコピー数としてしか算出されな かった。よって、 Sub- B法のプライマーセット、プローブを用い CRF01_AEの検体を正 確に測定することは困難であるといえる。
[0357] 《まとめ》
1. CRF01_AEの検体の場合、 Sub-B法でリアルタイム PCRを行った際、 PCRの立ち上 力 Sりサイクル数が極端に異なっていた。（108コピーのサンプル力 SAE1では 13サイクル 目、 AE2では 22サイクルで立ち上がり始めた）
2. Pan-HIV-1法と比較すると、 PCRの回数に例えると AE1検体ではで 23違うことを意 味し、 PCR生成物で換算すると 8倍の差となる。一方、 AE2では 212違うことを意味し、 P CR生成物で換算すると 4000倍の差となる。
3.実際の定量値で見てみると、 Sub-B法で定量を行った際、期待値と比べ AE1検体 で 1/4程度の誤差であった力 AE2検体では、予想通り期待値の 1/1000程度の量し か測定されな力つた。すなわち、 Sub-B法では正確な定量が難しいことを意味する。
4.一方、 Pan-HIV-1法を用いた場合、 10コピー時の場合、 AE1検体で期待値の 165 %、 AE2検体で期待値の 50%であった力 それ以外のコピー数では AE1検体で 78% から 111%の値を AE2検体で 71%から 104%を示した。リアルタイム PCRの結果として は極めて良好であった。
5.今まで測定できなかつた CRFO 1_AEの検体も本発明法である Pan- HIV-1法で正確 にまた、再現性良く測定できるようになった事が示された。
[0358] (プライマー，プローブ配列の検証）
本実施例，比較例で用いたプライマー，プローブの設計のもととなった HXB2遺伝子 上の対応する領域と、 HIV-1遺伝子のサブタイプ組換え流行株 CRF01_AEの患者遺 伝子の該当領域を比較対照した図を、図 51に示す。
[0359] リバース側プライマーの 5，側 3塩基目（リバースプライマーの 3，側 3塩基目に相当する 領域）に A→Gの変異があるため、プライマーと铸型が結合しにくい状態になっていた と考えられる。そのため、リアルタイム PCR画面上で見られた反応開始サイクルの大 幅な遅延及び、それにより PCR反応物の減少が生じたと思われる。
[0360] (実施例の考察）
[0361] 以上の結果から、本発明のプライマー，プローブ等を用いる本発明法 (Pan-HIV-1法) は、従来可能であったサブタイプ Bの 1種類だけでなぐサブタイプ A,C,D,及びサブタ イブ組換え流行株 CRF01_AE等にっ 、ても、同時に検出及び定量可能であることが 判明した。このことは、サブタイプ等の違いによる検出漏れを防ぐという意味で、本発 明の検出又は定量方法が、実用上極めて優れていることを意味している。また、本発 明のプライマー，プローブ等を用いる本発明法 (Pan-HIV-1法)が、濃度既知の 10コピ 一/ assay程度まで、 HIV-1遺伝子の検出及び定量も正確にできたという上記の結果 は、本発明のプライマー，プローブ等を用いる本発明法 (Pan-HIV-1法)力 微量な HI V-1遺伝子の測定に適した nested—リアルタイム PCR法を用いた際に、特にその有用 性を発揮し得ることを示して 、る。
産業上の利用可能性
[0362] 本発明のプライマー，プローブあるいはそれらを含むキットを用いた本発明の検出又 は定量方法によって、少なくとも HIV-1遺伝子のサブタイプ A,B,C,D,サブタイプの組 換え流行株 CRF01_AEは、確実に増幅，検出又は定量することができ、世界で感染 が流行しているかなりの部分が検出又は定量可能となる。特に、本発明のプライマー を 2対用いた、 nested- PCR法や nested-リアルタイム PCR法によれば、極めて低コピー の HIV-1遺伝子でも、特異的にかつ正確に測定ができる。実に、 2コピー Z106細胞と V、う驚異的な感度を達成することができる。
図面の簡単な説明
[0363] [図 1]各プライマー、プローブのベストマッチ配列の位置関係
[0364] [図 2]高感度リアルタイム PCR法の方法論
[0365] [図 3]サブタイプ A-A1検体における Pan-HIV-1法のフルォログラム
[0366] [図 4]サブタイプ A-A1検体における Sub-B法のフルォログラム
[0367] [図 5]サブタイプ A-A2検体における Pan-HIV-1法のフルォログラム
[0368] [図 6]サブタイプ A-A2検体における Sub-B法のフルォログラム
[0369] [図 7]サブタイプ A-A3検体における Pan-HIV-1法のフルォログラム
[0370] [図 8]サブタイプ A-A3検体における Sub-B法のフルォログラム
[0371] [図 9]Pan- HIV-1法によるサブタイプ A-A1検体の測定結果のフルォログラム
[0372] [図 10]Pan- HIV-1法によるサブタイプ A-A2検体の測定結果のフルォログラム
[0373] [図 ll]Pan- HIV-1法によるサブタイプ A-A3検体の測定結果のフルォログラム
[0374] [図 12]Sub-B法によるサブタイプ A-A1検体の測定結果のフルォログラム
[0375] [図 13]Sub-B法によるサブタイプ A-A2検体の測定結果のフルォログラム
[0376] [図 14]Sub-B法によるサブタイプ A-A3検体の測定結果のフルォログラム
[0377] [図 15]サブタイプ A検体のプライマー、プローブ領域の塩基配列とミスマッチの有無
[0378] [図 16]サブタイプ B-B1検体における Pan-HIV-1法のフルォログラム
[0379] [図 17]サブタイプ B-B1検体における Sub-B法のフルォログラム
[0380] [図 18]サブタイプ B-B2検体における Pan-HIV-1法のフルォログラム
[0381] [図 19]サブタイプ B-B2検体における Sub-B法のフルォログラム
[0382] [図 20]Pan- HIV-1法によるサブタイプ B-B1検体の測定結果のフルォログラム
[0383] [図 21]Pan- HIV-1法によるサブタイプ B-B2検体の測定結果のフルォログラム
[0384] [図 22]Sub-B法によるサブタイプ B-B1検体の測定結果のフルォログラム
[0385] [図 23]Sub-B法によるサブタイプ B-B2検体の測定結果のフルォログラム
[0386] [図 24]サブタイプ B検体のプライマー、プローブ領域の塩基配列とミスマッチの有無 [0387] [図 25]サブタイプ C- C1検体における Pan- HIV-1法のフルォログラム
[0388] [図 26]サブタイプ C- C1検体における Sub-B法のフルォログラム
[0389] [図 27]サブタイプ C- C2検体における Pan- HIV-1法のフルォログラム
[0390] [図 28]サブタイプ C-C2検体における Sub-B法のフルォログラム
[0391] [図 29] Pan-HIV-1法によるサブタイプ C- C1検体の測定結果のフルォログラム
[0392] [図 30] Pan-HIV-1法によるサブタイプ C- C2検体の測定結果のフルォログラム
[0393] [図 31] Sub-B法によるサブタイプ C-C1検体の測定結果のフルォログラム
[0394] [図 32] Sub-B法によるサブタイプ C-C2検体の測定結果のフルォログラム
[0395] [図 33]サブタイプ C検体のプライマー、プローブ領域の塩基配列とミスマッチの有無
[0396] [図 34]サブタイプ D-D1検体における Pan-HIV-1法のフルォログラム
[0397] [図 35]サブタイプ D-D1検体における Sub-B法のフルォログラム
[0398] [図 36]サブタイプ D-D2検体における Pan-HIV-1法のフルォログラム
[0399] [図 37]サブタイプ D-D2検体における Sub-B法のフルォログラム
[0400] [図 38] Pan-HIV-1法によるサブタイプ D-D1検体の測定結果のフルォログラム
[0401] [図 39] Pan-HIV-1法によるサブタイプ D-D2検体の測定結果のフルォログラム
[0402] [図 40] Sub-B法によるサブタイプ D-D1検体の測定結果のフルォログラム
[0403] [図 41] Sub-B法によるサブタイプ D-D2検体の測定結果のフルォログラム
[0404] [図 42]サブタイプ D検体のプライマー、プローブ領域の塩基配列とミスマッチの有無
[0405] [図 43]組換え流行株 CRF01_AE-AE1検体における Pan- HIV-1法のフルォログラム
[0406] [図 44]組換え流行株 CRF01_AE-AE1検体における Sub-B法のフルォログラム
[0407] [図 45]組換え流行株 CRF01_AE- AE2検体における Pan- HIV- 1法のフルォログラム
[0408] [図 46]組換え流行株 CRF01_AE-AE2検体における Sub-B法のフルォログラム
[0409] [図 47] Pan- HIV-1法による組換え流行株 CRF01_AE-AE1検体の測定結果のフルォロ グラム
[0410] [図 48] Pan- HIV-1法による組換え流行株 CRF01_AE-AE2検体の測定結果のフルォロ グラム
[0411] [図 49] Sub-B法による組換え流行株 CRF01_AE-AE1検体の測定結果のフルォロダラ ム [0412] [図 50]Sub-B法による組換え流行株 CRF01_AE-AE2検体の測定結果のフルォロダラ ム
[0413] [図 51]組換え流行株 CRF01_AE検体のプライマー、プローブ領域の塩基配列とミスマ ツチの有無

Claims

請求の範囲
[1] 下記の配列番号 1のポリヌクレオチド力もなる、人免疫不全ウィルス 1遺伝子の検 出又は定量用プライマー及び Z又はプローブ配列の選択用塩基配列。
目己列 ¾·号 1： cctagaactt taaatgcatg ggtaaaagta gtagaagaga aggctttcag cccagaagtg atac ccatgt tttcagcatt atcagaagga gccaccccac aagatttaaa caccatgcta aacacagtgg ggggacat ca agcagccatg caaatgttaa aagagaccat caatgaggaa gctgcagaat gggatagagt
[2] 下記 (ァ）又は (ィ)力も選択されるポリヌクレオチドの一種力もなる、人免疫不全ウイ ルス 1遺伝子検出又は定量用プライマー。
(ァ）配列番号 2〜9から選択されるポリヌクレオチドの一種
(ィ）配列番号 3, 5, 7, 9のいずれかのポリヌクレオチドの、 3'末端の 3塩基を除く他 の塩基のうち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド 目列 号 2： ncnannncnn tnaatncnnn ggt
目己列 ¾·号 3： cctagaactt taaatgcatg ggt
目列 号 4： ccnnanntna tnccnatgtt
目己列 ¾·号 5： ccagaagtga tacccatgtt
目列 号 6 :ttnannatmi gcanngnngc
酉己歹1 j番 7 :tttaacattt gcatggctgc
目列 号 8： antnnnnngn ntcntcnntn at
酉己列番 9： attctgcagc ttcctcattg at
[3] 下記グループ (I)又は（II)に属するポリヌクレオチドの一種と、下記グループ (III)又は
(IV)に属するポリヌクレオチドの一種力もなる、人免疫不全ウィルス 1遺伝子検出 又は定量用プライマー対。
グループ (I) :配列番号 2, 3,又は配列番号 3の、 3 '末端の 3塩基を除く他の塩基のう ち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（II)：配列番号 4, 5,又は配列番号 5の、 3 '末端の 3塩基を除く他の塩基の うち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド グループ (III)：配列番号 6, 7,又は配列番号 7の、 3'末端の 3塩基を除く他の塩基 のうち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド グループ (IV)：配列番号 8, 9,又は配列番号 9の、 3'末端の 3塩基を除く他の塩基 のうち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
[4] 下記（1)又は（2)力もなるポリヌクレオチドを構成要素として含む、人免疫不全ウィル スー 1遺伝子検出又は定量用プローブ。
(1)下記グループ (V)又は (VI)から選択されるポリヌクレオチドの一種
(2)一端に蛍光物質，他端に消光物質を結合された下記グループ (V)又は (VI)から 選択されるポリヌクレオチドの一種
グループ (V) :配列番号 10, 11,又は配列番号 11の、 5'末端の 3塩基を除く他の塩 基のうち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド グループ (VI)：グループ (V)の相補体
列 号 10 : atcmimmgn nnnnnnccnt nngnnanngc
目己列 ¾·号 11： atcttgtggg gtggctcctt ctgataatgc
[5] 下記 (A)乃至 (C)の少なくとも ヽずれか一つを含むことを特徴とする、人免疫不全ゥ ィルス 1遺伝子検出又は定量用キット。
(A)請求項 2に記載のプライマーの少なくとも一種
(B)請求項 3に記載のプライマー対の少なくとも一種
(C)請求項 4に記載のプローブの少なくとも一種
[6] 下記 (A)乃至 (D)の少なくともいずれか一つを用いることを特徴とする、人免疫不全 ウィルス 1遺伝子の検出又は定量方法。
(A)請求項 2に記載のプライマーの少なくとも一種
(B)請求項 3に記載のプライマー対の少なくとも一種
(C)請求項 4に記載のプローブの少なくとも一種
(D)請求項 5に記載の検出又は定量用キット
[7] 下記 (A)乃至（D)の少なくともいずれか一つを用い、下記（a)乃至（d)のいずれかの 方法を用いることを特徴とする、人免疫不全ウィルス 1遺伝子の検出又は定量方 法。
(A)請求項 2に記載のプライマーの少なくとも一種 (B)請求項 3に記載のプライマー対の少なくとも一種
(C)請求項 4に記載のプローブの少なくとも一種
(D)請求項 5に記載の検出又は定量用キット
(a) PCR法
(b) Nested- PCR法
(c)リアルタイム PCR法
(d) nested-リアルタイム PCR法
[8] 下記グループ (I)乃至 (VI)に属するポリヌクレオチドの一種力もなる、人免疫不全症候 群治療用遺伝子断片。
グループ (I) :配列番号 2, 3,又は配列番号 3の、 3 '末端の 3塩基を除く他の塩基のう ち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（II)：配列番号 4, 5,又は配列番号 5の、 3 '末端の 3塩基を除く他の塩基の うち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド グループ (III)：配列番号 6, 7,又は配列番号 7の、 3'末端の 3塩基を除く他の塩基 のうち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド グループ (IV)：配列番号 8, 9,又は配列番号 9の、 3'末端の 3塩基を除く他の塩基 のうち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド グループ (V) :配列番号 10, 11,又は配列番号 11の、 5'末端の 3塩基を除く他の塩 基のうち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド グループ (VI)：グループ (V)の相補体
[9] 下記グループ (I)乃至 (VI)に属するポリヌクレオチドの一種を用いることを特徴とする、 人免疫不全症候群の治療方法。
グループ (I) :配列番号 2, 3,又は配列番号 3の、 3 '末端の 3塩基を除く他の塩基のう ち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド
グループ（II)：配列番号 4, 5,又は配列番号 5の、 3 '末端の 3塩基を除く他の塩基の うち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド グループ (III)：配列番号 6, 7,又は配列番号 7の、 3'末端の 3塩基を除く他の塩基 のうち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド グループ (IV)：配列番号 8, 9,又は配列番号 9の、 3'末端の 3塩基を除く他の塩基 のうち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド グループ (V) :配列番号 10, 11,又は配列番号 11の、 5'末端の 3塩基を除く他の塩 基のうち、 1個又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたポリヌクレオチド グループ (VI)：グループ (V)の相補体
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