WO2016098892A1 - ザイールエボラウイルス検出用プライマーセット、アッセイキットおよび増幅方法 - Google Patents

ザイールエボラウイルス検出用プライマーセット、アッセイキットおよび増幅方法 Download PDF

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WO2016098892A1
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complementary
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二朗 安田
陽平 黒▲崎▼
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国立大学法人 長崎大学
東芝メディカルシステムズ株式会社
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    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
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    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a primer set for detecting Zaire Ebola virus, an assay kit, and an amplification method.
  • Ebola virus is a virus that infects humans or non-human primates and kills them with high probability.
  • EBOV includes 5 of Zaire Ebola virus (ZEBOV), Sudan Ebola virus (SEBOV), Thai Forest Ebola virus (formerly Ivory Coast Ebola virus) (ICEBOV), Bundibu Goebola virus (BEBOOV) and Reston Ebola virus (REBOV).
  • ZEBOV Zaire Ebola virus
  • SEBOV Sudan Ebola virus
  • ICEBOV Thai Forest Ebola virus (formerly Ivory Coast Ebola virus)
  • BEBOOV Bundibu Goebola virus
  • REBOV Reston Ebola virus
  • ZEBOV has a fatality rate of 90% and is known as the most pathogenic virus.
  • ZEBOV is detected by pathological methods, antigen-antibody reaction methods using monoclonal antibodies, PCR methods using specific primer sets, and the like.
  • Embodiment aims at providing the means which can amplify or detect ZEBOV accurately.
  • a nucleic acid primer set for LAMP amplification for specifically amplifying the ZEBOV gene is provided.
  • the F1 sequence contains at least 13 consecutive bases contained in SEQ ID NO: 31 or 64.
  • the F2 sequence contains at least 13 consecutive bases contained in SEQ ID NO: 62 or 63.
  • the F3 sequence comprises at least 13 consecutive bases contained in SEQ ID NO: 29, 36, 38, 55, 56, 57, 58, 59, 60 or 61.
  • the B1c sequence comprises at least 13 consecutive bases contained in SEQ ID NO: 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 or 75.
  • the B2c sequence contains at least 13 consecutive bases contained in SEQ ID NO: 65 or 66.
  • the B3c sequence contains at least 13 consecutive bases contained in SEQ ID NO: 34, 67, 82 or 83.
  • ZEBOV is a non-segmented negative-strand RNA virus, and its length is about 19 kb. There are a leader region and a trailer region, which are non-coding sequences, at the 3 'end and 5' end of the gene, respectively.
  • the embodiment is based on the discovery that a ZEBOV strain that could not be detected so far can be detected by designing a primer region using a specific sequence of the trailer region.
  • the primer set of the embodiment can detect a 2014-type Guinea strain (Guinea 14 strain).
  • a 2014-type Guinea strain (Guinea 14 strain).
  • 14 strains of Guinea cannot be detected.
  • the 1976-type Zaire strain (Zaire 76 strain)
  • the 1995-type Zaire strain (Zaire 95 strain) that were popular in the past were used.
  • the primer region according to the embodiment will be described with reference to FIGS. 1A and 1B.
  • FIG. 1A is a diagram showing ZEBOV RNA (referred to as “vRNA” in the figure) as a template, its cDNA, and each primer in association with each other.
  • the ZEBOV RNA to be detected includes an F3c region, an F2c region, an F1c region, a B1 region, a B2 region, and a B3 region as regions (that is, recognition regions) to which each primer binds. These regions are contained in the ZEBOV RNA in this order from the 3 'side to the 5' side. These regions include the F3c sequence, F2c sequence, F1c sequence, B1 sequence, B2 sequence and B3 sequence, respectively. These sequences and their complementary sequences, ie, F3 sequence, F2 sequence, F1 sequence, B1c sequence, B2c sequence and B3c sequence are referred to as recognition sequences.
  • Such ZEBOV RNA is used as the first template sequence.
  • CDNA is a complementary strand of ZEBOV RNA, and includes F3 sequence, F2 sequence, F1 sequence, B1c sequence, B2c sequence, and B3c sequence from 5 ′ side to 3 ′ side.
  • a cDNA is produced from the ZEBOV RNA contained in the sample to be examined by reverse transcription, and the amplification reaction is performed with the primer set of the embodiment using the ZEBOV RNA and cDNA as a template nucleic acid.
  • the F1 and F1c, F2 and F2c, F3 and F3c, B1 and B1c, B2 and B2c, and B3 and B3c sequences are complementary to each other.
  • a primer set including an internal primer (FIP and BIP primer) corresponding to the above six recognition regions and two external primers (F3 and B3 primers) was designed as one set.
  • the primer set according to the embodiment includes an FIP primer, an F3 primer, a BIP primer, and a B3 primer.
  • the FIP primer includes an F1c sequence and an F2 sequence from the 5 'side toward the 3' side.
  • the F3 primer contains the F3 sequence.
  • the BIP primer includes a B1c sequence and a B2 sequence from the 5 'side toward the 3' side.
  • the B3 primer contains the B3 sequence. Regions corresponding to the sequences of these primers are indicated by arrows in FIG. 1A.
  • the direction of the arrow indicates the directionality of the primer sequence corresponding to each region.
  • the starting point of the arrow represents the 5 'end and the end point of the arrow represents the 3' end.
  • the primer set according to the embodiment may include an LF primer and / or an LB primer as a loop primer.
  • FIG. 1B is a diagram showing an example of design sequences of the LF primer and the LB primer in addition to the primer design sequence of FIG. 1A.
  • ZEBOV RNA includes F3c region, F2c region, LFc region, F1c region, B1 region, LB region, B2 region, and B3 region as primer recognition regions. These regions are contained in the ZEBOV RNA in this order from the 3 'side to the 5' side.
  • the LFc region and the LB region include an LFc sequence and an LB sequence, respectively.
  • Such ZEBOV RNA is used as a template sequence.
  • the loop primer may be designed to bind to the loop portion of the amplification product, for example.
  • the loop portion may be a region indicated as a single-stranded portion in FIG. 1B. That is, the loop region is, for example, a range from the 5 ′ end of the F2c region of the vRNA to the base 3 ′ side of the 3 ′ end of the F1c region, or the 3 ′ end of the B2 region of the vRNA to the 5 ′ end of the B1 region. It may be in the range up to 5 ′ base.
  • each primer was determined by comparing the sequences of the 130 strains with accession numbers shown in Table 1.
  • Table 2 These strain names are shown in Table 2.
  • Table 2-1, Table 2-2, Table 2-3, Table 2-4, and Table 2-5 are collectively referred to as Table 2.
  • the comparison of the 130 strains was done by creating an alignment.
  • the used region is the 18299th to 18658th of the cDNA region corresponding to the trailer sequence of each strain.
  • the primer recognition region is designed using the LAMP primer design support software program (PrimerExplorer.ver.3; Net Research Laboratory, Tokyo (Japan); http://primerexplorer.jp/e/). Thereafter, the position on the cDNA and the type of base were altered and adjusted manually and visually while taking into account information from the alignment and experimental results.
  • the designed base area is the Tr2 system.
  • the Tr2-based F3, F2, F1, B1c, B2c and B3c regions are the regions of 18339-18358, 18368-18388, 18408-18427, 18449-18471, 18501-18522 and 18543-18562, respectively. is there.
  • the T273 system and the 5'UTR system were designed by modifying and adjusting the Tr2 system.
  • the T237 series F3, F2, F1, B1c, B2c and B3c regions are the regions of 18338-18357, 18367-18387, 18407-18426, 18435-18455, 18496-18513 and 18530-18551. .
  • the 5'UTR F3, F2, F1, B1c, B2c, and B3c regions are positions 18321-18343, 18367-18387, 18407-18426, 18449-18471, 18501-18522, and 18530-18551 Furthermore, positions 18388 to 18406 are LF regions.
  • cDNA of Zaire 76 H. sapiens-tc / COD / 1976 / Yambuku- Mayinga
  • 14 strain of Guinea H. sapiens ⁇ wt / GIN / 2014 / Gückedou-C05
  • Zaire 95 strain EBOV / H. sapiens-tc / COD / 1995/13625 Kikwit
  • two Gabon 96 strains EBOV / H. sapiens-tc / GAB / 1996 / 1Eko, EBOV / H. Sapiens-tc / GAB / 1996 / Ilembe
  • Zaire 07 strain EBOV / H.
  • Sapiens-tc / COD / 2007/4 / Luebo Sapiens-tc / COD / 2007/4 / Luebo
  • the sequence shown therein shows 360 bases from the 18299th to 18658th positions in the cDNA region corresponding to the Zaire Ebola virus trailer sequence in the 5 'to 3' direction.
  • 2A to 2C also show the primer recognition of Tr2 system, Tr273 system, and 5′UTR system, that is, Tr273wa system, Tr273wa2 system, Tr273wa3 system, Tr273wa4 system, and Tr273wa5 system, in association with the primer recognition region of cDNA.
  • Tr273wa system Tr273wa2 system
  • Tr273wa3 system Tr273wa4 system
  • Tr273wa5 system Tr273wa5 system
  • Table 3 shows primers designed for each of these strains. This table shows the correspondence between each primer sequence and the corresponding sequence number and the sequences shown in FIGS. 2A-2C.
  • the arrows in the figure indicate the direction of the sequence when used as a primer.
  • the underlined base is a modified site corresponding to the mutation of Guinea 14 strain.
  • FIGS. 3A and 3B examples of specific recognition sequences are shown in FIGS. 3A and 3B as in FIGS. 2A to 2C.
  • the sequence number is shown in parentheses.
  • a sequence number assigned with a symbol “c” indicates that it is a complementary sequence of the sequence represented by the sequence number.
  • FIGS. 3A and 3B the same sequence as the consensus sequence of FIGS. 2A to 2C (that is, the sequence from 18299 to 18658 in the cDNA region) is shown as positions 1 to 360.
  • the recognition sequence included in the primer set of the embodiment can be, for example, as follows.
  • the F3 sequence comprises at least 13 consecutive bases contained in SEQ ID NO: 29, 36, 38, 55, 56, 57, 58, 59, 60 or 61.
  • the F2 sequence contains at least 13 consecutive bases contained in SEQ ID NO: 62 or 63.
  • the F1 sequence contains at least 13 consecutive bases contained in SEQ ID NO: 31 or 64.
  • the B1c sequence comprises at least 13 consecutive bases contained in SEQ ID NO: 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 or 75.
  • the B2c sequence contains at least 13 consecutive bases contained in SEQ ID NO: 65 or 66.
  • the B3c sequence contains at least 13 consecutive bases contained in SEQ ID NO: 34, 67, 82 or 83. Any of these recognition sequences may be at least 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, or 25 bases included in the above SEQ ID NO. It may be 30 bases. Or these complementary sequences may be sufficient.
  • the design of the BIP primer and the selection of the F3 primer and the B3 primer combined therewith are important.
  • the fact that the design of the B1c region and the B2c region and the selection of the F3 primer and the B3 primer are important in order to amplify such a Guinea strain 14 is a finding first discovered by the present inventors.
  • a preferred B1c region for amplifying Guinea strain 14 is positions 18435 to 18471 in the cDNA region corresponding to the trailer sequence.
  • the B1c sequence may be designed based on, for example, the sequences represented by SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 and 75, and more preferably designed based on the SEQ ID NO: 75.
  • a preferred B1c sequence is, for example, at least 13 bases consecutive so as to include a base continuing from any of the first to fifth positions from the 5 ′ end contained in SEQ ID NO: 75, or the first position from the 3 ′ end. It may be at least 13 consecutive bases so as to include a base that continues from any base at the 6th position.
  • Examples of preferred B1c sequences are SEQ ID NOs: 6, 32, 46, 47 and 48, more preferably SEQ ID NOs: 46, 47 and 48.
  • a preferred B2 region for amplifying Guinea strain 14 is positions 18493 to 18522 in the cDNA region corresponding to the trailer sequence.
  • B2c sequences may be designed based on the sequences shown by SEQ ID NOs: 65 and 66, for example.
  • a preferred B2c sequence is, for example, at least 13 bases consecutive so as to include a base continuing from any of the first to seventh bases from the 5 'end contained in SEQ ID NOs: 65 and 66.
  • Examples of preferred B2c sequences are SEQ ID NOs: 33, 50, 51, 52, 53 and 78, more preferably SEQ ID NOs: 50, 51, 52 and 53. Alternatively, these are complementary sequences.
  • An example of a preferred F3 sequence is at least 13 consecutive bases contained in SEQ ID NO: 29, 55, 60 or 61, more preferably from the first position to the 5 ′ end contained in SEQ ID NO: 29, 55, 60 or 61. It is at least 13 bases continuous so as to include a base that continues from any base at the 5th position, for example, SEQ ID NO: 2, 39, and 40, and more preferably SEQ ID NO: 2 or 39. Alternatively, these are complementary sequences.
  • F2 sequences are SEQ ID NOs: 3, 42, 43, 62 and 63, more preferably SEQ ID NOs: 3 and 42. Alternatively, these are complementary sequences.
  • F1 sequences are SEQ ID NOs: 4, 44, 45 and 79, more preferably SEQ ID NOs: 4, 44 and 45. Alternatively, these are complementary sequences.
  • Examples of preferred B3c sequences include at least 13 bases that are consecutive from the 5 ′ end included in SEQ ID NO: 82 so as to include bases continuing from any of the first to fifth bases, or 3 included in SEQ ID NO: 34. It may be at least 13 consecutive bases so as to include a base continuing from any of the first to seventh bases from the end.
  • Preferred B3c sequences are, for example, SEQ ID NOs: 9 and 19. Alternatively, these are complementary sequences.
  • sequences for preferred loop primers are sequences comprising the sequences respectively represented by SEQ ID NOs: 11, 28 and 76, or sequences comprising at least 13 consecutive bases of these sequences.
  • SEQ ID NOs: 11 and 76 can be preferably used as a LFc primer.
  • SEQ ID NOs: 28 and 77 can be preferably used as LBc primers.
  • the sequence for the loop primer may be at least 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 or 25 bases included in the above SEQ ID NO. It may be a base to 30 bases. Or these complementary sequences may be sufficient.
  • the LFc sequence consists of SEQ ID NO: 76 and the LBc sequence consists of SEQ ID NO: 77.
  • these loop primers consist of these complementary sequences.
  • the length of the primer may be 13 to 40 bases, for example, 15 to 30 bases.
  • Any primer may contain additional sequences or components in addition to the recognition sequence, so long as they do not inhibit annealing to the template and do not interfere with primer extension.
  • the FIP primer can include a linker between the F1c and F2 sequences.
  • the BIP primer can also include a linker between the B1 and B2c sequences.
  • the linker sequence may be any base sequence, and preferably may be a sequence that does not specifically bind to the template sequence.
  • the length of the linker sequence may be, for example, 1 to 6 bases.
  • An example of a preferred linker sequence is TTTT.
  • each primer of a preferred primer set can be as follows.
  • the F3 primer may comprise a sequence represented by any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 39, or a complementary sequence thereof.
  • the FIP primer may comprise a sequence represented by any of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 21 or a complementary sequence thereof.
  • the BIP primer may comprise a sequence represented by any of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 27, or a complementary sequence thereof.
  • the B3 primer may comprise the sequence shown in either SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 19 or a complementary sequence thereof.
  • each primer of a preferable primer set can be as follows, for example.
  • the F3 primer may comprise at least 13 consecutive bases contained in the sequence shown in any one of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 39 or a complementary sequence thereof.
  • the FIP primer may comprise at least 13 consecutive bases contained in the sequence shown in any of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 21 or a complementary sequence thereof.
  • the BIP primer may comprise at least 13 consecutive bases contained in the sequence shown in any of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 27 or a complementary sequence thereof.
  • the B3 primer may comprise at least 13 consecutive bases contained in the sequence shown in either SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 19 or a complementary sequence thereof.
  • the combination of sequences for the F3 primer, FIP primer, BIP primer and B3 primer included in the primer set may be selected from the group consisting of: (1) SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 19 combination; (2) SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 10 combination; (3) SEQ ID NO: 20, sequence (4) Combination of SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 10; (5) SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25 and sequence (6) Combination of SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 10; (7) Combination of SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 10; (8 ) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 10; (9) SEQ ID NO: 20, S
  • More preferred primer sets are the above (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13) , (14), (15), (16), (17) and (18) may be a primer set including primers in the combinations shown in FIG.
  • a primer set that further includes a loop primer in the above primer set is also preferable.
  • Such a primer set comprises a sequence combination for F3 primer, FIP primer, BIP primer, B3 primer and LFc loop primer included in the primer set, (20) A combination of SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 11, or a combination of complementary sequences of each of the five sequences included in this primer set; Or a combination of sequences for F3 primer, FIP primer, BIP primer, B3 primer and LBc loop primer included in the primer set, (21) A combination of SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 28, or a combination of complementary sequences of each of the five sequences included in this primer set; Or a combination of sequences for F3 primer, FIP primer, BIP primer, B3 primer, LFc loop primer and LBc loop primer included in the primer set,
  • the above-mentioned primer set includes an LFc primer represented by SEQ ID NO: 76.
  • the sequence included therein may include a sequence corresponding to the recognition sequence for each primer sequence.
  • any primer may contain additional sequences or components in addition to the recognition sequence as long as annealing to the template is not inhibited and primer extension is not prevented.
  • the primer set of the embodiment the 14 strains of Guinea can be amplified, so that it is possible to detect ZEBOV with higher accuracy than before by detecting the amplification product.
  • the primer set it is possible to amplify the genes of Guinea 14 strain in a short time. That is, for example, when 10 4 copies of RNA are present, the amplification product can be amplified in about 20 minutes before the amplification product can be detected. This makes it possible to quickly detect ZEBOV.
  • the Zaire 76 strain and Zaire 95 strain can be amplified in a short time.
  • these primer sets are one of the most preferred primer sets. By these, it is possible to detect ZEBOV more accurately and quickly.
  • a method for detecting a ZEBOV Guinea strain is provided.
  • a method for detecting a ZEBOV Guinea strain is to amplify a nucleic acid contained in a sample using any of the above primer sets, and detect whether or not the sample contains a ZEBOV Guinea strain. Can be determined.
  • Nucleic acid amplification may be any method known per se that amplifies nucleic acids based on the same principle as the LAMP method or LAMP method.
  • a reverse transcription reaction may be performed prior to nucleic acid amplification, or an RT-LAMP method in which the reverse transcription reaction and the amplification reaction are performed in one reaction may be used.
  • a more preferred amplification method in this method is the RT-LAMP method.
  • amplification products can be detected using, for example, turbidity or fluorescence as an index. Detection of the amplification product using turbidity as an index may be performed, for example, with a turbidimeter, an absorptiometer, and visual inspection. Detection of an amplification product using fluorescence as an index is performed by detecting the generated fluorescence using a reagent that generates fluorescence in response to the presence of an amplification product or an amplification reaction, such as a fluorescent reagent or an intercalator containing calcein. That's fine.
  • the detection of the amplification product can be performed, for example, at a specific time after starting the amplification reaction.
  • the determination as to whether or not a ZEBOV Guinea strain is contained in the sample may be made, for example, based on whether or not the amplification product is equal to or greater than a predetermined threshold at a specific time.
  • turbidity when turbidity equal to or higher than a predetermined value is measured, it may be determined that a ZEBOV guinea strain is contained in the sample. For example, when a turbidity of 0.1 or more is measured during 60 minutes, it may be determined that the specimen contains a ZEBOV guinea strain.
  • fluorescence when using fluorescence as an index, The sample to be subjected to the method for detecting a ZEBOV Guinea strain may be a sample containing or possibly containing a nucleic acid. The sample may be obtained from a living body or an ex vivo environment.
  • the sample can be, for example, blood, plasma, serum, urine, stool, semen, saliva, oral mucosa, other body cavity mucosa, throat swab, sputum, and the like.
  • the nucleic acid structure shown in FIG. 4 is obtained as an amplification product or a part thereof.
  • the 14 ZEBOV Guinea strains and, if desired, the Zaire 76 and Zaire 95 strains can be detected.
  • Such a nucleic acid structure is also provided as an embodiment.
  • the nucleic acid structure will be described with reference to FIG. 4 (a), FIG. 4 (b), FIG. 4 (c) and FIG. 4 (d) are formed by a stem portion, which is a double-stranded region composed of a sequence complementary to each other, and this double-stranded region.
  • a stem-and-loop structure including a loop portion that is a single-stranded region is shown.
  • the nucleic acid structure of FIG. 4A includes an F1 sequence, an F2c sequence, and an F1c sequence in this order from the 3 ′ side toward the 5 ′ side.
  • the F1 sequence and the F1c sequence are bonded to each other to form a double strand.
  • 4B includes a B1 sequence, a B2 sequence, and a B1c sequence in this order from the 3 'side toward the 5' side.
  • the B1 sequence and the B1c sequence are bonded to each other to form a double strand.
  • the nucleic acid structure of FIG. 4 (c) includes an F1c sequence, an F2 sequence, and an F1 sequence in this order from the 5 'side toward the 3' side.
  • the F1c sequence and the F1 sequence are bonded to each other to form a double strand.
  • the nucleic acid structure of FIG. 4 (d) includes a B1c sequence, a B2c sequence, and a B1 sequence in this order from the 5 'side to the 3' side.
  • the B1c sequence and the B1 sequence are bonded to each other to form a double strand.
  • dumbbell structures having stem and loop structures on the 3 'side and 5' side, respectively.
  • the nucleic acid structure of FIG. 4 (e) includes F1 sequence, F2c sequence, F1c sequence, B1 sequence, B2 sequence, and B1 sequence in this order from 3 ′ side to 5 ′ side.
  • the F1 sequence and the F1c sequence are combined with each other to form a double strand
  • the B1 sequence and the B1c sequence are combined with each other to form a double strand.
  • the nucleic acid structure of FIG. 4 (f) includes F1c sequence, F2 sequence, F1 sequence, B1c sequence, B2c sequence and B1 sequence in this order from 5 ′ side to 3 ′ side.
  • the F1c sequence and the F1 sequence are combined with each other to form a double strand
  • the B1c sequence and the B1 sequence are combined with each other to form a double strand.
  • the sequence contained in these nucleic acid structures is determined by the sequence of the primer set used for the amplification reaction. That is, the nucleic acid structure is obtained for the first time by providing the above-described primer set. By detecting such a nucleic acid structure, it is possible to detect ZEBOV 14 Guinea strains that could not be detected in the past. As a result, it is possible to detect ZEBOV more accurately than in the past. Moreover, such a nucleic acid structure can be rapidly formed by using the above-described primer set. Thus, the nucleic acid construct can be used to rapidly detect ZEBOV.
  • an assay kit for use in the method of detecting ZEBOV described above.
  • Such an assay kit may include any of the primer sets described above.
  • the assay kit may include a container for storing a primer set, an enzyme for performing an amplification reaction, a substrate, a washing solution, a buffer solution and / or a salt for preparing a buffer solution, and the like.
  • an assay kit it becomes possible to detect 14 strains of ZEBOV Guinea that could not be detected so far. As a result, ZEBOV can be detected with higher accuracy than in the prior art.
  • such an assay kit can amplify the genes of Guinea 14 strain in a short time. Therefore, it is possible to detect ZEBOV quickly.
  • Example 10 A test for detecting ZEBOV was performed using the primer set of the embodiment.
  • Viral RNA synthesis ZEBOV of Zaire 76 strain and Zaire 95 strain was used for the experiment. Viral RNAs of Zaire 76 strain and Zaire 95 strain were obtained from the National Microbiological Laboratory, Public Health Agency of Canada. A part of the viral cDNA containing the primer design region was amplified by RT-PCR and purified. Guinea 14 strain synthesized a part (300 bases) of the viral cDNA including the primer design region (Hokkaido System Science, Sapporo, Japan). The cDNA was cloned using the pGEM3Zf (+) vector (Promega), and a partial viral RNA containing the primer design region was synthesized using T7 RNA polymerase and purified. Viral RNA was quantified spectrophotometrically.
  • the primer sets shown in Table 4 were prepared.
  • the “Set ID” column indicates the primer set number.
  • RT-LAMP reaction was performed according to the manufacturer's protocol of the Loopamp RNA amplification kit (Eiken Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan).
  • LAMP reaction solution composition (25 ⁇ L) FIP 40pmol BIP 40pmol F3 5pmol B3 5pmol LF 20pmol LB 20 pmol 2 ⁇ Reaction Mixture 12.5 ⁇ L Enzyme Mix (Bst DNA polymerase, avian myeloblastosis virus reverse transcriptase) 1.0 ⁇ L RNA sample 2.0 ⁇ L.
  • the LAMP reaction solution was incubated at 63 ° C. and observed by spectrophotometric analysis using a real-time turbidimeter (LA-200; Terramex, Kyoto, Japan).
  • Table 5 shows amplification products generated by RT-LAMP method using each primer set shown in Table 4 for each of Zaire 76 strain, Zaire 95 strain, or Guinea 14 strain, using turbidity as an index. The detected result is shown. The result showed the time required for the turbidity to reach 0.1 or more in minutes.
  • This threshold value of turbidity of 0.1 or more was set based on turbidity obtained from a plurality of negative controls. That is, it is a value obtained by doubling the average value of turbidity obtained for a plurality of negative controls.
  • the “set ID” column in the table indicates the primer set number.
  • primer set numbers 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21 and 23, 0.1 or more within 40 minutes are examples of preferred primer sets because turbidity was observed.
  • FIGS. 5A to 5L show the results of measuring the reactivity when using each primer set over time using turbidity as an index.
  • the horizontal axis represents time in minutes
  • the vertical axis represents turbidity.
  • the solid line shows the result of amplifying the Zaire 76 strain and the broken line the 14 Guinea strain.
  • turbidity was also measured for the negative control as described above.
  • FIG. 5A shows primer set number 1
  • FIG. 5B shows primer set number 1 ′ obtained by adding LFc primer to primer set number 1
  • FIG. 5C shows primer set number 2
  • FIG. 5D shows primer set obtained by adding LBc primer.
  • Set number 2 ′ FIG. 5E shows primer set number 5
  • FIG. 5F shows primer set number 5 ′ obtained by adding an LFc primer to primer set number 5
  • FIG. 5G shows primer set number 20
  • FIG. 5H shows primer set number 21, FIG. Are the results obtained using the primer set number 22
  • FIG. 5J is the primer set number 23
  • FIG. 5K is the primer set number 24
  • FIG. 5L is the primer set number 25.
  • turbidity was measured for a negative control to which water was added instead of the RNA sample, but at any time point from 0 to 60 minutes for any primer set. Turbidity was approximately zero.
  • primer set number 20 amplification of the Guinea strain was observed in about 33 minutes, and amplification of the Zaire 76 strain was observed in about 35 minutes (FIG. 5G).
  • primer set number 21 in which the LFc primer was added to this primer set number 20, amplification of the Guinea strain was observed at about 23 minutes, and amplification of the Zaire 76 strain was observed at about 26 minutes (FIG. 5H).
  • primer set number 22 in which LBc primer was added to primer set number 20
  • a slight decrease in amplification efficiency was observed for both Guinea strain and Zaire 76 strain compared to primer set number 20 (FIG. 5I).
  • primer set number 23 in which the LFc primer and the LBc primer were added to primer set number 20, amplification of the Guinea strain was observed in about 24 minutes, and amplification of the Zaire 76 strain was observed in about 26 minutes (FIG. 5J).
  • the rise time of the Zaire 76 strain was about 30 minutes, but no amplification was observed in the Guinea strain (FIG. 5K).
  • the rise time of amplification of the Zaire 76 strain was about 23 minutes, and the rise time of amplification of the Guinea strain was about 35 minutes (FIG. 5L).
  • the LBc primer does not improve the amplification efficiency and may contain it, but the use of the LFc primer is more preferable.
  • these FIP and BIP primers are equal to each other, and these F3 primers share 6 bases with each other on the ZEBOV trailer sequence and are close to each other. Further, these B3 primers are sequences sharing a structure except that the two bases are different from each other.
  • primer set numbers 6 and 8 these F3, FIP and B3 primers are equal to each other, and only the BIP primer is different from each other.
  • the types of bases selected for the mutation sites contained in these BIP primers are different from each other. Nevertheless, in the case of primer set numbers 6 and 8, similarly, amplification of ZEBOV 14 strain of Guinea started in about 20 minutes.
  • the BIP primer of primer set number 10 includes SEQ ID NO: 49 as the B1c sequence and SEQ ID NO: 90 (complementary sequence of SEQ ID NO: 54) as the B2 sequence.
  • the BIP primer of primer set number 13 includes SEQ ID NO: 47 as the B1c sequence and SEQ ID NO: 88 (complementary sequence of SEQ ID NO: 52) as the B2 sequence.
  • the BIP primer of primer set number 14 includes SEQ ID NO: 46 as the B1c sequence and SEQ ID NO: 87 (complementary sequence of SEQ ID NO: 51) as the B2 sequence.
  • the BIP primer of primer set number 15 includes SEQ ID NO: 46 as the B1c sequence and SEQ ID NO: 86 (complementary to SEQ ID NO: 50) as the B2 sequence.
  • the BIP primer of primer set number 16 includes SEQ ID NO: 6 as the B1c sequence and SEQ ID NO: 8 (complementary sequence of SEQ ID NO: 7) as the B2 sequence.
  • the F3, FIP primer and B3 primer of primer set numbers 10 and 16 are all designed to correspond to the mutation sites of Guinea 14 strain, but depending on the BIP primer used together, rapid Guinea There were cases where amplification of 14 strains became possible (primer set number 13 to 16) and amplification of 14 strains of Guinea could not be observed (primer set number 10).
  • primer set numbers 20 and 21 are compared with the primer set numbers 24 and 25, the FIP primer and the BIP primer of these four primer sets are common.
  • the F3 primer and the B3 primer are equal in the primer set numbers 20 and 21, and are equal in the primer set numbers 24 and 25.
  • primer set numbers 21 and 25 contain the same LF primer.
  • the experimental results of primer set numbers 20, 21, 24 and 25 are shown in FIGS. 5G, 5H, 5K and 5L, respectively. Comparing FIG. 5G and FIG. 5K, the amplification rise time of Zaire 76 strain is about 34 minutes and about 31 minutes, respectively, as indicated by the solid line. The rise of amplification became a little less than 10 minutes. On the other hand, compared to primer set numbers 20 (FIG.
  • the LF primer is an example of a preferable primer for amplification of the Guinea 14 strain.
  • the Guinea 14 strain can be efficiently amplified regardless of the use of this preferred primer, and Guinea.
  • Primer set number 20 that was able to efficiently amplify Zaire 76 strain as well as 14 strains is considered to be a preferred primer set for the amplification of ZEBOV and its detection.
  • the difference between the primer set number 24 and the primer set number 21 is the F3 primer and the B3 primer, but considering the other results described above, the F3 primer, especially the amplification of Guinea 14 strain, It was suggested that the design and selection of primers and B3 primers are also important.
  • primer set number 20 amplification of Zaire 76 strain started in about 25 minutes, and this was shortened by about 5 minutes or more by adding the LFc primer (primer set number 21).
  • primer set number 22 the LBc primer was added to the primer set number 20
  • almost no change was observed in the time until the rise of amplification primer set number 22
  • the result of adding the LFc primer and the LBc primer to the primer set number 20 was almost the same as the result of adding only the LFc primer. This result suggests that the LBc primer does not affect the amplification efficiency of Guinea 14 strain.
  • the 14 ZEBOV Guinea strains were amplified by the primer set of the embodiment. By enabling amplification of 14 strains of ZEBOV Guinea, it became possible to detect ZEBOV more accurately.
  • primer set numbers 20 to 23 and the like were able to rapidly amplify Zaire 76 strain in addition to ZEBOV 14 strain of Guinea. Although not shown in the data, primer set numbers 20 to 23 and the like can be rapidly amplified for the Zaire 95 strain.
  • the RT-LAMP reaction was performed in the same manner as in (2) above except that the synthetic RNA brought into the LAMP reaction was 6.1 ⁇ 10 5 copies from 6.1 ⁇ 10 5 copies to 6.1 ⁇ 10 1 copies. went.
  • the primer sets used are set ID21 and set ID26, and these primer sets are primer sets in which only the F3 primer is different from each other.
  • the F3 primers of set ID 21 and set ID 26 were respectively composed of nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 39 and SEQ ID NO: 2, and primers having the same sequence were used for the other primers. Specific configurations of these primer sets used are shown in Tables 4-6 and 6.
  • the concentration of ZEBOV 14 strain of Guinea in the sample is 10 ⁇ 5 times (3.05 ⁇ 10 5 copies / ⁇ L) to 10 ⁇ 9 times (3.05 ⁇ 10 1 copies / ⁇ L) by serial dilution of the stock solution by 10 times. Prepared.
  • test method was the same as described in the section “(2) Confirmation of reactivity of primer set” above.
  • FIG. 7 is a graph showing the results when a viral gene was amplified with two types of LAPM primers.
  • the vertical axis represents turbidity, and the horizontal axis represents time in minutes.
  • the difference between the F3 primers contained in the set ID 21 and the set ID 26 is only the type of the 8th base from the 5 'end. That is, the 8th base from the 5 'end is thymine (t or T) in set ID21 and cytosine (c or C) in set ID26.
  • set ID21 and set ID26 can amplify nucleic acids derived from 14 strains of ZEBOV Guinea almost equally well. Thereby, it was suggested that the primer set according to the embodiment enables rapid and accurate detection.
  • RT-LAMP method using the primer set according to the embodiment and quantification of the detectability of ZEBOV 14 Guinea strain in a sample similarly collected in Guinea A test was performed to compare with a typical RT-PCR (qRT-PCR).
  • RT-LAMP method was performed using isothermal nucleic acid amplification and real-time fluorescence detection apparatus, Genie (registered trademark) III (Optigene, West Wales, UK). DEPC-treated water and synthetic RNA of Zaire 76 strain were used as negative control and positive control, respectively.
  • LAMP reaction solution composition (25 ⁇ L) FIP 20 pmol BIP 20pmol F3 5pmol B3 5pmol LF 10pmol Isomaster Master Mix 15.0 ⁇ L AMV reverse transcriptase (0.15 U) 1.0 ⁇ L RNA sample 5.0 ⁇ L.
  • amplification was performed for 30 minutes at 63 ° C. in Genie (registered trademark) III, followed by dissociation analysis at 95 ° C. to 80 ° C. Non-specific amplification was excluded by comparing with the melting temperature of the positive control reaction.
  • RT-PCR method was subjected to a comparative test using a Quantitect RT-PCR kit (Qiagen) and a ZaireEBOV2014 primer and probe kit (TIM MOLBIOL, Hamburg, Germany).
  • the TIB kit is an emergency use authorization (EUS) for EBOV diagnosis from the US Food and Drug Administration.
  • RNA sample 5 ⁇ L was added to 25 ⁇ L of the reaction mixture.
  • Each reaction was performed on a SmartCycler II system (Cefed, U.S.A).
  • Table 7 shows the test conditions of the RT-LAMP method and the qRT-PCR method described above.
  • the RT-LAMP test was conducted by blind test with the diagnosis result by RT-PCR method, and the results of both tests were compared after completion of the test.
  • the results obtained by the RT-LAMP method and the qRT-PCR method matched the diagnostic results in all the samples. That is, even when the RT-LAMP method was used, it was possible to detect the 14 ZEBOV Guinea strains in the sample with the same accuracy as the qRT-PCR method.
  • Table 9 shows the time required for detection of viral RNA in four representative samples (clinical specimens A, B, C, and D) having different virus titers in the detection tests by the RT-LAMP method and the qRT-PCR method, respectively. Shown in
  • the detection time by the RT-LAMP method is longer than the detection time by the qRT-PCR method. Remarkably short.
  • the detection time by the RT-LAMP method was 10.2 minutes at the shortest and 13.3 minutes at the longest.
  • the detection time by the qRT-PCR method was 40.3 minutes at the shortest and 54.0 minutes at the longest.
  • the ZEBOV strains including the 14 strains of Guinea can be detected more rapidly with the same high accuracy as the qRT-PCR method used as a conventional EBOV diagnostic method by the primer set of the embodiment. It was proved.

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Abstract

　実施形態によれば、ＺＥＢＯＶ遺伝子を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットが提供される。Ｆ１配列は、配列番号３１または６４に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ２配列は、配列番号６２または６３に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ３配列は、配列番号２９、３６、３８、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６１に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ１ｃ配列は、配列番号６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４または７５に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ２ｃ配列は、配列番号６５または６６に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ３ｃ配列は、配列番号３４、６７、８２または８３に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。

Description

ザイールエボラウイルス検出用プライマーセット、アッセイキットおよび増幅方法
　本発明は、ザイールエボラウイルス検出用プライマーセット、アッセイキットおよび増幅方法に関する。
　エボラウイルス（ＥＢＯＶ）は、ヒトまたはヒト以外の霊長動物に感染し、高い確率でそれらに死を齎すウイルスである。
　ＥＢＯＶには、ザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）、スーダンエボラウイルス（ＳＥＢＯＶ）、タイフォレストエボラウイルス（旧アイボリーコーストエボラウイルス）（ＩＣＥＢＯＶ）、ブンディブギョエボラウイルス（ＢＥＢＯＶ）およびレストンエボラウイルス（ＲＥＢＯＶ）の５つの種が存在する。これらのうちのＺＥＢＯＶ、ＳＥＢＯＶ、ＩＣＥＢＯＶおよびＢＥＢＯＶがヒトに対して病原性を示すことが知られている。
　上記の種の中でも、ＺＥＢＯＶの致死率は９０％にもなり、最も病原性が高いウイルスとして知られている。
　ＺＥＢＯＶの検出は、病理学的方法、モノクローナル抗体を使用する抗原抗体反応による方法、特異的なプライマーセットを利用するＰＣＲ法などにより行われている。
　２０１４年現在、エボラウイルスの流行が拡大する中、ＺＥＢＯＶを精度よく検出できる手段の開発が望まれている。
　実施形態は、精度よくＺＥＢＯＶを増幅または検出できる手段を提供することを目的とする。
　実施形態によれば、ＺＥＢＯＶ遺伝子を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットが提供される。Ｆ１配列は、配列番号３１または６４に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ２配列は、配列番号６２または６３に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ３配列は、配列番号２９、３６、３８、５５、５６、５７、５８、５９、６０または６１に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ１ｃ配列は、配列番号６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４または７５に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ２ｃ配列は、配列番号６５または６６に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ３ｃ配列は、配列番号３４、６７、８２または８３に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。
鋳型核酸とプライマーとの対応を示す模式図である。 鋳型核酸とプライマーとの対応を示す模式図である。 ザイールエボラウイルスゲノムのｃＤＮＡの１例と対応するプライマー認識領域の例とを示す図である。 ザイールエボラウイルスゲノムのｃＤＮＡの１例と対応するプライマー認識領域の例とを示す図である。 ザイールエボラウイルスゲノムのｃＤＮＡの１例と対応するプライマー認識領域の例とを示す図である。 ザイールエボラウイルスゲノムのｃＤＮＡの１例と対応するプライマー認識領域の例とを示す図である。 ザイールエボラウイルスゲノムのｃＤＮＡの１例と対応するプライマー認識領域の例とを示す図である。 核酸構造物を示す模式図である。 実験結果を示すグラフである。 実験結果を示すグラフである。 実験結果を示すグラフである。 実験結果を示すグラフである。 実験結果を示すグラフである。 実験結果を示すグラフである。 実験結果を示すグラフである。 実験結果を示すグラフである。 実験結果を示すグラフである。 実験結果を示すグラフである。 実験結果を示すグラフである。 実験結果を示すグラフである。 実験結果を示すグラフである。 実験結果を示すグラフである。
　ＺＥＢＯＶは、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスであり、その長さは約１９ｋｂである。その遺伝子の３’端および５’端には、それぞれ非コード配列であるリーダー領域とトレーラー領域が存在している。
　実施形態は、トレーラー領域の特定の配列を利用してプライマー領域を設計することによって、これまで検出することができなかったＺＥＢＯＶ株を検出できることを発見したことに基づく。
　実施形態のプライマーセットは、２０１４年型のギニア株（ギニア１４株）を検出することが可能である。２０１４年のＺＥＢＯＶの流行拡大を鎮静化するためには、ＺＥＢＯＶを精度よく、迅速に検出することが必須であるが、そのためには、このギニア１４株の検出が必須である。従来のプライマーセットでは、ギニア１４株を検出できないが、実施形態のプライマーセットによれば、過去に流行した１９７６年型のザイール株（ザイール７６株）および１９９５年型のザイール株（ザイール９５株）だけではなく、ギニア１４株についてもより検出することが可能となる。それにより、ＺＥＢＯＶを精度よく検出することが可能となる。
　実施形態に従うプライマー領域について、図１Ａ、および１Ｂを用いて説明する。
　図１Ａは、鋳型としてのＺＥＢＯＶのＲＮＡ（図中、「ｖＲＮＡ」と記す）、そのｃＤＮＡ、および各プライマーを互いに対応づけて示した図である。検出されるべきＺＥＢＯＶのＲＮＡは、各プライマーが結合すべき領域（即ち、認識領域）としてＦ３ｃ領域、Ｆ２ｃ領域、Ｆ１ｃ領域、Ｂ１領域、Ｂ２領域、Ｂ３領域を含む。これらの領域は、３’側から５’側に向けて、この順番でＺＥＢＯＶのＲＮＡに含まれる。これらの領域は、それぞれＦ３ｃ配列、Ｆ２ｃ配列、Ｆ１ｃ配列、Ｂ１配列、Ｂ２配列およびＢ３配列を含む。これらの配列、およびこれらと相補的な配列、即ち、Ｆ３配列、Ｆ２配列、Ｆ１配列、Ｂ１ｃ配列、Ｂ２ｃ配列およびＢ３ｃ配列を認識配列と称する。このようなＺＥＢＯＶのＲＮＡが、第１の鋳型配列として使用される。
　ｃＤＮＡは、ＺＥＢＯＶのＲＮＡの相補鎖であり、５’側から３’側に向けて、Ｆ３配列、Ｆ２配列、Ｆ１配列、Ｂ１ｃ配列、Ｂ２ｃ配列およびＢ３ｃ配列を含む。検査に供される試料中に含まれるＺＥＢＯＶのＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡが作られ、ＺＥＢＯＶのＲＮＡとｃＤＮＡとを鋳型核酸として実施形態のプライマーセットによって増幅反応が行われる。
　ここで、Ｆ１配列とＦ１ｃ配列、Ｆ２配列とＦ２ｃ配列、Ｆ３配列とＦ３ｃ配列、Ｂ１配列とＢ１ｃ配列、Ｂ２配列とＢ２ｃ配列、Ｂ３配列とＢ３ｃ配列は、互いに相補的な配列である。
　このような鋳型配列について、上記の６つの認識領域に対応する内部プライマー（ＦＩＰおよびＢＩＰプライマー）と２つの外部プライマー（Ｆ３およびＢ３プライマー）とを含むプライマーセットを１つのセットとして設計した。
　実施形態に従うプライマーセットは、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーを含む。ＦＩＰプライマーは、５’側から３’側に向けてＦ１ｃ配列とＦ２配列とを含む。Ｆ３プライマーは、Ｆ３配列を含む。ＢＩＰプライマーは、５’側から３’側に向けてＢ１ｃ配列とＢ２配列とを含む。Ｂ３プライマーは、Ｂ３配列を含む。これらのプライマーのそれぞれの配列に該当する領域を図１Ａ中に矢印で示した。矢印の向きは、各領域に該当するプライマー配列の方向性を示しており、矢印の始点が５’端、矢印の終点が３’端を表す。
　更に実施形態に従うプライマーセットは、ＬＦプライマーおよび／またはＬＢプライマーをループプライマーとして含み得る。図１Ｂは、図１Ａのプライマー設計配列に加えて、更に、ＬＦプライマーおよびＬＢプライマーの設計配列の１例を示した図である。
　ＺＥＢＯＶのＲＮＡは、プライマー認識領域としてＦ３ｃ領域、Ｆ２ｃ領域、ＬＦｃ領域、Ｆ１ｃ領域、Ｂ１領域、ＬＢ領域、Ｂ２領域、Ｂ３領域を含む。これらの領域は、３’側から５’側に向けて、この順番でＺＥＢＯＶのＲＮＡに含まれる。ＬＦｃ領域およびＬＢ領域は、それぞれＬＦｃ配列およびＬＢ配列を含む。このようなＺＥＢＯＶのＲＮＡが、鋳型配列として使用される。
　或いは、ループプライマーは、例えば、増幅産物のループ部分に結合するように設計されてもよい。ループ部分は、図１Ｂ中に一本鎖部分と示した領域であり得る。即ち、ループ領域は、例えば、ｖＲＮＡのＦ２ｃ領域の５’端からＦ１ｃ領域の３’端よりも３’側の塩基までの範囲、またはｖＲＮＡのＢ２領域の３’端からＢ１領域の５’端よりも５’側の塩基までの範囲であり得る。
　各プライマーの配列は、表１に示すアクセッション番号の１３０株について配列を比較することにより決定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　これらの株名を表２に示す。ここで、表の番号に枝番号がある場合に、枝番号を省略したときには、全ての枝番号の表を総称する。例えば、表２－１、表２－２、表２－３、表２－４および表２－５を総称して表２と記す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　上記１３０株の比較は、アライメントを作成して行った。使用した領域は、各株のトレーラー配列に対応するｃＤＮＡの領域の１８２９９番目から１８６５８番目までである。
　プライマー認識領域の設計は、まず、ＬＡＭＰプライマー設計支援ソフトウェアプログラム（ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ ｖｅｒ.３；ネット研究所、東京（日本）；ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ.ｊｐ／ｅ／）を用いて基礎となる領域を設計し、その後、アライメントからの情報や実験結果などを考慮しながら、手動および目視などによってｃＤＮＡ上での位置や塩基の種類について改変および調整を行った。
　設計された基礎となる領域は、Ｔｒ２系である。Ｔｒ２系のＦ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃおよびＢ３ｃ領域は、それぞれ１８３３９～１８３５８位、１８３６８～１８３８８位、１８４０８～１８４２７位、１８４４９～１８４７１位、１８５０１～１８５２２位および１８５４３～１８５６２位の領域である。
　更にＴｒ２系について改変および調整を行って、Ｔ２７３系および５’ＵＴＲ系を設計した。
　Ｔ２３７系のＦ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃおよびＢ３ｃ領域は、１８３３８～１８３５７位、１８３６７～１８３８７位、１８４０７～１８４２６位、１８４３５～１８４５５位、１８４９６～１８５１３位および１８５３０～１８５５１位の領域である。
　５’ＵＴＲ系のＦ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃおよびＢ３ｃ領域は、１８３２１～１８３４３位、１８３６７～１８３８７位、１８４０７～１８４２６位、１８４４９～１８４７１位、１８５０１～１８５２２位および１８５３０～１８５５１位であり、更に、１８３８８～１８４０６位がＬＦ領域である。
　図２Ａ～２Ｃには、５’から３’の方向で、コンセンサス配列としてのザイール７６株（Ｈ.ｓａｐｉｅｎｓ－ｔｃ／ＣＯＤ／１９７６／Ｙａｍｂｕｋｕ－Ｍａｙｉｎｇａ）のｃＤＮＡと、ギニア１４株（Ｈ.ｓａｐｉｅｎｓ－ｗｔ／ＧＩＮ／２０１４／Ｇｕｅｃｋｅｄｏｕ－Ｃ０５）、ザイール９５株（ＥＢＯＶ／Ｈ.ｓａｐｉｅｎｓ－ｔｃ／ＣＯＤ／１９９５／１３６２５ Ｋｉｋｗｉｔ）、２種類のガボン９６株（ＥＢＯＶ／Ｈ.ｓａｐｉｅｎｓ－ｔｃ／ＧＡＢ／１９９６／１Ｅｋｏ、ＥＢＯＶ／Ｈ.ｓａｐｉｅｎｓ－ｔｃ／ＧＡＢ／１９９６／Ｉｌｅｍｂｅ）およびザイール０７株（ＥＢＯＶ／Ｈ.ｓａｐｉｅｎｓ－ｔｃ／ＣＯＤ／２００７／４ Ｌｕｅｂｏ）のｃＤＮＡとのアライメントとプライマー認識配列の設計例を示した。またそこに示された配列は、ザイールエボラウイルスのトレーラー配列に対応するｃＤＮＡの領域の１８２９９番目から１８６５８番目までの３６０個の塩基を５’から３’の方向で示している。
　また、図２Ａ～２Ｃには、ｃＤＮＡのプライマー認識領域に対応付けて、Ｔｒ２系、Ｔｒ２７３系、並びに５’ＵＴＲ系、即ち、Ｔｒ２７３ｗａ系、Ｔｒ２７３ｗａ２系、Ｔｒ２７３ｗａ３系、Ｔｒ２７３ｗａ４系およびＴｒ２７３ｗａ５系のプライマー認識配列の例を示した。
　また、これらの系統でそれぞれ設計されるプライマーを表３に示す。この表には、それぞれのプライマー配列と、対応する配列番号、更に、図２Ａ～２Ｃに示されている配列との対応を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　図中の矢印は、プライマーとして使用される際の配列の向きを示す。下線を付した塩基は、ギニア１４株の変異に合わせた改変部位である。
　更に、具体的な認識配列の例を図２Ａ～２Ｃと同様に図３Ａおよび３Ｂに示す。括弧内に配列番号を示す。配列番号に「ｃ」の符号が付されているものは、それが配列番号で示される配列の相補配列であることを示す。図３Ａおよび３Ｂでは、図２Ａ～２Ｃのコンセンサス配列と同じ配列（即ち、ｃＤＮＡの領域の１８２９９番目から１８６５８番目までの配列）を１～３６０位として示している。
　実施形態のプライマーセットに含まれる認識配列は、例えば、次の通りであり得る。Ｆ３配列は、配列番号２９、３６、３８、５５、５６、５７、５８、５９、６０または６１に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ２配列は、配列番号６２または６３に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ１配列は、配列番号３１または６４に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ１ｃ配列は、配列番号６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４または７５に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ２ｃ配列は、配列番号６５または６６に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ３ｃ配列は、配列番号３４、６７、８２または８３に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。これらの認識配列は何れも、上記配列番号に含まれる連続する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基であってもよく、例えば、１５塩基～３０塩基であってもよい。或いはこれらの相補配列であってもよい。
　ギニア株１４を増幅するためには、ＢＩＰプライマーの設計と、それに組み合わせるＦ３プライマーおよびＢ３プライマーの選択が重要である。このようなギニア株１４を増幅するためにＢ１ｃ領域およびＢ２ｃ領域の設計とＦ３プライマーおよびＢ３プライマーの選択が重要であるということは、本発明者によって初めて見出された知見である。
　例えば、ギニア株１４を増幅するための好ましいＢ１ｃ領域は、トレーラー配列に対応するｃＤＮＡの領域の１８４３５位～１８４７１位である。
　Ｂ１ｃ配列は、例えば、配列番号６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４および７５によりそれぞれ示される配列に基づいて設計されてよく、より好ましくは配列番号７５に基づいて設計される。好ましいＢ１ｃ配列は、例えば、配列番号７５に含まれる５’端から第１位～第５位の何れかの塩基から続く塩基を含むように連続する少なくとも１３塩基、または３’端から第１位～第６位の何れかの塩基から続く塩基を含むように連続する少なくとも１３塩基であってもよい。好ましいＢ１ｃ配列の例は、配列番号６、３２、４６、４７および４８であり、より好ましくは配列番号４６、４７および４８である。
　例えば、ギニア株１４を増幅するための好ましいＢ２領域は、トレーラー配列に対応するｃＤＮＡの領域の１８４９３位～１８５２２位である。
　Ｂ２ｃ配列の例は、例えば、配列番号６５および６６によりそれぞれ示される配列に基づいて設計されてよい。好ましいＢ２ｃ配列は、例えば、配列番号６５および６６に含まれる５’端から第１位～第７位の何れかの塩基から続く塩基を含むように連続する少なくとも１３塩基である。好ましいＢ２ｃ配列の例は、配列番号３３、５０、５１、５２、５３および７８であり、より好ましくは配列番号５０、５１、５２および５３である。或いはこれらの相補配列である。
　好ましいＦ３配列の例は、配列番号２９、５５、６０または６１に含まれる連続する少なくとも１３塩基であり、より好ましくは配列番号２９、５５、６０または６１に含まれる５’端から第１位～第５位の何れかの塩基から続く塩基を含むように連続する少なくとも１３塩基であり、例えば、配列番号２、３９および４０、より好ましくは配列番号２または３９である。或いはこれらの相補配列である。
　好ましいＦ２配列の例は、配列番号３、４２、４３、６２および６３であり、より好ましくは配列番号３および４２である。或いはこれらの相補配列である。
　好ましいＦ１配列の例は、配列番号４、４４、４５および７９であり、より好ましくは配列番号４、４４および４５である。或いはこれらの相補配列である。
　好ましいＢ３ｃ配列の例は、配列番号８２に含まれる５’端から第１位～第５位の何れかの塩基から続く塩基を含むように連続する少なくとも１３塩基、または配列番号３４に含まれる３’端から第１位～第７位の何れかの塩基から続く塩基を含むように連続する少なくとも１３塩基であってよい。好ましいＢ３ｃ配列は、例えば、配列番号９および１９である。或いはこれらの相補配列である。
　ループプライマーを使用することによって増幅効率を増大することが可能である。好ましいループプライマーのための配列の例は、配列番号１１、２８および７６によりそれぞれ示される配列をそれぞれ含む配列、またはこれらの配列の連続する少なくとも１３塩基を含む配列である。配列番号１１および７６は、ＬＦｃプライマーとして好ましく使用され得る。配列番号２８および７７は、ＬＢｃプライマーとして好ましく使用され得る。また、ループプライマーのための配列は、上記配列番号に含まれる連続する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基であってもよく、例えば、１５塩基～３０塩基であってもよい。或いはこれらの相補配列であってもよい。
　好ましいループプライマーにおいて、例えば、ＬＦｃ配列は配列番号７６からなり、ＬＢｃ配列は配列番号７７からなる。或いはこれらのループプライマーは、これらの相補配列からなる。
　プライマーの長さは、１３～４０塩基、例えば、１５～３０塩基であってもよい。
　何れのプライマーも、鋳型へのアニーリングを阻害せず、且つプライマーの伸長を妨げない限り、認識配列に加えて更なる配列または成分を含んでもよい。
　例えば、ＦＩＰプライマーは、Ｆ１ｃ配列とＦ２配列の間にリンカーを含み得る。また、ＢＩＰプライマーは、Ｂ１配列とＢ２ｃ配列の間にリンカーを含み得る。リンカー配列は、任意の塩基配列であればよく、好ましくは鋳型配列に特異的に結合しない配列であり得る。リンカー配列の長さは、例えば、１～６塩基であればよい。好ましいリンカー配列の例は、ＴＴＴＴである。
　例えば、好ましいプライマーセットの各プライマーは次の通りであり得る。Ｆ３プライマーは、配列番号２、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２２または配列番号３９の何れかで示される配列またはその相補配列を含み得る。ＦＩＰプライマーは、配列番号１２、配列番号１８または配列番号２１の何れかで示される配列またはその相補配列を含み得る。ＢＩＰプライマーは、配列番号１３、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６または配列番号２７の何れかで示される配列またはその相補配列を含み得る。Ｂ３プライマーが、配列番号１０または配列番号１９の何れかで示される配列またはその相補配列を含み得る。
　或いは好ましいプライマーセットの各プライマーは例えば次の通りであり得る。Ｆ３プライマーは、配列番号２、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２２または配列番号３９の何れかで示される配列またはその相補配列に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含み得る。ＦＩＰプライマーは、配列番号１２、配列番号１８または配列番号２１の何れかで示される配列またはその相補配列に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含み得る。ＢＩＰプライマーは、配列番号１３、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６または配列番号２７の何れかで示される配列またはその相補配列に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含み得る。Ｂ３プライマーが、配列番号１０または配列番号１９の何れかで示される配列またはその相補配列に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含み得る。
　プライマーセットに含まれるＦ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーおよびＢ３プライマーのための配列の組み合わせは、以下からなる群より選択されてもよい：
（１）配列番号１７、配列番号１８、配列番号１３および配列番号１９の組み合わせ；（２）配列番号２２、配列番号２１、配列番号１５および配列番号１０の組み合わせ；（３）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３および配列番号１０の組み合わせ；（４）配列番号２２、配列番号２１、配列番号２４および配列番号１０の組み合わせ；（５）配列番号２２、配列番号２１、配列番号２５および配列番号１０の組み合わせ；（６）配列番号２２、配列番号２１、配列番号２６および配列番号１０の組み合わせ；（７）配列番号２２、配列番号２１、配列番号２７おおび配列番号１０の組み合わせ；（８）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２３および配列番号１０の組み合わせ；（９）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２４および配列番号１０の組み合わせ；（１０）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２５および配列番号１０の組み合わせ；（１１）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２６および配列番号１０の組み合わせ；（１２）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２７および配列番号１０の組み合わせ；（１３）配列番号２０、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０の組み合わせ；（１４）配列番号２０、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１９の組み合わせ；（１５）配列番号２２、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０の組み合わせ；（１６）配列番号２２、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１９の組み合わせ；（１７）配列番号３９、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０の組み合わせ；（１８）配列番号２、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０の組み合わせ；（１９）前記（１）～（１８）の何れかの組み合わせに含まれる４つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ。
　より好ましいプライマーセットは、上記（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）、（１４）、（１５）、（１６）、（１７）および（１８）に示す組み合わせでプライマーを含むプライマーセットであり得る。
　また、上記のプライマーセットに更にループプライマーを含むプライマーセットも好ましい。そのようなプライマーセットは、プライマーセットに含まれるＦ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーおよびＬＦｃループプライマーのための配列の組み合わせが、
（２０）配列番号３９、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０、並びに配列番号１１の組み合わせ、またはこのプライマーセットに含まれる５つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ；
であってもよく、またはプライマーセットに含まれるＦ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーおよびＬＢｃループプライマーのための配列の組み合わせが、
（２１）配列番号３９、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０、並びに配列番号２８の組み合わせ、またはこのプライマーセットに含まれる５つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ；
であってもよく、或いは、プライマーセットに含まれるＦ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマー、ＬＦｃループプライマーおよびＬＢｃループプライマーのための配列の組み合わせが、
（２２）配列番号３９、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０、並びに配列番号１１および配列番号２８の組み合わせ、またはこのプライマーセットに含まれる６つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ
であってもよく、
（２３）配列番号２、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０、並びに配列番号１１の組み合わせ、またはこのプライマーセットに含まれる５つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ；
であってもよく、またはプライマーセットに含まれるＦ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーおよびＬＢｃループプライマーのための配列の組み合わせが、
（２４）配列番号２、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０、並びに配列番号２８の組み合わせ、またはこのプライマーセットに含まれる５つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ；
であってもよく、或いは、プライマーセットに含まれるＦ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマー、ＬＦｃループプライマーおよびＬＢｃループプライマーのための配列の組み合わせが、
（２５）配列番号２、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０、並びに配列番号１１および配列番号２８の組み合わせ、またはこのプライマーセットに含まれる６つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ
であってもよい。
　更に、上述のプライマーセットが、配列番号７６で示されるＬＦｃプライマーを含むことは好ましい。
　上述した何れのプライマーセットについても、そこに含まれる配列は、それぞれのプライマー配列のための認識配列に対応する配列を含んでいてもよい。また、鋳型へのアニーリングを阻害せず、且つプライマーの伸長を妨げない限り、何れのプライマーにおいても、認識配列に加えて更なる配列または成分を含んでもよい。
　このような方法によれば、これまで増幅することができなかったＺＥＢＯＶのギニア１４株の遺伝子を増幅することが可能となる。従来のプライマーセットには、ギニア１４株の遺伝子を増幅できるものはない。従って、例えば、ギニア１４株などに感染している場合には、そのような従来のプライマーセットでは得られる結果は偽陰性となってしまう。実施形態のプライマーセットによれば、ギニア１４株を増幅することができるので、増幅産物を検出することによってＺＥＢＯＶを従来に比べて精度よく検出することが可能となる。また、上述のプライマーセットによれば、ギニア１４株の遺伝子を短い時間で増幅することが可能である。即ち、例えば、１０４コピーのＲＮＡが存在する場合には、２０分程度でその増幅産物を検出できるまでに増幅することが可能である。それによりＺＥＢＯＶの検出を迅速に行うことが可能である。
　また、例えば、上述のプライマーセット（１７）、（１８）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）、（２４）、（２５）、は、ギニア１４株の遺伝子を短時間で増幅できるのみならず、ザイール７６株およびザイール９５株についても短い時間で増幅することが可能となる。従って、これらのプライマーセットは、最も好ましいプライマーセットの１つである。これらによって、ＺＥＢＯＶをより精度よく、且つ迅速に検出することが可能となる。
　更なる実施形態によれば、ＺＥＢＯＶのギニア株を検出する方法が提供される。ＺＥＢＯＶのギニア株を検出する方法は、上述の何れかのプライマーセットを用いて試料に含まれる核酸を増幅し、増幅産物を検出することにより前記試料にＺＥＢＯＶのギニア株が含まれているか否かを判定すればよい。
　核酸の増幅は、ＬＡＭＰ法またはＬＡＭＰ法と同様の原理により核酸を増幅するそれ自身公知の何れの方法であればよい。また当該方法においては、核酸の増幅に先駆けて逆転写反応を行ってもよく、或いは逆転写反応と増幅反応とを１つの反応において行うＲＴ－ＬＡＭＰ法を用いてもよい。当該方法におけるより好ましい増幅方法は、ＲＴ－ＬＡＭＰ法である。
　また増幅産物の検出は、例えば、濁度または蛍光を指標に行い得る。濁度を指標にする増幅産物の検出は、例えば、濁度計、吸光度計、および目視などで行えばよい。蛍光を指標にする増幅産物の検出は、例えば、カルセインを含む蛍光試薬やインタカレータなど、増幅産物または増幅反応の存在に応じて蛍光を生ずる試薬を用い、生じた蛍光を検出することにより行われればよい。
　増幅産物の検出は、例えば、増幅反応を開始した後の特定の時点で行い得る。試料に、ＺＥＢＯＶのギニア株が含まれているか否かの判定は、例えば、特定の時点で増幅産物が予め定められた閾値以上であるか否かで行われてもよい。
　例えば、濁度を指標にする場合では、予め定めた値以上の濁度が測定されたときに、試料中にＺＥＢＯＶのギニア株が含まれていると判定すればよい。例えば、６０分間の間に０．１以上の濁度が測定されたときに検体にＺＥＢＯＶのギニア株が含まれていると判定してもよい。例えば、蛍光を指標にする場合では、
　ＺＥＢＯＶのギニア株を検出する方法に供される試料は、核酸を含む、または核酸を含む可能性のある試料であればよい。試料は、生体または生体外の何れかの環境などから得られたものであってもよい。それらは、増幅反応を妨害しない状態であることが好ましく、採取された後にそれ自身公知の何れかの手段により前処理が行われてもよい。試料は、例えば、血液、血漿、血清、尿、便、精液、唾液、口腔内粘膜、それ以外の体腔粘膜、咽頭拭い液および喀痰などであり得る。
　このような方法によれば、これまで検出することができなかったＺＥＢＯＶのギニア１４株を検出することが可能となる。即ち、当該方法により得られる増幅産物を検出することによってＺＥＢＯＶを従来に比べて精度よく検出ことが可能となる。また、上述のプライマーセットによれば、ギニア１４株の遺伝子を短い時間で増幅することが可能である。それによりＺＥＢＯＶの検出を迅速に行うことが可能である。
　当該方法では、増幅産物またはその一部分として図４に示す核酸構造体が得られる。これらの核酸構造体の存在を検出することにより、ＺＥＢＯＶのギニア１４株、所望に応じて、ザイール７６株およびザイール９５株が検出できる。このような核酸構造体も実施形態として提供される。
　核酸構造体について、図４を参照しながら説明する。図４（ａ）、図４（ｂ）、図４（ｃ）および図４（ｄ）は、互いに相補的な配列からなる二本鎖領域であるステム部分と、この二本鎖領域により形成された一本鎖領域であるループ部分とを含むステム・ループ構造体を示す。
　図４（ａ）の核酸構造体は、３’側から５’側に向けて、Ｆ１配列、Ｆ２ｃ配列およびＦ１ｃ配列をこの順番で含む。Ｆ１配列およびＦ１ｃ配列は、互いに結合し二本鎖を形成している。
　図４（ｂ）の核酸構造体は、３’側から５’側に向けて、Ｂ１配列、Ｂ２配列およびＢ１ｃ配列をこの順番で含む。Ｂ１配列および前記Ｂ１ｃ配列は、互いに結合し二本鎖を形成している。
　図４（ｃ）の核酸構造体は、５’側から３’側に向けて、Ｆ１ｃ配列、Ｆ２配列およびＦ１配列をこの順番で含む。Ｆ１ｃ配列および前記Ｆ１配列は、互いに結合し二本鎖を形成している。
　図４（ｄ）の核酸構造体は、５’側から３’側に向けて、Ｂ１ｃ配列、Ｂ２ｃ配列およびＢ１配列をこの順番で含む。Ｂ１ｃ配列および前記Ｂ１配列は、互いに結合し二本鎖を形成している。
　図４（ｅ）および（ｆ）は、３’側と５’側にそれぞれステム・ループ構造を有するダンベル構造体を示す。
　図４（ｅ）の核酸構造体は、３’側から５’側に向けて、Ｆ１配列、Ｆ２ｃ配列、Ｆ１ｃ配列、Ｂ１配列、Ｂ２配列およびＢ１配列をこの順番で含む。Ｆ１配列とＦ１ｃ配列とが互いに結合し二本鎖を形成し、Ｂ１配列とＢ１ｃ配列とが互いに結合し二本鎖を形成している。
　図４（ｆ）の核酸構造体は、５’側から３’側に向けて、Ｆ１ｃ配列、Ｆ２配列、Ｆ１配列、Ｂ１ｃ配列、Ｂ２ｃ配列およびＢ１配列をこの順番で含む。Ｆ１ｃ配列とＦ１配列とが互いに結合し二本鎖を形成し、Ｂ１ｃ配列とＢ１配列とが互いに結合し二本鎖を形成している。
　これらの核酸構造体に含まれる配列は、増幅反応に使用されるプライマーセットの配列により決定される。即ち、当該核酸構造体は、上述したプライマーセットが提供されることにより初めて得られるものである。そして、このような核酸構造体を検出すれば、従来では検出できなかったＺＥＢＯＶのギニア１４株を検出することが可能となる。これにより、ＺＥＢＯＶを従来に比べて精度よく検出ことが可能となる。また、このような核酸構造体は、上述のプライマーセットを用いることによって迅速に形成できる。従って、当該核酸構造体は、ＺＥＢＯＶを迅速に検出するために使用できる。
　また実施形態によれば、上述したＺＥＢＯＶを検出する方法において使用するためのアッセイキットが提供される。そのようなアッセイキットは、上述した何れかのプライマーセットを含めばよい。更に、当該アッセイキットは、プライマーセットを収容する容器、増幅反応を行うための酵素、基質、洗浄液、緩衝液および／または緩衝液を調製するための塩類などを含んでもよい。
　このようなアッセイキットによれば、これまで検出することができなかったＺＥＢＯＶのギニア１４株を検出することが可能となる。それによってＺＥＢＯＶを従来に比べて精度よく検出ことが可能となる。また、このようなアッセイキットによって、ギニア１４株の遺伝子を短い時間で増幅することが可能である。そのため、ＺＥＢＯＶの検出を迅速に行うことが可能である。
　［例］
　実施形態のプライマーセットを用いて、ＺＥＢＯＶを検出する試験を行った。
　（１）ウイルスＲＮＡ合成
　実験には、ザイール７６株およびザイール９５株のＺＥＢＯＶを使用した。ザイール７６株、ザイール９５株のウイルスＲＮＡは、カナダ公衆衛生局国立微生物研究所（National Microbiological Laboratory, Public Health Agency of Canada）から譲り受けた。ＲＴ－ＰＣＲにてプライマー設計領域を含むウイルスｃＤＮＡの一部を増幅し、精製した。ギニア１４株は、プライマー設計領域を含むウイルスｃＤＮＡの一部（３００塩基）を合成した（北海道システムサイエンス、日本、札幌）。ｃＤＮＡはｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）ベクター（プロメガ）にてクローニングし、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてプライマー設計領域を含む部分的ウイルスＲＮＡを合成し、精製した。ウイルスＲＮＡは分光光度法にて定量した。
　ザイールエボラウイルスの検出を行うために表４に示すプライマーセットを準備した。表中、「セットＩＤ」の欄にはプライマーセット番号を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　（２）プライマーセットの反応性の確認
　上記（１）に示したそれぞれのプライマーセットを用いてＬＡＭＰ増幅を以下の方法で行った。ＬＡＭＰ法による核酸の増幅を行うためのＬＡＭＰ反応液の組成は以下の通りである。
　ＲＴ－ＬＡＭＰ反応はＬｏｏｐａｍｐＲＮＡ増幅キット（栄研化学株式会社、日本、東京）の製造者のプロトコルに従って実施した。
　ＬＡＭＰ反応液組成（２５μＬ）
ＦＩＰ　　　　　　　　　　４０ｐｍｏｌ
ＢＩＰ　　　　　　　　　　４０ｐｍｏｌ
Ｆ３　　　　　　　　　　　５ｐｍｏｌ
Ｂ３　　　　　　　　　　　５ｐｍｏｌ
ＬＦ　　　　　　　　　　　２０ｐｍｏｌ
ＬＢ　　　　　　　　　　　２０ｐｍｏｌ
２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　　１２．５μＬ
Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ（Bst DNA polymerase、avian myeloblastosis virus逆転写酵素）　１．０μＬ
ＲＮＡサンプル　　　　　　２．０μＬ。
　反応に持ち込んだ合成ＲＮＡの量は、ザイール７６株が６．４ｘ１０４、ザイール９５株が３．９ｘ１０４、ギニア１４株が６．１ｘ１０４コピーであった。
　ＲＴ－ＬＡＭＰアッセイによる増幅をリアルタイムモニタリングするために、前記ＬＡＭＰ反応液を６３℃でインキュベートし、リアルタイム濁度計（ＬＡ－２００；テラメックス、京都、日本）を用いて吸光光度分析によって観察した。
　また、各プライマーセットを用いた増幅および濁度の測定に並行して、ＲＮＡサンプルの代わりに水を加えたこと以外は同様なプロトコルで試験を行い、その結果をネガティブコントロールとした。
　その結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　表５は、表４に示した各プライマーセットを使用してザイール７６株、ザイール９５株またはギニア１４株のそれぞれについて、ＲＴ－ＬＡＭＰ法で増幅し、濁度を指標にして生じた増幅産物を検出した結果を示している。結果は、濁度が０．１以上となるまでに必要とされた時間を分単位で示した。この濁度０．１以上という閾値は、複数のネガティブコントロールから得られた濁度に基づいて設定した。即ち、複数のネガティブコントロールについて得られた濁度の平均値を２倍した値である。表中の「セットＩＤ」の欄にはプライマーセット番号を示した。
　結果は次の通りである。プライマーセット番号１、３、１０および２４では、閾値である０．１以上の濁度は観察されなかった。
　プライマーセット番号５、６、７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１および２３では、４０分以内に０．１以上の濁度が観察された。また、プライマーセット番号５、６、７、８、９、１１、１２、２１および２３は、約２５分で０．１以上の濁度が観察された。
　また、プライマーセット番号２０では、３５分で０．１以上の濁度が観察されたが、このプライマーセットに配列番号１１で示されるＬＦｃループプライマーとして、Ｔｒ２７３ｗａ＿ＬＦを追加した。その結果、プライマーセット番号２１では増幅効率が増大し、約２５分で０．１以上の濁度が観察された。また、プライマーセット番号２０に配列番号２８で示されるＬＢｃループプライマーと配列番号１１で示されるＬＦｃループプライマーとを追加したプライマーセット２３の場合では、増幅効率が増大し、２６．２分で０．１以上の濁度が観察された。それに対して、プライマーセット番号２０に配列番号２８で示されるＬＢｃループプライマー、即ち、Ｔｒ２＿ＬＢを追加したプライマーセット２２の場合では、増幅効率に影響はなかった。
　これらの結果から、プライマーセット番号５、６、７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１および２３では、４０分以内に０．１以上の濁度が観察されたことから、これらは好ましいプライマーセットの例である。
　（３）プライマーの組み合わせによるギニア株１４の増幅への影響
　上記（１）に示したプライマーセットのうち、プライマーセット番号１、２、５、２０および２２と、配列番号１１または２８の何れかのループプライマーを用いて上記（２）に記載のプロトコルと同様に試験を行った。
　その結果を図５Ａ～５Ｌに示す。図５Ａ～５Ｌには、各プライマーセットを用いたときの反応性を濁度を指標として経時的に測定した結果を示す。各グラフにおいて、横軸には時間を分単位で示し、縦軸には濁度を示した。グラフ中のデータは、実線がザイール７６株、破線がギニア１４株を増幅した結果を示す。また、全てのデータにおいて、各プライマーセットによる増幅に加えて、上述した通りのネガティブコントロールについても濁度を測定した。
　図５Ａは、プライマーセット番号１、図５Ｂはプライマーセット番号１にＬＦｃプライマーを加えたプライマーセット番号１’、 図５Ｃはプライマーセット番号２、図５Ｄはプライマーセット番号２にＬＢｃプライマーを加えたプライマーセット番号２’、図５Ｅはプライマーセット番号５、図５Ｆはプライマーセット番号５にＬＦｃプライマーを加えたプライマーセット番号５’、 図５Ｇはプライマーセット番号２０、図５Ｈはプライマーセット番号２１、図５Ｉはプライマーセット番号２２、図５Ｊはプライマーセット番号２３、図５Ｋはプライマーセット番号２４、図５Ｌはプライマーセット番号２５をそれぞれ用いて行った結果である。
　全てのプライマーセットの試験のために、ＲＮＡサンプルの代わりに水を添加したネガティブコントロールについて濁度を測定したが、何れのプライマーセットの場合でも測定時間０分～６０分までの何れの時点においても濁度は大凡０であった。
　図５Ａに示す通り、プライマーセット番号１では、ザイール７６株の増幅は約３０分で立ち上がったがギニア株の増幅は観察されなかった。このプライマーセットに対してＬＦｃプライマーを追加したときの結果を図５Ｂに示す。ＬＦｃプライマーの追加は、ザイール７６株の増幅を早めたが、ギニア株の増幅は見られなかった。
　プライマーセット番号２では、約２５分でザイール７６株の増幅が観察されたが、ギニア株では約５０分近くになり漸く増幅が観察された（図５Ｃ）。このプライマーセット番号２にＬＢｃプライマーを追加した場合では、ザイール７６株の増幅の立ち上がりの時間は殆ど変らなかったが、ギニア株では約５分早く増幅の立ち上がりが観察された（図５Ｄ）。
　プライマーセット番号５では、約２８分でギニア株の増幅が観察された（図５Ｅ）。このプライマーセット番号５にＬＦｃプライマーを追加した場合では、ギニアの増幅は約８分早い立ち上がりが観察された（図５Ｆ）。ザイール７６株についてはＬＦｃプライマーの有無には関係なく増幅の立ち上がりは観察されなかった。
　プライマーセット番号２０では、約３３分でギニア株の増幅が観察され、ザイール７６株の増幅は約３５分で観察された（図５Ｇ）。このプライマーセット番号２０にＬＦｃプライマーを追加したプライマーセット番号２１では、約２３分でギニア株の増幅が観察され、ザイール７６株の増幅は約２６分で観察された（図５Ｈ）。
　プライマーセット番号２０にＬＢｃプライマーを追加したプライマーセット番号２２では、ギニア株およびザイール７６株ともに、プライマーセット番号２０に比較して増幅効率の若干の低下が観察された（図５Ｉ）。
　プライマーセット番号２０にＬＦｃプライマーおよびＬＢｃプライマーを追加したプライマーセット番号２３では、約２４分でギニア株の増幅が観察され、ザイール７６株の増幅は約２６分で観察された（図５Ｊ）。
　プライマーセット番号２４では、ザイール７６株の増幅の立ち上がりの時間は約３０分であったが、ギニア株では増幅は観察されなかった（図５Ｋ）。プライマーセット番号２５では、ザイール７６株の増幅の立ち上がりの時間は約２３分であり、ギニア株での増幅の立ち上がりの時間は約３５分であった（図５Ｌ）。
　これらの結果から、上記のプライマーセットにおいては、ＬＢｃプライマーは増幅効率を向上せず、それを含んでいてもよいがＬＦｃプライマーの使用がより好ましいことが示唆された。
　また、プライマーセット番号２０では約３５分でギニア株１４の増幅の立ち上がりが観察されたのに対して、プライマーセット番号２４では、６０分以内ではギニア株の増幅の立ち上がりは観察されなかった。プライマーセット番号２０とプライマーセット番号２４とでは、これらのＦＩＰおよびＢＩＰプライマーは互いに等しく、これらのＦ３プライマーはＺＥＢＯＶのトレーラー配列上で６塩基を互いに共有し、互いに近い位置にある配列である。また、これらのＢ３プライマーについては、２つの塩基の種類が互いに異なることのみを除き、構造を共有する配列である。
　一方、プライマーセット番号６および８では、これらのＦ３、ＦＩＰおよびＢ３プライマーは互いに等しく、ＢＩＰプライマーのみが互いに異なる。これらのＢＩＰプライマーに含まれる変異部位のために選択された塩基の種類が互いに異なる。それにも拘わらず、プライマーセット番号６および８の場合では同様に約２０分でＺＥＢＯＶのギニア１４株の増幅が立ち上がった。
　また、プライマーセット番号１０とプライマーセット番号１３～１６とを比較すると、これらはＦ３、ＦＩＰプライマーおよびＢ３プライマーが互いに等しく、ＢＩＰプライマーのみが互いに異なる。プライマーセット番号１０のＢＩＰプライマーは、Ｂ１ｃ配列として配列番号４９、Ｂ２配列として配列番号９０（配列番号５４の相補配列）を含む。他方、プライマーセット番号１３のＢＩＰプライマーは、Ｂ１ｃ配列として配列番号４７、Ｂ２配列として配列番号８８（配列番号５２の相補配列）を含む。プライマーセット番号１４のＢＩＰプライマーは、Ｂ１ｃ配列として配列番号４６、Ｂ２配列として配列番号８７（配列番号５１の相補配列）を含む。プライマーセット番号１５のＢＩＰプライマーは、Ｂ１ｃ配列として配列番号４６、Ｂ２配列として配列番号８６（配列番号５０の相補配列）を含む。プライマーセット番号１６のＢＩＰプライマーは、Ｂ１ｃ配列として配列番号６、Ｂ２配列として配列番号８（配列番号７の相補配列）を含む。特に、プライマーセット番号１０および１６のＦ３、ＦＩＰプライマーおよびＢ３プライマーは、何れもギニア１４株の変異部位に対応するように設計されているが、共に使用されるＢＩＰプライマーに依存して迅速なギニア１４株の増幅が可能になる場合と（プライマーセット番号１３～１６）、ギニア１４株の増幅が観察できない場合とがあった（プライマーセット番号１０）。
　これらの結果から、ギニア１４株を増幅するためには、ＢＩＰプライマーの設計が重要であることが明らかとなった。この結果は、単に保存された領域を選択し、増幅されるべき新株、即ち、ギニア１４株遺伝子の変異部位の塩基にプライマー配列を対応させるだけではギニア１４株の遺伝子を増幅できないことを示唆している。
　更に、プライマーセット番号２０および２１と、プライマーセット番号２４と２５とを比較すると、これらの４つのプライマーセットのＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーは共通している。またＦ３プライマーとＢ３プライマーは、プライマーセット番号２０と２１とで等しく、プライマーセット番号２４と２５とで等しい。更にプライマーセット番号２１と２５は、同じＬＦプライマーを含む。プライマーセット番号２０、２１、２４および２５の実験結果は、それぞれ図５Ｇ、図５Ｈ、図５Ｋおよび図５Ｌに示されている。図５Ｇと図５Ｋとを比べると、実線で示されているようにザイール７６株の増幅の立ち上がりの時間はそれぞれ約３４分と約３１分であり、これらに同じＬＦプライマーを追加すると、両者ともに増幅の立ち上がりは１０分弱早くなった。これに対して図中破線で示されるギニア１４株についてプライマーセット番号２０（図５Ｇ）と２５（図５Ｋ）と比較すると、前者ではザイール７６株よりも早く約３２分で増幅の立ち上がりが観察できたのに対して、後者では６０分以内にギニア１４株の増幅の立ち上がりは観察されなかった。これらのプライマーセットにＬＦプライマーを追加すると、プライマーセット番号２１ではギニア１４株の増幅の立ち上がりが１０分程度早くなり、ザイール７６株では８分程度早くなった。他方、プライマーセット番号２５においては、ザイール７６株では７分程度立ち上がりが早くなった。またプライマーセット番号２５においては、ＬＦプライマーを含まないセットでは６０分以内に観察されなかったギニア１４株の増幅立ち上がりが、ＬＦプライマーの使用によって３３分頃に観察することができた。これらの結果から、ＬＦプライマーがギニア１４株の増幅においては好ましいプライマーの１例であることが示される一方で、この好ましいプライマーの使用の有無に拘わらずギニア１４株を効率よく増幅でき、且つギニア１４株と同様にザイール７６株についても効率よく増幅することができたプライマーセット番号２０は、ＺＥＢＯＶの増幅およびその検出のために好ましいプライマーセットであると考えられる。また、プライマーセット番号２４とプライマーセット番号２１との違いは、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーであるが、上述した他の結果を考え合わせると、ＺＥＢＯＶの増幅、特に、ギニア１４株の増幅には、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーの設計および選択も重要であることが示唆された。
　（４）ループプライマーの反応性に対する影響
　ＬＡＭＰ反応に持ち込んだ合成ＲＮＡの量がザイール７６株６．４ｘ１０５であることを除いて上記（２）と同様にＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。プライマーセットは上述のプライマーセット番号２０～２３を使用した。結果を図６に示す。
　プライマーセット番号２０では、約２５分でザイール７６株の増幅が立ち上がり、これは、ＬＦｃプライマーの追加により約５分以上短縮された（プライマーセット番号２１）。また、プライマーセット番号２０にＬＢｃプライマーを追加した場合には、増幅立ち上がりまでの時間に殆ど変化は見られなかった（プライマーセット番号２２）。プライマーセット番号２０にＬＦｃプライマーとＬＢｃプライマーとを追加した結果は、ＬＦｃプライマーのみを追加した結果と殆ど変らなかった。この結果から、ＬＢｃプライマーはギニア１４株の増幅効率に影響を与えないことが示唆された。
　実施形態のプライマーセットにより、ＺＥＢＯＶのギニア１４株が増幅された。ＺＥＢＯＶのギニア１４株の増幅を可能としたことにより、ＺＥＢＯＶをより精度よく検出することが可能となった。
　例えば、プライマーセット番号２０～２３などは、ＺＥＢＯＶのギニア１４株の他に、ザイール７６株についても迅速に増幅することが可能であった。また、データに示さないが、プライマーセット番号２０～２３などは、ザイール９５株についても迅速に増幅することが可能である。
　（５）ＺＥＢＯＶのギニア１４株の検出
　ＬＡＭＰ反応に持ち込んだ合成ＲＮＡがギニア１４株６．１ｘ１０５コピーから６．１ｘ１０１コピーであることを除いて上記（２）と同様にＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。使用したプライマーセットは、セットＩＤ２１およびセットＩＤ２６であり、これらのプライマーセットは、Ｆ３プライマーのみが互いに異なるプライマーセットである。具体的には、セットＩＤ２１およびセットＩＤ２６のＦ３プライマーはそれぞれ、配列番号３９および配列番号２でそれぞれ示されるヌクレオチド配列からなり、それ以外のプライマーについては互いに同じ配列からなるプライマーを用いた。使用されたこれらのプライマーセットの具体的な構成は、表４－６および表６に示す通りである。
　サンプル中のＺＥＢＯＶのギニア１４株の濃度は、原液を予め１０倍系列希釈することによって、１０－５倍（３．０５ｘ１０５コピー/μＬ）から１０－９倍（３．０５ｘ１０１コピー/μＬ）に調製した。
　試験の方法は、上記「（２）プライマーセットの反応性の確認」の項における記載と同じ方法により行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　その結果を図７に示す。図７は、２種類のＬＡＰＭプライマーによってウイルス遺伝子を増幅したときの結果を示すグラフである。縦軸に濁度を示し、横軸に分単位で時間を示した。セットＩＤ２１とセットＩＤ２６とにそれぞれ含まれるＦ３プライマーの違いは、５’端から第８位の塩基の種類のみである。即ち、５’端から第８位の塩基は、セットＩＤ２１ではチミン（ｔまたはＴ）であり、セットＩＤ２６ではシトシン（ｃまたはＣ）である。
　全ての合成ＲＮＡ濃度に亘り、セットＩＤ２１およびセットＩＤ２６共に良好にＺＥＢＯＶのギニア１４株由来の核酸を増幅することが可能であった。また、ウイルスの濃度が比較的低い場合、例えば、１０－７倍希釈（６．１ｘ１０３コピー）および１０－８倍希釈（６．１ｘ１０２コピー）の場合、セットＩＤ２６のプライマーセットの方が増幅効率が高い傾向が観察された。
　以上の結果から、セットＩＤ２１およびセットＩＤ２６は、ほぼ同等に良好に特異的にＺＥＢＯＶのギニア１４株由来の核酸を増幅することが可能であることが明らかになった。これにより、実施形態に従うプライマーセットにより、迅速且つ正確な検出が可能であることが示唆された。
　（６）臨床的なＺＥＢＯＶのギニア１４株の検出
　更に、同様にギニアにおいて採取されたサンプル中のＺＥＢＯＶのギニア１４株の検出能について、実施形態に従うプライマーセットを用いたＲＴ－ＬＡＭＰ法と、定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）とを比較するための試験を行った。
　　（ａ）ＲＴ－ＬＡＭＰ法
　ＲＴ－ＬＡＭＰ法は、等温核酸増幅およびリアルタイム蛍光検出装置、Ｇｅｎｉｅ（登録商標）III（Optigene、ウェスト・サセックス、U.K.）を用いて行った。ＤＥＰＣ処理水と、ザイール７６株の合成ＲＮＡとをそれぞれネガティブコントロールとポジティブコントロールとして使用した。
　ＬＡＭＰ増幅のリアルタイム蛍光検出は、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　ｆｏｒ　ＧｅｎｉｅＩＩＩ（Optigene）の製造者のプロトコルに従って実施した。
　ＬＡＭＰ反応液組成（２５μＬ）
ＦＩＰ　　　　　　　　　　２０ｐｍｏｌ
ＢＩＰ　　　　　　　　　　２０ｐｍｏｌ
Ｆ３　　　　　　　　　　　５ｐｍｏｌ
Ｂ３　　　　　　　　　　　５ｐｍｏｌ
ＬＦ　　　　　　　　　　　１０ｐｍｏｌ
Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　　１５．０μＬ
ＡＭＶ逆転写酵素（０．１５Ｕ）　１．０μＬ
ＲＮＡサンプル　　　　　　５．０μＬ。
　ＬＡＭＰ増幅および蛍光検出は、Ｇｅｎｉｅ（登録商標）IIIにおいて６３℃、３０分間に亘って増幅を行い、続いて９５℃～８０℃で解離分析を行った。非特異的な増幅は、ポジティブコントロール反応の融解温度と比較することにより除外した。
　　（ｂ）ＲＴ－ＰＣＲ法
　ＲＴ－ＰＣＲ法は、ＱｕａｎｔｉｔｅｃｔＲＴ－ＰＣＲキット（キアゲン）とＺａｉｒｅＥＢＯＶ２０１４プライマーおよびプローブキット（TIM MOLBIOL、ハンブルク、ドイツ）を用いて比較試験を行った。ＴＩＢキットは、米国食品医薬品局からＥＢＯＶ診断のための緊急使用権限（EUS）を受けたものである。
　５μＬのＲＮＡサンプルを２５μＬの反応混合物に添加した。各反応は、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒIIシステム（セフィード、U.S.A）において行った。
　上述したＲＴ－ＬＡＭＰ法およびｑＲＴ－ＰＣＲ法の試験条件を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　ＲＴ－ＬＡＭＰ試験は、ＲＴ－ＰＣＲ法による診断結果を伏せたブラインド試験により行い、試験終了後に、両試験結果を比較した。
　（ｃ）結果
　上記試験において使用されたサンプルは、ＺＥＢＯＶのギニア１４株への感染の疑いのある対象から採取されたサンプルである。
　表８に示すように、ＲＴ－ＬＡＭＰ法とｑＲＴ－ＰＣＲ法とによりそれぞれ得られた結果は、全てのサンプルにおいて診断結果が一致した。即ち、ＲＴ－ＬＡＭＰ法を用いた場合であっても、ｑＲＴ－ＰＣＲ法と同様の精度でサンプル中のＺＥＢＯＶのギニア１４株を検出することが可能であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　ウイルス力価の異なる代表的な４つのサンプル（臨床検体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）について、ＲＴ－ＬＡＭＰ法およびｑＲＴ－ＰＣＲ法のそれぞれによる検出試験でウイルスＲＮＡの検出に要した時間を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　表９に示す結果から明らかであるように、臨床検体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの何れのサンプルの場合においても、ＲＴ－ＬＡＭＰ法による検出時間の方が、ｑＲＴ－ＰＣＲ法による検出時間よりも顕著に短かった。例えば、ＲＴ－ＬＡＭＰ法による検出時間は、最短で１０．２分であり、最長でも１３．３分であった。それに比べてｑＲＴ－ＰＣＲ法による検出時間は、最短でも４０．３分であり、最長で５４．０分であった。
　以上のように、実施形態のプライマーセットにより、ギニア１４株を含めたＺＥＢＯＶ株を従来のＥＢＯＶ診断法として用いられるｑＲＴ－ＰＣＲ法と同様の高い精度で、より迅速に検出することが可能であることが証明された。
　本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。

Claims (19)

  1. 　ザイールエボラウイルスを特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットであって、
    それにより増幅されるべき鋳型配列は、３’側から５’側に向けてＦ３ｃ配列、Ｆ２ｃ配列、Ｆ１ｃ配列、Ｂ１配列、Ｂ２配列およびＢ３配列をこの順番で含み、
    当該プライマーセットは、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマーおよびＢ３プライマーを含み、ＦＩＰプライマーは、５’側から３’側に向けてＦ１ｃ配列とＦ２配列とをこの順番で含み、Ｆ３プライマーはＦ３配列を含み、ＢＩＰプライマーは、５’側から３’側に向けてＢ１ｃ配列とＢ２配列とをこの順番で含み、Ｂ３プライマーはＢ３配列を含み、
    　　ここで、Ｆ１配列とＦ１ｃ配列、Ｆ２配列とＦ２ｃ配列、Ｆ３配列とＦ３ｃ配列、Ｂ１配列とＢ１ｃ配列、Ｂ２配列とＢ２ｃ配列、Ｂ３配列とＢ３ｃ配列は互いに相補的であり、
    前記Ｆ１配列は、配列番号３１若しくは配列番号６４に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
    前記Ｆ２配列は、配列番号６２若しくは配列番号６３に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
    前記Ｆ３配列は、配列番号２９、配列番号３６、配列番号３８、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０若しくは配列番号６１に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
    前記Ｂ１ｃ配列は、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４若しくは配列番号７５に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
    前記Ｂ２ｃ配列は、配列番号６５若しくは配列番号６６に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、および
    前記Ｂ３ｃ配列は、配列番号３４、配列番号６７、配列番号８２若しくは配列番号８３に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含む
    ことを特徴とするプライマーセット。
  2. 　前記Ｆ３プライマーが配列番号２９、５５、６０若しくは６１に含まれる５’端から第１位～第５位の何れかの塩基から続く塩基を含むように連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列であり、
    　前記ＦＩＰプライマーが配列番号４、４４若しくは４５の何れかで示される配列またはその相補配列と、配列番号３若しくは４２の何れかで示される配列またはその相補配列とを含み、
    　前記ＢＩＰプライマーにおいて、当該Ｂ１ｃ配列が、配列番号７５に含まれる５’端から第１位～第５位の何れかの塩基を含むように連続する少なくとも１３塩基若しくはその相補配列、または３’端から第１位～第６位の何れかの塩基を含むように連続する少なくとも１３塩基若しくはその相補配列であり、当該Ｂ２ｃ配列が、配列番号６５若しくは６６に含まれる５’端から第１位～第７位の何れかの塩基を含むように連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列であり、
    　前記Ｂ３プライマーが、配列番号８２に含まれる５’端から第１位～第５位の何れかの塩基を含むように連続する少なくとも１３塩基若しくはその相補配列、または配列番号３４に含まれる３’端から第１～第７位の何れかの塩基を含むように連続する少なくとも１３塩基若しくはその相補配列である、
    　前記ＬＦｃプライマーが、配列番号１１で示される配列を含む、
    ことを特徴とする請求項１に記載のプライマーセット。
  3. 　前記Ｆ３プライマーが、配列番号２、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２２または配列番号３９の何れかで示される配列またはその相補配列を含み、
    　前記ＦＩＰプライマーが、配列番号１２、配列番号１８または配列番号２１の何れかで示される配列またはその相補配列を含み、
    　前記ＢＩＰプライマーが、配列番号１３、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６または配列番号２７の何れかで示される配列またはその相補配列を含み、　前記Ｂ３プライマーが、配列番号１０または配列番号１９の何れかで示される配列またはその相補配列を含む、
    ことを特徴とする請求項１または２に記載のプライマーセット。
  4. 　前記Ｆ３プライマーが、配列番号２、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２２または配列番号３９の何れかで示される配列またはその相補配列に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含み、
    　前記ＦＩＰプライマーが、配列番号１２、配列番号１８または配列番号２１の何れかで示される配列またはその相補配列に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含み、
    　前記ＢＩＰプライマーが、配列番号１３、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６または配列番号２７の何れかで示される配列またはその相補配列に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含み、
    　前記Ｂ３プライマーが、配列番号１０または配列番号１９の何れかで示される配列またはその相補配列に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む、
    ことを特徴とする請求項１または２に記載のプライマーセット。
  5. 　前記プライマーセットに含まれるＦ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーおよびＢ３プライマーのためのそれぞれの認識配列の組み合わせが以下からなる群より選択される請求項１～３の何れか１項に記載のプライマーセット：
    （１）配列番号１７、配列番号１８、配列番号１３および配列番号１９の組み合わせ；（２）配列番号２２、配列番号２１、配列番号１５および配列番号１０の組み合わせ；（３）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３および配列番号１０の組み合わせ；（４）配列番号２２、配列番号２１、配列番号２４および配列番号１０の組み合わせ；（５）配列番号２２、配列番号２１、配列番号２５および配列番号１０の組み合わせ；（６）配列番号２２、配列番号２１、配列番号２６および配列番号１０の組み合わせ；（７）配列番号２２、配列番号２１、配列番号２７おおび配列番号１０の組み合わせ；（８）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２３および配列番号１０の組み合わせ；（９）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２４および配列番号１０の組み合わせ；（１０）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２５および配列番号１０の組み合わせ；（１１）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２６および配列番号１０の組み合わせ；（１２）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２７および配列番号９の組み合わせ；（１３）配列番号２０、配列番号１２、配列番号１３および配列番号９の組み合わせ；（１４）配列番号２０、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１９の組み合わせ；（１５）配列番号２２、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０の組み合わせ；（１６）配列番号２２、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１９の組み合わせ；（１７）配列番号３９、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０の組み合わせ；（１８）配列番号２、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０の組み合わせ；並びに
    （１９）前記（１）～（１８）の何れかの組み合わせに含まれる４つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ。
  6. 　前記ザイールエボラウイルスが、ギニア１４株であることを特徴とする請求項１～５の何れか１項に記載のプライマーセット。
  7. 　前記ザイールエボラウイルスが、ギニア１４株、ザイール７６株およびザイール９５株であることを特徴とする請求項１～５の何れか１項に記載のプライマーセット。
  8. 　前記ＦＩＰプライマーが、更に前記Ｆ１ｃ配列と前記Ｆ２配列との間にリンカーを含み、および／または前記ＢＩＰプライマーが、更に前記Ｂ１配列と前記Ｂ２ｃ配列との間にリンカーを含むことを特徴とする請求項１～７の何れか１項に記載のプライマーセット。
  9. 　前記リンカーが、１～５０塩基長を有する任意の塩基配列からなることを特徴とする請求項８に記載のプライマーセット。
  10. 　更に、配列番号１１またはその相補配列を含むＬＦｃプライマーを含むことを特徴とする請求項１～９の何れか１項に記載のプライマーセット。
  11. 　請求項１～５の何れか１項に記載の何れかのプライマーセットと、前記プライマーセットを収容する容器とを含むザイールエボラウイルスを検出するためのアッセイキット。
  12. 　前記ザイールエボラウイルスが、ギニア１４株であることを特徴とする請求項１１に記載のアッセイキット。
  13. 　前記ザイールエボラウイルスが、ザイール７６株、ザイール９５株およびギニア１４株であることを特徴とする請求項１１に記載のアッセイキット。
  14. 　３’側から５’側に向けて、Ｆ１配列、Ｆ２ｃ配列およびＦ１ｃ配列をこの順番で含み、且つ前記Ｆ１配列と前記Ｆ１ｃ配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第１のステム・ループ構造体、
    　３’側から５’側に向けて、Ｂ１配列、Ｂ２配列およびＢ１ｃ配列をこの順番で含み、前記Ｂ１配列と前記Ｂ１ｃ配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第２のステム・ループ構造体、
    　５’側から３’側に向けて、Ｆ１ｃ配列、Ｆ２配列およびＦ１配列をこの順番で含み、前記Ｆ１ｃ配列と前記Ｆ１配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第３のステム・ループ構造体、
    　５’側から３’側に向けて、Ｂ１ｃ配列、Ｂ２ｃ配列およびＢ１配列をこの順番で含み、前記Ｂ１ｃ配列と前記Ｂ１配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第４のステム・ループ構造体、
    　３’側から５’側に向けて、Ｆ１配列、Ｆ２ｃ配列、Ｆ１ｃ配列、Ｂ１配列、Ｂ２配列およびＢ１ｃ配列をこの順番で含み、且つ前記Ｆ１配列と前記Ｆ１ｃ配列とが互いに結合し二本鎖を形成し、前記Ｂ１配列と前記Ｂ１ｃ配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第１のダンベル構造体、および／または
    　５’側から３’側に向けて、Ｆ１ｃ配列、Ｆ２配列、Ｆ１配列、Ｂ１ｃ配列、Ｂ２ｃ配列およびＢ１配列をこの順番で含み、且つ前記Ｆ１ｃ配列と前記Ｆ１配列とが互いに結合し二本鎖を形成し、前記Ｂ１ｃ配列と前記Ｂ１配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第２のダンベル構造体
    を含む核酸構造体であって、
    　　ここで、Ｆ１配列とＦ１ｃ配列、Ｆ２配列とＦ２ｃ配列、Ｆ３配列とＦ３ｃ配列、Ｂ１配列とＢ１ｃ配列、Ｂ２配列とＢ２ｃ配列、Ｂ３配列とＢ３ｃ配列は互いに相補的であり、
    前記Ｆ１配列は、配列番号３１若しくは配列番号６４に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
    前記Ｆ２配列は、配列番号６２若しくは配列番号６３に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
    前記Ｆ３配列は、配列番号２９、配列番号３６、配列番号３８、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０若しくは配列番号６１に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
    前記Ｂ１ｃ配列は、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４若しくは配列番号７５に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
    前記Ｂ２ｃ配列は、配列番号６５若しくは配列番号６６に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、および
    前記Ｂ３ｃ配列は、配列番号３４、配列番号６７、配列番号８２若しくは配列番号８３に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含む
    ことを特徴とする核酸構造体。
  15. 　前記核酸構造体が、鋳型としてのザイールエボラウイルスのギニア１４株を起源とする請求項１４に記載の核酸構造体。
  16. 　前記ザイールエボラウイルスが、ギニア１４株、ザイール７６株およびザイール９５株であることを特徴とする請求項１５に記載の核酸構造体。
  17. 　ザイールエボラウイルスを検出するための方法であって、請求項１～５に記載の何れかのプライマーセットを用いて検体に含まれる核酸を増幅し、濁度または蛍光を指標に前記検体にザイールエボラウイルスが含まれているか否かを判定する方法。
  18. 　前記ザイールエボラウイルスが、ギニア１４株であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
  19. 　前記ザイールエボラウイルスが、ギニア１４株、ザイール７６株およびザイール９５株であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
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