JP2019201670A - 核酸増幅 - Google Patents

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Abstract

【課題】核酸増幅の提供。【解決手段】核酸の増幅のための及びコンカテマーの生成のための方法及び組成物が開示される。本明細書において提供される増幅方法は、等温条件下で遂行され得る。方法及び組成物は、核酸ポリメラーゼ及びプライマー等の試薬を含み得る。核酸の増幅のための方法及び試薬に対する増加するニーズが存在する。特定の核酸の複数のコピーの生成は、核酸が所定の応用に用いられるために、しばしば必要か、又は有用である。例えば、目的の核酸のヌクレオチド配列を分析するために、配列が分析される前に、高い頻度で、そのコピー数を増やすために、この核酸が複製される。【選択図】なし

Description

［発明の背景］
核酸の増幅のための方法及び試薬に対する増加するニーズが存在する。特定の核酸の複数のコピーの生成は、核酸が所定の応用に用いられるために、しばしば必要か、又は有用である。例えば、目的の核酸のヌクレオチド配列を分析するために、配列が分析される前に、高い頻度で、そのコピー数を増やすために、この核酸が複製される。別の実施例では、サンプル中の特定の核酸の存在又は不在を決定するために、サンプル特定の核酸がサンプル中に存在する場合に、それが増幅され得るような条件の下に処理され得る。別の実施例では、プローブとして用いられるための核酸は、オリジナルの核酸テンプレートと同じ配列を含む多数の核酸を生成させるために、繰り返しコピーされ、それにより、プローブとして用いられる核酸の多数のコピーが生成される。
核酸の増幅のための様々な方法は周知である。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号を参照されたい）は、核酸の増幅のための人気のある方法である。ＰＣＲ反応を成功裏に遂行するために、この反応は、複数のサイクルで反復される複数の異なる温度で遂行されなければならない。このことは、ＰＣＲ反応の温度を繰り返し変化させるためのハードウエア、又は他の機構を必要とする。核酸の増幅のための別の方法はループ媒介等温増幅（“ＬＡＭＰ”）と称される（例えば、米国特許第６，４１０，２７８号を参照のこと）．ＬＡＭＰ反応は、等温的に遂行され得るが、典型的には、標的の核酸上の６つの明白に区別できる配列を認識する４つの異なるプライマーの使用を含み得る。
増幅された核酸を使用する、多くの及び成長する数の応用のために、増幅された核酸の生成を促進するために、核酸の増幅のための新しい方法及び試薬が望まれる。
［相互参照による組み込み］
本明細書において言及される、全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許及び特許出願のそれぞれが、参照により組み込まれるために、あたかも明確に、及び個々に参照により示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、本発明の明確な開示の内容と参照により本明細書に組み込まれた文書の内容の間に矛盾がある場合には、本発明の明確な開示の内容が支配する。
米国特許第４，６８３，２０２号明細書 米国特許第６，４１０，２７８号明細書
［発明の要旨］
本明細書において提供されるものは、核酸の増幅及びコンカテマーの生成に関する方法及び組成物である。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるものは、二本鎖の核酸テンプレートの２つ以上のコピーを含む、コンカテマーを生成するための方法であって、この方法は以下のものを含む：（Ａ）二本鎖の核酸テンプレートを含む一次二本鎖の核酸を、二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖にアニールされた第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物が、合成される得る条件下で、第一のプライマーの第一のコピー及びポリメラーゼにより処理することであって、前記第一のプライマーは、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、並びに（ｉ）及び（ｉｉ）２つの領域を含み：（ｉ）テール領域は以下を含み：（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり、（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む５’末端ヌクレオチド及び最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び（ｉｉ）テンプレート結合領域は以下のものを含み：（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド、（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり、（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び前記第一のプライマーの第一のコピーのテンプレート結合領域は、二本鎖の核酸テンプレートの前記第一の鎖にアニールし、（Ｂ）ステップ（Ａ）の前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物を、ステップ（Ａ）の前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物がアニールされた第二のプライマーの伸長された生成物が合成される条件下で、第二のプライマー及びポリメラーゼで処理することであって、前記第二のプライマーは、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含み：（ｉ）テール領域は以下のものを含み：（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド、（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり、（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び（ｉｉ）テンプレート結合領域は以下のものを含む：（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド、（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり、（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記３’末端ヌクレオチドと前記最も内部のヌクレオチドの間の中間領域であって、前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列と相補的である、ヌクレオチド配列を含み、もし前記第二のプライマーの５’末端ヌクレオチドが、前記第一のプライマーのテール領域の最も内部のヌクレオチドと整列するために配列される場合、及び前記第一のプライマーの５’末端ヌクレオチドが、第二のプライマーのテール領域の最も内部のヌクレオチドと整列する場合、前記第二のプライマーのテンプレート結合領域は、ステップ（Ａ）の前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物とアニールし、及び前記第二のプライマーの伸長された生成物は、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び３’末端ヌクレオチドを含む、３’末端領域を含み、前記３’末端領域は、前記第二のプライマーのテール領域を、５’から３’方向に読んだ場合の、ヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を含み、及び３’末端ヌクレオチドの３’末端領域の最終的なヌクレオチドは、第二のプライマーの伸長された生成物の、３’末端ヌクレオチドであり、（Ｃ）ステップ（Ｂ）の前記第二のプライマーの伸長された生成物を含む、二次核酸の第一のコピー、及び前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物を生成するために、ステップ（Ｂ）の前記第二のプライマーの伸長された生成物を、前記第一のプライマーの第二のコピー及びポリメラーゼにより、ステップ（Ｂ）の前記第二のプライマーの伸長された生成物によりアニールされた、前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物が、合成される条件下で、処理することであって、前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物は、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び３’末端ヌクレオチドを含む３’末端領域を含み、前記３’末端領域は、前記第一のプライマーを５’から３’方向に読んだ場合のテール領域と同じヌクレオチド配列であり、３’末端領域の最終的なヌクレオチドは、第二のプライマーの伸長された生成物の、３’末端ヌクレオチドであり、（Ｄ）（Ｃ）の二次核酸の少なくとも第二のコピーを生成するために、少なくともステップ（Ｃ）を、１回以上の追加回数で繰り返すこと、（Ｅ）二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物、及び二次核酸の第二のコピーの第二のプライマーの伸長された生成物を含む、クロスオーバー構造を生成するために、ステップ（Ｃ）の二次核酸の第一のコピー及びステップ（Ｄ）の二次核酸の第二のコピーを、第二の核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二の伸長化合物の３’末端領域が、第二の核酸の第二のコピーの第二のプライマーの３’末端領域とアニールする条件下で処理すること、（Ｆ）ステップ（Ａ）の二本鎖の核酸テンプレートのコピーを含むコンカテマーを生成するために、ステップ（Ｅ）のクロスオーバー構造を、二次核酸の第一のコピーの第二のコピーの第一のプライマーの伸長された生成物の伸長された生成物が合成され、及び二次核酸の第二のコピーの第二のプライマーの伸長された生成物の伸長された生成物が合成される条件下で、ポリメラーゼで処理することであって、前記コンカテマーは、二次核酸の第一のコピーの第二のコピーの第一のプライマーの伸長された生成物の伸長された生成物、及び二次核酸の第二のコピーの第二のプライマーの伸長された生成物の伸長された生成物を含む。
いくつかの実施形態では本明細書において提供されるものは、ポリヌクレオチド・テンプレート又はその類似の配列の２つ以上のコピーを含むコンカテマーを生成するための方法であり、この方法は：（Ａ）ポリヌクレオチド・テンプレートにアニールした、前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物が合成される条件下で、ポリヌクレオチド・テンプレートを含む、一次核酸を、第一のプライマーの第一のコピー及びポリメラーゼと処理することであって、前記第一のプライマーは、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、並びに（ｉ）及び（ｉｉ）の２つの領域を含み：（ｉ）テール領域は以下のものを含み、（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり、（ｃ）５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び（ｉｉ）テンプレート結合領域は以下のものを含み、（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり、（ｃ）３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の、１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び前記第一のプライマーの第一のコピーのテンプレート結合領域は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートにアニールし、（Ｂ）ステップ（Ａ）の前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物にアニールされた、前記第二のプライマーの伸長された生成物が合成される条件下で、ステップ（Ａ）の前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物を、第二のプライマー及びポリメラーゼと処理することであって、前記第二のプライマーは、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、並びに（ｉ）及び（ｉｉ）の２つの領域を含み：（ｉ）テール領域は以下のものを含み、（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、（ｉｉ）テンプレート結合領域は以下を含み、（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは、前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含み、前記第二のプライマーの５’末端ヌクレオチドが、前記第一のプライマーのテール領域の最も内部のヌクレオチドと整列し、及びもし前記第一のプライマーの５’末端ヌクレオチドが、第二のプライマーのテール領域の最も内部のヌクレオチドと配列が整列される場合、前記第二のプライマーのテンプレート結合領域は、ステップ（Ａ）の前記第一のプライマーの第一のコピー伸長された生成物とアニールし、及び前記第二のプライマーの伸長された生成物は、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び３’末端ヌクレオチドを含む３’末端領域を含み、前記３’末端領域は、前記第二のプライマーのテール領域を５’から３’方向に読んだ場合のヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を含み、及び前記３’末端領域の最終的なヌクレオチドは、第二のプライマーの伸長された生成物の３’末端ヌクレオチドとであり、（Ｃ）ステップ（Ｂ）の第二のプライマー伸長された生成物及び前記第一のプライマーの第二のコピー伸長された生成物を含む二次核酸の第一のコピーを生成するために、ステップ（Ｂ）前記第二のプライマーの伸長された生成物にアニールされた前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物が合成される条件下で、ステップ（Ｂ）の、前記第二のプライマーの伸長された生成物を、前記第一のプライマーの第二のコピー及びポリメラーゼと処理することであって、前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物は、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び３’末端ヌクレオチドを含む３’末端領域を含み、前記３’末端領域は、前記第一のプライマーのテール領域を５’から３’方向に読んだ場合のヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を含み、及び３’末端領域の最終的なヌクレオチドは、第二のプライマーの伸長された生成物の３’末端ヌクレオチドであり、（Ｄ）ステップ（Ｂ）前記第二のプライマーの伸長された生成物、及びステップ（Ｃ）の前記第一のプライマーの第二のコピー伸長された生成物を含む二次核酸の少なくとも第二のコピーを生成するために、ステップ（Ｃ）を、１回以上の追加回数で繰り返すこと、（Ｅ）二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物、及び前記二次核酸の第二のコピーの第二のプライマーの伸長された生成物を含むクロスオーバー構造を生成するために、ステップ（Ｃ）の二次核酸の第一のコピー、及びステップ（Ｄ）の二次核酸の第二のコピーを、二次核酸前の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物の３’末端領域が、前記二次核酸の第二のコピーの第二のプライマーの伸長された生成物の３’末端領域にアニールする条件下で処理すること、（Ｆ）ステップ（Ａ）のポリヌクレオチド・テンプレートの２つのコピーを含むコンカテマーを生成するために、前記二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物の伸長された生成物が合成され、及び前記二次核酸の第二のコピーの第二のプライマーの伸長された生成物の伸長された生成物が合成される条件下で、ステップ（Ｅ）の前記クロスオーバー構造を、ポリメラーと処理することであって、前記コンカテマーは、前記二次核酸第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物の伸長された生成物、及び前記二次核酸の第二のコピーの第二のプライマーの伸長された生成物の伸長された生成物を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（Ａ）の前記核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態ではステップ（Ａ）の前記核酸ポリメラーゼは、逆転写酵素である。
いくつかの実施形態では本明細書において提供されるものは、二本鎖の核酸テンプレートの２つ以上のコピーを含むコンカテマーを生成するための方法であり、この方法は以下のものを含む方法：（Ａ）以下のものを含む反応混合物を調製すること：（ｉ）二本鎖の核酸テンプレートを含む一次核酸（ｉｉ）単離された核酸ポリメラーゼ、（ｉｉｉ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含む第一のプライマー：（ａ）以下を含むテール領域（１）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド（２）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり（３）１つ以上のヌクレオチドを含む５’末端ヌクレオチド及び最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び（ｂ）以下のものを含むテンプレート結合領域（１）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド（２）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり、（３）１つ以上のヌクレオチドを含む、３’末端ヌクレオチド及び最も内部のヌクレオチドの間の中間部分であって、前記テンプレート結合領域は、前記核酸テンプレートの第一の鎖と相補的であり（ｉｖ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含む第二のプライマー：（ａ）以下のものを含むテール領域（１）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド（２）最も内部のヌクレオチド、この最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり（３）１つ以上のヌクレオチドを含む前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び（ｂ）以下のものを含むテンプレート結合領域（１）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド（２）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは３’末端ヌクレオチドから上流にあり、（３）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び前記テンプレート結合領域は、前記核酸テンプレートの第二の鎖に相補的であり、及びもし前記第二のプライマーの５’末端ヌクレオチドが、前記第一のプライマーのテール領域の最も内部のヌクレオチドと整列できる場合には、及び前記第一のプライマー５’末端ヌクレオチドが、前記第二のプライマーテール領域の最も内部のヌクレオチドと配列するように配列が整列されると、前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含み、及び（Ｂ）反応混合物を熱サイクルなしで少なくとも３分間インキュベートすることを含む。
いくつかの実施形態では本明細書において提供されるものは、ポリヌクレオチド・テンプレートの２つ以上のコピーを含むコンカテマーを生成するための方法であり、この方法は以下のものを含む：（Ａ）以下のものを含む反応混合物を調製すること：（ｉ）ポリヌクレオチド・テンプレートを含む核酸（ｉｉ）単離された核酸ポリメラーゼ、（ｉｉｉ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含む第一のプライマー：（ａ）以下のものを含むテール領域（１）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド（２）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり（３）１つ以上のヌクレオチドを含む前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び（ｂ）以下のものを含むテンプレート結合領域（１）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド（２）最も内部のヌクレオチド、であって、この最も内部のヌクレオチドは、前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり（３）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び前記テンプレート結合領域は前記ポリヌクレオチド・テンプレートに相補的であり、（ｉｖ）第二のプライマーは、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含み：（ａ）以下のものを含むテール領域（１）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド前記（２）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり（３）１つ以上のヌクレオチドを含む前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び（ｂ）以下のものを含むテンプレート結合領域（１）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド（２）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは、前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり（３）１つ以上のヌクレオチドを含む前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及びもし前記第二のプライマー５’末端ヌクレオチドが、前記第一のプライマーのテール領域の前記最も内部のヌクレオチドに整列し、及び前記第一のプライマーの５’末端ヌクレオチドが、前記第二のプライマーのテール領域の前記最も内部のヌクレオチドと整列するように、前記プライマーの配列が整列されると、前記テンプレート結合領域は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートに相補的なヌクレオチド配列に対して相補的であり、及び前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、及び（Ｂ）反応混合物を８０Ｃ未満の温度で少なくとも３分間インキュベートすることを含む。
いくつかの実施形態では本明細書において提供されるものは、二本鎖の核酸テンプレートの２つ以上のコピーを含むコンカテマーを生成するための方法であり、この方法は、二本鎖の核酸テンプレートを含む、二本鎖の核酸分子の第一のコピー及び第二のコピー及びポリメラーゼを共にインキュベートすることを含み、前記二本鎖の核酸分子は、第一の鎖及び第二の鎖を含み、それぞれが複数のヌクレオチドを含み、前記第一の鎖は、５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドを含み、並びに５’から３’方向の中に：Ａ１−Ｂ−Ａ２の一般形式の領域を含み、第二の鎖は、５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドを含み、並びに５’から３’方向の中に：Ｃ１−Ｄ−Ｃ２の一般形式の領域を含み、二本鎖の核酸分子の中に、領域Ｂは、二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖のヌクレオチド配列を含み、領域Ｄは、二本鎖の核酸テンプレートの第二の鎖のヌクレオチド配列を含み、領域Ａ１はＣ２にアニールされ、ＢはＤにアニールされ、及びＡ２はＣ１にアニールされ、前記二本鎖の核酸分子の第一のコピーの第一の鎖、及び前記二本鎖の核酸分子の第二のコピーの第二の鎖を含む、クロスオーバー構造が生成され、前記第一の鎖のＡ２領域は、第二の鎖のＣ２領域にアニールされ、前記クロスオーバー構造の第二の鎖の伸長された生成物にアニールされた前記クロスオーバー構造の第一の鎖の伸長された生成物を含むコンカテマー生成するために、前記クロスオーバー構造の第一の鎖の伸長された生成物が合成され、及び前記クロスオーバー構造の第二の鎖の伸長された生成物が合成され、このコンカテマーは、前記二本鎖の核酸テンプレートの２つのコピーを含む。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、ポリヌクレオチド・テンプレートをコピーするための方法であり、この方法は：第一のプライマーの複数のコピー及び第二のプライマーの複数のコピーを含む反応混合物中で前記ポリヌクレオチド・テンプレートをインキュベートすることを含み：前記第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一のプライマーの第二の領域は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートの第一の部分に相補的なヌクレオチド配列を含み；前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第二のプライマーの第二の領域は、パートナーのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含み、前記パートナーのヌクレオチド配列は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートの第二の部分と相補的であり；及び前記第一のプライマーの複数のコピー及び第二のプライマーの複数のコピーと前記ポリヌクレオチド・テンプレートのインキュベーションすると、少なくとも１つのコンカテマー鎖が形成され、このコンカテマー鎖は、５’末端及び３’末端を含み、及び５’から３’方向の中に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般的構造を有するヌクレオチド配列を含み：Ｃ’は、前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Ｔは、前記ポリヌクレオチド・テンプレート又はその類似の配列のヌクレオチド配列を表し、及びＸは、ヌクレオチドの配列の数を表す。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法では、５’から３’方向の中に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般的な構造を有するヌクレオチド配列を含むコンカテマー鎖の形成を含み、このコンカテマー鎖は第一のコンカテマー鎖であり、及び第二のコンカテマー鎖も形成され、第二のコンカテマー鎖は、５’末端及び３’末端を含み、及び５’から３’方向の中に：Ｃ−Ｘ’−Ｔ’−Ｃ−Ｔ’−Ｃの一般的構造を有するヌクレオチド配列を含み：Ｃは、前記第一のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、前記ポリヌクレオチド・テンプレートに相補的なヌクレオチド配列を表し、及びＸ’は、Ｘのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を表す。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、生物学的サンプル中の標的のポリヌクレオチド・テンプレートの検定のための方法であり、この方法は以下のものを含む：Ａ）前記生物学的サンプル又はその一部分を、第一のプライマーの複数のコピー及び第二のプライマーの複数のコピーを含む反応混合物中でインキュベートすることであって：前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、記第一のプライマーの第二の領域は、前記ポリヌクレオチド・テンプレート第一の部分と相補的なヌクレオチド配列を含み；前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第二のプライマーの第二の領域は、パートナーのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含み、このパートナーのヌクレオチド配列は前記ポリヌクレオチド・テンプレートの第二の部分と相補的であり；及び前記ポリヌクレオチド・テンプレートと、記第一のプライマーの複数のコピー及び第二のプライマーの複数のコピーとのインキュベーションすると、少なくとも１つのコンカテマー鎖が形成され、このコンカテマー鎖は、５’末端及び３’末端を含み、及び５’から３’方向中に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を含み：Ｃ’は、第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Ｔは、前記ポリヌクレオチド・テンプレート又はその類似した配列のヌクレオチド配列を表し、及びＸは、ヌクレオチドの任意の数及び配列を表し；及びＢ）Ａ）．のステップのインキュベートを開始した後の、１つ以上の点で、Ａ）の反応混合物中の増幅された核酸の量を測定すること。実施形態では、反応混合物中の増幅された核酸の量を測定することは、反応混合物中の蛍光のレベルを決定することを含み得る。実施形態では、前記方法は、反応混合物中の核酸増幅の変曲時間（変曲時間）を決定することを更に含み得る。
実施形態では、本明細書において提供される、５’から３’方向に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を有するコンカテマー鎖を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットにおいては、式中でＸは、[（Ｃ’−Ｔ）Ｎ]の５’から３’方向における一般構造を有する配列を含むことができ、Ｃ’は、前記第二のプライマーの最初の領域の配列を表し、Ｔは前記ポリヌクレオチド・テンプレート又はその類似の配列のヌクレオチド配列を表し、及びＮは０〜２０００の間の整数を表す。実施形態では、Ｎは、０〜１０、０〜１００、０〜１０００、０〜５０００、０〜１０，０００、１〜１０，０００、１〜１０００、１〜２０００、１〜５０００、又は１〜１０，０００の間の任意の整数であり得る。
実施形態では、本明細書において提供される、５’から３’方向に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を有するコンカテマー鎖を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットにおいては、式中でＸは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、５００、１０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、又は５００，０００を超えないヌクレオチドを含み得る。実施形態では、本明細書において提供される、５’から３’方向に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を有するコンカテマー鎖を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットにおいては、式中でＸは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、５００、１０００、１０，，０００、５０，０００、１００，０００、又は５００，０００ヌクレオチドを含むことができる。本明細書において提供される、５’から３’方向に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を有するコンカテマー鎖を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットにおいては、Ｘは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、５００、１０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００のヌクレオチドを含み、及びｎｏｍｏｒｅｔｈａｎ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、５００、１０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、又は５００，０００を超えないヌクレオチドを含み得る。
実施形態では、５’から３’方向に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を有するコンカテマー鎖を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットにおいては、少なくとも１つのＣ’及びＴの間に、Ｃ’又はＴ配列の部分ではない、１つ以上の追加のヌクレオチドが存在する。この１つ以上の追加のヌクレオチドは、例えば、１〜１０、１〜２０、１〜１００、又は１〜１０００のヌクレオチドであり得る。
実施形態では、５’から３’方向に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を有するコンカテマー鎖を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットにおいては、少なくとも１つのＣ’又はＴ配列は、１つ以上のヌクレオチドを欠失し得る。２つ以上のヌクレオチドが欠失している場合には、これらの欠失しているヌクレオチド隣接し得るか、又は離れた位置にあり得る。前記１つ以上の欠失ヌクレオチドは、例えば、１〜１０、１〜２０、１〜１００、又は１〜１０００ヌクレオチドであり得る。
実施形態では、５’から３’方向に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を有するコンカテマー鎖を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットにおいては、少なくとも１つのＣ’又はＴ配列は、１つ以上の点突然変異を有し得る。２つ以上の点突然変異が存在する場合、これらの点突然変異は隣接し得るか、又は離れた場所にあり得る。前記１つ以上の点突然変異は、例えば、１〜１０、１〜２０、１〜１００、又は１〜１０００の点突然変異であり得る。
実施形態では、５’から３’方向に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を有するコンカテマー鎖を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットにおいては、前記ヌクレオチド配列は、以下の特性の２つ又は３つの全てを有する：ｉ）少なくとも１つのＣ’及びＴの間に、Ｃ’又はＴ配列の一部ではない１つ以上の追加のヌクレオチドが存在する；ｉｉ）少なくとも１つのＣ’又はＴ配列は１つ以上のヌクレオチドを欠失し得る；及びｉｉｉ）少なくとも１つのＣ’又はＴ配列は、１つ以上の点突然変異を含む。
実施形態では、５’から３’方向に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を有するコンカテマー鎖を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットにおいては、前記ポリヌクレオチド・テンプレートが、ＲＮＡ分子である、実施形態では、前記Ｔは、前記ポリヌクレオチド・テンプレートのＲＮＡ配列と類似の、ＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を表す。
実施形態では、５’から３’方向に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を有するコンカテマー鎖を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットにおいては、前記コンカテマー鎖は、最も５’−側に存在するＣ’配列．の５’末端に更に１つ以上のヌクレオチドを含む。前記１つ以上のヌクレオチドは、例えば、１〜１０、１〜２０、１〜１００、又は１〜１０００のヌクレオチドであり得る。
実施形態では、５’から３’方向に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を有するコンカテマー鎖を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットにおいては、 前記コンカテマー 鎖は、最も３’−側に存在するＣ’ 配列の３’末端に更に１つ以上のヌクレオチドを含む。前記１つ以上のヌクレオチドは、 例えば、１〜１０、 １〜２０、 １〜１００、又は１〜１０００のヌクレオチドであり得る。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、二本鎖の核酸テンプレートの少なくとも２つのコピーを含むコンカテマーの生成方法であり、この方法は以下のものを含む：少なくとも第一のテンプレート分子及び第二のテンプレート分子を含む反応混合物中でインキュベートすることであって：前記第一のテンプレート分子は第一の核酸鎖及び第二の核酸鎖を含み：前記第一のテンプレート分子の前記第一の核酸鎖は、５’から３’方向の中に：Ｈ’−Ｓ−Ｙ１−Ｈ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を含み、式中：Ｈ’は、第一の相同配列のヌクレオチド配列を表し、Ｓは、二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖のヌクレオチド配列を表し、及びＹ１は、ヌクレオチドの任意の数及び配列を表し；及び前記第一のテンプレート分子の第二の核酸鎖は、５’から３’方向の中に：Ｈ−Ｙ１’−Ｓ’−Ｈの一般構造を有するヌクレオチド配列を含み、式中：Ｈは、第二の相同配列のヌクレオチド配列を表し、前記第一の相同配列及び第二の相同配列は互いに相補性であり、Ｙ１’は、Ｙ１のヌクレオチド配列に相補性のヌクレオチド配列を表し、及びＳ’は、二本鎖の核酸テンプレートの第二の鎖のヌクレオチド配列を表し、前記二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖及び第二の鎖は互いに相補的であり；及び第二のテンプレート分子は第一の核酸鎖及び第二の核酸鎖を含み：前記第二のテンプレート分子の第一の核酸鎖は、５’から３’方向の中に：Ｈ’−Ｓ−Ｙ２−Ｈ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を含み、式中：Ｈ’前記第一の相同配列のヌクレオチド配列を表し、Ｓは、二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖のヌクレオチド配列を表し、及びＹ２は、ヌクレオチドの任意の数及び配列を表し；及び前記第一のテンプレート分子の第二の核酸鎖は、５’から３’方向の中に、：Ｈ−Ｙ２’−Ｓ’−Ｈの一般構造を有する、ヌクレオチド配列を含み、式中：Ｈは、第二の相同配列のヌクレオチド配列を表し、Ｙ２’は、Ｙ２のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、及びＳ’は、前記二本鎖の核酸テンプレートの第二の鎖のヌクレオチド配列を表し；及び前記反応混合物中の第一のテンプレート分子を第二のテンプレート分子とインキュベートする際に、二本鎖の核酸テンプレートの、少なくとも２つのコピーを有する、少なくとも１つのコンカテマーが生成され、前記コンカテマーは、第一のコンカテマー鎖、及び第二のコンカテマー鎖を含み、前記第一のコンカテマー鎖は、５’末端及び３’末端を含み、及び５’から３’方向の中に：Ｈ’−Ｓ−Ｙ２−Ｈ’−Ｓ−Ｙ１−Ｈ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を含み、式中：Ｈ’、Ｙ１、Ｓ、及びＹ２のそれぞれは、上述のヌクレオチド配列を表し；及び第二のコンカテマー鎖は、５’末端及び３’末端を含み、及び５’から３’方向の中に：Ｈ−Ｙ１’−Ｓ’−Ｈ−Ｙ２’−Ｓ’−Ｈの一般構造を有する配列を含み、式中、Ｈ’、Ｙ１、Ｓ、及びＹ２は上述のヌクレオチド配列を表す。
実施形態では、５’から３’方向の中に：Ｈ’−Ｓ−Ｙ２−Ｈ’−Ｓ−Ｙ１−Ｈ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を含む、第一のコンカテマー鎖を含む、本明細書において提供される、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、Ｙ１及びＹ２の少なくとも１つ又は両方は、０個のヌクレオチドを表す。
実施形態では、５’から３’方向の中に：Ｈ’−Ｓ−Ｙ２−Ｈ’−Ｓ−Ｙ１−Ｈ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を含む、第一のコンカテマー鎖を含む、本明細書において提供される、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、Ｙ１は、５’から３’方向の中に、[（Ｈ’−Ｓ）Ｎ１]の一般構造を有する配列を含み、式中：Ｈ’及びＳは上述のヌクレオチド配列を表し、及びＮ１は、０〜２０００の間の任意の整数であり得る。
実施形態では、５’から３’方向の中に：Ｈ’−Ｓ−Ｙ２−Ｈ’−Ｓ−Ｙ１−Ｈ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を含む、第一のコンカテマー鎖を含む、本明細書において提供される、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、Ｙ２は、５’から３’方向の中に：[（Ｈ’−Ｓ）Ｎ２]の一般構造を有する配列を含み、式中：Ｈ’及びＳは、上述のヌクレオチド配列を表し、及びＮ１は、０〜２０００の間の任意の整数であり得る。
実施形態では、本明細書において提供される第一のテンプレート分子及び第二のテンプレート分子を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットものでは、前記第一のテンプレート分子及び第二のテンプレート分子は、両方とも二本鎖のＤＮＡ分子である。
実施形態では、本明細書において提供される、第一のテンプレート分子の第一の核酸鎖を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットは、前記第一の核酸鎖は、５’から３’方向中に：Ｈ’−Ｓ−Ｙ１−Ｈ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を含み、式中：Ｈ’は、第一の相同配列のヌクレオチド配列を表し、前記第一の相同配列は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００未満のヌクレオチドを含み得る。実施形態では、前記第一の相同配列は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００のヌクレオチドを含み得る。実施形態では、前記第一の相同配列は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００の、及び５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は２００未満のヌクレオチドを含み得る。
実施形態では、本明細書において提供される、反応混合物、容器、又はキットは、核酸ポリメラーゼを含む。実施形態では、核酸ポリメラーゼは、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼである。実施形態では、核酸ポリメラーゼＲＮＡポリメラーゼである。実施形態では、核酸ポリメラーゼは逆転写酵素である。実施形態では、反応混合物、容器、又はキットは、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素の両方等の２種類以上の核酸ポリメラーゼを含み得る。実施形態では、本明細書において提供される反応混合物、容器、又はキットものは、ヌクレオチド及び緩衝液を含む。
実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチド・テンプレートを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記ポリヌクレオチド・テンプレートは、単鎖の分子である。実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチド・テンプレートを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記ポリヌクレオチド・テンプレートは、二本鎖の核酸テンプレートの一本の鎖を含む。実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチド・テンプレートを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記ポリヌクレオチド・テンプレートはＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。
実施形態では、本明細書において提供される、核酸テンプレートを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記核酸テンプレート は、ＲＮＡ又はＤＮＡ 分子である。実施形態では、核酸テンプレートは、単鎖の又は二本鎖の分子であり得る。
実施形態では、本明細書において提供される、反応混合物のインキュベーションを含む方法では、前記反応混合物のインキュベーションの間、反応混合物の温度は、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３７、３５、３０、２５、又は２０Ｃを超えない。実施形態では、本明細書において提供される方法では、前記方法の全てのステップは、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３７、３５、３０、２５、又は２０Ｃ未満の温度において遂行される。実施形態では、本明細書において提供される反応混合物、容器、又はキットは、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３７、３５、３０、２５、又は２０Ｃ未満の温度に維持される。実施形態では、本明細書において提供される方法は、熱サイクリングなしで遂行される。
実施形態では、本明細書において提供される、第一の部分を含むポリヌクレオチド・テンプレートを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一の部分は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は２００未満のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供される、第一の部分を含むポリヌクレオチド・テンプレートを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一の部分は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は２００未満のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供される、第一の部分を含むポリヌクレオチド・テンプレートを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一の部分は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００未満のヌクレオチドを含み、及び１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は２００未満のヌクレオチドを含む。
実施形態では、本明細書において提供される、第一の領域を含むプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一の領域が、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供される、第一の領域を含むプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一の領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００未満のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供される、第一の領域を含むプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一の領域は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０の、及び５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、プライマーを含む。実施形態では、本明細書において提供される、第一の領域を含む第一のプライマー及び第一の領域を含む第二のプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一のプライマー及び第二のプライマーの両方は、上述のいかなる特徴も有し得る。実施形態では、本明細書において提供される、第一の領域を含む第一のプライマー及び第一の領域を含む第二のプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一のプライマーの第一の領域及び前記第二のプライマーの第一の領域は、同じ数のヌクレオチドを含み得る。実施形態では、本明細書において提供される、第一の領域を含む第一のプライマー及び第一の領域を含む第二のプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一のプライマーの第一の領域、及び前記第二のプライマーの第一の領域は、異なる数のヌクレオチドを含み得る。
実施形態では、本明細書において提供される、第二の領域を含むプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、この第二の領域は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供される、第二の領域を含むプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、この第二の領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００未満のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供される、第二の領域を含むプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、この第二の領域は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０の、及び５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００未満のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供される、第一の領域を含む第二のプライマー及び第二の領域を含む第二のプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一のプライマー及び第二のプライマーの両方は、前記第一のプライマー及び第二のプライマーの両方は、上述のいかなる特徴も有し得る。実施形態では、本明細書において提供される、第一の領域を含む第二のプライマー及び第二の領域を含む第二のプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一のプライマー及び第二のプライマーの両方は、同じ数のヌクレオチドを含み得る。実施形態では、本明細書において提供される、第一の領域を含む第二のプライマー及び第二の領域を含む第二のプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一のプライマー及び第二のプライマーの両方は、異なる数のヌクレオチドを含み得る。
実施形態では、本明細書において提供される、第二の領域を含む第二のプライマー、及び第二の部分を含むポリヌクレオチド・テンプレートを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第二のプライマーの第二の領域のヌクレオチド配列は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートの第二の部分のヌクレオチド配列と同じである。
実施形態では、本明細書において提供される、テール領域を含むプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記テール領域は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供される、テール領域を含むプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記テール領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００未満のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供される、テール領域を含むプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記テール領域は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０の、及び５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００未満のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供される、テール領域を含む第一のプライマー、及びテール領域を含む第二のプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一のプライマー及び第二のプライマーの両方が、上述のいかなる特徴も有し得る。実施形態では、本明細書において提供される、テール領域を含む第一のプライマー、及びテール領域を含む第二のプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一のプライマーのテール領域及び第二のプライマーのテール領域は、同じ数のヌクレオチドを含み得る。実施形態では、本明細書において提供される、テール領域を含む第一のプライマー、及びテール領域を含む第二のプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一のプライマーのテール領域及び第二のプライマーのテール領域は、異なる数のヌクレオチドを含み得る。
実施形態では、本明細書において提供されるテンプレート結合領域を含むプライマーを含む方法、反応混合物、容器、又はキットでは、テンプレート結合領域は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供されるテンプレート結合領域を含むプライマーを含む方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記テンプレート結合領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００未満のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供されるテンプレート結合領域を含むプライマーを含む方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記テンプレート結合領域は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０の、及び５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００未満のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供されるテンプレート結合領域を含む、第一のプライマー及びテンプレート−結合領域を含む第二のプライマーを含む、含む方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一のプライマー及び第二のプライマーの両方は、上述のいかなる特徴も有し得る。実施形態では、本明細書において提供されるテンプレート結合領域を含む、第一のプライマー及びテンプレート結合領域を含む第二のプライマーを含む、含む方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一のプライマーのテンプレート結合領域、及び前記第二のプライマーのテンプレート結合領域は同じ数のヌクレオチドを含み得る。実施形態では、本明細書において提供されるテンプレート結合領域を含む、第一のプライマー及びテンプレート結合領域を含む第二のプライマーを含む、含む方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一のプライマーのテンプレート結合領域、及び前記第二のプライマーのテンプレート結合領域は異なる数のヌクレオチドを含み得る。
実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチド・テンプレートを含む方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記ポリヌクレオチド・テンプレートは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、又は５０００のヌクレオチドを含み得る。実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチド・テンプレートを含む方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記ポリヌクレオチド・テンプレートは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、又は１０，０００未満のヌクレオチドを含み得る。実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチド・テンプレートを含む方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記ポリヌクレオチド・テンプレートは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、又は５０００の、及び９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、又は１０，０００未満のヌクレオチドを含み得る。
実施形態では、本明細書において提供される二本鎖の核酸テンプレートを含む方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記二本鎖の核酸テンプレートのそれぞれの鎖は、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、又は５０００のヌクレオチドを含み得る。実施形態では、本明細書において提供される二本鎖の核酸テンプレートを含む方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記二本鎖の核酸テンプレートのそれぞれの鎖は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、又は１０，０００未満のヌクレオチドを含み得る。実施形態では、本明細書において提供される二本鎖の核酸テンプレートを含む方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記二本鎖の核酸テンプレートのそれぞれの鎖は、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、又は５０００、の、及び９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、又は１０，０００未満のヌクレオチドを含み得る。
実施形態では、本明細書において提供される反応混合物、容器、又はキットは、リコンビナーゼ酵素を含まない。
実施形態では、本明細書において提供される、方法、反応混合物、容器、又はキットは、プライマー複数のコピーを含み得るか、又は取り込み得る。前記複数のコピーは、例えば、前記プライマーの、少なくとも５、１０、１５、２０、５０、１００、５００、１０００、１０，０００、１００，０００、又は１，０００，０００コピーであり得る。
実施形態では、本明細書において提供される、反応混合物又は容器 は、被験者からの生物学的サンプルの少なくとも一部分を含み得る。この生物学的サンプルは、例えば、唾液、 血液、 尿、 頬の裏からの拭い取り、又は鼻の拭い取りであり得る。前記被験者はヒトであり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法の全てのステップは、７０、６５、６０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、又は１０Ｃ未満の温度で遂行される。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法のいくつかのステップは、７０、６５、６０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、又は１０Ｃ未満の温度で遂行される。
いくつかの実施形態では本明細書において提供される方法の２つ以上のステップは、同じ反応混合物中で同時に遂行される。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法の全てのステップは、同じ反応混合物中で同時に遂行される。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法では、核酸テンプレートは、方法の開始から５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１２０、又は１８０分以内に、少なくとも１０、１００、１０００、１０，０００、１００、０００、又は１、０００、０００倍に増幅される。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法では、反応混合物中の核酸テンプレートのコピーの数は、方法の開始から、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１２０、又は１８０分以内に、少なくとも１０、１００、１０００、１０、０００、１００，０００、又は１，０００，０００倍に増幅される。
実施形態では、本明細書において提供される核酸テンプレートは、単鎖の又は二本鎖の核酸テンプレートであり得る。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、その中に流体連結に以下のものを含む容器である：第一のプライマーであって、前記第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、及び前記第一のプライマーの第二の領域は、ポリヌクレオチド・テンプレート第一の部分と相補的なヌクレオチド配列であり；第二のプライマーであって、前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、及び前記第二のプライマーの第二の領域は、パートナーのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記パートナーのヌクレオチド配列は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートの第二の部分に相補的であり；及び少なくとも１つのコンカテマー鎖であって、前記コンカテマー鎖は、５’末端及び３’末端を含み、並びに５’から３’方向の中に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般的構造を有するヌクレオチド配列を含み、式中：Ｃ’は、第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Ｔは、前記ポリヌクレオチド・テンプレート又はその類似の配列のヌクレオチド配列を表し、及びＸは、ヌクレオチドの任意の数及び配列を表す。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるものは、その中の流体連結に以下のものを含む容器である：（Ａ）単離された核酸ポリメラーゼ、（Ｂ）少なくとも第一の鎖を含む核酸テンプレート、（Ｃ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び以下の２つの領域を含む第一のプライマー：（ｉ）以下を含むテール領域（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチド前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり（ｃ）前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び（ｉｉ）以下を含むテンプレート結合領域（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり、（ｃ）前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の、１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、前記テンプレート結合領域は、前記核酸テンプレートの第一の鎖に相補的であり、並びに（Ｄ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び以下の２つの領域を含む第二のプライマー：（ｉ）以下を含むテール領域（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり（ｃ）前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の、１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び（ｉｉ）以下を含むテンプレート結合領域（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり（ｃ）前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の、１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び前記テンプレート結合領域は、前記核酸テンプレートの第一の鎖に相補的なヌクレオチド配列に対して相補的であり、及びもし前記プライマーの配列が整列される場合には、前記第二のプライマー５’末端ヌクレオチドが、前記第一のプライマーのテール領域の最も内部のヌクレオチドと整列し、及び前記第一のプライマー５’末端ヌクレオチドが、前記第二のプライマーのテール領域の最も内部のヌクレオチドと整列できる場合には、前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、
実施形態では、本明細書において提供されるものは、２つ以上の流体的に分離された容器を含むキットであり、前記容器は集合的に以下のものを含む：第一のプライマーであって、前記第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、及び前記第一のプライマーの第二の領域は、ポリヌクレオチド・テンプレートの第一の部分と相補的なヌクレオチド配列を含み；第二のプライマーであって、前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、及び前記第二のプライマーの第二の領域は、パートナーのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記パートナーのヌクレオチド配列は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートの第二の部分に相補的であり；及び単離されたＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有し：前記第一のプライマーの第一の領域、及び前記第二のプライマーは第一の領域は相補的である。
いくつかの実施形態では本明細書において提供されるものは、少なくとも第一の鎖を含む標的の目的の核酸を検出するためのキットであり、このキットは２つ以上の流体的に分離された容器を含み、前記容器は集合的に以下のものを含む：（Ａ）単離された核酸ポリメラーゼ、（Ｂ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び以下の２つの領域を含む第一のプライマー：（ｉ）以下を含むテール領域（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び（ｉｉ）以下を含むテンプレート結合領域（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、前記テンプレート結合領域は、前記標的の核酸の第一の鎖に相補的であり、及び（Ｃ）第二のプライマー５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び以下の２つの領域を含み：（ｉ）以下を含むテール領域（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び（ｉｉ）以下を含むテンプレート結合領域（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの中間部分、及びもし前記プライマーの配列が、前記第二のプライマーの５’末端ヌクレオチドが、前記第一のプライマーのテール領域の最も内部のヌクレオチドと整列し、及び前記第一のプライマーの５’末端ヌクレオチドが、前記第二のプライマーのテール領域の最も内部のヌクレオチドと整列できる場合には、前記テンプレート結合領域は、標的の核酸前記第一の鎖に相補的なヌクレオチド配列に相補的であり、及び前記第二のプライマーテール領域は、前記第一のプライマーテール領域ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では本明細書において提供される、キットは、標的の目的の核酸のヌクレオチド配列を有する核酸を含む。
いくつかの実施形態では本明細書において提供される、反応混合物、容器又はキットは、核酸染料を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される単離された核酸ポリメラーゼを含む容器又はキットの中で、前記単離された核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される単離された核酸ポリメラーゼを含む、容器又はキットの、単離された核酸ポリメラーゼは逆転写酵素である。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される容器又はキットは、単離された核酸ポリメラーゼを含み、前記容器又はキットは、ＤＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法、容器、又はキットは、核酸ポリメラーゼを含み、前記核酸ポリメラーゼは、鎖置換活性を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、１つ以上の反応成分又は前記方法のステップを核酸染料により処理することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される、核酸テンプレートを含む、方法、容器、又はキットでは、前記テンプレートは、ＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される、核酸テンプレートを含む、方法、容器、又はキットでは、前記テンプレートは、ＲＮＡ分子である。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される第一のプライマーを含む、方法、容器、又はキットでは、前記第一のプライマーのテール領域は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される第一のプライマーを含む、方法、容器、又はキットでは、前記第一のプライマーのテール領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、又は６０未満のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される、第二のプライマーを含む方法、容器、又はキットでは、前記第二のプライマーのテール領域は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される、第二のプライマーを含む方法、容器、又はキットでは、前記第二のプライマーのテール領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、又は６０未満のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される、第一のプライマーを含む方法、容器、又はキットでは、前記第一のプライマーのテンプレート結合領域は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される、第一のプライマーを含む方法、容器、又はキットでは、前記第一のプライマーのテンプレート結合領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、又は６０未満のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される、第二のプライマーを含む、方法、容器、又はキットでは、前記第二のプライマーのテンプレート結合領域は少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される、第二のプライマーを含む、方法、容器、又はキットでは、前記第二のプライマーのテンプレート結合領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、又は６０未満のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法及び組成物では、ＲＮＡ分子が前記テンプレート分子又は一次核酸であり、前記テンプレートの増幅は、前記ＲＮＡ分子に対応するＤＮＡ鎖のコピーの生成と称される。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、前記方法を含む検定からの蛍光信号を測定することを含む。
いくつかの実施形態では、核酸リガーゼが、本明細書において提供される方法又は組成物により含まれ得る。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは、リガーゼが、本明細書において提供される方法のための反応混合物に含まれる場合に、本明細書において提供される方法により、前記反応にが含まれない場合に比べて、より迅速に増幅されることができる。実施形態では、本明細書において提供される、反応混合物、容器、又はキットは、リガーゼ活性を有する酵素を含み得る。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、サンプル中の病原体について検定するための方法であり、この方法は、本明細書において提供される病原体からの核酸を増幅する方法を遂行することを含む。実施形態では、本明細書において提供される組成物又は方法において用いられる前記標的の核酸は、病原体からの核酸であり得る。実施形態では、本明細書において提供される方法において使用される前記第一の及び第二のプライマーのそれぞれは、前記病原体の核酸の配列に対して相補的な領域を含むか、又は前記病原体の核酸の配列に相補的な配列に相補的な配列を含み得る。実施形態では、前記病原体の核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。病原体は、限定なしで、ウイルス、微生物、真菌、及び原生生物を含む。サンプルは被験者からのものであることができ、及び本明細書の他の部分に記載されるサンプル特性のいかなるものも有し得る。
実施形態では、本明細書において提供される核酸の増幅のための方法は、ヒト又は動物の身体の外部からの診断的な方法のためのものである。例えば、サンプルは、ヒト又は動物から得られることができ、及び前記サンプルは、本明細書において提供される核酸の増幅方法により、標的の目的の核酸のために検定され得る。
実施形態では、本明細書において提供される方法は以下のものを含み得る：ａ）本明細書において提供される方法を遂行するための１つ以上の試薬を反応混合物中に提供すること、（例えば、１つ以上の第一のプライマー、第二のプライマー、核酸テンプレート、核酸ポリメラーゼ、ヌクレオチド、緩衝液、水等）、及びｂ）前記反応混合物を実質的な等温にインキュベートすることであって、この反応混合物の温度は、インキュベーションの間に、中心温度から、摂氏２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１度を超えるか、又は下回ることがないこと。実施形態では、中心の温度は、例えば、摂氏３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０度であり得る。
実施形態では、本明細書において提供される方法は、実質的に等温度で遂行され得る。実施形態では、実質的に等温度であることは、摂氏３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０度、からプラス又はマイナス摂氏２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１度であり得る。
実施形態では、本明細書において提供される方法のいずれも、摂氏９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、又は２５度を超えるものではない１つ以上の温度において遂行され得る。
実施形態では、本明細書において提供される方法は、熱サイクリング無しで遂行されることができ／反応混合物は熱サイクリングの無い条件下でインキュベートされ得る（即ち、例えば、ＰＣＲに基づく方法において用いられる、プライマーの鎖の分離又はハイブリダイゼーションを行うためにインキュベーション温度を上昇及び低下するサイクル無しで）。
本明細書において提供される、第一の領域を含む第一のプライマー及び第一の領域を含む第二のプライマーを含む、組成物及び方法であって、前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的である場合には、実施形態では、前記第一のプライマーの第一の領域、及び前記第二のプライマーの第一の領域の、ワトソン・クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）の塩基対の法則に従う、前記第一のプライマーの第一の領域の前記第二のプライマーの第一の領域に対するアニーリングにより生成される二本鎖の構造のヌクレオチド配列は、制限酵素の認識配列を形成しない。
本明細書において提供される、核酸ポリメラーゼを含む、組成物及び方法では、実施形態では、前記核酸ポリメラーゼは、３’から５’へのエクソヌクレアーゼ活性を有する。
本明細書において提供される実施形態では、提供されるものは標的核酸鎖を増幅するための方法であり、この方法は以下のものを含む：標的核酸鎖、第一のプライマー、及び第二のプライマーを含む反応混合物を、実質的に等温条件下にインキュベートすることであって：前記標的核酸鎖は第一の部分及び第二の部分を含み；前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記核酸鎖の第一の部分に相補的であり；前記第二のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は前記核酸鎖の第二の部分に相補的な配列に相補的であり；前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び前記標的核酸鎖は増幅される。随意的に、前記標的核酸鎖は、更に第三の部分を含むことができ、前記第三の部分は、前記標的核酸鎖において前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置し、及びｗｈｅｒｅｉｎ前記第二のプライマーの第一の領域は、前記標的核酸鎖の第三の部分に相補的である。
実施形態では、本明細書において提供されるいかなる方法においても、ポリヌクレオチドのテンプレート、標的核酸鎖等は、内部モチーフを含むことができ、本明細書において提供される前記標的核酸鎖を増幅するための、プライマーのテール領域は、前記内部モチーフに相補的である。
実施形態では、本明細書において提供される方法は、本明細書において提供される反応混合物に、更にＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッドに結合するペプチド−核酸（ＰＮＡ）プローブ及び染料を加えることを含むことができ、前記ＰＮＡプローブは、前記反応混合物中の増幅のための標的核酸、又はその相補体にに相補的である。
実施形態では、本明細書において提供される反応混合物は、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含み得る。
本明細書において核酸が「増幅される」等の記載がなされる場合、前記核酸は、「コピーされる」とも記載され得る。
実施形態では、第一の領域及び第二の領域を有するとして、本明細書に記載されるプライマーにおいては、前記第一の領域は、前記プライマーの５’末端を含むことができ、及び前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含むことができる。
実施形態では、テール領域及びテンプレート結合領域を有するとして、本明細書に記載されるプライマーにおいては、前記第一の領域は、前記プライマーの５’末端を含むことができ、及び前記第二の領域は、前記プライマーの３’末端を含むことができる。
本明細書において提供される実施形態では、提供されるものは標的核酸鎖を増幅するための方法であり、この方法は以下のものを含む：ポリヌクレオチドのテンプレートを含む反応混合物、第一のプライマー、及び第二のプライマーを熱サイクリングの無い条件下にインキュベートすることであって：前記ポリヌクレオチドのテンプレートは第一の部分及び第二の部分を含み；前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり；前記第二のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートのテンプレートの第二の部分に相補的な配列に相補的であり；前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び前記ポリヌクレオチドのテンプレートの複数のコピーが形成される。随意的に、前記ポリヌクレオチドのテンプレートは、更に第三の部分を含むことができ、前記第三の部分は、前記ポリヌクレオチドのテンプレート中で前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置し、及び前記第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分に相補的である。
本明細書において提供される実施形態では、提供されるものはポリヌクレオチドのテンプレートを増幅するための方法であり、この方法は第一のプライマー及び第二のプライマーを含む反応混合物中の前記ポリヌクレオチドのテンプレートをインキュベートすることを含み：前記ポリヌクレオチドのテンプレートは、第一の部分、第二の部分及び第三の部分を含み、前記第三の部分は、前記ポリヌクレオチドのテンプレート中で前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置し；前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一のプライマーの第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり；及び前記第二のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第二のプライマーの第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートのテンプレートの第二の部分に相補的な配列に相補的であり、前記第二のプライマーの第一の領域は、前記第一のプライマーの第一の領域に相補的であり、及び前記第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分に相補的である。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、ポリヌクレオチドのテンプレート中のヌクレオチド配列中の目的の位置におけるヌクレオチドの同一性を評価するための方法であり、この方法は以下のものを含む：Ａ）少なくとも第一の反応混合物及び第二の反応混合物のそれぞれの中の前記ポリヌクレオチドのテンプレートのコピーを提供することであって：前記ポリヌクレオチドのテンプレートは第一の部分、第二の部分及び第三の部分を含み、前記第三の部分は、前記ポリヌクレオチドのテンプレート中で前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置し、及び前記目的の部分は、前記第三の部分の中にあり；前記第一の反応混合物は、前記ポリヌクレオチドのテンプレート、第一のプライマー、及び第二のプライマーのコピーを含み：前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は、前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり、前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分に相補的な配列に相補的であり；前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び前記第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分に相補的であり；前記第二の反応混合物は、前記ポリヌクレオチドのテンプレート、第三のプライマー、及び第四のプライマーのコピーを含み：前記第三のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は、前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり；前記第四のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は、前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は、前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分に相補的である配列に相補的であり；前記第三のプライマーの第一の領域は、前記第四のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び前記第四のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分に相補的であり；及び前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列は、前記第四のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列とは、単一のヌクレオチドの分だけ異なり、前記第二及び第四のプライマーにおける異なるヌクレオチドの位置は、前記第二のプライマーの第一の領域又は第四のプライマーのヌクレオチド配列が、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分のヌクレオチド配列に対して、前記配列の最大の相補性により配向している場合には、前記ポリヌクレオチドのテンプレート中の興味のあるヌクレオチドの位置に対応し；Ｂ）熱サイクリングの無い条件下で前記第一の反応混合物及び第二の反応混合物をインキュベートすること；及びＣ）前記第一の反応混合物中での前記ポリヌクレオチドのテンプレートの増幅の量又は速度を、前記第二の反応混合物中での前記ポリヌクレオチドのテンプレートの増幅の量又は速度と比較することであって、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの増幅の速度又は量は、前記第二又は第四のプライマーの第一の領域及び前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分のヌクレオチド配列の間の相補性の程度を示す。（請求項７０に対応）
随意的に、本明細書において提供される、ポリヌクレオチドのテンプレートを含む実施形態では、前記ポリヌクレオチドのテンプレートはＤＮＡ鎖である。
随意的に、本明細書において提供される、ポリヌクレオチドのテンプレートを含む実施形態では、前記ポリヌクレオチドのテンプレートはＲＮＡ鎖である。
随意的に、本明細書において提供される、ポリヌクレオチドのテンプレートを含む実施形態では、前記ポリヌクレオチドのテンプレートは、二本鎖核酸分子の一本鎖である。実施形態では、前記二本鎖核酸分子は、二本鎖ＤＮＡ分子又は二本鎖ＲＮＡ分子である。
随意的に、本明細書において提供される、反応混合物中、容器、又はキットを含む実施形態では、前記反応混合物、容器、又はキットは、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む。
随意的に、本明細書において提供される、反応混合物中、容器、又はキットを含む実施形態では、前記反応混合物、容器、又はキットは逆転写酵素を含む。
随意的に、本明細書において提供される、反応混合物中、容器、又はキットを含む実施形態では、前記反応混合物、容器、又はキット核酸染料、ヌクレオチド、又は緩衝液を含む。
随意的に、本明細書において提供される、第一の部分、第二の部分、及び第三の部分を含むポリヌクレオチドのテンプレートを含む実施形態では、前記ポリヌクレオチドのテンプレートは、３’から５’の方向において１Ｐ−１Ｓ−３Ｐ−２Ｓ−２Ｐの要素の一般的な構造を有することができ：ここで、“１Ｐ”は前記第一の部分であり、“１Ｓ”は第一の空間であり、“３Ｐ”は前記第三の部分であり、“２Ｓ”は第二の空間であり、及び“２Ｐ”は前記第二の部分である。前記“第一の空間”及び“第二の空間”は前記第一の部分、第二の部分、又は第三の部分の一部ではないヌクレオチドを含む前記ポリヌクレオチドのテンプレートの部分である。実施形態では、前記第一の部分は、例えば、６〜３０の間のヌクレオチド、又は本明細書の他の部分に記載されるヌクレオチドの他の任意の数を有し得る。実施形態では、前記第一の空間は、例えば、２〜３０の間のヌクレオチド、又は本明細書の他の部分に記載されるヌクレオチドの他の任意の数を有し得る。実施形態では、前記第三の部分は、例えば、４〜１４の間のヌクレオチド、又は本明細書の他の部分に記載されるヌクレオチドの他の任意の数を有し得る。実施形態では、前記第一の空間は、例えば、２〜３０の間のヌクレオチド、又は本明細書の他の部分に記載されるヌクレオチドの他の任意の数を有し得る。実施形態では、前記第一の部分は、例えば、６〜３０の間のヌクレオチド、又は本明細書の他の部分に記載されるヌクレオチドの他の任意の数を有し得る。
実施形態では、本明細書において提供される、反応混合物中においてポリヌクレオチドのテンプレートをインキュベートすることを含む方法では、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの、少なくとも２、３、４、５、又は１０個のコピーを含むコンカテマー鎖が、前記反応混合物のインキュベーションの間に形成され得る。
本明細書において提供される実施形態で提供されるものは、二本鎖の核酸分子をぞ薄くするための方法であり、この方法は、第一のプライマー及び第二のプライマーを含む反応混合物中で二本鎖の核酸分子をインキュベートすることを含み：前記二本鎖の核酸分子は第一の鎖及び第二の鎖を含み、前記第一の鎖は第一の部分及び第三の部分を含み、及び前記第二の鎖は第二の部分を含み；前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一のプライマーの第二の領域は、前記第一の鎖の第一の部分に相補的であり；及び前記第二のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第二のプライマーの第二の領域は、前記第二の鎖の第二の部分に相補的であり、前記第二のプライマーの第一の領域は、前記第一の鎖の第三の部分に相補的であり、及び前記第二のプライマーの第一の領域は、前記第一のプライマーの第一の領域に相補的である。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、以下のものを含む 反応混合物中
である： ポリヌクレオチドのテンプレート、 第一のプライマー、及び第二のプライマーであって： 前記ポリヌクレオチドのテンプレートは、第一の部分、 第二の部分及び第三の部分を含み、前記第三の部分は、前記ポリヌクレオチドのテンプレート中で前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置し； 前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、 前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり； 前記第二のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、 前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は〜前記ポリヌクレオチドのテンプレートのテンプレートの第二の部分に相補的な配列に相補的であり； 前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び前記第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分に相補的である。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、ポリヌクレオチドのテンプレートの増幅のためのキットであり、前記キットは以下のものを含む：第一のプライマー及び第二のプライマーであって：前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり；前記第二のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分に相補的な配列に相補的であり；前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び前記第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分に相補的であり、前記第三の部分は、前記ポリヌクレオチドのテンプレート中で前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置する。
随意的に、本明細書において提供されるキットを含む実施形態では、前記キットの成分は少なくとも２つの別個の流体的に分離された容器の間に分配され得る。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、２つ以上の流体的に分離された容器を含むキットであり、前記容器は、集合的に以下のものを含む：第一のプライマー、第二のプライマー、第三のプライマー、及び第四のプライマーであって：前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり；前記第二のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分に相補的な配列に相補的であり；前記第三のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり；前記第四のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分に相補的な配列に相補的であり；前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；前記第三のプライマーの第一の領域は、前記第四のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び前記第一のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列は、前記第三のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列とは、単一のヌクレオチドの分だけ異なる。随意的に、前記第二のプライマーの第一の領域及び前記第四のプライマーの第一の領域の両方は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分に相補的であり、前記第三の部分は、前記ポリヌクレオチドのテンプレート中で前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置する。随意的に、前記第一のプライマー、第二のプライマー、第三のプライマー、及び第四のプライマーのそれぞれの第二の領域は、長さにおいて６〜３０個の間のヌクレオチドである。随意的に、前記第一のプライマー、第二のプライマー、第三のプライマー、及び第四のプライマーのそれぞれの第二の領域は、長さにおいて６〜３０個のヌクレオチドである（重複）。
本明細書において提供される、キットを含む実施形態では、前記キットは、前記キットの試薬により検出されるべきポリヌクレオチドのテンプレートのヌクレオチド配列を含む対照核酸鎖を含み得る。
本明細書において提供される方法及び組成物において、随意的に、ＰＮＡプローブ及び染料ＤｉＳｃ２（５）が導入され得る。前記ＰＮＡプローブは、関連する反応における増幅のために、標的配列に特異的にアニールでき、及びＤＮＡ−ＰＮＡ二本鎖等の。それらのコピーが形成される。本明細書において提供される方法は、染料がＤＮＡ−ＰＮＡ二本鎖に結合した際の、染料ＤｉＳｃ２（５）の色の変化を検出することを含むことができる。実施形態では、ＰＮＡプローブ及び染料が、反応の開始後、又は反応の完結後に、本明細書において提供される反応混合物に加えられることができる。実施形態では、ＰＮＡプローブ及び染料が、本明細書において提供される反応混合物に、反応の開始から、少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００分後に加えられ得る。実施形態では、ＰＮＡプローブ及び染料が、本明細書において提供される反応混合物に、反応の開始から、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００分未満に加えられることができる。
ポリヌクレオチド・テンプレート又は核酸テンプレートのコピー又は増幅を生成するための、本明細書における言及は、文脈が他の物を明確に指示しない限り、前記ポリヌクレオチド・テンプレート／核酸テンプレートの配列を含むコピーを生成することを含むと同時に、前記ポリヌクレオチド・テンプレート／核酸テンプレートの類似の配列を含むコピーを生成することを含む。例えば、ポリヌクレオチド・テンプレートがＲＮＡである場合、前記テンプレートのコピーを生成することは、前記ポリヌクレオチド・テンプレートのＲＮＡ配列のＤＮＡ版を含むＤＮＡ分子である、コピーを生成することを含み得る（即ち、このＤＮＡ配列は、Ｕの代わりにＴを含む）。
図面においては、
図１は本明細書において提供される方法の一般的な概要であり；パネル１Ａ〜１Ｋは、前記方法のステップ又は特徴を図示する。図１は以下のヌクレオチド配列を含む：１０３：ＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；１０４：ＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；１０５：ＡＴＧＧＧＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；１０６：ＣＣＡＴＡＡＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）；１１１：ＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；１１２：ＣＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）；１１３：ＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；１２１：ＣＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）；１２２：ＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）。 図１は本明細書において提供される方法の一般的な概要であり；パネル１Ａ〜１Ｋは、前記方法のステップ又は特徴を図示する。図１は以下のヌクレオチド配列を含む：１０３：ＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；１０４：ＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；１０５：ＡＴＧＧＧＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；１０６：ＣＣＡＴＡＡＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）；１１１：ＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；１１２：ＣＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）；１１３：ＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；１２１：ＣＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）；１２２：ＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）。 図１は本明細書において提供される方法の一般的な概要であり；パネル１Ａ〜１Ｋは、前記方法のステップ又は特徴を図示する。図１は以下のヌクレオチド配列を含む：１０３：ＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；１０４：ＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；１０５：ＡＴＧＧＧＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；１０６：ＣＣＡＴＡＡＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）；１１１：ＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；１１２：ＣＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）；１１３：ＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；１２１：ＣＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）；１２２：ＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）。 図１は本明細書において提供される方法の一般的な概要であり；パネル１Ａ〜１Ｋは、前記方法のステップ又は特徴を図示する。図１は以下のヌクレオチド配列を含む：１０３：ＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；１０４：ＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；１０５：ＡＴＧＧＧＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；１０６：ＣＣＡＴＡＡＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）；１１１：ＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；１１２：ＣＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）；１１３：ＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；１２１：ＣＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）；１２２：ＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）。 図１は本明細書において提供される方法の一般的な概要であり；パネル１Ａ〜１Ｋは、前記方法のステップ又は特徴を図示する。図１は以下のヌクレオチド配列を含む：１０３：ＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；１０４：ＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；１０５：ＡＴＧＧＧＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；１０６：ＣＣＡＴＡＡＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）；１１１：ＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；１１２：ＣＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）；１１３：ＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；１２１：ＣＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）；１２２：ＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）。 図１は本明細書において提供される方法の一般的な概要であり；パネル１Ａ〜１Ｋは、前記方法のステップ又は特徴を図示する。図１は以下のヌクレオチド配列を含む：１０３：ＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；１０４：ＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；１０５：ＡＴＧＧＧＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；１０６：ＣＣＡＴＡＡＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）；１１１：ＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；１１２：ＣＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）；１１３：ＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；１２１：ＣＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）；１２２：ＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴＡＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）。
図２Ａは、本明細書において提供される方法により用いられる、特定のプライマーの、ヌクレオチド配列を示す。図２Ａは、以下のヌクレオチド配列を含む：Ｐ１プライマー、３７ヌクレオチド：ＣＧＣＣＧＧＡＴＧＧＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＣＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）；Ｐ１プライマー、３５ヌクレオチド：ＣＣＧＧＡＴＧＧＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＣＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；Ｐ１プライマー、３３ヌクレオチド：ＧＧＡＴＧＧＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＣＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）；Ｐ１プライマー、３１ヌクレオチド：ＡＴＧＧＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＣＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）；Ｐ１プライマー、３０ヌクレオチド：ＴＧＧＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＣＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）；Ｐ１プライマー、２９ヌクレオチド：ＧＧＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＣＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）；Ｐ１プライマー、２８ヌクレオチド：ＧＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＣＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）；Ｐ１プライマー、２７ヌクレオチド：ＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＣＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）；Ｐ１プライマー、２６ヌクレオチド：ＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＣＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）；Ｐ１プライマー、２５ヌクレオチド：ＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＣＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）；Ｐ１プライマー、２４ヌクレオチド：ＴＴＧＧＧＡＡＡＣＣＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）；Ｐ１プライマー、２３ヌクレオチド：ＴＧＧＧＡＡＡＣＣＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）；Ｐ２プライマー、３６ヌクレオチド：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＴＣＣＧＧＣＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）；Ｐ２プライマー、３４ヌクレオチド：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＴＣＣＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）；Ｐ２プライマー、３２ヌクレオチド：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＴＣＣＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）；Ｐ２プライマー、３０ヌクレオチド：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＴＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）；Ｐ２プライマー、２９ヌクレオチド：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）；Ｐ２プライマー、２８ヌクレオチド：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）；Ｐ２プライマー、２７ヌクレオチド：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＣＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）；Ｐ２プライマー、２６ヌクレオチド：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）；Ｐ２プライマー、２５ヌクレオチド：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）；Ｐ２プライマー、２４ヌクレオチド：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）；Ｐ２プライマー、２３ヌクレオチド：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）；及びＰ２プライマー、２２ヌクレオチド：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）。
図２Ｂは、本明細書において提供される方法に従い遂行された反応からの結果を図示するグラフである。
図３Ａ及び３Ｂは、本明細書において提供される方法により用いられる特定のプライマーのヌクレオチド配列を示す。図３Ａは以下のヌクレオチド配列を含む：Ｃ５：ＡＴＧＧＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）；Ｄ５：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）；Ｃ６：ＧＧＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）；Ｄ６：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）；Ｃ７：ＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）；Ｄ７：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）；Ｃ８：ＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）；Ｄ８：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）；Ｃ９：ＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）；Ｄ９：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）；Ｃ１０：ＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）；Ｄ１０：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）；Ｃ１１：ＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）；Ｄ１１：ＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）；Ｃ１２：ＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）；及びＤ１２：ＧＴＴＴＣＣＣＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）。図３Ｂは、以下のヌクレオチド配列を含む：Ａ１：ＡＴＧＧＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）；Ｂ１：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＴＡＣＡＧＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）；Ａ２：ＧＧＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）；Ｂ２：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）；Ａ３：ＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）；Ｂ３：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）；Ａ４：ＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）；Ｂ４：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）；Ａ５：ＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）；Ｂ５：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＣＡＧＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）；Ａ６：ＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）；Ｂ６：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＡＣＡＧＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）；Ａ７：ＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）；Ｂ７：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）；Ａ８：ＧＧＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）；及びＢ８：ＧＴＴＴＣＣＣＡＣＡＧＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５）。 図３Ａ及び３Ｂは、本明細書において提供される方法により用いられる特定のプライマーのヌクレオチド配列を示す。図３Ａは以下のヌクレオチド配列を含む：Ｃ５：ＡＴＧＧＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）；Ｄ５：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）；Ｃ６：ＧＧＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）；Ｄ６：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）；Ｃ７：ＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）；Ｄ７：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）；Ｃ８：ＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）；Ｄ８：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）；Ｃ９：ＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）；Ｄ９：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）；Ｃ１０：ＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）；Ｄ１０：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）；Ｃ１１：ＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）；Ｄ１１：ＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）；Ｃ１２：ＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）；及びＤ１２：ＧＴＴＴＣＣＣＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）。図３Ｂは、以下のヌクレオチド配列を含む：Ａ１：ＡＴＧＧＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）；Ｂ１：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＴＡＣＡＧＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）；Ａ２：ＧＧＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）；Ｂ２：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）；Ａ３：ＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）；Ｂ３：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）；Ａ４：ＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）；Ｂ４：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）；Ａ５：ＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）；Ｂ５：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＣＡＧＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）；Ａ６：ＴＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）；Ｂ６：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＡＣＡＧＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）；Ａ７：ＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）；Ｂ７：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）；Ａ８：ＧＧＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）；及びＢ８：ＧＴＴＴＣＣＣＡＣＡＧＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５）。
図３Ｃ及び３Ｄは、本明細書において提供される方法に従って遂行される反応からの結果を図示するグラフである。
図４は、本明細書において提供される方法に従って遂行される反応からの結果を図示するグラフである。
図５は、本明細書において提供される方法に従って遂行される反応からの結果を図示するグラフである。
図６は、本明細書において提供される方法に従って遂行される反応からの結果を図示するグラフである。
図７は、本明細書において提供される方法に従い遂行された反応において、生成された生成物のヌクレオチド配列の配列の整列を示す。図７は、以下のヌクレオチド配列を含む（整列のトップ配列から、この整列のボトム配列までの順で）： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６：ＴＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＡＣＡＴＴＴＧＴＡＣＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＡＡＡＴＴＣＴＴＧＡＧＡ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７：ＴＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＡＣＡＴＴＴＧＴＡＣＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＡＡＡＴＴＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＡＣＡＴＴＴ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８：ＴＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＡＣＡＴＴＴＧＴＡＣＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＡＡＡＴＴＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＡＣＡＴＴＴ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９：ＴＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＡＣＡＴＴＴＧＴＡＣＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＡＡＡＴＴＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＡＣＡＴＴＴ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０：ＴＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＡＣＡＴＴＴＧＴＡＣＴＧＡＡＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＡＡＡＴＴＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＡＣＡＴＴＴ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１：ＴＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＡＣＡＴＴＴＧＴＡＣＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＡＡＡＴＴＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＡＣＡＴＴＴ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２：ＴＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＡＣＡＴＴＴＧＴＡＣＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＡＡＡＴＴＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＡＣＡＴＴＴ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３：ＴＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＡＣＡＴＴＴＧＴＡＣＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＡＡＡＴＴＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＡＣＡＴＴＴ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４：ＴＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＡＣＡＴＴＴＧＴＡＣＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＡＡＡＴＴＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＡＣＡＴＴＴ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５：ＴＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＡＣＡＴＴＴＧＴＡＣＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＡＡＴＴＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＡＣＡＴＴＴ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６：ＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＡＣＡＴＴＴＧＴＡＣＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＡＡＡＴＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡＴＡＣＡＴＴＴ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７：ＴＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣＴＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣ；及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８：ＧＧＡＡＧＡＣＣＡＡＡＴＴＣＴＴＧＡＧＡ。
図８Ａ〜Ｃは、本明細書において提供される分子の実施形態の特徴の一般的な模式図である。 図８Ａ〜Ｃは、本明細書において提供される分子の実施形態の特徴の一般的な模式図である。
図９は、本明細書において提供される分子の実施形態の特徴の一般的な模式図である。
図１０Ａ〜１０Ｃは、本明細書において提供される分子の実施形態の特徴の一般的な模式図である。 図１０Ａ〜１０Ｃは、本明細書において提供される分子の実施形態の特徴の一般的な模式図である。
図１１は、本明細書において提供される方法に従って遂行された反応からの結果を図示するグラフである。
図１２は、本明細書において提供される方法に従って遂行された反応からの結果を図示するグラフである。
図面及びその中の要素は、必ずしも形状又は尺度を、描かれる必要が無いことに注意されたい。例えば、図の要素の形状又は尺度は、表示の容易さ又は明瞭さのために単純化されるか、又は修飾され得ることに注意されたい。図面及びその中の要素は、例示的な、説明の目的のためだけの物であり、及びいかなる方法によっても、制限するものと解釈されるべきでないことを更に理解されたい。
［発明の詳細な説明］
本発明は、様々な修正、及び代替的な形態を含むが、その特定の実施形態は、図面において例として示され、並びに本明細書において詳細に記載される。しかしながら、本発明を開示された特定の形態に限定する意図はなく、それどころか、本発明は、特許請求の範囲により定義される、本発明の趣旨、及び範囲に該当する、全ての修正、等価物、及び代替物を包含すべきものであることを理解されたい。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
ポリヌクレオチド・テンプレートをコピーする方法であり、前記方法は以下を含む方法：第一のプライマー及び第二のプライマーを含む反応混合物で、前記ポリヌクレオチド・テンプレートをインキュベートすることであって：
前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一のプライマー
の第二の領域は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートの第一の部分に相補的な配列を含み；
前記第二のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第二のプライマー
の第二の領域は、パートナーのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記パートナーのヌクレオチド配列は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートの第二の部分に相補的であり；及び
前記ポリヌクレオチド・テンプレートの前記第一のプライマー及び第二のプライマ
ーとのインキュベーションの差異に、少なくとも１つのコンカテマー鎖が形成され、前記コンカテマー鎖は５’末端及び３’末端を含み、及び５’から３’方向の中に一般構造：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’を有するヌクレオチド配列を含み：Ｃ’は前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Ｔは、前記ポリヌクレオチド・テンプレート又はその類似の配列のヌクレオチド配列を表し、及びＸはヌクレオチドの任意の数及び配列を表す。
（項目２）
前記コンカテマー鎖が第一のコンカテマー鎖であり、及び前記ポリヌクレオチド・テンプレートの前記第一のプライマー及び第二のプライマーとのインキュベーションすると、第二のコンカテマー鎖も形成され、前記第二のコンカテマー鎖は、５’末端及び３’末端を含み、及び５’から３’方向の中に一般構造：Ｃ−Ｘ’−Ｔ’−Ｃ−Ｔ’−Ｃを有する、ヌクレオチド配列を含み：Ｃは、前記第一のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Ｔ’は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートに相補的なヌクレオチド配列を表し、及びＸ’は、前記Ｘのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を表す、項目１に記載の方法。
（項目３）
Ｘが、５’から３’方向の中に一般構造[（Ｃ’−Ｔ）Ｎ]を有する配列を含み、Ｃ’は、前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Ｔは、前記ポリヌクレオチド・テンプレート又はその類似の配列のヌクレオチド配列を表し、及びＮは０及〜１０００の間の整数である、項目１に記載の方法。
（項目４）
Ｘが０個のヌクレオチドを表す、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記反応混合物が、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを更に含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記反応混合物が、更に逆転写酵素を含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記ポリヌクレオチド・テンプレートがＲＮＡ分子である、項目１に記載の方法。
（項目８）
Ｔが、前記ポリヌクレオチド・テンプレートのＲＮＡ配列に類似のＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を表す、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ポリヌクレオチド・テンプレートが、二本鎖の核酸テンプレートの一本の鎖を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記反応混合物のインキュベーションの間に、前記反応混合物の温度が、８０Ｃを超えない項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記第一のプライマーの第一の領域が４〜２５のヌクレオチドを含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記第一のプライマーの第一の領域及び前記第二のプライマーの第一の領域が、同じ数のヌクレオチドを含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記ポリヌクレオチド・テンプレートが、１０〜１０００のヌクレオチドを含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記反応混合物が更に核酸染料を含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記反応混合物中の、前記ポリヌクレオチド・テンプレートのコピー数が、前記方法の開始から６０分以内に、少なくとも１０倍増大される、項目１に記載の方法。
（項目１６）
生物学的サンプル中の標的のポリヌクレオチド・テンプレートの検定のための方法であって、前記方法は以下を含む方法：
Ａ）前記生物学的サンプル又はその一部分を、第一のプライマー及び第二のプライマーを含む反応混合物中でインキュベートすることであって：
前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域、前記第一のプライマーの第二の領域は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートの第一の部分に相補的なヌクレオチド配列を含み；
前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第二のプライマーの第二の領域は、パートナーのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記パートナーのヌクレオチド配列は、前記ポリヌクレオチド・テンプレート第二の部分に相補的であり；及び
前記ポリヌクレオチド・テンプレートの前記第一のプライマー及び第二のプライマーとのインキュベーションすると、少なくとも１つのコンカテマー鎖が形成され、前記コンカテマー鎖は、５’末端及び３’末端を含み、及び５’から３’方向の中に一般構造：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’を有する、ヌクレオチド配列を含み：Ｃ’は、前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Ｔは、前記ポリヌクレオチド・テンプレート又はその類似の配列のヌクレオチド配列を表し、及びＸはヌクレオチドの任意の数及び配列を表し；及び
Ｂ）Ａ）の前記反応混合物の増幅された核酸を、Ａ）のステップのインキュベーションの開始後の、１つ以上の点において測定すること。
（項目１７）
前記反応混合物中の増幅された核酸の量を測定することが、前記反応混合物中の蛍光のレベルを定量することを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記反応混合物の核酸増幅の変曲時間を決定することを更に含む、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記生物学的サンプル又はその一部分が、ヒトからのものである、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
二本鎖の核酸テンプレートの少なくとも２つのコピーを含むコンカテマーを生成する方法であって、前記方法は、以下を含む方法：
反応混合物中で、少なくとも第一のテンプレート分子及び第二のテンプレート分子をインキュベートすることであって：
前記第一のテンプレート分子は、第一の核酸鎖及び第二の核酸鎖を含み：
前記第一のテンプレート分子の第一の核酸鎖は、５’から３’方向の中に一般構造：Ｈ’−Ｓ−Ｙ１−Ｈ’を有するヌクレオチド配列を含み：Ｈ’は、第一の相同配列のヌクレオチド配列を表し、Ｓは、前記二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖のヌクレオチド配列を表し、及びＹ１はヌクレオチドの任意の数及び配列を表し；及び
前記第一のテンプレート分子の第二の核酸鎖は、５’から３’方向の中に一般構造：Ｈ−Ｙ１’−Ｓ’−Ｈを有するヌクレオチド配列を含み：Ｈは、第二の相同配列のヌクレオチド配列を表し、前記第一の相同配列及び第二の相同配列は互いに相補的であり、Ｙ１’は前記Ｙ１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を表し、及びＳ’は、前記二本鎖の核酸テンプレートの第二の鎖のヌクレオチド配列を表し、前記二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖及び第二の鎖は互いに相補的であり；及び
第二のテンプレート分子は第一の核酸鎖及び第二の核酸鎖を含み：
前記第二のテンプレート分子の第一の核酸鎖は、５’から３’方向の中に一般構造：Ｈ’−Ｓ−Ｙ２−Ｈ’を有するヌクレオチド配列を含み：Ｈ’は、前記第一の相同配列ヌクレオチド配列を表し、Ｓは、前記二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖のヌクレオチド配列を表し、及びＹ２は、ヌクレオチドの任意の数及び配列を表し；及び
前記第一のテンプレート分子の第二の核酸鎖は、５’から３’方向の中に一般構造：Ｈ−Ｙ２’−Ｓ’−Ｈを有する、ヌクレオチド配列を含み、：Ｈは、前記第二の相同配列のヌクレオチド配列を表し、Ｙ２’は、Ｙ２のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を表し、及びＳ’は、前記二本鎖の核酸テンプレート第二の鎖のヌクレオチド配列を表し；及び
前記第一のテンプレート分子と第二のテンプレート分子の前記反応混合物中でのインキュベーションすると、前記二本鎖の核酸テンプレートの少なくとも２つのコピーを含む少なくとも１つのコンカテマーが生成され、前記コンカテマーは、第一のコンカテマー鎖及び第二のコンカテマー鎖を含み、前記第一のコンカテマー鎖は、５’末端及び３’末端を含み、及び５’から３’方向の中に一般構造：Ｈ’−Ｓ−Ｙ２−Ｈ’−Ｓ−Ｙ１−Ｈ’を有するヌクレオチド配列を含み、Ｈ’、Ｙ１、Ｓ、及びＹ２のそれぞれは、上述のヌクレオチド配列を表し；及び第二のコンカテマー鎖は、５’末端及び３’末端を含み、及び５’から３’方向の中に一般構造：Ｈ−Ｙ１’−Ｓ’−Ｈ−Ｙ２’−Ｓ’−Ｈを有する配列を含み、Ｈ’、Ｙ１、Ｓ、及びＹ２のそれぞれは、上述のヌクレオチド配列を表す。
（項目２１）
Ｙ１及びＹ２の内の少なくとも１つが、０ヌクレオチドを表す項目２０に記載の方法。
（項目２２）
Ｙ１及びＹ２の両方が０ヌクレオチドを表す項目２０に記載の方法。
（項目２３）
Ｙ１が５’から３’方向の中に一般構造[（Ｈ’−Ｓ）Ｎ１]を有する配列を含み、Ｈ’は第一の相同配列のヌクレオチド配列を表し、Ｓは、前記二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖のヌクレオチド配列を表し、及びＮ１は、０〜２０００の間の任意の整数である、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
Ｙ１は、５’から３’方向の中に一般構造[（Ｈ’−Ｓ）Ｎ１]を有する配列を含み、Ｈ’は、第一の相同配列のヌクレオチド配列を表し、Ｓは、前記二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖のヌクレオチド配列を表し、及びＮ１は、０〜２０００の間の任意の整数であり、及びＹ２がは、５’から３’方向の中に一般構造[（Ｈ’−Ｓ）Ｎ２]を有する配列を含み、Ｈ’は、第一の相同配列のヌクレオチド配列を表し、Ｓは、前記二本鎖の核酸テンプレート第一の鎖ヌクレオチド配列を表し、及びＮ２は０〜２０００の間の任意の整数である、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
Ｎ１及びＮ２が異なる整数である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
Ｎ１が０であり、及びＮ２が、１〜２０００の間の整数である、項目２５に記載の方法。（項目２７）
前記第一のテンプレート分子及び第二のテンプレート分子の両方が二本鎖のＤＮＡ分子である項目２０に記載の方法。
（項目２８）
前記第一の相同配列が４〜２５のヌクレオチドを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２９）
二本鎖の核酸テンプレートの２つ以上のコピーを含むコンカテマーを生成する方法であって、前記方法は以下を含む方法：
（Ａ）二本鎖の核酸テンプレートを含む、一次二本鎖の核酸を、第一のプライマーの第一のコピー及びポリメラーゼにより、前記二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖にアニールされた、前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物が合成される条件で処理することであって、
前記第一のプライマーは５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含み：
（ｉ）以下を含むテール領域
（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、
前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり
（ｃ）前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部の
ヌクレオチドの間の、１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
（ｉｉ）以下を含むテンプレート結合領域
（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記３
’末端ヌクレオチドから上流にあり
（ｃ）前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部の
ヌクレオチドの間の、１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
前記第一のプライマーの第一のコピーのテンプレート結合領域は、
前記二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖にアニールし、
（Ｂ）ステップ（Ａ）の前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物を、ステップ（Ａ）前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物によりアニールされた、前記第二のプライマーの伸長された生成物が合成される条件下で、第二のプライマー及びポリメラーゼにより処理することであって、
前記第二のプライマーは、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含み：
（ｉ）以下を含むテール領域
（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり
（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び
（ｉｉ）以下を含むテンプレート結合領域
（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記３
’末端ヌクレオチドから上流にあり
（ｃ）前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の、１つ以
上のヌクレオチドを含む中間部分、
前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、
前記第二のプライマーのテンプレート結合領域は、ステップ（Ａ）の前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物にアニールし、及び
前記第二のプライマーの伸長された生成物は、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び前記３’末端ヌクレオチドを含む３’末端領域を含み、前記３’末端領域は、５’から３’方向に読んだ場合の前記第二のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を含み、及び前記３’末端領域の最終的なヌクレオチドは、ｏｆ第二のプライマーの伸長された生成物の前記３’末端ヌクレオチドであり、
（Ｃ）ステップ（Ｂ）の前記第二のプライマーの伸長された生成物及び前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物を含む二次核酸第一のコピーを生成するために、ステップ（Ｂ）の前記第二のプライマーの伸長された生成物を、ステップ（Ｂ）前記第二のプライマーの伸長された生成物にアニールされた、前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物が、合成される条件下で前記第一のプライマーの第二のコピー及びポリメラーゼで処理することであって、
前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物は、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び前記３’末端ヌクレオチドを含む３’末端領域を含み、前記３’末端領域は、５’から３’方向に読んだ場合の前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を含み、及び前記３’末端領域の最終的なヌクレオチドは、第二のプライマーの伸長された生成物前記３’末端のヌクレオチドであり、
（Ｄ）ステップ（Ｃ）の前記二次核酸の少なくとも第二のコピーを生成するために、少なくともステップ（Ｃ）を１つ以上の追加的な回数繰り返すこと、
（Ｅ）前記二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物、及び前記二次核酸の第二のコピー第二のプライマーの伸長された生成物を含むクロスオーバー構造を生成するために、ステップ（Ｃ）の前記二次核酸の第一のコピー及びステップ（Ｄ）の前記二次核酸の第二のコピーを、前記二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物の３’末端領域が、前記二次核酸の第二のコピーの、第二のプライマーの伸長された生成物３’末端領域にアニールする条件下で処理すること、
（Ｆ）ステップ（Ａ）の前記二本鎖の核酸テンプレートの２つのコピーを含むコンカテマーを生成するために、ステップ（Ｅ）の前記クロスオーバー構造を、前記二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物の伸長された生成物が合成され、及び前記二次核酸の第二のコピーの、第二のプライマーの、伸長された生成物の、伸長された生成物が合成される条件下で、ポリメラーゼにより処理することであって、前記コンカテマーは、前記二次核酸の、第一のコピーの、第一のプライマーの、第二のコピーの、伸長された生成物の、伸長された生成物、及び前記二次核酸の、第二のコピーの、第二のプライマーの、伸長された生成物の、伸長された生成物を含む。
（項目３０）
ステップ（Ａ）の前記核酸ポリメラーゼが、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼである、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記方法の全てのステップが、８０Ｃ未満の温度で行われる、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記ステップの２つ以上が同時に生じる、項目２９に記載の方法。
（項目３３）
ポリヌクレオチド・テンプレート又はその類似の配列のを含むコンカテマーを生成するための方法であって、前記方法は以下を含む方法：
（Ａ）前記ポリヌクレオチド・テンプレートを含む一次核酸を、前記ポリヌクレオチド・テンプレートにアニールされた前記第一のプライマーの第一のコピーの合成された伸長された生成物が合成される条件下で第一のプライマーの第一のコピー及びポリメラーゼにより処理することであって、
前記第一のプライマーは５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域：
（ｉ）以下を含むテール領域
（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり、
（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、ａｎｄ
（ｉｉ）以下を含むテンプレート結合領域
（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記３
’末端ヌクレオチドから上流にあり
（ｃ）前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチド、１つ以上のヌ
クレオチドを含む中間部分、及び前記第一のプライマーの第一のコピーのテンプレート結合領域は前記ポリヌクレオチド・テンプレートにアニールし、
（Ｂ）ステップ（Ａ）の前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物を、ステップ（Ａ）前記第一のプライマーの第一のコピー伸長された生成物にアニールした前記第二のプライマーの伸長された生成物が、合成される条件下で第二のプライマー及びポリメラーゼと処理することであって、
前記第二のプライマーは、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含み：
（ｉ）以下を含むテール領域
（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり
（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分
（ｉｉ）以下を含むテンプレート結合領域
（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記３
’末端ヌクレオチドから上流にあり
（ｃ）前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の、１つ以
上のヌクレオチドを含む中間部分、
前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーテール領域ヌクレオチド配列相補的なヌクレオチド配列を含み、
前記第二のプライマーのテンプレート結合領域は、ステップ（Ａ）の前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物にアニールし、及び
前記第二のプライマーの伸長された生成物は、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び前記３’末端ヌクレオチドを含む３’末端領域を含み、前記３’末端領域は、５’から３’方向に読んだ場合の前記第二のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を含み、及び前記３’末端領域の最終的なヌクレオチドは、前記第二のプライマーの伸長された生成物の３’末端ヌクレオチドであり、
（Ｃ）ステップ（Ｂ）の前記第二のプライマーの伸長された生成物、及び前記第一のプライマーの第二のコピー伸長された生成物を含む、二次核酸の第一のコピーを生成するために、ステップ（Ｂ）前記第二のプライマー伸長された生成物を、ステップ（Ｂ）前記第二のプライマー伸長された生成物にアニールした前記第一のプライマーの第二のコピー伸長された生成物が合成される条件下で、前記第一のプライマーの第二のコピー及びポリメラーゼと処理することであって、
前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物は、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び前記３’末端ヌクレオチドを含む３’末端領域を含み、前記３’末端領域は、５’から３’方向に読んだ場合の前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を含み、及び前記３’末端領域の最終的なヌクレオチドは、第二のプライマーの伸長された生成物の３’末端ヌクレオチドであり、
（Ｄ）ステップ（Ｂ）の前記第二のプライマーの伸長された生成物及びステップ（Ｃ）の前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物を含む前記二次核酸の少なくとも第二のコピーを生成するために、少なくともステップ（Ｃ）を１つ以上の追加回数繰り返すこと、
（Ｅ）前記二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物、及び前記二次核酸の第二のコピーの第二のプライマーの伸長された生成物を含むクロスオーバー構造を生成するために、ステップ（Ｃ）の前記二次核酸の第一のコピー及びステップ（Ｄ）の前記二次核酸の第二のコピーを、前記二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物の３’末端領域が、前記二次核酸第二のコピー第二のプライマー、伸長された生成物３’末端領域とアニールする条件下で勝利すること、
（Ｆ）ステップ（Ａ）の前記ポリヌクレオチド・テンプレートの２つのコピーを含むコンカテマーを生成するために、ステップ（Ｅ）の前記クロスオーバー構造を、前記二次核酸第一のコピー前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物の伸長された生成物が合成され、及び前記二次核酸第二のコピーの第二のプライマーの伸長された生成物の伸長された生成物が合成される条件下で、ポリメラーゼと処理することであって、前記コンカテマーは、前記二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの、第二のコピーの伸長された生成物伸長された生成物、及び前記二次核酸の第二のコピーの第二のプライマーの伸長された生成物の伸長された生成物を含む。
（項目３４）
ステップ（Ａ）前記核酸ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
ステップ（Ａ）の前記核酸ポリメラーゼが、逆転写酵素である、項目３３に記載の方法。（項目３６）
前記方法の全てのステップが８０Ｃ未満の温度で遂行される、項目３３に記載の方法。
（項目３７）
前記方ステップの２つ以上が同時に生じる、項目３３に記載の方法。
（項目３８）
二本鎖の核酸テンプレートの２つ以上のコピーを含むコンカテマーを生成する方法であって、前記方法は以下を含む方法：
（Ａ）以下を含む反応混合物を調製すること：
（ｉ）前記二本鎖の核酸テンプレートを含む一次核酸、
（ｉｉ）単離された核酸ポリメラーゼ、
（ｉｉｉ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含む第一のプライマー：
（ａ）以下を含むテール領域
（１）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド
（２）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり、
（３）前記５’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドとの間のヌクレオチドを１つ以上含む中間部分、及び
（ｂ）以下を含むテンプレート結合領域
（１）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド
（２）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり、
（３）前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の、１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、
前記テンプレート結合領域は、前記核酸テンプレートの第一の鎖に相補的で
あり、
（ｉｖ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含む第二のプライマー：
（ａ）以下を含むテール領域
（１）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド
（２）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり、
（３）前記５’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドとの間のヌクレオチドを１つ以上含む中間部分、及び
（ｂ）以下を含むテンプレート結合領域
（１）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド
（２）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり、
（３）前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の、１つ以
上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
前記テンプレート結合領域は、前記核酸テンプレート第二の鎖に相補的であり、及び
前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含み、及び
（Ｂ）前記反応混合物を、少なくとも３分間、８０Ｃ未満の温度でインキュベートすること。
（項目３９）
ポリヌクレオチド・テンプレート２つ以上のコピーを含むコンカテマーを生成する方法であって、前記方法は以下を含む方法：
（Ａ）以下を含む反応混合物を調製すること：
（ｉ）前記ポリヌクレオチド・テンプレートを含む核酸
（ｉｉ）単離された核酸ポリメラーゼ、
（ｉｉｉ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含む第一のプライマー：
（ａ）以下を含むテール領域
（１）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド
（２）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり
（３）前記５’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の、１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
（ｂ）以下を含むテンプレート結合領域
（１）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド
（２）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記３
’末端ヌクレオチドから上流にあり、
（３）前記３’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の、１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
前記テンプレート結合領域は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートに相補
的であり、
（ｉｖ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含む第二のプライマー：
（ａ）以下を含むテール領域
（１）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド
（２）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり
（３）前記５’末端ヌクレオチド及び前記
最も内、及び
（ｂ）以下を含むテンプレート結合領域
（１）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド
（２）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記３
’末端ヌクレオチドから上流にあり
（３）前記３’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
前記テンプレート結合領域は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートに相補的なヌクレオチド配列に相補的であり、及び
前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、及び
（Ｂ）前記反応混合物を、少なくとも３分間、８０Ｃ未満の温度でインキュベートすること。
（項目４０）
前記二本鎖の核酸テンプレート又はポリヌクレオチド・テンプレートが、前記方法の開始から６０分以内で少なくとも１０倍に増幅される、項目２９〜３９のいずれか１つに記載の方法。
（項目４１）
前記第一のプライマーのテール領域が、４〜２５のヌクレオチドを含む、項目２９〜３９のいずれか１つに記載の方法。
（項目４２）
その中の流体連通に以下を含む容器：
第一のプライマーであって、前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、並びに前記第一のプライマーの第二の領域は、ポリヌクレオチド・テンプレートの第一の部分に相補的なヌクレオチド配列を含み；
第二のプライマーであって、前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域
を含み、並びに前記第二のプライマーの第二の領域は、パートナーのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記パートナーのヌクレオチド配列は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートの第二の部分に相補的であり；及び
少なくとも１つのコンカテマー鎖であって、前記コンカテマー鎖５’末端及び３’末端を含み、及び５’から３’方向の中に一般構造：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’を有するヌクレオチド配列を含み：Ｃ’は、前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Ｔｒは、前記ポリヌクレオチド・テンプレート又はその類似の配列のヌクレオチド配列を表し、及びＸはヌクレオチドの任意の数及び配列を表す。
（項目４３）
前記コンカテマー鎖が第一のコンカテマー鎖であり、及び前記容器が更に第二のコンカテマー鎖を含み、前記第二のコンカテマー鎖は、５’末端及び３’末端を含み、及び５’から３’方向の中に一般構造：Ｃ−Ｘ’−Ｔ’−Ｃ−Ｔ’−Ｃを有するヌクレオチド配列を含み：Ｃは、前記第一のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Ｔ’は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートに相補的なヌクレオチド配列を表し、及びＸ’は前記Ｘのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を表す、項目４２に記載の容器。
（項目４４）
Ｘが、５’から３’方向の中に一般構造[（Ｃ’−Ｔ）Ｎ]を有する配列を含み、Ｃ’は、前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Ｔは、前記ポは０〜１０００の間の任意の整数である、項目４２に記載の容器。
（項目４５）
Ｘが０個のヌクレオチドを表す、項目４２に記載の容器。
（項目４６）
その中の流体連通の中に以下を含む容器：
（Ａ）単離された核酸ポリメラーゼ、
（Ｂ）少なくとも第一の鎖を含む核酸テンプレート、
（Ｃ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含む第一のプライマー：
（ｉ）以下を含むテール領域
（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチド前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり
（ｃ）前記５’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
（ｉｉ）以下を含むテンプレート結合領域
（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記３
’末端ヌクレオチドから上流にあり
（ｃ）３’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、
前記テンプレート結合領域は、前記核酸テンプレートの第一の鎖に相補的で
あり、及び
（Ｄ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含む第二のプライマー：
（ｉ）以下を含むテール領域
（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり
（ｃ）前記５’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
（ｉｉ）以下を含むテンプレート結合領域
（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、３’末
端ヌクレオチドから下流にあり
（ｃ）前記３’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
前記テンプレート結合領域は、前記核酸テンプレート第一の鎖に相補的なヌクレオチド配列に相補的であり、及び
前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。
（項目４７）
前記容器が、鎖置換活性を有するDNＡポリメラーゼを含む、項目４２〜４６のいずれか１つに記載の方法。
（項目４８）
前記容器が更に逆転写酵素を含む、項目４７に記載の容器。
（項目４９）
前記ポリヌクレオチド・テンプレートがＲＮＡ分子である、項目４７に記載の容器。
（項目５０）
前記Ｔが、前記ポリヌクレオチド・テンプレートＲＮＡ配列に類似の、ＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を表す、項目４９に記載の容器。
（項目５１）
前記ポリヌクレオチド・テンプレートが、ＤＮＡ分子である、項目４２に記載の容器。
（項目５２）
前記ポリヌクレオチド・テンプレートが、二本鎖の核酸テンプレートの１つの鎖を含む、項目５１に記載の容器。
（項目５３）
前記第一のプライマーの第一の領域が４〜２５のヌクレオチドを含む、項目４２に記載の容器。
（項目５４）
前記第一のプライマーの第一の領域及び前記第二のプライマーの第一の領域が、同じ数のヌクレオチドを含む、項目４２に記載の容器。
（項目５５）
前記第一のプライマーのテール領域が４〜２５のヌクレオチドを含む、項目４６に記載の容器。
（項目５６）
前記第一のプライマーのテール領域及び前記第二のプライマーの第一の領域が同じ数のヌクレオチドを含む、項目４６に記載の容器。
（項目５７）
前記容器が更に核酸染料を含む、項目４２〜５６のいずれか１つに記載の容器。
（項目５８）
前記容器が、更にヌクレオチド及び緩衝液を含む、項目４２〜５７のいずれか１つに記載の容器。
（項目５９）
前記容器が、更に被験者からの生物学的サンプルの少なくとも一部分を含む、項目４２〜５８のいずれか１つに記載の容器。
（項目６０）
前記被験者がヒトである、項目５９に記載の容器。
（項目６１）
２つ以上の流体的に分離された容器を含むキットであって、前記コンテナは集合的に以下を含むキット：
第一のプライマーであって、前記第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、及び前記第一のプライマーの第二の領域は、ポリヌクレオチド・テンプレートの第一の部分に相補的なヌクレオチド配列を含み；
第二のプライマーであって、前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域
を含み、及び前記第二のプライマーの第二の領域は、パートナーのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記パートナーのヌクレオチド配列は、前記ポリヌクレオチド・テンプレート第二の部分に相補的であり；及び
単離されたＤＮＡポリメラーゼは鎖置換活性を
有し：
前記第一のプライマーの第一の領域及び前記第二のプライマーの第一の領域は相補
的である。
（項目６２）
少なくとも第一の鎖を含む標的の目的の核酸を検出するためのキットであって、前記キットは２つ以上の流体的に分離された容器を含み、前記コンテナは集合的に以下を含む：
（Ａ）単離された鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、
（Ｂ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含む第一のプライマー：
（ｉ）以下を含むテール領域
（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり
（ｃ）前記５’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
（ｉｉ）以下を含むテンプレート結合領域
（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記３
’末端ヌクレオチドから上流にあり
（ｃ）前記３’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、
前記テンプレート結合領域は、前記標的の核酸の第一の鎖に相補的であり、
及び
（Ｃ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び２つの領域を含む第二のプライマー：
（ｉ）以下を含むテール領域
（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり
（ｃ）前記５’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
（ｉｉ）以下を含むテンプレート結合領域
（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド
（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記３
’末端ヌクレオチドから上流にあり、
（ｃ）前記３’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
前記テンプレート結合領域は、前記標的の核酸の第一の鎖に相補的なヌクレオチド配列に相補的であり、及び前記第二のプライマーのテール領域は前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列の相補的なヌクレオチド配列を含む。
（項目６３）
更に逆転写酵素を含む、項目６１又は６２に記載のキット。
（項目６４）
前記第一のプライマーの第一の領域が、４〜２５のヌクレオチドを含む、項目６１に記載のキット。
（項目６５）
前記第一のプライマーのテール領域が、４〜２５のヌクレオチドを含む、項目６２に記載のキット。
（項目６６）
前記標的の目的の核酸のヌクレオチド配列を含む核酸を更に含む、項目６１〜６５のいずれか１つに記載のキット。
（項目６７）
ポリヌクレオチドのテンプレートをコピーする方法であって、以下を含む方法：
熱サイクリングの無い条件下でポリヌクレオチドのテンプレート、第一のプライマー、及び第二のプライマーを含む反応混合物をインキュベートすることであって：
前記ポリヌクレオチドのテンプレートは、第一の部分及び第二の部分を含み；
前記第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は、プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は、前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の領域に相補的であり；
前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は、前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は、前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分に相補的な配列に相補的であり；
前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び
前記ポリヌクレオチドのテンプレートの複数のコピーが生成される。
（項目６８）
前記ポリヌクレオチドのテンプレートが、第三の部分を更に含み、前記第三の部分は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの中で、前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置し、及び前記第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分に相補的である項目６７の方法。
（項目６９）
ポリヌクレオチドのテンプレートを増幅する方法であって、前記方法は第一のプライマー及び第二のプライマーを含む反応混合物中に前記ポリヌクレオチドのテンプレートをインキュベートすることを含み：
前記ポリヌクレオチドのテンプレートは第一の部分、第二の部分及び第三の部分を
含み、前記第三の部分は前記ポリヌクレオチドのテンプレートの中で前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置し；
前記第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一のプライマーの第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり；及び
前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、記第二のプライマーの第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分に相補的である配列に相補的であり、前記第二のプライマーの第一の領域は、前記第一のプライマーの第一の領域に相補的であり、及び前記第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分に相補的である。
（項目７０）
ポリヌクレオチドのテンプレート中のヌクレオチド配列の中の目的の部分のヌクレオチドの同一性を評価する方法であって、以下を含む方法：
Ａ）少なくとも第一の反応混合物及び第二の反応混合物のそれぞれの中の前記ポリヌクレオチドのテンプレートのコピーを提供することであって：
前記ポリヌクレオチドのテンプレートは第一の部分、第二の部分及び第三の部分を含み、前記第三の部分は、前記ポリヌクレオチドのテンプレート中で前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置し、及び前記目的の部分は、前記第三の部分の中にあり；
前記第一の反応混合物は、前記ポリヌクレオチドのテンプレート、第一のプライマー、及び第二のプライマーのコピーを含み：
前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は、前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は、前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり、
前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分に相補的な配列に相補的であり；
前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び
前記第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分に相補的であり；
前記第二の反応混合物は、前記ポリヌクレオチドのテンプレート、第三のプライマー、及び第四のプライマーのコピーを含み：
前記第三のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は、前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり；
前記第四のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は、前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は、前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分に相補的である配列に相補的であり；
前記第三のプライマーの第一の領域は、前記第四のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び
前記第四のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分に相補的であり；及び
前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列は、前記第四のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列とは、単一のヌクレオチドの分だけ異なり、前記第二及び第四のプライマーにおける異なるヌクレオチドの位置は、前記第二のプライマーの第一の領域又は第四のプライマーのヌクレオチド配列が、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分のヌクレオチド配列に対して、前記配列の最大の相補性により配向している場合には、前記ポリヌクレオチドのテンプレート中の目的のヌクレオチドの位置に対応し；
Ｂ）熱サイクリングの無い条件下で前記第一の反応混合物及び第二の反応混合物をインキュベートすること；及び
Ｃ）前記第一の反応混合物中での前記ポリヌクレオチドのテンプレートの増幅の量又は速度を、前記第二の反応混合物中での前記ポリヌクレオチドのテンプレートの増幅の量又は速度と比較することであって、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの増幅の速度又は量は、前記第二又は第四のプライマーの第一の領域及び前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分のヌクレオチド配列の間の相補性の程度を示す。
（項目７１）
前記ポリヌクレオチドのテンプレートがＤＮＡ鎖である、項目６７〜７０のいずれかに記載の方法。
（項目７２）
前記ポリヌクレオチドのテンプレートが、ＲＮＡ鎖である、項目６７〜７０のいずれかに記載の方法。
（項目７３）
前記ポリヌクレオチドのテンプレートが、二本鎖ＤＮＡ分子の一つの鎖である、項目６７〜７０のいずれかに記載の方法。
（項目７４）
前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分及び第二の部分が、それぞれ長さにおいて６〜３０ヌクレオチドの間である、項目６７〜７３のいずれかに記載の方法。
（項目７５）
前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分が、長さにおいて４〜１４ヌクレオチドの間である、項目６７〜７４のいずれかに記載の方法。
（項目７６）
前記反応混合物中のポリヌクレオチドのテンプレートのコピー数が、前記方法の開始から６０分以内に少なくとも１０倍に増加する、項目６７〜７５のいずれかに記載の方法。
（項目７７）
前記ポリヌクレオチドのテンプレートの少なくとも３つのコピーを含むコンカテマー鎖が、前記反応混合物のインキュベーション中に形成される、項目６７〜７６のいずれかに記載の方法。
（項目７８）
二本鎖の核酸分子を増幅する方法であって、前記方法は第一のプライマー及び第二のプライマーを含む反応混合物中の二本鎖の核酸分子をインキュベートすることを含み：
前記二本鎖の核酸分子は、第一の鎖及び第二の鎖を含み、前記第一の鎖は第一の部
分及び第三の部分を含み、及び前記第二の鎖は第二の部分を含み；
前記第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一のプライマーの第二の領域は、前記第一の鎖の第一の部分に相補的であり；及び
前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第二のプライマーの第二の領域は、前記第二の鎖の第二の部分に相補的であり、前記第二のプライマーの第一の領域は前記第一の鎖の第三の部分に相補的であり、及び前記第二のプライマーの第一の領域は、前記第一のプライマーの第一の領域に相補的である。
（項目７９）
前記反応混合物が、熱サイクリングなしでインキュベートされる、項目６９〜７８のいずれかに記載の方法。
（項目８０）
前記反応混合物が更に核酸染料を含む、項目６７〜７９のいずれかに記載の方法。
（項目８１）
前記反応混合物が、更に逆転写酵素を含む、項目６７〜８０のいずれかに記載の方法。
（項目８２）
以下を含む反応混合物：
ポリヌクレオチドのテンプレート、第一のプライマー、及び第二のプライマーを含
み：
前記ポリヌクレオチドのテンプレートは、第一の部分、第二の部分及び第三の部分を含み、前記第三の部分は、前記ポリヌクレオチドのテンプレート中で前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置し；
前記第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり；
前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートのテンプレートの第二の部分に相補的である配列に相補的であり；
前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び
前記第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分に相補的である。
（項目８３）
前記反応混合物が、更に鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む項目８２の反応混合物。
（項目８４）
前記反応混合物が、更に逆転写酵素を含む、項目８２〜８３のいずれにかの反応混合物。（項目８５）
前記反応混合物が、更に核酸染料を含む、項目８２〜８４のいずれにかの反応混合物。
（項目８６）
前記反応混合物が、更にヌクレオチド及び緩衝液を含む、項目８２〜８５のいずれにかの反応混合物。
（項目８７）
前記ポリヌクレオチドのテンプレーがＤＮＡ鎖である、項目８２〜８６のいずれにかの反応混合物。
（項目８８）
前記ポリヌクレオチドのテンプレートがＲＮＡ鎖である、項目８２〜８７のいずれにかの反応混合物。
（項目８９）
前記ポリヌクレオチドのテンプレートが二本鎖ＤＮＡ分子の一部分である、項目８２〜８８のいずれにかの反応混合物。
（項目９０）
前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分及び第二の部分が、長さにおいて、６〜３０ヌクレオチドの間である、項目８２〜８９のいずれにかの反応混合物。
（項目９１）
前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分が、長さにおいて、４〜１４ヌクレオチドの間である、項目８２〜９０のいずれかの反応混合物。
（項目９２）
ポリヌクレオチドのテンプレートの増幅のためのキットであって、以下を含むキット：
第一のプライマー及び第二のプライマーであって：
前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり；
前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第二の部分に相補的な配列に相補的であり；
前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び
前記第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分に相補的であり、前記第三の部分は、前記ポリヌクレオチドのテンプレート中で前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置する。
（項目９３）
前記第一のプライマー及び前記第二のプライマーは、流体的に分離された容器中にある、項目９２のキット。
（項目９４）
２つ以上の流体的に分離された容器を含むキットであって、前記容器が以下のものを集合的に含むキット：
第一のプライマー、第二のプライマー、第三のプライマー、及び第四のプライマーであって：
前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり；
前記第二のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分に相補的な配列に相補的であり；
前記第三のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分に相補的であり；
前記第四のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分に相補的な配列に相補的であり；
前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；
前記第三のプライマーの第一の領域は、前記第四のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び
前記第一のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列は、単一のヌクレオチドにより、前記第三のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列とは異なる。
（項目９５）
前記第二のプライマーの第一の領域及び前記第四のプライマーの第一の領域の両方が、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第三の部分に相補的であり、前記第三の部分が、前記ポリヌクレオチドのテンプレート中で前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置する、項目９４のキット。
（項目９６）
前記キットが、更に前記ポリヌクレオチドのテンプレートのヌクレオチド配列を含む対照核酸鎖を含む、項目９２〜９５のいずれかのキット。
（項目９７）
前記キットが、更に鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む、項目９２〜９６のいずれかのキット。
（項目９８）
前記キットが、更に逆転写酵素を含む、項目９２〜９７のいずれかのキット。
（項目９９）
前記キットが、更に核酸染料を含む、項目９２〜９８のいずれかのキット。
（項目１００）
前記キットが、更にヌクレオチド及び緩衝液を含む、項目９２〜９９のいずれかのキット。
（項目１０１）
前記第一のプライマー、第二のプライマー、第三のプライマー、及び第四のプライマーのそれぞれの第二の領域が長さにおいて、６〜３０ヌクレオチドの間である、項目９２〜１００のいずれかのキット。
（項目１０２）
前記第一のプライマー、第二のプライマー、第三のプライマー、及び第四のプライマーのそれぞれの第二の領域が長さにおいて、４〜１４ヌクレオチドの間である、項目９２〜１０１のいずれかのキット。
いくつかの実施形態では本明細書において提供されるものは、前記核酸の増幅及びコンカテマーの生成ーに関する方法及び組成物である。
本明細書において提供される方法においては、核酸コンカテマーの生成も、前記コンカテマーの核酸テンプレート／特定の核酸のコピー数を増幅させる。従って、本明細書におけるコンカテマーの生成のための方法及び組成物についての言及も、前記核酸の増幅に適用される。
本明細書において用いられる、“ポリヌクレオチド”は、２つ以上のヌクレオチドを含むポリマー鎖を指す。“ポリヌクレオチド”は、プライマー、オリゴヌクレオチド、核酸鎖などを指す。ポリヌクレオチドは、標準的又は非標準的ヌクレオチドを含み得る。典型的には、ポリヌクレオチドは一つの末端（“５’末端”）に５’リン酸を含み、及び鎖の他の末端（“３’末端）に３’水酸基を含む。ポリヌクレオチドのほとんどの５’ヌクレオチドは、本明細書においては、“前記ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチド”と称される。ポリヌクレオチドのほとんどの３’ヌクレオチドは、本明細書では、前記ポリヌクレオチド“３’末端ヌクレオチド”と称される。
５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドの文脈において、本明細書において用いられる用語“下流”は、前記ポリヌクレオチド内の参照点よりも前記３’末端ヌクレオチドにより近い、前記ポリヌクレオチド中の位置を指す。例えば、：５’ＡＴＡＡＧＣ３’の配列を持つプライマーにおいて、前記“Ｇ”は前記“Ｔ”及び全ての“Ａ”から下流にある。
５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドの文脈において、本明細書において用いられる用語“上流”は、前記ポリヌクレオチド内の参照点よりも前記５’末端ヌクレオチドにより近い、前記ポリヌクレオチド中の位置を指す。例えば、：５’ＡＴＡＡＧＣ３’の配列を持つプライマーにおいて、前記“Ｔ”は前記“Ｇ”前記“Ｃ”、及び前記“Ｇ”に最も近い、２つの“Ａ”から上流にある。
本明細書において用いられる、“核酸”は、非標準的ヌクレオチドを含むＤＮＡ及びＲＮＡを含むＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含む。“核酸”は、少なくとも１つのポリヌクレオチド（“核酸鎖”）を含む。“核酸”単鎖、又は二本鎖であり得る。
本明細書において用いられる、“コンカテマー”は、その中に、特定の核酸の２つ以上のコピーを含み、前記コピーが、順番に連結している核酸分子を指す。前記コンカテマーの中で、前記特定の核酸のコピーは、互いに直接連結することができるか、又はそれらは間接的に連結できる（例えば、前記特定の核酸のコピーの間にヌクレオチドがあり得る）。一実施例では、前記特定の核酸は、二本鎖の核酸テンプレートであることができるので、コンカテマーは、前記二本鎖の核酸テンプレートの２つ以上のコピーを含み得る。別の実施例では前記特定の核酸は、ポリヌクレオチド・テンプレートであり得るので、コンカテマーは、前記ポリヌクレオチド・テンプレートの２つ以上のコピーを含み得る。
本明細書において用いられる、“標的の”核酸又は分子は、目的の核酸を指す。標的の核酸／分子は、単鎖の又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む任意のタイプであり得る。
本明細書において用いられる、“相補的”配列は、２つのヌクレオチド配列が、互いに逆平行に整列された場合に、標準的塩基対法則（例えば、Ａ−Ｔ、Ｇ−Ｃ、又はＡ−Ｕ）に従って、ペアーを形成する複数の個々のヌクレオチド塩基を含むために、配列を含む分子が、互いに特異的にアニールできる２つのヌクレオチド配列を指す。配列が“相補的”であると見なされるためには、２つの配列の全てのヌクレオチド塩基が、互いにペアーを形成する能力を有する必要はない。例えば、もし２つの配列が相補性のために最適に整列されたときに、２つの配列の中の、少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％のヌクレオチド塩基が、互いにペアーを形成できる場合に、配列が相補的であると見なされる。加えて、２つの配列の長さが、互いに顕著に異なる場合でも、“相補的”と見なされ得る。例えば、ヌクレオチドのプライマーは、１００のヌクレオチドを含むより長いポリヌクレオチドに対して、前記プライマーが、より長いポリヌクレオチド特定の領域に対して逆平行に整列されたときに、もし前記プライマーの複数の個別のヌクレオチド塩基が、より長いポリヌクレオチドのヌクレオチド塩基とペアを形成できれば、“相補的”と見なされ得る。加えて、“相補的”配列は、１つ以上のヌクレオチド・アナログ又は核酸塩基アナログを含み得る。本明細書において用いられる、“完全に相補的な”又は“完全な相補性”等は、互いに１００％相補的な２つの配列を指す（即ち、最大の相補性でのペアーの形成の場合で、配列のヌクレオチドに、全く不適合が無い場合）。
本明細書において用いられる、タンパク質、核酸、又は他の生体分子に適用される用語“単離された”は、その自然に生じている環境における構成要素から、生成されたか、又は分離された分子を指す（例えば、それが自然に生成された細胞から生成されたタンパク質）。“単離された”分子は、分子の分子との接触にあってもよい（例えば、反応混合物の一部として）。本明細書において用いられる、“単離された”分子は、更に自然に生じるアミノ酸又はヌクレオチド配列を有する、組み換え的に生成されたタンパク質又は核酸をも含む。“単離された”核酸は、ポリペプチドを通常発現する細胞内に含まれる前記ポリペプチドをエンコードする核酸分子を含み、例えば、前記核酸分子は、自然の細胞とは異なる遺伝子の染色体上の位置にある。いくつかの実施形態では“単離された”ポリペプチドは、前記ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いてクマシー・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）、銀、又は他のタンパク質染色方法により証明されるところでは、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は１００％の等質性まで生成される。
本明細書において用いられる、テンプレート又は他の核酸の“配列” を含むものとして記載される核酸分子は、文脈型のものを明確に指示しない限り、前記テンプレート又は他の核酸それ自身を含むとも見なされ得る （例えば 、テンプレートの配列を含むとして記載される分子は、前記テンプレートを含むものとしても記載され得る）。
本明細書において用いられる、第一のポリヌクレオチドが、第二のポリヌクレオチドに“アニールされた（ａｎｎｅａｌｅｄ）”、“アニールしている（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）”等の場合は、前記第一のポリヌクレオチドの全体、又は任意のその一部分が、第二のポリヌクレオチドにアニールし得るか、及びその逆も成り立つ。
本明細書において用いられる、所定の対象を、状態又は他の対象等で“処理すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）”への言及は、所定の対象を、直接又は間接に、列挙された状態又は他の対象に曝露することを指す。従って、“処理すること”のステップが明白に区別できる関連する活動を含み得る一方（例えば、酵素を容器に加える、容器を振盪する等）で、全ての“処理すること”のステップが、明白に区別できる関連する活動を必要とはしない。例えば、１つ以上の試薬を含む反応は、容器中で設定されることができ、及び一旦この反応が開始されると、更なる人間又は機械による前記容器の内容への介入なしで、複数の事象又はステップが容器中で生じ得る。前記容器中での、これらの複数の事象又はステップの１つ以上は、反応の開始後には、前記容器の内容への個別の介入がないにも関わらず前記容器中の対象を「処理すること」と記載されることができる。
本明細書において提供される方法及び組成物の実施形態が、図１を参照しながら記載され得る。一次核酸１０１が提供され得る（図１Ａ）。前記一次核酸１０１は、核酸テンプレート１０２の配列を含み得る。前記核酸テンプレート１０２は、第一の鎖１０３及び第二の鎖１０４を含む二本鎖の核酸であり得る。図１では、前記二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖１０３は、５’から３’方向に、例示的なヌクレオチド配列：ＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を有する。前記第一の鎖１０３は、５’末端ヌクレオチド（最も５’側のＡ）及び３’末端ヌクレオチド（最も３’側のＣ）も含む。第二の鎖１０４は、５’から３’方向に、例示的なヌクレオチド配列：ＧＡＧＣＡＡＣＣＧＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を有する。第二の鎖１０４も５’末端ヌクレオチド（最も５’側のＧ）及び３’末端ヌクレオチド（最も３’側のＴ）を有する。
第一のプライマー１０５及び第二のプライマー１０６も提供され得る（図１Ｂ）。図１では、前記第一のプライマー１０５は、５’から３’方向の中に、例示的なヌクレオチド配列：ＡＴＧＧＧＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を有する。前記第一のプライマーも、５’末端ヌクレオチド（最も５’側のＡ）及び３’末端ヌクレオチド（最も３’側のＣ）を含む。前記第二のプライマー１０６は、５’から３’方向の中に例示的なヌクレオチド配列：ＣＣＡＴＡＡＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を有する。前記第二のプライマーも５’末端ヌクレオチド（最も５’側のＣ）及び３’末端ヌクレオチド（最も３’側のＧ）を含む。図１の核酸テンプレート１０２は、長さにおいて１１ヌクレオチドであり、及び例示的なヌクレオチド配列を有するが、これらは例示的なものであり、及び制限と見なされるべきではない。
前記第一のプライマー１０５は、以下の２つの領域を含み得る：ｉ）テール領域（”ｔａｉｌ”領域）及びｉｉ）テンプレート結合領域（“ｔｅｍｐ”領域）である。前記第一のプライマーのテール領域１０５は以下の３つの成分を含み得る：ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチドｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり、及びｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分である。図１では、前記第一のプライマーのテール領域１０５は、５’から３’方向の中に、例示的なヌクレオチド配列：ＡＴＧＧを含み、前記プライマーも５’末端ヌクレオチドはＡであり、前記中間の部分は真ん中のＴＧであり、及び最も内部のヌクレオチドは、最も３’側のＧである。前記第一のプライマーのテンプレート結合領域１０５は、３つの構成成分を含み得る：ａ）前記プライマー３’末端ヌクレオチド、ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり、及びｃ）前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分である。図１では、前記第一のプライマーのテンプレート結合領域１０５は、５’から３’方向の中に例示的なヌクレオチド配列：ＧＡＧＣ、を有し、このプライマーの前記３’末端ヌクレオチドはＣであり、前記中間部分は真ん中のＡＧであり、及び前記最も内部のヌクレオチドは、最も５’側のＧである。
前記第二のプライマー１０６は以下の２つの領域を含み得る：ｉ）テール領域及びｉｉ）テンプレート結合領域。前記第一のプライマー１０６のテール領域は、３つの構成要素を含み得る：ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド、ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり、及びｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分である。図１では、前記第二のプライマー１０６のテール領域は、５’から３’方向の中に例示的なヌクレオチド配列：ＣＣＡＴを有し、前記プライマーの５’末端ヌクレオチドは、最も５’側のＣであり、前記中間部分は、真ん中のＣＡであり、及び前記最も内部のヌクレオチドはＴである。前記第二のプライマー１０６のテンプレート結合領域は、３つの構成要素を含み得る：ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド、ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり、及びｃ）前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の、１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分である。図１では、前記第二のプライマー１０６のテンプレート結合領域は、５’から３’方向の中に例示的なヌクレオチド配列：ＡＡＣＧを有し、前記プライマーの３’末端ヌクレオチドはＧであり、前記中間部分は真ん中のＡＣであり、及び前記最も内部のヌクレオチドは最も５’側のＡである。
いくつかの実施形態では、もし前記プライマーの配列は、前記第二のプライマーの５’末端ヌクレオチドが、前記第一のプライマーの前記テール領域の最も内部のヌクレオチドに整列し、及び前記第一のプライマーの５’末端ヌクレオチドが、前記第二のプライマーのテール領域の最も内部のヌクレオチドに整列できる場合には、前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列に相補的ヌクレオチド配列を含むことができるの。例えば、図１では、前記第二のプライマーのテール領域１０６は、５’から３’方向の中に、ＣＣＡＴのヌクレオチド配列を有し、及び前記第一のプライマー１０５のテール領域は、５’から３’方向の中に、ＡＴＧＧのヌクレオチド配列を有する。前記第二のプライマーの５’末端ヌクレオチド（Ｃ）が、前記第一のプライマーのテール領域の最も内部のヌクレオチド（Ｇ）と整列された場合、及び前記第一のプライマーの５’末端ヌクレオチド（Ａ）が、前記第二のプライマー１０７のテール領域の最も内部のヌクレオチド（Ｔ）と整列された場合に、これらの配列は相補的である（図１Ｂ）。
前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有し得るが、典型的には、前記第一のプライマーの前記第二のプライマーに対するアニーリングにより生成される生成物は、本明細書において提供される方法又は組成物において、望ましくないか、又は有用ではないことに注意されたい。従って、いくつかの実施形態では、第一のプライマーと第二のプライマーがアニールされた生成物の生成を最小化するためのステップが取られ得る。そのようなステップは、例えば、第一のプライマー及び第二のプライマーを、本明細書において提供される方法を開始する前に、延長された時間の期間に前記プライマーが、相互作用するし得る条件の下に、予めインキュベートしないことを含み得る。
前記一次核酸は、前記第一のプライマーの第一のコピー１０５ａ及びポリメラーゼ１０８により、前記第一のプライマーの第一のコピー１０５ａのテンプレート結合領域が、前記核酸テンプレート１０３の第一の鎖（図１Ｃ）にアニールし、及び前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物１１１（図１Ｄ）が、生成される条件下で、処理され得る。前記ポリメラーゼ１０８は、前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物１１１の生成を触媒し得る。前記ポリメラーゼは、鎖置換活性を有し得る。前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物１１１の合成の間、前記ポリメラーゼは、前記核酸テンプレートの第二の鎖１０４を、前記核酸テンプレート１０３の第一の鎖から置き換えることができる。典型的には、この伸長された生成物は、前記第一のプライマーの第一のコピー１０５ａの３’末端から生成される。前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物１１１の生成の間、前記第一のプライマーの第一のコピー１０５ａは、合成された伸長生成物と共有結合的に連結することができるので、前記第一のプライマーの第一のコピーは、“前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物”として本明細書に記載される分子の一部となり得る。前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物１１１は、前記核酸テンプレート１０３の第一の鎖に相補的である。いくつかの実施形態では、前記第一のプライマーの第一のコピー１０５ａが、前記核酸テンプレートの第一の鎖１０３にアニールするとき、前記第一のプライマーの第一のコピー１０５ａのテール領域ではなく、テンプレート結合領域が、前記核酸テンプレートの第一の鎖にアニールする。
いくつかの実施形態では、前記第一のプライマーの第一のコピー１０５ａのテンプレート結合領域が、前記核酸テンプレートの第一の鎖１０３にアニールし、及び前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物１１１が形成される条件では、ポリメラーゼに基づく核酸合成を支援するために十分な任意の条件を含み得る。ポリメラーゼに基づく核酸合成の条件の例は、当技術分野では周知であり及び、例えば、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（分子のクローニング：実験室マニュアル）、Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ及びＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）において提供される。実施形態では、前記第一のプライマーのテンプレート結合領域又は第二のプライマーは、プライマーの３’末端から前記プライマーを伸長させる、核酸ポリメラーゼによる、前記プライマーのテンプレート依存性伸長を支援し得る。
前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物１１１は、前記第二のプライマー１０６及びポリメラーゼ１０８により、前記第二のプライマー１０６のテンプレート結合領域が前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物１１１にアニールし（図１Ｅ）、及び前記第二のプライマーの伸長された生成物１１２が形成され得る条件下で処理される（図１Ｆ）。前記ポリメラーゼ１０８は、前記第二のプライマーの伸長された生成物１０６の生成を触媒し得る。前記ポリメラーゼは鎖置換活性を有し得る。前記ポリメラーゼは、前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物１１１を生成するために用いられるものと、同じポリメラーゼのタイプであっても、又は異なることもできる。前記第二のプライマーの伸長された生成物１１２の合成の間、前記ポリメラーゼは、前記核酸テンプレートの第一の鎖１０３を、前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物１１１から置き換えることができる。典型的には、前記伸長された生成物は、前記第二のプライマー１０６の３’末端から生成される。前記第二のプライマーの伸長された生成物１１２の生成の間、前記第二のプライマー１０６は、合成された伸長生成物と共有結合的に連結され得るので、前記第二のプライマーは、本明細書に記載される“第二のプライマーの伸長された生成物”の分子の一部になり得る。前記第二のプライマーの伸長された生成物１１２は、前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物１１１に相補的である。いくつかの実施形態では、前記第二のプライマー１０６が、前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物１１１とアニールするとき、前記第二のプライマー１０６のテール領域ではなく、テンプレート結合領域が、前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物１１１にアニールする。前記第二のプライマーの伸長された生成物１１２は、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び３’末端領域を含む。前記３’末端領域の最終的なヌクレオチド（Ｔ）は、前記第二のプライマーの伸長された生成物の３’末端ヌクレオチド（Ｔ）であり、及び前記３’末端領域は、前記第二のプライマーのテール領域を５’から３’方向に読んだ場合のヌクレオチド配列（ＣＣＡＴ）と同じヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記第二のプライマー１０６のテンプレート結合領域が、前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物１１１にアニールし、及び前記第二のプライマー１１２の伸長された生成物が生成される条件は、本明細書の他の部分で議論される任意の条件を含む、ポリメラーゼに基づく核酸合成を支援する任意の条件を含み得る。前記条件は前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物１１１の生成に用いられるものと同じであり得るか、又はそれらは異なり得る。
前記第二のプライマーの伸長された生成物１１２は、前記第一のプライマーの第二のコピー１０５ｂ及びポリメラーゼ１０８により、前記第一のプライマーの第二のコピー１０５ｂのテンプレート結合領域が、前記第二のプライマーの伸長された生成物１１２（図１Ｇ）にアニールし、及び前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物１１３が形成される（図１Ｈ）条件下で処理され得る。前記ポリメラーゼ１０８は、前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物１１３の生成を触媒し得る。前記ポリメラーゼは鎖置換活性を有し得る。前記ポリメラーゼは前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物１１１、若しくは前記第二のプライマーの伸長された生成物１１２を生成したものと同じポリメラーゼのタイプであっても、又は異なってもよい。前記第一のプライマーの第二のコピー伸長された生成物１１３の合成の間、前記ポリメラーゼ前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物１１１を、前記第二のプライマーの伸長された生成物１１２から置き換えることができる。典型的には、前記伸長された生成物は、前記第一のプライマーの第二のコピー１０５ｂの３’末端から生成される。前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物１１３の生成の間に、前記第一のプライマーの第二のコピー１０５ｂは、合成された伸長生成物に共有結合的に連結できるので、前記第一のプライマーの第二のコピーは、本明細書において“前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物”と記載される分子の一部となる。前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物１１３は、前記第二のプライマー１１２の伸長された生成物に相補的である。いくつかの実施形態では、前記第一のプライマーの第二のコピー１０５ｂが、前記第二のプライマーの伸長された生成物１１２にアニールする場合、両方のテンプレート結合領域、及び前記第一のプライマーの第二のコピー１０５ｂのテール領域は、前記第二のプライマー１１２の伸長された生成物にアニールする。前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物１１３は、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び３’末端領域を有する。前記３’末端領域の最終的なヌクレオチド（Ｇ）は、前記第二のプライマーの伸長された生成物の３’末端ヌクレオチド（Ｇ）であり、及び前記３’末端領域は、前記第一のプライマーのテール領域を５’から３’方向に読んだ場合の（ＡＴＧＧ）と同じヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記第一のプライマーのテンプレート結合領域の第二のコピー１０５ｂが、前記第二のプライマーの伸長された生成物１１２にアニールし、及び前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物１１３が形成される条件は、本明細書の他の部分で議論される任意の条件を含む、ポリメラーゼに基づく核酸合成を支持するために十分な任意の条件を含み得る。この条件は、前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物１１１若しくは前記第二のプライマーの伸長された生成物１１２を生成するために用いられるものと同じであることができるか、又はそれらは異なり得る。
前記第一のプライマーの第二のコピー伸長された生成物１１３の生成は、前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物１１３及び前記第二のプライマー１１２の伸長された生成物を含む分子の生成をもたらすことができ、このものは、本明細書では、“二次核酸”１１５と称される。前記二次核酸１１５の中では、前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物１１３は、前記第二のプライマーの伸長された生成物にアニールされることができる。加えて、前記二次核酸１１５は、前記核酸テンプレート１０２の配列を含む。前記二次核酸１１５は、前記核酸テンプレート１０２単独よりも、より大きいヌクレオチド長を有する、なぜならば前記核酸テンプレート１０２の配列に加えて、それは、前記第一のプライマー及び第二のプライマーのテール領域の配列、及び相補的配列を含み得るからである。特に、二次核酸１１５は、第一の末端領域１１６及び第二の末端領域１１７を有し得る。前記第一の末端領域１１６は、前記第二のプライマーの伸長された生成物１１２の３’末端領域、及びその相補体を含み得る。第二の末端領域１１７は、前記第一のプライマーの第二のコピー伸長された生成物１１３の３’末端領域、及びその相補体を含み得る。
前記二次核酸１１５の第一のコピー１１５ａ及び第二のコピー１１５ｂが、形成され提供される（図１Ｉ）。前記二次核酸１１５の第一のコピー１１５ａ及び第二のコピー１１５ｂは、前記二次核酸１１５の一般構造を有する核酸が、それにより生成される、本明細書の他の部分で議論される任意のプロセスを含む、任意のプロセスにより生成され得る。例えば、前記二次核酸の第一のコピー１１５ａ及び第二のコピー１１５ｂを生成するために二次核酸１１５を一次核酸１０１から生成させる上述の完全なプロセスが、２回繰り返されることができる。別の実施例では、前記二次核酸の第一のコピー１１５ａ及び第二のコピー１１５ｂは、第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物１１１の単一のコピーから生成され得る。この実施例では、前記第二のプライマーの伸長された生成物の２つのコピー１１２ａ、１１２ｂは、第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物１１１の単一のコピーから生成されることができ、このことは、前記第二のプライマーの伸長された生成物１１２ａの第一のコピーが、前記第一のプライマーの第一のプライマーの第一のコピー伸長された生成物１１１の単一のコピーから、前記第二のプライマー１１２ｂ伸長された生成物の第二のコピーの生成を可能にする場合に生じ得る。次いで、例えば、前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物１１３ａ、１１３ｂは、前記第二のプライマーの伸長された生成物１１２ａ、１１２ｂのそれぞれから、それぞれ生成され得る。前記二次核酸の第一のコピー１１５ａ及び第二のコピー１１５ｂの生成のための追加的な手順も、本明細書において提供される方法と共に遂行され、及び用いられ得る。
前記二次核酸の、第一のコピー１１５ａ及び第二のコピー１１５ｂは、二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物１１３ａの３’末端領域が、前記二次核酸の第二のコピーの第二のプライマーの伸長された生成物１１２ｂの３’末端領域とアニールし、これらの鎖（図１Ｊ）（単純性のために、鎖１１３ｂ及び１１２は示されていない）を含む、クロスオーバー構造１１８を生成する。前記クロスオーバー構造１１８は、両方の構成成分の鎖の伸長生成物１１２ｂ、１１３ａが生成されることができる条件下で、更にポリメラーゼにより処理されることができ、前記伸長生成物は、それぞれ、本明細書では、“第一のコンカテマー鎖”１２１及び“第二のコンカテマー鎖”１２２と称され得る。前記第一のコンカテマー鎖１２１及び第二のコンカテマー鎖１２２は、共にアニールし合うことができ、及び集合的にコンカテマー１２０（図１Ｋ）と称され得る。前記コンカテマー１２０は、前記核酸テンプレート１０２の２つ以上のコピーを含み得る。前記コンカテマー１２０中では、前記核酸テンプレート１０２の２つ以上のコピーのいくつか又は全ては、テール領域の配列が、互いにアニールする場合に前記第一のプライマー１０５及び第二のプライマー１０６のテール領域の配列により、互いに分離されることができる。例えば、図１Ｋの前記コンカテマー１２０では、前記二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖の第一のコピーは、前記二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖の第二のコピーとは、５’−３’の順番での：ＣＣＡＴの配列により分離される。ＣＣＡＴは、５’−３’の順番での、前記第二のプライマーのテール領域１０６の配列でもある。同様に、図１Ｋの前記コンカテマー１２０では、前記二本鎖の核酸テンプレートの第二の鎖の第一のコピーは、前記二本鎖の核酸テンプレートの第二の鎖の第二のコピーから、５’−３’の順番での：ＡＴＧＧの配列により分離される。ＡＴＧＧは、５’−３’の順番での、前記第一のプライマーのテール領域１０５の配列でもある。このコンカテマー中では、前記第一のコンカテマー鎖のＣＣＡＴは、第二のコンカテマー鎖。のＡＴＧＧとアニールされる。
いくつかの実施形態ではクロスオーバー構造１１８又はクロスオーバー構造の鎖の伸長生成物が生成され得る条件は、ポリメラーゼに基づく核酸合成を支援するために十分な本明細書の他の部分で議論される任意の条件を含む、任意の条件を含み得る。この条件は、前記第一のプライマーの第一のコピー伸長された生成物１１１、前記第二のプライマーの伸長された生成物１１２、若しくは前記第一のプライマーの第二のコピー伸長された生成物１１１を生成するために用いられたものと同じであり得るか、又はそれらは異なり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるコンカテマーは、図１Ｉ−１Ｋに一般的に概観されるプロセスに従い、更にその長さにおいて、増大することができる。例えば、図１Ｋに示される前記コンカテマー分子１２０の２つは、それらが、図１Ｊ中に示されるものと同様の（より長い鎖を除いて）クロスオーバー構造を形成し、続いて、前記核酸テンプレート１０２の４つのコピーを含む、より大きなコンカテマー分子生成することができるように処理され得る。別の実施例では、二次核酸１１５及びコンカテマー１２０は、クロスオーバー構造を形成でき、前記核酸テンプレート１０２の３つのコピーを含む、より大きなコンカテマー分子が生成される。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法では、複数の異なる長さの複数の異なるコンカテマーが同時に生成され得る。
実施形態では、本明細書において提供される方法及び組成物が、図８を参照しながら記載され得る。ポリヌクレオチド・テンプレート８００（図８Ａ）は、増幅の標的であり得る。前記ポリヌクレオチド・テンプレート８００は、単一の核酸鎖である。前記ポリヌクレオチド・テンプレート鎖は、遊離したもの、単鎖の分子として存在し得るか、又はこれは、その中で前記ポリヌクレオチド・テンプレート鎖がその相補的鎖とアニールされている二本鎖の分子の一部として存在し得る。前記ポリヌクレオチド・テンプレート８００は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。
前記ポリヌクレオチド・テンプレート８００は、少なくとも第一の部分８０１（“（ｉ）”によっても示される）及び第二の部分８０２（“（ｉｉ）”によっても示される）を含み得る。前記第一の部分８０１及び第二の部分８０２は、それぞれ１０００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、又は３未満等の、又はそれぞれ、少なくとも１０００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３つのヌクレオチド等の、それぞれ任意の数のヌクレオチドを含み得る。典型的には、前記第一の部分８０１及び第二の部分８０２の、それぞれは、１０〜３０個のヌクレオチドを含み得るが、前記第一の部分８０１及び第二の部分８０２は、その上に、本明細書の他の部分に記載される他の長さでもあり得る。前記第一の部分８０１及び第二の部分８０２は、同じ又は異なる数のヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では前記ポリヌクレオチド・テンプレート８００は、前記第一の部分８０１及び第二の部分８０２に加えて、他の部分を含み得る。他の実施形態では、前記第一の部分８０１、及び第二の部分８０２は、前記ポリヌクレオチド・テンプレート８００の全体を構成し得る。前記ポリヌクレオチド・テンプレート８００は、本明細書の他の部分に記載される核酸テンプレートの長さを有し得る。前記ポリヌクレオチド・テンプレート８００は、一次核酸の一部分であり得る。前記ポリヌクレオチド・テンプレートは、被験者から得られたサンプル中に存在し得る。
前記ポリヌクレオチド・テンプレート８００は、第一のプライマー８１０及び第二のプライマー８２０（図８Ｂ）を含み得る反応混合物中で、インキュベートされ得る。典型的には、この反応混合物は、それぞれのプライマーの複数のコピー、例えば、少なくとも４、５、６、１０、１５、２０、５０、１００、１０００、１０，０００、１００，０００、又は１，０００，０００コピー又はそれを超えるプライマーのそれぞれを含み得る。前記第一のプライマー８１０は、第一の領域８１１（“（ｉ）”としても表示される）及び第二の領域８１２（“（ｉｉ）”とも表示される）を有し得る。前記第一のプライマーの第一の領域８１１は、５’末端を有することができ、及び前記第一のプライマーの第二の領域８１２は３’末端を有し得る。前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第一のプライマー第二の領域ヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有し得る。前記第二のプライマー８２０は、第一の領域８２１（“（ｉ）”としても表わされる）及び第二の領域８２２（“（ｉｉ）”としても表わされる）を有し得る。前記第二のプライマー８２１の第一の領域は、５’末端、及び前記第二のプライマー８２２の第二の領域は、３’末端を有し得る。前記第二のプライマーの第一の領域は、第二のプライマーの第二の領域のヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有し得る。
前記第一のプライマー第二の領域８１２は、前記ポリヌクレオチド・テンプレート８０１の第一の部分のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有し得る。図８では、前記ポリヌクレオチド・テンプレート第一の部分８０１のヌクレオチド配列は、文字Ａにより表わされ、及び前記第一のプライマー第二の領域８１２のヌクレオチド配列は、文字Ａ’で表わされ、Ａ及びＡ’は互いに相補的である。前記第二のプライマー第二の領域８２２は、パートナーのヌクレオチド配列８３０に相補的なヌクレオチド配列を有することができ、前記パートナーのヌクレオチド配列８３０は、前記ポリヌクレオチド・テンプレート第二の部分８０２のヌクレオチド配列に相補的である。図８では、前記ポリヌクレオチド・テンプレートの第二の部分８０２のヌクレオチド配列は、文字Ｂで表わされ、パートナーのヌクレオチド配列８３０のヌクレオチド配列は、文字Ｂ’で表わされ、及び前記第二のプライマーの第二の領域８２２のヌクレオチド配列は、文字Ｂで表わされ、Ｂ及びＢ’は互いに相補的である。言い換えると、図８により示されるように、前記ポリヌクレオチド・テンプレートの第二の部分８０２のヌクレオチド配列（Ｂ）は、前記第二のプライマーの第二の領域８２２のヌクレオチド配列（Ｂ）と同じであり得る。本明細書において提供される組成物及び方法により、パートナーのヌクレオチド配列８３０が、例えば、前記第一のプライマーの３’末端から伸長された生成物の一部分として生成され得る。実施形態では、前記第一のプライマーの第一の領域８１１は、相補的前記第二のプライマーの第一の領域８２１と相補的である。図８では、前記第一のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列は、文字Ｃにより表わされ、及び前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列は文字Ｃ’で表わされ、及びＣ’は互いに相補的である。
実施形態では、図８の第一のプライマー及び第二のプライマーは、本明細書の他の部分に記載される（例えば、図１におけるような）前記第一のプライマー及び第二のプライマーの特性のいかなるものも、それぞれ有し得る。更に、実施形態では、図８の前記第一のプライマーの第一の領域は、前記本明細書の他の部分に記載される第一のプライマーのテール領域の、いかなる特性をも有し得る。実施形態では、図８の前記第一のプライマーの第二の領域は、本明細書の他の部分に記載される第一のプライマーのテンプレート結合領域のいかなる特性をも有し得る。実施形態では、図８の前記第二のプライマーの第一の領域は、本明細書の他の部分に記載される、第二のプライマーのテール領域のいかなる特性をも有し得る。実施形態では、図８の前記第二のプライマー第二の領域は、本明細書の他の部分に記載される第二のプライマーテンプレート結合領域のいかなる特性をも有し得る。
実施形態では、ポリヌクレオチド・テンプレート８００及び第一のプライマー８１０の少なくとも２つのコピー、及び第二のプライマー８２０の少なくとも２つのコピーを含む反応混合物は、本明細書の他の部分に記載されるポリメラーゼに基づく核酸合成を支援し得る１つ以上の他の成分（例えば、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、緩衝液、水等）を含み得る。同様に、ポリヌクレオチド・テンプレート８００及び第一のプライマー８１０の少なくとも２つのコピー、及び第二のプライマー８２０の少なくとも２つのコピーを含む反応混合物は、本明細書の他の部分に記載される核酸テンプレートの増幅又はコンカテマーの生成ーを支援し得る反応条件の任意の条件下にインキュベートされ得る。
実施形態では、ポリヌクレオチド・テンプレート８００及び第一のプライマー８１０の少なくとも２つのコピー、及び第二のプライマー８２０の少なくとも２つのコピーの反応混合物での、本明細書に記載されるようなインキュベーションすると、１つ以上のコンカテマー鎖が形成され得る（図８Ｃ）。実施形態では、形成されたコンカテマー鎖８４０は、５’末端及び３’末端を有することができ、及び５’から３’方向の中に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般的構造を含む配列を有することができ、式中：Ｃ’は、前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列であり、Ｔは、前記ポリヌクレオチド・テンプレート又はその類似の配列の配列であり、及びＸは、ヌクレオチドの任意の数及び配列である。従って、前記コンカテマー鎖の一般的構造に示されるように、コンカテマー鎖は、前記ポリヌクレオチド・テンプレート又はその類似の配列の、配列の少なくとも２つのコピーを含むことができ、前記ポリヌクレオチド・テンプレートの配列のコピーは、少なくとも前記第二のプライマーの第一の領域の配列により分離される。実施形態では、Ｔは、前記ポリヌクレオチド・テンプレートの類似の配列である。本明細書において用いられる、ポリヌクレオチド・テンプレートの“類似の配列”は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートと同様の配列を含むが、ポリヌクレオチド・テンプレート中のヌクレオチドに対して１つ以上の類似のヌクレオチドを含む、配列を指す。従って、例えば、もし前記ポリヌクレオチド・テンプレートが、ＲＮＡ配列を含む場合、その類似の配列は同じ配列のＤＮＡ版であり得る（即ち、ＲＮＡ配列のウラシルが、類似のＤＮＡ配列でのチミンである）か、又はその反対も可である。実施例を継続して、もし前記ポリヌクレオチド・テンプレートが、５’ＵＡＣＣＵＧ３’のＲＮＡ配列を含む場合、類似の配列は、５’ＴＡＣＣＴＧ３’のＤＮＡ配列である。
実施形態では、５’から３’方向の中に一般的構造：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’を含む配列では、Ｘは、ゼロのヌクレオチド（即ち、Ｘの両側のＴ及びＣ配列は直接連結している）。他の実施形態では、Ｘは、１０，０００、５０００、４０００、３０００、２０００、１０００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、又は３未満のヌクレオチドである。Ｘの中のヌクレオチド（存在する場合には）任意の配列を有し得る。実施形態前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列であり、Ｔは、前記ポリヌクレオチド・テンプレートの配列又はその類似の配列であり、及びＮは、１〜５００、１〜２００、１〜１００、１〜５０、又は１〜１０等の１０００、５００、２００、１００、５０、又は１０未満の任意の整数である。例えば、もし“Ｎ”がであり、Ｘが、５’から３’方向の中に一般構造[（Ｃ’−Ｔ）Ｎ]を有する配列を含む場合、構造Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の中のＸの位置には、（Ｃ’−Ｔ）の３回の順次的な繰り返しがあるので、対応する構造は：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｃ’として書かれることができ、式中下線の引かれたＣ’及びＴは式[（Ｃ’−Ｔ）３]のＣ’−Ｔの繰り返しである。従って、例えば、本明細書において提供される組成物及び方法に従うと、前記ポリヌクレオチド・テンプレートの数十又は数百のコピーを含む、コンカテマー鎖が生成され得る。実施形態では、図８において提供される、コンカテマー鎖は、本明細書の他の部分に記載されるコンカテマー鎖の任意の特性を有し得る。更に、いくつかの実施形態では、コンカテマー鎖の生成の間、一般的構造Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’を有する配列の中の１つ以上のＣ’又はＴの位置において、少数のヌクレオチド（例えば、１５以下、１０以下、５以下、又は３以下）が、Ｃ’及びＴの間に挿入され得る。更に、いくつかの実施形態では、コンカテマー鎖の生成の間、一般的構造Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’を有する配列の中の１つ以上のＣ’又はＴの位置において、少数のヌクレオチド（例えば、１５以下、１０以下、５以下、又は３以下）が、Ｃ’又はＴ配列から削除され得る。従って、本明細書において提供される方法により提供される、コンカテマー鎖は、本明細書において提供される一般的構造を有する鎖を含み得るが、前記コンカテマー鎖の異なる配列成分の１つ以上の接触点（即ち、テンプレート配列及びプライマー配列／Ｔ及びＣ’の間の接触点）において、追加された又は除去された少数のヌクレオチドを有し得る。更に、実施形態では、本明細書において提供されるコンカテマー鎖は、追加的なヌクレオチド（例えば、最大３、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０００又はより多い追加的なヌクレオチド）を一般的構造Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の配列を有するコンカテマーを含む分子の５’又は３’末端に含み得る。実施形態では、前記一般的構造Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’のＣ’は、本明細書の他の部分に記載される第二のプライマーのテール領域の任意の特性（例えば、長さ、配列）を有し得る。実施形態では、前記一般的構造Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’のＴは、本明細書の他の部分に記載されるポリヌクレオチド・テンプレート鎖の任意の特性（例えば、長さ、配列）を有し得る。
実施形態では、本明細書において提供される方法により生成された、コンカテマー鎖８４０は、単鎖の分子の一部であり得る。他の実施形態では、本明細書において提供される方法に従って生成されたコンカテマー鎖８４０は、二本鎖のコンカテマーの一部であることができ、その中で前記コンカテマー鎖８４０は、コンカテマー鎖８５０に相補的な鎖にアニールされている。図８Ｃは、５’から３’方向の中に一般構造：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’（鎖８４０）又はＣ−Ｔ’−Ｃ−Ｔ’−Ｘ’−Ｃ（鎖８５０）を有する配列を有するコンカテマー鎖を図示しているが、この場合、Ｘは、０ヌクレオチドであるが、図８の概略図に従って生成されたコンカテマー鎖は、上述の又は本明細書の他の部分に記載されるコンカテマー鎖のいかなる特性をも有し得る。更に、図８Ｃに関係することとして、配列Ａ及びＢは、前記テンプレート鎖の一部であり、及び従って前記一般的構造Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’又はＣ−Ｔ’−Ｃ−Ｔ’−Ｘ’−Ｃの中では個別には記録されない。
更に、図８の実施形態の要素間の関係を示すために、ブロック８６０、８６２、８６４、８６６、及び８６８が図８中に提供される。ブロック８６０（バックスラッシュ様の塗りつぶしを持つ）は、全体のポリヌクレオチドのテンプレート配列（即ち、要素８００）、又はその相補的配列の相対的な位置を示す。ブロック８６２（垂直の線の塗りつぶしを持つ）は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分の配列の相対的な位置（即ち、要素８０１の配列の相対的な位置）、又はその相補的配列の相対的な位置を示す。従って、ブロック８６２も、要素８０１に相補的である、前記第一のプライマーの第二の領域（即ち、要素８１２）の配列を表す。ブロック８６４（垂直及び水平の塗りつぶしを持つ）は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分の配列の相対的な位置（即ち、要素８０２の配列の相対的な位置）、又はその相補的配列の相対的な位置を示す。従って、ブロック８６４も、要素８０２に相補的である、パートナーのヌクレオチド配列（即ち、要素８３０）を表す。ブロック８６４も、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分の配列（要素８０２）と同一、又は同様な配列であり得る、前記第二のプライマーの第二の領域の配列８２２の相対的な位置を示す。言い換えると、実施形態では、８２２のヌクレオチド配列は、８０２のヌクレオチド配列と同一であるか、又は同様であり得る。例えば、図８Ａに図示されるように、実施形態では、前記ポリヌクレオチドのテンプレートに、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分又は第二の部分ではない、ヌクレオチドが存在する。例えば、一実施例では、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分は、１５ヌクレオチドを含むことができ、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分は１５ヌクレオチドを含むことができ、及び前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分及び第二の部分の間は２５ヌクレオチドである。典型的には、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分、及び前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分のそれぞれは、長さにおいて１０〜３０ヌクレオチドであることができるが、他の数も予期される。例えば、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分及び第二の部分のそれぞれは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は１００ヌクレオチドであることができ、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は１００ヌクレオチド未満であることができ、又は少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０ヌクレオチド、及び６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は１００ヌクレオチド未満であることができる（上限は下限を超えて）。実施形態では、前記第一の部分及び第二の部分の間のポリヌクレオチドのテンプレートにおいて、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、又は５００のヌクレオチドが存在することができ、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、又は５００のヌクレオチド、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、又は２００のヌクレオチド、及び２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、又は５００未満のヌクレオチドが存在し得る（上限は下限を超えて）。ブロック８６６（波型の線で塗りつぶされている）は、前記第一のプライマーの第一の領域の配列（即ち、要素８１１／領域“Ｃ”の配列の相対的な位置）の相対的な位置、又はその相補的配列の相対的な位置を示す。従って、ブロック８６６も、要素８１１に相補的である、前記第二のプライマーの第一の領域の配列（要素８２１／領域“Ｃ’”）を示す。ブロック８６８（菱形で塗りつぶされている）は、コンカテマー鎖（要素８４０）の配列の相対的な位置、又はその相補的配列の相対的な位置を示す。従って、ブロック８６８も、前記コンカテマー鎖（要素８５０）に相補的である、鎖の配列を表す。図８Ｃに図示されるように、コンカテマー鎖又はその相補体（８６８）の中では、前記ポリヌクレオチドのテンプレート又はその相補体（８６０）の２つのコピーが存在し、前記第一のプライマーの第一の領域又はその相補体（８６６）のヌクレオチド配列により分離されている。加えて、コンカテマー鎖又はその相補体（８６８）の中では、前記第一のプライマーの第一の領域又は相補体（８６６）のヌクレオチド配列は、前記ポリヌクレオチドのテンプレート又はその相補体（８６０）の配列に、その両端において隣接（ｆｌａｎｋ）する。更に、コンカテマー鎖又はその相補体（８６８）の中では、前記第一のプライマーの第二の領域、又はその相補体（８６２）の配列の２つのコピーが存在し、及び前記第二のプライマーの第二の領域又はその相補体（８６４）の配列の２つのコピーが存在し、それらの両方とも、前記ポリヌクレオチドのテンプレート配列又はその相補体の２つのコピーの部分として、２つのコピーの中に存在する。ブロック８６０、８６２、８６４、８６６、及び８６８は、図８の要素との間に要求される、特定の何らかのサイズの関係を決定するものとして解釈されるべきではなく；むしろ、ブロック８６０、８６２、８６４、８６６、及び８６８は、本明細書において提供される、特定の実施形態における、図８の要素の間の、互いに対する相対的な一般的な位置を示すことを単に助けるものである。
本明細書において提供される、方法及び組成物に従い生成されたコンカテマーは、ヌクレオチドに任意の長さのものであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書において生成されたコンカテマー分子は、長さにおいて、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、又は２５，０００ヌクレオチドであり得る。本明細書において生成されたコンカテマー分子は、長さにおいて、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、又は２５，０００ヌクレオチド未満である。本明細書において生成されたコンカテマー分子は、長さにおいて、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、又は２０，０００ヌクレオチドの最小値を持ち、及び長さにおいて４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、又は２５、０００ヌクレオチドの長さの最大値を持つ範囲から選ばれる長さを持つことができる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法又は組成物に従って生成される、少なくともいくつかのコンカテマーは、上述の特性を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法又は組成物に従って生成されるコンカテマーのは、上述の特性を有する。
本明細書において提供される方法又は組成物に従って生成されるコンカテマーは、核酸テンプレート又は特定の核酸の任意の数のコピーを含み得る。いくつかの実施形態では本明細書において生成されるコンカテマー分子は、核酸テンプレート又は特定の核酸の、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００コピーを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書において生成されるコンカテマー分子は、核酸テンプレート又は特定の核酸の、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００未満のコピーを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書において生成されるコンカテマー分子は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、又は９０コピーの最小値を持ち、及び３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００コピーの最大値を有する範囲から選ばれる、核酸テンプレート又は特定の核酸のコピーの数を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法又は組成物に従って生成される少なくともいくつかのコンカテマーは、上述の特性を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法又は組成物に従って生成されるコンカテマーの、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％は、上述の特性を有し得る。
本明細書において提供される方法の進展は、複数の異なる方法で観察され得る。実施形態では、反応は核酸増幅生成物により検定され得る（例えば、生成物の量について又は生成の速度により）。他の実施形態では、反応は、核酸テンプレートに沿ったポリメラーゼの活性により検定され得る（例えば、テンプレート鎖に沿ったポリメラーゼの動き）。従って、いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法の事象は、方法からの生成物の累積に起因して（前記方法のステップの完了の間、又はその後の）、又は方法のステップの間に生じる検出可能な事象に起因して観察され得る。
増幅された核酸の存在は、例えば、反応生成物の検出により（増幅された核酸又は反応副生成物）又は前記反応の進展に伴うプローブの検出により検定され得る。
いくつかの実施形態では、反応生成物は、生成物を染料により染色することにより同定され得る。いくつかの実施形態では、染料は核酸と結合した時に、核酸と結合していない時よりも、より大きな蛍光を有し得る。実施形態では、染料は二本鎖の核酸にインターカレートし得るか、又は染料は核酸の外部領域に結合し得る。本明細書において提供される方法及び組成物により用いられ得る核酸染料としては、例えば、シアニン染料、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＢＲ（登録商標）染料、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩＩ、臭化エチジウム、ジヒドロエチジウム、ＢｌｕｅＶｉｅｗＴＭ、ＴＯＴＯ（登録商標）染料、ＴＯ−ＰＲＯ（登録商標）染料、ＰＯＰＯ（登録商標）染料、ＹＯＹＯ（登録商標）染料、ＢＯＢＯ（登録商標）染料、ＪＯＪＯ（登録商標）染料、ＬＯＬＯ（登録商標）染料、ＳＹＴＯＸ（登録商標）染料、ＳＹＴＯ（登録商標）染料、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化ヘキシジウム、メチレンブルー、ＤＡＰＩ、アクリジン・オレンジ、キナクリン、アクリジン二量体、９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン、ビスベンズイミド染料、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）染料、７−アミノアクチノマイシンＤ、アクチノマイシンＤ、ヒドロキシスチルバミジン、ピロニンＹ、ＤｉａｍｏｎｄＴＭ染料、ＧｅｌＲｅｄＴＭ、ＧｅｌＧｒｅｅｎＴＭ及びＬＤＳ７５１が挙げられる。
いくつかの実施形態では、反応生成物は、増幅反応の濁度の分析により同定され得る。例えば、実施形態では、増加した濁度は反応生成物及び反応副生成物の生成に相関付けられる（例えば、マグネシウムと複合化したピロリン酸）。
いくつかの実施形態では、反応生成物は、本明細書の方法に従って遂行される反応をゲル電気泳動により分離し、続いてそのゲルを核酸のための染料により染色ことにより同定され得る。前記染料は、本明細書で開示されるか、又はさもなければ当技術分野で周知の任意の核酸染料であり得る。
いくつかの実施形態では、核酸又は核酸の生成の検出のための当技術分野で周知の、任意の方法又は組成物が、本明細書において提供される方法及び組成物により用いられることができる。
いくつかの実施形態では、蛍光レポーター（蛍光色素分子）及び消光剤の１つ又は両方を含む、核酸テンプレート鎖の一部（又は同様の又は同一の配列を有する鎖）に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸プローブが、本明細書において提供される反応に含まれる。
一実施例では、核酸プローブは、蛍光レポーターを５’又は３’末端に、及び消光剤をその反対の末端に含み得る。前記プローブは、順番に、少なくとも第一の、第二の、及び第三の領域を含むヌクレオチド配列を更に含むことができ、前記第一の、及び第三の領域は互いに相補的であり、及び第二の領域の少なくとも一部分は、前記核酸テンプレートの鎖の一部に相補的である（プローブ“検出配列”）。いくつかの実施形態では、第二の領域の長さは、前記第一の又は第三の領域の長さよりも大きくてよい。いくつかの実施形態では、第二の領域の長さは、１０〜４０ヌクレオチドであることができ、及び第一及び第三の領域の長さは、４〜１０ヌクレオチドであることができる。前記プローブは、少なくとも２つの異なるコンフォーメーションを有し得る：（Ａ）前記プローブが、その検出配列にアニールされておらず、及び前記第一の及び第三の領域が、互いにアニールしあっているコンフォーメーション；このコンフォーメーションはステムからの前記第一の及び第三の領域及びループからの第二の領域を有する、ステム−ループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造であることができ、及び（Ｂ）前記プローブがその検出配列とアニールしているコンフォーメーションであって；このコンフォーメーションでは、第二の領域又はその一部分はその検出配列にアニールし、及び前記第一の及び第三の領域は互いにアニールしていない。前記プローブのコンフォーメーション（Ａ）では、前記蛍光レポーター及び消光剤（前記プローブの反対側の端末に配置されている／前記第一の及び第三の領域の外側の両末端に）は、互いに近接していることができる（両方とも、前記第一の及び第三の領域のアニーリングにより形成されるステム構造の末端にある）ので、前記蛍光レポーターは消光されることができる。前記プローブのコンフォーメーション（Ｂ）では、前記蛍光レポーター及び消光剤は、互いに近接していないので、前記蛍光レポーターは消光されないことができる。例えば、前記プローブが、ステム−ループ構造を形成するか、又はその検出配列にアニールするかのいずれかであり得る反応条件下では、前記プローブは、選択された反応生成物の蓄積を観察するために用いられることができる。いくつかの実施形態では、前記検出配列が存在する場合、前記プローブは前記検出配列にアニールでき、及び前記プローブは、前記蛍光色素分子の励起スペクトルの波長の光に対応して蛍光を発し得る。その一方、もし前記検出配列が存在しない場合、前記プローブはステム−ループ構造を形成でき、及び前記蛍光色素分子の励起スペクトルの波長の光に対応して蛍光を発しない。
別の実施例では、核酸プローブは、蛍光レポーターをその５’又は３’ 末端に含むことができ、及びそれは、消光剤を含む核酸プライマー とアニールできる。前記消光剤を含む核酸プライマー は、前記プライマーの中の位置に消光剤を含み得るので、前記核酸プローブ は前記プライマーにアニールしたときに、前記蛍光レポーターは消光される。前記プローブ は、例えば、前記反応 生成物前記プローブ が前記プライマーにアニールできるか、又はその検出 配列にアニールするかの、いずれかができる反応条件で、選択された反応 生成物の蓄積を観察するために用いられ得る。いくつかの実施形態では、前記検出配列が存在する場合、 前記プローブ は、前記検出配列にアニールでき、及び前記プローブ は、前記蛍光色素分子の励起スペクトルの波長の光に対応して蛍光を発し得る（従って反応 生成物の存在を示す）。その一方、前記検出配列が存在しない場合、
前記プローブ は、前記プライマーとのペアーを取り続け得るので、及び前記蛍光色素分子の励起スペクトルの波長の光に対応して蛍光を発しない。
蛍光レポーター及び消光剤のペアーを含むプローブにおいて、前記蛍光レポーター及び消光剤は、選択されることができるので前記消光剤、前記消光剤は、効果的に前記消光剤前記レポーターを消光できる。いくつかの実施形態では蛍光レポーターは消光剤前記消光剤と組み合わされ、前記蛍光レポーターの発光極大は、前記消光剤の吸収極大と同様である。前記蛍光レポーターとして用いられ得る蛍光色素分子としては、例えば、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） Ｇｏｌｄ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） Ｏｒａｎｇｅ、Ｑｕａｓａｒ ５７０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） Ｒｅｄ ５９０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ（登録商標） ６１０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） Ｒｅｄ ６１０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） Ｒｅｄ ６３５、Ｑｕａｓａｒ（登録商標） ６７０ （バイオサーチ・テクノロジーズ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、ＶＩＣ、ＮＥＤ（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５（ＧＥヘルスケア・ライフ・サイエンシズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））、Ｏｙｓｔｅｒ ５５６、Ｏｙｓｔｅｒ ６４５（インテグレ―ティッド・ＤＮＡテクノロジーズ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、ＬＣ ｒｅｄ ６１０、ＬＣ ｒｅｄ ６１０、ＬＣ ｒｅｄ ６４０、ＬＣ ｒｅｄ ６７０、ＬＣ ｒｅｄ ７０５（ロッシュ・アプライズ・サイエンス（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ））、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＴＭＲ、及びＲＯＸが挙げられる。用いられ得る消光剤としては、例えば、ＤＤＱ−Ｉ、ＤＤＱ−ＩＩ（ユーロジェンテック（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ））、Ｅｃｌｉｐｓｅ（エポック・バイオサイエンシズ（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ
ＲＱ（インテグレ―ティッド・ＤＮＡテクノロジーズ）、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３ （バイオサーチ・テクノロジーズ）、ＱＳＹ−７、ＱＳＹ−２１（モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、及びＤａｂｃｙｌが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される組成又は方法と共に用いられるプローブはペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブであってよい。ペプチド核酸は、例えば、核酸のホスホジエステル骨格が、反復的なＮ−（２−アミノエチル）グリシンのユニットにより置換され、及びそこに、メチルカルボニル結合によって、プリン及びピリミジンが取り付けられた合成ＤＮＡアナログである。随意的に、ＰＮＡプローブは、本明細書において提供される、ＰＮＡ−ＤＮＡ二本鎖に結合し、及びＰＮＡ−ＤＮＡ二本鎖に結合した際に色を変化させる染料を更に含む反応中に提供されることができる。そのような染料の例としては、３，３’−ジエチルチアジカルボシアニン・ヨウ化物[ＤｉＳｃ２（５）]がある。ＤｉＳｃ２（５）は、ＰＮＡ−ＤＮＡ二本鎖に結合した際に、深い紫いろから色を変化させ、及びこの色の変化は、例えば分光光度計、画像分析、又は人間の裸眼により観察され得る。ＰＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の検出のための、ＰＮＡプローブ及びＤｉＳｃ２（５）の使用は、例えば、Ｗｉｌｈｅｌｍｓｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００２年、第３０巻、第２号ｅ３に記載されており、これは参照により全ての目的で、本願に組み込まれる。ＰＮＡプローブを用いる実施形態では、典型的には、前記ＰＮＡプローブは、関連する増幅反応において、増幅されるべき配列に相補性であるようにデザインされる。従って、もし、この配列が成功裏に増幅されると、前記ＰＮＡプローブは、増幅された配列を含むＤＮＡ鎖にアニールし、及びこのアニーリングが検出され得る（例えば、ＮＡ−ＤＮＡ二本鎖に結合した時のＤｉＳｃ２（５）の色の変化を観察することにより）。本明細書において提供される実施形態でのＰＮＡプローブの使用は、従って配列が成功裏に増幅された反応を正確に決定することを支援し、及び核酸の非特異的な増幅を有する反応から、これらの反応を差別化することを支援する。本明細書において提供される実施形態でＰＮＡプローブを使用するためには、随意的に、反応の開始時に、前記ＰＮＡプローブが、本明細書において提供される反応混合物に含まれることができる。他の実施例では、前記ＰＮＡプローブは、前記反応混合物は、反応の開始後の時間、又は反応の完結後に加えられ得る。染料は、ＰＮＡプローブが加えられるのと同時に、又は異なる時間において、反応混合物中に加えられ得る。例えば、実施形態では、染料が反応の開始時に前記反応混合物に加えられることができ、及び前記ＰＮＡは、反応の開始後の時点で加えられ得る。実施形態では、本明細書において提供されるキットは、キットの試薬により増幅されるべきヌクレオチド配列に相補的であるＰＮＡプローブ、及びＰＮＡ−ＤＮＡ二本鎖に結合する染料を含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法に従い遂行される反応は、光源及び光学的センサーを含む装置の中で観察され得る。ある場合には、前記反応は、光源からの光の経路の中に位置づけられることができ、及び前記サンプルにより吸収される光（例えば、濁度反応の場合）、前記サンプルにより散乱される光（例えば、濁度反応の場合）、又は前記サンプルより放射される光（例えば、蛍光分子を含む反応の場合）が測定され得る。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１３年２月１８日に出願された、米国特許出願第１３／７６９，７７９号に開示される機器若しくはその中のモジュールの中で遂行されるか又は観察され得る。
本明細書において提供される方法を用いて、目的の核酸テンプレートの特異的な増幅生成物が、増幅反応の開始から、例えば、３０秒、１分、３分、５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４５分、６０分、９０分、１２０分、１８０分、又は２４０分以内で同定され得る。別の実施例では、本明細書において提供される方法を用いて、目的の核酸テンプレートに対して陽性の増幅反応が、前記テンプレートのわずか１０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、又は１，０００，０００コピーが生成されたときに同定され得る。別の実施例では、本明細書において提供される方法を用いて、方法の開始時に、目的のテンプレートの、わずか１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００、５０００、又は１０，０００コピーを含む、サンプル中の目的の核酸テンプレートの存在が、同定され得る。
実施形態では、本明細書において提供される方法は、標的の目的の核酸についての、サンプルの検定のために用いられ得る。特定の実施形態では、サンプル中の標的の目的の核酸の存在又は量は、反応中の核酸増幅についての変曲時間を決定することを含む方法により決定され得る。変曲時間／変曲点は、増幅反応が、核酸テンプレートに対して陽性であることが決定される時間又は点である。変曲時間／点は、例えば、選択された量の核酸が、前記反応において生成された、反応の開始後の時間、反応における増幅速度がベースライン相から、指数増殖期へ変化する時間、又は反応における増殖速度が、指数増殖期から、ベースライン相に変化する時間等の１つ以上のインジケーターにより、特定され得る。実施形態では、変曲時間／点は、蛍光における変化若しくは反応の吸光度、又は選択された値に達する、蛍光若しくは反応の吸光度に基づいて特定され得る。特定の実施形態では、サンプル中の標的の目的の核酸の存在又は量は、未知の量の標的の目的の核酸反応の核酸増幅についての変曲時間を、以下の１つ又は両方と比較することを含む方法により決定され得る：ｉ）前記標的の目的の核酸を欠くことが知られる反応（即ち、陰性対照）又はｉｉ）前記標的の目的の核酸を含むことが知られる反応（即ち、陽性対照）。実施形態では、前記標的の目的の核酸を含む反応、及び前記標的の核酸を含まない反応の両方が、選択された変曲時間について測定される。実施形態では、サンプル中の標的の目的の核酸の存在は、標的の目的の核酸を含み得るか、又は含まなくてよいサンプルを含む反応の変曲を、既知の標的の目的の核酸状況を持つ１つ以上の反応の変曲の時間との差を評価することを含む方法に基づいて決定され得る（例えば、前記標的の目的の核酸を含むことが知られるか、又は含まないことが知られる）。例えば、本明細書において提供される方法に従う前記反応の変曲時間が、前記標的の目的の核酸を含まないことが知られる、対応する反応よりも、少なくとも３、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、９０、１２０、又は１８０分早い場合に、サンプルが、標的の目的の核酸を含むと特定され得る。別の実施例では、本明細書において提供される方法に従う前記反応の変曲時間が、前記標的の目的の核酸を含むことが知られる対応する反応よりも、３、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、９０、１２０、又は１８０分未満遅い場合に、サンプルが前記標的の目的の核酸を含むと特定される。
本明細書において提供される方法は、任意の時間の長さの間に遂行され得る。典型的には、前記方法は、例えば、核酸複製の速度、ポリメラーゼ活性の発生、又は増幅生成物の蓄積を、観察するために十分な長さの間遂行される。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、１０秒、３０秒、１分、５分、１０分、２０分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、又は２４時間よりも短い合計時間の間遂行されることができ、その時間に、核酸複製、ポリメラーゼ活性の発生、又は増幅生成物の蓄積が測定される。
本明細書において提供される方法は、様々な方法により停止され得る。一実施形態では、方法のステップは、前記方法の１つ以上のステップに含まれる１つ以上の試薬（例えば、ｄＮＴＰ）の濃度の低下又は完全な消費に際して停止され得る別の実施形態では、方法のステップは、前記方法の１つ以上のステップに含まれる１つ以上の酵素（例えば、ポリメラーゼ）の不活性化に際して停止され得る。酵素は、様々な方法で不活性化され得る。例えば、酵素は、経時的に酵素の構造に影響するランダムな事象に起因して酵素活性を徐々に失うか、又は酵素は、その酵素活性の不活性化を加速する条件に曝露され得る（例えば、高温、極端なｐＨ等）。
いくつかの実施形態では、一次核酸は、単一の鎖であるか又は二本鎖であり得る。単一の鎖の一次核酸は、本明細書においては、“一次ポリヌクレオチド”と称される。一次核酸は直線状であるか又は円形であり得る。一次核酸は、核酸テンプレートを含み得る。いくつかの実施形態では、一次核酸の全体は、核酸テンプレートであり得る。他の実施形態では、一次核酸は、核酸テンプレートの一部分ではない１つ以上のヌクレオチドを含み得る（例えば、前記一次核酸は、前記一次核酸中に含まれる核酸テンプレートよりも、ゆおり長いものであり得る）。いくつかの実施形態では、一次核酸は核酸テンプレートの２つ以上のコピーを含み得る。一次核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの混合物を含み得る。二本鎖の直線状の一次核酸は、平滑末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）又はスティッキー末端（ｓｔｉｃｋｙ ｅｎｄ）を有し得る（“スティッキー末端”は、１つ以上の対になっていないヌクレオチドを有する張り出した鎖を有する末端を称する）。
一次核酸は、任意の長さのヌクレオチドであり得る。例えば、一次核酸は、長さにおいて少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、７５０、１０００、又は１５００ヌクレオチドであってよい。別の実施例では一次核酸は、長さにおいて、２〜１００，０００、５〜１００、０００、１０〜１００，０００、１５〜１００，０００、２０〜１００，０００、２５〜１００，０００、３０〜１００，０００、５０〜１００，０００、７０〜１００，０００、１００〜１００，０００、２００〜１００，０００、２〜１０，０００、５〜１０，０００、１０〜１０，０００、１５〜１０，０００、２０〜１０，０００、２５〜１０，０００、３０〜１０，０００、５０〜１０，０００、７０〜１０，０００、１００〜１０，０００、２００〜１０，０００、２〜５，０００、５〜５，０００、１０〜５，０００、１５〜５，０００、２０〜５，０００、２５〜５，０００、３０〜５，０００、５０〜５，０００、７０〜５，０００、１００〜５，０００、２００〜５，０００、２〜３，０００、５〜３，０００、１０〜３，０００、１５〜３，０００、２０〜３，０００、２５〜３，０００、３０〜３，０００、５０〜３，０００、７０〜３，０００、１００〜３，０００、２００〜３，０００、２〜１，０００、５〜１，０００、１０〜１，０００、１５〜１，０００、２０〜１，０００、２５〜１，０００、３０〜１，０００、５０〜１，０００、７０〜１，０００、１００〜１，０００、２００〜１，０００、２〜５００、５〜５００、１０〜５００、１５〜５００、２０〜５００、２５〜５００、３０〜５００、５０〜５００、７０〜５００、１００〜５００、又は２００〜５００ヌクレオチド塩基であり得る。
いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは、単一の鎖又は二本鎖であり得る。核酸テンプレートの単一の鎖は、本明細書においては“ポリヌクレオチド・テンプレート”と称される。本明細書において言及される“ポリヌクレオチド・テンプレート”は、その相補的配列との結合からは除外されない。言い換えると、“ポリヌクレオチド・テンプレート”は、例えば、単鎖の核酸テンプレートの全体であり得るか、又はそれは二本鎖の核酸テンプレートの１つの鎖であり得る。核酸テンプレートは一次核酸分子内に含まれ得る。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは一次核酸分子の全体を構成し得る。他の実施形態では、核酸テンプレートは、前記核酸テンプレートの一部ではない、１つ以上のヌクレオチドを含む、一次核酸の中に含まれ得る（例えば、前記核酸テンプレートは、前記核酸テンプレートを含む一次核酸よりも、長さにおいて短いことができる）。
核酸テンプレートは、任意の長さのヌクレオチドであり得る。例えば、核酸テンプレートは、長さにおいて、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、７５０、１０００、又は１５００ヌクレオチドであり得る。別の実施例では核酸テンプレートは、長さにおいて、２〜１００，０００、５〜１００，０００、１０〜１００，０００、１５〜１００，０００、２０〜１００，０００、２５〜１００，０００、３０〜１００，０００、５０〜１００，０００、７０〜１００，０００、１００〜１００，０００、２００〜１００，０００、２〜１０，０００、５〜１０，０００、１０〜１０，０００、１５〜１０，０００、２０〜１０，０００、２５〜１０，０００、３０〜１０，０００、５０〜１０，０００、７０〜１０，０００、１００〜１０，０００、２００〜１０，０００、２〜５，０００、５〜５，０００、１０〜５，０００、１５〜５，０００、２０〜５，０００、２５〜５，０００、３０〜５，０００、５０〜５，０００、７０〜５，０００、１００〜５，０００、２００〜５，０００、２〜３，０００、５〜３，０００、１０〜３，０００、１５〜３，０００、２０〜３，０００、２５〜３，０００、３０〜３，０００、５０〜３，０００、７０〜３，０００、１００〜３，０００、２００〜３、０００、２〜１，０００、５〜１，０００、１０〜１，０００、１５〜１，０００、２０〜１，０００、２５〜１，０００、３０〜１，０００、５０〜１，０００、７０〜１、０００、１００〜１，０００、２００〜１，０００、２〜５００、５〜５００、１０〜５００、１５〜５００、２０〜５００、２５〜５００、３０〜５００、５０〜５００、７０〜５００、１００〜５００、又は２００〜５００のヌクレオチド塩基であり得る。
本明細書において用いられる“プライマー”は、ポリヌクレオチドであって、ｉ）オリジナルの核酸鎖にハイブリダイズする能力があり、及びｉｉ）新しい核酸鎖の合成のための開始点として作用し、前記新しい核酸鎖は、プライマーの伸長された生成物であり、及びオリジナルの鎖に対して相補的である。プライマーは、その３’末端に遊離したＯＨ基（水酸基）を持つことができ、これは伸長生成物のための合成の始原として機能し得る。
プライマーは、標準的ヌクレオチド[例えば、標準的ＤＮＡデオキシリボヌクレオチド
（デオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシンン一リン酸、チミジン一リン酸、デオキシシチジンン一リン酸）又は標準的ＲＮＡリボヌクレオチド（アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、シチジン一リン酸）]、代替的なヌクレオチド
（例えば、イノシン）、修飾されたヌクレオチド、ヌクレオチド・アナログ、又はそれらの組み合わせを含む。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、ペプチド核酸、モルフォリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）（例えば、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴ）、ロックされた核酸[例えば、Ｋａｕｒ、Ｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５（２３
）、７３４７〜５５（２００６）を参照されたい]、グリコール核酸、又はトレオース核
酸を含み得る。プライマーは、例えば、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合（架橋していないＯがイオウにより置換される）、又はペプチド結合（ペプチド核酸の一部として）を含むバックボーンを有し得る。代替的なヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、及びヌクレオチド・アナログは、本明細書では集合的に“非標準的ヌクレオチド”と称される。
プライマー中での非標準的ヌクレオチドの存在は、プライマーの様々な性質に影響し得る。いくつかの実施形態では、プライマー中への非標準的ヌクレオチドの包含は、その相補的配列に対するプライマーの熱力学的な安定性を増加し得るか、又は減少し得る。例えば、増加した熱力学的安定性を有するプライマーは、ロックされた核酸を含み得る。減少した熱力学的安定性を有するプライマーは、例えば、イノシン（Ａｕｅｒら、Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４；５０２１〜５０２５（１９９６）に記載される）又はカルボキシル基等の負に荷電した化学基を含み得る。
本明細書において提供される第一のプライマー又は第二のプライマーは、任意の長さのものであり得る。前記第一のプライマー及び第二のプライマーは同じ数のヌクレオチドを含み得るか、又は異なる数のヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では第一の又は第二のプライマーは、長さにおいて、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、７５０、１０００、又は１５００ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では第一の又は第二のプライマーは、長さにおいて２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、７５０、１０００、又は１５００ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態では第一の又は第二のプライマーは、長さにおいて、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、７５０、又は１０００ヌクレオチドの最小値を有し、及び長さにおいて３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、７５０、１０００、又は１５００ヌクレオチドの最大値を有する範囲から選択される長さを有し得る。
本明細書において提供される、第一のプライマー又は第二のプライマーのテール領域は任意の長さのものであり得る。典型的には、同じテンプレートに向けられる、第一のプライマー及び第二のプライマーのテール領域は同じ数のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記第一の又は第二のプライマーのテール領域は、長さにおいて、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、７５０、１０００、又は１５００ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では前記第一の又は第二のプライマーのテール領域は、長さにおいて、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、７５０、１０００、又は１５００ヌクレオチドを超え得る。いくつかの実施形態では前記第一の又は第二のプライマーのテール領域は、長さにおいて、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、７５０、又は１０００ヌクレオチドの最小値を持ち、及び長さにおいて、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、７５０、１０００、又は１５００ヌクレオチドの最大値を有する範囲から選択された長さを有し得る。
本明細書において提供される、第一のプライマー又は第二のプライマーのテンプレート結合領域は、任意の長さのものであり得る。同じテンプレートに向けられる、前記第一のプライマー及び第二のプライマーのテンプレート結合領域は、同じ数のヌクレオチドを含み得るか、又は異なる数のヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では前記第一の又は第二のプライマーのテンプレート結合領域は、長さにおいて、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、７５０、１０００、又は１５００ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では前記第一の又は第二のプライマーのテンプレート結合領域は、長さにおいて、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、７５０、１０００、又は１５００ヌクレオチドを超え得る。いくつかの実施形態では前記第一の又は第二のプライマーのテンプレート結合領域は、長さにおいて、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、７５０、又は１０００ヌクレオチドの最小値を持ち、及び長さにおいて、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、７５０、１０００、又は１５００ヌクレオチドの最大値を持つ範囲から選択される数を有し得る。
いくつかの実施形態では、プライマーは、任意の長さであることができ、及び前記プライマーを含む方法又はそのステップに対して用いられる温度において、前記プライマーの相補体に対する十分に安定な、及び特異的なアニーリングを許容する任意のヌクレオチド配列を含み得る。プライマーの所望される厳密な長さは、反応の温度、前記プライマーの化学的組成、及び前記プライマーを含む反応を含む様々な因子に依存し得る。いくつかの実施形態では、前記プライマーのテンプレート結合領域は、任意の長さのものであることができ、及び前記プライマーを含む方法又はそのステップに対して用いられる温度において、前記プライマーのテンプレート結合領域がその相補体に対する十分に安定な、及び特異的なアニーリングを許容する任意のヌクレオチド配列を含み得る。前記プライマーのテンプレート結合領域の所望される厳密な長さは、反応の温度、前記プライマーの化学的組成、及び前記プライマーを含む反応を含む様々な因子に依存し得る。前記プライマーへの１つ以上の非標準的ヌクレオチドの包含は、本明細書において提供される方法で使用される前記プライマーの所望の長さを、非標準的ヌクレオチドを欠く対応するプライマーの長さに比較して変化させ得る。例えば、もし本明細書において提供される方法で、特定の融解温度（“Ｔｍ”）を持つプライマーを有することが望まれる場合、いくつかの実施形態では、前記プライマーが、少なくともいくつかの非標準的ヌクレオチドを含む場合には、選択されたＴｍを持つプライマーは、標準的ヌクレオチドのみを含むプライマーと比較した場合に、より短い長さのものになり得る。一般的に、ヌクレオチド配列の“融解温度”は、クレオチド配列を有する核酸の５０％が、その相補的配列とペアーを形成するものに基づき（即ち、二本鎖の分子中にあり）、及びヌクレオチド配列を有する核酸の５０％が、単鎖の形態中にある温度を指す。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される第一のプライマー又は第二のプライマーの一つ又は両方は、標的核酸配列内の内部モチーフ（即ち、ヌクレオチド配列）に相補的である、前記プライマーのテール領域におけるヌクレオチド配列を含むようにデザインされ得る。例えば、再度図１を参照するが、第一のプライマーテール領域１０５は、二本鎖核酸テンプレート１０４の第二の鎖における内部モチーフ、前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長生成物１１１、又は前記第一のプライマー１１３の第二のコピーの伸長生成物に相補的な、ヌクレオチド配列を含み得る。同様に、未だに図１を参照するが、第二のプライマーのテール領域１０６は、二本鎖核酸テンプレート１０３の第一の鎖の中の内部モチーフ又は前記第二のプライマーの伸長生成物１１２に相補的な、ヌクレオチド配列を含み得る。プライマーのテール領域において、標的核酸配列内の内部モチーフに相補的なヌクレオチド配列を有する、少なくともいくつかの状況は、本明細書に記載される反応の速度又は特異性を増加させ得る。
理論に束縛されることなしに、プライマーのテール領域に、標的核酸配列内の内部モチーフに相補的なヌクレオチド配列を有することは、図９中に概観される機構に従って、反応の速度又は特異性を増加させ得ることが信じられる。簡潔さのために、図９及びこの機構は第一のプライマーの第一のコピーのみを参照して記載されているが、必要に応じて、第一のプライマー、第二のプライマー等の第二のコピーにも等しく適用され得る。更に、図９及びこの機構は、前記第二のプライマーの伸長生成物１１２にアニールする、前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長生成物１１１を参照して記載されるが、本明細書に記載されるプライマーの伸長生成物を含む他の分子にも、等しく適用され得る。さて図９に移るが、第一のプライマーのテール領域の少なくとも一部分は、前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長生成物１１１中の内部モチーフ９０２（バックスラッシュ様のもので塗りつぶされた）に相補的であり、前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長生成物（本明細書の他の部分に記載される）１１１中に統合され得る、ヌクレオチド配列９０１（市松模様で塗りつぶされた）を含み得る。前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長生成物１１１は、前記第二のプライマー１１２の伸長生成物にアニールされ得る。前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長生成物１１１及び前記第二のプライマー１１２の伸長生成物を含む二本鎖核酸が“ブリージング（ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）”する間、前記プライマーのテール領域９０１は、前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長生成物中に存在する前記内部モチーフ９０２の方に移動し、一次的にアニールすることができる。前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長生成物中に存在する前記内部モチーフ９０２への一次的なアニーリングの後に、前記プライマーのテール領域９０１は、前記第二のプライマー１１２の伸長生成物にアニールされた、オリジナルの位置に向かって戻ることができ、及び随意的に、それは、これらの配置の間を繰り返し前後に移動できる（図９中の矢印で示される）。テール領域のヌクレオチド配列９０１が前記内部モチーフ９０２にアニールしている間、前記第二のプライマーの伸長生成物１１２の３’末端における１つ以上のヌクレオチドは、脱アニール化されることができ、及び第一のプライマーの新しいコピー、又は別の二本鎖核酸（例えば、二次核酸）における相補性配列への結合が可能になる。前記第二のプライマーの伸長生成物１１２の３’末端における、１つ以上のヌクレオチドが、第一のプライマーの新しいコピー、又は別の二本鎖核酸（例えば、二次核酸）における相補性配列への結合する場合には、これらの事象のいずれも、例えば、前記第一のプライマーの新しい伸長生成物の形成（オリジナルの第一のプライマー伸長生成物を、その形成の間置換する）により、本明細書の他の部分に記載される反応の速度を増加させることができる。更に、前記第一のプライマー中に内部モチーフ９０２に相補的であるヌクレオチド配列９０１が無い場合でさえも、本明細書において提供される方法中の二本鎖核酸の中の相補性配列の間の“ブリージング”が、それでも存在し得る。しかしながら、二本鎖核酸が“ブリーズ”できる間の時間の量は、内部モチーフ９０２に相補的である、前記第一のプライマー中のヌクレオチド配列９０１がある場合に増大されることができ、及びこのことは、回り回って本明細書において提供される方法に従う反応の速度を増加させ得る。
実施形態では、内部モチーフは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、又は１００ヌクレオチドを含み得る。実施形態では、内部モチーフ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、又は１００未満のヌクレオチドを含み得る。実施形態では、内部モチーフは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は７５及び３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、又は１００未満のヌクレオチド（上限は下限を超える）を含み得る。典型的には、前記内部モチーフに相補的である、前記プライマー中のヌクレオチド配列は、前記内部モチーフ中におけるものと、同数のヌクレオチドを含む。更に、前記内部モチーフに相補的である、前記プライマー中のヌクレオチド配列は、前記内部モチーフに完全に相補的であり得るか、又は前記プライマー及び前記内部モチーフのヌクレオチド配列の間に１つ以上の非適合のヌクレオチドがあってよい。前記内部モチーフの開始は、伸長して、前記内部モチーフを含むプライマー伸長生成物を形成する、前記プライマーの３’末端ヌクレオチドから、任意の距離により分離されてよいが、典型的には前記プライマーの３’末端ヌクレオチドから、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、又は１００ヌクレオチドにより、分離されることができる。実施形態では、前記内部モチーフの開始は、伸長して、前記内部モチーフを含むプライマー伸長生成物を形成する、前記プライマーの３’末端ヌクレオチドから、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、又は１００未満のヌクレオチドにより分離され得る。実施形態では、前記内部モチーフの開始は、伸長して、前記内部モチーフを含むプライマー伸長生成物を形成する、前記プライマーの３’末端ヌクレオチドから、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は７５及び３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、又は１００未満のヌクレオチドだけ分離され得る（ここで上限は下限を超える）。
本明細書において用いられる、単一の標的核酸鎖／ポリヌクレオチドのテンプレートの文脈においては、“内部モチーフ”は、本明細書において提供される標的核酸を増幅するためにのプライマー対の１つのプライマーのテール領域が相補的である、前記標的核酸鎖の一部であり、及びプライマー対の他のプライマーのテール領域と同一又は同様なヌクレオチド配列を有する。従って、例えば、標的核酸中の前記内部モチーフが、５’から３’の方向においてＧＧＧＡＴＧＧＡのヌクレオチド配列を有する場合、本明細書において提供される方法に従って標的核酸を増幅するために用いられるプライマー対の１つのプライマーテール／第一の領域は、、５’から３’の方向においてＴＣＣＡＴＣＣＣのヌクレオチド配列（又は同様の配列）を有し、及び前記プライマーの対の他のプライマーのテール／第一の領域は、５’から３’の方向においてＧＧＧＡＴＧＧＡ（又は同様の配列）のヌクレオチド配列を有する。二本鎖の標的核酸の文脈においては、用語“内部モチーフ”は、上記で単一の鎖について記載されたように、２つの鎖のいずれかの関連する領域を指す。本明細書に記載されるプライマー伸長生成物の文脈においては、“内部モチーフ”は、その特定のプライマー伸長生成物を形成するために伸長された、プライマーのテール領域に対応する、前記プライマーの伸長生成物に相補的である、伸長生成物の一部を指す。更に、特定の鎖の中の“内部モチーフ”に相補的である、異なる鎖の中のヌクレオチド配列を称する場合には、その相補性配列は、本明細書においては、“内部モチーフ相補体”と称され得る。注目すべきは、２つの相補性核酸鎖が存在する状況では（例えば、２つの相補性プライマー伸長生成物を含む２本鎖分子におけるように）、おれぞれの鎖は、異なる“内部モチーフ”（異なる鎖の“内部モチーフ”は、互いに相補性である）を有するために、本明細書において提供される“内部モチーフ”の記載は、必要に応じて、関連する鎖又はプライマーを基準として資格を有する。例えば、核酸の第一の鎖が、５’−３’の順序において、Ｃ’−Ｂ−Ｃ−Ａ−Ｃ’の部分、及び前記核酸の第二の鎖が、５’−３’の順序において、Ｃ−Ａ’−Ｃ’−Ｂ’−Ｃの部分を有し、前記第一の鎖の部分Ｃ’が、前記第二の鎖のＣ部分にアニールされ、前記第一の鎖の部分Ａが前記第二の鎖の部分Ａ’にアニールされる等の二本鎖の核酸が記載されることができる。Ｉｆ前記第一の鎖の部分Ｃ’が本明細書において提供される前記プライマーのテール領域に対応し、及び部分Ｃ’は、部分Ｃに相補的であると、次いで前記第一の鎖の部分Ｃは、前記第一の鎖の“内部モチーフ”と称されることができ、及び前記第二の鎖の部分Ｃ’は、前記第一の鎖との関係において、“内部モチーフ相補体”と称されることができる。銅二次、前記第二の鎖の部分Ｃも、本明細書において提供される前記プライマーのテール領域に対応し、及びそれが部分Ｃ’に相補的であると、次いで、前記第二の鎖の部分Ｃ’は、前記第二の鎖の“内部モチーフ”と称されることができ、及び前記第一の鎖の部分Ｃは、前記第二の鎖との関係において、“内部モチーフ相補体”と称されることができる。
実施形態では、本明細書において提供される方法及び組成物は、図１０を参照して記載されることができる。図１０の特徴は、図１０のテンプレートが内部モチーフも含むことを除いて図８と一般的に同じ方法で記載されることができる。
ポリヌクレオチドのテンプレート１０００（図１０Ａ）は、増幅の標的であり得る。前記ポリヌクレオチドのテンプレート１０００は単一の核酸鎖である。前記ポリヌクレオチドのテンプレート鎖は、遊離状態、一本鎖分子、又はそれは、その中で前記ポリヌクレオチドのテンプレート鎖が、その相補性鎖にアニールされた２本鎖分子の一部として存在することができる。前記ポリヌクレオチドのテンプレート１０００は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。
前記ポリヌクレオチドのテンプレート１０００は、ｍａｙｃｏｎｔａｉｎ少なくとも第一の部分１００１（“（ｉ）”及び文字“Ａ”によっても示される）及び第二の部分１００２（“（ｉｉ）”及び文字“Ｂ”によっても示される）を含むことができる。前記第一の部分１００１及び第二の部分１００２のそれぞれは、図８において、前記テンプレートの第一の部分及び第二の部分について記載されたような、任意の数のヌクレオチドを含むことができる。前記第一の部分１００１及び第二の部分１００２は、同じ又は異なる数のヌクレオチドを含み得る。加えて、前記ポリヌクレオチドのテンプレート１０００は第三の部分１００３（“（ｉｉｉ）”及び文字“Ｃ”によっても示される）を含むことができ、この第三の部分は“内部モチーフと称される。この内部モチーフは、典型的には６〜１０ヌクレオチドを含むが、随意的には、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２ヌクレオチド、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０未満のヌクレオチド、又は少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２ヌクレオチド及び６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０未満のヌクレオチド（上限は下限を超えて）等の、他の数のヌクレオチドを含み得る。前記内部モチーフ１００３は、典型的には前記第一の部分１００１及び前記第二の部分１００２のいずれかの側から、２〜２５ヌクレオチドによって分離されるが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０ヌクレオチド、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は６０未満のヌクレオチド、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０ヌクレオチド及び２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は６０の間のヌクレオチド（上限は下限を超えて）等の、他の数のヌクレオチドによって分離されることもできる。実施形態では、前記第一の部分１００１及び前記内部モチーフ１００３の間に、前記第二の部分１００２及び前記内部モチーフ１００３の間と比較して（例えば、前記第一の部分及び前記内部モチーフの間に６ヌクレオチドがあることができ、及び前記第二の部分及び前記内部モチーフの間に６ヌクレオチドがあることができる）、同じ数のヌクレオチドがあることができる。他の実施形態では、前記第一の部分１００１及び前記内部モチーフ１００３の間に、前記第二の部分１００２及び前記内部モチーフ１００３の間と比較して（例えば、前記第一の部分及び前記内部モチーフの間に６ヌクレオチドがあることができ、及び前記第二の部分及び前記内部モチーフの間に８ヌクレオチドがあることができる）、異なる数のヌクレオチドがあることができる。実施形態では、前記内部モチーフ及び前記第一の部分１００１又は前記第二の部分１００２の間にヌクレオチドが無いことができる（例えば、実施形態では、前記内部モチーフは、前記第一の部分１００１又は第二の部分１００２の１つ又は両方に直接隣接できる）。
前記ポリヌクレオチドのテンプレート１０００は、第一のプライマー１０１０及び第二のプライマー１０２０を含む反応混合物中でインキュベートされ得る（図１０Ｂ）。典型的には、前記反応混合物は、例えば、前記プライマーのそれぞれの少なくとも４、５、６、１０、１５、２０、５０、１００、１０００、１０，０００、１００，０００、又は１００万を超えるコピー等の、それぞれのプライマーの複数のコピーを含む。前記第一のプライマー１０１０は第一の領域１０１１（“（ｉ）”によっても示される）及び第二の領域１０１２（“（ｉｉ）”によっても示される）を含み得る。前記第一のプライマーの第一の領域１０１１は５’末端を有することができ、及び前記第一のプライマーの第二の領域１０１２は３’末端を有することができる。前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第一のプライマー第二の領域のヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有し得る。前記第二のプライマー１０２０は、第一の領域１０２１（“（ｉ）”によっても示される）及び第二の領域１０２２（“（ｉｉ）”によっても示される）を有し得る。前記第二のプライマーの第一の領域１０２１は５’末端を有することができ、及び前記第二のプライマーの第二の領域１０２２は３’末端を有することができる。前記第二のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第二の領域のヌクレオチド配列とは、異なるヌクレオチド配列を有することができる。
前記第一のプライマーの第二の領域１０１２は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分１００１のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有し得る。図１０において、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分１００１のヌクレオチド配列は、文字Ａで表わされ、及び前記第一のプライマーの第二の領域１０１２のヌクレオチド配列は文字Ａ’で表わされ、ここでＡ及びＡ’は互いに相補性である。前記第二のプライマーの第二の領域１０２２は、パートナーのヌクレオチド配列１０３０に相補的なヌクレオチド配列を有することができ、このパートナーのヌクレオチド配列１０３０は前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分１００２のヌクレオチド配列に相補的である。図１０において、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分１００２のヌクレオチド配列は文字Ｂで表わされ、そのパートナーのヌクレオチド配列１０３０のヌクレオチド配列は、文字Ｂ’で表わされ、及び前記第二のプライマーの第二の領域１０２２のヌクレオチド配列は文字Ｂで表わされ、ここでＢ及びＢ’は互いに相補性である。言い換えると、図１０により示されるように、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分１００２のヌクレオチド配列（Ｂ）は、前記第二のプライマーの第二の領域１０２２のヌクレオチド配列（Ｂ）と同じであり得る。本明細書において提供される組成物及び方法により、パートナーのヌクレオチド配列１０３０が、例えば、前記第一のプライマーの３’末端からの伸長生成物の一部として形成され得る。実施形態では、前記第一のプライマーの第一の領域１０１１は、前記第二のプライマーの第一の領域１０２１に相補性である。図１０において、前記第一のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列は、文字Ｃにより表わされ、及び前記第二のプライマーの第一の領域ヌクレオチド配列は文字Ｃ’により表わされ、ここでＣ及びＣ’は互いに相補性である。
加えて、前記第二のプライマーの第一の領域１０２１は、前記ポリヌクレオチドのテンプレート中の内部モチーフ１００３に相補性であり得る。図１０において、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの内部モチーフ１００３のヌクレオチド配列は、文字Ｃで表わされ、ここでＣ及びＣ’は互いに相補性である。従って、図１０により示されるように、実施形態では、前記第一のプライマーの第一の領域１０１１は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの内部モチーフ１００３と同じヌクレオチド配列を有することができる一方で、ｗｈｉｌｅ前記第二のプライマーの第一の領域１０２１は、前記内部モチーフ１００３に相補的な配列を有する。加えて、前記第二のプライマーの第一の領域１０２１は、前記第一のプライマーの第一の領域１０１１及び前記内部モチーフの両方に相補的である一方で、前記第一のプライマーの第一の領域１０１１は、前記第二のプライマーの第一の領域１０１１及び前記内部モチーフ相補体に相補的である。
実施形態では、図１０の前記第一のプライマー及び第二のプライマーは、それぞれ、本明細書の他の部分に記載される（例えば、図１又は８における）前記第一のプライマー及び第二のプライマーの任意の特性を有し得る。更に、実施形態では、図１０の前記第一のプライマーの第一の領域は、本明細書の他の部分に記載される、第一のプライマーのテール領域の任意の特性を有し得る。実施形態では、図１０の前記第一のプライマーの第二の領域は、本明細書の他の部分に記載される第一のプライマーのテンプレート結合領域の任意の特性を有し得る。実施形態では、図１０の前記第二のプライマーの第一の領域は、本明細書の他の部分に記載される、第二のプライマーのテール領域の任意の特性を有し得る。実施形態では、図１０の前記第二のプライマーの第二の領域は、本明細書の他の部分に記載される第二のプライマーのテンプレート結合領域の任意の特性を有し得る。
実施形態では、ポリヌクレオチドのテンプレート１０００、第一のプライマー１０１０の少なくとも２つのコピー、及び第二のプライマー１０２０の少なくとも２つのコピーを含む反応混合物は、本明細書の他の部分に記載されるポリメラーゼに基づく核酸合成を支援する１つ以上の他の成分（例えば、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、緩衝液、水等）を含み得る。同様に、ポリヌクレオチドのテンプレート１０００、第一のプライマー１０１０の少なくとも２つのコピー、及び第二のプライマー１０２０の少なくとも２つのコピーを含む反応混合物は、本明細書の他の部分に記載核酸テンプレートの増幅又はコンカテマーの形成を支援する任意の反応条件においてインキュベートされ得る。
実施形態では、本明細書に記載される反応混合物中での、ポリヌクレオチドのテンプレート１０００及び第一のプライマー１０１０の少なくとも２つのコピー、及び第二のプライマー１０２０の少なくとも２つのコピーのインキュベーションに際して、１つ以上のコンカテマー鎖が形成され得る（図１０Ｃ）。実施形態では、形成されたコンカテマー鎖１０４０は、５’末端及び３’末端を有することができ、及び５’から３’の方向において一般構造：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’を含む配列を有することができ、ここでＣ’は前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列であり、Ｔは前記ポリヌクレオチドのテンプレート配列又はその類似の配列であり、及びＸはヌクレオチドの任意の数及び配列である。図１０Ｃにより更に示されるように、５’から３’の方向において、鎖１０４０の前記ポリヌクレオチドのテンプレートの配列の中では、テンプレートの以下の部分の配列が存在する：Ｂ（前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分）、Ｃ（前記内部モチーフ）、及びＡ（前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分）。従って、図１０Ｃに示されるように、前記内部モチーフ／内部モチーフ相補体の配列は、実施形態では本明細書において提供されるコンカテマー鎖の複数の部分において生じている。特に、鎖１０４０においては、前記内部モチーフ相補体（Ｃ’）の配列は、コンカテマー鎖において、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの２つのコピー配列の間、及び前記鎖の末端に出現しており、及び前記内部モチーフ（Ｃ）の配列は前記ポリヌクレオチドのテンプレートの配列中の同じ鎖の中に生じている。従って、コンカテマー鎖１０４０の一般的構造により示されているように、コンカテマー鎖は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの配列の少なくとも２つのコピー、又はその類似の配列を含むことができ、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの配列のコピーは、少なくとも前記第二のプライマーの第一の領域配列により分離される。実施形態では、上記で提供された一般構造Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’中のＴは、前記ポリヌクレオチドのテンプレートと類似の配列であることができる。
実施形態では、本明細書において提供される方法に従って形成されたコンカテマー鎖１０４０は、一本鎖分子の一部分であり得る。他の実施形態では、本明細書において提供される方法に従って形成されたコンカテマー鎖１０４０は、二本鎖コンカテマーの一部であることができ、その二本鎖の中では、コンカテマー鎖１０４０は、コンカテマー鎖１０５０に相補的である鎖にアニールされている。図１０Ｃは、５’から３’の方向において、一般構造：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’（鎖１０４０）又はＣ−Ｔ’−Ｃ−Ｔ’−Ｘ’−Ｃ（鎖１０５０）を有する配列（ここでＸは０ヌクレオチドである）を有するコンカテマー鎖を図示する一方、図１０の図式に従って形成されたコンカテマー鎖は、本明細書の上記に、又は他の場所に記載されるコンカテマー鎖の任意の特性を有し得る。更に、図１０Ｃに示されるように、配列Ａ及びＢ及びＣは、テンプレート鎖の一部であり、及び従って一般構造Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’又はＣ−Ｔ’−Ｃ−Ｔ’−Ｘ’−Ｃの中では、個別に記録されない。
図１０実施形態での、要素の関係を更に示すために、ブロック１０６０、１０６２、１０６４、１０６６、及び１０６８が図１０中に提供される。ブロック１０６０（バックスラッシュ様の塗りつぶしを持つ）は、全体のポリヌクレオチドのテンプレート配列（即ち、要素１０００）の相対的な位置、又はその相補的配列の相対的な位置を示す。ブロック１０６２（垂直の線の塗りつぶしを持つ）は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分配列の相対的な位置（即ち、要素１００１の配列の相対的な位置）、又はその相補的配列の相対的な位置を示す。従って、ブロック１０６２も、要素１００１に相補的である前記第一のプライマーの第二の領域（即ち、要素１０１２）の配列を表す。ブロック１０６４（垂直及び水平の線の塗りつぶしを持つ）は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分の配列の相対的な位置（即ち、要素１００２配列の相対的な位置）、又はその相補的配列の相対的な位置を示す。従って、ブロック１０６４も、前記要素１００２に相補的である前記パートナーのヌクレオチド配列（即ち、要素１０３０）の配列を示す。ブロック１０６４も、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第二の部分（要素１００２）、又は同様の配列の配列と同じ配列であり得る、前記第二のプライマーの第二の領域１０２２の配列の相対的な位置を示す。言い換えると、実施形態では１０２２のヌクレオチド配列は、１００２のヌクレオチド配列と同一であるか、又は同様であり得る。例えば、図１０Ａ中に図示されるように、実施形態では、前記ポリヌクレオチドのテンプレート中には、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分、第二の部分、又は第三の部分（内部モチーフ）の部分ではないヌクレオチドが存在する。ブロック１０６６（波線の塗りつぶしを持つ）は、前記第一のプライマーの第一の領域の配列の相対的な位置（即ち、要素１０１１／領域“Ｃ”の配列の相対的な位置）、又はその相補的配列の相対的な位置を示す。従って、ブロック１０６６も、要素１０１１に相補的である、前記第二のプライマーの第一の領域（要素１０２１／領域“Ｃ’”）の配列を示す。加えて、ブロック１０６６も、前記内部モチーフ又はその相補的配列の相対的な位置を示す。注目すべきは、ｔｈｅｏｆ前記内部モチーフ配列又はその相補性配列の両方が前記第一の及び第二のプライマーのテール領域中と同様に、テンプレート配列中に存在することである。本明細書の他の部分に記載されるように、前記内部モチーフは、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの第一の部分又は第二の部分の１つ又は両方に直接的に隣接することができるか、又は前記内部モチーフ及び前記第一の部分又は前記第二の部分の間に追加的なヌクレオチドが存在することができる。ブロック１０６８（菱形の塗りつぶしを持つ）は、コンカテマー鎖（要素１０４０）の配列の相対的な位置、又はその相補的配列の相対的な位置を示す。従って、ブロック１０６８も、前記コンカテマー鎖（要素１０５０）に相補的である鎖の配列を表す。図１０Ｃ中に図示されるように、前記コンカテマー鎖又はその相補体（１０６８）の中には、前記第一のプライマーの第一の領域又はその相補体（１０６６）のヌクレオチド配列により分離された、前記ポリヌクレオチドのテンプレート配列又はその相補体（１０６０）の２つのコピーが存在する。前記ポリヌクレオチドのテンプレートのコピーを分離しているこの配列は、前記内部モチーフ又はその相補体（１０６６）の配列でもある。加えて、前記コンカテマー鎖又はその相補体（１０６８）の中では、前記第一のプライマーの第一の領域、又はその相補体（１０６６）のヌクレオチド配列が、前記ポリヌクレオチドのテンプレート配列、又はその相補体（１０６０）に、その両方の末端で隣接（ｆｌａｎｋ）している。更に、コンカテマー鎖又はその相補体（１０６８）の中には、前記第一のプライマーの第二の領域、又はその相補体（１０６２）の配列の２つのコピー、及び前記第二のプライマーの第二の領域又はその相補体（１０６４）の配列の配列２つのコピーが存在し、それらの両方とも、２つのコピーの中に、前記ポリヌクレオチドのテンプレート配列又はその相補体の２つのコピーの一部として存在する。ブロック１０６０、１０６２、１０６４、１０６６、及び１０６８は、図１０の要素との間に要求される、特定の何らかのサイズの関係を決定するものとして解釈されるべきではなく；むしろ、ブロックブロック１０６０、１０６２、１０６４、１０６６、及び１０６８は、本明細書において提供される、特定の実施形態における、図１０の要素の間の、互いに対する相対的な一般的な位置を示すことを単に助けるものである。
本明細書において提供されるプライマーは、任意の適切な方法により調製され得る。例えば、プライマーは、化学的に合成され得る。別の実施例では、本明細書に記載されるプライマーの一部を生成するか、又は一部になるために、天然の核酸が単離され、開裂され（例えば、制限酵素により）、及び／又は修飾され得る。
いくつかの実施形態では標識がプライマーに取りつけられ得る標識は、例えば、結合リガンド（例えば、ジゴキシン又はビオチン）、酵素、蛍光性分子／蛍光色素分子、発光性分子、消光剤分子、又は放射性同位体を含む。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドの塩基は２−アミノプリン等の蛍光性アナログにより置換され得る（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１、６６４４〜６６４８（１９９４）を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、ｉ）第一のプライマーの第一のコピーのテンプレート結合領域が、核酸テンプレート鎖にアニールし、ｉｉ）第二のプライマーのテンプレート結合領域が、第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物にアニールし、ｉｉｉ）第一のプライマーの第二のコピーのテンプレート結合領域が、第二のプライマーの伸長された生成物にアニールするか、又はｉｖ）二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物の３’末端領域が、二次核酸の第二のコピーの第二のプライマーの伸長された生成物の３’末端領域にアニールして、これらの鎖を含むクロスオーバー構造を生成することができる条件は、記核酸を、プライマー又は異なる核酸鎖が、二本鎖の分子の鎖の間に入り込むことを促進するために十分な程度に、及び前記プライマー又は異なる核酸鎖が、開裂した二本鎖の核酸分子の一本の鎖にアニールすることを許容するために十分な程度に、二本鎖の核酸分子の鎖が“呼吸”できる（即ち、塩基対を結合している水素結合の局所的な断裂を、短時間受ける）温度において、前記核酸を、インキュベートすることを、それぞれが、（即ち、ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、又はｉｖ）の任意のものが、）含み得る。いくつかの実施形態では、方法又はそのステップは、少なくとも１０、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、９０、又は９５Ｃの温度において遂行され得るか、又はインキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、方法又はそのステップは、１０、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、９０、又は９５Ｃ未満の温度において遂行され得るか、又はインキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、方法又はそのステップは、１０、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、又は９０Ｃ及び１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、９０又は９５Ｃの間の温度において遂行され得るか、又はインキュベートされ得る。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法又はそのステップに対して、前記ステップ又は方法は、関連する対を形成している可能性のあるヌクレオチド鎖、又はその領域（例えば、前記第一のプライマーのテンプレート結合領域対前記核酸テンプレートの第一の鎖、前記第二のプライマーのテンプレート結合領域対前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物、前記第一のプライマー対第二のプライマーの伸長された生成物、前記第二のプライマーの伸長された生成物の３’末端領域対その相補体、前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物の３’末端領域対その相補体等）の融解温度（Ｔｍ）未満の温度において遂行される。いくつかの実施形態では、方法又はそのステップ本明細書において提供される、前記ステップ又は方法は、前記ステップ又は方法は、関連する対を形成している可能性のあるヌクレオチド鎖、又はその領域（例えば、前記第一のプライマーのテンプレート結合領域対前記核酸テンプレートの第一の鎖、前記第二のプライマーのテンプレート結合領域対前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物、前記第一のプライマー対第二のプライマーの伸長された生成物、前記第二のプライマーの伸長された生成物の３’末端領域対その相補体、前記第一のプライマーの第一のコピー伸長された生成物の３’末端領域対その相補体等）の融解温度（Ｔｍ）未満の温度において遂行される。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法又はそのステップでは、前記ステップ又は方法は、関連する対を形成している可能性のあるヌクレオチド鎖、又はその領域（例えば、前記第一のプライマーのテンプレート結合領域対前記核酸テンプレートの第一の鎖、前記第二のプライマーのテンプレート結合領域対前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物、前記第一のプライマー対第二のプライマーの伸長された生成物、前記第二のプライマーの伸長された生成物の３’末端領域対その相補体、前記第一のプライマーの第一のコピー伸長された生成物の３’末端領域対その相補体等）のＴｍの温度又はＴｍ＋／−１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、又は２５Ｃの範囲内で遂行される。
いくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼは、本明細書において提供される方法又は組成物により含まれる。ポリメラーゼは、プライマーの伸長された生成物を生成し得る。前記プライマー及びその伸長された生成物は、テンプレート核酸鎖に相補的であり得る。一般的に、核酸ポリメラーゼは、前記プライマーの３’末端においてプライマーの伸長された生成物の合成を開始する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼが、本明細書において提供される方法又は組成物により含まれる。本明細書において用いられる、“ＤＮＡポリメラーゼ”は、ＤＮＡテンプレートに対して一次的又は唯一のポリメラーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを指す。いくつかの実施形態では、逆転写酵素が、本明細書において提供される方法又は組成物により含まれる。本明細書において用いられる、“逆転写酵素”は、ＤＮＡ鎖をＲＮＡテンプレートから合成できる核酸ポリメラーゼを指す。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼが、本明細書において提供される方法又は組成物により含まれる。本明細書において用いられる、“ＲＮＡポリメラーゼ”は、ＲＮＡ鎖をＤＮＡ又はＲＡＮテンプレートから合成できる核酸ポリメラーゼを指す。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるポリメラーゼは、鎖置換活性を有し得る。鎖置換活性を有するポリメラーゼは、例えば、ｅｘｏ−Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片（ＫｌｅｎｏｗＦｒａｇｍｅｎｔ）、ＶｅｎｔＲＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔＲＤＮＡポリメラーゼ、９ＮｍＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの大きな断片を含む。鎖置換活性を有する他のポリメラーゼも用いられ得る。
修飾されたポリメラーゼのバージョンも、修飾されたポリメラーゼが、配列依存性核酸合成活性を有する前提で、本明細書において提供される前記方法及び組成物により用いられ得る。修飾されたポリメラーゼのバージョン（“修飾されたポリメラーゼ”）は、例えば、前記ポリメラーゼの親のバージョンの配列から、１００以下、７０以下、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１０以下、５以下、４以下、３以下、２以下、又は１つの異なるアミノ酸を有し得る。いくつかの実施形態では、修飾されたポリメラーゼは、前記ポリメラーゼの親のバージョンの配列から、１０００、７００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２０、１０未満から、５を超えるか、それより５つ少ないアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾されたポリメラーゼは、親のポリメラーゼのフラグメントを含み得る。いくつかの実施形態では、修飾されたポリメラーゼは、ポリメラーゼから誘導された部分及び、非ポリメラーゼタンパク質から誘導された部分を持つ、キメラ・ポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、修飾されたポリメラーゼは、親のポリメラーゼと比較して、例えば、増加された触媒活性、増加された安定性、又は増加された熱安定性を有し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるポリメラーゼ、は熱安定性である。熱に安定なポリメラーゼは、例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、９０、１２０、又は１８０分の半減期を、最大２５、３０、３５４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５Ｃの温度において有し得る。いくつかの実施形態では、修飾されたポリメラーゼは熱に安定であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法及びそのステップは、ポリメラーゼに基づく核酸合成を支援するために十分な条件を含むか、又はその条件下で遂行され得る。ポリメラーゼに基づく核酸合成の例示的な条件は、当技術分野では周知であり及び、例えば、上記のＧｒｅｅｎ及びＳａｍｂｒｏｏｋの著書において提供される。ポリメラーゼに基づく核酸合成反応のための非限定的な成分は、以下の１つ以上を含み得る：ポリメラーゼ酵素（例えば、５０マイクロリットルの反応容積当たり０．０１〜１０単位の酵素の濃度の、又はその中の、５０マイクロリットルの反応容積当たり、例えば、０．０１〜１、０．１〜１０、０．１〜５、０．５〜１０、０．５〜５、０．５〜２、１〜１０、又は１〜５単位の酵素を含む任意の範囲の濃度の、ここで１単位の酵素は、７５Ｃにおいて、３０分で、１５ｎｍｏｌのｄＮＴＰを重合生成物に組み込める）；テンプレート（少なくとも、例えば、反応当たり、１、１０、１００、１，０００、１０，０００、又は１００，０００コピーの濃度における）；プライマー（例えば，０．０１〜１０マイクロモルの濃度、又はその中の任意の範囲、例えば、０．０１〜１、０．１〜１０、０．１〜５、０．５〜５、又は０．５〜２マイクロモルの濃度における）；ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰであって、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰのそれぞれに対して５０〜５００マイクロモル、又はその中の、例えば、５０〜３５０、１００〜５００、１００〜３００、２００〜５００、又は３００〜４００マイクロモルを含む任意の範囲のそれぞれのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ）；塩（例えば、１〜２００ミリモル、又はその中の、例えば、１〜１００、１〜５０、１〜２０、１〜１０、１０〜２０、１０〜５０、又は１０〜２００ミリモルを含む任意の範囲の濃度における、例えば、ＫＣｌ又は酢酸カリウム、）；緩衝液（例えば、１〜１００ミリモル、又はその中の、例えば、１〜５０、１〜２０、１〜１０、１〜５、１０〜１００、２０〜１００、又は５０〜１００ミリモルの任意の範囲の濃度における例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ又はＴｒｉｓ−酢酸、ｐＨ７．８〜８．５、）；及びマグネシウムイオン（例えば０．１及〜１０ミリモル、又はその中の、例えば、０．１〜５、０．１〜１、０．５〜１０、０．５〜５、又は０．５〜２．５ミリモルを含む任意の範囲の濃度における）。ポリメラーゼに基づく核酸合成反応のための、追加的な非限定的な成分は、前記反応の速度を増加させることができ、前記反応の忠実性を増加させ得るか、又は前記反応における酵素又はＤＮＡの安定性を増加させることができ、及びｍ以下の１つ以上を含み得る：ゼラチン（例えば，０．０００１％〜０．１％ｗ／ｖの間の濃度の）、ＢＳＡ（例えば，０．０１〜１マイクログラム／マイクロリットルの）、ショ糖（例えば０．０１モル〜０．８モルの濃度の）、トレハロース（例えば０．０１モル〜０．８モルにおける）、ＤＭＳＯ（例えば，０．０１〜１０％ｖ／ｖの濃度における）、ベタイン（例えば、０．１〜１０モルの濃度における）、ホルムアミド（例えば、０．１〜１０％ｖ／ｖの濃度における）、グリセロール（例えば、０．１及び２０％ｖ／ｖの濃度における）、ポリエチレングリコール（例えば、０．１及び２０％ｖ／ｖの濃度における）、非イオン性洗剤[例えば、ＮＰ−４０（例えば、０．０１及び１％ｖ／ｖの濃度におけるの濃度に
おける）]、Ｔｗｅｅｎ−２０（例えば、０．０１及び１％ｖ／ｖの濃度における）、又
はＴｒｉｔｏｎＸ−１００（例えば、０．０１及び１％ｖ／ｖの濃度における）]、アン
モニアイオン[例えば、硫酸アンモニウム（例えば、１及び１００ミリモルの濃度におけ
る）、及びＥＤＴＡ（例えば、０．００１及び０．１ミリモルの濃度における）。他の試薬も、本明細書において提供されるポリメラーゼに基づく核酸合成反応．中に存在し得る。例えば、ＲＮＡ反応生成物又は非標準的ヌクレオチドを含む反応生成物合成するために十分な試薬が用いられ得る。ポリメラーゼに基づく核酸合成を支持するために十分な条件は、様々な温度及びｐＨ値を含み得る。例えば、ポリメラーゼに基づく核酸合成反応のｐＨは、例えば６．５、７、７．５、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．５、９、又は９．５等のｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０であり得る。ポリメラーゼに基づく核酸合成反応の温度は、一定であっても、又は可変であってもよい。一定の温度は、例えば、２０、２５、３０、３５、３７、４０、４２、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又は８５Ｃ等の、１０Ｃ〜９５Ｃであり得る。変化される温度は、２０、２５、３０、３５、３７、４０、４２、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又は８５Ｃから選択される２つ以上の温度等の、例えば、１０Ｃ〜９５Ｃの２つ以上の異なる温度であり得る。
本明細書において提供される方法は、様々な温度において遂行され得る。いくつかの実施形態では、方法の全てのステップは、同じ温度で遂行され得る。従って、ＰＣＲ等における温度サイクリングは、本明細書で開示される方法では必要ない。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、２つ以上の異なる温度において遂行され得る。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法のための試薬を含む反応混合物は、２つ以上の異なる温度においてインキュベートされ得る。いくつかの実施例では、速度、正確性、又は本明細書において提供される方法の異なるステップの他の特徴を最適化するために、異なる温度が選択され得る。例えば、ポリメラーゼの酵素活性を増大させるために温度が選択され得る。いくつかの実施例では、プライマーのテンプレートに対する結合特異性を増加させるために、又はｔｏテンプレートのプライマーに対するアクセス可能性を増加させるために（例えば、より高い温度が、二本鎖テンプレート核酸の分離を促進し得る）異なる温度が選択され得る。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法の全てのステップは、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０又は１０°Ｃ未満の温度で行われる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、２０〜６０、３０〜７０、４０〜８０、２０〜４０、３０〜５０、４０〜６０、５０〜７０、６０〜８０、３０〜４０、３５〜４５、４０〜５０、４５〜５５、５０〜６０、５５〜６５°Ｃの温度で遂行され得る。特定の実施形態では、標的の核酸を含むサンプルは、本明細書において提供される方法の開始の前に、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は９５Ｃ未満の温度に加熱される。特定の実施形態では、本明細書において提供される反応混合物は、本明細書において提供される方法の開始前又は開始後に、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５Ｃを超える高い温度に一度加熱され得る。前記反応混合物を高い温度に加熱した後で、前記方法の遂行の残りの時間の間、本明細書の他の部分で提供されるより低い温度において維持され得る（例えば、４０〜７０Ｃの温度において）。実施形態では、本明細書において提供される方法の開始前に、反応混合物又はサンプルが高い温度まで加熱される場合、核酸ポリメラーゼは、前記反応混合物又はサンプルが高い温度に加熱された後で、前記反応混合物又はサンプルに加えられることができ、及び前記反応混合物又はサンプルは、本明細書において提供されるより低い温度に戻される。本明細書で開示される方法は、熱サイクルと共に、又はなしで遂行され得る。
１つの考察として、本明細書において提供される方法又はそのステップのために用いられる温度は、前記方法のステップの中で用いられる酵素にとって適切であるために選択され得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼが用いられる方法については、前記反応の温度は、前記ポリメラーゼの活性を有意に損なわないように選択される（例えば、前記反応の温度は、ポリメラーゼが、少なくとも２４、１２、６、４、３、２、１、０．７５、０．５、０．２５、又は０．１時間の半減期を持つように選択され得る）。代替的に、方法は、前記方法において、用いられる酵素の活性を損なう温度において遂行され得る（例えば、前記反応温度は、前記反応中の酵素が、２４、１２、６、４、３、２、１、０．７５、０．５、０．２５、又は０．１時間未満の半減期を有するように選択され得る）。いくつかの実施形態では、方法が、１つ以上の酵素の活性を損なう温度又は他の条件（例えば、ｐＨ）で遂行される場合、前記方法の開始後にの、１つ以上の間隔において、追加的な酵素が、損なわれた酵素の活性を補うために前記反応に加えられ得る。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法の１つ以上のステップは、同じ反応容器（例えば、チューブ、チップ、コンテナー等）で生じる。
本明細書において提供される方法のための試薬は、反応の開始において、すべて共に供給され得るか、又はそれらは順次に加えられることができ、１つ、２つ、又はより多くのステップの後に、新しい試薬が反応に加えられる。状況次第で、新しい試薬（例えば、酵素、プライマー）が、前記反応のコースの間に、基質に作用するために利用可能な試薬の量を増やすために、又は不活性化された試薬（例えば、酵素）の機能を置き換えるために、反応容器に加えられることができる。本明細書において提供される方法の反応の開始後の１つ以上の選択された時間間隔において、新しい試薬が、反応に加えられ得る（例えば、反応の開始後、１、３、５、７、１０、１５、２０、３０、４５、又は６０分で）。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法の１つ以上のステップは、同時に生じ得る。例えば、前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物の単一のコピーが生成された後で、第二のプライマーの伸長された生成物の複数のコピーが、前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物の単一のコピーから順次生成される。第二のプライマー伸長された生成物コピーが、前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物の単一のコピーから順次生成されるに連れて、前記第二のプライマー伸長された生成物個々のコピーは、例えば、前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物を生成するためのテンプレートとして機能し、二次核酸の成分となることができ、クロスオーバー構造の成分となることができ、又は第二のプライマー／第一のコンカテマー鎖の伸長された生成物の伸長された生成物の生成のための開始点となり得る。別の実施例では、二次核酸の２つのコピーは、第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物が核酸テンプレートの第一の鎖から生成されるのと同時に、クロスオーバー構造を生成し得る。別の実施例では、第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物の１つのコピーは、核酸テンプレートの第一の鎖から、第一のプライマーの第一のコピー伸長された生成物異なるコピーから前記第二のプライマーの伸長された生成物が生成されるのと同時に生成される。本明細書において提供される他のステップも、同時に生じ得る。加えて、本明細書において提供される、二本鎖の核酸テンプレートを含む方法及び組成物では、前記核酸テンプレートの、いずれかの鎖は、“第一の鎖”と見なされることができ、及び本明細書において提供される、プライマー対のいずれかのプライマーは、“第一のプライマー”と見なされ得る。従って、いくつかの実施例では、本明細書において提供される方法による、二本鎖の核酸の両方の鎖は、核酸の“第一の鎖”として、同時に用いられることができ、前記プライマー対の反対側のプライマーは、異なる“第一の鎖”に対する“第一のプライマー”として機能する。更に、本明細書において提供される方法に従って生成される様々な構造は、随意的に、本明細書において提供される方法の異なる経路に入り得る。例えば、実施形態では、本明細書の他の部分に記載されるクロスオーバー構造を形成するために、第一の二次核酸は、第二の二次核酸と対を形成し得る。他の実施形態では、第一の二次核酸は、第一のプライマーにより侵入されることができ、及び前記第二のプライマーの、その伸長された生成物は、前記第一のプライマーの新しい伸長された生成物の生成のためのテンプレートとして機能し得る。前記第一のプライマーの新しい伸長された生成物を生成するために、前記二次核酸の一部である、前記第一のプライマーの伸長された生成物は、置換される。別の実施例では実施形態では、第一のコンカテマーは、別のコンカテマーと対を形成して、クロスオーバー構造を形成する。他の実施形態では、第一のコンカテマーは、第一のプライマーにより侵入されることができ、及び前記第一のコンカテマー鎖は、新しい第二のコンカテマー鎖の生成のためのテンプレートとして機能し得る。新しい第一のコンカテマー鎖を生成するために、前記コンカテマーの一部である、前記第一のコンカテマー鎖は置換される。本明細書において提供される方法の間に、他の同様の事象も生じ得る。
本明細書において提供される反応及び組成物は、第一のプライマー、第二のプライマー、一次核酸、二次核酸、前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長生成物、前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長生成物、第二のプライマーの伸長生成物、クロスオーバー構造、コンカテマー等の複数のコピーを含み得る。従って、本明細書において提供される方法は、本明細書において提供される複数のステップが、同時に生じ、及びそのようなステップが関連する分子の複数のコピーにより生じ得るプロセスを含み得る。
いくつかの実施形態では、第一の及び第二のプライマーの２つ以上のセットは、本明細書において提供される方法又は組成物において提供され、それぞれのセットは第一のプライマー及び第二のプライマーを含み、及び異なるプライマーのセットは、異なる核酸テンプレートに対して相補的である。前記第一の及び第二のプライマーのセットにおける、テンプレート結合領域は、同じ二本鎖の核酸テンプレートの異なる鎖に対して相補的であり得る。典型的には、所定のセットにおける、前記第一の及び第二のプライマーテール領域は、他のプライマーセットの第一の及び第二のプライマーからの異なるテール領域からの、同じ方法又は組成物に用いられるために異なる非相補的配列を有するために、異なるプライマーからのプライマーテールのセットは相補的ではない。このことは、異なる核酸テンプレートから誘導された鎖を含むハイブリッドのクロスオーバー構造の生成を防止するために望ましい。代替的に、異なる核酸テンプレートから誘導された鎖を含む、ハイブリッドのクロスオーバー構造及びコンカテマーを生成するために、２つ以上の異なるプライマーのセットにおける前記第一の及び第二のプライマーのテール領域は相補的配列を有することができる。２つ以上のプライマーのセットの、本明細書において提供される方法又は組成物への包含は、同じ反応容器中での複数の異なる核酸テンプレートの同時の増幅を支持し得る。このことは例えば、サンプル中の、目的の複数のテンプレートを増幅するために、又はサンプル中の複数の異なるテンプレートの存在を検定するために有用であり得る。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、１００、２００、５００又はそれを超える第一の及び第二のプライマーのセットが本明細書において提供される方法では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、１００、２００、５００又はそれを異なる核酸テンプレートを増幅するために、又はその存在を検定するために提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法では、核酸テンプレートは、迅速に増幅され得る。例えば、いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは、前記方法の開始後の０．１、０．５、１、３、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、９０、１２０、又は１８０分以内に、少なくとも５００倍に増幅され得る。別の実施例では、いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは、前記方法の開始後の０．１、０．５、１、３、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、９０、１２０、又は１８０分以内に、少なくとも１０，０００倍に増幅され得る。別の実施例では、いくつかの実施形態では、前記方法の開始から、０．１分、０．５分、１分、３分、５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、９０分、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、又は２４時間以内に、核酸テンプレートは、前記方法の開始時点で、反応混合物中に存在していた、核酸テンプレートのオリジナルの量の少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、又は１，０００，０００倍に、増幅され得る。いくつかの実施形態では、方法が開始されたときに、前記方法第一のステップのための全ての試薬は、前記方法のための反応混合物を含む容器の中に存在する。いくつかの実施形態では、方法が開始されたときに、前記方法の全てのステップのための試薬の全てが前記方法のための反応混合物を含む容器中に存在する。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法では、核酸テンプレートは、線形速度よりも大きな速度において増幅され得る。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法では、核酸テンプレートは指数関数的に増幅され得る。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法では、核酸テンプレートは、前記方法の開始後の、１、２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、４５、６０、９０、１２０、１８０、又は２４０分毎に、数において少なくとも２倍になる。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは、前記方法の開始時点で、前記反応中に存在した前記核酸テンプレートのオリジナルの量の少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、又は１０，０００，０００倍に増幅される。
本明細書において提供される方法により生成されたコンカテマー中の核酸テンプレートの複数のコピーの存在は、本明細書において提供される方法に従った、核酸テンプレートの迅速な増幅に貢献し得る。とりわけ、核酸テンプレートの鎖の複数のコピーが、単一のコンカテマー鎖内に存在し得るので、単一のポリメラーゼの単一のコンカテマー鎖へのロード（ｌｏａｄｉｎｇ）は、前記ポリメラーゼが、前記コンカテマー鎖に沿って移動するに連れて前記核酸テンプレートの鎖の複数のコピーの生成をもたらし得る。ある場合には、核酸ポリメラーゼが、核酸鎖に遭遇し及びその上にロードするために必要な時間は、増幅反応全体の速度に大きく影響し得る。例えば、もし複製反応の間に、ポリメラーゼが遭遇する、それぞれの核酸鎖が、核酸テンプレートの鎖の単一のコピーのみを含む場合、ポリメラーゼは、前記テンプレートの鎖のコピーのそれぞれが生成された後に、新しいテンプレート鎖に遭遇して、その上にロードする必要がある。その一方で、コンカテマーに対しては、前記ポリメラーゼがコンカテマー鎖に遭遇して、その上にロードすると、それは、前記コンカテマー鎖を離れるか、又は別の鎖に遭遇して、その上にロードする必要なく、前記テンプレートの鎖の複数のコピーを合成できる。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるものは、単鎖の又は二本鎖のＲＮＡテンプレートからの、二本鎖のＤＮコンカテマーの生成のための、方法及び組成物である。前記方法は、本明細書において提供される方法にも、含まれ得る、逆転写酵素酵素（例えば、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＴＭ逆転写酵素、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩＴＭ逆転写酵素、又はＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔＴＭ逆転写酵素）を除いて、本明細書に記載されるように遂行されることができる。前記第一のプライマーの第一のコピーは、前記ＲＮＡテンプレートにアニールでき、及び前記逆転写酵素は、前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物を生成でき、これは逆転写のプロセスによるＤＮＡ鎖として生成される。ＲＮＡの逆転写のための方法及び条件は、当技術分野では周知であり、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＲＮＡ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｄ．Ｒｉｏら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１１）において開示されている。逆転写酵素酵素による、（ＲＮＡ鎖からの）前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物（ＤＮＡ鎖である）の生成の後に、コンカテマーの生成のための残りのステップは、本明細書の他の部分に記載されるものと同じであり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法及び組成物は、１つ以上の“バンピング・プライマー”（ｂｕｍｐｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ）を含み得る。バンピング・プライマーは、本明細書において提供される方法及び組成物とともに、例えば、反応生成物の生成の反応速度又は特異性を、例えば、核酸テンプレート第二の鎖が、核酸テンプレートの第一の鎖から置換される速度を増し、第一のプライマーの伸長生成物から核酸テンプレートの第一の鎖が置換される速度を増し、又は第二のプライマーの伸長生成物から置換される速度を増す。本明細書において用いられる“バンピング・プライマー”は、核酸テンプレートの第一の鎖又は第二の鎖の、第一のプライマー又は第二のプライマーのテンプレート結合領域が結合するものと同じ鎖の上の配列から下流の配列に相補的なプライマーを指す。従って、バンピング・プライマーが、第一のプライマー又は第二のプライマーがアニールするものと同じ核酸鎖にアニールする場合、前記バンピング・プライマーの３’末端は、前記第一のプライマー又は第二のプライマーの５’末端に向かって配向する（即ち、前記第一のプライマー又は第二のプライマーの５’末端ヌクレオチド及びテール領域）。核酸ポリメラーゼと、プライマー伸長生成物の生成を支援する条件下でインキュベートされたときに、バンピング・プライマーの伸長された生成物は、バンピング・プライマーの３’末端から、前記ポリメラーゼにより生成され得る。バンピング・プライマーの３’末端は、前記第一のプライマー又は第二のプライマーの５’末端に配向しているために、バンピング・プライマーの伸長された生成物は、長さにおいて増加しているために、それは最終的には、前記第一のプライマー又は第二のプライマーの５’末端に、伸長生成物として遭遇する。前記ポリメラーゼは、次いで前記第一のプライマー又は第二のプライマーを、前記第一のプライマー又は第二のプライマーのいかなる伸長された生成物とも同時に鎖から置換することができる。従って、反応本明細書において提供されるバンピング・プライマーは加速し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるものは、本明細書において提供される１つ以上の酵素、プライマー、又は他の試薬を含む容器である。容器は、液体又は固体の物質を支持するか、又は収容する能力を有する任意の構造を含むことができ、及びチューブ、コンテナ、チップ等を含み得る。いくつかの実施形態では、容器の壁は、壁を通過して光の透過を許容し得る。容器は光学的に透明であり得る。容器は、例えば、本明細書の他の部分に記載される単離された核酸ポリメラーゼ、単離されたＤＮＡポリメラーゼ、単離された逆転写酵素、第一のプライマー、第二のプライマー、核酸染料、又は核酸プローブ、の任意の１つ以上を含み得る。容器の内容物の任意の物の任意の数のコピーが提供され得る（例えば、第一のコピー、第二のコピー、第三のコピー等）。容器の内容物は流体連通にあり得る。いくつかの実施形態では、容器は、更に核酸テンプレートを含み得る。いくつかの実施形態では、容器は、更にヌクレオチド、緩衝液、塩、水、又は本明細書において提供される核酸の増幅のための他の試薬を更に含み得る。いくつかの実施形態では、容器は、２つ以上のプライマーのセットを含むことができ、それぞれのプライマーのセットは、第一の及び第二のプライマーを含むことができ、及び異なるプライマーのセットは、異なる核酸テンプレートに相補的である。
本明細書において提供される方法に対して有用な、２つ以上の試薬が、梱包され及びキットとして提供され得る。例えば、キットは、以下の任意の２つ以上を含み得る：核酸テンプレート、第一のプライマー、第二のプライマー、核酸ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、緩衝液、核酸染料、核酸プローブ、又は本明細書の他の部分に記載されるｄＮＴＰ。前記キットの中には、前記２つ以上の試薬が、別個の容器又は同じ容器の中に梱包され得る。いくつかの実施形態では、キットは、ヌクレオチド、緩衝液、塩、水、又は本明細書において提供される、核酸の増幅のための他の試薬を更に含み得る。
実施形態では、本明細書において提供される第一のプライマー及び第二のプライマーは、プライマーのセットとして一緒に提供され得る。前記プライマーのセットは、スタンドアローンのキット又は組成物として提供され得るか、又は前記プライマーのセットは、本明細書において提供される方法を遂行するための１つ以上の他の試薬と共にキットにおいて提供され得る。
いくつかの実施形態では、核酸リガーゼが、本明細書において提供される方法又は組成物に含まれ得る。リガーゼは、ヌクレオチドとの間の、典型的には１つのヌクレオチドの５’リン酸、及び別のヌクレオチドの３’水酸基の間のホスホジエステル結合の形成を触媒し得る。本明細書において提供される反応は、リガーゼを前記反応に組み込むことにより、リガーゼを含まない場合の反応と比べて、標的の核酸を、より大きな速度で増幅し得る。リガーゼは、例えば、本明細書において提供される反応に存在する、コンカテマーのサイズ又は数を増加させ得る。
核酸リガーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ リガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ ＤＮＡ リガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡ リガーゼ、ＡｍｐリガーゼＴＭ、Ｔ４ ＲＮＡ リガーゼ １、及びＴ４ ＲＮＡ リガーゼ２を含む。
連結反応を触媒するために、特定のリガーゼはＡＴＰを必要とする（例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ）か、又はＮＡＤ＋を必要とする（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ）。いくつかの実施形態では、リガーゼは、平滑な末端を有する核酸を連結する。いくつかの実施形態では、リガーゼは、スティッキー末端を有する核酸を連結し得る。いくつかの実施形態では、リガーゼは、平滑な及びスティッキー末端を有する核酸を連結し得る。
修飾されたバージョンのリガーゼは、修飾されたリガーゼが、ヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の生成を触媒する能力を有するという前提において、本明細書において提供される方法及び組成物により使用されることもできる。修飾されたバージョンのリガーゼ（“修飾されたリガーゼ”）は、例えば、その親の配列から、１００以下、７０以下、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１０以下、５以下、４以下、３以下、２以下、又は１つのアミノ酸が異なる、天然のバージョンのリガーゼを有し得る。いくつかの実施形態では、修飾されたリガーゼは、親のリガーゼよりも、１０００、７００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２０、１０、又は５つ以下のアミノ酸が少ないものを含み得る。いくつかの実施形態では、修飾されたリガーゼは、親のリガーゼの断片を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾されたリガーゼは、非リガーゼタンパク質から導出された、リガーゼ及び部分から導出された、キメラ性のポリペプチドを有し得る。いくつかの実施形態では、修飾されたリガーゼは、親のリガーゼに対して、例えば、増大された触媒的活性、増大された安定性、又は増大された熱的安定性を有し得る。
いくつかの実施形態では、リガーゼ本明細書において提供される、熱に安定なリガーゼは、例えば、最大２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５Ｃの温度下で、ｏｆ少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、９０、１２０、又は１８０分の半減期を有し得る。いくつかの実施形態では、修飾されたリガーゼは、熱に安定であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される、方法及び組成物に含まれるリガーゼは、修飾されたリガーゼ本明細書においては、“ｐ５０−Ｔｔｈ”と称され、以下のアミノ酸配列を有する：
リガーゼｐ５０−Ｔｔｈｈは、少なくとも６０Ｃの温度において、熱に安定な平滑末端連結反応活性を有する。リガーゼｐ５０−Ｔｔｈは、Ｈｉｓ１０−を含むリーダー配列、ヒトＮＦ−ｋａｐｐａ−Ｂタンパク質アクセッション番号ＮＰ＿００３９８９のアミノ酸４０〜３６６からのｐ５０配列（イタリック体で示される）、柔軟なグリシンに富む配列、及びＴｈｅｒｍｕｓＴｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＨＢ８、アクセッションＹＰ＿１４４３６３からのＴｔｈＤＮＡリガーゼ配列（下線により示される）を含むキメラ・タンパク質であり、本明細書において提供される方法及び組成物と共に用いられ得る（例えば、ｐ５０−Ｔｔｈリガーゼから、１００以下、７０以下、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１０以下、５以下、４以下、３以下、２以下、又は１つの異なるアミノ酸と共に）。実施形態では、本明細書において提供される方法組成物又と共に用いられるリガーゼは、両方とも参照により、その全体が全ての目的で本明細書に組み込まれる、２０１３年３月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／８０２，１２４号、又は２０１４年３月１５日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／３０００３号に記載されるリガーゼであり得る。
本明細書において提供される、核酸テンプレートの増幅／前記テンプレートの少なくとも２つのコピーを含むコンカテマーの生成のための様々な方法及び組成物は、等温的及び熱サイクル依存性核酸増幅のために、他の方法及び組成物により遂行されている機能の多くを満たすことができる。本明細書において提供される方法に従う増幅のための核酸テンプレートも、本明細書においては“標的の核酸”等と称される。本明細書において提供される方法及び組成物は、例えば、目的の核酸の単離及びクローニング、遺伝子発現の分析、核酸の診断的な同定、新規核酸の合成、核酸プローブ合成及びラベリング、被験者の法医学的な特定、被験者からの対立遺伝子の同定、遺伝的スクリーニング、核酸シークエンシング、及び関係する用途に用いられ得る。標的の核酸分子は単鎖の又は二本鎖の及びＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含むいかなるタイプの物でもよい。標的の核酸は、いかなるタイプの物でも、又はいかなる機能の物でもよい。（例えば、タンパク質コーディング配列、規制配列、イントロン等）。標的の核酸は、遺伝子の全体でも、又はその部分でもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法又は組成物は、選択された時間の期間の間にサンプルから形成された標的の増幅生成物の量を測定するために、又はサンプルからテンプレートの特定の数のコピーを生成するために必要な時間を決定するために、サンプル中の標的の核酸の量（その標的の存在又は不在を含む）を検出するために用いられ得る。本明細書において提供される方法及び組成物により使用されるサンプルは、本明細書の他の部分に記載され、及び、例えば、被験者の体液、分泌物、又は組織を含み得る。実施形態では、サンプルは、本明細書において提供される方法により、前記サンプル中の標的の核酸を増幅するために、前記サンプルを検定において使用することに先立って処理され得る。サンプルの処理は、本明細書の他の部分に記載される、いかなる処理のステップも含むことができ、及び例えば、超音波処理又は化学的な溶解ステップを含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、同じ反応容器中で、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、又はそれを超える異なる標的の核酸に対する検定のために同時に遂行され得る。典型的には、それぞれの標的の目的の核酸に対して、第一のプライマー及び第二のプライマーが提供され、そのそれぞれが、前記核酸標的の鎖に対して相補的であるか、又はその相補体に対して相補的である。異なる標的の核酸の同じ容器中での増幅は、例えば、異なる標的の核酸中の検出配列に対して特異的な配列を有する核酸プローブ、及び異なる蛍光色素分子の使用により監視され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法又は組成物は、標的の核酸（例えば、変異の場合又はＳＮＰ）中の目的の特定のヌクレオチドの、存在又は不在を検出するために用いられ得る。例えば、目的のヌクレオチドを含むか、それに隣接する、標的の核酸中の領域に選択的に結合する第一の又は第二のプライマーが選択され得る。前記プライマーは、それが選択的に：ｉ）その領域が、目的のヌクレオチドを含む場合に、その領域に結合するか、又はｉｉ）その領域が目的のヌクレオチドを含む場合に、その領域に結合しないかの、どちらかであることができるように設計され得る。本明細書に記載される方法は、選択されたプライマーにより遂行されることができ、及び増幅反応の結果は、前記標的の核酸中の、目的のヌクレオチドの存在又は不在に関する情報を提供し得る。例えば、もし、前記第一のプライマーのテンプレート結合領域が、目的の特定のヌクレオチド（例えば、変異）を含む、前記標的の核酸中の配列に相補的なヌクレオチド配列を持つために設計されている場合、サンプルから選択されたプライマーによる、前記標的の核酸の成功裏の増幅は、前記サンプル前記特定の目的のヌクレオチドを有する標的の核酸を含むことを示し得る。いくつかの実施形態では、標的の核酸中の目的のヌクレオチドの分析のために用いられたプライマーは、前記プライマーの３’末端に、必要不可欠なヌクレオチド（即ち、前記標的の核酸中の目的のヌクレオチドの同じ位置に対応するヌクレオチド）を含み得る。そのような場合には、前記プライマーの３’末端ヌクレオチドへのアニーリングは、前記標的の核酸中の目的のヌクレオチドの存在に依存し得る。もし前記プライマーの３’末端ヌクレオチドが、前記標的の核酸中のヌクレオチドにアニールしない場合（例えば、前記ヌクレオチドの間のミスマッチに起因して）、このミスマッチは、核酸ポリメラーゼが、前記プライマーから伸長された生成物を合成する能力を大きく損なう。従って、いくつかの実施形態では、目的のヌクレオチドに対応する、３’末端ヌクレオチドを有するプライマーは、標的の核酸中の特定のヌクレオチドの存在又は不在を決定するために有用であり得る。そのような実施形態においては、ある場合には前記プライマーの３’末端における、前記必要不可欠なヌクレオチドは、前記標的の核酸中の目的のヌクレオチドと相補的であるために選択されることができ、及びその他の状況においては、前記プライマー３’末端における不可欠なヌクレオチドは、前記標的の核酸中の目的のヌクレオチドに対しては非相補的であるために選択され得る。前記目的のヌクレオチドは、例えば、標的の核酸野生型、変異型、又は多型を表現する。（旧１８５）
他の実施形態では、標的核酸中の目的の特定のヌクレオチド（例えば、突然変異体又はＳＮＰ）は、目的のヌクレオチドが、第一の又は第二のプライマーテンプレート結合領域に対して相補性ではない領域中の標的核酸中に存在するようにプライマーを選択することにより検出され得る。例えば、目的のヌクレオチドは、標的核酸配列のほぼ真ん中に存在することができる。実施形態では、前記目的のヌクレオチドは、本明細書の他の部分に記載される“内部モチーフ”中に存在することができる。目的のヌクレオチドが内部モチーフ中にある場合、実施形態では、プライマー対は、内部モチーフ又はその相補体に相補的であり、及び前記標的配列中の内部モチーフ中の目的のヌクレオチドの存在又は不在のための検定に用いられ得る、前記プライマーのテール領域中のヌクレオチド配列を含むように調製され得る。本明細書の他の部分で説明されるように、前記プライマーのテール領域中のヌクレオチド配列の、そのプライマーの伸長生成物中の内部モチーフに対する一時的なアニーリングは、本明細書において提供される反応の速度を増加させ得る。ある状況では、前記プライマーのテール領域のヌクレオチド配列の、そのプライマーの伸長生成物中の内部モチーフに対する親和性が大きいほど、その反応は、より早く起こり得る。更に、典型的には、前記プライマーの伸長生成物中の内部モチーフ中のヌクレオチドに結合し得る、前記プライマーのテール領域中のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの数が大きいほど、伸長生成物中の前記内部モチーフについての伸長生成物のテール領域中のヌクレオチド配列に対する親和性が高くなる。従って、及び本明細書において提供される組成物及び方法により、実施形態では、標的配列中の目的のヌクレオチドの存在又は不在は、標的配列又はその相補体中の前記内部モチーフに結合でき、及び前記テール領域中では、前記内部モチーフ又はその相補体中の特定の目的のヌクレオチドに特異的に結合するヌクレオチドを有するか、又は有さない、前記プライマーのテール領域中のヌクレオチド配列を有するプライマーの使用を介して決定され得る。典型的には、前記プライマーのテール領域中のヌクレオチド配列が、前記標的中の目的のヌクレオチドに対応する、そのプライマーの伸長生成物中のヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドを含む場合に、前記プライマーのテール領域中の、関連するヌクレオチドが、前記標的中の目的のヌクレオチドに対応する、そのプライマーの伸長生成物中のヌクレオチドに相補性ではない場合よりも、反応はより早く生じる。例えば、標的核酸鎖の野生型の内部モチーフは、ヌクレオチド配列：５’ＴＡＴＴＧＣＡＴ３’を有し得る。しかしながら、配列中の“Ｇ”は、集団中の多くの個体が、前記配列中で、“Ｇ”又は他のヌクレオチドを有するかを決定するために、配列：５’ＡＴＧＣＡＡＴＡ３’の配列を有する、そのテール領域中のヌクレオチド配列を含むプライマーが調製され得る。もし、このプライマー（及び適切な第二のプライマー）が、本明細書において提供される方法に従う、標的核酸の増幅に用いられる場合、前記内部モチーフ中に“Ｇ”が存在する場合には増幅反応は、前記内部モチーフ“Ｇ”の部分に異なるヌクレオチドが存在する場合に比較して、特定の反応速度を有することができる。この理由は、前記プライマーのテール領域中のヌクレオチド配列で、前記内部モチーフ中に“Ｇ”が存在する場合には、前記内部モチーフに対して完全に相補性であるが、Ｇの正常な位置に“Ｇ”以外のヌクレオチドが存在する場合には、そうはならないためである。一般的に、個の実施例においては、もし“Ｇ”が前記内部モチーフ中に存在する場合、前記プライマーのテール領域は、前記内部モチーフに対して、“Ｇ”が存在しない場合に比べて、より高い頻度でアニールし、及びこのことは、回り回って“Ｇ”が存在する場合に、存在しない場合よりも、より速い反応を導く。及び本明細書において提供されるシステム及び方法では、プライマーは、目的のヌクレオチドの存在又は不在のいずれかを検定するために調製され得る（例えば、プライマーは、もし変異型のヌクレオチドが存在する場合に、野生型のヌクレオチドが存在するよりも、反応が、より迅速に生じることができるように調製され得るか、又はその逆も可能である）。更に、実施形態では、プライマーは、標的中の内部モチーフ中の目的の位置の未知のヌクレオチドの識別を決定できるように調製され得る。例えば、標的核酸中の目的のヌクレオチドび対して適切な対応をするＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣのいずれかのそれぞれを含む４つの異なるプライマー対が形成され得る。実施形態では、より速い反応結果を生じる、プライマー対が、標的核酸中の内部モチーフ中の目的の部分中にどのヌクレオチドが存在するかを示し得る。例えば、標的核酸は、５’から３’の方向において：ＧＴＡＡＣＧＡＧの配列を通常は有する内部モチーフを有し得る。しかしながら、標的核酸の異なる変異体は、前記内部モチーフ中の５番目の位置（即ち、“Ｃ”の位置）に、異なったヌクレオチドを有し得る。この実施例を続けるが、もし前記内部モチーフの５番目の位置にどのヌクレオチドが存在する不明である、標的核酸を含むサンプルが提供された場合、そのサンプルは少なくとも４つの部分に分割され、及びその４つの部分は第一の反応混合物、第二の反応混合物、第三の反応混合物、及び第四の反応混合物として用いられることができる。５’から３’の方向において、それぞれ：ＣＴＣＧＴＴＡＣ及びＧＴＡＡＣＧＡＧの配列を持ったテール領域を有するプライマーである、第一のプライマー対が前記第一の反応混合物に提供される。これらのテール領域は、もし“Ｃ”が、内部モチーフの５番目の位置に存在する場合には、前記内部モチーフ又はその相補体に完全に相補性である。従って、もし前記標的が、この反応混合物中で、最も速く増幅される場合には、そのことは前記標的中の内部モチーフ中の目的のヌクレオチドの位置に“Ｃ”が存在することを示す。５’から３’の方向において、それぞれ：ＣＴＣＡＴＴＡＣ及びＧＴＡＡＴＧＡＧの配列を持ったテール領域を有するプライマーである第二のプライマー対が、前記第二の反応混合物に提供される。これらのテール領域は、もし“Ｔ”が内部モチーフの５番目の位置に存在する場合には、前記内部モチーフ又はその相補体に完全に相補性である。従って、もし前記標的が、この反応混合物中で、最も速く増幅される場合には、そのことは前記標的中の内部モチーフ中の目的のヌクレオチドの位置に“Ｔ”が存在することを示す。５’から３’の方向においてそれぞれ：ＣＴＣＣＴＴＡＣ及びＧＴＡＡＧＧＡＧの配列を持つテール領域を有するプライマーである、第三のプライマー対が前記第三の反応混合物に提供される。これらのテール領域は、もし“Ｇ”が、内部モチーフの５番目の位置に存在する場合には、前記内部モチーフ又はその相補体に完全に相補性である。従って、もし前記標的が、この反応混合物中で、最も速く増幅される場合には、そのことは前記標的中の内部モチーフ中の目的のヌクレオチドの位置に“Ｇ”が存在することを示す。５’から３’の方向においてそれぞれ：ＣＴＣＴＴＴＡＣ及びＧＴＡＡＡＧＡＧの配列を持ったテール領域を有するプライマーである第四のプライマー対が、前記第四の反応混合物に提供される。これらのテール領域は、もし“Ａ”が、内部モチーフの５番目の位置に存在する場合には、前記内部モチーフ又はその相補体に完全に相補性である。従って、もし前記標的が、この反応混合物中で、最も速く増幅される場合には、そのことは前記標的中の内部モチーフ中の目的のヌクレオチドの位置に“Ａ”が存在することを示す。実施形態では、上記に一般的に記載された方法又は組成物は、随意的には、例えば、全ての可能なヌクレオチド変異体をスクリーンすることが望まれていない場合（例えば、目的の位置に、典型的には２つの異なるヌクレオチドが見出される場合）には、目的の位置におけるヌクレオチドに対して、２又は３つだけのの選択肢に対応するプライマー対を持つ、２又は３つだけの反応混合物を持つように調製されることができる。
実施形態では、標的核酸を含むサンプルは、少なくとも第一の及び第二の部分に分割されることができ、本明細書において提供される方法に従い、前記第一の部分が、第一のプライマー対を持つ第一の反応混合物中でインキュベートされ、及び前記第二の部分が、第二のプライマー対を持つ第二の反応混合物中でインキュベートされる。実施形態では、前記第一のプライマー対及び前記第二のプライマー対は、それぞれのプライマーのテール／第一の領域において単一のヌクレオチドの分だけ互いに異なる（例えば、前記第一の対の第一のプライマーの第一の領域の配列は、前記第二の対の第一のプライマーの第一の領域の配列とは、単一のヌクレオチド分だけ異なる）。前記プライマーのテール領域において異なる、この単一のヌクレオチドは、標的核酸中の目的のヌクレオチドの位置に対応し得る。前記第一の反応混合物中の標的核酸の増幅の量又は速度を、前記第二の反応混合物中のものと比較することにより、標的核酸中の目的のヌクレオチドの同一性が決定され得る。実施形態では、上記で概観した方法は、サンプルの第一の、第二の、第三の、及び第四の部分、並びに第一のプライマー対、第二のプライマー対、第三のプライマー対、及び第四のプライマー対により遂行されることができ、ｗｈｅｒｅｉｎ前記第一のプライマー対、第二のプライマー対、第三のプライマー対、及び第四のプライマー対は、プライマーのそれぞれのテール／第一の領域において、上述したように単一のヌクレオチド分だけ異なる。
実施形態では、 少なくとも第一の 標的核酸及び第二の 標的核酸が提供されることができ、前記第一の 標的核酸及び前記第二の 標的核酸は、本明細書の他の部分に記載される内部モチーフ の目的の位置における、単一のヌクレオチドにより異なる。 実施形態では、本明細書において提供される方法に従い、前記第一の 標的核酸 は、本明細書に記載されるプライマー対を含む第一の反応混合物 中でインキュベートされることができ、及び前記第二の 標的核酸 は、同じプライマー対を含む第二の反応混合物 中でインキュベートされ得る。前記第一の反応混合物中の前記第一の標的核酸の増幅の量又は速度を、前記第二の反応混合物中の前記第二の 標的核酸のもの、又は絶対的な値と比較することにより、本明細書の他の部分に記載される原理により、前記第一の 標的核酸及び前記第二の 標的核酸標的の１つ又は両方の中の目的のヌクレオチドの同一性が決定され得る。
加えて、実施形態では、本明細書に記載される、単一の目的のヌクレオチドを決定するための組成物又は方法は、複数のヌクレオチド突然変異体又は多型を決定するためにも使用され得る。
本明細書において提供される方法及び組成物は、核酸を含み得る任意のサンプルから核酸を増幅するために用いられ得る。サンプルの例としては、様々な流体サンプルが挙げられる。ある場合には、前記サンプルは、被験者からの体液サンプルであり得る。前記サンプルは、１つ以上の流体成分を含み得る。ある場合には、固体又は半固体のサンプルが提供され得る。前記サンプルは、前記被験者から採集された組織を含み得る。前記サンプルは、被験者の体液、分泌物、又は組織を含み得る。前記サンプルは、生物学的サンプルであり得る。前記生物学的サンプルは体液、分泌物、又は組織サンプルであり得る。生物学的サンプルの例は、限定はされないが、血液、血清、唾液、尿、胃液及び消化液、涙液、糞便、精液、膣液、腫瘍性組織から収集された間質液、眼液、汗、粘液、耳垢、脂、腺分泌物、呼気、髄液、毛髪、指の爪、皮膚細胞、血漿、鼻腔拭い液又は鼻咽頭洗浄液、髄液、脳脊髄液、組織、咽喉拭い液、生検体、胎盤液、羊水、臍帯血、リンパ液、体腔液、痰、膿、微生物相、胎便、母乳及び／又は他の排泄物を挙げることができる。前記サンプルは、ヒト又は動物から提供され得る。サンプル植物、微生物（例えば、ウイルス、バクテリア）、又は他の生物学的物質から提供され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法及び組成物は、ポイント・オブ・サービスの場所において遂行され得るか、又は用いられ得る（例えば、被験者の自宅又は勤務先、グローサリー・ストア、ドラッグ・ストア、クリニック、学校等）。本明細書において提供される方法及び組成物は、被験者の診断又は治療を支援するために被験者からのサンプル中の迅速な核酸の増幅を許容し得る。例えば、本明細書で提供される方法及び組成物は、被験者のために、ウイルス（例えば、インフルエンザ）又は微生物（例えば、連鎖球菌）等の病原体からの核酸の存在を試験するために用いられ得る。
実施形態では、本明細書において提供される方法及び組成物は、１つの病原体又は一つの病原体の特徴（例えば、病原体中の遺伝子又は遺伝子の変異体）を検出するために用いられ得る。本明細書において提供される方法又は組成物を用いて検出され得る病原体又はその特徴は、例えば、アシネトバクター・バウマンニ、ｂｌａＲＯＢ耐性遺伝子、ｂｌａＴＥＭ耐性遺伝子、ボルデテラ・ホルメシイ、バークホルデリア・セパシア、カンジダ・アルビカンス、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・ソルデリ、エンテロバクター・アエロゲネス、エンテロバクター・クロアカ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、大腸菌、肺炎桿菌、ＫＰＣ耐性遺伝子、レジオネラ・ニューモフィラ、ｍｅｃＡ耐性遺伝子、ｍｅｃＣ耐性遺伝子、モラクセラ・カタラーリス、マイコバクテリウム膿瘍、緑膿菌、霊菌、黄色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌（バンコマイシン耐性）ＶＲＳＡ、ストレプトコッカス・アガラクティエ（連鎖球菌Ｂ）、肺炎連鎖球菌、肺炎連鎖球菌（ペニシリン感受性）、化膿連鎖球菌、ｖａｎＡ耐性遺伝子、ｖａｎＢ耐性遺伝子、アデノウイルスＢ、アデノウイルスＣ、アデノウイルスＥ、ボカウイルス１＋３、ボカウイルス２＋４、パラ百日咳菌、百日咳菌、クラミジア肺炎、クロストリジウム・ソルデリ、コロナウイルス２２９Ｅ、コロナウイルスＨＫＵ１、コロナウイルスＭＥＲＳ、コロナウイルスＮＬ６３、コロナウイルスＯＣ４３、ヒトメタニューモウイルスＡ、ヒトメタニューモウイルスＢ、インフルエンザＡ−ＭＰ、インフルエンザＢ−ＭＰ、インフルエンザＨ１Ｎ１（２００９年）、新型インフルエンザ（季節的）、インフルエンザＨ３Ｎ２、インフルエンザＨ５Ｎ１、インフルエンザＨ７Ｎ９（ＨＡ遺伝子）、インフルエンザＨ７Ｎ９（ＮＡ遺伝子）、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、結核菌、マイコプラズマ肺炎、パラインフルエンザ１、パラインフルエンザ２、パラインフルエンザ３、パラインフルエンザ４ａ、パラインフルエンザ４ｂ、呼吸器合胞体ウイルスＡ（ＲＳＶＡ）、呼吸器合胞体ウイルスＢ（ＲＳＶＢ）、ライノウイルスＡ、ライノウイルスＢ、ライノウイルスＣ、風疹ウイルス、化膿連鎖球菌、カンジダ・アルビカンス、トラコーマクラミジア、ヒトパピローマウイルス、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＳＶ−１／２、マイコプラズマジェニタリウム、淋菌、梅毒トレポネーマ（梅毒）、膣トリコモナス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、ＨＩＶ、ＨＩＶ−１Ｍ群、ＨＩＶ−１グループＯ１、ＨＩＶ−１グループＯ３、ＨＩＶ−２、グループＡ、ＨＩＶ−２、Ｂ群、マイコプラズマ・ホミニス、プロテウスミラビリス、プロテウス・ペンネリ、プロテウス・ブルガリス、エス・腐性、ウレアプラズマリティクム、バチルス炭疽菌、ペスト菌、デング熱ウイルス、マラリア原虫、クルーズトリパノソーマ（シャーガス病）、西ナイルウイルス１、西ナイルウイルス２、ノロウイルス系統１、ノロウイルス系統２、エボラウイルスを含み得る。実施形態では、１、２、３、５、１０、２０、３０、５０、又はそれを超えるそのような病原体又はその特徴は、本明細書において提供される方法を用いて被験者から１つの単一のサンプルから検定され得る。実施形態では、すべての目的のためにその全体の参考としてここに援用され、２０１４年９月５日に提出された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／５４４２４、又は、２０１４年５月２０日に提出された米国仮特許出願第６２／００１０５０に記載されている核酸増幅に基づく検定又は検定パネルのいずれかは、本明細書に記載の核酸増幅を用いて遂行され得る。同様に、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／５４４２４、又は、米国仮特許出願第６２／００１、０５０に記載されている病原体又はその特徴のいずれかは、本明細書において提供される核酸増幅を用いて検定され得る。
実施形態では、インフルエンザパネルは、１つ以上のインフルエンザ株からの核酸の増幅のために本明細書において提供される方法を用いて遂行され得る。例えば、本明細書で提供される方法を用いて、１つ以上のインフルエンザＡ、インフルエンザＡＨ３Ｎ２、インフルエンザＡＨ５Ｎ１、インフルエンザＡＨ７Ｎ９−ＨＡ遺伝子、インフルエンザＡＨ７Ｎ９−ＮＡ遺伝子、又はインフルエンザＢからの１つ以上の核酸が増幅され得る。本明細書において提供される方法を用いて遂行され得る他のパネルは、例えば、１つの呼吸器パネル、１つの性感染症パネル、１つの血液媒介病原体パネル、又は１つの院内感染パネルを含む。これらのパネルのいずれかは、少なくとも２、３、４、５、１０、１５、又は２０の異なる病原体又は遺伝子のための検定を含み得る。
実施形態では、本明細書において提供される方法及び組成物は、インフルエンザＡウイルスの検出および細分類のために用いられ得る。インフルエンザＡ亜型は、２つのウイルス遺伝子、赤血球凝集素（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）の型に定義される。現在、１８の既知ＨＡ遺伝子（Ｈ１−Ｈ１８）及び１１の既知ＮＡ遺伝子（Ｎ１−Ｎ１１）がある。これらの遺伝子は、インフルエンザＡウイルスで異なる分子上に記号化される、及び、したがって、インフルエンザＡ亜型が異なるＨＡおよびＮＡ遺伝子のいずれかの組み合わせを搬送することが可能である。正確にインフルエンザＡウイルスを検出し、分類するためには、少なくとも２つ及び最大１８の既知ＨＡ遺伝子すべて、及び少なくとも２つ及び最大１１の既知のＮＡ遺伝子すべてのためにインフルエンザＡウイルスを含むことが知られ得る又は知られているサンプルを試験することが望ましい場合がある。実施形態では、１人の被験者からの単一のサンプルは、２つ以上の部分に分割され得る、及びその部分は各１８の既知ＨＡ遺伝子及び１１の既知のＮＡ遺伝子（すなわち、２９の異なるプライマー対）のための特定のテンプレート結合領域を有する本明細書で提供される反応条件下で培養され得る。実施形態では、１人の被験者からの単一のサンプルは、少なくとも２９の異なる部分に分けられ得る。前記第一の部分はＨ１のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第二の部分は、Ｈ２のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第三の部分は、Ｈ３のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第四の部分は、Ｈ４のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第五の部分は、Ｈ５のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第六の部分は、Ｈ６のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第七の部分は、Ｈ７のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第八の部分は、Ｈ８のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第九の部分は、Ｈ９のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第十の部分は、Ｈ１０のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第十一の部分は、Ｈ１１のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第十二の部分は、Ｈ１２のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第十三の部分は、Ｈ１３のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第十四の部分は、Ｈ１４のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第十五の部分は、Ｈ１５のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第十六の部分は、Ｈ１６のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第十七の部分は、Ｈ１７のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第十八の部分は、Ｈ１８のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第十九の部分は、Ｎ１のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第二十の部分は、Ｎ２のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第二十一の部分は、Ｎ３のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第二十二の部分は、Ｎ４のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第二十三の部分は、Ｎ５のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第二十四の部分は、Ｎ６のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第二十五の部分は、Ｎ７のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第二十六の部分は、Ｎ８のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第二十七の部分は、Ｎ９のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。前記第二十八の部分は、Ｎ１０のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。及び前記第二十九の部分は、Ｎ１１のために特定のテンプレート結合領域を有するプライマー対を用いて本明細書において提供される反応条件下で培養される。いくつかの実施形態では、本明細書の他の箇所に記載されるように、２、３、４、５又はそれを超える異なるＨＡ又はＮＡ亜型のためのプライマー対は、（例えば、１つの共通の容器内で）１人の被験者からの１つのサンプルの単一部分を用いて培養され得る、及び増幅反応の生成物は、配列特異的なプローブ（例えば、ＤＮＡプローブ又はＰＮＡプローブ）を用いて同定され得る。実施形態では、１つのパネルは、単一サンプルが少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、又は上記に記載のＨＡ及びＮＡ亜型の２９のすべてのためにプライマー対を用いて増幅反応のために用いられる。実施形態では、１つのパネルは１つ以上のＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、又はＮ９を増幅する反応を含み得る。実施形態では、インフルエンザＡ又はその亜型の検出のために本明細書において記載される１つのパネル又は方法は、更に、例えば、インフルエンザＡマトリックスタンパク質遺伝子（これは、すべてのインフルエンザＡ亜型に存在する。従って、適切なサンプル採取又は処理を確実にするために、１つのサンプル採取又は処理中に１つ以上の場所で追加され得る１つのサンプルのインフルエンザＡを同定するために用いられ得る。）、ヒトＲＮアーゼＰ（ヒトの被験者から適切なサンプル採取を確実にするため：非ヒト被験者については、他の適切な種特異的制御遺伝子が用いられ得る。）、又は急上昇核酸制御を検出するための試薬又は反応を含み得る。実施形態では、キットは前記方法のいずれかを遂行するために、又は上記に提供される前記パネルのいずれかのために提供され得る。
実施形態では、本明細書において提供される方法を用いて、プライマーの単一の対は、他の核酸増幅法（例えばＰＣＲ又はＬＡＭＰ）を用いて、プライマーの単一の対を用いて増幅され得るよりも、標的核酸配列のより多くの種類を増幅するために用いられる。例えば、実施形態では、前記プライマーのテンプレート結合領域及び前記テンプレート間に１、２、３、４、５又はそれ以上のヌクレオチドの不整合がある場合でさえ、本明細書において提供される方法によると、前記テンプレートを増幅するためのテンプレートに十分にアニールし得る。実施形態では、提供される１つの方法で用いられる少なくとも１つの第一のプライマー及びまた、任意で前記第二のプライマーの前記テンプレート結合領域の少なくとも６、８、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４％の前記ヌクレオチドがテンプレート配列中のヌクレオチドに対して相補性がない場合に、本明細書において提供される方法が遂行され得る。従って、本明細書において提供されるプライマーおよび方法の使用は、プライマーの同じ対により複数の類似しているが、異なる配列の増幅を容易にし得る。例えば、本明細書において提供されるプライマーおよび方法は、株は類似しているが、異なるヌクレオチド配列を有するインフルエンザＡの複数の異なる株の検出に有用であり得る。例えば、両方の株は、Ｈ１Ｎ１亜型として定義されるが、前記株は、わずかに異なるＨ１又はＮ１のヌクレオチド配列を有するインフルエンザＡの二つの異なる株であり得る。本明細書において提供される組成物及び方法を用いて、実施形態では、前記第一の株及び前記第二の株の両方が同じプライマー対を用いて増幅され得る。
更に、病原体から核酸の増幅のために用いられるプライマーは、本明細書において提供される方法に従って前記同じプライマー対を用いて１つの病原体の複数の異なる株の検出を更に援助するために、病原体の核酸中の高度に保存された領域に基づいて選択され得る。このような高度に保存された領域は、例えば、１つ病原体の複数の株にわたって目的の遺伝子の配列アラインメントによって同定され得る。例えば、ジェンバンクのＩＤ番号を持つＨＡ３配列：ＡＥＫ９８４００、ＡＢＧ４７８６２、ＡＥＯ００６８９、ＡＢＦ１７９５４、ＡＦＧ９９２３７、ＡＦＧ９９０２７、ＡＢＯ３３０６９、ＡＢＥ１２６２３、ＡＦＧ７２７９０、ＡＡＡ８７５５３、ＡＡＺ３８６０５、ＡＦＮ１９７００、ＡＢＢ０４３７１、ＡＢＣ３９８０５は、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡウイルスの異なる分離株からのものである。それにもかかわらず、プライマーの注意深い選択によって、そのような全てのＨＡ３の遺伝子は、本明細書において提供される方法に従ってプライマーの同じセットを用いて増幅され得る。例えば、５‘−３’の順序で配列を有するＨＡ３遺伝子の部分：ＡＡＣＣＴＣＡＣＴＡＣＧＴＡＡＧＴＣＴＴＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＴＴＡＣＣＣＡＣＧＴＡＧＡＣＴＡＧＡＧＴＡＡＴＡＡＣＴＣＧＡＡＡＡＧＧＧＴ（配列ＩＤ番号：９１）は、本明細書において提供される方法に従って、増幅のための１つの標的として選択され得る（前記配列はＲＮＡ形態よりむしろ、ＤＮＡで提供される）。この配列を説明すると、５’から３’の方向で、図１０の例では、これらの用語が用いられているように、前記第一の下線の配列は前記テンプレートの前記第二の部分、前記第二の下線の配列は内部のモチーフ、及び前記第三の下線の配列は前記テンプレートの前記第一の部分である。この及び他のそのような例では、本明細書において提供される方法に従って、前記テンプレートの前記第一の部分、前記テンプレートの第二の部分、及び内部モチーフのように機能する前記特定配列同様、増幅のための両方の総標的配列は、本明細書に記載されるプライマーは広範囲の関連した配列をうまく増幅するために用いられ得るように選択され得る。本明細書に記載される１つの第一のプライマーは、プライマーのテンプレート結合領域が上記テンプレートの前記最初の部分に相補的であり提供され得る、及び本明細書に記載される１つの第二のプライマーは前記プライマーのテンプレート結合領域が前記テンプレートの前記第二の部分に相補的である１つのパートナー配列に相補的であり提供され得る。任意に、前記プライマーは、更に、内部モチーフ又は１つのその相補的配列に対して相補性のテール領域を有し得る。このようなプライマーは、例えば、本明細書において提供される組成物又は方法で提供され得る。
本明細書において提供される方法を用いて、病原体または遺伝子が、例えば、１つのサンプル又は１つの反応混合物中のマイクロリットルあたり、１０００、５００、１００、５０、１０、５、２、または１より少ない低い濃度で確実に同定され得る。実施形態では、本明細書において提供される方法は、具体的には、病原体又は遺伝子の一種から核酸を増幅し得る、及び、関連する病原体又は遺伝子からの核酸を増幅しない。例えば、インフルエンザＡマトリックスタンパク質遺伝子を増幅するために本明細書において提供される検定は、インフルエンザＡの複数の異なる株からのこの遺伝子を増幅し得るが、インフルエンザＢからの遺伝物質を増幅しない。
実施形態では、本明細書において提供される方法は１つ以上の潜在的妨害物質の存在下でうまく遂行され得る。潜在的妨害物質の例は、ＢＳＡ、グルコース、ビリルビン、亜硝酸塩、ベータｈＣＧ、アセトン、低ｐＨ条件、高ｐＨ条件、アセトアミノフェン、アスピリン、プロゲスチン、エチニルエストラジオール、尿防腐剤、精液、個人的潤滑剤、避妊ゼリー、殺精子剤、フェミニン粉末、痔クリーム、ミコナゾール、ヒトゲノムＤＮＡ、ローション、ユニバーサル輸送媒体（ウイルス）、ＡＭＩＥＳ輸送培地（細菌）、血液、ムチン、アシクロビル、口唇ヘルペス治療、尿、糞便、ヘモグロビン、トリグリセリド、ＥＤＴＡ、ヘパリン、コレステロール、ガンマグロブリン、アンピシリン、ニコチン、コチニン、鼻スプレー、点鼻薬、又はそれらの任意の組み合わせを含む。実施形態では、本明細書において提供される方法は、ここにすべての目的において参考として援用される、２０１４年５月２０日に提出された米国仮特許出願第６２／００１、０５０号で提供されるように少なくとも同じ大きさの濃度である１つの潜在的妨害の存在下で遂行され得る。実施形態では、本明細書において提供される方法は、米国仮特許出願第６２／００１，０５０号で提供されるより最大で少なくとも１０％、２５％、５０％、または、１００％の濃度である１つの潜在的妨害物質の存在下で遂行され得る。
本明細書で開示される検定及び方法は、サンプルを処理するための機器、又はシステムの上で遂行され得る。本明細書で開示される検定及び方法は、直ちに、自動化された検定機器であり得るか、又は自動化された検定システムであり得る、サンプルを処理するための機器、又はサンプルを処理するためのシステムに組み込まれて用いられ得る。そのような機器、及びそのようなシステムは、本明細書で開示される方法の実施に対して有用であり得る。例えば、機器は、サンプルを受け取るために有用であり得る。機器は、サンプルを調製し、又は処理するために有用であり得る。機器は、サンプルに対する検定を遂行するために有用である。機器は、サンプルからのデータを取得するために有用であり得る。機器は、サンプルから得られたデータを送信するために有用であり得る。機器は、サンプルの処理又は検定の後のサンプルの廃棄に対して有用であり得る。
機器 は、システムの一部分であることができ、その構成要素がサンプル処理機器であり得る。 機器 はサンプル処理機器であり得る。サンプル処理機器 は、サンプルの収集、臨床検査のためにサンプルを調製するために、又は本明細書で開示される１つ以上の
試薬により方法を遂行することを促進するために構成され得る。 サンプル処理機器 は、サンプルからデータを取得するために構成され得る。サンプル処理機器 は、サンプルから取得されたデータを送信するために構成され得る。サンプル処理機器はサンプルからのデータを分析するために構成され得る。 サンプル処理機器は、サンプルから取得されたデータを分析するために 、別の機器、臨床検査施設、又は臨床検査施設に関係する個人と通信
被験者の体内又は体表上に配置されるために構成され得る。サンプル処理機器は、サンプルを被験者から、サンプルを直接的には、又は間接的にかのいずれかにより、受け取るために構成され得る。サンプルは、例えば、血液サンプル（例えば、指先穿刺、又は静脈穿刺、又は動脈血液サンプルから得られたサンプル）、尿サンプル、生検サンプル、組織切片、糞便サンプル、又は他の生物学的サンプル；水サンプル、土壌サンプル、食品サンプル、空気サンプル；又は他のサンプルであってよい。血液サンプルは、例えば、全血、血漿、又は血清を含み得る。サンプル処理機器は、前記機器の筐体を通じて、被験者からサンプルを受け取り得る。前記サンプル収集は、サンプル収集サイト、又は他の場所において生じ得る。前記サンプルは、サンプル収集サイトにおいて、前記機器に提供され得る。
いくつかの実施形態では、サンプル処理機器は、カートリッジを受け入れるか、又は保持するために構成され得る。いくつかの実施形態では、サンプル処理機器カートリッジを含む。前記カートリッジは、前記サンプル処理機器から取り外すことができる。いくつかの実施形態では、サンプルは、前記サンプル処理機器のカートリッジに提供され得る。代替的に、サンプルは、サンプル処理機器の別の部分に提供され得る。前記カートリッジ及び／又は機器は、サンプルを受け入れるために構成され得るサンプル収集ユニットを含み得る。
カートリッジはサンプルを含むことができ、及びサンプルの処理又は試験において使用するための試薬、サンプルの処理又は試験において使用するための使い捨て品、又は他の物質を含み得る。カートリッジは、本明細書で開示される方法を遂行するための、本明細書で開示される試薬を含み得る。カートリッジのサンプル処理機器への配置、又はその中へのカートリッジの挿入に続いて、前記カートリッジの１つ以上の成分が、前記サンプル処理機器の他の成分と流体連通にもたらされ得る。例えば、もしサンプルがカートリッジにおいて収集される場合、前記サンプルは、前記サンプル処理機器の他の部分に輸送され得る。同様に、もし１つ以上の試薬がカートリッジ上に提供されると、前記試薬は、前記サンプル処理機器の他の部分に移動され得るか、又は前記サンプル処理機器の他の成分が、前記試薬にもたらされ得る。いくつかの実施形態では、カートリッジの試薬又は成分は、カートリッジのオンボードに留まることができる。いくつかの実施形態では、チュービング又は保守管理（例えば、手動又は自動化された保守管理）を要する流体工学は含まれない。
サンプル又は試薬は、サンプル処理機器等の機器に輸送され得る。サンプル又は試薬は、機器内で移動され得る。サンプル又は試薬の、そのような移動は、カートリッジから機器までの連続的な流体の経路を提供することなしで達成され得る。サンプル又は試薬の、そのような移動は、機器内で、連続的な流体の経路を提供することなしで達成され得る。実施形態では、サンプル又は試薬の、そのような移動は、サンプル取扱いシステム（例えば、ピペット）により達成されることができ；例えば、サンプル、試薬、又はそれらの等分が、サンプル、試薬、又はその等分をその中に収容するチップを、前記サンプル処理機器上の場所又はその中の場所に、移動させるサンプル取扱いシステムに操作可能に接続された、ピペットチップ等の開放先端を持つ、輸送構成要成分に吸引され得る。前記サンプル、試薬、又はそれらの等分は、前記サンプル処理機器上の又は内の場所に預け入れられることができる。サンプル及び試薬、又は複数の試薬は、サンプル取扱いシステムを用いて、同様の様式で混合され得る。前記カートリッジの１つ以上の成分は、自動化された様式で、前記サンプル処理機器他の部分に移動され得るか、又はその逆も成り立ち得る。
サンプル処理機器等の機器は、流体取扱いシステムを有し得る。流体取扱いシステムは、サンプル等の液体の輸送、希釈、抽出、等分化、混合、及び他の活動を遂行し得るか、又はその遂行を支援し得る。いくつかの実施形態では、流体取扱いシステムは機器の筐体内に収納され得る。流体取扱いシステムは、流体の収集、送達、処理及び／又は輸送、乾燥試薬の溶解、液体の混合及び／又は液体と乾燥試薬の混合、と同時に、非流体成分、サンプル、又は物質の収集、送達、処理及び／又は輸送を可能にする。前記流体は、サンプル、試薬、希釈剤、洗浄剤、染料、又は前記機器により用いられ得る任意の他の流体であることができ、及び限定はされないが、均一な流体、異なる液体、エマルション、懸濁液、及び他の流体を含み得る。流体取扱いシステム、限定されずにピペットは、前記機器の周囲で、容器を輸送するためにも用いられることができる（その中に流体を含んでも、又は含まなくてもよい）。前記流体取扱いシステムは、液体を分注するか又は吸引し得る。前記サンプルは、流体中を浮遊する１つ以上の微粒子又は固体物体を含み得る。
実施形態では、流体取扱いシステムは、ピペット、ピペットチップ、注射器、毛細管、又は他の構成成分を含み得る。前記流体取扱いシステムは、内部表面及び外部表面及び開放末端を持つ部分を有し得る。前記流体取扱いシステムは、ピペットを含むことができ、これはピペット本体及びピペットノズルを含み、及びピペットチップを含み得る。ピペットチップは、ピペットノズルから取り外しできても、又はできなくてもよい。実施形態では、流体取扱いシステムは、ピペットチップに嵌合したピペットを用いることができ；ピペットチップは使い捨てであり得る。チップは、ピペットと嵌合した時に、液密の密封を形成し得る。ピペットチップは、１回、２回、又は又はそれ以上の回数用いられ得る。実施形態では、流体取扱いシステムは、ピペット又は同様の機器を、ピペットチップと共に、又はなしで、吸引、分注、混合、輸送、又はさもなければ、流体を取り扱うために用い得る。前記流体は、所望の場合に、流体取扱いシステムから分注され得る。前記流体は、分注される前に、例えば、ピペットチップにおける開口部から、ピペットチップに収納されることができる。実施形態では、又は使用中の例では、前記流体の全てが分注されることができ；他の実施形態では、又は使用中の例では、チップ内の前記流体の一部分は、分注され得る。ピペットは選択的に流体を吸入し得る。前記ピペットは、選択された量の流体を吸引し得る。前記ピペットは、前記チップ、又は容器内の前記流体を、撹拌する機構を作動する能力を有し得る。前記ピペットは、非液体形状である物質又は試薬を含む、混合のための継続的な流れのループを生成するチップ又は容器を組み込み得る。ピペットチップは、測定された複数の流体の同時の、又は２部の基質反応のような順次の送達等により、混合を促進することもできる。
前記流体取扱いシステムは、１つ以上の流体的に単離された、又は水圧駆動的に独立したユニットを含み得る。例えば、前記流体取扱いシステムは１つ、２つ、又はそれを超えるピペットチップを含み得る。前記ピペットチップは、流体を受け入れて拘束するために構成され得る。前記チップは、互いに流体的に単離され得るか、又は互いに水圧駆動的に独立し得る。それぞれのチップ内に含まれる流体は、流体的に分離されているか、又は互いに、他のチップの中の流体及び前記機器内の他の流体と、水圧駆動的に独立している。前記流体的に分離されたか、又は水圧駆動的に独立したユニットは、前記機器他の部分及び／又は互いにに対して相対的に移動し得る。前記流体的に分離されたか、又は水圧駆動的に独立したユニットは、個別に移動し得る。流体取扱いシステムは、１つ以上の基部又は支持部を含み得る。基部又は支持部は、つ以上のピペット又はピペットユニットを支持し得る。基部又は支持部は、前記流体取扱いシステムの１つ以上のピペットを互いに接続させ得る。
サンプル処理機器は、被験者から得られたサンプルに対するステップの処理を遂行するためか、又は活動を行うため構成され得る。サンプルの処理は、例えば、サンプル希釈、サンプルの等分への分割、抽出、試薬との接触、ろ過、分離、遠心分離、又は他の予備的な又は処理作業又はステップを含む、サンプル調製を含み得る。サンプル処理機器は、前記サンプルに対する、１つ以上のサンプル調製作業又はステップを遂行するために構成され得る。随意的に、サンプルは、化学的反応及び／又は物理的処理ステップのために調製され得る。サンプル調製活動又はステップは、以下の一つ以上を含み得る：遠心分離、分離、ろ過、希釈、富化、精製、沈殿、インキュベーション、ピペッティング、輸送、クロマトグラフィー、細胞溶解、血球計算、粉砕、破砕、活性化、超音波処理、マイクロカラム処理、磁気ビーズによる処理、ナノ粒子による処理、又は他のサンプル調製作業又はステップ。例えば、サンプル調製は、血液を血清及び／又は微粒子分画に分離するための１つ以上のステップ、又はその他の任意のサンプルを様々な成分に分離するための含み得る。サンプル調製は、血液サンプル、又は他の生物学的サンプル等のサンプルを希釈する及び／又は濃縮する１つ以上のステップを含み得る。サンプル調製は、抗凝血剤又は他の成分をサンプルに加えることを含み得る。サンプル調製は、サンプルの精製も含み得る。実施形態では、全てのサンプル処理、調製、又は検定行為又はステップは、単一の機器により遂行され得る。実施形態では、全てのサンプル処理、調製、又は検定行為又はステップは、単一の機器の筐体内で遂行され得る。実施形態では、ほとんどのサンプル処理、調製、又は検定行為又はステップは単一の機器により遂行され、及び単一の機器の筐体内で遂行され得る。実施形態では、多くのサンプル処理、調製、又は検定行為又はステップは、単一の機器により遂行され、及び単一の機器の筐体内で遂行され得る。実施形態では、サンプル処理、調製、又は検定行為又はステップは、２つ以上の機器により遂行され得る。
サンプル処理機器は、サンプルについて１つ以上の検定、及び前記サンプルからのデータを取得するために構成され得る。サンプル処理機器は、本明細書において提供される方法を追加的な検定と同様に遂行し得る。検定は、１つ以上の物理的な又は化学的な処理を含むことができ、及び１つ以上の化学的又は物理的な反応を実行することを含み得る。サンプル処理機器は、少量の体液サンプルに対して１つ、２つ以上の検定をを遂行するために構成され得る。本明細書の他の部分に記載されるように、１つ以上の化学的反応は、容積を有するサンプルに対して生じることができる。例えば、１つ以上の化学的反応は、フェムトリットル未満の容積を有するピルの中で生じ得る。一例では、前記サンプル収集ユニットは、血液又は間質液の単一の一滴以下に相当する体液サンプルを受け取るために構成され得る。実施形態では、サンプルの容積は大変少なく、その容積は、１０００μＬ、約５００μＬ、約２５０μＬ、約１５０μＬ、約１００μＬ、約７５μＬ、約５０μＬ、約４０μＬ、約２０μＬ、約１０μＬ、約５μＬ、約１μＬ、約０．５μＬ、約０．１Μｌ未満であるか、又はその他の小さな容積を下回るものである。実施形態では、全てのサンプル検定行為又はステップは、単一のサンプルについて遂行される。実施形態では、全てのサンプル検定行為又はステップは、単一の機器により遂行される。実施形態では、全てのサンプル検定行為又はステップは、単一の機器の筐体内で遂行される。実施形態では、ほとんどのサンプル検定行為又はステップは、単一の機器により遂行され、及び単一の機器の筐体において遂行され得る。実施形態では、多くのサンプル検定行為又はステップは、単一の機器により遂行されることができ、及び単一の機器の筐体内で遂行され得る。実施形態では、サンプル処理、調製、又は検定行為又はステップは、２つ以上の機器により遂行され得る。
サンプル処理機器は、サンプルに対して複数の検定を遂行するために構成され得る。いくつかの実施形態では、サンプル処理機器は本明細書において提供される方法、及び１つ、２つ、又はそれより多い追加的な検定を遂行するために構成され得る。実施形態では、サンプル処理機器は、単一のサンプルについて複数の検定を遂行するために構成され得る。実施形態では、サンプル処理機器は、単一のサンプルに対して複数の検定を遂行するために構成されることができ、前記サンプルは小量のサンプルである。例えば、少量のサンプルは、約１０００μＬ未満の、約５００μＬ、約２５０μＬ、約１５０μＬ、約１００μＬ、約７５μＬ、約５０μＬ、約４０μＬ、約２０μＬ、約１０μＬ、約５μＬ未満の、約１μＬ未満の、約０．５μＬ未満の、約０．１μＬ未満の、又は他の小量の容積の小量の容積であるサンプル容積サンプルを有し得る。処理機器は、単一のサンプルについて、多重化された検定を遂行する能力を有し得る。複数の検定は、同時に実行されることができ；順次に遂行されることができ；又はいくつかの検定が同時に実行さ得る一方で、他の物は順次に遂行され得る。１つ以上の対照検定及び／又は校正器（例えば、検定／試験のための校正器の制御の構成を含む）も前記機器に組み込まれることができ；対照検定及び校正器に対する検定は、サンプルに対して遂行される検定と同時に検定されることができるか、又はサンプルに対する検定の前、若しくは後に、遂行され得るか、又はそれらの任意の組み合わせであってよい。実施形態では、全てのサンプル検定行為又はステップは、単一の機器により遂行される。実施形態では、複数の検定行為又はステップの全ては、単一の機器の筐体内で遂行される。実施形態では、ほとんどのサンプル検定行為又は複数の検定ステップは、単一の機器により遂行され、及び単一の機器の筐体内で遂行され得る。実施形態では、多くのサンプル検定行為又は複数の検定のステップは、単一の機器により遂行され、及び単一の機器の筐体内で遂行され得る。実施形態では、サンプル処理、調製、又は検定行為又はステップは、２つ以上の機器により遂行され得る。
実施形態では、複数の検定の全てが短い時間間隔内で遂行され得る。実施形態では、そのような短い時間間隔は、約３時間、約２つの時間、約１時間、約４０分、約３０分、約２５分、約２０分、約１５分、約１０分、約５分、約４分、約３分、約２分、約１分未満、又は他の短い時間間隔を含み得る。
サンプル処理機器は、前記サンプルに関する１つ以上の信号を検出するために構成され得る。サンプル処理機器は、記サンプルの性質の１つ以上を特定するために構成され得る。例えば、前記サンプル処理機器は、検体の存在又は濃度（例えば、標的の核酸）又は複数の検体又は前記サンプル（例えば、体液、分泌物、組織、又は他のサンプル中の又はそれらを介して）の疾患状態を、検出するために構成され得る。代替的に、前記サンプル処理機器は、１つ以上の検体存在又は濃度を検出するために分析され得る信号（疾患状態を示す）か、又は前記サンプル中の疾患状態を、検出するために構成され得る。この信号は、前記機器のオンボードで分析され得るか、又はべちゅの場所で分析され得る。臨床検査を実行することは、分析又は収集されたデータの比較を含んでも、又は含まなくてもよい。
化学的反応又は他の処理ステップは、前記サンプルと共に、又は前記サンプルなしで遂行され得る。前記機器により調製され得るか、又は実行され得るステップ、検査、又は検定の例は、限定はされないが免疫検定、核酸検定（例えば、本明細書において提供される方法）、受容体に基づく検定、血球計算検定、比色検定、酵素的検定、電気泳動的検定、電気化学的検定、分光的検定、クロマトグラフィー的検定、顕微鏡的検定、局所的検定、熱量測定的検定、比濁的検定、凝集検定、放射性同位体検定、粘度測定検定、凝固検定、凝固時間検定、タンパク合成検定、組織学的検定、培養物検定、浸透圧検定、及び／又は他のタイプの検定、遠心分離、分離、ろ過、希釈、富化、精製、沈殿、粉砕、インキュベーション、ピペッティング、輸送、細胞溶解、又は他のサンプル調製行為又はステップ、又はそれらの組み合わせが挙げられる。前記機器により調製され得るか、又は実行され得るステップ、検査、又は検定は、顕微鏡法、血球計算、及び画像を調製するか、又は利用する他の技法を含む、画像化を含むことができる。前記機器により調製され得るか、又は実行され得るステップ、検査、又は検定の例は、更に織学、形態学、運動学、力学、及び／又は細胞に対するそのような評価を含むサンプルの状態の評価を更に含み得る。
機器は、全てのオンボードのステップ（例えば、単一の機器により遂行され得るステップ又は行為）を、短い時間の量において遂行する能力を有し得る。機器は単一のサンプルに対する全てのオンボードのステップを、短い時間の量において遂行する能力を有し得る。例えば、被験者からのサンプル収集データを送信するまで及び／又は分析までは、約３時間以下、２時間以下、１時間以下、５０分以下、４５分以下、４０分以下、３０分以下、２０分以下、１５分以下、１０分以下、５分以下、４分以下、３分以下、２分以下、又は１分以下を必要とし得る。サンプルを前記機器内に受け入れてから、前記機器からそのようなサンプルに関するデータを送信するまで、及び／又は分析までの時間の量は、タイプ又は前記サンプルに対して遂行されるステップ、検査、又は検定の数に依存し得る。サンプルを前記機器内に受け入れてから、前記機器からそのようなサンプルに関するデータを送信するまで、及び／又は分析までは、約３時間以下、２時間以下、１時間以下、５０分以下、４５分以下、４０分以下、３０分以下、２０分以下、１５分以下、１０分以下、５分以下、４分以下、３分以下、２分以下、又は１分以下を必要とし得る。
機器は、サンプルを処理又は検定した後に、生物学的サンプルなどのサンプルを廃棄のために準備するか、若しくは廃棄のために構成され得る。
実施形態では、サンプル処理機器は、サンプルから得られたデータを送信するために構成され得る。実施形態では、サンプル処理機器は、ネットワークを通じて通信するために構成され得る。サンプル処理機器は、ネットワークと連結できるための通信モジュールを含み得る。サンプル処理機器は、有線接続又は無線的にネットワークに接続され得る。前記ネットワークは、ローカル・エリア・ネットワーク（ＬＡＮ）またはインターネットなどの広域ネットワーク（ＷＡＮ）などのネットワークであり得る。いくつかの実施形態では、前記ネットワークはパーソナル・エリア・ネットワークであってよい。前記ネットワークはクラウドを含み得る。前記サンプル処理機器は、前記ネットワークに、仲介機器なしで接続され得るか、又は仲介機器がサンプル処理機器をネットワークに接続するために必要であり得る。サンプル処理機器は、ネットワークを通じて別の機器と通信し得る、限定はされないがパーソナルコンピュータ、サーバーコンピュータ、又はラップトップコンピュータ；Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＣＥ機器等のパーソナル・デジタル（ＰＤＡ）、セルフォン等の電話、スマートフォン（例えば、ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、及びｒｏｉｄ、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標）等）、又は位置把握携帯電話（ＧＰＳ等の）；ネットワークに接続されたローミング機器等のローミング機器；無線電子メール機器等の無線機器又はコンピュータ・ネットワークと無線的に通信する能力を有する他の機器；又はネットワークを通じて通信することができ、及び電子的なやり取りを行い得る任意のタイプのネットワーク機器を含む、任意のタイプのネットワーク化された機器であり得る。そのような通信は、クラウドコンピューティングインフラストラクチャー、又は他の機器によりアクセスされ得る、任意の他のタイプのデータ保存インフラストラクチャーにデータを提供することを含み得る。
サンプル処理機器は、サンプルに関するデータを、例えば、ヘルスケア専門家、臨床検査施設等のヘルスケア専門家の場所、又はその関係者に提供し得る。臨床検査施設、ヘルスケア専門家、又は被験者の１つ以上は、又は前記サンプル処理機器から提供されるデータを受信するか、又はアクセスし得るネットワーク機器を有し得る。サンプル処理機器は、サンプルに関するデータをデータベースに提供するために構成され得る。サンプル処理機器は、サンプルに関するデータを、電子医学記録システム、臨床検査施設情報システム、臨床検査施設自動化システム、又は他のシステム又若しくはソフトウエアに提供するために構成され得る。サンプル処理機器は、データを報告書の形態で提供し得る。
臨床検査施設、機器、又は他の実体又はソフトウエアは、サンプルに関するデータの分析をリアルタイムで遂行し得る。ソフトウエアシステムは、化学的分析及び／又は病理学的分析を遂行し得るか、又はこれらは、臨床検査施設、臨床施設、及び専門又はエキスパートの職員の組み合わせの間で分配され得る。分析はサンプルの定性的及び／又は定量的評価を含み得る。データ分析は、後続するサンプルの定性的及び／又は定量的評価を含み得る。随意的に、生データ、前処理されたデータ、又は分析されたデータに基づいて報告書が作成され得る。そのような報告書は、前記サンプルから得られたデータ、そのサンプルが取得された被験者の身元及び他の情報、データの分析、及び他の機密情報の機密性を維持するために作成されることができる。前記報告書及び／又は前記データは、ヘルスケア専門家に送信され得る。サンプル処理機器により得られたデータ、そのようなデータの分析、又は報告書は、データベース、電子的医学記録システム、臨床検査施設情報システム、臨床検査施設自動化システム、又は他のシステム又はソフトウエアに提供されることができる。
本明細書で開示される方法、組成物、又は他の試薬を用いるか、又はそれらと共に用いられる、試薬、検定、方法、キット、機器、及びシステムの例の記載及び開示は、例えば、米国特許第８，０８８，５９３号；米国特許第８，３８０，５４１号；２０１３年２月１８日に出願された，米国特許出願第１３／７６９，７９８号；２０１３年２月１８日に出願された，米国特許出願第１３／７６９，７７９号；２０１１年９月２６日に出願された米国特許出願第１３／２４４，９４７号；２０１２年９月２５日に出願された，国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／５７１５５号；２０１１年９月２６日に出願された，米国特許出願第１３／２４４，９４６号；２０１１年９月２６日に出願された，米国特許出願第１３／２４４，９４９号；及び２０１１年９月２６日に出願された，米国特許出願第６１／６７３，２４５号，２０１４年３月１５日に出願された，国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／３００３４号及び２０１４年３月１５日に出願された米国特許出願第１４／２１４，８５０号の中に見出されることができ、全ての特許及び特許出願の開示は、それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は２０１３年１１月２２日に出願された、米国特許仮出願第６１／９０８，０２７号；２０１４年５月２０日に出願された米国仮出願第６２／００１，０５０号；２０１４年３月１５日に出願された米国本出願第１４／２１４，８５０号；及び２０１４年３月１５日に出願された，国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／３００３４号による利益及び優先権を主張し，その開示は，その全体が全ての目的で，参照により本明細書に組み込まれる。２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／８００，６０６号の開示はまた，それらの全体が，参照により本明細書に組み込まれる。
実施例
以下の実施例は、説明的な目的のみに提供され、本開示をいかなる方法によっても制限することを意図されていない。
実施例１−可変のテール領域の長さによるテンプレート核酸の増幅
本明細書において提供される方法は、標的の核酸を増幅するために用いられた。反応は、インフルエンザＡウイルス血球凝集素（ＨＡ３）遺伝子（ＲＮＡ分子）の４６４のヌクレオチドの一部分である、標的の核酸Ｔ１２４Ａ１の約１０２ヌクレオチド部分に対する検定のために調製された。前記Ｔ１２４Ａ１のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９に提供される。第一のプライマー（“Ｐ１”）の１２変異及び第二のプライマー（“Ｐ２”）の１２変異が調製された。前記プライマー変異の全ての配列が図２Ａ中に提供されている。前記プライマーの全てが、長さにおいて１５ヌクレオチドのテンプレート結合領域を含んでいた。前記第一のプライマーの全ての変異のテンプレート結合領域の配列は：ＣＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）（前記５’−３’方向において）である。前記第二のプライマーの全ての変異のテンプレート結合領域は：ＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）（５’−３’方向において）である。前記異なるプライマー変異は、長さにおいて８〜２２ヌクレオチドの範囲の特に長さにおいて８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、又は２２ヌクレオチドテール領域に含まれる。前記第一のプライマーのテール領域の塩基配列は：ＣＧＣＣＧＧＡＴＧＧＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）（５’−３’方向において）である。前記塩基配列は、長さにおいて２２ヌクレオチドであり；前記第一のプライマーの、より短いテール領域の配列は、同じ配列から、適切な数のヌクレオチドを前記テール領域の５’末端から差し引いたものである（例えば、１８ヌクレオチドの長さのテール領域を持つプライマーが、前記塩基配列から、同じテール領域を有し、そこから前記第一の塩基配列の４ヌクレオチド（ＣＧＣＣ）を差し引いたものである）。前記第二のプライマーのテール領域は：ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＴＣＣＧＧＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３）（５’−３’方向において）の塩基配列を有していた。前記塩基配列は、長さにおいて２２ヌクレオチドであり；前記第一のプライマーのより短いテール領域は同じ配列から、適切な数のヌクレオチドを、前記テール領域の３’末端から取り除いたものであり（例えば、１８ヌクレオチド長さのテール領域を持つ前記プライマーは、前記塩基配列と同じ配列のテール領域を有し、前記塩基配列最後の４ヌクレオチド（ＧＧＣＧ）を欠失している）。
１５０マイクロリットルの反応混合物が調製され、そのそれぞれは：５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス酢酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭＤＴＴ、３０μｇウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．８Ｍベタイン、それぞれ、１．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ、２μＭのＳＹＴＯ（登録商標）５９（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．８ユニット／μｌのＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、０．０１６ユニット／μｌのＡＭＶ逆転写酵素酵素を含む（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１ユニット／μｌネズミＲＮａｓｅ阻害剤（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、０．８μＭの第一のプライマー変異、０．８μＭの第二のプライマー変異、マイクロリットル当たりに、及び１００，０００コピーＴ１２４Ａ１テンプレート、及び５９Ｃで、１００分、ＣＦＸ９６Ｔｏｕｃｈ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）において、インキュベートされた。検定についての変曲点は、ＣＦＸマネージ・ソフトウエア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）による単一閾値法を用いて決定され、及び図２Ｂに示される。このＸ−軸は、前記反応に用いられた第一の及び第二のプライマーのテール領域のヌクレオチドの長さを提供し、及び前記Ｙ−軸は、検体の変曲時間（分における）を提供する。それぞれのテール領域のヌクレオチド長さについて、２つの隣接したバーが示される：左のバーは、前記テンプレート反応を含む変曲時間、及び右のバーはテンプレートを欠く反応の変曲時間である［“テンプレートの無い対照”（“ＮＴＣ”）］。９０分を超える変曲時間に対しては、バーは示されない。図２Ｂ、に示されるように、これらの反応条件では、８〜１５ヌクレオチドのテール領域を持つプライマー、及び、よりとりわけ、８〜１１ヌクレオチドは、最も早い変曲時間により支持され得る。テンプレートの無い対照反応は、最終的には局時間を示し；このことは、経時的に、生成されるバックグラウンドの非特異的な生成物に起因する。
実施例２−可変的なテール領域の長さ及び可変的なテンプレート結合領域の長さを持つテンプレート核酸の増幅
本明細書において提供される方法は、標的の核酸を増幅するために用いられた。反応は、上記の実施例１に記載された、標的の核酸Ｔ１２４Ａ１の検定のために調製された。第一のプライマー及び第二のプライマーのペアーのセットの２つの異なるグループが、調製された。前記プライマーのペアーの第一のグループでは、前記プライマーのそれぞれが、長さにおいて２０ヌクレオチドのテンプレート結合領域（“２０ヌクレオチドテンプレート結合領域”グループと呼ぶ）を有していた。プライマーのペアーの第二のグループでは、前記プライマーのそれぞれが、長さにおいて１６ヌクレオチドのテンプレート結合領域（“１６ヌクレオチドテンプレート結合領域”グループと呼ぶ）。それぞれのグループ内で、８つの異なるテール領域の長さ：７、８、９、１０、１１、１２、１４、及び１６ヌクレオチドを持った、第一の及び第二のプライマーのペアーのセットが調製された。図３は、前記１６ヌクレオチドテンプレート結合領域グループのための異なるプライマーのペアーのセットのヌクレオチド配列（図３Ａ）及び前記２０ヌクレオチドのテンプレート結合領域グループのための異なるプライマーのペアーのセットのヌクレオチド配列（図３Ｂ）を提供する。図３Ａ及び３Ｂにおいて、前記“テール”配列は、テール領域を指す。前記プライマーの配列は５’−３’方向において示される。
１１０マイクロリットルの反応混合物が調製され、そのそれぞれは：５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス酢酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭＤＴＴ、３０μｇウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．８Ｍベタイン、それぞれ１．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ、２μＭＳＹＴＯ（登録商標）５９（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．８ユニット／μｌのＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、０．０１６ユニット／μｌのＡＭＶ逆転写酵素酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１ユニット／μｌネズミＲＮａの第二のプライマーの変異体、及びマイクロリットル当たり、１００，０００コピーのＴ１２４Ａ１テンプレートを含んでおり、及びこれらは、５６Ｃで１００分間、ＣＦＸ９６タッチ器具（Ｔｏｕｃｈ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中でインキュベートされた。検定の変曲点は図３Ｃ（２０ヌクレオチドテンプレート結合領域グループ）及び３Ｄ（１６ヌクレオチドテンプレート結合領域グループ）に示される。図３Ｃ及び３Ｄの両方において、Ｘ−軸は、前記反応に用いられた前記第一の及び第二のプライマーのテール領域のヌクレオチドの長さを提供し、及びＹ−軸は検定の変曲時間（分単位での）を示す。それぞれのテール領域のヌクレオチドの長さに対して、２つの隣り合ったバーが示される：左のバーは、テンプレートを含む反応についての変曲時間であり、及び右のバーは、テンプレートを欠いた反応の変曲時間である。図３に示されるように、これらの反応条件下では、比較的短いテール領域を有するプライマーを含む反応は、より速い変曲時間、及びテンプレートを含む反応対テンプレートの無い反応の変曲時間のより大きな分離を示した。例えば、１６ｂｐ及び２０ｂｐプライマーの両方に対して、長さ７、８、又は９ヌクレオチドのテール領域を有するプライマーを含む反応は、長さ１２、１４、又は１６ヌクレオチドのテール領域を有するプライマーを含む反応よりも、より早い変曲時間を示した。
実施例３−可変温度におけるテンプレート核酸の増幅
本明細書において提供される方法は、標的の核酸を増幅するために用いられた。反応は、上記の実施例１に記載された、標的の核酸Ｔ１２４Ａ１の検定のために調製された。第一のプライマー“ＲＬＸ０８９２”（配列：５’ＴＴＧＧＧＡＡＡＣＣＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣ３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）及び第二のプライマー“ＲＬＸ０８９３”（配列：５’ＧＴＴＴＣＣＣＡＡＡＴＧＣＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣ３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）が、Ｔ１２４Ａ１を増殖するために用いられた。これらのプライマーの両方は９ヌクレオチドのテール領域を有し、ＲＬＸ０８９２ｈは、１５ヌクレオチドのテンプレート結合領域を有し、及びＲＬＸ０８９３は、１４ヌクレオチドのテンプレート結合領域を有する。ＲＬＸ０８９２のテール領域は：５’ＴＴＧＧＧＡＡＡＣ３’（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：８４）であり、及び前記ＲＬＸ０８９３のテール領域は：５’ＧＴＴＴＣＣＣＡ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５）である。
８０マイクロリットルの反応混合物の、それぞれが以下のものを含むように構成された：５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス酢酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭＤＴＴ、２０μｇウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．８Ｍベタイン、それぞれ１．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ、２μＭＳＹＴＯ（登録商標）５９（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．８ユニット／μＬＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、０．０１６ユニット／μｌのＡＭＶ逆転写酵素酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１ユニット／μｌのネズミＲＮａｓｅ阻害剤（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、０．。８μＭの第一のプライマーＲＬＸ０８９２、０．８μＭの第二のプライマーＲＬＸ０８９３、及びマイクロリットル当たり、１０，０００、１，０００、１００又は０コピーのＴ１２４Ａ１テンプレートであり、及び反応混合物は、３回繰り返して、５２、５２．７、５４、５５．９、５８．４、６０．３、６１．４又は６２Ｃで１００分間、ＣＦＸ９６タッチ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中でインキュベートされた。検定の変曲点が図４に示される。Ｘ−軸は、反応のインキュベーション温度を提供し、及びＹ−軸は、検定の変曲時間（分単位における）を提供する。それぞれの温度に対して、４つの隣り合ったバーが示され、左から右へ：１０，０００コピーのテンプレート／マイクロリットル、１０００コピーのテンプレート／マイクロリットル、１００コピーのテンプレート／マイクロリットル、又はゼロのテンプレートの対照を示す。図４に示されるように、これらの反応条件下で、この検定は、前記テンプレートを、５２〜６２Ｃの温度範囲の全体を通じて、１０００コピーのテンプレート／マイクロリットルへ効果的に増幅し、及び特定の温度においては、テンプレートの濃度は少なくともわずか１００コピーテンプレート／マイクロリットルであった。
実施例４−ヒトゲノムＤＮＡの存在中下でのテンプレート核酸の増幅
本明細書において提供される方法は、標的の核酸を増幅するために用いられた。反応は、ヒトＤＮＡの存在下で、標的の核酸Ｔ１２４Ａ１（上述の）を検定するために調製された。第一のプライマー“ＲＬＸ０８９２”（上述の）及び第二のプライマー“ＲＬＸ０８９３”（上述の）の存在が、Ｔ１２４Ａ１を増幅するために用いられた。
１６０マイクロリットルの反応混合物が、調製され、それぞれは：５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス酢酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭＤＴＴ、２０μｇウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．８Ｍベタイン、それぞれ１．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ、０．４ｘＳＹＴＯ（登録商標）５９（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．８ユニット／μｌＬＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、０．０１６ユニット／μＬＡＭＶ逆転写酵素酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、１ユニット／μＬネズミＲＮａｓｅ阻害剤（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、０．８μＭの第一のプライマーＲＬＸ０８９２、０．８μＭの第二のプライマーＲＬＸ０８９３、及びマイクロリットル当たり、１，０００、１００又は０コピーのＴ１２４Ａ１テンプレート、及び０、１、２．５、５、又は１０ナノグラムのヒトゲノムＤＮＡを含み、及びこれらの反応混合物は、５６Ｃで１００分間、ＣＦＸ９６タッチ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でインキュベートされた。検定の変曲点が図５に示される。Ｘ−軸は、反応中のヒトゲノムＤＮＡ（“ｈＤＮＡ”）の量を提供し、及びＹ−軸は検定の変曲時間（分単位における）を提供する。それぞれの量のｈＤＮＡに対して、３つの隣接したバーが示され、左から右へ：１０００コピーテンプレート／マイクロリットル、１００コピーテンプレート／マイクロリットル、又はゼロのテンプレートを示す。図５中に示されるように、これらの反応条件下で、この検定は、少なくとも１０ｎｇのｈＤＮＡの存在下でも、前記テンプレートを１０００コピーテンプレート／マイクロリットルにおいて効果的に増幅した。更に、ｈＤＮＡの前記反応への添加は、５又は１０ｎｇのｈＤＮＡの濃度においてさえＮＴＣ変曲時間において、比較的小さい減少のみを引き起こした。
実施例５−ウイルス溶解物溶出液からのテンプレート核酸の増幅
本明細書において提供される方法が、標的を含む２つの異なるサンプルからの標的の核酸の増幅に用いられた。標的の核酸Ｔ１２４Ａ１は２つのサンプルにおいて調製された：１）単離されたＴ１２４Ａ１ＲＮＡ分子を含むサンプル（実施例１のように）、及び２）インフルエンザＡＨ３Ｎ２ウイルスサンプルから単離された核酸を含むサンプル。Ｔ１２４Ａ１は、ＨＡ３遺伝子の一部分であり、及び従ってインフルエンザＡＨ３Ｎ２ウイルスから単離された核酸のサンプル中に存在することが予期される。インフルエンザＡウイルス溶解物は、ＣｈｅｍａｇｉｃウイルスＤＮＡ／ＲＮＡキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により、製造者の説明書に従って調製された。２つの異なるサンプル中のＴ１２４Ａ１の濃度は、ｑＰＣＲにより定量され、及び前記サンプルは、前記サンプル中のＴ１２４Ａ１の濃度を正規化するために希釈された。第一のプライマー“ＲＬＸ０８９２”及び第二のプライマー“ＲＬＸ０８９３”がＴ１２４Ａ１の増幅のために用いられた。
２５マイクロリットル反応混合物が調製され、それぞれは：５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス酢酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭＤＴＴ、２０μｇウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．８Ｍベタイン、それぞれ、１．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ、２ｕＭＳＹＴＯ（登録商標）５９（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．８ユニット／μＬＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、０．０１６ユニット／μＬＡＭＶ逆転写酵素酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、１ユニット／μＬネズミＲＮａｓｅ阻害剤（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、０．８μＭの第一のプライマーＲＬＸ０８９２、０．８μＭの第二のプライマーＲＬＸ０８９３、及び１マイクロリットル当たり１０，０００、１０００又は０コピーのＴ１２４Ａ１テンプレートを含み、それぞれの反応混合物は、及び５６Ｃで、１００分間、ＣＦＸ９６タッチ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）においてインキュベートされた。検定の変曲点が図６に示される。Ｘ−軸は、前記反応中のテンプレートのコピー数／マイクロリットルを提供し、及びＹ−軸は、検定の変曲時間（分単位における）を提供する。テンプレートのコピー／マイクロリットルのそれぞれの量に対して、２つの隣接するバーが示され、左から右に：単離されたＴ１２４Ａ１、及びインフルエンザＡウイルス溶解物である。ＮＴＣに対する変曲点も示される。図６において示されるように、これらの反応条件下では、両方の検定とも、単離されたＴ１２４Ａ１テンプレートを、インフルエンザＡウイルス溶解物中のＴ１２４Ａ１テンプレートと共に効果的に増幅した。
実施例６−テンプレート核酸の増幅
本明細書において提供される方法は、標的の核酸を増幅するために用いられた。反応は、インフルエンザＢウイルス血球凝集素（ＨＡ）遺伝子（ＲＮＡ分子）の、２９８ヌクレオチド部分である、Ｔ１２９Ｄ１の５４ヌクレオチド部分に対する検定のために調製された。の前記Ｔ１２９Ｄ１のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０に提供される。第一のプライマー“Ａ８”（ヌクレオチド配列：５’ＴＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＡＡＣ３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６）及び第二のプライマー“Ｂ８”（ヌクレオチド配列：５’ＴＣＴＣＡＡＧＡＡＴＴＴＧＧＴＣＴＴＣＣ３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７）が、Ｔ１２９Ｄ１を増幅するために用いられた。これらのプライマーの両方は、前記第一の８ヌクレオチド（５’末端から）はテール領域であり、及び最後の１２ヌクレオチドが、テンプレート結合領域である。共に、これらのプライマーは、標的のＴ１２９Ｄ１の５４ヌクレオチド部分を標的とする。
１００マイクロリットル反応混合物が調製され、これは：５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス酢酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭＤＴＴ、２０μｇウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．８Ｍベタイン、それぞれ、１．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ、０．４ｘＳＹＴＯ（登録商標）５９（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．８ユニット／μＬＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、０．０１６ユニット／μＬ ＡＭＶ逆転写酵素酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、１ユニット／μＬネズミＲＮａｓｅ阻害剤（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、０．８μＭの第一のプライマーＡ８、０．８μＭの第二のプライマーＢ８、及びマイクロリットル当たり、１００，０００のＴ１２９Ｄ１テンプレートを含み、及びこの反応混合物は、５８Ｃで、１００分間、ＣＦＸ９６タッチ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中でインキュベートされた。１００分後に、サンプルが前記反応から取り出され、及びクローンベクターにリゲートされた。反応生成物を含むベクターは、ベクター特異的プライマーを用いて、クローニングのサイトに向かわせるために配列された。シークエンシング反応の複数の実施例からの結果の一部が図７に示される。このシークエンシングの結果は、予期された構造を有するコンカテマーが形成されたことを示している。特に、これらの実施例においては、前記反応生成物の単一の鎖において、Ｔ１２９Ｄ１遺伝子からの、標的の５４ヌクレオチド配列の複数のコピーが存在し、Ａ８プライマーのテール領域（５’ＴＣＴＴＧＡＧＡ３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８）の配列により分離された。図７においては、このことのＴ１２９Ｄ１の第二の（左から右の）部分の発生のみが示されており；この配列は、図に示されるヌクレオチドを超えて延伸する。
実施例７−内部モチーフへ相補性のテールを持つプライマー
標的とする核酸の中の内部モチーフを相補する配列を含むプライマーテールの本明細書において提供される実施形態を更に説明するために、一つの模範的な核酸の配列をここに提供する。５４ヌクレオチド全体の長さのポリヌクレオチドのテンプレートを、提供することが出来る（実施例７テンプレート）。実施例７テンプレートは、図１０のエレメント１０００に対応する。実施例７テンプレートの配列は、以下の通りである：５インチＴＣＧＣＴＴＧＡＡＣＴＧＡＧＧＡＣＴＴＡＧＣＧＣＣＴＡＧＡＡＡＣＴＴＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２）．実施例７テンプレートを説明すると、５’から３’の方向へ、まず最初の下線の配列は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの前記第二の部分（例えば、図１０にあるようなエレメント１００２と類似している）で、第２番目の下線の配列は、内部モチーフ（例えば、図１０にあるエレメント１００３に対応する）であり、及び第３番目の下線の配列は、前記ポリヌクレオチドのテンプレートの前記第一の部分（例えば、図１０にあるエレメント１００１に対応する）である。実施例７テンプレートの具体的なヌクレオチド及びここで提供される他の配列は、５’から３’の方向へ読まれるそれぞれの配列におけるそれらの位置に関して示される。従って、例えば、実施例７テンプレートの５’末端の“Ｔ”は、第１番目の位置にあり、５’末端の“Ｔ”と隣接した“Ｃ”は、第２番目にある、等々。２４ヌクレオチド全体の長さの第一のプライマーを、提供することが出来る。（“実施例７第一のプライマー”）。実施例７第一のプライマーは、図１０にあるエレメント１０１０に対応する。実施例７第一のプライマーの配列は、以下の通りである：５’ＣＴＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡＧＴＴＧＧＴＴＡＣＣＴＧ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３）．下線の配列は、実施例７第一のプライマーの最初／テール領域（図１０にあるエレメント１０１１に対応する）であり、下線がない配列は、実施例７第一のプライマーの第２番目／テンプレートバインディング領域（図１０にあるエレメント１０１２に対応する）である。また、注目すべきは、実施例７第一のプライマーの前記第一の領域は、実施例７テンプレートの内部モチーフと同じヌクレオチド配列を持っていると言う事実である。実施例７第一のプライマーは、以下の通りに実施例７テンプレートへアニール出来る：実施例７テンプレート及び実施例７第一のプライマーが方向付けられ、実施例７テンプレートの３’末端及び実施例７第一のプライマーの５’末端が同じ方向を向く場合は、実施例７第一のプライマーの下線がない配列（５’から３’の方向へ読み、ＡＣＣＡＧ…．と示される）は、実施例７テンプレートの前記第一の部分（３’から５’の方向へ読み、ＴＧＧＴＣ…．と示される）へアニールされる。更に具体的には、実施例７第一のプライマーの９番目の位置にある“Ａ”は、実施例７テンプレートの５４番目の位置にある“Ｔ”と二つ一組になり、実施例７第一のプライマーの１０番目の位置にある“Ｃ”は、実施例７テンプレートの５３番目の位置にある“Ｇ”と二つ一組になり、実施例７第一のプライマーの１１番目の位置にある“Ｃ”は、実施例７テンプレートの５２番目の位置にある“Ｇ”と二つ一組になる、等々。実施例７第一のプライマーが、実施例７テンプレートへアニールされる際、鎖置換活動を持つポリメラーゼは、実施例７第一のプライマーを伸長させ、この中の他の場所でも述べられているように、実施例７第一のプライマー伸長体を創り出す。実施例７第一のプライマー伸長体は、５’から３’の方向のヌクレオチド配列を持つ：５’ＣＴＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡＧＴＴＧＧＴＴＡＣＣＴＧＡＧＣＣＡＡＧＴＴＴＣＴＡＧＧＣＧＣＴＡＡＧＴＣＣＴＣＡＧＴＴＣＡＡＧＣＧＡ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）．実施例７第一のプライマー伸長体を説明すると、５’から３’の方向において、最初の下線がない配列は、実施例７第一のプライマーの前記第一の領域の配列で、最初の下線の配列は、実施例７テンプレーの前記第一の部分を補足する配列であり、第２番目の下線の配列は、実施例７第一のプライマー伸長体の内部モチーフの配列で、また、第３番目の下線の配列は、実施例７テンプレートの前記第二の部分の相補的な配列である。実施例において、実施例７第一のプライマー伸長体が、実施例７テンプレートにアニールされる際、ある環境においては、実施例７第一のプライマーの前記第一の領域の配列である実施例７第一のプライマー伸長体の一部分が、一時的に実施例７第一のプライマー伸長体の内部モチーフにアニールする。すなわち、実施例７第一のプライマー伸長体の最初に位置する“Ｃ”が、３８番目に位置する“Ｇ”にアニールし、第２番目に位置する“Ｔ”が、３７番目に位置する“Ａ”へアニールし、３番目に位置する“Ａ”が３６番目に位置する“Ｔ”へアニールする、等々、８番目に位置する“Ｃ”が３１番目に位置する“Ｇ”へアニールするまで継続される。実施例７第一のプライマーの前記第一の領域の配列である、実施例７第一のプライマー伸長体の一部分が、実施例７第一のプライマー伸長体の内部モチーフに一時的にアニールする際、これらの部分の間にある実施例７第一のプライマー伸長体の一部分は（例えば、実施例７テンプレートの前記第一の部分を相補する配列を含んでいる）実施例７テンプレートからアニールされなくなる、従って、例えば、実施例７第一のプライマーのもう一つのコピーを実施例７テンプレート及び追加された次世代の実施例７第一のプライマー伸長体と束ねる役割を果たしている。
２４ヌクレオチド全体の長さの第二のプライマーは、図１０にあるエレメント１０２０に対応する。実施例７第二のプライマーの配列は、以下の通りである：５’ＧＴＴＴＣＴＡＧＴＣＧＣＴＴＧＡＡＣＴＧＡＧＧＡ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）．下線の配列は、実施例７第二のプライマーの前記第一の領域（図１０にあるエレメント１０２１に相当する）で、また、下線がない配列は、実施例７第二のプライマーの前記第二の領域（図１０にあるエレメント１０２２に対応する）である。実施例７第二のプライマーは、以下のように実施例７第一のプライマー伸長体にアニールしうる：実施例７第二のプライマーの９番目に位置する“Ｔ”は、実施例７第一のプライマー伸長体の６２番目に位置する“Ａ”と二つ一組になり、実施例７第二のプライマーの１０番目に位置する“Ｃ”は、実施例７第一のプライマー伸長体の６１番目に位置する“Ｇ”と二つ一組になり、実施例７第二のプライマーの１１番目に位置する“Ｇ”は、実施例７第一のプライマー伸長体の６０番目に位置する“Ｃ”と二つ一組になる、等々。実施例７第二のプライマーは、鎖置換活動を持つポリメラーゼによって伸長され、この中の何処にでも記述されているように、実施例７第二のプライマー伸長体を生み出す。実施例７第二のプライマー伸長体は、５’から３’の方向へヌクレオチド配列を持つ：５’ＧＴＴＴＣＴＡＧＴＣＧＣＴＴＧＡＡＣＴＧＡＧＧＡＣＴＴＡＧＣＧＣＣＴＡＧＡＡＡＣＴＴＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＴＴＣＴＡＧ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６）．実施例７第二のプライマー伸長体を説明すると、５’から３’の方向へ、最初の下線のない配列は、実施例７第二のプライマーの前記第一の領域配列で、最初の下線の配列は、実施例７テンプレートの前記第二の部分の配列であり、二番目の下線の配列は、実施例７第二のプライマー伸長体の内部モチーフの配列で、三番目の下線の配列は、ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆ実施例７テンプレートの前記第一の部分の配列である、また、四番目の下線のない配列は、実施例７第二のプライマーの前記第一の領域の配列及び実施例７第一のプライマーの前記第一の領域を相補する配列である。実施形態において、実施例７第二のプライマー伸長体が、実施例７第一のプライマー伸長体にアニールされる際、ある環境において、実施例７第二のプライマーの前記第一の領域の配列である実施例７第二のプライマー伸長体の一部分が、一時的に実施例７第二のプライマー伸長体の内部モチーフにアニールしうる。すなわち、実施例７第二のプライマー伸長体の最初に位置する“Ｇ”が、４０番目に位置する“Ｃ”にアニールし、２番目に位置する“Ｔ”が、３９番目に位置する“Ａ”にアニールし、３番目に位置する“Ｔ”が、３８番目に位置する“Ａ”にアニールする、等々、８番目に位置する“Ｇ”が、３３番目に位置する“Ｃ”にアニールするまで継続する。実施例７第二のプライマーの前記第一の領域の配列である、実施例７第二のプライマー伸長体の一部分が、一時的に実施例７第二のプライマー伸長体の内部モチーフにアニールする際、これらの部分間にある実施例７第二のプライマー伸長体の一部分（例えば、実施例７テンプレートの前記第二の部分の配列を含む）は、実施例７第一のプライマー伸長体からアニールされない可能性がある、よって、例えば、実施例７第二のプライマーのもう一つのコピーを実施例７第一のプライマー伸長、及び追加された実施例７第二のプライマー伸長体の次世代へ束ねる役割を果たしている。
実施形態において、この中の他の場所でも提供される方法は、上述の一般的なメカニズムに従って行われうる。プライマー、標的核酸、反応条件、反応生成物などに関する、この中の他の場所でも提供されるいかなる説明及び詳細も、前実施例７において説明される一般的なメカニズムを含む反応が適用されうる。
実施例８−ＳＮＰ探知
ここで提供される方法は、標的核酸におけるＳＮＰ／変異を確認するために用いられた。単一のヌクレオチドによって区別された２つのバージョンの標的核酸が提供された。核酸テンプレートのバージョン１の最初の鎖（“バージョン１テンプレート”；また、“野生タイプ”配列とも言われる）は、５’から３’の方向の配列を持つ：
バージョン１テンプレートを説明すると、５’から３’の方向へ、最初の下線の配列は、バージョン１テンプレートの前記第二の部分で、２番目の下線の配列は、バージョン１テンプレートの内部モチーフで、また３番目の下線の配列は、バージョン１テンプレート前記第一の部分である。核酸テンプレートのバージョン２（“バージョン２テンプレート”；また、“ＳＮＰ”配列とも示される）の最初の鎖は、５’から３’の方向への配列を持つ：
バージョン２テンプレートを説明すると、５’から３’の方向へ、最初の下線の配列は、バージョン２テンプレートの前記第二の部分で、２番目の下線の配列は、バージョン２テンプレートの内部モチーフで、また３番目の下線の配列は、バージョン２テンプレート前記第一の部分である。バージョン１テンプレート及びバージョン２テンプレート配列は、それぞれのテンプレート内の単一のヌクレオチドが違うだけである。特に、バージョン１テンプレートは、その配列内の３１番目の位置に“Ａ”を持っており（太字およびイタリックのフォントで強調されている）、同じく、バージョン２テンプレートは、その配列内の３１番目の位置に“Ｔ”を持っている（太字およびイタリックのフォントで強調されている）。第一のプライマー及び第二のプライマーは、また、テンプレート配列を増幅するために提供されている。前記第一のプライマー（“実施例８プライマー１”）は、次の配列を持つ：５’ＴＣＣＡＴＣＣＣＡＡＣＴＧＴＣＣＣＣＡＴＣＴ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９）．下線の配列は、実施例８プライマー１の先頭／末尾領域で、また下線のない配列は、実施例８プライマー１の２番目／テンプレートバインディングの領域である。前記第二のプライマー（“実施例８プライマー２”）は、次の配列を持つ：５’ＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＡＴＴＣＡＴＣＡＣＧＴＴＴ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００）。下線の配列は、実施例８プライマー２の先頭／末尾領域で、また、下線のない配列は、実施例８プライマー２の２番目／テンプレートバインディング領域である。
この中の他の場所でも説明される別の増幅反応は、バージョン１テンプレートあるいはバージョン２テンプレートのいずれかに対して、実施例８プライマー１及び実施例８プライマー２をプライマーとして使用し、バージョン１テンプレート及びバージョン２テンプレートの両方に対する反応と共に行われた。同じ条件下での多重反応は、それぞれのテンプレートに対して行われた。
バージョン１テンプレート反応において、実施例８プライマー１が、実施例８プライマー１の伸長体（（“バージョン１テンプレートプライマー１伸長体）のポリメラーゼによってバージョン１テンプレート及び世代にアニールすると、バージョン１テンプレートプライマー１伸長体は、以下の配列を持つようになる：
バージョン１テンプレートプライマー１伸長体を説明すると、５’から３’の方向へ、最初の下線のない配列は、実施例８プライマー１の先頭／末尾領域の配列で、最初の下線の配列は、バージョン１テンプレートの前記第一の部分の相補的な配列あり、２番目の下線の配列は、バージョン１テンプレートプライマー１伸長体の内部モチーフの配列（太字でイタリックの“Ｔ”が、対象のヌクレオチド）である、また、３番目の下線の配列は、バージョン１テンプレートの前記第二の部分の相補的な配列である。ここで説明される方法に従って、実施形態において、実施例８プライマー１の先頭／末尾領域の配列に対応するバージョン１テンプレートプライマー１伸長体の一部分は、バージョン１テンプレートプライマー１伸長体の内部モチーフに一時的にアニールしうる、すなわち、１番目に位置する“Ｔ”は、５２番目に位置する“Ａ”にアニールし、２番目に位置する“Ｃ”は、５１番目に位置する“Ｇ”にアニールし、３番目に位置する“Ｃ”は、５０番目に位置する“Ｇ”にアニールする、等々、８番目に位置するが、４５番目に位置する“Ｇ”にアニールするまで継続される。注目すべきは、実施例８プライマー１の先頭／末尾領域の配列に対応するバージョン１テンプレートプライマー１伸長体の一部分はバージョン１テンプレートプライマー１伸長体の内部モチーフの配列に対し、完全に相補的な点である（例えば、二組となったヌクレオチドの８つのセットのどの間に置いても、ミスマッチはない）。
バージョン２テンプレート反応において、実施例８プライマー１が、実施例８プライマー１の伸長体（（“バージョン２テンプレートプライマー１伸長体）のポリメラーゼによってバージョン２テンプレート及び世代にアニールすると、バージョン２テンプレートプライマー１伸長体は、以下の配列を持つようになる：
バージョン２テンプレートプライマー１伸長体を説明すると、５’から３’の方向へ、最初の下線のない配列は、実施例８プライマー１の先頭／末尾領域の配列で、最初の下線の配列は、バージョン２テンプレートの前記第一の部分の相補的な配列あり、２番目の下線の配列は、バージョン２テンプレートプライマー１伸長体の内部モチーフの配列（太字でイタリックの“Ａ”が、対象のヌクレオチド）である、また、３番目の下線の配列は、バージョン２テンプレートの前記第二の部分の相補的な配列である．ここで説明される方法に従って、実施形態において、実施例８プライマー１の先頭／末尾領域の配列に対応するバージョン２テンプレートプライマー１伸長体の一部分は、バージョン２テンプレートプライマー１伸長体の内部モチーフに一時的にアニールしうる、すなわち、１番目に位置する“Ｔ”は、５２番目に位置する“Ａ”にアニールし、２番目に位置する“Ｃ”は、５１番目に位置する“Ｇ”にアニールし、３番目に位置する“Ｃ”は、５０番目に位置する“Ｇ”にアニールする、等々、８番目に位置するが、４５番目に位置する“Ｇ”にアニールするまで継続される。注目すべきは、実施例８プライマー１の先頭／末尾領域の配列に対応するバージョン２テンプレートプライマー１伸長体の一部分は、バージョン２テンプレートプライマー１伸長体の内部モチーフの配列に対し、完全には相補的でない点である、なぜなら、４番目に位置する“Ａ”と４９番目に位置する“Ａ”との間にミスマッチがあるからである。従って、バージョン１テンプレートプライマー１伸長体をバージョン２テンプレートプライマー１伸長体と比較すると、実施例８プライマー１の先頭／末尾に対応するそれぞれの伸長体の一部分は、バージョン２テンプレートプライマー１伸長体におけるよりも、バージョン１テンプレートプライマー１伸長体において、内部モチーフの配列に対しより一層の相補を持ち、そして、より一層安定してアニールする。特に、バージョン１テンプレートプライマー１伸長体内の配列“ＴＣＣＡＴＣＣＣ”は、バージョン１テンプレートプライマー１伸長体における内部モチーフに対し、完全に相補的である（８ヌクレオチド中８個が適切に二組みなり得る）、ところが、バージョン２テンプレートプライマー１伸長体における配列“ＴＣＣＡＴＣＣＣ”は、バージョン２テンプレートプライマー１伸長体における内部モチーフに対し、完全に相補的とはならない（８ヌクレオチド中７個が二組になり得る）。一般的には、プライマーテールに対応する伸長体の一部分と伸長体における内部モチーフとの間で、より大きな相補があればあるほど、これら２つの部分の間のアニールは安定した結果となる。一つの伸長体が、これら二つの部分がアニールされたものとして形成された際は、それはここで示された反応率を、例えば、一つの伸長体の領域の内部アニール化によって影響を受けた相補鎖の中のアニールされていないヌクレオチドに新しいプライマーを結合させることを許可することによって、あるいは、ここで提供された方法に従って、鎖状形態の割合を増加することによって、加速させるかもしれない。
上述した様に、同じようなメカニズムは、また、バージョン１テンプレート及びバージョン２テンプレートプライマー２伸長体に対しても起こる。その場合、伸長体のテール領域の部分は、バージョン１テンプレートプライマー２伸長体に対して完全に相補的であるが、バージョン２テンプレートプライマー２伸長体に対しては、完全に相補的ではない。
図１１は、これらのテンプレート及びプライマーでの増幅反応の結果を示している。Ｘ軸は時間を示し、Ｙ軸は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）（増幅されたＤＮＡを示している）を示している。図１１に示されるように、バージョン１テンプレートでの増幅反応（“野生タイプ”配列）は、バージョン２テンプレート（“ＳＮＰ”配列）での反応よりも、より素早く起った。従って、これらの結果として、ここで提供される方法は、例えば、単一ヌクレオチド変種を持つ配列間の区別するために、使用できることを示している。
実施例９−ＳＮＰ検出
本明細書で提供される方法は、ヒトの標的の核酸におけるＳＮＰ／突然変異を識別するのに用いられた。ＢＲＣＡ１タンパク質のＱ３５６Ｒ異形は、増大した癌のリスクと関連づけられ得る。Ｑ３５６Ｒ異形は、例えば、グルタミンを野生型ＢＲＣＡ１の３５６アミノ酸の位置で記号化するコドン（ヌクレオチド配列ＣＡＧ）が、グルタミンの代わりにアルギニンを記号化することが出来るように、代わりにヌクレオチド配列ＣＧＧを持つ時に起こりうる。
その他のヌクレオチド間において、３５６アミノ酸の位置へのコドンを含む、ＢＲＣＡ１ゲノム配列の一部分の異なる型が４種、獲得された．前記第一の型（「野生型標的」）は、３５６アミノ酸の位置（配列ＣＡＧ）においてグルタミンを記号化する野生型コドンを含み、及び５’末端から３’末端の方向においてヌクレオチド配列を有する。：
前記第二の型（「Ｑ３５６Ｒ標的」）は、３５６アミノ酸の位置（配列ＣＧＧ）においてアルギニンを記号化するコドンを含み、及び５’末端から３’末端の方向においてヌクレオチド配列を有する。：
前記第三の型（「Ｑ３５６Ｐ標的」）は、３５６アミノ酸の位置（配列ＣＧＧ）においてプロリンを記号化するコドンを含み、及び５’末端から３’末端の方向においてヌクレオチド配列を有する。：
前記第四の型（「Ｑ３５６Ｌ標的」）は、３５６アミノ酸の位置（配列ＣＴＧ）においてロイシンを記号化するコドンを含み、及び５’から３’の方向においてヌクレオチド配列を有する。：
５’末端から３’末端の方向内の上記４種の各標的においては、前記第一の下線部の配列は標的の前記第二の部分、前記第二の下線部の配列は標的の内部モチーフ、及び第三の下線部の配列は標的の前記第一の部分である。
上記４種の標的配列は、各標的の内部モチーフ配列における単体ヌクレオチドのみにより異なる。具体的に言うと、野生型標的は（太字およびイタリックの書体で強調されている）配列内の３７番目の位置において「Ａ」を有し、それに対し、Ｑ３５６Ｒ標的は配列内の３７番目の位置において「Ｇ」を、Ｑ３５６Ｐ標的は配列内の３７番目の位置において「Ｃ」を、及びＱ３５６Ｌ標的は配列内の３７番目の位置において「Ｔ」を有する。第一のプライマー及び第二のプライマーも、標的配列を増幅するために提供された。前記第一のプライマー（「実施例９プライマー１）」は、以下の配列を有する。：５’ＡＴＴＣＡＧＡＡＴＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＡＣＴＣ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７）下線部の配列は実施例９プライマー１の前記第一・テール領域であり、及び非下線部の配列は実施例９プライマー１の前記第二・テンプレートを結びつけている領域である。前記第二のプライマー（「実施例９プライマー２）」は以下の配列を有する。．：５’ＴＴＣＴＧＡＡＴＡＡＧＡＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＡＴ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８）．下線部の配列は実施例９プライマー２の前記第一・テール領域であり、及び非下線部の配列は実施例９プライマー２の前記第二・テンプレートを結びつけている領域である。
本明細書で説明されたものとは別の増幅反応が上記４種の各標的のために実施されたが、それらは全て実施例９プライマー１及び実施例９プライマー２のプライマーを用いた４種の標的のための反応を示している。反応の状態は以下の通りであった。：５０ｍＭカリウム酢酸、２０ｍＭトリス酢酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭマグネシウム酢酸、１ｍＭＤＴＴ、０．８Ｍベタイン、２ｕＭＳＹＴＯ（登録商標）５９（ライフテクノロジーズ社）、０。８単元／μｌＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランド・バイオラボ社）、実施例９プライマー１の０．８μＭ、実施例９プライマー２の０．８μＭ、及び１０コピー標的分子／μｌ。反応は、９０分間５６度で保持され、及び各反応の屈折点はＣＦＸマネージャー・ソフトウェア（バイオ・ラッド社）を用いた単―閾値法の利用を決定づけた。多数の反応が同じ条件下で各標的のために実施されている。
増幅反応は本明細書の他の箇所で説明したメカニズムにより発生したものである。例えば、実施例８の中にもある。例えば、実施例９のプライマー１及び実施例９のプライマー２の伸長生成物伸長生成物は上記の各標的核酸から形成されており、それぞれ個別の反応において、例えば野生型標的の実施例９プライマー１伸長生成物、Ｑ３５６Ｒ標的の実施例９プライマー１伸長生成物、Ｑ３５６Ｐ標的の実施例９プライマー１伸長生成物、及びＱ３５６Ｌ標的の実施例９プライマー１伸長生成物、及び実施例９プライマー２からの各標的より付随する伸長生成物を、形成するためである。
注目すべきは、例えば、実施例９プライマー１の前記第一／テール領域に付随してくる野生型標的の実施例９プライマー１伸長生成物の一部が野生型標的の実施例９プライマー１伸長生成物の内部モチーフに対して完全相補性を有するのに対し、Ｑ３５６Ｒ標的、Ｑ３５６Ｐ標的及びＱ３５６Ｌ標的プライマー１伸長生成物の各々のために実施例９プライマー１の第一テール領域に付随してくる伸長生成物の一部は、個別の伸長生成物の内部モチーフに対して完全には相補性を有していないことである。具体的に言うと、前述したとおり、標的配列の３７番目のヌクレオチドを巻き込む位置において、単一のヌクレオチドの不一致があるのだ。この不一致は本明細書で提供された反応の比率に影響を与え得る。
それぞれ異なる標的での試験の平均屈折時間は、以下の通りである。：野生型標的：２４．５分、Ｑ３５６Ｒ標的：４９．５分、Ｑ３５６Ｐ標的：５５．７分、及びＱ３５６Ｌ標的：５９．８分。従って、試験の屈折時間により示されるように、反応は内部モチーフにおける単一のヌクレオチドにより変化する標的間で直ちに分化することができる。他の標的と比べられる通り、野生型標的試験の著しく、より早い屈折時間は、以下の結果となり得る。例えば、実施例９プライマー１の前期第一・テール領域に付随してくる野生型標的の実施例９プライマー１伸長生成物の一部及び野生型標的の実施例９プライマー１伸長生成物における内部モチーフ間の、完全な相補性である。また、それとは対照的に、実施例９プライマー１の前期第一・テール領域に付随するＱ３５６Ｒ標的、Ｑ３５６Ｐ標的及びＱ３５６Ｌ標的の実施例９プライマー１伸長生成物の一部及び個別の実施例９プライマー１伸長生成物における内部モチーフ間の、不完全な相補性である。同様の推論が、前記プライマー伸長生成物の伸長生成物にも適応される。
実施例１０−インフルエンザＮ９遺伝子増幅
本明細書で提供される方法は、インフルエンザＡ型ウイルス、亜類型Ｈ７Ｎ９を含むサンプルからノイラミニダーゼ遺伝子（Ｎ９）の一部を増幅するために用いられた。Ｎ９からの標的配列は、５’末端から３’末端方向内（ＤＮＡ型）にあり、以下の通りである。：ＡＡＣＴＴＴＡＡＧＧＡＣＧＡＡＣＡＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧＴＡＡＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＡＡＣＡＡＡＧＴＡＡＴＡＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＴＡＡＴＡＡＣＡＡＡＣＣＧＡＡＣＡＣＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）テンプレートを増幅するために用いられた前記第一のプライマーは、５’末端から３’末端方向内の以下の配列を有した。：ＣＴＴＣＣＡＴＴＴＧＡＡＡＣＡＡＣＣＡＡＣＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０）前記第一のプライマーを記述し、下線部の領域は前記プライマーのテール・第一領域であり、非下線部の領域は前記第二・テンプレートを結びつける領域である。テンプレートを増幅するために用いられた前記第二のプライマーは、５’末端から３’末端方向内に以下の配列を有した。：ＡＡＴＧＧＡＡＧＴＴＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＣＴＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１）前記第一のプライマーを記述し、下線部の領域は前記プライマーのテール・第一領域であり、非下線部の領域は前記第二・テンプレートを結びつける領域である．本明細書で説明された通り、複数の反応が前記第一のプライマー及び第二のプライマーを用いて実施された。それは、反応がテンプレート配列を含むまたは含まない、いずれの場合においてもである。テンプレートを含む反応は、一つの反応につき２５０，０００コピーのテンプレート配列を含んでいた。その反応の結果は図１２に示されている。Ｘ軸の数値は分、及びＹ軸の値は相対的蛍光単位（ＲＦＵ）である。グラフに表されている通り、テンプレートのある反応において、ＲＦＵはテンプレート配列の増幅を示しながら２０分辺りのところで急激に上がっている。テンプレートなしの反応においては、ＲＦＵの上昇は６０分辺りのところで、その後は非特異性背景の生成物の結果である。
本明細書において提供されるヌクレオチド及びアミノ酸配列は、他に記載がない限り人工的な配列である。
本発明の好適な実施形態が示され、及び本明細書に記載されるが、当業者にとっては、そのような実施形態は単に例としてのみ提供されていることは自明であろう。上記の記載は、包括的であるか、又は開示された厳密な実施形態に限定することを意図するものではなく、及び他の修正及び変形が、発明の範囲を逸脱することなく上記の教示を踏まえると可能である。好まれるか又は否かに関わらず、いかなる特性も任意の他の特性と組み合わされ得る。本明細書において提供される発明が、本明細書において、便宜性の目的ために、限定された数の用語及び語句で記載されるが、本明細書において提供されていないが、本発明を正確に記載する用語又は語句を用いても記載され得るであろうことも理解されたい。所定の請求項が明確に言明されていない限り、添付された請求項は、手段プラス機能の限定を含むものとは解釈されない。本明細書の記載、以下の特許請求範囲の全体を通して用いられるように、「ａ（１つ）」「ａｎ（１つ）」「ｔｈｅ（前記の）」は、文脈において明白に示さない限り、複数の意味を含むことを理解されたい。例えば、“ａｎ ａｓｓａｙ”は単一の検定又は複数の検定うを指し得る。更に、本明細書の記載、以下の特許請求範囲の全体を通して用いられるように、「ｉｎ（〜の中に）」の意味は、文脈で明白に示されない限り、「ｉｎ（〜の中に）」、および「ｏｎ（〜の上に）」を含む。本明細書の記載、以下の特許請求範囲の全体を通して用いられるように、第二の対象の“少なくとも一部分”を含むとして記載された、第一の対象は、第二の対象の全量／完全な第二の対象を含み得る。本明細書の記載、以下の特許請求範囲の全体を通して用いられるように、用語“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”、“ｉｎｃｌｕｄｅ”、及び“ｃｏｎｔａｉｎ”、並びに関係する時制は、包括的であり、及び制約が無く、及び追加的な、列挙されていない要素又は方法のステップを排除しない。更に、広げる言葉（ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇ ｗｏｒｄ）及び”１つ以上の”、”少なくとも”、”限定はされないが”等の語句は、ある場合には、より狭いケースが意図されていると読まれるべきではなく、又はそのような広げる言葉が例の中に要求されると読まれるべきではない。最後に、更に、本明細書の記載、および以下の特許請求の範囲の全体を通して用いられる、「ｏｒ（又は）」の意味は、文脈で明白に示されない限り、接続詞および離接的接続詞の両方を含む。従って、用語”ｏｒ（又は）”は文脈で明白に指示しない限り、“及び／又は”を含む。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2014233213A1 (en) 2013-03-15 2015-09-17 Theranos Ip Company, Llc Thermostable blunt-end ligase and methods of use
CA2960859A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Theranos, Inc. Hybrid multi-step nucleic acid amplification
US10822648B1 (en) 2016-07-29 2020-11-03 Labrador Diagnostics Llc Hybrid multi-step nucleic acid amplification
CN110819738A (zh) * 2019-11-20 2020-02-21 拱北海关技术中心 高致病性h7n9禽流感病毒的检测方法及其引物和探针
CA3198842A1 (en) * 2020-10-21 2022-04-28 Illumina, Inc. Sequencing templates comprising multiple inserts and compositions and methods for improving sequencing throughput

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004267093A (ja) * 2003-03-07 2004-09-30 Arkray Inc Ｄｎａ増幅法およびそのためのキット
JP2012529904A (ja) * 2009-06-15 2012-11-29 ルモラ・リミテッド ステム加速等温核酸増幅技術

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5928905A (en) * 1995-04-18 1999-07-27 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
GB0504774D0 (en) * 2005-03-08 2005-04-13 Lingvitae As Method
GB0618046D0 (en) * 2006-09-13 2006-10-25 Lingvitae As Method
US7910302B2 (en) * 2006-10-27 2011-03-22 Complete Genomics, Inc. Efficient arrays of amplified polynucleotides
WO2013035875A1 (ja) * 2011-09-08 2013-03-14 独立行政法人理化学研究所 プライマーセット及びそれを用いた標的核酸配列の増幅方法並びに変異核酸の検出方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004267093A (ja) * 2003-03-07 2004-09-30 Arkray Inc Ｄｎａ増幅法およびそのためのキット
JP2012529904A (ja) * 2009-06-15 2012-11-29 ルモラ・リミテッド ステム加速等温核酸増幅技術

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 420, JPN6018035105, 2012, pages 738 - 742, ISSN: 0004537037 *

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