CN110819738A - 高致病性h7n9禽流感病毒的检测方法及其引物和探针 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学检测领域，公开了一种检测高致病性H7N9禽流感病毒的引物和探针，所述引物序列为：F‑引物：5’‑AATGTTCCTGAGGT TCCAAAGGGAAAACGGACTGC‑3’，R‑引物：5’‑GAGTGCTTTTGTAATCTGCAGCAGTTCCCTCTCCC‑3’；所述探针的序列为：5’‑CGGGTTTCATTGAAAAT GGATGGGAAGGCCTATTGATGGTTGGTATGGT‑3’。本发明所述检测方法的特异性强、灵敏度高、重复性好，还具有简便、快速的特点。

Description

高致病性H7N9禽流感病毒的检测方法及其引物和探针

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及高致病性H7N9禽流感病毒的检测方法及其引物和探针。

背景技术

禽流感是由A型禽流感病毒(Avian influenz virus,AIV)引起的禽类疾病。AIV根据基质蛋白HA和NA的抗原特性分为16种HA亚型(H1-H16)和9种NA亚型(N1-N9)，共有144种亚型。该病毒除可以感染禽类外，部分毒株也能够引起人感染发病。2013年3月以来，发生人感染禽流感并导致多人死亡的病例，经国家禽流感参考实验室证实，此次禽流感疫情由全球首次发现的H7N9新型流感病毒引起，能导致人类发生严重或致命的呼吸系统疾病。

疫情初期，H7N9亚型禽流感病毒对家禽是低致病性的，家禽的死亡率很低，有的甚至没有出现明显临床症状，也无死亡病例。但根据2017年2月19日中国疾控中心报道，从广东的两例人感染禽流感H7N9病例中分离病毒株的测序结果显示，该病毒已变异为高致病性禽流感病毒，造成禽类中出现病死等情况。农业部2017年3月24日发布了湖南省永州市东安县蛋鸡感染禽流感病毒的情况，这是我国第一起蛋鸡感染高致病性H7N9禽流感的疫情。

因此，建立一种快速检测方法对于控制新发高致病性H7N9亚型禽流感是非常重要的。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测高致病性H7N9禽流感病毒的引物和探针，以及基于所述引物和探针的RAA(重组酶介导核酸扩增)检测方法。本发明所述检测方法的特异性强、灵敏度高、重复性好，还具有简便、快速的特点。

一种检测高致病性H7N9禽流感病毒的引物和探针，

所述引物的序列为：

F-引物：5’-AATGTTCCTGAGGTTCCAAAGGGAAAACGGACTGC-3’，

R-引物：5’-GAGTGCTTTTGTAATCTGCAGCAGTTCCCTCTCCC-3’；

所述探针的序列为：

5’-CGGGTTTCATTGAAAATGGATGGGAAGGCCTATTGATGGTTGGTATGGT-3’。

优选的，所述探针上标记有荧光基团、淬灭基团和THF，所述荧光基团与所述淬灭基团均标记在T碱基上，所述荧光基团与所述淬灭基团的间距为1～5nt；所述荧光基团与所述淬灭基团之间设有所述THF，所述THF距所述探针5’端≥30nt，所述THF距所述探针3’端≥15nt。

所述THF为四氢呋喃残基，所述THF的数量为一个。

本发明根据GenBank中公布的高致病性H7N9亚型禽流感病毒核酸HA基因的全序列与其它禽流感病毒HA基因的全序列进行比对，通过分析找到高致病性H7N9亚型禽流感病毒区别于其他禽流感病毒的特异性保守区域。

本发明针对该特异性保守区域设计特异性引物和探针，设计了多组不同的引物和探针组合，并经过筛选和分析，从而确定上述引物和探针的检测效果最佳。

优选的，所述荧光报告基团包括FAM(羧基荧光素)、TET(四氯-6-羧基荧光素)、HEX(六氯-6-甲基荧光素)、CY3(3H-吲哚菁)或JOE(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)中的一种。

优选的，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL、MGB或Eclipse中的一种。

优选的，所述探针的3’末端还标记有修饰基团。

更优选的，所述修饰基因包括胺基、磷酸基团、生物素-TEG、巯基或C3-spacer中的一种。所述修饰基团对探针3’末端起封闭和阻断作用，可阻止探针3’末端发生进一步的延伸。

上述引物和探针均委托由生工生物(上海)股份有限公司合成。

一种用于检测高致病性禽流感病毒H7N9的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物和探针。

优选的，所述试剂盒还包括阳性标准品和阴性标准品。所述阳性标准品为插入高致病性H7N9禽流感病毒HA全基因序列的质粒。所述阴性标准品为超纯水或纯净水。其中超纯水由双蒸水经高温杀菌制得。

一种非诊断目的的高致病性禽流感病毒H7N9的检测方法，包括以下步骤：

(1)提取样品RNA；

(2)以所述样品RNA为模板，利用上述引物和探针进行实时荧光重组酶介导核酸扩增检测；

(3)收集荧光信号，得出样品检测结果。

本发明采用RAA(重组酶介导核酸扩增)技术结合上述的引物和探针进行高致病性禽流感病毒H7N9的检测，样品检测结果可通过荧光检测仪进行读取。

优选的，所述样品RNA的OD260/280(OD260代表核酸的吸光度，OD280代表蛋白质的吸光度)为1.8～2.0。由于RAA技术对模板的要求较低，样品RNA的提取可采用人工提取或试剂盒提取，具体提取方法不作限制。为保证检测的准确性，当所提取样品RNA的OD260/280不为1.8～2.0时，需重新提取样品RNA。

优选的，所述实时荧光重组酶介导核酸扩增检测的反应体系中：F-引物的浓度为10μmol/L，R-引物的浓度为10μmol/L，探针的浓度10μmol/L。

优选的，所述RAA检测的反应体系中：F-引物的用量为2μL，R-引物的用量为2μL，探针的用量为0.6μL。

优选的，所述RAA检测的反应程序为：39℃40s，1个循环；39℃30s，30～40个循环。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

(1)本发明通过采用RAA检测技术，可在恒温条件下完成检测，降低了对设备的要求，具有更广阔的应用范围；

(2)本发明所述检测方法的特异性强，灵敏度高；

(3)本发明所述检测方法操作简便，且检测效率高，通常情况下仅需15～20分钟即可完成，实现了高致病性H7N9禽流感病毒的快速检测，尤其适用于动物卫生监督、海关检疫部门或医院等场所。

附图说明

图1为实施例3中阳性对照组和阴性对照组的检测结果；

图2为实施例3中生物材料的检测结果；

图3为实施例4中灵敏度试验结果；

图4为实施例5中样品的检测结果；

图5～7为实施例6中阳性标准品的重复性试验结果。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。

实施例1

根据GenBank中公布的高致病性H7N9亚型禽流感病毒核酸HA基因的全序列与其它禽流感病毒HA基因的全序列进行比对，通过分析找到高致病性H7N9亚型禽流感病毒区别于其他禽流感病毒的特异性保守区域。

针对该特异性保守区域，使用分子生物学软件Oligo7.0设计特异性引物和探针。

其中引物的序列为：

F-引物：5’-AATGTTCCTGAGGTTCCAAAGGGAAAACGGACTGC-3’，

R-引物：5’-GAGTGCTTTTGTAATCTGCAGCAGTTCCCTCTCCC-3’；

其中探针的序列为：

5’-CGGGTTTCATTGAAAATGGATGGGAAGGCC(FAM-dT)A(THF)T(BHQ1-dT)GATGGTTGGTATGGT-C3 spacer-3’。

其中THF位点距探针5’端32个核苷酸，距探针3’端17个核苷酸；其中FAM-dT表示标记有荧光基团FAM的胸腺嘧啶脱氧核苷酸，BHQ1-dT表示标记有淬灭基团BHQ1的胸腺嘧啶脱氧核苷酸。其中荧光基团与淬灭基团的间距为3nt。

上述引物和探针委托生工生物(上海)股份有限公司合成。

实施例2

一种非诊断目的的高致病性H7N9禽流感病毒的检测方法，包括以下步骤：

(1)提取样品RNA；

(2)以样品RNA为模板，利用实施例1中的引物和探针进行实时荧光RAA检测；

(3)收集荧光信号，得出样品检测结果。

采用RNA提取试剂盒进行样品RNA的提取，其中RNA提取试剂盒为购自TaKaRa宝生物有限公司的TRIzol(RNAiso Plus)产品。

采用购自杭州众测生物科技有限公司的RAA恒温核酸快速扩增试剂(荧光型)进行实时荧光RAA检测。

RAA检测的反应体系：

上述Buffer均来自杭州众测生物科技有限公司的RAA恒温核酸快速扩增试剂(荧光型)。该试剂中已包含反转录酶，反转录过程已整合至反应体系中。

RAA检测的反应程序如表1所示：

表1

步骤	温度	时间	循环数	是否收集荧光
					预热	39℃	40s	1	否
扩增	39℃	30s	40	是

采用Genchek-1荧光检测仪(厂家:杭州众测生物科技有限公司)对荧光信号进行检测，根据扩增曲线直接读取检测结果。

实施例3

特异性试验

采用实施例2中检测方法对以下材料进行检测，验证该检测方法的特异性。

生物材料：猪流感H1N1亚型灭活疫苗LN株、猪流感H3N2灭活抗原、H5N1基因重组病毒疫苗株Re-8株、H9N2亚型禽流感病毒灭活抗原、鸡新城疫活疫苗LaSota株(ND)、低致病性H7N9禽流感病毒灭活抗原、高致病性H7N9禽流感病毒灭活抗原；上述抗原均购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司。

阴性对照组：纯净水；

阳性对照组：新发高致病性H7N9禽流感病毒HA全基因序列合成质粒。

其中新发高致病性H7N9禽流感病毒HA全基因序列合成质粒委托上海旭冠生物科技有限公司合成。

如图1所示，P(阳性对照组)出现扩增曲线，N(阴性对照组)未出现扩增曲线。

如图2所示，除P(阳性对照组)、高致病性H7N9禽流感病毒灭活抗原出现扩增曲线外，猪流感H1N1亚型灭活疫苗LN株、猪流感H3N2灭活抗原、H5N1基因重组病毒疫苗株Re-8株、H9N2亚型禽流感病毒灭活抗原、鸡新城疫活疫苗LaSota株(ND)、低致病性H7N9禽流感病毒灭活抗原和N(阴性对照组)均未出现扩增曲线。由此可见，本发明所建立的检测方法具备良好的特异性。

实施例4

灵敏度试验

取实施例1中高致病性H7N9禽流感病毒HA基因全序列合成质粒作为模板，用NanoDrop-1000 Spectrophotometer紫外分光光度计(厂家：美国NanoDrop Technologies公司)测定其浓度，根据阿伏伽德罗常数换算成目的基因拷贝数，以10倍梯度依次进行稀释，得到10⁷～10¹共7个梯度的阳性标准品。

对经梯度稀释后的阳性标准品分别使用实施例2中的检测方法进行检测，验证该检测方法的灵敏度。

如图3所示，6个阳性标准品出现扩增曲线，其中最低浓度是拷贝数为10²的阳性标准品，由此得出该检测方法的灵敏度为10²拷贝数，具有良好的灵敏度。

实施例5

样品检测

鸡血液(1份)，鸡肺脏组织(1份)，鸡肉组织(2份)，鸡咽肛拭子(2份)。

使用实施例2的检测方法对以上样品进行检测，并取实施例4中浓度梯度为10⁴的质粒作为阳性对照组，取纯净水作为阴性对照组。

如图4所示，除P(阳性对照组)出现明显的扩增曲线外，6份鸡样品和N(阴性对照组)均未检测到荧光信号的变化，得出该6份鸡样品均未感染高致病性H7N9禽流感病毒。

为了验证此次检测的准确性，将该6份鸡样品在实验室中同时采用血清型方法进行鉴定，最终确认该6份样品中不含有高致病性H7N9禽流感病毒。

实施例6

重复性试验

取实施例4中稀释至10³、10⁴、10⁵拷贝数的禽流感H7亚型HA基因质粒阳性标准品为模板，分别使用实施例2的反应体系和反应程序进行试验，单次试验重复数8个。

如图5～7所示，每次的多个检测结果高度重叠，检测结果完全一致，因此本发明所建立的检测方法具有良好的重复性。

实施例7

一种用于检测多杀性巴氏杆菌的试剂盒，包括实施例1中的引物和探针，阳性标准品(新发高致病性H7N9禽流感病毒HA全基因序列合成质粒)和阴性标准品(纯净水)。

Claims (10)

1.一种检测高致病性H7N9禽流感病毒的引物和探针，其特征在于，

所述引物的序列为：

F-引物：5’-AATGTTCCTGAGGTTCCAAAGGGAAAACGGACTGC-3’，

R-引物：5’-GAGTGCTTTTGTAATCTGCAGCAGTTCCCTCTCCC-3’；

所述探针的序列为：

5’-CGGGTTTCATTGAAAATGGATGGGAAGGCCTATTGATGGTTGGTATGGT-3’。

2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针上标记有荧光基团、淬灭基团和THF，所述荧光基团与所述淬灭基团均标记在T碱基上，所述荧光基团与所述淬灭基团的间距为1～5nt；所述荧光基团与所述淬灭基团之间设有所述THF，所述THF距所述探针5’端≥30nt，所述THF距所述探针3’端≥15nt。

3.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、TET、HEX、CY3或JOE中的一种，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL、MGB或Eclipse中的一种。

4.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，所述探针的3’末端还标记有修饰基团。

5.根据权利要求4所述的引物和探针，其特征在于，所述修饰基因包括胺基、磷酸基团、生物素-TEG、巯基或C3-spacer中的一种。

6.一种用于检测高致病性H7N9禽流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2至5中任一项所述的引物和探针。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性标准品和阴性标准品。

8.一种非诊断目的的高致病性H7N9禽流感病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取样品RNA；

(2)以所述样品RNA为模板，利用权利要求2至5中任一项所述的引物和探针进行实时荧光重组酶介导核酸扩增检测；

(3)收集荧光信号，得出样品检测结果。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述样品RNA的OD260/280为1.8～2.0。

10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述实时荧光重组酶介导核酸扩增检测的反应程序为：39℃40s，1个循环；39℃30s，30～40个循环。

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