CN103276110A - 用于快速检测新型h7n9亚型禽流感病毒的多重荧光rt-pcr试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于快速检测新型H7N9亚型禽流感病毒的多重荧光RT-PCR试剂盒及方法。所述包括一组用于检测所有H7亚型禽流感病毒的特异性引物和探针和一组用于检测新型N9亚型禽流感病毒的特异性引物和探针。两组引物是分别针对H7N9亚型禽流感病毒的血凝素抗原（HA）和神经氨酸酶抗原(NA)基因序列进行设计的，这样在实际检测应用过程中既不会对H7亚型禽流感病毒造成漏检亦可以检测判定新型N9亚型禽流感病毒。经实验验证，本发明的试剂盒具有很好的特异性和灵敏性，将在H7N9亚型病毒的早期检测中发挥重要作用。

Description

用于快速检测新型H7N9亚型禽流感病毒的多重荧光RT-PCR试剂盒及方法

技术领域

本发明属于分子检测领域，具体涉及一种用于快速检测新型H7N9亚型禽流感病毒的多重荧光RT-PCR试剂盒及方法。

背景技术

2013年3月底，在上海和安徽两地先后发生禽流感病毒感染人的疫情，经过国家禽流感参考实验室证实，此次禽流感由全球首次发现的H7N9新型流感病毒引起。截止到2013年5月1日16时，全国内地共报告127例确诊病例，其中死亡26人，死亡率达到20.47%，在禽流感病毒各亚型中其死亡率仅次于H5N1（2003.1～2013.5，30/45，66.67%）。由于该亚型病毒的突发性、高死亡率及尚无有效预防治疗措施，所以发生时对公共卫生安全和社会的稳定造成了很大的影响。

禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae）A型流感病毒属，其基因组为8条单股负链RNA，可编码HA、NA、M1、M2、NP、PA、PB1、PB2、NS1、NS210种病毒蛋白。根据病毒分子表面抗原血凝素（Hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）的抗原特性可分为16种HA（H1～H16）和10种NA（N1～N10），理论上可形成160种不同的禽流感病毒亚型，且各亚型之间通常无交叉免疫保护性。而且据实验证实，不同亚型禽流感病毒同时感染一个细胞时，不同亚型的病毒基因组会发生片段重组，造成病毒变异。据Chen等报道此次发生的新型H7N9亚型禽流感病毒为新型重配病毒，其内部基因来自于中国存在的H9N2亚型的禽流感病毒，这也是该亚型病毒突发时现存免疫制剂无法起到保护作用的原因。本研究利用荧光RT-PCR反应的快速、灵敏及污染性小等特点，建立了基于TaqMan探针的多重荧光RT-PCR检测方法，期望在新型H7N9亚型禽流感病毒的早期检测中发挥作用。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种用于快速检测新型H7N9亚型禽流感病毒的多重荧光RT-PCR引物和探针。

本发明的另一个目的在于提供一种用于快速检测新型H7N9亚型禽流感病毒的多重荧光RT-PCR试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供一种快速检测新型H7N9亚型禽流感病毒的多重荧光RT-PCR方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种用于快速检测新型H7N9亚型禽流感病毒的多重荧光RT-PCR引物和探针，其包括一组用于检测H7亚型禽流感病毒的特异性引物和探针和一组用于检测N9亚型禽流感病毒的特异性引物和探针，其中，

用于检测H7亚型禽流感病毒的引物和探针如下所示：

H7F：TAGAATACAGATTGACCCAGTCAAA（SEQ ID NO:1），

H7R：CCCCGAAGCTAAACCAAAGT（SEQ ID NO:2），

H7P：FAM-TAAGCAGCGGCTACAAAGATGTGA-BHQ1（SEQ ID NO:3）；

用于检测N9亚型禽流感病毒的引物和探针如下所示：

N9F：GGAATAGCAAACCTAGGATTGAA（SEQ ID NO:4）；

N9R：GGTTGTGAGTGTGAGCAATTG（SEQ ID NO:5）；

N9P：HEX-TAGGACTGCATCTAAAACCGGGCT-BHQ1（SEQ ID NO:6）。

一种用于快速检测新型H7N9亚型禽流感病毒的多重荧光RT-PCR试剂盒，其含有上述的引物组。

所述试剂盒中还含有反转录酶、Tap聚合酶、RT-PCR反应缓冲液、阳性标准品和阴性标准品。

所述阳性标准品为含有H7N9亚型禽流感病毒的血凝素抗原（HA）基因序列（GenBank：KC853766）的重组质粒和含有神经氨酸酶抗原(NA)基因序列（GenBank：KC853765）的重组质粒。

一种快速检测新型H7N9亚型禽流感病毒的多重荧光RT-PCR方法，包括如下步骤：

（1）提取待检样品RNA；

（2）以待检样品RNA为模板，利用上述的引物和探针（SEQ ID NO:1～6）进行RT-PCR反应；

（3）结果判断：根据扩增曲线，对照阳性标准品和阴性标准品的扩增结果，判断样品是否为新型H7N9亚型禽流感病毒。

本发明的有益效果是：

本发明所建立的多重荧光RT-PCR方法在特异性的试验中显示能够将H7N9亚型禽流感病毒与同类的其他病原很好的区分开来，而且在引物设计的时候选择HA和NA基因的不同的区域，设计的H7引物探针能够检测新旧所有H7亚型病毒而N9引物探针只针对此次新发的N9亚型禽流感病毒，这样在实际检测应用过程中既不会对H7亚型禽流感病毒造成漏检亦可以检测判定新型N9亚型禽流感病毒。灵敏度试验显示最低能够检测到10copies。因此，针对我国此次新型H7N9亚型禽流感病毒的突发情况，本发明中所建立的方法将在该亚型病毒的早期检测中发挥重要作用。

附图说明

图1为H7和N9引物组对新型H7N9的cDNA的扩增结果（M：DNA Maker，H7：H7引物组的扩增结果，N9：N9引物组的扩增结果）；

图2为多重荧光RT-PCR体系鉴定结果；

图3为多重荧光RT-PCR特异性试验（左侧两条曲线为H7N9标准品扩增曲线，右侧为H7N3样品扩增曲线）

图4为多重荧光RT-PCR灵敏度试验（由左向右为1×10⁷～1×10⁰copies/μL）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1新型H7N9亚型禽流感病毒的多重荧光RT-PCR检测体系的建立

1.材料

抗原：H1N2、H3N2、H5N1、H5N9、H6N2、H7N3和H9N2禽流感抗原购自哈尔滨兽医研究所。新型H7N9AIV核酸为RNA逆转录之后的cDNA，来自中国疾病预防控制中心。

试剂和仪器：DNA/RNA磁珠提取试剂盒，购自深圳市易瑞生物技术有限公司；One StepRT-PCR试剂盒，DNA胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒，DL2000DNA Mark，pMD18-T均购自宝生物工程(大连)有限公司；紫外分光光度计NanoDrop ND-1000，美国Thermo FisherScientific；ABI7500Fast Real-Time PCR System，美国Applied Biosystems。

2.实验方法和结果

2.1引物和探针

在GenBank中下载新型H7N9亚型禽流感病毒的血凝素抗原（HA）基因序列（GenBank：KC853766）和神经氨酸酶抗原(NA)基因序列（GenBank：KC853765），利用Primer Express2.0设计两套特异性的引物和探针，由上海辉睿生物科技有限公司合成。其中H7引物组可以扩增原有H7和新发H7亚型病毒，N9引物组扩增只针对此次发生的新型N9亚型病毒。这样在检测时既不会造成H7亚型禽流感病毒漏检现象同时也可以区分新旧N9亚型病毒。引物探针序列及基因登录号见表1。

表1引物和探针

2.2病毒RNA提取

按照DNA/RNA磁珠提取试剂盒说明进行。

2.3目的片段扩增

以新型H7N9的cDNA为模板，分别利用表1中的H7引物组和N9引物组进行RT-PCR扩增。采用TaKaRa One Step RT-PCR试剂盒，反应体系为：50μL：2×1Step Buffer25μL，10μmol/L上下游引物探针各2.5μL，PrimeScript1Step Enzyme Mix：2.0μL，RNA模板5.0μL，加RNase Free H₂O补足50μL。反应程序：50℃30min，95℃2min，95℃30s，55℃30s，72℃40s，72℃7min，35个循环，反应结束后于2.0%琼脂糖凝胶电泳检测（见图1）。

2.4阳性标准品质粒的制备

将电泳检测后的目的条带胶回收，克隆，测序鉴定，并以此重组质粒分别作为H7和N9阳性标准品。将重组质粒用紫外分光光度计测定质粒浓度，根据阿伏伽德罗常数换算成目的基因的拷贝数，并以10倍连续梯度分别各自稀释为1×10⁰～1×10⁷copies/μL八个浓度梯度。

2.5多重荧光RT-PCR体系鉴定

以标准品为模板，同时利用表1中的两组引物和探针进行多重荧光RT-PCR。体系25μL：2×Buffer12.5μL，RNase Free H₂O0.5μL，10μmol/L的引物探针各1.0μL，共6.0μL，PrimeScript1Step Enzyme Mix1.0μL，模板各5.0μL。反应条件：94℃2min，94℃10s，55℃40s，40个循环。本次扩增结果由图2可看出，该体系中有标准的S型曲线扩增，说明该体系具有检测新型H7N9亚型禽流感病毒的可行性。

本发明方法扩增结果判断：如果扩增结果中出现两条标准的S型曲线扩增，说明样品为新型H7N9（2013）阳性；如果只有H7一条S型曲线扩增，则样品为旧型H7亚型禽流感病毒阳性。扩增结果无S型曲线扩增，则H7亚型禽流感病毒阴性。

实施例2特异性实验

分别以H1N2、H3N2、H5N1、H5N9、H6N2、H7N3、H9N2禽流感病毒RNA和新型H7N9的cDNA为模板，以实施例1所建立的多重荧光RT-PCR体系进行鉴定，验证所建立方法的特异性，检测结果见图3。由图3看出，只有H7N9样品的H7和N9扩增出两条标准的S型曲线，其他样品中只有H7N3样品的H7检测出现特异性扩增，其他参照病毒均无荧光增长，说明所建立方法可检测新旧所有H7亚型病毒和新型N9亚型病毒，而对原有的N9亚型病毒具有区分能力。

实施例3灵敏度实验

分别以1×10⁰～1×10⁷copies/μL八个浓度梯度的阳性标准品质粒为模板进行多重荧光RT-PCR。25μL的RT-PCR体系中加入5μL反应模板。由图4可以看出，H7和N9均出现明显S型扩增曲线的最低浓度为10copies，即该方法针对H7和N9的最低检测限均为10copies的数量级。

实施例4临床样品检测

使用本方法对270份禽咽肛咽拭子进行检测，没有出现阳性。用禽流感病毒通用型荧光RT-PCR方法进行验证，符合率为100%。进一步证明本发明方法的准确性高。

由以上实施例可知，本发明所建立的多重荧光RT-PCR方法能够将H7N9亚型禽流感病毒与同类的其他病原很好的区分开来，灵敏度试验显示最低能够检测到10copies。该方法将在H7N9亚型病毒的早期检测中发挥重要作用。

<110>  珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>  用于快速检测新型H7N9亚型禽流感病毒的多重荧光RT-PCR试剂盒及方法

<130> 

<160>  6    

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

tagaatacag attgacccag tcaaa                                             25

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

ccccgaagct aaaccaaagt                                                   20

 

<210>  3

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

taagcagcgg ctacaaagat gtga                                              24

 

<210>  4

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

ggaatagcaa acctaggatt gaa                                               23

 

<210>  5

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  5

ggttgtgagt gtgagcaatt g                                                 21

 

<210>  6

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  6

taggactgca tctaaaaccg ggct                                              24

Claims (5)

1.用于快速检测新型H7N9亚型禽流感病毒的多重荧光RT-PCR引物和探针，其包括一组用于检测H7亚型禽流感病毒的特异性引物和探针和一组用于检测N9亚型禽流感病毒的特异性引物和探针，其中，

用于检测H7亚型禽流感病毒的引物和探针如下所示：

H7F：TAGAATACAGATTGACCCAGTCAAA（SEQ ID NO:1），

H7R：CCCCGAAGCTAAACCAAAGT（SEQ ID NO:2），

H7P：FAM-TAAGCAGCGGCTACAAAGATGTGA-BHQ1（SEQ ID NO:3）；

用于检测N9亚型禽流感病毒的引物和探针如下所示：

N9F：GGAATAGCAAACCTAGGATTGAA（SEQ ID NO:4）；

N9R：GGTTGTGAGTGTGAGCAATTG（SEQ ID NO:5）；

N9P：HEX-TAGGACTGCATCTAAAACCGGGCT-BHQ1（SEQ ID NO:6）。

2.一种用于快速检测新型H7N9亚型禽流感病毒的多重荧光RT-PCR试剂盒，其含有权利要求1所述的引物和探针。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有反转录酶、Tap聚合酶、RT-PCR反应缓冲液、阳性标准品和阴性标准品。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品为含有H7N9亚型禽流感病毒的血凝素抗原（HA）基因序列（GenBank：KC853766）的重组质粒和含有神经氨酸酶抗原(NA)基因序列（GenBank：KC853765）的重组质粒。

5.一种快速检测新型H7N9亚型禽流感病毒的多重荧光RT-PCR方法，包括如下步骤：

（1）提取待检样品RNA；

（2）以待检样品RNA为模板，利用权利要求1所述的引物和探针进行RT-PCR反应；

（3）结果判断：根据扩增曲线，对照阳性标准品和阴性标准品的扩增结果，判断样品是否为新型H7N9亚型禽流感病毒。

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