CN104131009A - 一种检测不同流感病毒的引物组合物及其应用 - Google Patents
一种检测不同流感病毒的引物组合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测不同流感病毒的引物组合物及其应用。本发明公开的一组引物组合物，由如下(1)-(4)任意所示的引物对组成：(1)SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子；(2)SEQ ID No.3所示的DNA分子和SEQ ID No.4所示的DNA分子；(3)SEQ ID No.5所示的DNA分子和SEQ ID No.6所示的DNA分子；(4)SEQ ID No.7所示的DNA分子和SEQ ID No.8所示的DNA分子。本发明对及时诊断、及时治疗发病犬，及时预测流行趋势，预防流感大流行，以及开展大规模犬流感病毒的流行病学监测有着积极的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种引物组合物及其应用，特别涉及一种能同时检测H3N2亚型犬流感病毒，H3N8亚型犬流感病毒，H1N1/2009亚型流感病毒和季节性H3N2亚型人流感病毒的引物组合物及其应用，属于病毒检测领域。
背景技术
犬对多种流感病毒均易感，由于犬和人的高度接触性，流感病毒可能通过患犬而感染人类，威胁公共卫生健康。病毒学和血清学调查表明我国犬群中主要流行的是犬H3N2、H1N1/2009和人季节性H3N2流感病毒。而欧美犬群中主要流行的是H3N8亚型犬流感病毒，也不排除其传播到中国犬群的可能性。一旦引起犬流感病毒在犬中的大流行，将会对犬和人类造成不可估量的损失和伤害。因此，对这些病毒做好及时的监测是非常有必要的。这就迫切需要建立一种能够同时检出这四种病毒的通用性良好的检测方法。
传统的流感病毒检测方法为：采用鸡胚进行病毒分离培养(需时2-3天)，然后采用血凝抑制试验进行流感病毒亚型的鉴定(需时1天)。传统的检测方法费时、费力，不能做出快速而及时的诊断，而且由于病毒的变异频率非常高，常常导致这些方法无法检出病毒，出现漏检的情况。因此，临床上，迫切需要一种能快速鉴别诊断犬流感病毒的检测方法，以确保可以及时发现及时治疗，对预防犬流感的大流行以及人类感染具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测不同流感病毒的引物组合物及其应用。
本发明提供一组引物组合物，由如下(1)-(4)任意所示的引物对组成：
(1)SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(2)SEQ ID No.3所示的DNA分子和SEQ ID No.4所示的DNA分子；
(3)SEQ ID No.5所示的DNA分子和SEQ ID No.6所示的DNA分子；
(4)SEQ ID No.7所示的DNA分子和SEQ ID No.8所示的DNA分子；
所述SEQ ID No.1所示的DNA分子、SEQ ID No.3所示的DNA分子、SEQ ID No.5所示的DNA分子、SEQ ID No.7所示的DNA分子为上游引物；
所述SEQ ID No.2所示的DNA分子、SEQ ID No.4所示的DNA分子、SEQ ID No.6所示的DNA分子、SEQ ID No.8所示的DNA分子为下游引物；
所述SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子分别为扩增H3N8亚型犬流感病毒的上游引物和下游引物，所述SEQ ID No.3所示的DNA分子和SEQ IDNo.4所示的DNA分子分别为扩增季节性H3N2亚型人流感病毒的上游引物和下游引物，所述SEQ ID No.5所示的DNA分子和SEQ ID No.6所示的DNA分子分别为扩增H1N1/2009亚型流感病毒的上游引物和下游引物，所述SEQ ID No.7所示的DNA分子和SEQ ID No.8所示的DNA分子分别为扩增H3N2亚型犬流感病毒的上游引物和下游引物；
所述H3N8亚型犬流感病毒具体为A/canine/California/70645-4/2006(H3N8)、A/canine/Colorado/6723-8/2008(H3N8)、A/canine/Colorado/30604/2006(H3N8)、A/canine/Colorado/17864/2006(H3N8)和/或A/canine/Colorado/8880/2006(H3N8)；
所述季节性H3N2亚型人流感病毒具体为A/Jiangxi/262/05(H3N2)、A/Beijing-Xicheng/11542/2011(H3N2)、A/Beijing-Huairou/1458/2012(H3N2)、A/Anhui-Baohe/1127/2012(H3N2)和/或A/Henan-Muye/35/2012(H3N2)；
所述H1N1/2009亚型流感病毒具体为A/California/04/2009(H1N1)、A/canine/Beijing/cau9/2009(H1N1)、A/canine/Beijing/cau2/2009(H1N1)、A/Beijing/7/2009(H1N1)和/或A/Beijing/132/2010(H1N1)；
所述H3N2亚型犬流感病毒具体为A/canine/Beijing/364/2009(H3N2)、A/canine/Beijing/359/2009(H3N2)、A/canine/Beijing/362/2009(H3N2)、A/canine/Beijing/305/2009(H3N2)和/或A/canine/Beijing/418/2010(H3N2)。
上述引物组合物中，所述引物由如下(1)-(4)所示的引物对组成：
(1)SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(2)SEQ ID No.3所示的DNA分子和SEQ ID No.4所示的DNA分子；
(3)SEQ ID No.5所示的DNA分子和SEQ ID No.6所示的DNA分子；
(4)SEQ ID No.7所示的DNA分子和SEQ ID No.8所示的DNA分子。
一种检测或辅助检测样品中是否含有H3N2亚型犬流感病毒、H3N8亚型犬流感病毒、季节性H3N2亚型人流感病毒和/或H1N1/2009亚型流感病毒的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含上述任一所述的引物组合物；
所述H3N2亚型犬流感病毒具体为A/canine/Beijing/364/2009(H3N2)、A/canine/Beijing/359/2009(H3N2)、A/canine/Beijing/362/2009(H3N2)、A/canine/Beijing/305/2009(H3N2)和/或A/canine/Beijing/418/2010(H3N2)；
所述H3N8亚型犬流感病毒具体为A/canine/California/70645-4/2006(H3N8)、A/canine/Colorado/6723-8/2008(H3N8)、A/canine/Colorado/30604/2006(H3N8)、A/canine/Colorado/17864/2006(H3N8)和/或A/canine/Colorado/8880/2006(H3N8)；
所述季节性H3N2亚型人流感病毒具体为A/Jiangxi/262/05(H3N2)、A/Beijing-Xicheng/11542/2011(H3N2)、A/Beijing-Huairou/1458/2012(H3N2)、A/Anhui-Baohe/1127/2012(H3N2)和/或A/Henan-Muye/35/2012(H3N2)；
所述H1N1/2009亚型流感病毒具体为A/California/04/2009(H1N1)、A/canine/Beijing/cau9/2009(H1N1)、A/canine/Beijing/cau2/2009(H1N1)、A/Beijing/7/2009(H1N1)和/或A/Beijing/132/2010(H1N1)。
一种检测或辅助检测样品中是否含有H3N2亚型犬流感病毒、H3N8亚型犬流感病毒、季节性H3N2亚型人流感病毒和/或H1N1/2009亚型流感病毒的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：以样品的cDNA为模板，以上述任一所述的引物组合物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果PCR扩增产物中有148bp的片段，则样品候选为含有H3N8亚型犬流感病毒的样品，如果PCR扩增产物中有303bp的片段，则样品候选为含有季节性H3N2亚型人流感病毒的样品，如果PCR扩增产物中有407bp的片段，则样品候选为含有H1N1/2009亚型流感病毒的样品，如果PCR扩增产物中有544bp的片段，则样品候选为含有H3N2亚型犬流感病毒的样品；
所述148bp的片段为SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子为引物扩增得到的；
所述303bp的片段为SEQ ID No.3所示的DNA分子和SEQ ID No.4所示的DNA分子为引物扩增得到的；
所述407bp的片段为为SEQ ID No.5所示的DNA分子和SEQ ID No.6所示的DNA分子为引物扩增得到的；
所述544bp的片段为为SEQ ID No.7所示的DNA分子和SEQ ID No.8所示的DNA分子为引物扩增得到的。
上述方法中，所述PCR的体系为：ddH2O6.5μl，2×PCR扩增缓冲液12.5μl，上述任一所述的引物组合物中浓度为20μmol/μl的各上游引物各0.5μl，上述任一所述的引物组合物中浓度为20μmol/μl的各下游引物各0.5μl，cDNA2μl；
所述2×PCR扩增缓冲液的商品名称具体为2×EasyTaq PCR SuperMix，购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为AS111，包含EasyTaq DNA聚合酶、dNTPs和优化的反应缓冲液，浓度为2×；
所述PCR的反应程序为94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃35s，30个循环；72℃10min；4℃24h；
所述H3N2亚型犬流感病毒具体为A/canine/Beijing/364/2009(H3N2)、A/canine/Beijing/359/2009(H3N2)、A/canine/Beijing/362/2009(H3N2)、A/canine/Beijing/305/2009(H3N2)和/或A/canine/Beijing/418/2010(H3N2)；
所述H3N8亚型犬流感病毒具体为A/canine/California/70645-4/2006(H3N8)、A/canine/Colorado/6723-8/2008(H3N8)、A/canine/Colorado/30604/2006(H3N8)、A/canine/Colorado/17864/2006(H3N8)和/或A/canine/Colorado/8880/2006(H3N8)；
所述季节性H3N2亚型人流感病毒具体为A/Jiangxi/262/2005A/Jiangxi/262/05(H3N2)、A/Beijing-Xicheng/11542/2011(H3N2)、A/Beijing-Huairou/1458/2012(H3N2)、A/Anhui-Baohe/1127/2012(H3N2)和/或A/Henan-Muye/35/2012(H3N2)；
所述H1N1/2009亚型流感病毒具体为A/California/04/2009(H1N1)、A/canine/Beijing/cau9/2009(H1N1)、A/canine/Beijing/cau2/2009(H1N1)、A/Beijing/7/2009(H1N1)和/或A/Beijing/132/2010(H1N1)。
上述任一所述的引物组合物在制备检测或辅助检测样品中是否含有H3N2亚型犬流感病毒、H3N8亚型犬流感病毒、季节性H3N2亚型人流感病毒和/或H1N1/2009亚型流感病毒的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述试剂盒在制备检测或辅助检测样品中是否含有H3N2亚型犬流感病毒、H3N8亚型犬流感病毒、季节性H3N2亚型人流感病毒和/或H1N1/2009亚型流感病毒的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述的应用中，所述H3N2亚型犬流感病毒为A/canine/Beijing/364/2009(H3N2)、A/canine/Beijing/359/2009(H3N2)、A/canine/Beijing/362/2009(H3N2)、A/canine/Beijing/305/2009(H3N2)和/或A/canine/Beijing/418/2010(H3N2)；
所述H3N8亚型犬流感病毒为A/canine/California/70645-4/2006(H3N8)、A/canine/Colorado/6723-8/2008(H3N8)、A/canine/Colorado/30604/2006(H3N8)、A/canine/Colorado/17864/2006(H3N8)和/或A/canine/Colorado/8880/2006(H3N8)；
所述季节性H3N2亚型人流感病毒为A/Jiangxi/262/05(H3N2)、A/Beijing-Xicheng/11542/2011(H3N2)、A/Beijing-Huairou/1458/2012(H3N2)、A/Anhui-Baohe/1127/2012(H3N2)和/或A/Henan-Muye/35/2012(H3N2)；
所述H1N1/2009亚型流感病毒为A/California/04/2009(H1N1)、A/canine/Beijing/cau9/2009(H1N1)、A/canine/Beijing/cau2/2009(H1N1)、A/Beijing/7/2009(H1N1)和/或A/Beijing/132/2010(H1N1)。
本发明提供了一组能同时检测H3N2亚型犬流感病毒、H3N8亚型犬流感病毒、季节性H3N2亚型人流感病毒和H1N1/2009亚型流感病毒的引物组合物，并在此基础上建立了一种能同时检测这四种病毒的多重RT-PCR方法。本发明提供的方法较血凝抑制传统方法更快捷，且覆盖范围广，不仅能够检出经典类型毒株，还能检出近年来最新的流行变异株，具有很好的覆盖性和通用性。本发明的方法不仅可以检测临床采集的样品如鼻咽拭子，而且也可对病毒尿囊液进行检测，操作简单、容易推广，便于基层操作和应用，成为犬流感病毒诊断和流行病学调查的有用检测工具。本发明对及时诊断、及时治疗发病犬，及时预测流行趋势，预防流感大流行，以及开展大规模犬流感病毒的流行病学监测有着积极的意义。
附图说明
图1为特异性检测。
图2为灵敏度检测。
图3为敏感性检测。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
Trizol购自invitrogen公司，产品目录号为15596-026。
Ribolock Rnase Inhibitor购自fermentas公司，产品目录号为EO0381。
dNTP Mix购自fermentas公司，产品目录号为R0191。
RevertAid Reverse Transcriptase购自fermentas公司，产品目录号为EP0441，内含5×Reaction Buffer(pH 8.3的250 mM Tris-HCl,250 mM KCl,20 mM MgCl2,50mM DTT)。
2×EasyTaq PCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为AS111，包含EasyTaq DNA聚合酶、dNTPs和优化的反应缓冲液，浓度为2×。
H3N2亚型犬流感病毒A/canine/Beijing/364/2009(H3N2)、A/canine/Beijing/359/2009(H3N2)、A/canine/Beijing/362/2009(H3N2)、A/canine/Beijing/305/2009(H3N2)、A/canine/Beijing/418/2010(H3N2)在文献“Sun Y.,Sun S.,Ma J.,Tan Y.,Du L.,Shen Y.,Mu Q.,Pu J.,Lin D.,and LiuJ..Identification and characterization of avian-origin H3N2 canine influenzaviruses in northern China during 2009-2010.Virology 435(2),301-307(2013)”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
季节性H3N2亚型人流感病毒A/Jiangxi/262/05(H3N2)在文献“Sun Y.,Bi Y.,Pu J.,Hu Y.,Wang J.,Gao H.,Liu L.,Xu Q.,Tan Y.,Liu M.,Guo X.,Yang H.,and Liu J.Guinea pig model for evaluating the potential public health riskof swine and avian influenza viruses.Plos One 5(11),e15537(2010)”中公开过，A/Beijing-Xicheng/11542/2011(H3N2)、A/Beijing-Huairou/1458/2012(H3N2)、A/Anhui-Baohe/1127/2012(H3N2)、A/Henan-Muye/35/2012(H3N2)在文献“黄维娟,成艳辉,李希妍,赵翔,郭俊峰,王钊,谭敏菊,李明,隋竑弢,隗合江，陈瑶瑶，肖宁,蓝雨，王大燕,舒跃龙.2011-2012年度中国H3N2亚型流感病毒病原学特征分析[J].病毒学报，2013，29(3):258-264”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
H3N8亚型犬流感病毒A/canine/California/70645-4/2006(H3N8),A/canine/Colorado/6723-8/2008(H3N8),A/canine/Colorado/30604/2006(H3N8),A/canine/Colorado/17864/2006(H3N8)和A/canine/Colorado/8880/2006(H3N8)在文献“Rivailler,P.,Perry,I.A.,Jang,Y.,Davis,C.T.,Chen L.M.,Dubovi,E.J.,and Donis,R.O.Evolution of canine and equine influenza(H3N8)virusesco-circulating between 2005 and 2008.Virology 408(1),71-79(2010)”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
H1N1/2009亚型流感病毒A/California/04/2009(H1N1)在文献“Garten,R.J.,Davis,C.T.,Russell,C.A.,Shu,B.,Lindstrom,S.,Balish,A.,Sessions,W.M.,Xu,X.,Skepner,E.,Deyde,V.,Okomo-Adhiambo,M.,Gubareva,L.,Barnes,J.,Smith,C.B.,Emery,S.L.,Hillman,M.J.,Rivailler,P.,Smagala,J.,de Graaf,M.,Burke,D.F.,Fouchier,R.A.,Pappas,C.,Alpuche-Aranda,C.M.,Lopez-Gatell,H.,Olivera,H.,Lopez,I.,Myers,C.A.,Faix,D.,Blair,P.J.,Yu,C.,Keene,K.M.,Dotson,P.D.Jr.,Boxrud,D.,Sambol,A.R.,Abid,S.H.,St George,K.,Bannerman,T.,Moore,A.L.,Stringer,D.J.,Blevins,P.,Demmler-Harrison,G.J.,Ginsberg,M.,Kriner,P.,Waterman,S.,Smole,S.,Guevara,H.F.,Belongia,E.A.,Clark,P.A.,Beatrice,S.T.,Donis,R.,Katz,J.,Finelli,L.,Bridges,C.B.,Shaw,M.,Jernigan,D.B.,Uyeki,T.M.,Smith,D.J.,Klimov,A.I.and Cox,N.J.Antigenic and genetic characteristics of swine-origin 2009 A(H1N1)influenzaviruses circulating in humans.Science 325(5937),197-201(2009)”中公开过，A/canine/Beijing/cau2/2009(H1N1)和A/canine/Beijing/cau9/2009(H1N1)在文献“Degui Lin,Shasha Sun,Lijie Du,Jingjiao Ma,Linghong Fan,Juan Pu,YipengSun,Jingyi Zhao,Honglei Sun and Jinhua Liu.Natural and experimental infectionof dogs with pandemic H1N1/2009 influenza virus.Journal of General Virology93,119-123(2012)”中公开过，A/Beijing/7/2009(H1N1)和A/Beijing/132/2010(H1N1)在文献“Yipeng Sun,Qi Xu,Ye Shen,Linqing Liu,Kai Wei,Honglei Sun,JuanPu,Kin-Chow Chang,Jinhua Liua.Naturally Occurring Mutations in the PA GeneAre Key Contributors to Increased Virulence of Pandemic H1N1/09 Influenza Virusin Mice.J.Virol.2014,88(8):4600.”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
犬瘟病毒(CDV-WZ)在文献“刘巧荣，包新奇，孙明，王芳，乔明明，李佳，陈曦，秦亚嫂，陈西钊.感染CDV的犬病料N、H、F基因的克隆与序列分析[J].中国比较医学杂志，2011，21(4)：37-41”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
犬细小病毒(CPV/BJ005/07)在文献“宋永奇，李玉燕，吕艳丽，韩博.犬细小病毒VP2基因序列分析[J].中国农学通报,2008,24(7):26-31”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
实施例1、临床样品检测
一、临床样品的采集
临床棉拭子：鼻拭子或咽拭子。4℃保存，24小时内送实验室检测。
二、样品处理
将棉拭子分别浸入1mlPBS溶液(含1万单位青霉素、链霉素)中，充分捻动，拧干后弃去拭子，将溶液4℃8000rpm离心5min，取上清液为样本液，4℃保存备用。
三、阳性对照为临床感染H3N2亚型犬流感病毒和实验分别感染H3N8亚型犬流感病毒、H1N1/2009亚型流感病毒或季节性H3N2亚型人流感病毒的犬的鼻拭子或咽拭子。4℃保存，24小时内送实验室检测，按照步骤二的方法进行处理。阴性对照为灭菌双蒸水，4℃保存备用。
四、设计并合成针对H3N2亚型犬流感病毒，H3N8亚型犬流感病毒，H1N1/2009亚型流感病毒和季节性H3N2亚型人流感病毒HA基因高度保守区域的引物，如表1所示。
表1 引物组合物
表1中，H3N8-485F和H3N8-632R分别为扩增H3N8亚型犬流感病毒的上游引物和下游引物，hH3N2-818F和hH3N2-1120R分别为扩增季节性H3N2亚型人流感病毒的上游引物和下游引物，H1N1-679F和H1N1-1085R分别为扩增H1N1/2009亚型流感病毒的上游引物和下游引物，cH3N2-602F和cH3N2-1145R分别为扩增H3N2亚型犬流感病毒的上游引物和下游引物。
五、病毒RNA的反转录
1、分别取处理后的样本液、阴性对照和阳性对照300μl，加900ul TRIZOL，轻轻颠倒混匀10次。
2、加200μl氯仿，颠倒混匀10次，冰浴5-10min，期间轻轻颠倒混匀。4℃13000r/min离心15min，得上清。
3、取700μl上清液移入新的离心管，加入等量的异丙醇，轻轻颠倒混匀，混匀后，-20℃放置15min，4℃13000r/min离心15min。
4、弃上清，贴壁缓缓加1ml体积百分含量为75％的乙醇的DEPC水溶液，加完后轻转两圈。4℃13000r/min离心5min。
5、弃上清，先用黄色枪头吸干残留液体，瞬离后，再用白色枪头吸干，置于冰上风干5min。
6、加入11μl无RNA酶水溶解，立即加入1μl Uni12引物，瞬离后，70℃水浴5min后，立即冰激1min。
Uni12引物：5’-AGCAAACGACC-3’(SEQ ID No.9)
7、依次加入如下试剂，RT体系(/每管)为20μl：
之后，瞬离，放于37℃水浴1h，之后70℃5min，得到cDNA，4℃保存。
六、PCR反应
PCR反应体系：
每管反应体系为25μl，反应体系如下：
混匀，并作好标记。
PCR反应程序：
94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃35s，30个循环；72℃10min；4℃24h。
得到样本液、阴性对照和阳性对照的PCR扩增产物。
七、电泳
各取5μl各PCR扩增产物和Marker进行琼脂糖凝胶电泳，结果表明，各阳性对照出现预期大小的目的条带，阴性对照无目的条带出现。被检的样本液中出现544bp的扩增带，表明样品中含有H3N2亚型犬流感病毒。
实施例2、引物组合物的特异性检测
一、总RNA的提取及反转录
取H3N2亚型犬流感病毒(A/canine/Beijing/364/2009(H3N2))、季节性H3N2亚型人流感病毒(A/Jiangxi/262/05(H3N2))、H3N8亚型犬流感病毒(A/canine/California/70645-4/2006(H3N8))、H1N1/2009亚型流感病毒(A/California/04/2009(H1N1))及这四种病毒的混合液、犬瘟病毒(CDV-WZ)，犬细小病毒(CPV/BJ005/07)及阴性拭子样品(处理方法同实施例1中步骤二)，提取各样品的总RNA并反转录合成cDNA，方法同实施例1中步骤五。
二、PCR扩增检测引物组合物的特异性
分别以步骤一的各cDNA为模板，以表1的四对引物的组合物为引物进行PCR扩增，同时设置双蒸水对照，得到各PCR扩增产物，方法同实施例1中的步骤六。
三、电泳
取各PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。
图1中，M、1、2、3、4、5、6、7、8、9分别代表TransDNA Marker Ⅰ(从上至下依次为700bp，600bp，500bp，400 bp，300bp，200bp，100bp)、四种病毒(H3N8亚型犬流感病毒(A/canine/California/70645-4/2006(H3N8))，季节性H3N2亚型人流感病毒(A/Jiangxi/262/05(H3N2))，H1N1/2009亚型人流感病毒(A/California/04/2009(H1N1))和H3N2亚型犬流感病毒(A/canine/Beijing/364/2009(H3N2))的混合液、H3N8亚型犬流感病毒(A/canine/California/70645-4/2006(H3N8))、季节性H3N2亚型人流感病毒(A/Jiangxi/262/05(H3N2))、H1N1/2009亚型流感病毒(A/California/04/2009(H1N1))、H3N2亚型犬流感病毒(A/canine/Beijing/364/2009(H3N2))、CDV(CDV-WZ)、CPV(CPV/BJ005/07)、阴性拭子样品及双蒸水对照。
图1表明，H3N2亚型犬流感病毒(A/canine/Beijing/364/2009(H3N2))经上述检测仅可见544bp扩增带，H1N1/2009亚型流感病毒(A/California/04/2009(H1N1))经检测仅可见407bp扩增带，季节性H3N2亚型人流感病毒(A/Jiangxi/262/05(H3N2))经检测仅可见303bp扩增带，H3N8亚型犬流感病毒(A/canine/California/70645-4/2006(H3N8))经检测仅可见148bp扩增带，而四种病毒的混合液扩增出了四条预期大小的特异性条带。而CDV，CPV，双蒸水及阴性拭子样品均无任何目的条带。结果表明，表1的引物组合物的特异性良好。
实施例3、引物组合物的灵敏度检测
一、各个稀释液的制备
分别将H3N2亚型犬流感病毒(A/canine/Beijing/364/2009(H3N2))、季节性H3N2亚型人流感病毒(A/Jiangxi/262/05(H3N2))、H3N8亚型犬流感病毒(A/canine/California/70645-4/2006(H3N8))、H1N1/2009亚型流感病毒(A/California/04/2009(H1N1))及这四种病毒混合液用双抗PBS溶液(双抗PBS溶液配制方法如下：Na2HPO4·12H202.9g，KH2PO40.2g，NaCl 8g,KCl 0.2g，加入蒸馏水定容至1L,高压灭菌后加入1万单位青霉素和链霉素)稀释，制成病毒含量分别为1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100、1×10-1TCID50/100μl的各个病毒及病毒混合液的稀释液。
二、分别提取各个病毒及病毒混合液的稀释液的总RNA并反转录合成cDNA，方法同实施例1中步骤五。
三、PCR扩增检测引物组合物的灵敏度
分别以步骤一的各cDNA为模板，以表1的四对引物的组合物为引物进行PCR扩增，同时设置双蒸水为阴性对照，得到各PCR扩增产物，方法同实施例1中的步骤六。
四、电泳
取各PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。
图2中，A为H3N8亚型犬流感病毒(A/canine/California/70645-4/2006(H3N8))、季节性H3N2亚型人流感病毒(A/Jiangxi/262/05(H3N2))、H1N1/2009亚型流感病毒(A/California/04/2009(H1N1))和H3N2亚型犬流感病毒(A/canine/Beijing/364/2009(H3N2))的灵敏度，1、2、3、4、5、6、7分别为病毒液的浓度为1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100、1×10-1TCID50/100ul时的PCR电泳条带，8为阴性对照。B为四种病毒(H3N8亚型犬流感病毒(A/canine/California/70645-4/2006(H3N8))，季节性H3N2亚型人流感病毒(A/Jiangxi/262/05(H3N2))，H1N1/2009亚型人流感病毒(A/California/04/2009(H1N1))和H3N2亚型犬流感病毒(A/canine/Beijing/364/2009(H3N2))的混合液的灵敏度，1、2、3、4、5、6分别为病毒混合液的浓度为1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100TCID50/100ul时的PCR电泳条带，7为阴性对照。M代表TransDNAMarkerⅠ(从上至下依次为700bp，600bp，500bp，400 bp，300bp，200bp，100bp)。
图2表明，浓度为1×100TCID50/100μl及以上的H3N2亚型犬流感病毒，浓度为1×100TCID50/100μl及以上的H3N8亚型犬流感病毒，浓度为1×101TCID50/100μl及以上的H1N1/2009亚型流感病毒和浓度为1×100TCID50/100μl及以上的季节性H3N2亚型人流感病毒均得到了预期大小的特异性条带，浓度为1×103TCID50/100μl及以上的四种病毒混合液均得到了4条预期大小的特异性条带，说明建立的四重RT-PCR方法灵敏度非常高。
实施例4、引物组合物的敏感性检测
一、样品准备
分别选取5株H3N2亚型犬流感病毒(A/canine/Beijing/364/2009(H3N2)，A/canine/Beijing/359/2009(H3N2)，A/canine/Beijing/362/2009(H3N2)，A/canine/Beijing/305/2009(H3N2)和A/canine/Beijing/418/2010(H3N2))，5株季节性H3N2亚型人流感病毒(A/Jiangxi/262/05(H3N2)，A/Beijing-Xicheng/11542/2011(H3N2)、A/Beijing-Huairou/1458/2012(H3N2)、A/Anhui-Baohe/1127/2012(H3N2)、A/Henan-Muye/35/2012(H3N2))，5株H3N8亚型犬流感病毒(A/canine/California/70645-4/2006(H3N8),A/canine/Colorado/6723-8/2008(H3N8),A/canine/Colorado/30604/2006(H3N8)，A/canine/Colorado/17864/2006(H3N8)和A/canine/Colorado/8880/2006(H3N8))及5株H1N1/2009亚型流感病毒(A/California/04/2009(H1N1)，A/canine/Beijing/cau9/2009(H1N1)，A/canine/Beijing/cau2/2009(H1N1),A/Beijing/7/2009(H1N1)和A/Beijing/132/2010(H1N1)的病毒液，以及H3N8亚型犬流感病毒(A/canine/California/70645-4/2006(H3N8))，季节性H3N2亚型人流感病毒(A/Jiangxi/262/05(H3N2))，H1N1/2009亚型流感病毒(A/California/04/2009(H1N1))和H3N2亚型犬流感病毒(A/canine/Beijing/364/2009(H3N2))的混合液进行敏感性检测。
分别提取总RNA并反转录合成cDNA，方法同实施例1中步骤五。
二、PCR扩增检测引物组合物的敏感性
分别以步骤一的各cDNA为模板，以表1的四对引物的组合物为引物进行PCR扩增，同时设置双蒸水为阴性对照，得到各PCR扩增产物，方法同实施例1中的步骤六。
三、电泳
取各PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。
图3中，A、B、C、D分别为H3N8亚型犬流感病毒、季节性H3N2亚型人流感病毒、H1N1/2009亚型流感病毒和H3N2亚型犬流感病毒的敏感性检测。其中A、B、C、D中的M代表TransDNA MarkerⅠ(从上至下依次为700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)，1代表H3N8亚型犬流感病毒(A/canine/California/70645-4/2006(H3N8))，季节性H3N2亚型人流感病毒(A/Jiangxi/262/05(H3N2))，H1N1/2009亚型流感病毒(A/California/04/2009(H1N1))和H3N2亚型犬流感病毒(A/canine/Beijing/364/2009(H3N2))的混合液，7代表阴性对照。
A中2、3、4、5、6分别代表毒株A/canine/California/70645-4/2006(H3N8)、A/canine/Colorado/6723-8/2008(H3N8)、A/canine/Colorado/30604/2006(H3N8)、A/canine/Colorado/17864/2006(H3N8)和A/canine/Colorado/8880/2006(H3N8)。
B中2、3、4、5、6分别代表毒株A/Jiangxi/262/05(H3N2)，A/Beijing-Xicheng/11542/2011(H3N2)、A/Beijing-Huairou/1458/2012(H3N2)、A/Anhui-Baohe/1127/2012(H3N2)和A/Henan-Muye/35/2012(H3N2)。
C中2、3、4、5、6分别代表毒株A/California/04/2009(H1N1)、A/canine/Beijing/cau9/2009(H1N1)、A/canine/Beijing/cau2/2009(H1N1)、A/Beijing/7/2009(H1N1)和A/Beijing/132/2010(H1N1)。
D中2、3、4、5、6分别代表毒株A/canine/Beijing/364/2009(H3N2)、A/canine/Beijing/359/2009(H3N2)、A/canine/Beijing/362/2009(H3N2)、A/canine/Beijing/305/2009(H3N2)和A/canine/Beijing/418/2010(H3N2)。
图3表明，同一类型的毒株均得到了预期大小的目的条带。结果表明，表1的引物组合物的敏感性良好。
Claims (7)
1.一组引物组合物，由如下(1)-(4)任意所示的引物对组成：
(1)SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(2)SEQ ID No.3所示的DNA分子和SEQ ID No.4所示的DNA分子；
(3)SEQ ID No.5所示的DNA分子和SEQ ID No.6所示的DNA分子；
(4)SEQ ID No.7所示的DNA分子和SEQ ID No.8所示的DNA分子；
所述SEQ ID No.1所示的DNA分子、SEQ ID No.3所示的DNA分子、SEQ ID No.5所示的DNA分子、SEQ ID No.7所示的DNA分子为上游引物；
所述SEQ ID No.2所示的DNA分子、SEQ ID No.4所示的DNA分子、SEQ ID No.6所示的DNA分子、SEQ ID No.8所示的DNA分子为下游引物；
所述SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子分别为扩增H3N8亚型犬流感病毒的上游引物和下游引物，所述SEQ ID No.3所示的DNA分子和SEQ IDNo.4所示的DNA分子分别为扩增季节性H3N2亚型人流感病毒的上游引物和下游引物，所述SEQ ID No.5所示的DNA分子和SEQ ID No.6所示的DNA分子分别为扩增H1N1/2009亚型流感病毒的上游引物和下游引物，所述SEQ ID No.7所示的DNA分子和SEQ ID No.8所示的DNA分子分别为扩增H3N2亚型犬流感病毒的上游引物和下游引物。
2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于：所述引物组合物由如下(1)-(4)所示的引物对组成：
(1)SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(2)SEQ ID No.3所示的DNA分子和SEQ ID No.4所示的DNA分子；
(3)SEQ ID No.5所示的DNA分子和SEQ ID No.6所示的DNA分子；
(4)SEQ ID No.7所示的DNA分子和SEQ ID No.8所示的DNA分子。
3.一种检测或辅助检测样品中是否含有H3N2亚型犬流感病毒、H3N8亚型犬流感病毒、季节性H3N2亚型人流感病毒和/或H1N1/2009亚型流感病毒的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1或2所述的引物组合物。
4.一种检测或辅助检测样品中是否含有H3N2亚型犬流感病毒、H3N8亚型犬流感病毒、季节性H3N2亚型人流感病毒和/或H1N1/2009亚型流感病毒的方法，包括如下步骤：以样品的cDNA为模板，以权利要求1或2所述的引物组合物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果PCR扩增产物中有148bp的片段，则样品候选为含有H3N8亚型犬流感病毒的样品，如果PCR扩增产物中有303bp的片段，则样品候选为含有季节性H3N2亚型人流感病毒的样品，如果PCR扩增产物中有407bp的片段，则样品候选为含有H1N1/2009亚型流感病毒的样品，如果PCR扩增产物中有544bp的片段，则样品候选为含有H3N2亚型犬流感病毒的样品；
所述148bp的片段为以SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子为引物扩增得到的；
所述303bp的片段为以SEQ ID No.3所示的DNA分子和SEQ ID No.4所示的DNA分子为引物扩增得到的；
所述407bp的片段为以SEQ ID No.5所示的DNA分子和SEQ ID No.6所示的DNA分子为引物扩增得到的；
所述544bp的片段为以SEQ ID No.7所示的DNA分子和SEQ ID No.8所示的DNA分子为引物扩增得到的。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述PCR的体系为：ddH2O6.5μl，2×PCR扩增缓冲液12.5μl，权利要求1或2所述的引物组合物中浓度为20μmol/μl的各上游引物各0.5μl，权利要求1或2所述的引物组合物中浓度为20μmol/μl的各下游引物各0.5μl，cDNA2μl；
所述2×PCR扩增缓冲液的商品名称具体为2×EasyTaq PCR SuperMix，购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为AS111，包含EasyTaq DNA聚合酶、dNTPs和优化的反应缓冲液，浓度为2×；
所述PCR的反应程序为94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃35s，30个循环；72℃10min；4℃24h。
6.权利要求1或2所述的引物组合物在制备检测或辅助检测样品中是否含有H3N2亚型犬流感病毒、H3N8亚型犬流感病毒、季节性H3N2亚型人流感病毒和/或H1N1/2009亚型流感病毒的产品中的应用。
7.权利要求3所述的试剂盒在制备检测或辅助检测样品中是否含有H3N2亚型犬流感病毒、H3N8亚型犬流感病毒、季节性H3N2亚型人流感病毒和/或H1N1/2009亚型流感病毒的产品中的应用。
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105821158A (zh) * | 2016-04-11 | 2016-08-03 | 公安部南京警犬研究所 | 用于检测犬流感病毒的rt-lamp引物组合物、试剂盒及其应用 |
| CN106636475A (zh) * | 2017-03-01 | 2017-05-10 | 中国农业大学 | 一种检测北美h3n8亚型犬流感病毒的引物组及其应用 |
| CN106676103A (zh) * | 2017-03-01 | 2017-05-17 | 中国农业大学 | 一种检测北美h3n1亚型猪流感病毒的引物组及其应用 |
| CN107447051A (zh) * | 2017-09-13 | 2017-12-08 | 北京美康基因科学股份有限公司 | 甲型h3/h1n1(2009)/h1n1流感病毒多重荧光pcr检测试剂盒及其用途 |
| CN110592276A (zh) * | 2019-07-08 | 2019-12-20 | 北京世纪元亨动物防疫技术有限公司 | 用于检测犬流感病毒的特异性引物及试剂盒 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1635163A (zh) * | 2004-11-01 | 2005-07-06 | 中国农业大学 | 一种检测h5n1亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒 |
| CN102304591A (zh) * | 2011-10-08 | 2012-01-04 | 中国农业大学 | 鉴定h3亚型禽流感病毒的pcr引物对及其应用 |
-
2014
- 2014-07-28 CN CN201410363681.8A patent/CN104131009B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1635163A (zh) * | 2004-11-01 | 2005-07-06 | 中国农业大学 | 一种检测h5n1亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒 |
| CN102304591A (zh) * | 2011-10-08 | 2012-01-04 | 中国农业大学 | 鉴定h3亚型禽流感病毒的pcr引物对及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SUN Y ET AL.: "Identification and characterization of avian-origin H3N2 canine influenza viruses in northern China during 2009-2010", 《VIROLOGY》, 31 December 2013 (2013-12-31), pages 301 - 307 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105821158A (zh) * | 2016-04-11 | 2016-08-03 | 公安部南京警犬研究所 | 用于检测犬流感病毒的rt-lamp引物组合物、试剂盒及其应用 |
| CN106636475A (zh) * | 2017-03-01 | 2017-05-10 | 中国农业大学 | 一种检测北美h3n8亚型犬流感病毒的引物组及其应用 |
| CN106676103A (zh) * | 2017-03-01 | 2017-05-17 | 中国农业大学 | 一种检测北美h3n1亚型猪流感病毒的引物组及其应用 |
| CN106636475B (zh) * | 2017-03-01 | 2020-05-22 | 中国农业大学 | 一种检测北美h3n8亚型犬流感病毒的引物组及其应用 |
| CN107447051A (zh) * | 2017-09-13 | 2017-12-08 | 北京美康基因科学股份有限公司 | 甲型h3/h1n1(2009)/h1n1流感病毒多重荧光pcr检测试剂盒及其用途 |
| CN110592276A (zh) * | 2019-07-08 | 2019-12-20 | 北京世纪元亨动物防疫技术有限公司 | 用于检测犬流感病毒的特异性引物及试剂盒 |
Also Published As
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