TWI702293B - 用於a型流感病毒及b型流感病毒檢測之方法 - Google Patents

用於a型流感病毒及b型流感病毒檢測之方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI702293B
TWI702293B TW107138861A TW107138861A TWI702293B TW I702293 B TWI702293 B TW I702293B TW 107138861 A TW107138861 A TW 107138861A TW 107138861 A TW107138861 A TW 107138861A TW I702293 B TWI702293 B TW I702293B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
influenza
virus
primer
probe
Prior art date
Application number
TW107138861A
Other languages
English (en)
Other versions
TW202018093A (zh
Inventor
單亦智
蘇家興
Original Assignee
新加坡商克雷多生物醫學私人有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 新加坡商克雷多生物醫學私人有限公司 filed Critical 新加坡商克雷多生物醫學私人有限公司
Priority to TW107138861A priority Critical patent/TWI702293B/zh
Priority to EP19188685.2A priority patent/EP3647438A1/en
Priority to JP2019139726A priority patent/JP7064473B2/ja
Priority to KR1020190135341A priority patent/KR20200050872A/ko
Priority to US16/669,510 priority patent/US11639532B2/en
Publication of TW202018093A publication Critical patent/TW202018093A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI702293B publication Critical patent/TWI702293B/zh
Priority to KR1020220039622A priority patent/KR20220044707A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
    • C12Q2565/101—Interaction between at least two labels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Abstract

本發明揭示一種藉由分別檢測基質基因及非結構基因來檢測可疑樣品中A型流感病毒及B型流感病毒的方法。該信號可由螢光檢測系統檢測。

Description

用於A型流感病毒及B型流感病毒檢測之方法
本發明係關於一種檢測人體組織樣品中之A型流感病毒(Flu A)及B型流感病毒(Flu B)的方法。具體而言，針對Flu A，本發明提供用於檢測A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9中之至少一者的引子、探針及其他相關試劑。針對Flu B，本發明提供用於檢測B型流感病毒之引子、探針及其他相關試劑。
流感在全世界之局部暴發或流行病中為常見的。流行病隨時都有可能出現，但通常集中在高濕度之月份。其突然發生，幾乎沒有預兆。受影響之人數可能從幾百至幾十萬不等。流行病可能係短暫的，持續幾天或幾週，但是更大的流行病則可持續幾個月。雖然流感在大多數個體中為一種輕度疾病，但其對老年人或虛弱的個體而言卻會危及生命。流行病導致生產力之巨大損失。世界衛生組織(WHO)委託建立了一個國際通信實驗室網路，以監測傳染性病毒中之抗原變化及感染之傳播。
根據世界衛生組織之調研及資料，A型及B型流感病毒佔流感檢測之大多數。人類A型及B型流感病毒幾乎每年冬天都會在北美、東亞及東南亞造成季節性疾病流行。C型流感感染通常會引起輕度呼吸道疾病，並且認為不會引起流行病。D型流感病毒只會影響牛，並且未發現其會感染人或給人帶來疾病。
基於病毒表面上之以下兩種蛋白質，將A型流感病毒分成各種亞型：血球凝集素(H)及神經胺糖酸酶(N)。有18種不同的血球凝集素亞型及11種不同的神經胺糖酸酶亞型。A型流感病毒可以進一步分解成不同的病毒株。A型流感病毒屬於正黏病毒科(Orthomyxoviridae)之正黏病毒屬，其為一種具有螺旋對稱性之ssRNA包膜病毒。A型流感病毒之基因組為分段的，具有8個RNA片段。A型流感病毒上存在四種抗原，即血球凝集素(HA)、神經胺糖酸酶(NA)、核衣殼(NP)及基質(M)蛋白。NA為一種類型特異性抗原，以A、B及C三種形式存在，為人類流感病毒之分類提供基礎。基質蛋白包圍核衣殼並佔顆粒質量之35-45%。HA介導病毒對細胞受體之附著。神經胺糖酸酶分子在包膜中以較少之數量存在。
A型流感病毒為人類季節性流感之主要成員，能夠感染所有年齡的人並引起甚至可能導致死亡之嚴重疾病。季節性流感為由A型流感病毒引起之一種重要的全球人類呼吸道疾病，一年四季普遍存在於熱帶地區，而溫帶地區主要發生在冬季，具有一定的季節性流行病特徵。目前有兩種A型流感病毒亞型在人類中傳播，其可導致全球大流行性感染，亦即H1Nl及H3N2。此外，認為H5N1及H7N9亦為重要的亞型，因為在人類中，H5N1及H7N9感染可能引起嚴重的疾病並且具有高死亡率。
B型流感病毒為病毒科正黏病毒科中之另一個屬。B型流感病毒基因組長14548個核苷酸並由8段線性負義單股RNA組成。分成多部分之基因組經衣殼化，每段處於單獨的核衣殼中，並且核衣殼由一個包膜包圍。B型流感病毒不分亞型，但可以進一步分解為譜系及病毒株。目前，基於表面糖蛋白血球凝集素之抗原性質，B型流感病毒存在兩種共循環譜系。此等譜系由稱為B型/山形(Yamagata)/16/88樣病毒及B型/維多利亞(Victoria)/2/87樣病毒。B型流感病毒之衣殼由包膜包裹，而其病毒粒子則由包膜、基質蛋白、核蛋白複合物、核衣殼及聚合酶複合物組成。
A型及B型流感病毒感染藉由呼吸道飛沫傳播。病毒顆粒與呼吸道上皮細胞結合，後者富含病毒受體。存在於病毒顆粒上之神經胺糖酸酶藉由釋放已經由上皮細胞表面上存在之黏液結合的病毒顆粒來幫助感染過程。流感之典型症狀出現在感染後，並且包括明顯的發燒、頭痛、畏光、顫抖、乾咳、不適、肌痛及喉嚨乾癢。發燒為連續的，持續3天左右。雖然B型流感病毒之症狀及治療與A型流感病毒之症狀及治療相似，但B型流感病毒引發嚴重併發症之幾率低於A型流感病毒。
A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9均為高度傳染性的並且能夠引起嚴重的併發症。其中一種A型流感亞型H5N1特別受到關注，因為其比其他A型流感亞型及B型流感病毒更快地發生突變，已被證實具有高致病性，會在男性中引起嚴重疾病。因此，為了即時監測突變，重要的是區分A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9與B型流感病毒。
現如今存在可用於檢測A型及B型流感病毒之RNA的RT-PCR分析，其提供最大的靈敏度及特異性。此外，可以對PCR產物進行定序以進行病毒株鑑定。最敏感及最受歡迎的樣本為鼻咽拭子。然而，考慮到在獲取鼻咽拭子時所涉及之困難，咽拭子及鼻拭子更為常用。
鑒於上述情況，有必要開發一種具有高準確度及高穩定性之分析，用於同時檢測可疑樣品中之A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9中之至少一者及B型流感病毒。
本發明之目的為提供一種檢測方法，用於檢測可疑樣品中A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9之基質基因(下文稱「M基因」)之存在，以及用於同時檢測可疑樣品中B型流感病毒之非結構基因(下文稱「NS基因」)之存在。更確切而言，若可疑樣品含有A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9中之至少一者，則本發明將檢測到這至少一種亞型。若可疑樣品含有B型流感病毒之至少一種病毒株，則本發明將檢測到這至少一種病毒株。另外，若可疑樣品含有A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1中之至少一者及B型流感病毒，則本發明將分別檢測到此等。
具體而言，本發明之目的為提供指定的引子及探針，用於分別檢測可疑樣品中A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9以及B型流感病毒之存在。指定的探針及引子對A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9以及B型流感病毒具有特異性。此過程中亦包括具有核酸外切酶水解能力之模板依賴性聚合酶。根據本發明，此目的藉由一種檢測可疑樣品中A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9中之至少一者及/或B型流感病毒之存在的方法來達成，該方法包含以下步驟： (a)    提供懷疑含有A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9之M基因及/或B型流感病毒之NS基因的樣品； (b)    提供對A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9之M基因具有特異性的一對引子，其包含正向引子及反向引子，其中該正向引子選自以下之群：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8；並且該反向引子選自以下之群：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:18； (c)    提供對B型流感病毒之NB基因具有特異性的一對引子，其包含正向引子及反向引子，其中該正向引子選自以下之群：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:25；並且該反向引子選自以下之群：SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35及SEQ ID NO:36； (d)    用逆轉錄酶及模板依賴性聚合酶擴增可疑樣品中所含之核酸； (e)    在步驟(d)期間，將兩個不同探針與可疑樣品中所含之核酸黏接，形成雜交產物，其中對A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9具有特異性之第一探針選自以下之群：SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10；並且對B型流感病毒具有特異性之第二探針選自以下之群：SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:28；以及 (f)    檢測由RT-PCR產物產生之兩個不同信號，分別作為A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9及/或B型流感病毒之靶核酸之存在的指示。
根據本發明，由雜交產物產生之信號可以藉由螢光檢測系統檢測。兩個不同信號中對第一探針具有特異性的一個信號指示A型流感亞型H1N1、N3N2、H5N1及/或H7N9之存在，而對第二探針具有特異性的另一個信號指示B型流感病毒之存在。
提供此發明內容係為了簡要地標識本發明之一些態樣，此等態樣將在下面之具體實施方式中進一步加以描述。此發明內容不旨在標識本發明之關鍵或必要特徵，亦不旨在限制任何申請專利範圍之範圍。術語「態樣」將理解為「至少一個態樣」。上文所描述之態樣及本文中所描述之本發明之其他態樣藉由示例之方式示出，並且不限於附圖。
以下僅說明本發明之原理。因此，應當理解，熟習此項技術者將能夠設計出各種配置，此等配置雖然未在本文中明確描述或示出，但體現本發明之原理且包括在其精神及範圍內。
此外，本文中所敍述之所有實例及條件語言主要明確地旨在僅用於教授目的以輔助讀者理解本發明之原理及發明人所提供之概念以深入該領域，且應詮釋為不限於此等特定敍述之實例及條件。
此外，本文中敍述本發明之原理、態樣及實施例以及其特定實例之所有陳述均意欲涵蓋其結構及功能等效物。另外，此等效物旨在包括當前已知之等效物以及未來開發之等效物，亦即任何後來開發之執行相同功能之要素，不論結構。
除非本文另有明確說明，圖式未按比例繪製。
為了確保該方法可以成功地進行，本發明提供一種PCR或即時PCR分析，用於使用TaqMan探針與共軛的小溝結合物(minor groove binder，MGB)配體之快速鑑定。
在此分析中，用不同的螢光報導分子來標記類型特異性探針已確保類型特異性螢光之檢測。在此分析中施加之Taq聚合酶為具有核酸外切酶水解功能之DNA依賴性聚合酶。藉由螢光報導分子之片段之數量來檢測螢光信號，該螢光報導分子之片段係藉由DNA依賴性聚合酶之核酸外切酶水解而由與靶核酸雜交之探針上切割下來。該引子及/或探針包含經修飾之核苷酸或非核苷酸化合物。
目前，H1Nl及H3N2為兩種常見的A型流感亞型，其導致在人類中傳播之全球大流行性感染。另一方面，儘管H5N1及H7N9為不常見的A型流感亞型，但其極可能在人類中引起嚴重疾病並導致高死亡率。因此，儘早檢測這四種A型流感亞型為重要的，以便儘早開始治療。此外，由於這四種亞型均重要，因此不需要區分可疑樣品中任一亞型與其他亞型。本發明揭示一種檢測所有四種A型流感亞型H1Nl、H3N2、H5N1及H7N9中共有並存在之特定序列的方法。若本發明對可疑樣品之檢測結果為陽性，則意味存在至少一種亞型。隨後可以開始早期治療。
M基因(SEQ ID NO:1)存在於A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9中，並且以二聚體之形式轉譯成位於病毒包膜下方之基質蛋白(下文稱為「M蛋白」)，並與病毒核糖核蛋白(viral ribonucleoprotein，vRNP)複合物相互作用，從而在內核組分與膜蛋白之間形成橋樑。vRNP攜帶宿主範圍之決定子。M蛋白與病毒RNA及vRNP接觸，從而促進RNP複合物之形成並引起RNP與核基質之解離。M基因藉由將病毒組分募集到組裝位點而在組裝過程中起重要作用，並且在包括病毒顆粒之形成之芽殖過程中起必不可少之作用。靶向M蛋白以賦予交叉亞型保護作用之新型疫苗已被證明是有希望的。
因此，鑒於M基因存在於A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9中，本發明中所揭示之所有引子及探針全都選自所有四種亞型之M基因並對其具有特異性，如圖1中所示。更確切而言，用於檢測A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9之正向引子選自以下之群：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8；並且反向引子選自以下之群：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:18。探針為SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10之群組中之一者，其亦對M基因具有特異性。螢光信號之存在指示樣品中之A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9。
NS基因存在於A型流感病毒及B型流感病毒中，該病毒在複製階段表現NS蛋白。然而，B型流感病毒之NS基因之獨特生物活性由以下指示：其對前體mRNA加工之抑制不足且與A型流感病毒之NS基因的序列一致性＜ 20%。NS蛋白為在B型流感病毒中發現之同源二聚體RNA結合蛋白，其為病毒複製之必需因子。在複製階段期間，NS蛋白結合mRNA之poly-A尾部以使其保持在細胞核中。鑒於B型流感病毒之NS基因(SEQ ID NO:19)在B型/山形/16/88樣及B型/維多利亞/2/87樣流感病毒中為高度保守的，所以本發明中所揭示之對B型流感病毒具有特異性之引子及探針序列選自NS基因。
Ms2，一種ssRNA噬菌體，通常在初步逆轉錄過程後用作生物實驗及病毒/病原體檢測中之內部對照。包括內部對照之應用，其用於監測靶病毒之充分加工及RT-PCR反應中抑制因子之存在，以防止由於抑制或人為錯誤導致之假陰性結果。因此，在以下實施例中，將ms2作為內部對照添加至含有待檢測之A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1、H7N9及/或B型流感病毒之檢測管中。由逆轉錄產生之ms2之全長互補DNA如由SEQ ID NO:37所表示。
使用TaqMan探針之本發明比傳統方法靈敏，其中本發明之檢測極限(下文稱為LOD)對於A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9以及B型流感病毒可達到101 個複製。因此，本發明適合A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9以及B型流感病毒之快速且明確的檢測。
在本發明之一個實施例中，提供一系列用於測試已知濃度(病毒顆粒複製數)樣品中之A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9以及B型流感病毒之LOD的步驟，包含以下步驟： (a)    從103 病毒複製數至102 及101 製備A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9中之至少一個亞型的兩個連續單一稀釋液，其中這三個連續稀釋液含有A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9之M基因； (b)    從103 病毒複製數至102 及101 製備B型流感病毒之至少一種亞型的兩個連續單一稀釋液，其中這三個連續稀釋液含有B型流感病毒之NS基因； (c)    提供對A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9之M基因具有特異性的一對引子，其包含正向引子及反向引子，其中該正向引子選自以下之群：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8；並且該反向引子選自以下之群：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:18； (d)    提供對B型流感病毒之NS基因具有特異性的一對引子，其包含正向引子及反向引子，其中該正向引子選自以下之群：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:25；並且該反向引子選自以下之群：SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35及SEQ ID NO:36； (e)    將ms2添加至A型流感病毒及B型流感病毒之所有連續稀釋液中，隨後向所有連續稀釋液中添加ms2之一對引子作為內部對照，這對引子包含正向引子及反向引子，其中該正向引子選自以下之群：SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40及SEQ ID NO:41；並且該反向引子選自以下之群：SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:46； (f)    用逆轉錄酶及模板依賴性聚合酶擴增A型流感病毒、B型流感病毒及內部對照之已知濃度樣品中所含之核酸； (g)    在步驟(f)期間，將兩個不同探針與已知濃度樣品中所含之核酸黏接，形成雜交產物，其中對A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9具有特異性之第一探針選自以下之群：SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10；並且對B型流感病毒具有特異性之第二探針選自以下之群：SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:28； (h)    在步驟(f)期間，使得對ms2具有特異性之探針黏接，形成雜交產物，其中探針序列如SEQ ID NO:42所示；以及 (i)    檢測由雜交產物產生之三個不同信號，這三個信號分別作為A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9及/或B型流感病毒以及內部對照之靶核酸之存在的指示。
在本發明之另一個實施例中，提供一種檢測可疑樣品中A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9中至少一者及/或B型流感病毒之存在的方法，該方法包含以下步驟： (a)    提供懷疑含有A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9之M基因及/或B型流感病毒之NS基因的樣品； (b)    提供一對引子，其包含對A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9之M基因具有特異性的正向引子及反向引子，其中該正向引子選自以下之群：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8；且該反向引子選自以下之群：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:18； (c)    提供一對引子，其包含對B型流感病毒之NS基因具有特異性的正向引子及反向引子，其中該正向引子選自以下之群：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:25；且該反向引子選自以下之群：SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35及SEQ ID NO:36； (d)    提供ms2及一對引子，其包含ms2之正向引子及反向引子作為內部對照，其中該正向引子選自以下之群：SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40及SEQ ID NO:41，且該反向引子選自以下之群：SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:46； (e)    用逆轉錄酶及模板依賴性聚合酶擴增可疑樣品及內部對照中所含之核酸； (f)    在步驟(e)期間，將兩個不同探針與可疑樣品中所含之核酸黏接以形成雜交產物，其中對A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9具有特異性之第一探針選自以下之群：SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10；且對B型流感病毒具有特異性之第二探針選自以下之群：SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:28； (g)    在步驟(e)期間，使對該ms2具有特異性之探針黏接以形成雜交產物，其中該探針序列如SEQ ID NO:42所示；以及 (h)    檢測該雜交產物產生之三個不同信號，分別作為A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9及/或B型流感病毒以及內部對照之靶核酸存在的指示。實施例 1 A 型流感亞型 H1N1 、 H3N2 、 H5N1 及 H7N9 之 LOD
在此實施例中使用已知濃度之H3N2顆粒作為A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9之代表。從103 複製數至102 及101 複製數製備兩個連續稀釋液。使用具有SEQ ID NO:5 (F)及SEQ ID NO:18 (R)之引子擴增A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9之M基因。在此實施例中亦使用具有SEQ ID NO: 9之探針。該探針亦可以用SEQ ID NO: 10替換。關於內部對照，使用具有SEQ ID NO: 39 (F)及SEQ ID NO:45 (R)之引子擴增ms2。在此實施例中亦使用具有SEQ ID NO: 42之探針。引子及探針序列顯示於表1中。 表1. 引子序列
Figure 107138861-A0304-0001
進行擴增並在Roche Light Cycler 96即時系統(Roche Molecular Systems, Inc.)上即時量測及監測擴增。每個反應混合物之體積為20 µl，並且在以下條件下擴增： 表2. 參考樣品之擴增條件
Figure 107138861-A0304-0002
反應混合物首先在50℃下進行2分鐘逆轉錄。實際擴增反應首先在95℃下培育2分鐘，隨後根據以下示意圖進行50個循環： 95℃ 1秒 à 60℃ 1秒。
圖2顯示給定的一對引子、探針以及內部對照之動力學PCR生長曲線。當103 、102 及101 之H3N2顆粒之生長曲線超過臨限值時，最初可檢測到明確且特定的信號。在這樣的條件及引子序列下，檢測極限可達到101 複製數。
換言之，若可疑樣品經A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9感染，所有此等亞型均含有M基因序列，則爬坡曲線(climbing curve)將顯示在動力學PCR生長曲線中。同時，亦可檢測到ms2信號，作為適當過程之代表。實施例 2 B 型流感病毒之 LOD
馬來西亞(Malaysia) 2506/2004病毒株為一種B型/維多利亞/2/87樣流感病毒株，在此實施例中由用作B型流感病毒之兩個譜系之代表。從103 病毒複製數至102 及101 複製數製備兩個連續稀釋液。使用具有SEQ ID NO:22 (F)及SEQ ID NO:33 (R)之引子擴增B型流感病毒之可疑NS基因。在此實施例中亦使用具有SEQ ID NO:28之探針。該探針亦可以替換為SEQ ID NO:27。關於內部對照，使用具有SEQ ID NO: 39 (F)及SEQ ID NO:45 (R)之引子擴增ms2。在此實施例中亦使用具有SEQ ID NO: 42之探針。引子及探針序列顯示於表3中。 表3. 引子序列
Figure 107138861-A0304-0003
進行擴增並在Roche Light Cycler 96即時系統(Roche Molecular Systems, Inc.)上即時量測及監測擴增。每個反應混合物之體積為20 µl，並且在以下條件下擴增： 表4.參考樣品之擴增條件
Figure 107138861-A0304-0004
反應混合物首先在50℃下進行2分鐘逆轉錄。實際擴增反應首先在95℃下培育2分鐘，並且隨後根據以下示意圖進行50個循環： 95℃ 1秒 → 60℃ 1秒。
圖3顯示給定的一對引子、探針以及內部對照之動力學PCR生長曲線。當103 、102 及101 之馬來西亞2506/2004顆粒之生長曲線超過臨限值時，最初可檢測到明確且特定的信號。在此條件下檢測極限可達到101 複製數。
換言之，若可疑樣品經含有NS基因序列之B型流感病毒感染，則爬坡曲線將顯示在動力學PCR生長曲線中。同時，亦可檢測到ms2信號以作為適當過程之代表。實施例 3 A 型流感亞型 H1N1 、 H3N2 、 H5N1 及 H7N9 以及 B 型流感病毒檢測
本發明揭示一種分別檢測四種A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9中之至少一者及/或B型流感病毒之存在的方法。較佳地，本發明不包含樣品製備步驟。在從可疑樣品(其可以為咽/鼻拭子或鼻咽拭子)純化或分離出核酸之後，該核酸含於樣品收集緩衝液中。
此實施例提供一種檢測方法，其用於檢測在具有流感樣症狀之未知患者的可疑樣品中A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9之M基因的存在，其中可疑樣品之核酸含於樣品收集緩衝液中，如上文所提及。同時亦檢測B型流感病毒之NS基因之存在。更準確而言，若可疑樣品含有A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9中之至少一者，則檢測結果將反映出這樣一種結果，亦即在這個可疑樣品中至少存在一種A型流感病毒亞型，不管存在的為這四種亞型中之哪一種。另外，若可疑樣品含有B型流感病毒之至少一種病毒株，則本發明亦將同時檢測到這至少一種病毒株。而且另外，若可疑樣品含有A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9中之至少一者及/或B型流感病毒，則此等病毒將會被分別檢測到。
為檢測A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9中之至少一者，使用具有SEQ ID NO:5 (F)及SEQ ID NO:18 (R)之引子擴增A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9之M基因。在此實施例中亦使用具有SEQ ID NO: 9之探針。關於內部對照，使用具有SEQ ID NO: 39 (F)及SEQ ID NO:45 (R)之引子擴增ms2。在此實施例中亦使用具有SEQ ID NO: 42之探針。引子及探針序列顯示於表1中。
為檢測B型流感病毒，使用具有SEQ ID NO:22 (F)及SEQ ID NO:33 (R)之引子擴增B型流感病毒之可疑NS基因。在此實施例中亦使用具有SEQ ID NO:28之探針。關於內部對照，使用具有SEQ ID NO: 39 (F)及SEQ ID NO:45 (R)之引子擴增ms2。在此實施例中亦使用具有SEQ ID NO: 42之探針。引子及探針序列顯示於表3中。
進行擴增並在Roche Light Cycler 96即時系統(Roche Molecular Systems, Inc.)上即時量測及監測擴增。每個反應混合物之體積為20 µl，並且在以下條件下擴增： 表5. 參考樣品之擴增條件
Figure 107138861-A0304-0005
反應混合物首先在50℃下進行2分鐘逆轉錄。實際擴增反應首先在95℃下培育2分鐘，隨後根據以下示意圖進行50個循環： 95℃ 1秒 à 60℃ 1秒。
圖4顯示給定的一對引子、探針以及內部對照之動力學PCR生長曲線。在圖4中，檢測結果顯示，可疑樣品含有A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N2及H7N9中之至少一者以及B型流感病毒。隨後用定序程序處理可疑樣品，並且結果顯示可疑樣品含有A型流感H3N2及B型流感病毒馬來西亞2506/2004。實施例 4 A 型流感亞型 H1N1 、 H3N2 、 H5N1 及 H7N9 以及 B 型流感病毒之隨機檢測
在此實施例中，提供一種針對本發明之檢測特異性的測試。臨床檢測之特異性係指該檢測能夠正確鑑定彼等沒有疾病/症狀之樣品的能力。因此，具有100%特異性之檢測能夠正確地鑑定所有沒有疾病/症狀之樣品。具有80%特異性之檢測正確地報告80%沒有疾病/症狀之樣品為檢測陰性(真陰性)，但是20%沒有疾病/症狀之樣品被錯誤地鑑定為檢測陽性(假陽性)。為了測試本發明之特異性，在此實施例中提供4個不屬於正黏病毒科物種之樣品，如下所列。每個物種之TCID50高於1.43*105 /ml。 表6. 4個樣品之樣品清單
Figure 107138861-A0304-0006
在這4個樣品中使用相同的製備程序及擴增條件，包括指定的引子及探針，其分別對A型流感H1N1、H3N2、H5N1及H7N9 (引子：SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:18；探針：SEQ ID NO: 9)及B型流感病毒(引子：SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:33；探針：SEQ ID NO: 28)具有特異性。在此實施例中亦使用ms2顆粒、引子及探針(引子：SEQ ID NO: 39及SEQ ID NO:45；探針：SEQ ID NO: 42)作為內部對照。
進行擴增並在Roche Light Cycler 96即時系統(Roche Molecular Systems, Inc.)上即時量測及監測擴增。每個反應混合物之體積為20 µl，並且在以下條件下擴增： 表7. 參考樣品之擴增條件
Figure 107138861-A0304-0007
反應混合物首先在50℃下進行2分鐘逆轉錄。實際擴增反應首先在95℃下培育2分鐘，隨後根據以下示意圖進行50個循環： 95℃ 1秒 à 60℃ 1秒。
圖5顯示給定的一對引子、探針以及內部對照之動力學PCR生長曲線。在圖5中，這四個樣品之檢測結果顯示，沒有樣品被檢測及識別為A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1及H7N9，亦沒有樣品被檢測及識別為B型流感病毒，但能正常檢測到每個物種之內部對照。因此，本發明之特異性能夠在鑑定A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9以及B型流感病毒方面達到100%特異性校正。
圖1展示4種A型流感亞型之M基因引子序列區域。
圖2展示實施例1之動力學PCR生長曲線。
圖3展示實施例2之動力學PCR生長曲線。
圖4展示實施例3之動力學PCR生長曲線。
圖5展示實施例4之特異性測試結果。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010

Claims (7)

  1. 一種檢測可疑樣品中A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9及B型流感病毒存在的方法，其中該方法並未區分該可疑樣品中A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9或者其他亞型，該方法包含以下步驟：(a)提供懷疑含有A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9之基質基因的樣品，其中亦懷疑該樣品含有B型流感病毒之非結構基因，(b)提供用於檢測A型流感病毒之基質基因的一對引子，其包含第一引子及第二引子，其中該第一引子選自以下之群：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8，且其中該第二引子選自以下之群：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18，(c)提供用於檢測B型流感病毒之非結構基因的一對引子，其包含第三引子及第四引子，其中該第三引子選自以下之群：SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26，且其中該第四引子選自以下之群：SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36，(d)提供一對引子，其包含ms2之正向引子及反向引子作為內部對照，其中該正向引子選自以下之群：SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40及SEQ ID NO：41，且該反向引子選自以下之群：SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45及SEQ ID NO：46， (e)將步驟(a)至(d)之樣品、第一引子至第四引子、正向引子及反向引子置於一單一容器內，用逆轉錄酶及模板依賴性聚合酶擴增靶核酸，(f)在步驟(e)期間，將第一探針及第二探針與該靶核酸黏接以形成雜交產物，其中該第一探針序列對A型流感病毒之基質基因具有特異性且選自以下之群：SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10，且該第二探針對B型流感病毒之非結構基因具有特異性且選自以下之群：SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28，(g)在步驟(e)期間，使對該ms2具有特異性之探針黏接以形成雜交產物，其中該探針序列如SEQ ID NO：42所示，以及(h)檢測該雜交產物產生之信號以作為該靶核酸存在之指示，其中當第一探針與靶核酸黏接所形成之雜交產物之第一信號存在時，指示該樣品中存在A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9，且當該第一信號不存在時，指示該樣品中不存在A型流感亞型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9。
  2. 如請求項1之方法，其中該等雜交產物產生之信號為螢光信號。
  3. 如請求項2之方法，其中該第一探針、該第二探針及該ms2探針之所有5'端均攜帶螢光報導分子，該等螢光報導分子選自由以下組成之群：FAM、HEX、VIC、CY3、CY5、TET、ALEXA594及ALEXA643；且該三個探針之3'端攜帶淬滅劑(quenchers)，該等淬滅劑選自由以下組成之群：TMARA、MGB及BHQ；且其中所有三個探針之螢光報導分子為不同。
  4. 如請求項3之方法，其中該等雜交產物產生之三個不同的螢光信號係藉由該等螢光報導分子之片段之數量來檢測，該等螢光報導分子之片段係藉由DNA依賴性聚合酶之核酸外切酶水解分別由與該靶核酸雜交之第一探針或第二探針上切割下來。
  5. 如請求項4之方法，其中第二螢光信號之存在指示該樣品中存在該B型流感病毒，且其中該第二螢光信號之不存在指示該樣品中不存在該B型流感病毒。
  6. 如請求項1之方法，其中該方法可檢測該樣品中至少101複製數之A型流感病毒亞型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9、及至少101複製數之B型流感病毒。
  7. 如請求項1之方法，其中步驟(a)還包括：(a1)從該樣品純化或分離出核酸，並將該核酸儲存於樣品收集緩衝液中。
TW107138861A 2018-11-01 2018-11-01 用於a型流感病毒及b型流感病毒檢測之方法 TWI702293B (zh)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW107138861A TWI702293B (zh) 2018-11-01 2018-11-01 用於a型流感病毒及b型流感病毒檢測之方法
EP19188685.2A EP3647438A1 (en) 2018-11-01 2019-07-26 Method for influenza a virus and influenza b virus detection
JP2019139726A JP7064473B2 (ja) 2018-11-01 2019-07-30 インフルエンザａウイルスおよびインフルエンザｂウイルスを検出する方法
KR1020190135341A KR20200050872A (ko) 2018-11-01 2019-10-29 인플루엔자 a 바이러스 및 인플루엔자 b 바이러스 검출 방법
US16/669,510 US11639532B2 (en) 2018-11-01 2019-10-30 Method for Influenza A virus and Influenza B virus detection
KR1020220039622A KR20220044707A (ko) 2018-11-01 2022-03-30 인플루엔자 a 바이러스 및 인플루엔자 b 바이러스 검출 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW107138861A TWI702293B (zh) 2018-11-01 2018-11-01 用於a型流感病毒及b型流感病毒檢測之方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW202018093A TW202018093A (zh) 2020-05-16
TWI702293B true TWI702293B (zh) 2020-08-21

Family

ID=67439131

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW107138861A TWI702293B (zh) 2018-11-01 2018-11-01 用於a型流感病毒及b型流感病毒檢測之方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11639532B2 (zh)
EP (1) EP3647438A1 (zh)
JP (1) JP7064473B2 (zh)
KR (2) KR20200050872A (zh)
TW (1) TWI702293B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111663007A (zh) * 2020-07-17 2020-09-15 广州阳普医疗科技股份有限公司 一种多种病毒核酸联合检测引物与探针组合以及检测试剂盒
US20220042117A1 (en) * 2020-08-06 2022-02-10 Roche Molecular Systems, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE SIMULTANEOUS DETECTION OF INFLUENZA A, INFLUENZA B, AND SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS 2 (SARS-CoV-2)
CN113215329A (zh) * 2021-06-29 2021-08-06 郑州安图莫比分子诊断技术有限公司 呼吸道7种亚型流感病毒多重pcr检测的引物、探针和试剂盒
CN113621735A (zh) * 2021-08-11 2021-11-09 江苏金迪克生物技术股份有限公司 一种荧光定量pcr检测流感病毒滴度的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201538734A (zh) * 2006-09-12 2015-10-16 Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc 生物體識別產品及方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6015664A (en) * 1995-11-03 2000-01-18 Mcw Research Foundation Multiplex PCR assay using unequal primer concentrations to detect HPIV 1,2,3 and RSV A,B and influenza virus A, B
SG10201806098QA (en) * 2006-02-13 2018-08-30 Us Gov Health & Human Services Primers and probes for detection and discrimination of types and subtypes of influenza viruses
DE602007009973D1 (de) * 2006-04-28 2010-12-02 Siemens Healthcare Diagnostics Nukleinsäureprimer und sonden zur erkennung von influenza-viren des menschen und vögeln
US20130059748A1 (en) * 2011-07-06 2013-03-07 Intelligent Medical Devices, Inc. Optimized probes and primers and methods of using same for the binding, detection, differentiation, isolation and sequencing of influenza a; influenza b and respiratory syncytial virus
GB201203547D0 (en) * 2012-02-29 2012-04-11 Vela Operations Pte Ltd Multiplex real-time PCR detection of influenza viruses 2009 H1N1, influenza A and influenza B
US20140127674A1 (en) * 2012-10-25 2014-05-08 Intelligent Medical Devices, Inc. Optimized probes and primers and methods of using same for the binding, detection, differentiation, isolation and sequencing of influenza a; influenza b and respiratory syncytial virus
AU2014403832B2 (en) * 2014-08-22 2021-11-04 Cepheid Methods of detecting influenza
CN106555012A (zh) * 2016-10-25 2017-04-05 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 用于a型动物流感病毒检测的试剂、检测方法及应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201538734A (zh) * 2006-09-12 2015-10-16 Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc 生物體識別產品及方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220044707A (ko) 2022-04-11
JP7064473B2 (ja) 2022-05-10
US20200140963A1 (en) 2020-05-07
EP3647438A1 (en) 2020-05-06
US11639532B2 (en) 2023-05-02
TW202018093A (zh) 2020-05-16
KR20200050872A (ko) 2020-05-12
JP2020068763A (ja) 2020-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI702293B (zh) 用於a型流感病毒及b型流感病毒檢測之方法
Coiras et al. Simultaneous detection of influenza A, B, and C viruses, respiratory syncytial virus, and adenoviruses in clinical samples by multiplex reverse transcription nested‐PCR assay
Lee et al. High-throughput, sensitive, and accurate multiplex PCR-microsphere flow cytometry system for large-scale comprehensive detection of respiratory viruses
Woźniak-Kosek et al. Detection of the influenza virus yesterday and now.
CN102337351A (zh) 一种流感病毒分型检测试剂盒
US9803251B2 (en) Methods of detecting influenza virus
CN104131009B (zh) 一种检测不同流感病毒的引物组合物及其应用
CN110343784B (zh) 基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的组合物及试剂盒
CN102321769B (zh) 鉴定新城疫病毒和多亚型禽流感病毒的引物对及其应用
CN106435036B (zh) 一种用于检测d型流感病毒的荧光pcr引物和探针及检测方法
US10006097B2 (en) Compositions and methods for detection and discrimination of influenza viruses
CN102140557B (zh) 一种a型流感病毒核酸快速同步检测试剂盒
CN102230023B (zh) 双重荧光定量rt-pcr检测试剂盒及应用
CN102304591B (zh) 鉴定h3亚型禽流感病毒的pcr引物对及其应用
WO2019133727A1 (en) Universal influenza virus probe set for enrichment of any influenza virus nucleic acid
CN112011644A (zh) 甲型流感病毒和乙型流感病毒的检测方法
Aufi et al. Epidemiology of seasonal influenza outbreak among Iraqi population: 2018
Qin et al. Subtyping animal influenza virus with general multiplex RT-PCR and Liquichip high throughput (GMPLex)
CN105861757A (zh) H9亚型禽流感病毒和h6亚型禽流感病毒的二重rt-pcr试剂盒及其应用
CN106086234A (zh) H9亚型aiv、h6亚型aiv和aiv的三重rt‑pcr试剂盒及其应用
CN110846437A (zh) 鸡细小病毒与h9亚型禽流感病毒二重pcr检测引物组、试剂盒及方法
CN110777219A (zh) 鸡细小病毒与h9亚型禽流感病毒三重pcr检测引物组、试剂盒及方法
AL-Ezzy Molecular Diagnostic Approaches For SARS-COV2
CN106702028B (zh) H10n7禽流感病毒的实时荧光pcr检测试剂盒及检测方法
Lu et al. Studies on multiplex RT-PCR for detection of Avian Influenza Virus type A group and specific H5 and H7 subtypes