KR20220044707A - 인플루엔자 a 바이러스 및 인플루엔자 b 바이러스 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 기질 유전자 및 비구조적 유전자를 각각 검출함으로써, 의심되는 샘플에서 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스를 검출하는 방법을 개시한다. 신호는 형광 검출 시스템에 의해 검출될 수 있다.
Description
본 발명은 인간 조직 샘플에서 인플루엔자 A 바이러스(Flu A) 및 인플루엔자 B 바이러스(Flu B)를 검출하는 방법에 관한 것이다. 특히, Flu A의 경우, 본 발명은 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9 중 적어도 1종을 검출하기 위한 프라이머, 프로브 및 기타 관련 시약을 제공한다. Flu B의 경우, 본 발명은 인플루엔자 B 바이러스를 검출하기 위한 프라이머, 프로브 및 기타 관련 시약을 제공한다.
인플루엔자는 보통 국지적인 발병(local outbreak) 또는 전 세계적인 전염병(epidemic)으로 나타난다. 전염병은 언제든지 발생할 수 있지만, 대개는 습도가 높은 달에 집중된다. 전염병은 거의 또는 전혀 경고 없이 갑작스럽게 발생한다. 영향을 받는 사람의 수는 수백에서 수십만까지 다양할 수 있다. 전염병은 금방 사라질 수 있고(short-lived), 며칠 또는 몇 주 지속될 수 있지만, 대규모 전염병은 수개월 지속될 수 있다. 인플루엔자는 대부분의 개체에서 경미한 질병이지만, 노인이나 쇠약한 개체에게는 생명을 위협할 정도이다. 전염병은 생산성의 큰 손실을 초래한다. 세계보건기구(WHO)는 의사소통 실험실의 국제적 네트워크에 감염 바이러스의 항원 변화와 감염 확산을 모니터링을 의뢰하였다.
세계보건기구의 연구 및 데이터에 따르면, 인플루엔자 A 및 B 바이러스는 인플루엔자 검출 중 대부분을 차지하였다. 인간 인플루엔자 A 및 B 바이러스는 북미, 동아시아 및 남동아시아에서 거의 매년 겨울철에 계절성 전염병을 유발한다. 인플루엔자 유형 C 감염은 일반적으로 경미한 호흡기 질병을 유발하며, 전염병을 초래하는 것으로 여겨지지는 않는다. 인플루엔자 D 바이러스는 소(cattle)에만 영향을 미치며, 사람을 감염시키거나 사람에 질병을 유발하는 것으로 알려져 있지는 않다.
인플루엔자 A 바이러스는 바이러스 표면의 두 개의 단백질인 헤마글루티닌(hemagglutinin, H) 및 뉴라미니다아제(neuraminidase, N)에 기초하여 하위유형으로 구분된다. 18종의 상이한 헤마글루티닌 하위유형과 11종의 상이한 뉴라미니다아제 하위유형이 있다. 인플루엔자 A 바이러스는 서로 다른 균주로 더 세분될 수 있다. 인플루엔자 A 바이러스는 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae)의 패밀리에서 오르토믹소바이러스 속에 속하며, 이는 나선 대칭(helical symmetry)을 갖는 ssRNA 외피보유(ssRNA-enveloped) 바이러스의 일종이다. 인플루엔자 A 바이러스의 게놈은 8개의 RNA 단편으로 분절되어 있다. 헤마글루티닌(HA), 뉴라미니다아제(NA), 뉴클레오캡시드(nucleocapsid, NP) 및 기질(matrix, M) 단백질인 인플루엔자 A 바이러스에 존재하는 4개의 항원이 있다. NA는 세 가지 형태 A, B 및 C로 발생하는 유형 특이적(type-specific) 항원으로, 이는 인간 인플루엔자 바이러스 분류의 기초를 제공한다. 기질 단백질은 뉴클레오캡시드를 둘러싸고 있으며, 입자 질량(particle mass)의 35 내지 45%를 구성한다. HA는 세포 수용체에 대한 바이러스의 부착을 매개한다. 뉴라미니다아제 분자는 외피에 더 적은 양으로 존재한다.
인플루엔자 A 바이러스는 인간의 계절성 인플루엔자의 주요 구성원으로, 이는 모든 연령대의 사람을 감염시킬 수 있고, 심지어 사망에 이르게 할 수 있는 중증의 질병을 유발할 수 있다. 계절성 인플루엔자는 1년 내내 열대 지역에서 유행하는 인플루엔자 A 바이러스에 의해 발생하는 중요한 전 세계적인 인간 호흡기 질병으로, 온대지역에서는 몇 가지 계절성 전염병의 특징을 가지고 주로 겨울철에 발생한다. 현재, 전 세계적인 유행성 감염을 초래할 수 있는 인간에서 유행하는 인플루엔자 A 바이러스에는 두 가지 하위유형 즉, H1N1 및 H3N2가 있다. 또한, H5N1 및 H7N9는 인간에서 H5N1 및 H7N9의 감염이 중증 질병을 초래할 수 있으며 높은 사망률을 나타내었기 때문에, 중요한 하위유형으로 간주된다.
인플루엔자 B 바이러스는 오르토믹소바이러스과 바이러스 패밀리에서의 또 다른 속이다. 인플루엔자 B 바이러스 게놈은 14548개 뉴클레오티드 길이이고, 선형의 네가티브-센스(negative-sense), 단일 가닥 RNA의 8개 세그먼트로 이루어진다. 다중으로 분할된(multipartite) 게놈은 단백질 막으로 둘러싸여(encapsidated) 있고, 각각의 세그먼트는 별도의 뉴클레오캡시드 안에 있으며, 뉴클레오캡시드는 하나의 외피로 둘러싸여 있다. 인플루엔자 B 바이러스는 하위유형으로 나뉘지는 않지만, 계통(lineage) 및 균주로 더 세분화될 수 있다. 현재, 표면 당단백질 헤마글루티닌의 항원 특성을 기반으로 한 인플루엔자 B 바이러스의 두 가지 상호 순환(co-circulating) 계통이 있다. 이 계통은 B/야마가타/16/88-유사(B/Yamagata/16/88-like) 및 B/빅토리아/2/87-유사(B/Victoria/2/87-like) 바이러스라 지칭된다. 인플루엔자 B 바이러스의 캡시드는 둘러싸여 있는 반면, 그것의 비리온은 외피, 기질 단백질, 핵단백질 복합체, 뉴클레오캡시드 및 중합효소 복합체로 이루어져 있다.
인플루엔자 A 및 B 바이러스 감염은 호흡기 비말(respiratory droplet)을 통해 확산된다. 이 바이러스 입자는 바이러스 수용체가 풍부한 호흡 상피의 세포에 결합한다. 바이러스 입자상에 존재하는 뉴라미니다아제는 상피 세포의 표면에 존재하는 점액질에 의해 결합되어 있던 바이러스 입자를 방출시킴으로써 감염 과정을 돕는다. 인플루엔자의 전형적인 증상은 감염 후에 나타나며, 현저한 열, 두통, 광선기피증(photophobia), 오한, 마른기침, 불쾌감, 근육통 및 건조하고 간지러운 목을 포함한다. 열은 지속적이며, 약 3일간 계속된다. 인플루엔자 B 바이러스의 증상 및 치료는 인플루엔자 A 바이러스의 증상 및 치료와 유사하지만, 인플루엔자 B 바이러스로부터 중증의 합병증이 발생할 가능성은 인플루엔자 A 바이러스보다 낮다.
인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9는 모두 전염성이 높으며, 중증의 합병증을 초래할 수 있다. 다른 인플루엔자 A 하위유형 및 인플루엔자 B 바이러스보다 훨씬 더 빠르게 돌연변이될 수 있기 때문에 특히 우려가 되는 인플루엔자 A 하위유형 중 하나인 H5N1는 고병원성인 것으로 밝혀진 바 있으며, 사람에서 중증의 질병을 초래할 수 있다. 따라서, 실시간으로 돌연변이를 모니터링하기 위하여, 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9 대 인플루엔자 B 바이러스를 구별하는 것이 중요하다.
요즘에는 최대 민감도와 특이도를 제공하는 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 RNA 검출을 위한 RT-PCR 분석이 가능하다. 더욱이, PCR 생성물은 균주 확인을 위하여 서열 분석될 수 있다. 가장 민감하고 인정받는 시료는 비인두 면봉 검체(nasopharyngeal swab)이다. 그러나 비인두 면봉을 취하는 것과 관련된 어려움을 감안하여, 목과 코 면봉 검체가 더 흔히 사용된다.
상기 관점에서, 높은 정확도와 안정성으로, 의심되는 샘플에서 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9 중 적어도 1종 및 인플루엔자 B 바이러스를 동시에 검출하는 분석법을 개발할 필요가 있다.
요약
본 발명의 목적은 의심되는 샘플에서 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 또는 H7N9의 기질 유전자(matrix gene)(이하, "M 유전자")의 존재를 검출할뿐만 아니라, 동시에 의심되는 샘플에서 인플루엔자 B 바이러스의 비-구조적 유전자(non-structual gene)(이하, "NS 유전자")의 존재를 검출하는 검출 방법을 제공하는 것이다. 보다 정확하게는, 의심되는 샘플이 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 또는 H7N9 중 적어도 1종을 함유하는 경우, 본 발명에 의해 검출될 것이다. 의심되는 샘플이 인플루엔자 B 바이러스 중 적어도 1종의 균주를 함유하는 경우, 본 발명에 의해 검출될 것이다. 또한, 의심되는 샘플이 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 중 적어도 1종 및 인플루엔자 B 바이러스를 함유하는 경우, 본 발명에 의해 별도로 검출될 것이다.
본 발명의 목적은 특히, 의심되는 샘플에서 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9, 그리고 인플루엔자 B 바이러스의 존재를 각각 검출하기 위한 지정된(designated) 프라이머 및 프로브를 제공하는 것이다. 지정된 프로브 및 프라이머는 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9, 그리고 인플루엔자 B 바이러스에 대해 특이적이다. 엑소뉴클레아제 가수분해 능력이 있는 주형 의존적 중합효소(template-dependent polymerase) 또한 이 과정에 포함된다. 이 목적은 다음 단계를 포함하는, 의심되는 샘플에서 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9 중 적어도 1종 및/또는 인플루엔자 B 바이러스의 존재의 검출 방법에 의해 본 발명에 따라 달성된다:
(a) 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 또는 H7N9의 M 유전자 및/또는 인플루엔자 B 바이러스의 NS 유전자를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계;
(b) 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9의 M 유전자에 대해 특이적인 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍을 제공하는 단계로서, 여기에서 정방향 프라이머는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 군으로부터 선택되고; 역방향 프라이머는 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18의 군으로부터 선택되는 것인 단계;
(c) 인플루엔자 B 바이러스의 NB 유전자에 대해 특이적인 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍을 제공하는 단계로서, 여기에서 정방향 프라이머는 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25의 군으로부터 선택되고; 역방향 프라이머는 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35 및 서열번호 36의 군으로부터 선택되는 것인 단계;
(d) 의심되는 샘플에 함유된 핵산을 역전사효소 및 주형 의존적 중합효소로 증폭시키는 단계;
(e) 단계 (d) 동안, 두 개의 상이한 프로브를 의심되는 샘플에 함유된 핵산에 대해 어닐링하여 혼성화된 생성물을 형성하는 단계로서, 여기에서 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9에 대해 특이적인 제1 프로브는 서열번호 9 및 서열번호 10의 군으로부터 선택되고; 인플루엔자 B 바이러스에 대해 특이적인 제2 프로브는 서열번호 27 및 서열번호 28의 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및
(f) 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9 및/또는 인플루엔자 B 바이러스의 표적 핵산의 존재에 대한 지표로서 RT-PCR 생성물로부터 생성되는 2종의 별개의 신호를 각각 검출하는 단계.
본 발명에 따르면, 혼성화된 생성물로부터 생성된 신호는 형광 검출 시스템에 의해 검출될 수 있다. 제1 프로브에 대해 특이적인 2종의 별개의 신호 중 하나는 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, N3N2, H5N1 및/또는 H7N9의 존재를 나타내고, 제2 프로브에 대해 특이적인 나머지 신호는 인플루엔자 B 바이러스의 존재를 나타낸다.
이 요약은 아래의 구체적인 내용에서 더 설명되는 본 발명의 일부 양태를 간략하게 확인하기 위하여 제공된 것이다. 이 요약은 본 개시의 핵심적인 또는 필수적인 특징을 확인하고자 하는 것이 아니며, 임의의 청구항의 범위를 제한하고자 하는 것도 아니다. 용어 "양태"는 "적어도 하나의 양태"로 해석되어야 한다. 상기 설명된 양태 및 본 설명에 기술된 본 개시의 다른 양태는 예로써 설명된 것으로, 첨부되는 도면에 한정되지 않는다.
도 1은 네 가지 인플루엔자 A 하위유형의 M 유전자 프라이머 서열 영역을 도시한 것이다.
도 2는 구현예 1의 동적 PCR 성장 곡선을 도시한 것이다.
도 3은 구현예 2의 동적 PCR 성장 곡선을 도시한 것이다.
도 4는 구현예 3의 동적 PCR 성장 곡선을 도시한 것이다.
도 5는 구현예 4의 특이도 시험 결과를 도시한 것이다.
도 2는 구현예 1의 동적 PCR 성장 곡선을 도시한 것이다.
도 3은 구현예 2의 동적 PCR 성장 곡선을 도시한 것이다.
도 4는 구현예 3의 동적 PCR 성장 곡선을 도시한 것이다.
도 5는 구현예 4의 특이도 시험 결과를 도시한 것이다.
다음은 단지 본 발명의 원리를 설명한 것이다. 따라서, 당업자는 본원에 명시적으로 기재되거나 나타나 있지 않더라도 본 발명의 원리를 구현하고 그것의 사상 및 범위 내에 포함되는 다양한 방식을 고안할 수 있음을 이해할 것이다.
나아가, 본원에 기재된 모든 예 및 조건부 언어는 더 나아가 당업계에 본 발명자(들)이 기여한 개시 및 개념의 원리를 독자가 이해하도록 돕는 교육적인 목적으로만 의도된 것이고, 이러한 구체적으로 언급된 예 및 조건에 제한 없이 해석되어야 한다.
또한, 본 개시의 원리, 양태 및 구현예뿐만 아니라, 이의 구체적인 실시예를 기재한 본원의 모든 언급은 이의 구조적 및 기능적 균등물을 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 이러한 균등물은 현재 알려진 균등물뿐만 아니라 미래에 개발되는 균등물, 즉 구조와 무관하게 동일한 기능을 수행하는 차후에 개발되는 임의의 구성요소 모두를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 달리 명백하게 명시하지 않는 한, 도면은 일정한 비율로 도시되어 있지 않다.
방법이 성공적으로 처리될 수 있음을 확실히 하기 위하여, 본 발명은 접합된(conjugated) 마이너 그루브 결합제(minor groove binder, MGB) 리간드를 갖는 TaqMan 프로브를 이용하는 신속한 확인을 위한 PCR 또는 실시간 PCR 분석법을 제공한다.
이러한 분석법에서, 상이한 형광 리포터로 유형 특이적 프로브를 표지(labeling)하는 것은 유형 특이적 형광의 검출을 보장하였다. 이 분석법에 적용된 Taq 중합효소는 엑소뉴클레아제 가수분해 기능이 있는 DNA 의존적 중합효소이다. 형광 신호는 형광 리포터의 단편의 양에 의해 검출되는데, 이는 DNA 의존적 중합효소의 엑소뉴클레아제 가수분해에 의해 표적 핵산에 혼성화된 프로브로부터 절단된다. 프라이머 및/또는 프로브는 변형된 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 화합물을 포함한다.
현재, H1N1 및 H3N2는 인간에서 유행하는 전 세계적인 유행성 감염증을 초래하는 두 가지 흔히 보여지는 인플루엔자 A 하위유형이다. 한편, H5N1 및 H7N9는 흔하지 않은 인플루엔자 A 하위유형이지만, 이들은 인간에서 중증 질병을 유발하여 높은 사망률을 초래할 가능성이 매우 높다. 따라서, 조기에 치료가 시작될 수 있도록 이들 4종의 인플루엔자 A 하위유형을 가능한 한 조기에 검출하는 것이 중요하다. 또한, 이들 4종의 하위유형이 모두 중요하므로, 의심되는 샘플에서 이들 4종 중 임의의 1종을 나머지와 구분할 필요는 없다. 본 발명은 모든 4종의 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9에서 공유되고 존재하는 특정 서열을 검출하는 방법을 개시한다. 본 발명의 검출 결과가 의심되는 샘플에 대해 양성인 경우, 그것은 적어도 1종의 하위유형이 존재함을 의미한다. 그러면, 조기 치료가 시작될 수 있다.
M 유전자(서열번호 1)는 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9에 존재하고, 이량체 형태로 바이러스 외피 아래에 존재하는 기질 단백질(이하 "M 단백질")로 번역되며, 바이러스 리보핵산단백질(viral ribonucleoprotein, vRNP) 복합체와 상호 작용하여 내부의 코어 구성요소와 막 단백질 사이에 가교(bridge)를 형성한다. vRNP는 숙주 범위에 대한 결정기(determinant)를 보유한다. M 단백질은 바이러스 RNA 및 vRNP 양쪽 모두와 접촉하여, RNP 복합체의 형성을 촉진하고 핵 기질로부터 RNP의 해리를 유발한다. M 유전자는 바이러스 구성요소를 조립 부위로 동원(recruiting)함으로써 조립에 중요한 역할을 하며, 바이러스 입자의 형성을 비롯한 발아 과정에서 필수적인 역할을 한다. 하위유형 교차 방어(cross-subtype protection)를 부여하기 위하여 M 단백질을 표적으로 하는 신규한 백신이 전도 유망한 것으로 밝혀진 바 있다.
따라서, M 유전자가 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9에 존재한다는 점을 고려하면, 본 발명에 개시된 모든 프라이머 및 프로브는 도 1에 나타낸 바와 같이 모든 4종의 하위유형의 M 유전자로부터 선택되고 이에 대해 특이적이다. 보다 정확하게는, 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9의 검출을 위한 정방향 프라이머는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 군으로부터 선택되고; 역방향 프라이머는 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18의 군으로부터 선택된다. 서열번호 9 및 서열번호 10의 군 중 하나인 프로브 또한, M 유전자에 대해 특이적이다. 형광 신호의 존재는 샘플 내 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 또는 H7N9의 존재를 나타낸다.
NS 유전자는 복제 단계 중에 NS 단백질을 발현하는 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스 양쪽 모두에 존재한다. 그러나 인플루엔자 B 바이러스의 NS 유전자의 독특한 생물학적 활성은 pre-mRNA 프로세싱 억제의 결핍 및 인플루엔자 A 바이러스의 NS 유전자에 대한 20% 미만의 서열 동일성(identity)으로 표시된다. NS 단백질은 인플루엔자 B 바이러스에서 발견된 동종이량체(homo-dimeric) RNA 결합 단백질로서, 이는 바이러스 복제를 위한 필수적인 인자이다. 복제 단계 중, NS 단백질은 mRNA의 폴리-A 꼬리에 결합하여 이를 핵에 유지시킨다. 인플루엔자 B 바이러스의 NS 유전자(서열번호 19)가 인플루엔자 B/야마가타/16/88-유사 및 B/빅토리아/2/87-유사 바이러스 양쪽 모두에서 고도로 보존된다는 점을 고려하여, 본 발명에 개시된 인플루엔자 B 바이러스에 특이적인 프라이머 및 프로브 서열은 NS 유전자로부터 선택된다.
ssRNA 박테리오파지인 ms2는 생물학적 실험 및 예비적인 역전사 프로세스 후의 바이러스/병원균 검출에서 내부 대조군(internal control)으로 흔히 사용된다. 내부 대조군의 적용은 억제 또는 사람의 실수로 인한 거짓 음성(false-negative) 결과를 방지하기 위해, 표적 바이러스의 적절한 프로세싱 및 RT-PCR 반응에서의 억제 인자의 존재를 모니터링하기 위하여 포함된다. 따라서, 다음의 구현예에서, ms2는 검출될 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1, H7N9, 및/또는 인플루엔자 B 바이러스를 함유하는 검출 튜브에 내부 대조군으로서 포함된다. 역전사로부터 생성된 ms2의 전장(full length) 상보적 DNA는 서열번호 37로 표시된 바와 같다.
TaqMan 프로브를 이용하는 본 발명은 전통적인 방법보다 더욱 민감하며, 여기서 본 발명의 검출 한계(이하 LOD)는 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 또는 H7N9뿐만 아니라, 인플루엔자 B 바이러스에 대해 101개 카피에 이를 수 있다. 따라서, 본 발명은 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9, 그리고 인플루엔자 B 바이러스의 신속하고 확실한 검출에 적합하다.
본 발명의 일 구현예에서, 공지된 농도(바이러스 입자 카피 수)의 샘플에서 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9, 그리고 인플루엔자 B 바이러스의 LOD를 시험하기 위하여, 다음 단계를 포함하는 일련의 단계가 제공된다:
(a) 103 바이러스 카피 수에서 102 및 101까지 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1, 또는 H7N9 중 적어도 1종의 하위유형의 2단계 단일 희석물을 제조하는 단계로서, 여기에서 이들 세 가지 단계별 희석물은 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 또는 H7N9의 M 유전자를 함유하는 것인 단계;
(b) 103 바이러스 카피 수에서 102 및 101까지 인플루엔자 B 바이러스의 적어도 1종의 하위유형의 2단계 단일 희석물을 제조하는 단계로서, 여기에서 이들 세 가지 단계별 희석물은 인플루엔자 B 바이러스의 NS 유전자를 함유하는 것인 단계;
(c) 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9의 M 유전자에 대해 특이적인 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍을 제공하는 단계로서, 여기에서 정방향 프라이머는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 군으로부터 선택되고; 역방향 프라이머는 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18의 군으로부터 선택되는 것인 단계;
(d) 인플루엔자 B 바이러스의 NS 유전자에 대해 특이적인 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍을 제공하는 단계로서, 여기에서 정방향 프라이머는 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25의 군으로부터 선택되고; 역방향 프라이머는 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35 및 서열번호 36의 군으로부터 선택되는 것인 단계;
(e) 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스의 모든 단계별 희석물에 ms2를 첨가한 다음, 모든 단계별 희석물에 내부 대조군으로 ms2의 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍을 첨가하는 단계로서, 여기에서 정방향 프라이머는 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40 및 서열번호 41의 군으로부터 선택되고, 역방향 프라이머는 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45 및 서열번호 46의 군으로부터 선택되는 것인 단계;
(f) 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스의 공지된 농도의 샘플에 함유된 핵산, 및 내부 대조군을 역전사효소 및 주형 의존적 중합효소로 증폭시키는 단계;
(g) 단계 (f) 동안, 두 개의 상이한 프로브를 공지된 농도의 샘플에 함유된 핵산에 대해 어닐링하여 혼성화된 생성물을 형성하는 단계로서, 여기에서 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9에 대해 특이적인 제1 프로브는 서열번호 9 및 서열번호 10의 군으로부터 선택되고; 인플루엔자 B 바이러스에 대해 특이적인 제2 프로브는 서열번호 27 및 서열번호 28의 군으로부터 선택되는 것인 단계;
(h) 단계 (f) 동안, ms2에 특이적인 프로브를 어닐링하여 혼성화된 생성물을 형성하는 단계로서, 여기에서 프로브 서열은 서열번호 42와 같은 것인 단계; 및
(i) 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9 및/또는 인플루엔자 B 바이러스의 표적 핵산 및 내부 대조군의 존재에 대한 지표로서 혼성화된 생성물로부터 생성된 3종의 별개의 신호를 각각 검출하는 단계.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 다음 단계를 포함하는, 하나의 의심되는 샘플에서 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9 중 적어도 1종 및/또는 인플루엔자 B 바이러스의 존재의 검출 방법이 제공된다:
(a) 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9의 M 유전자, 및/또는 인플루엔자 B 바이러스의 NS 유전자를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계;
(b) 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9의 M 유전자에 대해 특이적인 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍을 제공하는 단계로서, 여기에서 정방향 프라이머는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 군으로부터 선택되고; 역방향 프라이머는 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18의 군으로부터 선택되는 것인 단계;
(c) 인플루엔자 B 바이러스의 NS 유전자에 대해 특이적인 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍을 제공하는 단계로서, 여기에서 정방향 프라이머는 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25의 군으로부터 선택되고; 역방향 프라이머는 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35 및 서열번호 36의 군으로부터 선택되는 것인 단계;
(d) 내부 대조군으로 ms2 및 ms2의 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍을 제공하는 단계로서, 여기에서 정방향 프라이머는 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40 및 서열번호 41의 군으로부터 선택되고, 역방향 프라이머는 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45 및 서열번호 46의 군으로부터 선택되는 것인 단계,
(e) 의심되는 샘플 안에 함유된 핵산 및 내부 대조군을 역전사효소 및 주형 의존적인 중합효소로 증폭시키는 단계;
(f) 단계 (e) 동안, 두 개의 상이한 프로브를 의심되는 샘플에 함유된 핵산에 대해 어닐링하여 혼성화된 생성물을 형성하는 단계로서, 여기에서 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9에 대해 특이적인 제1 프로브는 서열번호 9 및 서열번호 10의 군으로부터 선택되고; 인플루엔자 B 바이러스에 대해 특이적인 제2 프로브는 서열번호 27 및 서열번호 28의 군으로부터 선택되는 것인 단계;
(g) 단계 (e) 동안, ms2에 특이적인 프로브를 어닐링하여 혼성화된 생성물을 형성하는 단계로서, 여기에서 프로브 서열은 서열번호 42와 같은 것인 단계; 및
(h) 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9 및/또는 인플루엔자 B 바이러스의 표적 핵산 및 내부 대조군의 존재에 대한 지표로서 혼성화된 생성물로부터 발생하는 3개의 별개의 신호를 각각 검출하는 단계.
실시예
구현예 1. 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9의 LOD
인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9의 대표로서 공지된 농도의 H3N2 입자를 본 구현예에서 사용하였다. 103개 카피 수에서 102 및 101개 카피 수까지 2단계 희석물을 제조하였다. 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 또는 H7N9의 M 유전자를 증폭시키기 위하여 서열번호 5(F) 및 서열번호 18(R)을 갖는 프라이머를 사용하였다. 서열번호 9를 갖는 프로브 또한 본 구현예에서 사용하였다. 프로브는 또한 서열번호 10으로 교체될 수 있다. 내부 대조군의 경우, ms2를 증폭시키기 위하여 서열번호 39(F) 및 서열번호 45(R)를 갖는 프라이머를 사용하였다. 서열번호 42를 갖는 프로브 또한 본 구현예에서 사용하였다. 프라이머 및 프로브 서열을 표 1에 나타낸다.
Roche Light Cycler 96 실시간 시스템(Roche Molecular Systems, Inc.)으로 증폭을 수행하고, 측정하고 모니터링하였다. 각각의 반응 혼합물 부피는 20 μl였으며, 다음의 조건하에서 증폭하였다:
반응 혼합물을 먼저 50℃에서 2분 동안 역전사시켰다. 실제 증폭 반응물을 먼저 95℃에서 2분 동안 배양한 다음, 아래의 계획(scheme)에 따라 50 사이클을 수행하였다:
95℃ 1초. → 60℃ 1초.
도 2는 주어진 프라이머 쌍, 프로브 및 내부 대조군에 대한 동적(kinetic) PCR 성장 곡선을 나타낸다. H3N2 입자의 103, 102 및 101의 성장 곡선이 임계값(threshold)을 초과할 경우, 분명하고 특이적인 신호는 초기에 검출 가능하다. 이러한 조건 및 프라이머 서열하에서의 검출 한계는 101개 카피 수에 이를 수 있다.
즉, 의심되는 샘플이 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 또는 H7N9(이들 모두는 M 유전자 서열을 함유함)에 의해 감염된 경우, 상승하는 곡선이 동적 PCR 성장 곡선에서 나타날 것이다. 한편, ms2 신호는 또한 적절한 프로세스의 대표로서 검출 가능하다.
구현예 2. 인플루엔자 B 바이러스의 LOD
인플루엔자 B 바이러스의 두 계통의 대표로서 인플루엔자 B/빅토리아/2/87-유사 바이러스 균주인 말레이시아 2506/2004 균주을 본 구현예에서 사용하였다. 103개 바이러스 카피 수에서 102 및 101개 카피 수까지 2단계 희석물을 제조하였다. 의심되는 인플루엔자 B 바이러스의 NS 유전자를 증폭시키기 위하여, 서열번호 22(F) 및 서열번호 33(R)을 갖는 프라이머를 사용하였다. 서열번호 28를 갖는 프로브 또한 본 구현예에서 사용하였다. 프로브는 또한, 서열번호 27로 교체될 수 있다. 내부 대조군의 경우, ms2를 증폭시키기 위하여 서열번호 39(F) 및 서열번호 45(R)를 갖는 프라이머를 사용하였다. 서열번호 42를 갖는 프로브 또한 본 구현예에서 사용하였다. 프라이머 및 프로브 서열을 표 3에 나타낸다.
Roche Light Cycler 96 실시간 시스템(Roche Molecular Systems, Inc.)으로 증폭을 수행하고, 측정하고, 모니터링하였다. 각각의 반응 혼합물 부피는 20 μl였고, 다음 조건 하에서 증폭하였다:
반응 혼합물을 먼저 50℃에서 2분 동안 역전사시켰다. 실제 증폭 반응물을 먼저 95℃에서 2분 동안 배양한 다음, 다음 계획에 따라 50 사이클을 수행하였다:
95℃ 1초. → 60℃ 1초.
도 3은 주어진 프라이머 쌍, 프로브 및 내부 대조군에 대한 동적 PCR 성장 곡선을 나타낸다. 말레이시아 2506/2004 입자의 103, 102 및 101의 성장 곡선이 임계값을 초과할 경우, 분명하고 특이적인 신호가 초기에 검출 가능하다. 이러한 조건에서 검출 한계는 101개 카피 수에 이를 수 있다.
즉, 의심되는 샘플이 인플루엔자 B 바이러스(이는 NS 유전자 서열을 함유함)에 의해 감염된 경우, 상승하는 곡선이 동적 PCR 성장 곡선에서 나타날 것이다. 한편, ms2 신호는 또한 적절한 공정의 대표로서 검출 가능하다.
구현예 3. 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9 및 인플루엔자 B 바이러스 검출
본 발명은 4종의 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9 중 적어도 1종 및/또는 인플루엔자 B 바이러스의 존재를 각각 검출하는 방법을 개시한다. 바람직하게는, 본 발명은 샘플 준비 단계를 포함하지 않는다. 목/코 면봉 검체 또는 비인두 면봉 검체일 수 있는 의심되는 샘플로부터의 핵산의 정제 또는 단리 후, 핵산은 샘플 수집 완충액에 함유된다.
이 구현예는 인플루엔자 유사 증상을 갖는 미지의 환자의 의심되는 샘플에서 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 또는 H7N9의 M 유전자의 존재를 검출하는 검출 방법을 제공하기 위한 것으로, 여기에서 의심되는 샘플의 핵산은 상기 언급된 바와 같이 샘플 수집 완충액에 함유된다. 인플루엔자 B 바이러스의 NS 유전자의 존재 또한, 동시에 검출된다. 보다 정확하게는, 의심되는 샘플이 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 또는 H7N9 중 적어도 1종을 함유할 경우, 검출 결과는 이들 4종의 하위유형 중 어느 것이 존재하는지와 무관하게, 이 의심되는 샘플에 인플루엔자 A 바이러스 중 적어도 1종의 하위유형이 존재한다는 결과를 반영한다. 또한, 의심되는 샘플이 인플루엔자 B 바이러스 중 적어도 1종의 균주를 함유할 경우, 이 또한, 본 발명에 의해 동시에 검출된다. 그리고 또한, 의심되는 샘플이 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9 중 적어도 1종 및/또는 인플루엔자 B 바이러스를 함유할 경우, 이는 별도로 검출될 것이다.
인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 또는 H7N9의 적어도 1종을 검출하기 위해, 서열번호 5(F) 및 서열번호 18(R)을 갖는 프라이머를 사용하여 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 또는 H7N9의 M 유전자를 증폭시켰다. 서열번호 9를 갖는 프로브 또한, 본 구현예에서 사용하였다. 내부 대조군의 경우, ms2를 증폭시키기 위하여 서열번호 39(F) 및 서열번호 45(R)를 갖는 프라이머를 사용하였다. 서열번호 42를 갖는 프로브 또한, 본 구현예에서 사용하였다. 프라이머 및 프로브 서열을 표 1에 나타낸다.
인플루엔자 B 바이러스를 검출하기 위해, 서열번호 22(F) 및 서열번호 33(R)을 갖는 프라이머를 사용하여 의심되는 인플루엔자 B 바이러스의 NS 유전자를 증폭시켰다. 서열번호 28을 갖는 프로브 또한, 본 구현예에서 사용하였다. 내부 대조군의 경우, ms2를 증폭시키기 위하여 서열번호 39(F) 및 서열번호 45(R)를 갖는 프라이머를 사용하였다. 서열번호 42를 갖는 프로브 또한, 본 구현예에서 사용하였다. 프라이머 및 프로브 서열을 표 3에 나타낸다.
Roche Light Cycler 96 실시간 시스템(Roche Molecular Systems, Inc.)으로 증폭을 수행하고, 측정하고, 모니터링하였다. 각각의 반응 혼합물 부피는 20 μl였고, 다음 조건 하에서 증폭하였다:
반응 혼합물을 먼저 50℃에서 2분 동안 역전사시켰다. 실제 증폭 반응물을 먼저 95℃에서 2분 동안 배양한 다음, 다음 계획에 따라 50 사이클을 수행하였다:
95℃ 1초. → 60℃ 1초.
도 4는 주어진 프라이머 쌍, 프로브 및 내부 대조군에 대한 동적 PCR 성장 곡선을 나타낸다. 도 4에서, 검출 결과는 의심되는 샘플이 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N2 및 H7N9 중 적어도 1종 및 인플루엔자 B 바이러스를 함유하고 있음을 보여준다. 그 후, 의심되는 샘플을 서열분석 절차로 처리하였고, 결과는 의심되는 샘플이 인플루엔자 A H3N2와 인플루엔자 B 바이러스 말레이시아 2506/2004를 함유하고 있음을 보여주었다.
구현예 4. 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9 및 인플루엔자 B 바이러스의 무작위 검출
이 구현예에서는, 본 발명의 검출 특이도에 대한 시험이 제공된다. 임상적 검출의 특이도는 질병/증상이 없는 샘플을 정확하게 확인하는 검출의 능력을 지칭한다. 따라서, 100% 특이도를 갖는 검출은 질병/증상이 없는 모든 샘플을 정확하게 확인한다. 80% 특이도를 갖는 검출은 질병/증상이 없는 샘플의 80%는 검출 음성(진짜 음성)으로 정확하게 보고하지만, 질병/증상이 없는 20% 샘플은 검출 양성(거짓 양성)으로 부정확하게 확인된다. 본 발명의 특이도를 시험하기 위하여, 아래 열거된 바와 같이 오르토믹소바이러스 종에 속하지 않는 4종 샘플이 본 구현예에 제공된다. 각 종의 TCID50은 1.43*105/ml 보다 높다.
각각 인플루엔자 A H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9(프라이머: 서열번호 5 및 서열번호 18; 프로브: 서열번호 9) 및 인플루엔자 B 바이러스(프라이머: 서열번호 22 및 서열번호 33; 프로브: 서열번호 28)에 대해 특이적인 지정된 프라이머 및 프로브를 비롯하여, 동일한 준비 절차 및 증폭 조건을 이들 4종 샘플에 사용하였다. 내부 대조군으로 ms2 입자, 프라이머 및 프로브(프라이머: 서열번호 39 및 서열번호 45; 프로브: 서열번호 42) 또한, 이 구현예에서 사용하였다.
Roche Light Cycler 96 실시간 시스템(Roche Molecular Systems, Inc.)으로 증폭을 수행하고, 측정하고, 모니터링한다. 각각의 반응 혼합물 부피는 20 μl였고, 다음 조건 하에서 증폭하였다:
반응 혼합물을 먼저 50℃에서 2분 동안 역전사시켰다. 실제 증폭 반응물을 먼저 95℃에서 2분 동안 배양한 다음, 다음 계획에 따라 50 사이클을 수행하였다:
95℃ 1초. → 60℃ 1초.
도 5는 주어진 프라이머 쌍, 프로브 및 내부 대조군에 대한 동적 PCR 성장 곡선을 나타낸다. 도 5에서, 이들 4종 샘플의 검출 결과는 각 종의 내부 대조군은 정상적으로 검출되는 반면, 어떠한 샘플에서도 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 및 H7N9, 그리고 인플루엔자 B 바이러스가 검출되고 인식되지 않았음을 보여준다. 따라서, 본 발명의 특이도는 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 또는 H7N9 뿐만 아니라, 인플루엔자 B 바이러스를 확인하는 데 있어서 100% 특이도 보정(correction)에 이를 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> CREDO BIOMEDICAL PTE LTD
<120> METHOD FOR INFLUENZA A VIRUS AND INFLUENZA B VIRUS DETECTION
<130> P18-211-INP-LLI
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<151> 2018-11-01
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<210> 1
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<212> DNA
<213> Influenza A virus
<400> 1
agatgagtct tctaaccgag gtcgaaacgt acgttctctc tatcgtcccg tcaggccccc 60
tcaaagccga gatcgcacag agacttgaag atgtctttgc tgggaagaac accgatcttg 120
aggctctcat ggaatggcta aagacaagac caatcctgtc acctctgact aaggggattt 180
taggatttgt gttcacgctc accgtgccca gtgagcgagg actgcagcgt agacgctttg 240
tccaaaatgc ccttaatggg aatggggatc caaataacat ggacagagca gttaaactgt 300
atagaaagct taagagggag ataacattcc atggggccaa agaaatagca ctcagttatt 360
ctgctggtgc acttgccagt tgtatgggcc tcatatacaa caggatgggg gctgtgacca 420
ctgaagtggc atttggcctg gtatgcgcaa cctgtgaaca gattgctgac tcccagcata 480
ggtctcatag gcaaatggtg acaacaacca atccactaat aagacatgag aacagaatgg 540
ttctggccag cactacagct aaggctatgg agcaaatggc tggatcgagt gagcaagcag 600
cagaggccat ggaggttgct agtcaggcca ggcaaatggt gcaggcaatg agagccattg 660
ggactcatcc tagctccagt gctggtctga aagatgatct tcttgaaaat ttgcaggcct 720
atcagaaacg aatgggggtg cagatgcaac gattcaagtg atcctcttgt tgttgccgca 780
agtatcattg ggatcttgca cttgatattg tggattcttg atcgtctttt tttcaaatgc 840
atttatcgtc tctttaaaca cggtctgaaa agagggcctt ctacggaagg agtaccagag 900
tctatgaggg aagaatatcg aaaggaacag cagaatgctg tggatgctga cgatagtcat 960
tttgtcaaca tagagctgga gtaa 984
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 2
atgagycttc taaccgaggt cgaaacg 27
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 3
ttcgacctcg gttag 15
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 4
cttctaaccg aggtcgaaac g 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 5
tcaggccccc tcaaagccga 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 6
ccrtcaggcc ccctcaaagc 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 7
ccctcaaagc cgagatcg 18
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 8
atgagycttc taaccgaggt cg 22
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 9
ttcacgctca ccgtgcc 17
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 10
tttgtgttca cgctcaccgt gcc 23
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 11
cgtctacgct gcagtcctcg ctcac 25
<210> 12
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 12
gcgaggactg cagc 14
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 13
ggtcttgtct ttagccattc catgagag 28
<210> 14
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 14
catggaatgg ctaaag 16
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 15
cgctgcagtc ctcgctcac 19
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 16
cgctgcagtc ctcgctcact 20
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 17
taatacgact cactataggg cgtctacgct gc 32
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 18
ctacgctgca gtcctcgctc a 21
<210> 19
<211> 1066
<212> DNA
<213> Influenza B virus
<400> 19
tgtttagtca ctggcaaaca gagaaaaatg gcgaacaaca acatgaccac aacacaaatt 60
gaggtgggtc cgggagcaac caatgccacc ataaactttg aagcaggaat tctggagtgc 120
tatgaaaggc tttcatggca aagagccctt gactatcccg gtcaagaccg cctaaacaga 180
ctaaaaagaa aattagagtc aagaataaag acccacaaca aaagtgagcc tgaaagtaaa 240
aggatgtccc ttgaagagag aaaagcaatt ggagtaaaaa tgatgaaagt actcctattt 300
atgaatccgt ctgctgaaat tgaagggttt gagccatact gtatgaacag ttcctcaaat 360
agcaactgta cgaaatacaa ttggaccgat tacccttcaa caccagagag gtgccttgat 420
gacatagagg aagaaccaga ggatgttgat ggcccaactg aaatagtatt aagggacatg 480
aacaacaaag atgcaaggca aaagataaag gaggaagtaa acactcagaa agaagggaag 540
ttccgtttga caataaaaag ggatatacgt aatgtattgt ccttgagagt gttggtaaat 600
ggaacattcc tcaaacaccc caatggatac aagtccttgt caactctgca tagattgaat 660
gcatatgacc agagtggaag gcttgttgct aaacttgttg ccactgatga tcttacagtg 720
gaggatgaag aagatggcca tcggatcctc aactcactct tcgagcgtct caatgaagga 780
cattcaaagc caattcgagc agctgaaact gcggtgggag tcttatccca atttggtcaa 840
gagcaccgat tatcaccaga agagggagac aattagattg gtcacggaag aactttatct 900
tttaagtaaa agaattgatg ataacatact attccacaaa acagtgatag ctaacagctc 960
cataatagct gacatggttg tatcattatc attattagaa acattgtatg aaatgaagga 1020
tgtggttgaa gtgtacagca ggcagtgctt gtgaatttaa aataaa 1066
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 20
gatgttgatg gcccaactga aatag 25
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 21
ggatgaagaa gatggccatc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 22
aagatggcca tcggatcctc 20
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 23
ctcaaytcac tcttcgagcg tc 22
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 24
ccatcggatc ctcaaytcac tc 22
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 25
atgaagaaga tggccatcgg 20
<210> 26
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 26
ggaggatgaa gaagatgg 18
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 27
caattcgagc agctgaaa 18
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 28
ccaattcgag cagctgaaac tgcg 24
<210> 29
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 29
caccgattat cacca 15
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 30
ctcttctggt gataatcggt gctc 24
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 31
ttctggtgat aatcggtgct c 21
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 32
aaccatgtca gctattatgg agctg 25
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 33
ggtgataatc ggtgctcttg acc 23
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 34
tctaattgtc tccctcttct g 21
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 35
attgtctccc tcttctggtg 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 36
gataatcggt gctcttgacc 20
<210> 37
<211> 1207
<212> DNA
<213> Bacteriophage MS2
<400> 37
aatgccattt ttaatgtctt tagcgagacg ctaccatggc tatcgctgta ggtagccgga 60
attccattcc taggaggttt gacctgtgcg agcttttagt acccttgata gggagaacga 120
gaccttcgtc ccctccgttc gcgtttacgc ggacggtgag actgaagata actcattctc 180
tttaaaatat cgttcgaact ggactcccgg tcgttttaac tcgactgggg ccaaaacgaa 240
acagtggcac tacccctctc cgtattcacg gggggcgtta agtgtcacat cgatagatca 300
aggtgcctac aagcgaagtg ggtcatcgtg gggtcgcccg tacgaggaga aagccggttt 360
cggcttctcc ctcgacgcac gctcctgcta cagcctcttc cctgtaagcc aaaacttgac 420
ttacatcgaa gtgccgcaga acgttgcgaa ccgggcgtcg accgaagtcc tgcaaaaggt 480
cacccagggt aattttaacc ttggtgttgc tttagcagag gccaggtcga cagcctcaca 540
actcgcgacg caaaccattg cgctcgtgaa ggcgtacact gccgctcgtc gcggtaattg 600
gcgccaggcg ctccgctacc ttgccctaaa cgaagatcga aagtttcgat caaaacacgt 660
ggccggcagg tggttggagt tgcagttcgg ttggttacca ctaatgagtg atatccaggg 720
tgcatatgag atgcttacga aggttcacct tcaagagttt cttcctatga gagccgtacg 780
tcaggtcggt actaacatca agttagatgg ccgtctgccg tatccagctg caaacttcca 840
gacaacgtgc aacatatcgc gacgtatcgt gatatggttt tacataaacg atgcacgttt 900
ggcatggttg tcgtctctag gtatcttgaa cccactaggt atagtgtggg aaaaggtgcc 960
tttctcattc gttgtcgact ggctcctacc tgtaggtaac atgctcgagg gccttacggc 1020
ccccgtggga tgctcctaca tgtcaggaac agttactgac gtaataacgg gtgagtccat 1080
aatctcagcc atgcatcgag gggtacaatc cgtatggcca acaactggcg cgtacgtaaa 1140
gtctcctttc tcgatggtcc ataccttaga tgcgttagca ttaatcaggc aacggctctc 1200
tagatag 1207
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 38
tggcgcgtac gtaaagtctc ct 22
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 39
ctggcgcgta cgtaaagtct cc 22
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 40
gcgcgtacgt aaagtctcct ttctc 25
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 41
gcattaatca ggcaacggct ctc 23
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 42
ccctcaaccg gagtttgaag catg 24
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 43
gccagttccg ccattgtcg 19
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 44
gtcgccagtt ccgccattgt 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 45
gaccccgtta gcgaagttgc 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 46
cgaccccgtt agcgaagttg 20
<210> 47
<211> 211
<212> DNA
<213> Influenza A virus
<400> 47
tcgtcccgtc aggccccctc aaagccgaga tcgcgcagag acttgaagat gtctttgctg 60
gaaagaacac agatcttgag gcactcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac 120
ctttgactaa ggggatttta ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac 180
tgcagcgtag acgctttgtc cagaatgccc t 211
<210> 48
<211> 211
<212> DNA
<213> Influenza A virus
<400> 48
tcgttccgtc aggccccctc aaagccgaga tcgcgcagag acttgaagat gtctttgctg 60
gaaagaacac agatcttgag gctctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac 120
ctctgactaa ggggattttg ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac 180
tgcagcgtag acgctttgtc caaaatgccc t 211
<210> 49
<211> 211
<212> DNA
<213> Influenza A virus
<400> 49
tcatcccgtc aggccccctc aaagccgaga tcgcgcagag acttgaagat gtctttgcag 60
gaaagaacac tgatctcgag gctctcatgg agtggctaaa gacaagacca atcctgtcac 120
ctctgactaa agggatcttg ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gaacgaggac 180
tgcagcgtag acgctttgtc cagaatgccc t 211
<210> 50
<211> 211
<212> DNA
<213> Influenza A virus
<400> 50
tcgtcccgtc aggccccctc aaagccgaga tcgcgcagag acttgaagat gtctttgcag 60
ggaagaacac agatctcgag gctctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac 120
ctttgactaa ggggattttg gggtttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac 180
tgcagcgtag acgctttgtc caaaatgcac t 211
Claims (6)
- 의심되는 샘플에서 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 또는 H7N9, 및 인플루엔자 B 바이러스의 존재를 검출하는 방법으로서,
(a) 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 또는 H7N9의 기질 유전자(matrix gene)를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계, 여기에서 샘플은 또한 인플루엔자 B 바이러스의 비구조적 유전자(non-structual gene)를 함유하는 것으로 의심됨,
(b) 제1 및 제2 프라이머를 포함하는, 인플루엔자 A 바이러스의 기질 유전자를 검출하기 위한 프라이머 쌍을 제공하는 단계, 여기에서 제1 프라이머는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 군으로부터 선택되고, 제2 프라이머는 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18의 군으로부터 선택됨,
(c) 제3 및 제4 프라이머를 포함하는, 인플루엔자 B 바이러스의 비구조적 유전자를 검출하기 위한 프라이머 쌍을 제공하는 단계, 여기에서 제3 프라이머는 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26의 군으로부터 선택되고, 제4 프라이머는 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35 및 서열번호 36의 군으로부터 선택됨,
(d) 내부 대조군(internal control)으로 ms2의 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍을 제공하는 단계, 여기에서 정방향 프라이머는 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40 및 서열번호 41의 군으로부터 선택되고, 역방향 프라이머는 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45 및 서열번호 46의 군으로부터 선택됨,
(e) 표적 핵산을 역전사 효소 및 주형 의존적 중합효소로 증폭시키는 단계,
(f) 단계 (e) 동안, 제1 및 제2 프로브를 표적 핵산에 대해 어닐링하여 혼성화된 생성물을 형성하는 단계, 여기에서 제1 프로브 서열은 인플루엔자 A 바이러스의 기질 유전자에 대해 특이적이며 서열번호 9 및 서열번호 10의 군으로부터 선택되고, 제2 프로브는 인플루엔자 B 바이러스의 비구조적 유전자에 대해 특이적이며 서열번호 27 및 서열번호 28의 군으로부터 선택됨,
(g) 단계 (e) 동안, ms2에 특이적인 프로브를 어닐링하여 혼성화된 생성물을 형성하는 단계, 여기에서 프로브 서열은 서열번호 42와 같음, 및
(h) 표적 핵산의 존재에 대한 지표로서 혼성화된 생성물로부터 생성된 신호를 검출하는 단계
를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서,
혼성화된 생성물로부터 생성된 신호는 형광 신호인 것인 방법. - 제2항에 있어서,
제1, 제2 및 ms2 프로브의 모든 5'-말단은 형광 리포터를 가지고 있으며, 이는 FAM, HEX, VIC, CY3, CY5, TET, ALEXA594 및 ALEXA643으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 3개의 프로브의 3'-말단은 ??처(quencher)를 가지고 있으며, 이는 TMARA, MGB 및 BHQ로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 여기에서 3개의 프로브 모두의 형광 리포터는 별개(distinct)의 것인 방법. - 제3항에 있어서,
혼성화된 생성물로부터 생성된 3개의 별개의 형광 신호는 형광 리포터의 단편의 양으로 검출되며, 이는 DNA 의존적 중합효소의 엑소뉴클레아제 가수분해에 의해 표적 핵산에 혼성화된 제1 또는 제2 프로브로부터 각각 절단되는 것인 방법. - 제4항에 있어서,
제1 형광 신호의 존재는 의심되는 샘플에서의 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 또는 H7N9의 존재를 나타내고, 제1 형광 신호의 부재는 의심되는 샘플에서의 인플루엔자 A 하위유형 H1N1, H3N2, H5N1 또는 H7N9의 부재를 나타내는 것인 방법. - 제4항에 있어서,
제2 형광 신호의 존재는 의심되는 샘플에서의 인플루엔자 B 바이러스의 존재를 나타내고, 제2 형광 신호의 부재는 의심되는 샘플에서의 인플루엔자 B 바이러스의 부재를 나타내는 것인 방법.
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