CN111663007A - 一种多种病毒核酸联合检测引物与探针组合以及检测试剂盒 - Google Patents

一种多种病毒核酸联合检测引物与探针组合以及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种多种病毒核酸联合检测引物与探针组合以及检测试剂盒。本发明公开了一种甲型流感(H1N1)病毒、甲型流感(H3N2)病毒、乙型流感(FluB)病毒、新冠病毒2019‑nCoV、呼吸道合胞病毒、副流感病毒和腺病毒的检测引物和探针组合，该引物和探针组合可以同时检测上述七种病毒，且检测灵敏度高、重复性好、假阳性低、假阴性低。

Description

一种多种病毒核酸联合检测引物与探针组合以及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种多种病毒核酸联合检测引物与探针组合以及检测试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒(2019-nCoV/SARS-CoV-2)、甲型流感病毒(甲型H1N1流感病毒、H3N2)、乙型流感病毒(Influenza B，IFV B)、呼吸道合胞病毒(Respiratory SyncytialVirus，RSV)、副流感病毒(Parainfluenza Virus，PIV)、腺病毒呼吸道(Adenovirus，Adv)等呼吸道疾病均有发热等相似的临床症状，仅靠发热等临床表现来区别患者，或单指标检测是否为新型冠状病毒(2019-nCoV/SARS-CoV-2)，并不足以满足医院对患者的分流。因此，提供一种快速鉴别新型冠状病毒与其它呼吸道病毒的产品来辅助临床，为临床提供精准检测，从而合理分流不同患者，使不同患者都得到快速的救治是本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种多种病毒核酸联合检测引物与探针组合以及检测试剂盒，可以同时快速检测新型冠状病毒、甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒和腺病毒，且检测灵敏度高、重复性好、假阴性低、假阳性低。
其具体技术方案如下：
本发明提供了一种多种病毒核酸联合检测引物与探针组合，所述引物包括：
(1)用于检测新型冠状病毒ORF1ab基因的引物对，其核苷酸序列依次如SEQ IDNO：1-2所示；
(2)用于检测甲型H1N1流感病毒matrix(M1)基因的引物对，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：5-6所示；
(3)用于检测甲型H3N2流感病毒matrix(M1)基因的引物对，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：9-10所示；
(4)用于检测乙型流感病毒matrix(M1)基因的引物对，其核苷酸序列依次如SEQID NO：13～14所示；
(5)用于检测呼吸道合胞病毒matrix基因的引物对，其核苷酸序列依次如SEQ IDNO：17-18所示；
(6)用于检测腺病毒hexon的引物对，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：21-22所示；
(7)用于检测副流感病毒hemagglutinin neuraminidase基因基因的引物对，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：25-26所示；
(8)用于检测内标Rnase P的引物对，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：29-30所示；
八种靶基因的探针均由两条反向互补的不等长的寡核苷酸链组成，且标记荧光剂的寡核苷酸链与靶基因碱基互补。
优选地，所述探针包括：
(1)用于检测新型冠状病毒靶基因的探针，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：3-4所示；
(2)用于检测甲型H1N1流感病毒matrix(M1)基因的探针，其核苷酸序列依次如SEQID NO：7-8所示；
(3)用于检测甲型H3N2流感病毒matrix(M1)基因的探针，其核苷酸序列依次如SEQID NO：11-12所示；
(4)用于检测乙型流感病毒matrix(M1)基因的探针，其核苷酸序列依次如SEQ IDNO：15～16所示；
(5)用于检测呼吸道合胞病毒matrix基因的探针，其核苷酸序列依次如SEQ IDNO：19-20所示；
(6)用于检测腺病毒hexon基因的探针，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：23-24所示；
(7)用于检测副流感病毒hemagglutinin neuraminidase基因的探针，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：27-28所示；
(8)用于检测内标Rnase P的探针，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：31-32所示。
优选地，所述探针中，与靶基因核苷酸链碱基互补的寡核苷酸链的5’端标记荧光剂，3’端需封闭，另一条寡核苷酸链3’端采用淬灭剂封闭。
本发明探针两条链在稳定的双链结构，荧光剂与淬灭剂紧密相邻，荧光剂的荧光被淬灭，此时探针没有荧光；在酸、碱、热等条件下探针分开成两条单链，淬灭剂远离荧光剂，荧光剂发出荧光；当恢复至温和条件，两条链复性为双链状态，荧光剂与淬灭剂，探针没有荧光；当检测环境存在靶DNA时，靶DNA链置换带有淬灭剂的负链，两条链分开，淬灭剂远离荧光剂，荧光剂受激发而产生荧光信号。
本发明中，与靶基因核苷酸链碱基互补的寡核苷酸链的5’端标记荧光剂，3’端磷酸化封闭。
本发明中，所述荧光剂选自FAM、HEX、CY5或ROX；所述淬灭剂选自BHQ1或BHQ2。
本发明还提供了上述多种病毒核酸联合检测引物与探针组合在制备多种病毒核酸联合检测试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种多种病毒核酸联合检测试剂盒，包括上述多种病毒核酸联合检测引物与探针组合。
优选地，用于检测靶基因的探针使用浓度为180-220nM，用于检测内标的探针使用浓度为80-120nM，用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为180-220nM，用于检测内标的引物使用浓度为80-120nM。
更优选地，用于检测靶基因的探针使用浓度为200nM，用于检测内标的探针使用浓度为100nM，用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为200nM，用于检测内标的引物使用浓度为100nM。
优选地，所述联合检测试剂盒还包括PCR缓冲液、酶混合液、空白对照和阳性对照。
优选地，所述PCR缓冲液的组成为：26-30mol/L pH 8-8.5Tris-HCl，15-25mmol/L(NH4)2SO4，28-32mmol/L KC1，3.5-4.5mmol/L MgCl2，0.15-0.25mol/L dNTPs。
更优选地，所述PCR缓冲液组成为：28mol/L pH8.0 Tris-HCl，20mmol/L(NH4)2SO4，30mmol/L KC1，4.0mmol/L MgCl2，0.2mol/L dNTPs。
优选地，所述酶混合液包括热启动Taq酶、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶UNG；其中热启动Taq酶的用量为3-8U/人份，逆转录酶的用量为3-8U/人份，尿嘧啶糖基化酶的用量为0.05-0.2U/人份。
优选地，所述阳性对照：新型冠状病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；
甲型H1N1流感病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；
甲型H3N2流感病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；
乙型流感病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；
呼吸道合胞病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；
腺病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；
副流感病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；
内标质粒，浓度为1.0×104copies/ml；
所述空白对照为无RNA酶的水。
本发明中，内标选用的是人Rnase P蛋白基因作为内源性内标，监控样本采集、提取及检测整个实验流程，避免假阴性出现。同时设置UNG酶+dUTP防污染措施避免PCR产物污染带来的假阳性结果。
本发明提供的试剂盒检测灵敏度高、重复性好、假阳性低、假阴性低，可以分两管同时检测七种呼吸道病毒，无需单独检测每种病毒，实现快速鉴别诊断、使得不同患者得到及时针对性治疗。
从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种甲型流感(H1N1)病毒、甲型流感(H3N2)病毒、乙型流感(FluB)病毒、新冠病毒2019-nCoV、呼吸道合胞病毒、副流感病毒和腺病毒的检测引物和探针组合，该引物和探针组合可以同时检测上述七种病毒，且检测灵敏度高、重复性好、假阳性低、假阴性低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例4提供的新冠病毒2019-nCoV质粒质控品扩增结果；
图2为本发明实施例4提供的甲型(H1N1)流感病毒质粒质控品扩增结果；
图3为本发明实施例4提供的甲型(H3N2)流感病毒质粒质控品扩增结果；
图4为本发明实施例4提供的乙型流感(FluB)病毒质粒质控品扩增结果图；
图5为本发明实施例4提供的新冠病毒2019-nCoV质粒质控品扩增结果图；
图6为本发明实施例4提供的呼吸道合胞病毒质粒质控品扩增结果图；
图7为本发明实施例4提供的副流感病毒质粒质控品扩增结果图；
图8为本发明实施例4提供的腺病毒质粒质控品扩增结果图。
具体实施方式
为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中，甲型流感(H1N1)病毒质粒质控品、甲型流感(H3N2)病毒质粒质控品、乙型流感(FluB)病毒质粒质控品、新冠病毒2019-nCoV质粒质控品、呼吸道合胞病毒质粒质控品、副流感病毒质粒质控品、腺病毒质粒质控品及细胞内标的Rnase P基因质粒质控品均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
实施例1
本实施例为多种病毒引物与探针组合物的设计
表1本实施例引物和探针组合表
Figure BDA0002589638090000051
Figure BDA0002589638090000061
Figure BDA0002589638090000071
Figure BDA0002589638090000081
对比例1
本对比例为多种病毒引物和探针组合物的设计，如表2所示。
表2本对比例引物和探针组合表
Figure BDA0002589638090000082
Figure BDA0002589638090000091
Figure BDA0002589638090000101
对比例2
本对比例为多种病毒引物和探针组合物的设计，如表3所示。
表3本对比例引物和探针组合表
Figure BDA0002589638090000102
Figure BDA0002589638090000111
Figure BDA0002589638090000121
实施例2
经过相应的检测体系优化探索，建立了如下检测体系：每管PCR加入10μl RT-PCR扩增液及5μl的探针引物混合液。并加入5μl模板RNA量。即RT-PCR检测体系(总体积20μl)包括：
(1)10μl RT-PCR扩增液，扩增液包括PCR缓冲液、热启动Taq酶5U、逆转录酶5U、尿嘧啶糖基化酶(UNG)0.1U；PCR缓冲液的组成为：28mol/L pH8.0 Tris-HCl，20mmol/L(NH4)2SO4，30mmol/L KC1，4.0mmol/L MgCl2，0.2mol/L dNTPs；
(2)5μl扩增检测液：用于检测靶基因的探针使用浓度为200nM，用于检测内标的探针使用浓度为100nM，用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为200nM，用于检测内标的引物使用浓度为100nM；
(3)5μl模板核酸。
利用实施例1表1、对比例1表2和对比例表3所示各组引物与探针进行检测，使用甲型流感(H1N1)病毒质粒质控品、甲型流感(H3N2)病毒质粒质控品、乙型流感(FluB)病毒质粒质控品、新冠病毒2019-nCoV质粒质控品、呼吸道合胞病毒质粒质控品、副流感病毒质粒质控品、腺病毒质粒质控品及细胞内标的Rnase P基因质粒质控品进行引物探针组合进行测试。荧光检测通道和RT-PCR扩增程序的设定如表4和表5所示。测试结果如表6所示。
表4荧光检测通道的设定
Figure BDA0002589638090000131
表5 RT-PCR扩增程序的设定
Figure BDA0002589638090000132
表6各组MIX检测结果Ct值
引物和探针组合 实施例1 对比例1 对比例2
2019-nCov检测Ct 30.16 31.23 30.86
甲流HIN1检测Ct 28.32 30.12 30.21
甲流H3N2检测Ct 29.51 31.26 30.16
乙型流感病毒检测Ct 30.82 32.36 33.08
呼吸道合胞病毒检测Ct 29.06 30.63 31.22
副流感病毒检测Ct 31.16 32.86 32.63
腺病毒检测Ct 29.52 30.88 30.27
RNase P检测Ct 29.26 30.83 31.20
表6结果结果显示，相比对比例1和对比例2设计的引物和探针，本发明实施例1的引物和探针组合，针对每个病原体的检出敏感性及特异性最优。
实施例3
本实施例为试剂盒的制备与操作
1、试剂盒的制备：
(1)引物与探针组合如实施例1表1所示。
(2)PCR缓冲液组成为：28mol/L pH8.0 Tris-HCl，20mmol/L(NH4)2SO4，30mmol/LKC1，4.0mmol/L MgCl2，0.2mol/L dNTPs。
(3)酶混合液组成：热启动Taq酶的用量为3-8U/人份，逆转录酶的用量为3-8U/人份，尿嘧啶糖基化酶的用量为0.05-0.2U/人份。
(4)阳性对照：新型冠状病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；
甲型H1N1流感病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；
甲型H3N2流感病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；
乙型流感病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；
呼吸道合胞病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；
腺病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；
副流感病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；
内标质粒，浓度为1.0×104copies/ml。
(5)空白对照：无RNA酶的水。
2、试剂盒的操作
(1)样本采集及处理：
1)鼻咽拭子：用无菌拭子拭取鼻腔、咽部分泌物，将其置于无菌试管(400-500μL生理盐水或PBS)，用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。
2)痰液：留取前清水漱口3次，用力咳出呼吸道深部的痰液吐至无菌痰液收集器中。患者痰液较深不易咳出时，可在咳痰前捶背、协助排痰。采集痰量不能少于1mL。液化方法：痰液样本中加入等体积的乙酰半胱氨酸(10g/L)，室温振荡30分钟，待充分液化后才可进行后续核酸提取。
3)肺泡灌洗液：收集支气管肺泡灌洗液密闭送检。
样本采用MagaBio plus病毒DNA/RNA纯化试剂盒II，配套博日的自动提取仪。
(2)样品检测：取5μl样品提取的DNA/RNA分别加入PCR反应液管I，管II混匀后，再放置于荧光定量PCR仪中反应，扩增程序如表5所示。
(3)扩增曲线分析：
1)样本在检测管I的FAM、HEX/JOE和ROX荧光检测通道Ct值均显示为Undet，其RNA内参在CY5荧光检测通道Ct值≤37，管II中的FAM、HEX/JOE、ROX和CY5荧光检测通道Ct值均显示为Undet，判断为阴性。
2)样本在管I中FAM荧光检测通道Ct值≤37，HEX/JOE和ROX荧光检测通道Ct值显示为Undet，其RNA内参在CY5荧光检测通道Ct值≤37或Undet，管II中的FAM、HEX/JOE、ROX和CY5荧光检测通道Ct值均显示为Undet，判断为2019-nCoV阳性。
3)样本在管I中HEX/JOE荧光检测通道Ct值≤37，FAM和ROX荧光检测通道Ct值显示为Undet，其RNA内参在CY5荧光检测通道Ct值≤37或Undet，管II中的FAM、HEX/JOE、ROX和CY5荧光检测通道Ct值均显示为Undet，判断为甲型H1N1流感病毒阳性。
4)样本在管I中ROX荧光检测通道Ct值≤37，FAM和HEX/JOE荧光检测通道Ct值显示为Undet，其RNA内参在CY5荧光检测通道Ct值≤37或Undet，管II中的FAM、HEX/JOE、ROX和CY5荧光检测通道Ct值均显示为Undet，判断为甲型H3N2流感病毒阳性。
5)样本在管I中FAM、HEX/JOE和ROX荧光检测通道Ct值显示为Undet，其RNA内参在CY5荧光检测通道Ct值≤37或Undet，管II中的FAM荧光检测通道Ct值≤37，HEX/JOE、ROX和CY5荧光检测通道Ct值均显示为Undet，判断为乙型流感病毒阳性。
6)样本在管I中FAM、HEX/JOE和ROX荧光检测通道Ct值显示为Undet，其RNA内参在CY5荧光检测通道Ct值≤37或Undet，管II中的HEX/JOE荧光检测通道Ct值≤37，FAM、ROX和CY5荧光检测通道Ct值均显示为Undet，判断为呼吸道合胞病毒病毒阳性。
7)样本在管I中FAM、HEX/JOE和ROX荧光检测通道Ct值显示为Undet，其RNA内参在CY5荧光检测通道Ct值≤37或Undet，管II中的ROX荧光检测通道Ct值≤37，FAM、HEX/JOE和CY5荧光检测通道Ct值均显示为Undet，判断为副流感病毒阳性。
8)样本在管I中FAM、HEX/JOE和ROX荧光检测通道Ct值显示为Undet，其RNA内参在CY5荧光检测通道Ct值≤37或Undet，管II中的CY5荧光检测通道Ct值≤37，HEX/JOE、ROX和FAM荧光检测通道Ct值均显示为Undet，判断为腺病毒阳性。
9)样本在两管中各荧光通道Ct值显示为Undet，判断为无效，需重新采样。
实施例4
本实施例为试剂盒准确性检测
1、对甲型(H1N1)流感病毒质粒质控品、甲型(H3N2)流感病毒质粒质控品、乙型流感(FluB)病毒质粒质控品、新冠病毒2019-nCoV质粒质控品、呼吸道合胞病毒质粒质控品、副流感病毒质粒质控品、腺病毒质粒质控品及细胞内标的Rnase P基因质粒质控品(不同浓度：1×105copies/ml、1×104copies/ml、1×103copies/ml、1×102copies/ml、1×101copies/ml)进行测试。
2、结果如图1～8所示，分别是不同浓度的甲型(H1N1)流感病毒质粒质控品、甲型(H3N2)流感病毒质粒质控品、乙型流感(FluB)病毒质粒质控品、新冠病毒2019-nCoV质粒质控品、呼吸道合胞病毒质粒质控品、副流感病毒质粒质控品、腺病毒质粒质控品及细胞内标的Rnase P基因质粒质控品扩增结果曲线图。结果显示本发明试剂盒针对甲型(H1N1)流感病毒、甲型(H3N2)流感病毒、乙型流感(FluB)病毒、新冠病毒2019-nCoV、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒品及细胞内标的Rnase P基因的扩增曲线曲线性好，结果准确，最低检出限为1×103copies/ml。
以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 广州阳普医疗科技股份有限公司
广州阳普医学检验有限公司
杭州康代思锐生物科技有限公司
<120> 一种多种病毒核酸联合检测引物与探针组合以及检测试剂盒
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccctgtgggt tttacactta a 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgattgtgc atcagctga 19
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgtctgcgg tatgtggaaa gg 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttccacata ccgcagacgg 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaccgatcct gtcacctct 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcagtcctcg ctcactggg 19
<210> 7
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Claims (10)

1.一种多种病毒核酸联合检测引物与探针组合，其特征在于，所述引物包括：
(1)用于检测新型冠状病毒ORF1ab基因的引物对，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1-2所示；
(2)用于检测甲型H1N1流感病毒matrix(M1)基因的引物对，其核苷酸序列依次如SEQID NO：5-6所示；
(3)用于检测甲型H3N2流感病毒matrix(M1)基因的引物对，其核苷酸序列依次如SEQID NO：9-10所示；
(4)用于检测乙型流感病毒matrix(M1)基因的引物对，其核苷酸序列依次如SEQ IDNO：13～14所示；
(5)用于检测呼吸道合胞病毒matrix基因的引物对，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：17-18所示；
(6)用于检测腺病毒hexon基因的引物对，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：21-22所示；
(7)用于检测副流感病毒hemagglutinin neuraminidase基因的引物对，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：25-26所示；
(8)用于检测内标Rnase P的引物对，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：29-30所示；
靶基因的探针均由两条反向互补的不等长的寡核苷酸链组成，且标记荧光剂的寡核苷酸链与靶基因碱基互补。
2.根据权利要求1所述多种病毒核酸联合检测引物与探针组合，其特征在于，所述探针包括：
(1)用于检测新型冠状病毒ORF1ab基因的探针，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：3-4所示；
(2)用于检测甲型H1N1流感病毒matrix(M1)基因的探针，其核苷酸序列依次如SEQ IDNO：7-8所示；
(3)用于检测甲型H3N2流感病毒matrix(M1)基因的探针，其核苷酸序列依次如SEQ IDNO：11-12所示；
(4)用于检测乙型流感病毒matrix(M1)基因的探针，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：15～16所示；
(5)用于检测呼吸道合胞病毒matrix基因的探针，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：19-20所示；
(6)用于检测腺病毒hexon基因的探针，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：23-24所示；
(7)用于检测副流感病毒hemagglutinin neuraminidase基因的探针，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：27-28所示；
(8)用于检测内标Rnase P的探针，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：31-32所示。
3.根据权利要求2所述多种病毒核酸联合检测引物与探针组合，其特征在于，所述探针中，与靶基因核苷酸链碱基互补的寡核苷酸链的5’端标记荧光剂，3’端需封闭，另一条寡核苷酸链3’端采用淬灭剂封闭。
4.权利要求1至3任意一项所述的多种病毒核酸联合检测引物与探针组合在制备多种病毒核酸联合检测试剂盒中的应用。
5.一种多种病毒核酸联合检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至3任意一项所述的多种病毒核酸联合检测引物与探针组合。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，用于检测靶基因的探针使用浓度为180-220nM，用于检测内标的探针使用浓度为80-120nM，用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为180-220nM，用于检测内标的引物使用浓度为80-120nM。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述联合检测试剂盒还包括PCR缓冲液、酶混合液、空白对照和阳性对照。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液的组成为：26-30mol/LpH 8-8.5Tris-HCl，15-25mmol/L(NH4)2SO4，28-32mmol/L KC1，3.5-4.5mmol/L MgCl2，0.15-0.25mol/L dNTPs。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述酶混合液包括热启动Taq酶、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶UNG；其中热启动Taq酶的用量为3-8U/人份，逆转录酶的用量为3-8U/人份，尿嘧啶糖基化酶的用量为0.05-0.2U/人份。
10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照：新型冠状病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；
甲型H1N1流感病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；
甲型H3N2流感病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；
乙型流感病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；
呼吸道合胞病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；
腺病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；
副流感病毒质粒，浓度为1.0×105copies/ml；
内标质粒，浓度为1.0×104copies/ml；
所述空白对照为无RNA酶的水。
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