CN116606958A - 检测副流感1/2/3型的引物探针组合物、试剂盒及使用方法 - Google Patents
检测副流感1/2/3型的引物探针组合物、试剂盒及使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116606958A CN116606958A CN202310205365.7A CN202310205365A CN116606958A CN 116606958 A CN116606958 A CN 116606958A CN 202310205365 A CN202310205365 A CN 202310205365A CN 116606958 A CN116606958 A CN 116606958A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- primer
- parainfluenza
- sequence
- type
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 122
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 title claims abstract description 53
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 56
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 38
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 28
- 241000726041 Human respirovirus 1 Species 0.000 claims abstract description 22
- 241001559187 Human rubulavirus 2 Species 0.000 claims abstract description 21
- 241000712003 Human respirovirus 3 Species 0.000 claims abstract description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 54
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 33
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 33
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 33
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 29
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 21
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 20
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 15
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 11
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 11
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 7
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 6
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000621 Ribonuclease P Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 claims description 3
- 102000004167 Ribonuclease P Human genes 0.000 claims description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 42
- 101150008820 HN gene Proteins 0.000 abstract description 18
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 9
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 abstract description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 20
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 14
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 11
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 101150104466 NOCT gene Proteins 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]propan-1-one Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)CCC(=O)N1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 201000008197 Laryngitis Diseases 0.000 description 1
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029803 Nosocomial infection Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 201000007100 Pharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 206010044302 Tracheitis Diseases 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000000642 iatrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008140 language development Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 208000020029 respiratory tract infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 206010044008 tonsillitis Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种检测副流感1/2/3型的引物探针组合物、试剂盒及使用方法，针对副流感病毒1型、2型和3型的HN基因设计，包括：检测1型的上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示；检测2型的上游引物的序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.5所示，探针序列如SEQ ID NO.6所示；检测3型的上游引物的序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.8所示，探针序列如SEQ ID NO.9所示；所有探针的两端分别设有荧光基团和淬灭基团，本发明实现了对引物探针设计、试剂盒反应体系和扩增程序的优化，有效缩短了检测时间，适用于副流感病毒1/2/3型引起的呼吸道感染的辅助诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测副流感1/2/3型的引物探针组合物、试剂盒及使用方法。
背景技术
呼吸道感染(Respiratory tract infection，RTI)是人类最常见的一类疾病，是全球范围内引起人群发病和死亡的最主要原因之一。呼吸道感染引起的临床表现主要为鼻炎、咽炎、喉炎、扁桃体炎等症状，严重的可引起气管炎、支气管炎及肺炎等，但不同病原体引起的感染，其治疗方法、疗效和病程也不尽相同。目前已证明，大部分呼吸道感染是由呼吸道病毒引起的，常见的呼吸道病毒包括副流感病毒、流感病毒、冠状病毒和呼吸道合胞病毒等。
由于可引发呼吸道感染的病原体种类繁多，患者可能携带不止一种病原体，不同病毒之间、病毒和细菌之间的临床体征和症状相互重叠，往往使得仅基于临床表现的病因诊断变得困难，无法准确确定致病原因，特别是患病幼儿群体，语言发育系统未完善，较难、甚至无法准确描述病痛，可能导致治疗无效，造成抗生素滥用以及医源性交叉感染，因此，对副流感1型、2型及3型进行快速检测及分型，可以帮助诊断和准确用药，具有临床意义。
实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time PCR)是一种实时监控核酸扩增的技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控，以此实现对初始模板的定量分析，利用该技术可以有效对副流感病毒进行检测和分型。但是常规的单重PCR反应，在一个反应管中只能检测单一目标，如需检测多个目标，则需要多种扩增试剂，增加试剂耗材的成本和样本处理时间。
发明内容
针对相关技术中的问题，本发明提出一种检测副流感1/2/3型的引物探针组合物、试剂盒及使用方法，以克服现有相关技术所存在的上述技术问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种检测副流感1/2/3型的引物探针组合物，针对副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型的HN基因设计，包括：
检测副流感1型的上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的序列如SEQ IDNO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示；
检测副流感2型的上游引物的序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物的序列如SEQ IDNO.5所示，探针序列如SEQ ID NO.6所示；
检测副流感3型的上游引物的序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物的序列如SEQ IDNO.8所示，探针序列如SEQ ID NO.9所示；
所有所述探针的两端分别设有荧光基团和淬灭基团。
对人的副流感病毒进行分型检测的难度主要在于特异性引物的设计，要在亚型的层级对副流感1/2/3型进行检测区分，对引物的保守性和区别于其他型别的特异性具有非常高的设计要求。本发明以副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型的HN基因为靶序列设计上、下游引物和探针，具有良好的特异性，可以有效避免脱靶效应，保证检测结果的准确度，避免出现假阳性或假阴性，可对副流感病毒1型、副流感病毒2型及副流感病毒3型进行有效地检测和分型。
优选地，所述副流感1型的探针采用SQ双淬灭探针，所述副流感1型的探针5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有第一个淬灭基团BHQ1，且在第9-10个碱基之间添加第二个淬灭基团BHQ1。
优选地，所述副流感2型的探针采用SQ双淬灭探针，所述副流感2型的探针5’端标记有VIC荧光基团，3’端标记有第一个淬灭基团BHQ1，且在第9-10个碱基之间添加第二个淬灭基团BHQ1。
双淬灭探针(SQ)在常规双标探针5’末端携带荧光基团和3’端携带淬灭基团的基础上，在探针第9-10个碱基之间添加第二个淬灭基团，以实现最大荧光淬灭效果，降低探针背景荧光，提高探针的荧光增强倍数和灵敏度，优化扩增结果。
具体地，所述副流感3型的探针5’端标记有ROX荧光基团，3’端标记有BHQ2淬灭基团，保证在反应过程中可对副流感3型病毒进行区分，提高检测效率。
优选地，还包括检测内标的上游引物的序列如SEQ ID NO.10所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.11所示，探针序列如SEQ ID NO.12所示；
所述内标的探针5’端标记有CY5荧光基团，3’端标记有BHQ2淬灭基团；
所述内标对照为人的核糖核酸酶P的基因片段。所述内标对照能对样本的采集、提取及检测过程进行监控，避免假阴性判读结果的出现。
本发明还涉及一种检测副流感1/2/3型的试剂盒，包括核酸扩增反应液、酶混合液、阳性对照和阴性对照；
所述核酸扩增反应液包括上述的引物探针组合物。
本发明的试剂盒可以一管多检，同时对副流感病毒1/2/3型和内标进行检测和分型，减少了相关试剂的使用、节省样本处理时间及其他试剂耗材，具有高灵敏性和特异性，缩短了检测时间。
优选地，所述核酸扩增反应液包括所述引物探针组合物、PCR缓冲液和核苷酸混合液(dNTPs)；
所述核酸扩增反应液包括以下浓度的组分：
所述引物探针组合物包括：
检测副流感1型的所述上游引物0.2-0.5μM，所述下游引物0.2-0.5μM，探针0.05-0.2μM；
检测副流感2型的所述上游引物0.2-0.5μM，所述下游引物0.2-0.5μM，探针0.05-0.2μM；
检测副流感3型的所述上游引物0.2-0.5μM，所述下游引物0.2-0.5μM，探针0.05-0.2μM；
检测内标的所述上游引物0.1-0.3μM，所述下游引物0.1-0.3μM，探针0.05-0.2μM；
所述PCR缓冲液包括0.1M-0.4M Tris-HCl、20mM-100mM KCl、1.0mM-4.0mM MgCl2及10％-50％甘油；
所述核苷酸混合液0.1-0.4mM。
具体地，所述酶混合液包括DNA聚合酶、反转录酶和酶稀释液；
所述阳性对照包括副流感病毒1型假病毒样颗粒、副流感病毒2型假病毒样颗粒、副流感病毒3型假病毒样颗粒和样本保存液；
阴性对照包括灭活的细胞液和样本保存液。
本发明还涉及一种非诊断目的的、检测副流感1/2/3型的试剂盒使用方法，采用上述的试剂盒；
进行PCR反应前先配置溶液，取15μL所述核酸扩增反应液和1μL酶混合液混合，振荡混匀后瞬时离心，按15μL分装到八联排管或PCR反应板中，再分别加入10μL样本核酸。
进一步地，所述PCR反应的扩增程序包括以下步骤：
逆转录温度50℃，时长3min，1个循环；
预变性温度95℃，时长1min，1个循环；
变性温度95℃，时长5Sec，退火延伸，收集荧光温度55℃，时长20Sec，共45个循环。
本发明的使用方法采用多对引物、多条探针的荧光核酸扩增方法，可在单管中实现对副流感病毒1/2/3型的型别检测，同时本发明还优化扩增程序，缩短了检测时间。
具体地，试剂盒使用方法包括以下步骤：
(1)分别取出所述核酸扩增反应液、酶混合液、阳性对照和阴性对照，在室温下融化，充分振荡混匀后瞬时离心；
(2)配制反应液：取离心管加入15μL所述核酸扩增反应液和1μL酶混合液混合，振荡混匀后瞬时离心，按15μL分装到八联排管或PCR反应板中；
(3)提取核酸：待测样本与阴性对照、阳性对照共同进行核酸提取；
(4)加样：向步骤(2)得到的八联排管或PCR反应板中分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照的核酸各10μL，盖紧管盖，振荡混匀后瞬时离心；
(5)扩增检测：将加样后的八联排管或PCR反应板放入荧光定量PCR仪中进行扩增和荧光检测，本发明的检测方法为实时荧光RT-PCR，将RNA逆转录与DNA扩增相结合，
扩增程序如下表：
需要说明的是，每次检测均需设置阴性对照和阳性对照进行质量扩增。
阴性对照只有CY5通道荧光信号有明显增长，呈典型S型扩增曲线，且Ct值≤30；
阳性对照FAM、VIC、ROX通道荧光信号有明显增长，呈典型S型扩增曲线，且Ct值≤30。
在阴性对照和阳性对照结果正常的情况下，根据扩增曲线和Ct值判断样本检测结果，结果判定表格如下：
对于阳性样本，内标检测结果不作要求；对于阴性样本，其内标检测应为阳性(Ct值≤38)，若内标NoCt或Ct值＞38，则该样本的检测结果无效，建议重新提取样本进行复检或重新采样检测。
综上，本发明分别以副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型的HN基因为靶序列设计特异性引物探针，其中副流感病毒1型、副流感病毒2型使用双淬灭探针有效提高灵敏度，通过多通道荧光PCR扩增检测副流感病毒1/2/3型，实现了对引物探针设计、试剂盒反应体系和扩增程序的优化，有效缩短了检测时间。
本发明适用于副流感病毒1/2/3型引起的呼吸道感染的辅助诊断，能够特异性地区分副流感病毒1/2/3型与其他病毒。
附图说明
图1是实施例对副流感病毒1型灵敏度检测的扩增曲线图；
图2是实施例对副流感病毒2型灵敏度检测的扩增曲线图；
图3是实施例对副流感病毒3型灵敏度检测的扩增曲线图；
图4是对比例1的副流感病毒1型双标探针与实施例的双淬灭探针对比的扩增曲线图；
图5是对比例2的副流感病毒2型双标探针与实施例的双淬灭探针对比的扩增曲线图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
(一)实施例
一种检测副流感1/2/3型的引物探针组合物，针对副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型的HN基因设计，包括：
(1)检测副流感1型的上游引物的序列为5’-CCTATGACATCAACGACAACAG-3’，
下游引物的序列为5’-GCAAGGAGCATAACTGGTAACC-3’，
SQ双淬灭探针序列为5’FAM-TCATGTTCTGTAATAGCTGCAGGAACAAGG-BHQ1 3’，第9-10个碱基之间添加第二个淬灭基团BHQ1；即
(2)检测副流感2型的上游引物的序列为5’-TGGAGTCATGCCATGCAATG-3’，
下游引物的序列为5’-CTATCGATTTGCTGGAGCCTTTC-3’，
SQ双淬灭探针序列为5’VIC-CAAGTTTTTGCCCTGCTAATTGCATCAC-BHQ1 3’，第9-10个碱基之间添加第二个淬灭基团BHQ1；
(3)检测副流感3型的上游引物的序列为5’-CAACCATATGCTGCGCTATAC-3’，
下游引物的序列为5’-GTTGTGTTGCAGATTGCATTCTC-3’，
探针序列为5’ROX-CTCGGGTATGGAGGTCTTGAACATCCA-BHQ2 3’；
(4)内标对照为人的核糖核酸酶P的基因片段，内标的上游引物的序列为5’-TGGACCTGCGAGCGGG-3’，
下游引物的序列为5’-TGAGCGGCTGTCTCCACA-3’，
探针序列为5’CY5-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGC-BHQ2 3’；
对比例1
检测副流感1型的探针采用常规的双标探针，即5’末端携带荧光基团FAM和3’端携带淬灭基团BHQ1；其余引物设计、内标、序列与实施例相同。
对比例2
检测副流感2型的探针采用常规的双标探针，即5’末端携带荧光基团VIC和3’端携带淬灭基团BHQ1；其余引物设计、内标、序列与实施例相同。
实施例、对比例1和对比例2的引物探针均由上海生工生物工程股份有限公司合成。
(二)将实施例、对比例1和对比例2按下述步骤分别制备成试剂盒
试剂盒包括核酸扩增反应液、酶混合液、阳性对照和阴性对照。
所述核酸扩增反应液包括实施例/对比例1/对比例2的引物探针组合物(1)、PCR缓冲液(2)和核苷酸混合液dNTPs(3)。
(1)所述引物探针组合物包括：
检测副流感1型的所述上游引物0.4μM，所述下游引物0.4μM，探针0.1μM；
检测副流感2型的所述上游引物0.4μM，所述下游引物0.4μM，探针0.1μM；
检测副流感3型的所述上游引物0.4μM，所述下游引物0.4μM，探针0.1μM；
检测内标的所述上游引物0.2μM，所述下游引物0.2μM，探针0.06μM；
(2)所述PCR缓冲液包括0.3M Tris-HCl、50mM KCl、2.0mM MgCl2及50％甘油；
(3)所述核苷酸混合液0.2mM。
按上述组分浓度配置实施例的核酸扩增反应液(副流感1型和副流感2型探针使用双淬灭探针)、对比例1的核酸扩增反应液(副流感1型探针使用双标探针)、对比例2的核酸扩增反应液(副流感2型探针使用双标探针)。
所述酶混合液包括DNA聚合酶、反转录酶和酶稀释液。
所述阳性对照包括副流感病毒1型假病毒样颗粒、副流感病毒2型假病毒样颗粒、副流感病毒3型假病毒样颗粒和样本保存液。
阴性对照包括灭活的细胞液和样本保存液。
(三)实施例、对比例1和对比例2制成的试剂盒按下述使用方法进行病毒检测具体操作包括以下步骤：
(1)分别取出所述核酸扩增反应液、酶混合液、阳性对照和阴性对照，在室温下融化，充分振荡混匀后瞬间离心；
(2)配制反应液：取3支离心管分别加入实施例的核酸扩增反应液、对比例1的核酸扩增反应液和对比例2的核酸扩增反应液各15μL/人份和1μL/人份酶混合液混合，振荡混匀后瞬时离心，按15μL/人份分装到PCR反应板中；
(3)提取核酸：使用广州科方生物技术股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(备案号：粤穗械备20210387号)对副流感病毒1型HN基因假病毒、副流感病毒2型HN基因假病毒、副流感病毒3型HN基因假病毒的梯度稀释样本进行核酸的提取，同步提取阴性对照及阳性对照的核酸；
(4)加样：向步骤(2)得到的PCR反应板中分别加入副流感病毒1型HN基因假病毒、副流感病毒2型HN基因假病毒、副流感病毒3型HN基因假病毒的梯度稀释样本、阴性对照和阳性对照的核酸各10μL，盖紧管盖，振荡混匀后瞬时离心；
(5)扩增检测：将加样后的PCR反应板放入荧光定量PCR仪中进行扩增和荧光检测，检测方法为实时荧光RT-PCR，将RNA逆转录与DNA扩增相结合，
扩增程序如下表：
需要说明的是，每次检测均有设置阴性对照和阳性对照进行质量扩增。
阴性对照只有CY5通道荧光信号有明显增长，呈典型S型扩增曲线，且Ct值≤30；
阳性对照FAM、VIC、ROX通道荧光信号有明显增长，呈典型S型扩增曲线，且Ct值≤30。
在阴性对照和阳性对照结果正常的情况下，根据扩增曲线和Ct值判断样本检测结果，结果判定表格如下：
对于阳性样本，内标检测结果不作要求；对于阴性样本，其内标检测应为阳性(Ct值≤38)，若内标NoCt或Ct值＞38，则该样本的检测结果无效，重新提取样本进行复检或重新采样检测。
检测结果如下:
(1)通过采用实施例制备的试剂盒和检测方法对副流感病毒1型HN基因假病毒7.0×102～7.0×106copies/mL样本、副流感病毒2型HN基因假病毒4.0×102～4.0×106copies/mL样本、副流感病毒3型HN基因假病毒5.0×102～5.0×106copies/mL样本进行检测。
根据实施例配制PCR反应体系，进而进行多重RT-qPCR反应，获得荧光扩增曲线(如图1-3所示)，绘制标准曲线并确定最低检出限。
由图1-3所示，本发明的试剂盒对副流感病毒1型7.0×102～7.0×106copies/mL、副流感病毒2型4.0×102～4.0×106copies/mL及副流感病毒3型5.0×102～5.0×106copies/mL进行扩增获得的荧光扩增曲线均呈典型的S型曲线，且在不同浓度下获得的各荧光扩增曲线间距均匀，具有良好的相关性，其线性方程可以解析为：
副流感病毒1型HN基因：y＝2.832x+22.262(R2＝0.9968)；
副流感病毒2型HN基因：y＝2.645x+22.803(R2＝0.9998)；
副流感病毒3型HN基因：y＝2.703x+22.917(R2＝0.9995)。
从上述线性方程中，可以得出本发明的试剂盒对各副流感病毒血清型的最低检出限分别为：
副流感病毒1型HN基因：7×102copies/mL；
副流感病毒2型HN基因：4×102copies/mL；
副流感病毒3型HN基因：5×102copies/mL。
同时，通过对四个荧光通道的灵敏度比较来看，四个荧光通道的扩增效率相近，引物间相互干扰少，试剂盒性能稳定。
(2)通过采用实施例制备的试剂盒和对比例1制备的试剂盒对副流感病毒1型HN基因假病毒7.0×102～7.0×106copies/mL样本进行检测，副流感病毒1型在使用双淬灭探针和双标探针的对比结果如附图4所示，第一组曲线为实施例(双淬灭探针)，第二组曲线为对比例1(双标探针)。
从图中可以看出，第一组曲线的荧光增幅高于第二组曲线，第一组的检测结果优于第二组，具体数据见下表所示：
(3)通过采用实施例制备的试剂盒和对比例2制备的试剂盒对副流感病毒2型HN基因假病毒4.0×102～4.0×106copies/mL样本进行检测，副流感病毒2型在使用双淬灭探针和双标探针的对比结果如附图5所示，第一组曲线为实施例(双淬灭探针)，第二组曲线为对比例2(双标探针)。
从图中可以看出，第一组曲线的荧光增幅高于第二组曲线，第一组的检测结果优于第二组，具体数据见下表所示：
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
Claims (10)
1.一种检测副流感1/2/3型的引物探针组合物，其特征在于，针对副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型的HN基因设计，包括：
检测副流感1型的上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的序列如SEQ IDNO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示；
检测副流感2型的上游引物的序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物的序列如SEQ IDNO.5所示，探针序列如SEQ ID NO.6所示；
检测副流感3型的上游引物的序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物的序列如SEQ IDNO.8所示，探针序列如SEQ ID NO.9所示；
所有所述探针的两端分别设有荧光基团和淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述副流感1型的探针采用SQ双淬灭探针，所述副流感1型的探针5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有第一个淬灭基团BHQ1，且在第9-10个碱基之间添加第二个淬灭基团BHQ1。
3.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述副流感2型的探针采用SQ双淬灭探针，所述副流感2型的探针5’端标记有VIC荧光基团，3’端标记有第一个淬灭基团BHQ1，且在第9-10个碱基之间添加第二个淬灭基团BHQ1。
4.根据权利要求1至3任一权利要求所述的引物探针组合物，其特征在于，所述副流感3型的探针5’端标记有ROX荧光基团，3’端标记有BHQ2淬灭基团。
5.根据权利要求1至3任一权利要求所述的引物探针组合物，其特征在于，还包括检测内标的上游引物的序列如SEQ ID NO.10所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.11所示，探针序列如SEQ ID NO.12所示；
所述内标的探针5’端标记有CY5荧光基团，3’端标记有BHQ2淬灭基团；
所述内标对照为人的核糖核酸酶P的基因片段。
6.一种检测副流感1/2/3型的试剂盒，其特征在于，包括核酸扩增反应液、酶混合液、阳性对照和阴性对照；
所述核酸扩增反应液包括权利要求1至5任一权利要求所述的引物探针组合物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增反应液包括所述引物探针组合物、PCR缓冲液和核苷酸混合液；
所述核酸扩增反应液包括以下浓度的组分：
所述引物探针组合物包括：
检测副流感1型的所述上游引物0.2-0.5μM，所述下游引物0.2-0.5μM，探针0.05-0.2μM；
检测副流感2型的所述上游引物0.2-0.5μM，所述下游引物0.2-0.5μM，探针0.05-0.2μM；
检测副流感3型的所述上游引物0.2-0.5μM，所述下游引物0.2-0.5μM，探针0.05-0.2μM；
检测内标的所述上游引物0.1-0.3μM，所述下游引物0.1-0.3μM，探针0.05-0.2μM；
所述PCR缓冲液包括0.1M-0.4M Tris-HCl、20mM-100mM KCl、1.0mM-4.0mM MgCl2及10％-50％甘油；
所述核苷酸混合液0.1-0.4mM。
8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述酶混合液包括DNA聚合酶、反转录酶和酶稀释液；
所述阳性对照包括副流感病毒1型假病毒样颗粒、副流感病毒2型假病毒样颗粒、副流感病毒3型假病毒样颗粒和样本保存液；
阴性对照包括灭活的细胞液和样本保存液。
9.非诊断目的的试剂盒使用方法，其特征在于，采用权利要求6至8任一权利要求所述的试剂盒；
进行PCR反应前先配置溶液，取15μL所述核酸扩增反应液和1μL酶混合液混合，振荡混匀后瞬时离心，按15μL分装到八联排管或PCR反应板中，再分别加入10μL样本核酸。
10.根据权利要求9所述的试剂盒使用方法，其特征在于，所述PCR反应的扩增程序包括以下步骤：
逆转录温度50℃，时长3min，1个循环；
预变性温度95℃，时长1min，1个循环；
变性温度95℃，时长5Sec，退火延伸，收集荧光温度55℃，时长20Sec，共45个循环。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310205365.7A CN116606958A (zh) | 2023-03-06 | 2023-03-06 | 检测副流感1/2/3型的引物探针组合物、试剂盒及使用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310205365.7A CN116606958A (zh) | 2023-03-06 | 2023-03-06 | 检测副流感1/2/3型的引物探针组合物、试剂盒及使用方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116606958A true CN116606958A (zh) | 2023-08-18 |
Family
ID=87682465
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310205365.7A Pending CN116606958A (zh) | 2023-03-06 | 2023-03-06 | 检测副流感1/2/3型的引物探针组合物、试剂盒及使用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116606958A (zh) |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101545015A (zh) * | 2009-05-11 | 2009-09-30 | 北京海康基因芯片开发有限公司 | 一种检测传染病病原体的方法及试剂盒 |
| CN103451318A (zh) * | 2011-12-15 | 2013-12-18 | 上海市公共卫生临床中心 | 一种同时检测多种呼吸道病毒的试剂盒及其用途 |
| CN104032035A (zh) * | 2014-06-18 | 2014-09-10 | 黄芳 | 一种同时检测人的ⅰ型、ⅱ型及ⅲ型副流感病毒的方法及试剂盒 |
| CN105018648A (zh) * | 2015-08-03 | 2015-11-04 | 博奥生物集团有限公司 | 一种用于检测呼吸道病毒的试剂盒及其应用 |
| US20180371527A1 (en) * | 2015-12-14 | 2018-12-27 | The United States of America as Represented by the Secretary of the Department of Health and Human S | Detection of live attenuated influenza vaccine viruses |
| CN109487008A (zh) * | 2018-12-26 | 2019-03-19 | 重庆中元汇吉生物技术有限公司 | 呼吸道病原体的多重pcr检测试剂盒、用途及其使用方法 |
| CN111378789A (zh) * | 2020-06-01 | 2020-07-07 | 广州凯普医药科技有限公司 | 一种呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒 |
| CN111534576A (zh) * | 2020-07-08 | 2020-08-14 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 用于荧光定量pcr的方法、组合物、试剂盒及其用途 |
| CN114134252A (zh) * | 2021-10-19 | 2022-03-04 | 中国检验检疫科学研究院 | 用于检测冠状病毒的引物和试剂盒 |
| CN114645101A (zh) * | 2022-04-20 | 2022-06-21 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 一种用于新冠病毒奥密克戎变异株分型的多重荧光检测引物探针组及试剂盒 |
-
2023
- 2023-03-06 CN CN202310205365.7A patent/CN116606958A/zh active Pending
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101545015A (zh) * | 2009-05-11 | 2009-09-30 | 北京海康基因芯片开发有限公司 | 一种检测传染病病原体的方法及试剂盒 |
| CN103451318A (zh) * | 2011-12-15 | 2013-12-18 | 上海市公共卫生临床中心 | 一种同时检测多种呼吸道病毒的试剂盒及其用途 |
| CN104032035A (zh) * | 2014-06-18 | 2014-09-10 | 黄芳 | 一种同时检测人的ⅰ型、ⅱ型及ⅲ型副流感病毒的方法及试剂盒 |
| CN105018648A (zh) * | 2015-08-03 | 2015-11-04 | 博奥生物集团有限公司 | 一种用于检测呼吸道病毒的试剂盒及其应用 |
| US20180371527A1 (en) * | 2015-12-14 | 2018-12-27 | The United States of America as Represented by the Secretary of the Department of Health and Human S | Detection of live attenuated influenza vaccine viruses |
| CN109487008A (zh) * | 2018-12-26 | 2019-03-19 | 重庆中元汇吉生物技术有限公司 | 呼吸道病原体的多重pcr检测试剂盒、用途及其使用方法 |
| CN111378789A (zh) * | 2020-06-01 | 2020-07-07 | 广州凯普医药科技有限公司 | 一种呼吸道感染病原体核酸联合检测试剂盒 |
| CN111534576A (zh) * | 2020-07-08 | 2020-08-14 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 用于荧光定量pcr的方法、组合物、试剂盒及其用途 |
| CN114134252A (zh) * | 2021-10-19 | 2022-03-04 | 中国检验检疫科学研究院 | 用于检测冠状病毒的引物和试剂盒 |
| CN114645101A (zh) * | 2022-04-20 | 2022-06-21 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 一种用于新冠病毒奥密克戎变异株分型的多重荧光检测引物探针组及试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 张向阳: "医学分子生物学", 江苏凤凰科学技术出版社, pages: 116 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230114907A1 (en) | Rt-pcr detection method and kit for novel coronavirus | |
| EP3882364B1 (en) | Dual detection kit for 2019 novel corona virus | |
| CN111270013A (zh) | 一种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量pcr试剂盒、方法及引物探针组合物 | |
| CN111020064A (zh) | 新型冠状病毒ORF1ab基因核酸检测试剂盒 | |
| CN112063756B (zh) | 多重检测呼吸道病毒核酸的方法及试剂盒 | |
| CN110273027B (zh) | 诺如病毒gⅰ、gⅱ和gⅳ型核酸分型检测试剂盒及检测方法 | |
| US20230070496A1 (en) | Nucleic Acid Detection Kit For Novel Coronavirus 2019-nCoV | |
| CN111334615A (zh) | 一种新型冠状病毒检测方法与试剂盒 | |
| CN111518960A (zh) | 一种用于冠状病毒分型检测的多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法 | |
| US20220411852A1 (en) | Composition for detecting pathogens, and kit and method therefor | |
| CN111910017A (zh) | 一种检测呼吸道病原体多重real-time PCR试剂盒、方法和应用 | |
| CN111893215A (zh) | 一种检测冠状病毒多重real-time PCR试剂盒、方法和应用 | |
| CN113652505A (zh) | 检测新型冠状病毒及其voc-202012/01突变株的方法和试剂盒 | |
| CN111926114A (zh) | 一种检测副流感病毒多重real-time PCR试剂盒、方法和应用 | |
| CN113186342B (zh) | 一种18联呼吸道病毒核酸联合检测装置 | |
| CN110699492A (zh) | 一种永安河病毒实时荧光定量pcr检测引物和探针、检测试剂盒、检测方法及其应用 | |
| CN112501358B (zh) | 一种用于检测9种儿童消化道病原体的引物探针组合及试剂盒 | |
| CN113388701A (zh) | 引物探针组合物及其在制备副流感病毒分型检测试剂盒中的应用 | |
| CN112921126A (zh) | 一种人呼吸道合胞病毒分型检测多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法 | |
| CN111676316B (zh) | 一种快速区分非洲猪瘟病毒基因ii型与其它基因型的引物、探针及其检测方法 | |
| CN112410465A (zh) | 新型冠状病毒SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因恒温扩增引物组及试剂盒 | |
| CN114634996B (zh) | 用于检测牛呼吸道疾病的引物探针组合、试剂盒及其应用 | |
| CN116606958A (zh) | 检测副流感1/2/3型的引物探针组合物、试剂盒及使用方法 | |
| CN113278738A (zh) | 用于副流感病毒分型检测的引物探针组合物及实时荧光定量pcr试剂盒 | |
| CN112899385A (zh) | 鉴别布鲁氏菌s2疫苗株与野毒株的引物组、探针及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |