CN109628642B - 一种用于检测呼吸道病毒的核酸组合及其应用 - Google Patents

一种用于检测呼吸道病毒的核酸组合及其应用 Download PDF

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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Abstract

本发明涉及病毒分子检测领域，具体而言，涉及一种用于检测呼吸道病毒的核酸组合及其应用。一种用于检测呼吸道病毒的核酸组合，所述核酸组合包括以下引物对及其对应的探针中的一种或多种，各引物对及其对应的探针如SEQ ID NO：1‑9所示。该核酸组合针对4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒特异基因设计，结合实时荧光定量PCR技术和三重荧光探针，同时对4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒进行检测，具有灵敏度高，特异性好的特点。

Description

一种用于检测呼吸道病毒的核酸组合及其应用
技术领域
本发明涉及病毒分子检测领域，具体而言，涉及一种用于检测呼吸道病毒的核酸组合及其应用。
背景技术
人类4型疱疹病毒(Epstein-Barr Virμs，EBV)属于疱疹病毒科γ疱疹病毒亚科，是重要的肿瘤相关病毒，与多种人类淋巴和上皮细胞性肿瘤的发生有关，如Bμrkitt′s淋巴瘤(Bμrkitt′s lymphoma，BL)、霍奇金淋巴瘤、免疫缺陷病人的淋巴细胞瘤、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)和胃癌等，EBV感染十分普遍，特别是儿童时期。呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virμses，简称RSV)是属于副粘液病毒科的一种RNA病毒；是儿童呼吸道病毒感染中最常见的病毒之一。人腺病毒(Hμman adenovirμs，HAdV)为腺病毒科的哺乳动物腺病毒属一种DNA病毒。人腺病毒在呼吸道病毒中的感染率仅次于呼吸道合胞病毒。
急性呼吸道感染是儿童最主要的威胁之一，其中超过90％是由呼吸道病毒感染引起。人类4型疱疹病毒、呼吸道合胞病毒和人腺病毒均可引起世界范围内婴幼儿呼吸道感染，所致疾病的临床症状复杂多样可出现发热、咳嗽、淋巴结肿大等上呼吸道感染症状，多以肺炎、支气管炎、咽炎等临床表现为主，不易区分。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服呼吸道常见病毒与EB病毒感染临床表现不易区分的缺陷，提供一种快速检测4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒的核酸检测试剂盒，该试剂盒具有高通量、操作简便、重复性强、检测结果快速客观等优点。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种用于检测呼吸道病毒的核酸组合，所述核酸组合包括以下引物对及其对应的探针中的一种或多种；
第一引物对如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，第一探针的核酸序列如SEQ IDNO：3所示；
第二引物对如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，第二探针的核酸序列如SEQ IDNO：6所示；
第三引物对如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，第三探针的核酸序列如SEQ IDNO：9所示。
进一步地，所述探针均为自身淬灭探针。
进一步地，所述探针的5′端标记荧光报告基团，3′端标记淬灭基团。
进一步地，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、、Qμasar 705、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red、LC RED640中的任一种。
进一步地，所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1、Tamra中的任一种。
进一步地，所述核酸组合至少包括两个引物对及其对应的探针，不同探针的5′端标记荧光报告基团不同。
如在一些实施例中，核酸组合包括两个引物对及其对应的探针；如在一些实施例中，核酸组合包括三个引物对及其对应的探针。其中，两个引物对及其对应的探针是本发明提供的三种中的任意两种的组合。
本发明还提供了呼吸道病毒的检测试剂盒，包括上述的核酸组合。
本发明对上述引物和探针的摩尔配比比例进行了摸索和优化，试验结果发现，它们之间不同的摩尔配比比例对于检测结果的特异性和灵敏性具有显著的差异。本发明通过高通量的筛选试验发现，上述引物和探针在下述配比下，具有最优的检测效果。
优选地，第一引物对及其对应的探针中，SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3的摩尔比为6:6:4。
优选地，第二引物对及其对应的探针中，SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6的摩尔比为6:6:4。
优选地，第三引物对及其对应的探针中，SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9的摩尔比为6:6:4。
进一步地，所述检测试剂盒还包括样品处理液、空白对照、阳性对照、反应扩增液、Taq酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、定量标准品、去RNA酶水中的任一种或多种。
进一步地，Taq酶为热启动Taq酶，逆转录酶为M-MLV逆转录酶。
优选地，所述反应扩增液为包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钾、氯化镁以及核苷酸的混合液。
优选地，所述阳性对照为灭活的4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒培养液；所述空白对照为去RNA酶水。
优选地，所述定量标准品为合成的含有4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒特异基因的质粒，利用国际标准品对定量标准品进行定量。
本发明采用三重荧光定量PCR技术，分别设计针对4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒的特异性引物和探针，实现了在同一反应体系中同时检测4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒的目的。引物和探针的设计采用primer 6.0专用软件设计，将设计的引物和探针在NCBI的GeneBank进行比对，检测引物和探针的特异性。引物和探针在专业合成公司合成，采用紫外分光光度计测定光密度值(A260nm/A280nm在1.8-2.0之间为合格)。
本发明对4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒的检测具有良好的应用前景。
本发明对各病毒进行检测时，步骤如下：
待检测物采用上述的核酸序列组合进行实时荧光定量PCR，得到待测样本中各病毒的Ct值，进而判断是否为阳性。
扩增程序如下：
第一步：50℃保持20-30min；
第二步：94±1℃保持2-5min；
第三步：94±1℃保持10-15s，55℃保持40±2s，45±2个循环，其中55℃设置采集荧光信号。
采集的荧光信号结果采用以下方法判定：
结果判定：
4型疱疹病毒(又称EB病毒)：荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.86判断为EB病毒阳性；无典型“S”型扩增或CT>35.86，且内标的CT≤35.86，判断为EB病毒阴性。
腺病毒：荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤34.36，判断为腺病毒阳性；无典型“S”型扩增或CT>34.36，且内标的CT≤34.36，判断为腺病毒阴性。
合胞病毒：荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.12，判断为合胞病毒阳性；无典型“S”型扩增或CT>35.12，且内标的CT≤35.12，判断为合胞病毒阴性。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的试剂盒操作简便且能有效防止污染，PCR荧光检测时间(从标本处理开始)仅为2-3小时，而且在同一反应体系中实现同时检测4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒。PCR荧光检测是全封闭操作，加入样本抽提产物之后可以不再打开管盖，减少了污染产生的机会。
(2)本发明能够同时检测出4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒，解决了现有产品只能在一管中检测一种病毒的问题。
(3)本发明还具有灵敏度高、特异性好、可重复性强、检测结果快速客观等优点，在临床诊断、疾病预防监测领域具有极大的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是本发明中三重荧光定量PCR技术原理图；
图2是本发明实施例1中试剂盒检测样本的曲线图；
图3是本发明实施例2中检测4型疱疹病毒的灵敏度试验结果图；
图4是本发明实施例2检测腺病毒的灵敏度试验结果图；
图5是本发明实施例2检测呼吸道合胞病毒的灵敏度试验结果图；
图6是是本发明实施例3检测4型疱疹病毒的特异性试验结果图；
图7是是本发明实施例3检测腺病毒的特异性试验结果图；
图8是是本发明实施例3检测呼吸道合胞病毒的特异性试验结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
技术术语解释：
多重荧光定量PCR技术是在同一反应体系中加入多条不同荧光标记的探针。例如，针对3个靶基因的探针分别标记FAM，CY5,和HEX。PCR反应过程中，若待检样本包含靶基因1，则标记FAM的探针产生荧光信号；若待检样本包含靶基因2，则标记CY5的探针产生荧光信号。若待检样本包含靶基因3，则标记HEX的探针产生荧光信号。这样，同一管反应则可确定三个靶基因。具体参考图1。
下面对本发明实施例的一种用于检测4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒核酸组合及其应用和试剂盒进行具体说明。
实施例1
本发明提供一种快速检4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒的核酸检测试剂盒：
其中，核酸扩增反应液包括三羟甲基氨基甲烷(50mM)、氯化钾(100mM)、氯化镁(15mM)、核苷酸混合液(dUTP与dTTP的浓度分别为1.25mM，dATP,dCTP与dGTP浓度分别为2.5mM)。
4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒反应液包含以下组分：
组分(1)：用于检测人类4型疱疹病毒的引物对，碱基序列分别如SEQ ID No.1、SEQID No.2所示，引物浓度均为600nM(nmol/L)，其对应的探针碱基序列如SEQ ID No.3所示，SEQ ID No.3探针浓度为400nM(nmol/L)；该探针的5′端标记有荧光报告基团FAM，3′端标记有荧光淬灭基团BHQ1；
组分(2)：用于检测人类呼吸道腺病毒引物对，碱基序列分别如SEQ ID No.4、SEQID No.5所示，引物浓度均为600nM(nmol/L)；其对应的探针碱基序列如SEQ ID No.6所示，探针浓度为400nM(nmol/L)，该探针的5′端标记有荧光报告基团CY5，3′端标记有荧光淬灭基团BHQ3；
组分(3)：用于检测人类呼吸道合胞病毒引物对，碱基序列分别如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示，引物浓度均为600nM(nmol/L)；其对应的探针碱基序列如SEQ ID No.9所示，探针浓度为400nM(nmol/L)，该探针的5′端标记有荧光报告基团HEX，3′端标记有荧光淬灭基团BHQ2；
4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒反应液用去RNA酶水配制。
其中，各引物探针如表1所示。
表1各引物探针序列
注：X1、X2和X3为荧光报告基团，Y1、Y2和Y3为荧光淬灭基团。
酶混合液包括Taq酶(0.2U/μl)、UNG酶(0.04U/μl)，其中，Taq酶为热启动Taq酶。核酸扩增反应液包含Mg2+(15mM)，dNTP,引物探针混合液(引物浓度均为1.875μM，探针浓度为1.25μM),阳性对照为灭活的4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒培养液；空白对照为去RNA酶水。
定量标准品为合成的含有4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒特异基因的质粒，利用国际标准品对阳性标准品进行定量。
应用上述核酸组合对4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒进行实时荧光定量PCR扩增的实验
表1 PCR反应体系
在荧光定量PCR扩增仪中扩增，按照下列程序进行PCR扩增：
扩增结束后，根据荧光曲线判断是否感染4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒。部分扩增曲线如图2所示。
经多次试验，采集的荧光信号结果采用以下方法判定：
结果判定：
在FAM通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.86，判断为EB病毒阳性；无典型“S”型扩增或CT>35.86，且内标的CT≤35.86，判断为EB病毒阴性。
在CY5通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤34.36，判断为腺病毒阳性；无典型“S”型扩增或CT>34.36，且内标的CT≤34.36，判断为腺病毒阴性。
在HEX通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.12，判断为合胞病毒阳性；无典型“S”型扩增或CT>35.12，且内标的CT≤35.12，判断为合胞病毒阴性。
实施例2
本发明试剂盒检测的灵敏性试验
阳性参考品为灭活的4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒培养液。分别将含有1×10 4TCID 50/ml的4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒培养液的核酸提取液按照稀释浓度为1×104、1×103、1×102、50、10、1TCID50/ml六个浓度进行灵敏度试验。
阴性参考品分别为甲型流感病毒H1N1亚型、副流感病毒1型、偏肺病毒、冠状病毒培养液。
采用本发明试剂盒(实施例1制备)按照实施例1相同的方法进行检测。结果见图3-5。图3-5中，本发明提供的试剂盒具有良好的灵敏性，并且CT值随浓度减少呈梯度改变。
试验结果表明，本发明试剂盒对于4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒诊断具有高度的灵敏性。其中，对4型疱疹病毒的检测灵敏度能够达到1TCID50/ml，对腺病毒和呼吸道合胞病毒的检测灵敏度能够达到10TCID50/ml。
实施例3
本发明试剂盒检测的特异性试验
用本发明试剂盒(实施例1制备)检测4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒H1N1亚型、副流感病毒1型、偏肺病毒、冠状病毒等，按照实施例1相同的方法进行检测。
检测结果表明：FAM通道仅4型疱疹病毒进行扩增，CY5通道仅对腺病毒进行扩增。HEX通道仅对呼吸道合胞病毒进行扩增。试验结果表明本发明检测试剂盒能特异性扩增4型疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒，而不与其它病毒核酸发生交叉反应，结果见图6-8。
图6中，其他病毒包括腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒H1N1亚型、副流感病毒1型、偏肺病毒、冠状病毒；
图7中，其他病毒包括EB病毒、合胞病毒、甲型流感病毒H1N1亚型、副流感病毒1型、偏肺病毒、冠状病毒；
图8中，其他病毒包括EB病毒、腺病毒、甲型流感病毒H1N1亚型、副流感病毒1型、偏肺病毒、冠状病毒。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆博利达医学科技有限公司
<120> 一种用于检测呼吸道病毒的核酸组合及其应用
<130> 2018
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgagggctcc acatacacag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgctggcatg gatgattgga 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctgttcaat acaatgtcct a 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gccgttaaga gtgtcaccca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgctctatgc caactcagcc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
acaggaccat gtggcgcatt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggagagctac taagaaggca 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggacacgtta cttacccctg aa 22
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gaagaggagg tggtaagc 18

Claims (7)

1.一种用于检测呼吸道病毒的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括以下引物对及其对应的探针；
第一引物对如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，第一探针的核酸序列如SEQ ID NO：3所示；
第二引物对如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，第二探针的核酸序列如SEQ ID NO：6所示；
第三引物对如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，第三探针的核酸序列如SEQ ID NO：9所示；
第一引物对及其对应的探针中，SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3的摩尔比为6:6:4；
第二引物对及其对应的探针中，SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6的摩尔比为6:6:4；
第三引物对及其对应的探针中，SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9的摩尔比为6:6:4。
2.根据权利要求1所述的用于检测呼吸道病毒的核酸组合，其特征在于，所述探针均为自身淬灭探针；
进一步地，所述探针的5′端标记荧光报告基团，3′端标记淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的用于检测呼吸道病毒的核酸组合，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、Qμasar 705、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red、LC RED640中的任一种；
进一步地，所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1、Tamra中的任一种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的用于检测呼吸道病毒的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括三个引物对及其对应的探针，不同探针的5′端标记荧光报告基团不同。
5.呼吸道病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的核酸组合。
6.根据权利要求5所述的呼吸道病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括样品处理液、阴性对照、阳性对照、反应扩增液、Taq酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、定量标准品、去RNA酶水中的任一种或多种。
7.根据权利要求6所述的呼吸道病毒的检测试剂盒，其特征在于，Taq酶为热启动Taq酶，逆转录酶为M-MLV逆转录酶。
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