CN101812532A - 呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒检测引物和探针 - Google Patents

呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒检测引物和探针 Download PDF

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谢茜
符芳芳
李杨霞
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Abstract

本发明是涉及多种呼吸道病毒——呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒检测引物和探针。特别地，本发明是一种能同时进行呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒四种病毒检测的引物和探针。本发明的引物和探针分别包括呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒的上游引物、下游引物和探针。

Description

呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒检测引物和探针
技术领域
本发明是涉及多种呼吸道病毒诊断用的引物和探针。特别地，本发明是一种能同时进行呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒四种病毒诊断的引物和探针。
背景技术
急性呼吸道感染90％以上是由病毒引起的，其中以呼吸道病毒最常见，如甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒呼吸道合胞病毒(RSV)以及腺病毒等，多种病毒具有感染力强、传播快、潜伏期短、发病急等特点。呼吸道病毒感染常可导致较高的发病率和死亡率，尤其受到环境变化和生态平衡破坏的影响，病毒发生各种变异，常突然暴发，病情凶险，病死率高，并且近年来新的致病性病毒还在不断地被发现，如人类偏肺病毒、SARS病毒、高致病性禽流感病毒等，给临床诊断和治疗及疾病的监控带来很大困难，如1997年在香港肆虐的禽流感以及2003年SARS的暴发。这些都提示我们即时与准确的鉴别诊断，快速识别病原体，对预防疾病的传播和患者的诊断治疗至关重要。同时，鉴别诊断对于制定策略与计划来应对像SARS暴发一样的公共卫生危机也有非常重大的意义。因此针对多种呼吸道病毒感染病原的同时，快速检测技术的建立将大大推进呼吸系统感染疾病的诊断与治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时对呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒进行诊断的引物和探针。
基于上述目的，本发明采用以下技术方案。
检测和鉴定不同病毒的引物和配套探针可以混合使用，不会相互干扰检测和鉴定的结果。用于检测多种呼吸道病毒的引物和探针序列分别包括：
(1)合胞病毒引物和探针：
上游引物RSV F：GCAAATATGGAAACATACGTGAACA
下游引物RSV R：GCACCCATATTGTWAGTGATGCA
探针RSV Probe：CTTCACGAAGGCTCCACATACACAGCWG FAM-BHQ
(2)腺病毒引物和探针：
上游引物AdV F：GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT
下游引物AdV R：GCCCCAGTGGTCTTACATGCACATC
探针AdV Probe：TGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA HEX-BHQ 1
(3)副流感病毒引物和探针：
上游引物PIV-1F：GTTGTCAATGTCTTAATTCGTATCAATAATT
下游引物PIV-1R：GTAGCCTMCCTTCGGCACCTAA
探针PI V-1Probe：TAGGCCAAAGATTGTTGTCGAGACTATTCCAA  FAM-TAMRA
上游引物PIV-2F：GCATTTCCAATCTTCAGGACTATGA
下游引物PIV-2R：ACCTCCTGGTATAGCAGTGACTGAAC
探针PIV-2Probe：CCATTTACCTAAGTGATGGAATCAATCGCAAAFAM-TAMRA
(4)流感病毒引物和探针：
上游引物IfB F：AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA
下游引物IfB R：CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA
探针IfB Probe：CACCCATATTGGGCAATTTCCTATGGC  JOE-TAMRA
上游引物IfA F：AAGACCAATCCTGTCACCTCTGA
下游引物IfA R：CAAAGCGTCTACGCTGCAGTCC
探针IfA Probe：TTTGTGTTCACGCTCACCGT FAM-MGB
本发明的具体原理是利用一对靶核酸序列的特异性引物和探针，采用一步法实时荧光定量RT-PCR试剂盒，通过PCR技术实现靶核酸序列片断的扩增。所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，在PCR扩增过程中，DNA聚合酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片断上的荧光探针酶切降解，使报告基团的荧光信号可以被检测，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而可以通过荧光强弱来判断待测样本中靶核苷酸序列的存在。
本发明将多重PCR与Taqman荧光探针技术结合起来，即在一次检测过程中，可对多种可能引发急性呼吸道感染的病原体进行同时检测，达到快速诊断、指导治疗的目的，从而克服常规PCR的局限性，解决了临床上的检测通量的瓶颈问题，缩短工作时间，减少原料耗损，并且具有敏感性、特异性更强、有效解决PCR污染、自动化程度更高等特点。荧光探针定量PCR检测技术巧妙地利用了PCR技术的DNA高效扩增、探针技术高特异性和光谱技术的敏感性及定量分析的优点。同时克服了传统PCR技术易污染、假阳性率高且不能定量的缺点，成为目前最先进的检测技术。
具体实施方式
1.引物和探针的设计：通过分别对所有已知的呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒的基因序列进行比较分析，选择高度保守的区段，设计多对引物和探针，引物长度一般为20碱基左右。最优引物探针序列组合如下：
(1)合胞病毒引物和探针：
上游引物RSV F：GCAAATATGGAAACATACGTGAACA
下游引物RSV R：GCACCCATATTGTWAGTGATGCA
探针RSV Probe：CTTCACGAAGGCTCCACATACACAGCWG FAM-BHQ
(2)腺病毒引物和探针：
上游引物AdV F：GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT
下游引物AdV R：GCCCCAGTGGTCTTACATGCACATC
探针AdV Probe：TGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA HEX-BHQ 1
(3)副流感病毒引物和探针：
上游引物PIV-1F：GTTGTCAATGTCTTAATTCGTATCAATAATT
下游引物PIV-1R：GTAGCCTMCCTTCGGCACCTAA
探针PI V-1Probe：TAGGCCAAAGATTGTTGTCGAGACTATTCCAA FAM-TAMRA
上游引物PIV-2F：GCATTTCCAATCTTCAGGACTATGA
下游引物PIV-2R：ACCTCCTGGTATAGCAGTGACTGAAC
探针PIV-2Probe：CCATTTACCTAAGTGATGGAATCAATCGCAAAFAM-TAMRA
(4)流感病毒引物和探针：
上游引物IfB F：AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA
下游引物IfB R：CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA
探针IfBProbe：CACCCATATTGGGCAATTTCCTATGGC  JOE-TAMRA
上游引物IfA F：AAGACCAATCCTGTCACCTCTGA
下游引物IfA R：CAAAGCGTCTACGCTGCAGTCC
探针IfAProbe：TTTGTGTTCACGCTCACCGT FAM-MGB
2.反应体系的优化：利用灭活的呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒作为待检样品，用Trizol试剂抽提病毒基因组RNA，分装后贮存于-80℃。
2.1引物浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒引物浓度分别从0.1μmol/l至1.6μmol/l作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定最佳引物浓度是0.2μmol/l。
2.2探针浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒探针浓度分别从0.1μmol/l至0.5μmol/l作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定最佳探针浓度是0.16μmol/l。
利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒实时荧光RT-PCR反应体系为25μl。按照一步法荧光定量RT-PCR试剂盒说明进行反应液的配置。
3.仪器检测通道的选择
选择的荧光检测通道应与探针所标记的报告荧光基团一致，具体按照仪器使用说明书进行设置。
4.PCR反应条件如下
42℃30min进行逆转录反应；95℃3min，1个循环；94℃10s，55℃40s，40个循环，在55℃40s阶段收集荧光。
5.检测结果分析
如果待检样本中含有呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒，则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度可以达到1000拷贝/ml，如果待检样本中没有呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒，则显示阴性扩增曲线，即无扩增信号，提示上述引物对和探针具有良好的特异性和灵敏度。
本发明的优点在于：
(1)本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可以达到1000拷贝/ml，说明其灵敏度良好。
(2)本发明提供的引物和探针对不含呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒的样本没有检测信号，说明其特异性强。
(3)由于本发明是针对呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒基因序列进行比对分析，选取高度保守部位进行引物和探针的设计，避免了假阴性结果的出现。
诊断呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒的引物和探针序列
合胞病毒引物和探针
RSV F  GCAAATATGGAAACATACGTGAACA
RSV R GCACCCATATTGTWAGTGATGCA
RSV Probe CTTCACGAAGGCTCCACATACACAGCWG FAM-BHQ
腺病毒引物和探针
AdV F  GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT
AdV R GCCCCAGTGGTCTTACATGCACATC
AdV Probe TGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA  HEX-BHQ 1
副流感病毒引物和探针
PIV-1F GTTGTCAATGTCTTAATTCGTATCAATAATT
PIV-1R GTAGCCTMCCTTCGGCACCTAA
PI V-1Probe TAGGCCAAAGATTGTTGTCGAGACTATTCCAA  FAM-TAMRA
PIV-2F GCATTTCCAATCTTCAGGACTATGA
PIV-2R ACCTCCTGGTATAGCAGTGACTGAAC
PIV-2Probe CCATTTACCTAAGTGATGGAATCAATCGCAAA FAM-TAMRA
流感病毒引物和探针
IfB F  AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA
IfB R  CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA
IfBProbe  CACCCATATTGGGCAATTTCCTATGGC    JOE-TAMRA
IfA F  AAGACCAATCCTGTCACCTCTGA
IfA R  CAAAGCGTCTACGCTGCAGTCC
IfA Probe  TTTGTGTTCACGCTCACCGT  FAM-MGB

Claims (3)

1.一种用于检测和鉴定四种呼吸道常见病毒的引物序列，四种呼吸道常见病毒包括呼吸道胞病毒、腺病毒、流感病毒和副流感病毒，引物序列包括下面6个序列：
(1)一种用于检测和鉴定呼吸道合胞病毒的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括上游引物RSV F序列为5’GCAAATATGGAAACATACGTGAACA  3’，下游引物RSV R序列为5’GCACCCATATTGTWAGTGATGCA  3’；
(2)一种用于检测和鉴定腺病毒的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括上游引物AdV F序列为5’GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT 3’，下游引物AdV R序列为5’GCCCCAGTGGTCTTACATGCACATC 3’；
(3)一种用于检测和鉴定副流感病毒的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括上游引物PIV-1F序列为5’GTTGTCAATGTCTTAATTCGTATCAATAATT  3’，下游引物PIV-1R序列为5’GTAGCCTMCCTTCGGCACCTAA  3’；
(4)一种用于检测和鉴定副流感病毒的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括上游引物PIV-2F序列为5’GCATTTCCAATCTTCAGGACTATGA  3’，下游引物PIV-2R序列为5’ACCTCCTGGTATAGCAGTGACTGAAC  3’；
(5)一种用于检测和鉴定流感病毒的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括上游引物IfAF序列为5’AAGACCAATCCTGTCACCTCTGA  3’，下游引物IfA R序列为5’CAAAGCGTCTACGCTGCAGTCC    3’；
(6)一种用于检测和鉴定流感病毒的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括上游引物IfB F序列为5’AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA  3’，下游引物IfB R序列为5’CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA 3’。
2.一种用于检测和鉴定四种呼吸道常见病毒的探针序列，四种呼吸道常见病毒包括呼吸道胞病毒、腺病毒、流感病毒和副流感病毒，探针序列包括下面6个序列：
(1)一种用于检测和鉴定呼吸道合胞病毒的探针序列，其特征在于所述的探针RSV Probe序列为5’CTTCACGAAGGCTCCACATACACAGCWG FAM-BHQ  3’；
(2)一种用于检测和鉴定呼腺病毒的探针序列，其特征在于所述的探针AdV Probe序列为5’TGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA  HEX-BHQ 13’；
(3)一种用于检测和鉴定副流感病毒的探针序列，其特征在于所述的探针PIV-1Probe序列为5’TAGGCCAAAGATTGTTGTCGAGACTATTCCAA FAM-TAMRA  3’；
(4)一种用于检测和鉴定副流感病毒的探针序列，其特征在于所述的探针PIV-2Probe序列为5’CCATTTACCTAAGTGATGGAATCAATCGCAAA FAM-TAMRA  3’；
(5)一种用于检测和鉴定流感病毒的探针序列，其特征在于所述的探针IfA Probe序列为5’TTTGTGTTCACGCTCACCGT FAM-MGB  3’；
(6)一种用于检测和鉴定流感病毒的探针序列，其特征在于所述的探针IfB Probe序列为5’CACCCATATTGGGCAATTTCCTATGGC  JOE-TAMRA 3’。
3.6种引物(包括RSV引物、AdV引物、PIV-1引物、PIV-2引物、IfA引物和IfB引物)和6种探针(包括RSV探针、AdV探针、PIV-1探针、PIV-2探针、IfA探针和IfB探针)可以混合用来同时进行多种呼吸道病毒的检测和鉴定，主要是呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒和副流感病毒四种常见呼吸道病毒，而且不会相互影响检测结果。
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