CN104419713A

CN104419713A - 基于环介导的等温扩增的人呼吸道合胞病毒检测试剂盒

Info

Publication number: CN104419713A
Application number: CN201310398466.7A
Authority: CN
Inventors: 蓝柯; 穆永林; 陈倩倩; 张驰宇
Original assignee: Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Current assignee: Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Priority date: 2013-09-04
Filing date: 2013-09-04
Publication date: 2015-03-18

Abstract

本发明涉及基于环介导的等温扩增的人呼吸道合胞病毒检测试剂盒。本发明人经过比较筛选，找到了针对RSV特异性良好的环介导等温扩增引物，所述引物针对含有RSV以外的核酸不发生特异性扩增。本发明的方法可良好地应用于鉴定RSV成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。

Description

基于环介导的等温扩增的人呼吸道合胞病毒检测试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学和核酸检测技术领域。具体地，本发明涉及基于环介导的等温扩增的人呼吸道合胞病毒检测试剂盒。

背景技术

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)于1955年首次从黑猩猩中分离出毒株。并于1955年从婴儿中分离得到与黑猩猩中株有相同抗原特性的病毒株，在随后的研究中发现，该病毒以人为自然宿主，是引起人呼吸道感染的重要病原。该病毒在体外感染细胞时会使相邻的细胞形成合胞体，产生块状的细胞病变，并因而得名。RSV是不分节段的负股单链RNA病毒，属副粘病毒科，肺病毒亚科，肺病毒属；与副流感病毒，麻疹病毒，偏肺病毒属同一科。

RSV感染人会引起上呼吸道感染，出现咳嗽，流涕，低烧等症状，下呼吸道感染在轻度感染的婴儿中也很普遍，长时间的RSV感染会引起细支气管炎，哮喘及由肺炎引起的缺氧，严重的可危及生命。RSV感染在婴儿和成人中都有发生，但婴儿，老人和有心肺疾病及免疫缺陷的人更容易被感染，而且会表现出更严重的症状。大约2/3的婴儿会在出生后的第一年之内经历RSV感染，大约90%的婴儿会在第二年经历RSV感染，几乎所有的婴儿都会在出生两年内经历至少一次RSV感染，其中有一半会经历两次RSV感染。在小于5岁的儿童中，20%的住院治疗，18%的急诊以及门诊是由RSV感染引起的。儿童在最初几年会经常性的经历RSV的重复感染，即使在成年后，RSV依然可以感染同一个体。RSV的重复感染不依赖于抗原的改变。RSV在初次感染时会引起下呼吸道感染，但在再次感染时症状会减轻，成人经历RSV感染时基本没有症状。6周到六个月的婴儿最易发生严重的RSV感染，其高峰出现在2到3月大小。

RSV的发病率随季节而变化，在温带地区一般在每年的冬季和初春爆发，一二月份为发病的高峰，在热带地区爆发于雨季。RSV依据抗体反应分为A，B两个亚型，A型和B型交替流行传播，A性为主要流行亚型并具有更强的致病性。A型和B型的交替流行为RSV频繁的重复感染提供了一种可能的机制，即通过亚型交替可以规避由前一种流行亚型带来的宿主免疫机制。但同一亚型的重复感染也频繁出现。

现有技术中，呼吸道合胞病毒的检测方法主要包括病毒培养分离，酶连免疫检测，荧光抗体检测，胶体金快速检测，多重PCR检测，荧光定量PCR检测，NASBA检测(Nucleic acid sequence-based amplification，核酸序列依赖的扩增反应)，基因芯片检测的检测技术。

病毒培养技术用收集的样本与细胞共培养，通过观察细胞病变或其他方法检测病毒的扩增来确定样本中是否有病毒感染。此方法虽然是曾经的病毒感染检测“金色标准”，但只能检测样本中的具有感染能力的病毒颗粒，灵敏度不足。而且操作程序复杂，对实验场地和设备有生物安全等级要求，检测过程长(至少要一周以上)，不能用于现场检测，对不同病毒的检测结果不同。

基于抗体的酶标检测，直接与间接荧光检测以及胶体金快速检测均利用抗原与抗体之间的特异结合，通过偶联了显色基团的抗体实现对病原体的可视化检测。抗体检测不依赖大型设备，而且检测结果可在30分钟以内得到。但抗体检测由于没有信号放大的过程，灵敏性要比分子检测低，而且结果容易出现假阳性及假阴性。由于新抗体的制备周期较长，该方法很难用于新出现病毒的检测，而且对于由抗原漂变产生的新的病毒亚型的检测能力也值得怀疑。

病原的核酸分子检测通过聚合酶对病原的核酸分子进行扩增，然后利用荧光，电泳等方法对反应过程或产物进监测，根据反应是否进行或产物是否出现来判定病原是否出现。与普通PCR相比多重定量PCR，可以实现多种病毒的同时检测，而且反应过程可以实时监测，还可以确定样品中病原的量，灵敏度也高于普通PCR。但基于PCR的方法都需要热循环仪等设备，对检测场地也有要求，定量PCR还需要专门训练，这些都限制了PCR相关技术在快速检测中的应用。

基因芯片等基于杂交的检测方法利用病毒特异的探针或探针组通过孵育，杂交，显色，结果扫描等步骤实现多种病毒的高通量检测，但生产芯片需要昂贵的设备，杂交过程耗时很久，结果检测也需要特殊仪器及专业人员。这些都限制了该种技术在快速检测中的应用，使其只能作为一种研究手段实现对病原基因信息的分析。

NASBA也是一种恒温，连续的酶介导的核酸扩增技术，该技术同时使用T7RNA聚合酶，反转录酶，与核糖核酸酶同过转录与反转录过程的交替进行实现模板的扩增，但该技术需要通过分子信标等荧光探针实现结果的检测，因而需要特殊设备，且主要用于RNA模板的检测。由于结果检测需要专门的设备，该技术主要用实验室检测，很难用于现场检测。除了NASBA外还有SDA，HAD，RCA等恒温扩增技术可能用于病原检测。

LAMP(Loop-mediated isothermal amplification，环介导的等温扩增)是于2000年首次报道并在其后经过不断改进形成的一种等温，连续，快速，高特异和可视化检测的核酸扩增方法。鉴于难以找到合适的、较广谱的扩增引物，以及，难以实现根据颜色变化进行结果判定，目前国内外还没有RSV的RT-LAMP检测产品出现。

发明内容

本发明的目的在于提供基于环介导的等温扩增的人呼吸道合胞病毒检测方法以及试剂盒。

在本发明的第一方面，提供分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括：

呼吸道合胞病毒A亚型N基因编码区第610-930位(即以N基因起始密码子ATG中A作为第1位起算)所示的多核苷酸；

呼吸道合胞病毒B亚型L基因编码区第2452-3052位(即以L基因起始密码子ATG中A作为第1位起算)所示的多核苷酸。

在一个优选例中，所述的呼吸道合胞病毒A亚型N基因编码区第610-930位所示的多核苷酸的核苷酸序列如：SEQ ID NO:13-51任一所示；

所述的呼吸道合胞病毒B亚型L基因编码区第2452-3052位所示的多核苷酸的核苷酸序列如：SEQ ID NO:52-61任一所示。

在本发明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于制备鉴定呼吸道合胞病毒的检测试剂或试剂盒。

在本发明的另一方面，提供一种鉴定呼吸道合胞病毒的方法，所述方法包括：以待测样品的RNA为模板，以特异性扩增引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含呼吸道合胞病毒；

其中，所述的特异性扩增引物包括：

引物对1：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；

引物对2：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；

引物对3：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；

引物对4：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；

引物对5：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；和

引物对6：SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。

在一个优选例中，所述的扩增是环介导等温扩增。

在另一优选例中，所述的环介导等温扩增条件是：

(1)60±2℃(较佳地60±1℃)恒温反应60±10min(较佳地60±5min)；或

(2)①60±2℃(较佳地60±1℃)30秒，②60℃±2℃(较佳地60±1℃)30秒采集荧光；步骤①-②重复进行60±10次(较佳地60±5次)。

在另一优选例中，所述的环介导等温扩增的体系中包括：引物对1-6混合物，环介导等温扩增反应缓冲液，Bst聚合酶，AMV RTase，荧光素(较佳地为钙黄绿素)；其中，所述的环介导等温扩增反应缓冲液包括：甜菜碱，dNTP，Thermolpol RB，硫酸镁，Tween-20。

在另一优选例中，所述的荧光素是钙黄绿素或SYBR Green I荧光染料。

在另一优选例中，所述的荧光素是钙黄绿素；还在体系中加入锰离子溶液(如氯化锰)；在环介导等温扩增反应结束后，在扩增产物中存在绿色，则表明扩增阳性；扩增产物中存在橘黄色，则表明扩增阴性。

在另一优选例中，所述鉴定呼吸道合胞病毒的方法是非疾病诊断方法。

在另一优选例中，所述的引物以混合物的形式用于扩增，较佳地，

SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2在引物混合物中终浓度为0.2μM；

SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4在引物混合物中终浓度为1.6μM；

SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6在引物混合物中终浓度为0.8μM；

SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8在引物混合物中终浓度为0.2μM；

SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10在引物混合物中终浓度为1.6μM；

SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12在引物混合物中终浓度为0.8μM。

在本发明的另一方面，提供一种用于环介导等温扩增的缓冲液，所述缓冲液包括：甜菜碱，dNTP，Thermolpol RB，硫酸镁，Tween-20。

在一个优选例中，所述的用于环介导等温扩增的缓冲液中，甜菜碱0.5M，dNTP1.6mM，Thermolpol RB1×，硫酸镁6mM，Tween-200.2%v/v。

在本发明的另一方面，提供一种鉴定呼吸道合胞病毒的试剂盒，所述试剂盒中包括：

引物对1：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；

引物对2：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；

引物对3：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；

引物对4：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；

引物对5：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；和

引物对6：SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。

在一个优选例中，所述试剂盒中还包括：

所述的用于环介导等温扩增的缓冲液或独立分装的甜菜碱、dNTP、Thermolpol RB、硫酸镁和Tween-20；含有呼吸道合胞病毒的检测标准品；RNA提取试剂；甜菜碱；Bst DNA聚合酶；AMV RTase；和/或荧光素；如钙黄绿素；较佳地还包括锰离子溶液；更佳地为钙黄绿素和氯化锰按浓度比1:100(目视检测)，或1:200(real-time检测)配制而成的混合液；说明鉴定呼吸道合胞病毒的方法的使用说明书。

在本发明的另一方面，提供所述的试剂盒的用途，用于从待测样品(如食品，离体样品，药物)中鉴定呼吸道合胞病毒。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、曲线为反应体系在565-590nm范围内的发射荧光随时间的变化，反应曲线1-9依次对应实验条件表中的1-9号实验条件。

图2、上图为用实验一中的引物组与RSV标准株反应的目视结果，表7为照片中对应编号的反应管内所加的模板；下图为对应反应的实时荧光变化曲线。

图3、上图为以RSV及相近种属病毒的RNA为模板测试引物组反应是否特异针对RSV，表9为上图内反应体系对应的模板；下图为对应管的实时荧光变化曲线。

图4、对RSAV A族毒株VR-1540(上图)和B族毒株VR-1400(下图)的RNA提取液进行十倍倍比稀释后的反应过程。上图中，1号为阴性对照，2号为未稀释的模板，3-8号依次为对RSV模板进行10，100，1000，10000，100000，1000000倍稀释。下图中，A1号为阴性对照，A2号为未稀释的模板，A3-A8号依次为对RSV模板进行10，100，1000，10000，100000，1000000倍稀释。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究和试验，首次揭示一种呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)的环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)检测方法。经过比较筛选，找到了针对RSV特异性良好的引物，所述引物针对含有RSV以外的核酸不发生特异性扩增。本发明的方法可良好地应用于鉴定RSV成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。

本发明人通过对大量RSV基因组序列的分析，找到了在很多RSV病毒基因组中相对保守的序列区段。所述区段是呼吸道合胞病毒A亚型N基因编码区第609-930位所示的多核苷酸；呼吸道合胞病毒B亚型L基因编码区第2452-3052位所示的多核苷酸。进一步地，所述的呼吸道合胞病毒A亚型N基因编码区第609-930位所示的多核苷酸的核苷酸序列如：SEQ ID NO:13-51任一所示；所述的呼吸道合胞病毒B亚型L基因编码区第2452-3052位所示的多核苷酸的核苷酸序列如：SEQ ID NO:52-61任一所示。上述相对保守的区段可用于制备鉴定呼吸道合胞病毒的检测试剂或试剂盒。

基于上述RSV病毒基因组中相对保守的序列区段进行引物的筛选，获得一类可特异性鉴定RSV的引物，其对于RSV的RNA发生特异性扩增，而对其它病毒的核酸不发生特异性扩增。

LAMP是近年来发展的一种新颖和较成熟的等温核酸扩增技术。与PCR方法相比，LAMP不需要热循环仪(PCR仪)，且由于LAMP反应中产生大量的副产物-白色焦磷酸镁沉淀，扩增产物通过肉眼观察或浊度计即可判定结果；因此LAMP适合于现场、战时野外或条件较差的实验室进行快速检测。LAMP技术以其快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、病原微生物鉴定和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。总体而言，LAMP法是一种简便、快速、高特异的基因扩增法，不需要特殊的试剂和仪器设备，采用该方法能建立起总成本低廉的检测体系。

本发明采用环介导等温扩增(LAMP)快速检测技术，设计三对针对目的序列的八段区域的引物，利用链置换聚合酶和扩增产物自身形成的可与引物结合的颈环结构实现目的片段的循环扩增，最终产物为一系列不同长度的目的序列的串联长链。该扩增方法的扩增效率是PCR的100倍。同时反应的副产物焦磷酸根会大量积累，可以通过焦磷酸根和反应体系内的镁离子形成的白色沉淀的量来监测反应的进行程度并可用来判定结果的阳性及阴性。也可以同过钙黄绿素等金属指示剂的变色反应来指示反应的进行，并可用来试试监测反应进程。

因此，本发明提供一种引物，所述的引物是LAMP扩增引物，包括：引物对1：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；引物对2：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；引物对3：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；引物对4：SEQ ID NO:7和SEQID NO:8；引物对5：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；和引物对6：SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。

本发明的这些引物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。

利用本发明的引物，进行LAMP反应，可通过浊度仪检测或显色观察，快速地判断待测样品是否含有RSV。优选地，可应用荧光素来进行结果观察。作为本发明的更优选方式，LAMP反应体系中加入锰离子溶液；运用钙黄绿素作为荧光素，LAMP荧光检测试剂中的钙黄绿素初始与锰离子结合以产生骤冷效应。接着副产物的焦磷酸根与锰离子结合并从钙黄绿素上带走锰离子使其产生荧光。由此管内出现荧光即表明目标基因被大量扩增。将含有扩增产物和嵌入式荧光染料的离心管放入紫外灯下照射产生的荧光强度更甚。

本发明还提供了一种鉴定RSV的方法，所述方法包括：以待测样品的RNA为模板，以特异性扩增RSV的引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含RSV。更优选地，基于本发明所提供的适用于鉴定RSV的特异性引物，所述方法包括：以待测样品的RNA为模板，以引物对1～引物对6的混合引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含RSV。

获取待测样品的RNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的RNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。

本发明还涉及一种用于鉴定RSV的试剂盒，所述试剂盒中含有针对RSV的LAMP扩增引物。

此外，所述的试剂盒还可含有其它鉴定RSV的试剂，如(但不限于)：含有RSV的检测标准品；用于环介导等温扩增的缓冲液；含有呼吸道合胞病毒的检测标准品；RNA提取试剂；甜菜碱；Bst DNA聚合酶；AMV RTase；和/或荧光素(如钙黄绿素；较佳地还包括锰离子溶液；较佳地为为钙黄绿素和氯化锰按浓度比1:100(目视检测)，或1:200(real-time检测)配制而成的混合液)；说明鉴定呼吸道合胞病毒的方法的使用说明书。

此外，所述的试剂盒中还可含有鉴定RSV的使用说明书和/或标准操作程序。

本发明所述的试剂盒可实现快速检测、批量检测RSV的目的。

本发明的主要优点在于：

(1)首次揭示一种可特异性鉴定RSV的引物，所述的引物特异性良好，对于RSV能够实现特异性扩增，而对于RSV以外的其它病毒基因组不能特异性扩增。并且，所述引物具有良好的再现性、结果稳定可靠。

(2)利用所述的引物或含有所述引物的检测试剂盒，可快速、大批量地检测RSV，从待测样品中快速准确地区分RSV，并且所需样品量少，操作简单。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

I.实验材料和方法

病毒样品及RNA提取

从上海南翔医院收集从09年08月到12年12月的77个呼吸道的鼻咽拭子样本，将拭子浸入病毒运输液中，待反应前将病毒运输液分装用于核酸提取。用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen)RNA提取试剂盒提取样本浸出液中的病毒RNA，并用无RNA酶水洗脱。洗脱液可以作为反应模板使用。

病毒标准株包括RSV A族(VR-26，VR-1540)，RSV B族(VR-1580，VR-955，VR-1400)，Influenza B(VR-823)，Rhinovirus(VR-283)，Reovirus(VR-824)，Mesales virus(VR-24)，coronavirus(VR-1558)，influenzaA(VR-825)，均购自ATCC，括号内为ATCC编号。

LAMP反应缓冲液

取50mM硫酸镁3μl，6M甜菜碱2.08μl，10mM dNTPs4μl，10×ThermolpolRB2.5μl，4%Tween-201.25μl，2.02μl无RNA酶水或等比例放大得到反应体系的缓冲液，每次反应加入14.85μl。其中10×Thermolpol RB是NEB公司的Bst DNA聚合酶大片段的反应缓冲液，由200mM Tris-HCl，100mM(NH₄)₂SO₄，100mM KCl，20mM MgSO₄，1%Triton X-100组成，pH8.8。

反应用酶

每次反应加入8U/μl的Bst聚合酶大片段1μl，10U/μl的AMV反转录酶0.05μl。

显色剂

10×钙黄绿素溶液(500μM：5mM)：取100μl1mM钙黄绿素母液与100μl10mM氯化锰混合或等比例扩大配制而成，每次反应加入1.5μl，用于反应结果的目视检测。

10×钙黄绿素溶液(250μM：5mM)：取50μl1mM钙黄绿素母液与100μl10mM氯化锰以及50μl双蒸水混合或等比例扩大配制而成，每次反应加入1.5μl，用于反应过程的实时监测。

RT-LAMP反应

RT-LAMP反应体系如表1。

表1

反应过程如下：

目视检测为60℃保温60分钟。

荧光定量检测为：

II.实施例

实施例1、引物设计

获得50株HRSV的全基因组序列(获自GenBank)，进行多重序列比对以及序列分析，寻找保守区域，发现A型RSV和B型RSV间的差异太大，很难设计通用检测引物。

进一步地，针对50株病毒，将RSV A型和B型分开再进行比对，发现A型在比对结果的基因组1813-2030bp区段(即：A亚型N基因编码区第610-930位)，B型在比对结果的基因组12000-12600bp区段(即：B亚型L基因编码区第2452-3052位)的保守性很高，适于作为引物设计区域。举例而言，A亚型N基因编码区第610-930位序列包括SEQ ID NO:13-51任一序列；B亚型L基因编码区第2452-3052位序列包括SEQ ID NO:52-61任一序列。其中：SEQ ID NO:13来源于GenBank登录号JF920059.1。SEQ ID NO:14来源于GenBank登录号JF920065.1。SEQ ID NO:15来源于GenBank登录号JF920062.1。SEQ ID NO:16来源于GenBank登录号U39662.1。SEQ ID NO:17来源于GenBank登录号NC_001803.1。SEQ ID NO:18来源于GenBank登录号GU591760.1。SEQ ID NO:19来源于GenBank登录号GU591770.1。SEQ ID NO:20来源于GenBank登录号GU591769.1。SEQ ID NO:21来源于GenBank登录号FJ948820.1。SEQ ID NO:22来源于GenBank登录号JF920057.1。SEQ ID NO:23来源于GenBank登录号JF920051.1。SEQ ID NO:24来源于GenBank登录号JF920049.1。SEQ ID NO:25来源于GenBank登录号JF920050.1。SEQ ID NO:26来源于GenBank登录号JF920048.1。SEQ ID NO:27来源于GenBank登录号JF920047.1。SEQ ID NO:28来源于GenBank登录号JF920046.1。SEQ ID NO:29来源于GenBank登录号JF920054.1。SEQ ID NO:30来源于GenBank登录号JF920053.1。SEQ ID NO:31来源于GenBank登录号JF920052.1。SEQ ID NO:32来源于GenBank登录号GU591767.1。SEQ ID NO:33来源于GenBank登录号GU591768.1。SEQ ID NO:34来源于GenBank登录号AY911262.1。SEQ ID NO:35来源于GenBank登录号FJ614813.1。SEQ ID NO:36来源于GenBank登录号GU591771.1。SEQ ID NO:37来源于GenBank登录号JF920058.1。SEQ ID NO:38来源于GenBank登录号AF035006.1。SEQ ID NO:39来源于GenBank登录号M74568.1。SEQ ID NO:40来源于GenBank登录号JF920069.1。SEQ ID NO:41来源于GenBank登录号U63644.1。SEQ ID NO:42来源于GenBank登录号U50363.1。SEQ ID NO:43来源于GenBank登录号U50362.1。SEQ ID NO:44来源于GenBank登录号GU591765.1。SEQ ID NO:45来源于GenBank登录号GU591759.1。SEQ ID NO:46来源于GenBank登录号GU591762.1。SEQ ID NO:47来源于GenBank登录号GU591758.1。SEQ ID NO:48来源于GenBank登录号GU591766.1。SEQ IDNO:49来源于GenBank登录号GU591761.1。SEQ ID NO:50来源于GenBank登录号GU591763.1。SEQ ID NO:51来源于GenBank登录号GU591764.1。SEQID NO:52来源于GenBank登录号JN032116.1。SEQ ID NO:53来源于GenBank登录号JN032119.1。SEQ ID NO:54来源于GenBank登录号JN032117.1。SEQID NO:55来源于GenBank登录号JN032120.1。SEQ ID NO:56来源于GenBank登录号JQ582843.1。SEQ ID NO:57来源于GenBank登录号JQ582844.1。SEQID NO:58来源于GenBank登录号NC_001781.1。SEQ ID NO:59来源于GenBank登录号AF013254.1。SEQ ID NO:60来源于GenBank登录号AF013255.1。SEQ ID NO:61来源于GenBank登录号AY353550.1。

上述序列的一致性比对结果如下：

A型：

GA(t/c)ATAGC(c/a)AACAG(c/t)TT(c/t)TATGAAGTGTTTGAAAAA(t/c)ATCC(t/c)CA(c/t)TTTATAGATGTTTTTGTTCATTTTGGTATAGCACAATCTTC(t/c)ACCAGAGGTGGCAG(t/c)AGAGTTGAAGG(g/a)AT(t/c)TTTGC(a/t)GGATT(g/a)TTTATGAATGC(c/t)TATGGTGCAGGGCAAGT(g/a)ATG(t/c)TACGGTGGGG(g/a)GTCTTAGC(a/c)AAATC(a/c/g/t)(g/a)T(t/c)AAAAA(t/c)ATTATG(t/c)TAGG(a/g)CA(c/t)GCTAGTGT(g/a)CAAGCAGAAATGGAACA(a/g)GTTGT(g/t)GA(g/a)GT(t/g)TATGA(a/g)TATGC(c/t)CA(a/g)AAATT(g/a)GGTGG(a/t)GAAGC(a/c)GG(a/g)TTCTACCATATATTGAACAACCC(a/g)AA(a/g)GCATCA

B型：

GTAAACCAGTTA(g/a)ACTTATAGAGGGTCAGACCCATGCTCAAGCAGATTATTTGTTAGCATTAAATAGCCTTAAATTG(c/t)TATATAAAGAGTATGCAGG(c/t)ATAGGCCATAAGCT(t/c)AAGGGAAC(a/t)GA(g/a)ACCTATATATCCCG(a/g)GATATGCA(g/a)TTCATGAGCAAAACAATCCAGCACAATGGAGTGTACTATCCAGCCAGTATCAAAAAAGTCCTGAGAGTAGGTCCATGGATAAATACAATACTTGATGATTTTAAAGTTAGTTTAGAATCTATAGG(t/c)AGCTTAACACAGGAGTTAGAATACAGAGG(a/g)GAAAGCTTATTATGCAGTTTAATATTTAG(g/a)AACATTTGGTTATACAATCAAATTGCT(c/t)TGCAACTCCGAAATCATGCATTATGT(a/c)A(c/t)AATAAGCTATATTTAGATATATTGAAAGTA(t/c)TAAAACACTTAAAAAC(t/c)TTTTT(t/c)AATCTTGATAGTATCGATA(c/t)(g/a)GC(g/a)TTATCATTGTATATGAA(c/t)TTGCCTATGCTGTTTGGTGGTGGTGATCCTAATTTGTTATATCGAAGCTTTTATAG(g/a)AGAACTCCAGA(c/t)TTCCTTACAGAAGCTATAGTACATTCAGTGTT(c/t)GTGTT(g/a)AGCTA

A型比对结果代表了由39条A族RSV比对结果的1760-2080区域比对结果推断出的一致序列。B型比对结果代表了由10条B族RSV比对结果的12000-12600区域推导出的一致序列。大写字母为39条序列中均相同的点，括号中碱基为各序列中存在差异的位点。

将上述序列从比对结果中截取出来，经重新比对后，进行引物设计。

对设计出的引物用所建立的RT-LAMP检测体系进行筛选，得到符合要求的引物，筛选得到的工作引物如表2和表3。

表2、A族引物列表

表3、B族引物列表

引物混合液(PrimerMix)配方如下：

取稀释至100μM的RSV-A-F30.05μl，100μM的RSV-A-B30.05μl，100μM的RSV-A-LF0.1μl，100μM的RSV-A-LB0.1μl，100μM的RSV-A-FIP0.4μl，100μM的RSV-A-BIP0.4μl，100μM的RSV-B-F30.05μl，100μM的RSV-B-B30.05μl，100μM的RSV-B-LF0.1μl，100μM的RSV-B-LB0.1μl，100μM的RSV-B-FIP0.4μl，100μM的RSV-B-BIP0.4μl或按比例扩大得到引物混合液，每次反应加2.6μl进反应体系中。

实施例2、体系建立及优化

以文献中报道的RT-LAMP体系为出发体系(Ushio，M.and I.Yui，et al.(2005).J Med Virol77(1):121-7)，成分如下：

对上述体系中四个因素设置三个水平记性正交试验。

表4、因素水平表

表5、实验条件表

以RSV毒株VR-1400(B型)和VR-26(A型)为模板用所设计的引物及实验条件表中列出的条件组合进行反应，用钙黄绿素实时监测反应过程。

正交试验的荧光定量检测结果如图1，曲线为反应体系在565-590nm范围内的发射荧光随时间的变化，反应曲线1-9依次对应实验条件表中的1-9号实验条件。以起峰时间为标准，从结果中计算出起峰时间最快的条件组合。

对放映过程中的荧光变化过程进行分析，反应进行速度最快的条件组合作为最优组合得到的最优条件组合如表6。

表6、最优体系

将最优体系中除钙黄绿素、引物和酶之外的成分配成LAMP反应缓冲液，如下：

取50mM硫酸镁3μl，6M甜菜碱2.08μl，10mM dNTPs4μl，10×Thermolpol RB2.5μl，4%Tween-201.25μl，2.02μl无RNA酶水或等比例放大得到反应体系的缓冲液，每次反应加入14.85μl。

实施例3、反应过程的目视及实时监测

提取RSV标准毒株(A：VR-26，VR-1540；B：VR-1400，VR-955，VR-1580)的RNA，用RSV-A引物组合RSV-B引物组的混合液与以所提取的RNA为模板，用下述反应体系分别在PCR仪及荧光定量PCR仪上反应确定引物组的有效性。

目视检测反应体系：

反应过程如下：

目视检测为60℃保温60分钟。加样顺序如表7。

表7、加样顺序

1	2	3	4	5	6
						-	VR-26	VR-1540	VR-1580	VR-955	VR-1400

荧光定量检测为：

荧光定量检测结果如图2和表7。可见，可准备地检测出VR-26，VR-1540；VR-1400，VR-955，VR-1580病毒株。

实施例4、RSV引物组的特异性

以RSV及相近种属的RNA为模板(所用毒株如表8)，用前述的反应体系分别对所述模板进行目视及实时定量检测，

表8、特异性反应模板

反应体系及程序如下：

目视检测反应体系如下：

加样顺序如表9。

表9、加样顺序

1	2	3	4	5	6	7	8	9
									-	VR-26	VR-1400	VR-823	VR-283	VR-824	VR-24	VR-1558	VR-825

荧光定量检测反应体系如下：

反应过程如下：

目视检测为60℃保温60分钟。

荧光定量检测为：

结果如图3，上图为以RSV及相近种属病毒的RNA为模板测试引物组反应是否特异针对RSV，表9为上图内反应体系对应的模板，下图为对应管的实时荧光变化曲线。

结果可见，RSV引物组的特异性良好，对于非RSV病毒检测阴性。

实施例5、引物组检测的敏感性

以提取的10^5.75TCID₅₀/200μl VR-1540的RSV A族毒株和10^4.5TCID₅₀/200μl的RSV B族毒株的RNA为模板，对模板进行10倍倍比稀释，用目视和实时监测反应体系检测反应结果。

荧光定量检测反应体系：

反应过程如下：

荧光定量检测为：

结果如图4，为对RSAV A族毒株VR-1540和B族毒株VR-1400的RNA提取液进行十倍倍比稀释后的反应过程。

实施例6、对临床样本的检测

从医院采集的鼻咽拭子样本77例，用下述的样本处理方法处理后得到RNA模板，用前面建立的RT-LAMP反应体系检测样品。之后用RT-PCR对样品进行检测，验证RT-LAMP反应的正确性。

RT-LAMP反应体系：

60℃保温60分钟。肉眼判断结果。

RT-PCR反应体系(使用Qiagen one-step RT-PCR试剂盒)：

5×缓冲液	5μl
		dNTP	1μl
引物(两个引物分别加1微升)	1μl×2
		H₂O	13.5μl
RNA	2.5μl
		酶	1μl

反应体系：

用电泳检测结果。

结果比较如表10，样本数N=77。

表10

	RT-PCR阳性	RT-PCR阴性
			RT-LAMP阳性	36	2
RT-LAMP阴性	2	37

由表10结果可见，经RT-LAMP检测阳性的样本38份，RT-PCR阳性36份，阴性2份。经RT-LAMP检测阴性的样本39份，RT-PCR阴性37份，阳性2份。可见，RT-LAMP与RT-PCR的检测结果比较接近，准确率很高。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括：

呼吸道合胞病毒A亚型N基因编码区第610-930位所示的多核苷酸；

呼吸道合胞病毒B亚型L基因编码区第2452-3052位所示的多核苷酸。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述的呼吸道合胞病毒A亚型N基因编码区第610-930位所示的多核苷酸的核苷酸序列如：SEQ ID NO:13-51任一所示；

3.权利要求1或2所述的多核苷酸的用途，其特征在于，用于制备鉴定呼吸道合胞病毒的检测试剂或试剂盒。

4.一种鉴定呼吸道合胞病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：

以待测样品的RNA为模板，以特异性扩增引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含呼吸道合胞病毒；

其中，所述的特异性扩增引物包括：

引物对1：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；

引物对2：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；

引物对3：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；

引物对4：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；

引物对5：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；和

引物对6：SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的扩增是环介导等温扩增。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的环介导等温扩增条件是：

(1)60±2℃恒温反应60±10min；或

(2)①60±2℃30秒，②60℃±2℃30秒采集荧光；步骤①-②重复进行60±10次。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的环介导等温扩增的体系中包括：引物对1-6混合物，环介导等温扩增反应缓冲液，Bst聚合酶，AMVRTase，荧光素；

其中，所述的环介导等温扩增反应缓冲液包括：甜菜碱，dNTP，ThermolpolRB，硫酸镁，Tween-20。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的荧光素是钙黄绿素；还在体系中加入锰离子溶液；在环介导等温扩增反应结束后，在扩增产物中存在绿色，则表明扩增阳性；扩增产物中存在橘黄色，则表明扩增阴性。

9.一种用于环介导等温扩增的缓冲液，其特征在于，所述缓冲液包括：甜菜碱，dNTP，Thermolpol RB，硫酸镁，Tween-20。

10.如权利要求9所述的用于环介导等温扩增的缓冲液，其特征在于，所述缓冲液中，甜菜碱0.5M，dNTP1.6mM，Thermolpol RB1×，硫酸镁6mM，Tween-200.2%v/v。

11.一种鉴定呼吸道合胞病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：

引物对1：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；

引物对2：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；

引物对3：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；

引物对4：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；

引物对5：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；和

引物对6：SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。

12.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：

权利要求9所述的用于环介导等温扩增的缓冲液或独立分装的甜菜碱、dNTP、Thermolpol RB、硫酸镁和Tween-20；

含有呼吸道合胞病毒的检测标准品；

RNA提取试剂；

甜菜碱；

Bst DNA聚合酶；

AMV RTase；

荧光素；和/或

说明鉴定呼吸道合胞病毒的方法的使用说明书。

13.权利要求11或12所述的试剂盒的用途，用于从待测样品中鉴定呼吸道合胞病毒。