JP5976180B2 - インフルエンザ検出方法およびそのためのキット - Google Patents

インフルエンザ検出方法およびそのためのキット Download PDF

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Description

本発明は、インフルエンザＡおよび／またはＢウイルスの存在を検出するための、プライマー、プローブならびにそのようなプライマーおよび／またはプローブを用いた方法およびキットに関する。
合計３種類のインフルエンザウイルス株、すなわち、Ａ、ＢおよびＣが存在する。３つの株のうち、インフルエンザＡは、人間を含めた様々な動物に感染することができるため、最も病原性が高いとみなされている。インフルエンザＢおよびインフルエンザＣウイルスは、通常は人間にのみ感染する。野鳥を天然の宿主として使用するインフルエンザウイルスは「トリインフルエンザウイルス」と呼ばれ、人間を天然の宿主として使用するインフルエンザウイルスは「ヒトインフルエンザウイルス」と呼ばれる。いくつかの事例において、人間および他の動物は、感染した家畜化した鳥および／または感染した野鳥との接触を介して、トリインフルエンザウイルスに感染する。種を交差して人間に感染したトリインフルエンザウイルスが、最近のヒトインフルエンザの大流行の原因となっている。
外被に包まれたウイルスであるインフルエンザウイルスは、８つの一本鎖のマイナス鎖ＲＮＡセグメントを含有するゲノムを有する。ウイルス外被は、ウイルスの付着を司っているタンパク質である２つの主要な表面ウイルス糖タンパク質、すなわち血球凝集素（「ＨＡ」）およびノイラミニダーゼ（「ＮＡ」）を有する、宿主由来の脂質二重層を有する。外被内では、マトリックスタンパク質（「ＭＩ」）および核タンパク質（「ＮＰ」）がウイルスＲＮＡを保護している。インフルエンザウイルスのＡ、Ｂ、およびＣ型の命名は、ＭＩマトリックスタンパク質およびＮＰの抗原特性に基づいている。８つのＲＮＡセグメントは、少なくとも１０個のウイルスタンパク質をコードしており、セグメント１、２、および３は、３つのウイルスポリメラーゼタンパク質をコードしており、セグメント４はＨＡをコードしており、セグメント５はＮＰをコードしており、セグメント６はＮＡをコードしており、セグメント７はＭ１およびＭ２マトリックスタンパク質をコードしており（前者はイオンチャネル活性を有し、ウイルス外被中に包埋されている）、セグメント８は非構造タンパク質ＮＳ１およびＮＳ２をコードしている（前者は宿主の抗ウイルス応答を遮断し、後者はウイルス粒子のアセンブリに関与している）。
インフルエンザＡ株は、ウイルスの表面上のＨＡおよびＮＡタンパク質に基づいて、亜型へとさらに分類することができる。インフルエンザＡウイルスは、１６個の異なるＨＡ亜型および９個の異なるＮＡ亜型を有し、これらはすべて、ウイルスの表面上に多くの異なる組合せで存在し得る。たとえば、Ｈ５Ｎ１ウイルスは、その表面上にＨＡ５タンパク質およびＮＡ１タンパク質を有する。特にインフルエンザＡウイルスの、高い度合の遺伝的、したがって免疫学的な可変性の理由は、通常の遺伝的浮動（点突然変異）に加えて、遺伝的シフト（ウイルス遺伝子の再集合）が稀に起こる場合もあることが原因である。これは、他のウイルスとは異なり、インフルエンザウイルスのゲノムがセグメント化されていること、また、インフルエンザＡが人間および動物のどちらにもおける病原体であることが原因である。
すべての亜型が鳥において見つかっている。人間において見つかっている、より一般的なインフルエンザＡ亜型は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３亜型であり、Ｈ５、Ｈ７、およびＨ９亜型も、人間に感染することが知られている。インフルエンザＢおよびＣ株は亜型に従って分類されていない。
１９９７年以降、以前は鳥に排他的に感染していたインフルエンザＡウイルスがヒトに感染しており、致命的な結果となっている。一部のヒトの死亡の結果を伴った、確認されたトリインフルエンザウイルスの流行が、１９９７年（香港でＨ５Ｎ１）、１９９９年（中国および香港でＨ９Ｎ２）、２００２年（米国バージニア州でＨ７Ｎ２）、２００３年（中国および香港でＨ５Ｎ１、オランダでＨ７Ｎ７、香港でＨ９Ｎ２、米国ニューヨーク州でＨ７Ｎ２）、２００４年（タイおよびベトナムでＨ５Ｎ１、カナダでＨ７Ｎ３）、ならびに２００５年（タイおよびベトナムでＨ５Ｎ１）に報告されている。
インフルエンザＡおよびＢウイルスは、主に鼻咽頭および口腔咽頭の腔に感染し、最初は罹患した人において一般的な呼吸器症状を引き起こす。アデノウイルス、パラインフルエンザウイルスまたは呼吸器合胞体（ｓｙｎｃｉｔｉａｌ）ウイルス（ＲＳウイルス）などの、鼻腔または咽頭腔に感染する他のウイルスが類似の症状を引き起こすため、熟練の医療従事者でさえも、患者の臨床症状のみに基づいて、高い信頼性でインフルエンザを診断することは不可能である。
トリインフルエンザＡおよびＢウイルスを検出するための伝統的な方法には、培養強化酵素結合免疫吸着アッセイ（「ＣＥ−ＥＬＩＳＡ」）および有胚のニワトリ卵におけるウイルス単離などの、溶菌斑アッセイ（ｐｌａｑｕｅ ａｓｓａｙ）が含まれる。ウイルスの赤血球凝集素およびノイラミニダーゼの亜型決定は、検出後に血清学的方法によって実施する。伝統的な方法は十分な感度であることが示されているが、プロセスには時間がかかり、したがって、個々の患者の診断にすぐに関連性のあるものではない。たとえば、有胚卵におけるウイルス単離は、結果が得られるまでに１〜２週間かかる。インフルエンザＡ／Ｂ感染症を検出するための他の方法は、抗原の検出、細胞培養物中の単離、または逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によるインフルエンザに特異的なＲＮＡの検出を含む。抗原検出の使用は、そのような試験の感度が原因で大きな問題が存在する。迅速試験キットは、一般に、２４時間以内に結果を提供し、インフルエンザの検出において約７０％の感度であり、約９０％の特異度である。迅速試験キットの感度とは、試料の３０％のもので偽陰性が得られ得ることを意味し、試験は多重化されていない。これらはすべて実験室内で実施し、通常は、その結果は、処方される処置に影響を与えるほど十分に迅速に生成されない。
現在、世界保健機関で規定されているように、ヒトにおいてトリインフルエンザＡウイルスを同定するための推奨される診断方法は、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、ウイルス培養およびＰＣＲアッセイである。ＩＦＡおよびウイルス培養方法はどちらも労力を要し、大量の試料で実現可能でない。
本発明は、添付の独立クレーム中に定義されている。本発明の一部の任意選択の特徴は、添付の従属クレーム中に定義されている。
詳細には、本発明は上記問題に取り組み、患者検体中のインフルエンザウイルスをより効率的に検出する方法において有用な、感度および特異性の高いオリゴヌクレオチド、その断片および／または誘導体を提供する。プライマーおよび／またはプローブは、インフルエンザの検出において高感度かつ特異的であり、インフルエンザによる感染症および／またはそれに関連する病状を決定するための、迅速かつ対費用効果の高い診断的および予後的試薬を提供し得る。詳細には、これらのプライマーは、季節性インフルエンザＡおよびＢを新規インフルエンザＡから区別することによってすべてのインフルエンザＡおよびインフルエンザＢ株ならびに亜型を検出することができ、また、新しく出現したインフルエンザＡおよびＢ株を検出することができる、特異的および／または高感度の検出方法を提供する。これらのプライマーは、現地、すなわち医療現場（「ＰＯＣ」）で行うことができる情報価値のあるインフルエンザアッセイを提供し得る。
一態様によれば、本発明は、配列番号１から配列番号１９、その断片、誘導体、突然変異体、および相補的配列からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、少なくとも１つの単離したオリゴヌクレオチドを提供する。オリゴヌクレオチドは、インフルエンザＡおよび／またはＢウイルスと結合するおよび／またはそれから増幅されることができ得る。
別の態様によれば、本発明は、少なくとも１つの順方向プライマーおよび少なくとも１つの逆方向プライマーを含む少なくとも１対のオリゴヌクレオチドを提供し、順方向プライマーは、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、その断片、誘導体、突然変異体、および相補的配列からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなり、逆方向プライマーは、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８、その断片、誘導体、突然変異体、および相補的配列からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。
別の態様によれば、本発明は、本発明の任意の態様による１対のオリゴヌクレオチドおよび少なくとも１つのプローブを含む、少なくとも１組のオリゴヌクレオチドを提供する。プローブは、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１９、その断片、誘導体、突然変異体、および相補的配列からなる群から選択され得るヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。
さらなる態様によれば、本発明は、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３および配列番号１６、その断片、誘導体、突然変異体、および相補的配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる少なくとも１つの順方向プライマー、ならびに配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８、その断片、誘導体、突然変異体、および相補的配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる少なくとも１つの逆方向プライマーを用いて、インフルエンザＡおよび／またはＢウイルスから増幅された、少なくとも１つの単位複製配列を提供する。
一態様によれば、本発明は、
（ａ）少なくとも１つの生体試料を提供するステップと、
（ｂ）本発明の任意の態様による少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対またはオリゴヌクレオチド組を、生体試料中の少なくとも１つの核酸、ならびに／または生体試料から抽出、精製および／もしくは増幅した少なくとも１つの核酸と接触させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の接触から生じた任意の結合を検出し、結合が検出された場合にインフルエンザＡおよび／またはＢウイルスが存在するステップと
を含む、生体試料中のインフルエンザＡおよび／またはＢウイルスの存在を検出する少なくとも１つの方法を提供する。
一態様によれば、本発明は、本発明の任意の態様による少なくとも１つの順方向プライマーおよび本発明の任意の態様による１つの逆方向プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施することを含む、インフルエンザＡおよび／またはＢウイルスの核酸を増幅する少なくとも１つの方法を提供する。
別の態様によれば、本発明は、本発明の任意の態様による少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対またはオリゴヌクレオチド組を含む、インフルエンザＡおよび／またはＢウイルスを検出するための少なくとも１つのキットを提供する。すべてのプライマーおよびプローブを混合して、多重化された１ステップの蛍光プローブに基づいたリアルタイムＰＣＲを、１本のチューブ中で、高い特異性および高い感度で構築し得る。
特定の態様によれば、患者検体中のインフルエンザＡおよび／またはＢウイルスのＤＮＡを検出することができるＰＣＲの方法において有用な、感度および特異性の高いプライマー、その断片および／または誘導体が提供される。この試験を使用して、インフルエンザＡおよび／またはＢウイルスに罹患している患者からの検体を検査し得る。プライマーは高感度かつ特異的であり得る。さらに、少なくとも１つのＩＣ分子をそれぞれの反応中に含めて、ＰＣＲの性能を監視し得る。
（Ａ）（ＦＡＭ）Ｆｌｕ Ａ、（Ｂ）（ＨＥＸ）ブタＨ１Ｎ１、（Ｃ）（ＴｅｘＲＤ）Ｆｌｕ Ｂ、（Ｄ）（ＣＹ５）Ｆｌｕ Ａ Ｈ３Ｎ２を検出する、四重ＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフである。 臭化エチジウムによって分析した、ＰＣＲ産物の大きさを示すアガロースゲル電気泳動の結果の写真である。
本明細書中で言及した書誌参照は、利便上、参考文献のリストとして記載し、実施例の最後に追加されている。そのような書誌参照の内容全体が本明細書中に参考として組み込まれている。
定義
用語「生体試料」とは、本明細書中で、少なくとも１つの動物および／または植物からの任意の組織および／または流体の試料として定義される。生体試料は、ヒトを含めた動物、流体、固体（たとえば大便）または組織、ならびに、乳製品、野菜、肉や食肉以外の部分、および廃棄物などの、液体および固体の食品および飼料の製品および成分であり得る。生体試料は、それだけには限定されないが、有蹄動物、熊、魚、ウサギ目動物（ｌａｇａｍｏｒｐｈ）、げっ歯類などの動物を含めた、様々な家畜のファミリーのすべて、および自然または野生の動物から得られ得る。環境試料には、表面物質、土壌、水、空気および工業的試料などの環境物質、ならびに食品および乳業の加工機器、装置、器具、用具、使い捨ておよび使い捨てでない物品から得られた試料が含まれる。これらの例は、本明細書中に開示した方法に適用可能な試料の種類を限定するものと解釈されるべきでない。特に、生体試料は、少なくとも人間からの任意の組織および／または流体であり得る。
本明細書中、用語「相補的」とは、塩基対合の規則によって関連づけられたポリヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチドまたは標的核酸などのヌクレオチドの配列）に関して使用する。たとえば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」に相補的である。核酸鎖間の相補性の度合は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に顕著な影響を与える。このことは、増幅反応、および核酸間の結合に依存する検出方法において特に重要である。特に、「相補的配列」とは、一方の配列の５’末端が他方の３’末端と対合するように核酸配列とアラインメントした場合に、「逆平行に会合」するオリゴヌクレオチドをいう。天然の核酸中に一般的に見つからない特定の塩基が本明細書中に開示した核酸中に含まれていてもよく、たとえば、イノシンおよび７−デアザグアニンが含まれる。相補性は完璧である必要はなく、安定な二重鎖はミスマッチの塩基対または一致していない塩基を含有し得る。核酸技術の技術者は、たとえば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成および配列、イオン強度ならびにミスマッチの塩基対の発生率を含めたいくつかの変数を考慮して、二重鎖の安定性を経験的に決定することができる。第１のオリゴヌクレオチドが標的核酸のある領域に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドが同じ領域（またはこの領域の一部分）に対して相補性を有する場合、「重複領域」が標的核酸に沿って存在する。重複の度合は、相補性の程度に応じて変動し得る。
用語「含む」とは、本明細書中で、「主に含まれるが、必ずしも単独である必要はない」として定義される。さらに、用語「含む」は、当業者には、「からなる」が含まれるとして自動的に読み取られるであろう。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の変形は、対応して変動する意味を有する。
用語「誘導体」とは、本明細書中で、本発明のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド配列の化学修飾として定義される。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、たとえば、アルキル、アシル、またはアミノ基による水素の置換えが含まれることができる。
用語「断片」とは、本明細書中で、配列にオリゴヌクレオチドの特徴および機能を与える活性／結合部位を含む、オリゴヌクレオチドの完全配列の不完全または単離した部分として定義される。詳細には、これは少なくとも１つのヌクレオチドまたはアミノ酸が短い場合がある。より詳細には、断片は、オリゴヌクレオチドがインフルエンザウイルスと結合することを可能にする結合部位（複数可）を含む。たとえば、順方向プライマーの断片は、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、もしくは配列番号１６の少なくとも１０、１２、１５、１８もしくは１９個の連続したヌクレオチドを含んでいてもよく、および／または、逆方向プライマーは、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、もしくは配列番号１８の少なくとも１０、１２、１５、１８、１９、２０、２２、もしくは２４個の連続したヌクレオチドを含んでいてもよい。より詳細には、プライマーの断片は少なくとも１５個のヌクレオチドの長さであり得る。
用語「内部対照（ＩＣ）分子」とは、本明細書中で、本発明の方法で使用するインフルエンザウイルスと同じプライマー組によって同時増幅される、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたオリゴヌクレオチド分子として定義される。詳細には、ＩＣは、偽陰性結果を回避するために、反応混合物中に混合してＰＣＲの性能を監視し得る。このＩＣ分子を検出するためのプローブは、この分子の内部部分に特異的であり得る。この内部部分は人工的に設計される場合があり、自然に存在しない場合がある。
本発明のコンテキストにおいて使用する用語「インフルエンザウイルス」には、「トリインフルエンザウイルス」および「ヒトインフルエンザウイルス」の分類に該当するインフルエンザウイルスのすべての亜型が含まれる。インフルエンザウイルスは、インフルエンザＡ、ＢまたはＣウイルスであり得る。詳細には、インフルエンザＡウイルスには、それだけには限定されないが、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２などが含まれ得る。
用語「突然変異」とは、本明細書中で、一定の長さのヌクレオチドの核酸配列中の変化として定義される。当業者は、小さな突然変異、特に置換、欠失および／または挿入の点突然変異は、特に核酸をプローブとして使用する場合に、ヌクレオチドのストレッチにわずかな影響しか与えないことを理解されよう。したがって、本発明によるオリゴヌクレオチドには、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入の突然変異が包含される。さらに、本発明によるオリゴヌクレオチドおよびその誘導体は、プローブとしても機能する場合があり、したがって、本明細書中で言及する任意のオリゴヌクレオチドには、その突然変異および誘導体も包含される。たとえば、突然変異が、標的遺伝子の任意のプライマーハイブリダイゼーション部位の数塩基の位置、特に５’末端で起こる場合、プライマーの配列は、プライマーの感度および特異性に影響を与えない場合がある。
用語「生体試料中の核酸」とは、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含有する任意の試料をいう。特に、核酸源は、それだけには限定されないが、血液、唾液、脳脊髄液、胸膜液、乳、リンパ液、痰および精液を含めた生体試料である。
一態様によれば、本発明は、配列番号１から配列番号１９、その断片、誘導体、突然変異体、および相補的配列からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、少なくとも１つの単離したオリゴヌクレオチドを提供する。オリゴヌクレオチドは、インフルエンザウイルスと結合するおよび／またはそれから増幅されることができ得る。インフルエンザウイルスは、インフルエンザＡおよび／またはＢから選択され得る。特に、オリゴヌクレオチドはプライマーおよび／またはプローブとして有用な場合があり、インフルエンザの一方もしくは両方の株および／または他の非関連のウイルス／微生物を含有する試料中のインフルエンザＡおよび／またはＢを特異的に検出するための方法で使用し得る。本発明のプライマーおよびプローブのこれらのヌクレオチド配列は、それぞれの株のゲノムに独特であるが、それぞれの株内の多くのウイルスにまたがって保存的でもある、インフルエンザＡおよびインフルエンザＢのゲノムの領域に特異的にハイブリダイズするように設計されている。
本発明の任意の態様によるプライマーは、インフルエンザＡの遺伝子型をインフルエンザＢから区別するために使用し得る。詳細には、本発明によるプライマーを使用して、インフルエンザＡウイルスの様々な亜型の遺伝子型を区別し得る。さらに詳細には、プライマーを使用して、インフルエンザＡおよび／またはインフルエンザＢウイルスを、ブタ起源Ｈ１Ｎ１の亜型決定の確認、季節性Ｈ１Ｎ１、季節性Ｈ３Ｎ２などと区別し得る。
インフルエンザウイルスは薬物耐性株であり得る。インフルエンザウイルスの薬物耐性株は、アマンタジン、オセルタミビル、リマンタジン、ザナミビルなどからなる群から選択される１つまたは複数の薬物に対して耐性であり得る。インフルエンザウイルスの薬物耐性株は、複数の薬物に対して耐性であり得る多剤耐性株であり得る。
オリゴヌクレオチド配列は１３〜３５個の連結されたヌクレオチドの長さであってよく、配列番号１から配列番号１９からなる群から選択される配列のうちの任意のものに対して少なくとも７０％の配列同一性を含み得る。当業者には、所定プライマーは、増幅反応において相補的核酸鎖の合成を有効にプライミングするために１００％の相補性でハイブリダイズする必要はないことが理解されよう。プライマーは、介在または隣接するセグメントがハイブリダイゼーション現象（たとえば、ループ構造またはヘアピン構造）に関与しないように、１つまたは複数のセグメントにわたってハイブリダイズし得る。特に、オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号１から配列番号１９からなる群から選択される配列のうちの任意の１つに対して、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有し得る。
開示した具体的なプライマー配列と比較して、７０％〜１００％、またはその内の任意の範囲の配列同一性の変動の程度が可能である。配列同一性の決定を以下の例中に記載する。２個の同一でない残基を有する別の２０個のヌクレオチドの長さのプライマーと同一である、２０個のヌクレオチドの長さのプライマーは、１８〜２０個の同一の残基を有する（１８／２０＝０．９または９０％の配列同一性）。別の例では、すべての残基が２０個の核酸塩基の長さのプライマーの１５個のヌクレオチドのセグメントと同一である、１５個のヌクレオチドの長さのプライマーは、２０個のヌクレオチドのプライマーと１５／２０＝０．７５または７５％の配列同一性を有する。
パーセント相同性、配列同一性または相補性は、たとえば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｎａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、１９８１、２、４８２〜４８９）のアルゴリズムを使用する、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ配列解析パッケージ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ）、ＵＮＩＸ用バージョン８、遺伝学コンピューターグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）によって、初期設定を用いて決定することができる。当業者はパーセント配列同一性またはパーセント配列相同性を計算することができ、必要以上の実験を行わずに、増幅産物を産生させるために核酸の相補鎖の合成をプライミングするその役割におけるプライマーの機能に対する、プライマーの配列同一性の変動の効果を決定することができる。
別の態様によれば、本発明は、少なくとも１つの順方向プライマーおよび少なくとも１つの逆方向プライマーを含む少なくとも１対のオリゴヌクレオチドを提供し、順方向プライマーは、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、その断片、誘導体、突然変異体、および相補的配列からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなり、逆方向プライマーは、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８、その断片、誘導体、突然変異体、および相補的配列からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。
別の態様によれば、本発明は、本発明の任意の態様による１対のオリゴヌクレオチドおよび少なくとも１つのプローブを含む、少なくとも１組のオリゴヌクレオチドを提供する。
プローブは、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５および配列番号１９、その断片、誘導体、突然変異体、および相補的配列からなる群からのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなっていてよく、また、単位複製配列と結合することができ得る。
プローブは、その５’および３’末端で蛍光色素を用いて標識し得る。５’を標識した蛍光色素の例には、それだけには限定されないが、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、およびシアニン−５（Ｃｙ５）が含まれ得る。３’を標識した蛍光色素の例には、それだけには限定されないが、５−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）およびブラックホールクエンチャー（ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ）−１、２、３（ＢＨＱ−１、２、３）が含まれ得る。
本発明のオリゴヌクレオチドは、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列に基づいた増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、高温ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）またはライゲーション媒介性増幅（ＬＭＡ）などの、当分野で知られている様々な核酸増幅技法で使用し得る。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、ウイルス核酸の直接ハイブリダイゼーションを介して増幅なしでインフルエンザＡおよびＢを直接検出するため、あるいはウイルスの核酸のＤＮＡもしくはＲＮＡコピーまたはその相補体を検出するための、当業者に知られている様々な方法においても使用し得る。
本発明の任意の態様によるオリゴヌクレオチドは、臨床または培養試料のどちらかからインフルエンザを検出するための方法において使用してよく、臨床試料には、それだけには限定されないが、鼻咽頭、鼻および喉のスワブならびに鼻咽頭の吸引液および洗浄液が含まれ得る。臨床試料は、ウイルス核酸のより効率的な検出を可能にするために、試験前に予備処理を行い得る。たとえば、試料を採取し、ウイルスを安定化させるために輸送培地に加え得る。鼻咽頭、鼻および喉のスワブを輸送培地に加え得る。鼻咽頭の吸引液および洗浄液は、輸送培地を加えることによって安定化される場合またはされない場合がある。試験室で受け取られた後、ウイルスを不活性化し、溶解してウイルスＲＮＡを遊離させ得る。その後、核酸を任意選択で抽出して、後のアッセイステップの潜在的な阻害剤または他の干渉剤を除去し得る。本発明の方法を行うために、ウイルス核酸をインフルエンザＡおよび／またはインフルエンザＢの特異的検出に必須の構成要素と混合し得る。
さらなる態様によれば、本発明は、本発明の任意の態様による少なくとも１つの順方向プライマーおよび少なくとも１つの逆方向プライマーを用いてインフルエンザから増幅された、少なくとも１つの単位複製配列を提供する。
一態様によれば、本発明は、
（ａ）少なくとも１つの生体試料を提供するステップと、
（ｂ）本発明の任意の態様による少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対またはオリゴヌクレオチド組を、生体試料中の少なくとも１つの核酸、ならびに／または生体試料から抽出、精製および／もしくは増幅した少なくとも１つの核酸と接触させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の接触から生じた任意の結合を検出および／または定量し、結合が検出された場合にインフルエンザウイルスが存在するステップと
を含む、生体試料中のインフルエンザウイルスの存在を検出および／または定量する少なくとも１つの方法を提供する。
一態様によれば、本発明は、本発明の任意の態様による少なくとも１つの順方向プライマーおよび本発明の任意の態様による１つの逆方向プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施することを含む、インフルエンザＡおよび／またはＢウイルスの核酸を増幅する少なくとも１つの方法を提供する。
別の態様によれば、本発明は、本発明の任意の態様による少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対またはオリゴヌクレオチド組を含む、インフルエンザＡおよび／またはＢウイルスを検出するための少なくとも１つのキットを提供する。キットは、インフルエンザ症状を患っている患者においてヒトおよびトリのインフルエンザウイルスを検出するために、臨床医によって使用され得る。そのようなキットは、トリインフルエンザＡ、インフルエンザＡ、またはヒトインフルエンザＢを検出するための１つまたは複数のプライマーおよびプローブの組を含むであろう。
トリインフルエンザＡ、インフルエンザＡ、またはヒトインフルエンザＢを検出するためのプライマーおよび／またはプローブの組は、表１中に見つけ得る。
表１．トリインフルエンザＡ、インフルエンザＡ、および／またはヒトインフルエンザＢを検出するための５個のプライマーおよび／またはプローブの組。「Ｙ」はヌクレオチドＣ／Ｔを表し、「Ｋ」はＧ／Ｔを表し、「Ｒ」はヌクレオチドＡ／Ｇを表す。
一態様では、本発明は、
−配列番号１、その断片、誘導体、突然変異体、または相補的配列の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる順方向プライマー、
−配列番号２、その断片、誘導体、突然変異体、または相補的配列の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる逆方向プライマー、および
−配列番号３、その断片、誘導体、突然変異体、または相補的配列の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるプローブ
を含む、少なくとも１組のオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明の本態様による組は、試料からのインフルエンザＡウイルスと結合するおよび／またはそれを検出することができ得る。
別の態様によれば、本発明は、
−配列番号４、その断片、誘導体、突然変異体、または相補的配列の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる順方向プライマー、
−配列番号５、その断片、誘導体、突然変異体、または相補的配列の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる逆方向プライマー、および
−配列番号６、その断片、誘導体、突然変異体、または相補的配列の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるプローブ
を含む、少なくとも１組のオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明の本態様による組は、インフルエンザＡウイルスと結合するおよび／またはそれを検出することができ得る。インフルエンザＡウイルスはインフルエンザＡウイルスのＨ１Ｎ１亜型であり得る。インフルエンザＡウイルスはインフルエンザＡウイルスのブタ起源Ｈ１Ｎ１亜型であり得る。
別の態様によれば、本発明は、
−配列番号７、その断片、誘導体、突然変異体、または相補的配列の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる順方向プライマー、
−配列番号８、その断片、誘導体、突然変異体、または相補的配列の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる逆方向プライマー、および
−配列番号９、その断片、誘導体、突然変異体、または相補的配列の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるプローブ
を含む、少なくとも１組のオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明の本態様による組は、インフルエンザＡウイルスと結合するおよび／またはそれを検出することができ得る。インフルエンザＡウイルスはインフルエンザＡウイルスのＨ１Ｎ１亜型であり得る。インフルエンザＡウイルスはインフルエンザＡウイルスのブタ起源Ｈ１Ｎ１亜型であり得る。
別の態様によれば、本発明は、
−配列番号１０、その断片、誘導体、突然変異体、または相補的配列の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる順方向プライマー、
−配列番号１１、その断片、誘導体、突然変異体、または相補的配列の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる逆方向プライマー、および
−配列番号１２、その断片、誘導体、突然変異体、または相補的配列の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるプローブ
を含む、少なくとも１組のオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明の本態様による組は、インフルエンザＡウイルスと結合するおよび／またはそれを検出することができ得る。インフルエンザＡウイルスはインフルエンザＡウイルスのＨ１Ｎ１亜型であり得る。インフルエンザＡウイルスは季節性Ｈ１Ｎ１であり得る。
一態様によれば、本発明は、
−配列番号１３、その断片、誘導体、突然変異体、または相補的配列の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる順方向プライマー、
−配列番号１４、その断片、誘導体、突然変異体、または相補的配列の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる逆方向プライマー、および
−配列番号１５、その断片、誘導体、突然変異体、または相補的配列の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるプローブ
を含む、少なくとも１組のオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明の本態様による組は、インフルエンザＡウイルスと結合するおよび／またはそれを検出することができ得る。インフルエンザＡウイルスはインフルエンザＡウイルスのＨ３Ｎ２亜型であり得る。インフルエンザＡウイルスはインフルエンザＡウイルスのブタ起源Ｈ３Ｎ２亜型であり得る。
別の態様によれば、本発明は、
−配列番号１６、その断片、誘導体、突然変異体、または相補的配列の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる順方向プライマー、
−配列番号１７もしくは配列番号１８、その断片、誘導体、突然変異体、または相補的配列の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる逆方向プライマー、および
−配列番号１９、その断片、誘導体、突然変異体、または相補的配列の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるプローブ
を含む、少なくとも１組のオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明の本態様による組は、インフルエンザＢウイルスと結合するおよび／またはそれを検出することができ得る。
一態様によれば、本発明は、本発明の任意の態様によるオリゴヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施することを含む、インフルエンザウイルスの核酸を増幅する少なくとも１つの方法を提供する。
本発明の任意の態様による方法は、内部分子（ＩＣ）およびＩＣに特異的なプローブを生体試料と混合するステップをさらに含み得る。ＩＣの使用はインフルエンザ診断の効率を改善させて結果の正確さを高め得る。
上記は、例示の目的で提供し、本発明を限定することを意図しない以下の実施例を参照することで、より容易に理解されると考えられる。
当分野で知られており、具体的に記載していない標準の分子生物学技法は、一般に、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）の記載に従った。
ここまでに本発明を一般的に説明した。例示の目的で提供し、本発明を限定することを意図しない以下の実施例を参照することで、上記はより容易に理解されるであろう。
四重検出
蛍光プローブに基づいたリアルタイムの１ステップのＲＴ−ＰＣＲを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ ＲＴ／Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ Ｍｉｘ（カタログ番号１１７３２−２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を用いて、２．５μｌのＲＮＡ試料、４対の順方向／逆方向プライマー、０．１５μＭの最終濃度のそれぞれのプライマーおよび０．１μＭの最終濃度の４つすべてのプローブを含有する２５μｌの反応体積で、サーマルサイクラー中で行った。熱サイクリングは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３０００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国Ｌａ Ｊｏｌｌａ）によって行った。その後、蛍光検出をそれぞれのサイクルで読み取って、陽性試料を明らかにした。４つのプライマー対には、Ａ１４５Ｆ／Ｒ（それぞれ配列番号１および配列番号２）、Ｈ１ｓ１４２Ｆ／Ｒ（それぞれ配列番号７および配列番号８）、Ｈ３−１１６Ｆ／Ｒ（それぞれ配列番号１３および配列番号１４）、ならびにＢ１８８Ｆ／Ｒ１、Ｒ２（それぞれ配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８）が含まれていた。４つの対応する蛍光プローブには、Ａ１４５−ＦＡＭ（配列番号３）、Ｈ１ｓ１４２−ＨＥＸ（配列番号９）、Ｈ３−１１６−Ｃｙ５（配列番号１５）およびＢ１８８−ＴｘＲｄ（配列番号１９）が含まれていた。
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３０００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国Ｌａ Ｊｏｌｌａ）は、以下のステップおよび条件で使用した：５５℃で１０分間の逆転写、９５℃で２．５分間のＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの初期の活性化、続いて、４２サイクルの、９５℃で１７秒間の変性、５５℃で３１秒間のアニーリング、および６８℃で３２秒間の伸長。蛍光データ収集点は、それぞれのサイクルの５５℃のプラトーのアニーリングステップに設定した。
以下の試料でＲＴ−ＰＣＲを実施した。
１．ブタ様Ｈ１Ｎ１、ＷＨＯ、オーストラリアによるＡ／Ａｕｃｋｌａｎｄ／３／２００９ Ｈ１Ｎ１ブタ様インフルエンザから抽出した精製ＲＮＡ。
（−５）：１０−５培希釈、（−６）：１０−６培希釈、（−７）：１０−７培希釈、ストックから。
２．Ｈ３Ｎ２、患者から抽出した精製ＲＮＡ。
（−２）：１０−２培希釈、（−３）：１０−３培希釈。
３．Ｆｌｕ Ｂ、ＡＴＣＣ、ＶＲ−７８６から得たウイルスストックから抽出した精製ＲＮＡ。
（−５）：１０−５培希釈、（−６）：１０−６培希釈。
４．ＮＴＣ、水。
結果を表２に示す。サイクル閾値（Ｃｔ）をサイクルの回数に対してプロットし、図１に示した。
表２．配列番号１、配列番号２、配列番号７、配列番号８、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲの結果。
ゲル電気泳動用のＨ１ｓ１３８プライマー対（配列番号４および配列番号５）
一重の１ステップのＲＴ−ＰＣＲを、酵素混合物、プライマー対のＨ１ｓ１３８プライマー対（すなわち配列番号４および配列番号５）を含有するＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ｑＲＴ−ＰＣＲキット（カタログ番号：１１７３２−２０）で行った。ＰＣＲ産物は、臭化エチジウム−アガロースゲル電気泳動によって分析した。
以下の試料でＰＣＲを実施した：
１．ブタ様Ｈ１Ｎ１、ＷＨＯ、オーストラリアによるＡ／Ａｕｃｋｌａｎｄ／３／２００９ Ｈ１Ｎ１ブタ様インフルエンザから抽出した精製ＲＮＡ。（−６）：ストックから１０−６培希釈、
２．患者試料、および
３．陰性対照、水。
結果を表３に示す。電気泳動の結果を図２に示す。予測されたＰＣＲ産物の長さは１３８ｂｐである。図２に見られるように、プライマーは標的に特異的であり、陽性対照および一部の患者の試料で１３８ｂｐのバンドをもたらした。
表３．患者試料の電気泳動および四重（実施例１と同様）の結果。
実施例１で説明した四重ＲＴ−ＰＣＲを同じ患者の試料に対して使用した。結果を表２に示す。見ることができるように、図２で陽性であった患者の試料（すなわち１３８ｂｐのバンドを示す）はブタ起源Ｈ１Ｎ１を有することが確認されたため、電気泳動の結果は四重ＲＴ−ＰＣＲの結果に対応している。
参考文献
ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）。
ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、１９８１、２、４８２〜４８９。

Claims (10)

  1. 生体試料中のインフルエンザＡ、または、インフルエンザＡおよびＢウイルスの多重検出（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）のためのキットであって、
    前記キットは、プライマーとプローブの混合物を含み、
    前記混合物は、少なくとも１つの順方向プライマー、少なくとも１つの逆方向プライマー、および、少なくとも１つのプローブを含む、オリゴヌクレオチドの組を含み、
    ここで、前記順方向プライマーは配列番号１のヌクレオチド配列を含み、前記逆方向プライマーは配列番号２のヌクレオチド配列を含み、および、前記プローブは配列番号３のヌクレオチド配列を含み、
    さらに、
    ａ）ブタ起源Ｈ１Ｎ１を検出するための、配列番号４のヌクレオチド配列を含む順方向プライマー、配列番号５のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および、配列番号６を含む少なくとも１つのプローブ；
    ｂ）ブタ起源Ｈ１Ｎ１を検出するための、配列番号７のヌクレオチド配列を含む順方向プライマー、配列番号８のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および、配列番号９を含む少なくとも１つのプローブ；
    ｃ）季節性Ｈ１Ｎ１を検出するための、配列番号１０のヌクレオチド配列を含む順方向プライマー、配列番号１１のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および、配列番号１２を含む少なくとも１つのプローブ；
    ｄ）季節性Ｈ３Ｎ２を検出するための、配列番号１３のヌクレオチド配列を含む順方向プライマー、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および、配列番号１５を含む少なくとも１つのプローブ；および、
    ｅ）インフルエンザＢを検出するための、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む順方向プライマー、配列番号１７および１８から選択されるヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および、配列番号１９を含むまたは配列番号１９からなる少なくとも１つのプローブ；
    からなる群から選択される１組または２組以上のオリゴヌクレオチド、を含む、
    キット。
  2. 請求項１に記載のキットであって、
    前記キットは、プライマーとプローブの混合物を含み、
    前記混合物は、インフルエンザＡ、および、インフルエンザＡウイルス亜型ブタ起源Ｈ１Ｎ１および季節性Ｈ３Ｎ２を検出するための、ａ）またはｂ）、およびｄ）中のオリゴヌクレオチドの組を含む、
    キット。
  3. 請求項１に記載のキットであって、
    前記キットは、プライマーとプローブの混合物を含み、
    前記混合物は、インフルエンザＡ、および、インフルエンザＡウイルス亜型ブタ起源Ｈ１Ｎ１、季節性Ｈ１Ｎ１および季節性Ｈ３Ｎ２を検出するための、ａ）またはｂ）、ｃ）およびｄ）中のオリゴヌクレオチドの組を含む、
    キット。
  4. 請求項１に記載のキットであって、
    前記キットは、プライマーとプローブの混合物を含み、
    前記混合物は、インフルエンザＡ、および、インフルエンザＡウイルス亜型ブタ起源Ｈ１Ｎ１、季節性Ｈ３Ｎ２、および、インフルエンザＢを検出するための、ａ）またはｂ）、ｄ）およびｅ）中のオリゴヌクレオチドの組を含む、
    キット。
  5. 請求項１に記載のキットであって、
    前記キットは、プライマーとプローブの混合物を含み、
    前記混合物は、インフルエンザＡ、および、インフルエンザＡウイルス亜型ブタ起源Ｈ１Ｎ１、季節性Ｈ３Ｎ２、および、インフルエンザＢを検出するための、ｂ）、ｄ）およびｅ）中のオリゴヌクレオチドの組を含む、
    キット。
  6. 請求項１に記載のキットであって、
    前記キットは、プライマーとプローブの混合物を含み、
    前記混合物は、インフルエンザＡ、および、インフルエンザＡウイルス亜型ブタ起源Ｈ１Ｎ１、季節性Ｈ１Ｎ１、季節性Ｈ３Ｎ２、および、インフルエンザＢを検出するための、ａ）またはｂ）、ｃ）からｅ）中のオリゴヌクレオチドの組を含む、
    キット。
  7. 請求項１に記載のキットであって、
    前記キットは、プライマーとプローブの混合物を含み、
    前記混合物は、インフルエンザＡ、および、インフルエンザＡウイルス亜型ブタ起源Ｈ１Ｎ１、季節性Ｈ１Ｎ１、季節性Ｈ３Ｎ２、および、インフルエンザＢを検出するための、ｂ）からｅ）中のオリゴヌクレオチドの組を含む、
    キット。
  8. 生体試料中のインフルエンザＡの存在をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出および／または定量する方法であって、
    前記方法は、
    （ａ）少なくとも１つの生体試料を提供するステップと、
    （ｂ）請求項１から３のいずれか一項に定義されるプライマーとプローブの混合物を、前記生体試料中の少なくとも１つの核酸、ならびに／または前記生体試料から抽出、精製および／もしくは増幅した少なくとも１つの核酸と接触させるステップと、
    （ｃ）ステップ（ｂ）の接触から生じた任意の結合を検出および／または定量し、結合が検出された場合にウイルスが存在するステップと
    を含む、方法。
  9. 生体試料中のインフルエンザＡおよびＢウイルスの存在をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出および／または定量する方法であって、
    前記方法は、
    （ａ）少なくとも１つの生体試料を提供するステップと、
    （ｂ）請求項１、４〜７のいずれか１項に記載のプライマーとプローブの混合物を、前記生体試料中の少なくとも１つの核酸、ならびに／または前記生体試料から抽出、精製および／もしくは増幅した少なくとも１つの核酸と接触させるステップと、
    （ｃ）ステップ（ｂ）の接触から生じた任意の結合を検出および／または定量し、結合が検出された場合にウイルスが存在するステップと
    を含む、方法。
  10. 生体試料中のインフルエンザＡ、または、インフルエンザＡおよびＢウイルスの多重検出（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）のための、プライマーとプローブの混合物の使用であって、
    前記混合物は、少なくとも１つの順方向プライマー、少なくとも１つの逆方向プライマー、および、少なくとも１つのプローブを含む、オリゴヌクレオチドの組を含み、
    ここで、前記順方向プライマーは配列番号１のヌクレオチド配列を含み、前記逆方向プライマーは配列番号２のヌクレオチド配列を含み、および、前記プローブは配列番号３のヌクレオチド配列を含み、
    さらに、
    ａ）ブタ起源Ｈ１Ｎ１を検出するための、配列番号４のヌクレオチド配列を含む順方向プライマー、配列番号５のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および、配列番号６を含む少なくとも１つのプローブ；
    ｂ）ブタ起源Ｈ１Ｎ１を検出するための、配列番号７のヌクレオチド配列を含む順方向プライマー、配列番号８のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および、配列番号９を含む少なくとも１つのプローブ；
    ｃ）季節性Ｈ１Ｎ１を検出するための、配列番号１０のヌクレオチド配列を含む順方向プライマー、配列番号１１のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および、配列番号１２を含む少なくとも１つのプローブ；
    ｄ）季節性Ｈ３Ｎ２を検出するための、配列番号１３のヌクレオチド配列を含む順方向プライマー、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および、配列番号１５を含む少なくとも１つのプローブ；および、
    ｅ）インフルエンザＢを検出するための、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む順方向プライマー、配列番号１７および１８から選択されるヌクレオチド配列を含む逆方向プライマー、および、配列番号１９を含むまたは配列番号１９からなる少なくとも１つのプローブ；
    からなる群から選択される１組または２組以上のオリゴヌクレオチド、を含む、
    使用。
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