CN102597261A - 流感检测方法及其试剂盒 - Google Patents

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井上雅文
T·巴克汉姆
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Tan Tock Seng Hospital
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Abstract

本发明提供了简单、特异和/或灵敏的测试A和/或B型流感病毒的存在的寡核苷酸。还提供了用于测试中的包括用作探针和/或引物的寡核苷酸的试剂盒。

Description

流感检测方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及引物、探针以及使用该引物和/或探针用来检测A和/或B型流感病毒存在的方法和试剂盒。
背景技术
共计有三种类型的流感病毒毒株A、B和C。在这三种毒株中，A型流感病毒被认为致病性最强，因为其可以感染包括人类在内的许多种动物。B型流感病毒和C型流感病毒通常仅感染人类。利用野生禽类作为天然宿主的流感病毒称为“禽流感病毒”，而利用人作为天然宿主的流感病毒称为“人流感病毒”。在一些病例中，人和其它动物通过接触感染的家禽和/或感染的野生禽类而感染禽流感病毒。具有交叉的物种并感染人类的禽流感病毒对近来广泛流行的人流感负有责任。
流感病毒，一种有包膜病毒，具有包含8个单链负义RNA片段的基因组。病毒包膜具有源自宿主的脂双分子层，其带有两种负责病毒吸附的主要表面病毒糖蛋白：血凝素(“HA”)和神经氨酸酶(“NA”)。在包膜内，基质蛋白(“Ml”)和核蛋白(“NP”)保护病毒RNA。流感病毒的A、B和C型的命名是基于Ml基质蛋白和NP的抗原特征。所述8个RNA片段编码至少10种病毒蛋白：片段1、2和3编码三种病毒聚合酶蛋白；片段4编码HA；片段5编码NP；片段6编码NA；片段7编码M1和M2基质蛋白，前者具有离子通道活性并且嵌入病毒包膜；以及片段8编码非结构蛋白NS1和NS2，前者阻断宿主抗病毒反应并且后者参与病毒颗粒的装配。
根据病毒表面上的HA和NA蛋白，A型流感病毒株可以进一步分成亚型。A型流感病毒具有16种不同的HA亚型和9种不同的NA亚型，所有这些亚型可以以许多不同的组合存在于病毒表面上。例如，H5N1病毒在其表面上有HA5蛋白和NA1蛋白。高度的遗传以及由此的免疫变异性(尤其是A型流感病毒)的原因是由于这样的事实：除了通常的遗传漂变(点突变)以外，也可以罕有发生遗传漂移(病毒基因的重配)。这是由于这样的事实：与其他病毒相反，流感病毒的基因组是分段的并且A型流感病毒是人以及动物体内的病原体。
所有亚型在鸟中都有发现。在人体中发现的更常见的A型流感病毒亚型是H1、H2和H3亚型，已经知道H5、H7和H9亚型也会感染人类。B型流感病毒株和C型流感病毒株不根据亚型分类。
自1997年，先前仅感染鸟类的A型流感病毒已经感染人类并具有致命的后果。被证实的一些导致人死亡的禽流感病毒的爆发已经在1997年(H5N1在香港)、1999年(H9N2在中国和香港)、2002年(H7N2在美国弗吉尼亚)、2003年(H5N1在中国和香港；H7N7在荷兰；H9N2在香港；H7N2在美国纽约)、2004年(H5N1在泰国和越南；H7N3在加拿大)以及2005年(H5N1在泰国和越南)报道。
A型流感病毒和B型流感病毒主要感染鼻咽腔和口咽腔并最初在受感染的人中引起一般的呼吸系统症状。即使是有经验的医疗专业人员也不可能仅仅根据患者的临床症状非常可靠地诊断流感，这是因为其他感染鼻腔和咽腔的病毒(如腺病毒、副流感病毒或呼吸道合胞病毒(RS病毒))会引起相似症状。
传统的检测A型禽流感病毒和B型禽流感病毒的方法包括噬菌斑测定，如培养增强酶联免疫吸附测定(“CE-ELISA”)和鸡胚蛋中病毒分离。通过血清学方法在检测后进行病毒的血凝素和神经氨酸酶分型。虽然传统方法表现出足够的灵敏性，但是过程费时并因此对于个体患者不能快速诊断；例如，在胚胎蛋中分离病毒花费一到两周的时间得到结果。其他的检测A/B型流感病毒感染的方法包括抗原检测、细胞培养分离或者通过逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测流感特异性RNA。由于这些测试的灵敏性，使用抗原检测过程中有一个巨大的问题。快速测试试剂盒通常在24小时内提供结果，并且具有约70％的检测流感灵敏性和约90％的特异性。快速测试试剂盒的灵敏性表示多达30％的样本可产生假阴性，并且测试并非多重的(multiplexed)。它们都是在实验室中进行，并且通常得出结果不够快而不能影响处方治疗。
目前世界卫生组织规定，推荐的在人体中识别A型禽流感病毒的诊断方法是免疫荧光测定(IFA)、病毒培养和PCR测定。IFA和病毒培养方法均费力并且对于大量样本是不可行的。
发明内容
发明概述
在所附的独立权利要求中限定本发明。在所附的从属权利要求中限定本发明的一些可选特征。
特别是，本发明提出了上述问题，并且提供了用于更有效地检测患者样品中流感病毒的方法中的高度灵敏和特异的寡核苷酸、其片段和/或衍生物。引物和/或探针在流感检测中可为灵敏的且特异的，并提供了快速和经济有效的用于确定因流感和/或与此相关的病情引起的感染的诊断和预后试剂。特别是，这些引物提供了特异的和/或灵敏的检测方法，该检测方法能够通过区分季节性A和B型流感与新型A型流感而检测所有A型流感和B型流感病毒株和亚型以及检测新出现的A和B型流感病毒株。这些引物可以提供能够在现场中(即，及时现场护理(“POC”))进行的详实的流感测定。
根据一个方面，本发明提供了至少一种分离的寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：19、其片段、衍生物、突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列，基本由选自SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：19、其片段、衍生物、突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列组成，或者由选自SEQ IDNO：1到SEQ ID NO：19、其片段、衍生物、突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列组成。所述寡核苷酸可以与A和/或B型流感病毒结合，和/或从A和/或B型流感病毒扩增。
根据另一个方面，本发明提供了至少一对寡核苷酸，其包括至少一种正向引物和至少一种反向引物，其中，所述正向引物包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：16，其片段，衍生物，突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列；基本由选自SEQID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQID NO：16，其片段，衍生物，突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列组成；或者由选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQID NO：13、SEQ ID NO：16，其片段，衍生物，突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列组成；以及所述反向引物包含选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18，其片段，衍生物，突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列；基本由选自SEQID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQID NO：17、SEQ ID NO：18，其片段，衍生物，突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列组成；或者由选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18，其片段，衍生物，突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列组成。
根据另一个方面，本发明提供了至少一组寡核苷酸，其包括一对根据本发明任一方面的寡核苷酸和至少一种探针。所述探针包含可选自SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：19，其片段，衍生物，突变和互补序列中的一种核苷酸序列；基本由选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：19，其片段，衍生物，突变和互补序列中的一种核苷酸序列组成；或者由选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQID NO：15、SEQ ID NO：19，其片段，衍生物，突变和互补序列中的一种核苷酸序列组成。
根据再一个方面，本发明提供了至少一种使用至少一种正向引物和至少一种反向引物从A和/或B型流感病毒扩增的扩增子，所述正向引物包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：16，其片段，衍生物，突变和互补序列中的核苷酸序列；基本由选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：13和SEQ ID NO：16，其片段，衍生物，突变和互补序列中的核苷酸序列组成；或者由选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：16，其片段，衍生物，突变和互补序列中的核苷酸序列组成；以及所述反向引物包含选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18，其片段，衍生物，突变和互补序列中的核苷酸序列；基本由选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18，其片段，衍生物，突变和互补序列中的核苷酸序列组成；或者由选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18，其片段，衍生物，突变和互补序列中的核苷酸序列组成。
根据一个方面，本发明提供了至少一种检测生物样本中A和/或B型流感病毒存在的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供至少一种生物样本；
(b)使根据本发明任一方面的至少一种寡核苷酸、一对寡核苷酸或一组寡核苷酸，与生物样本中的至少一种核酸接触，和/或与从生物样本中提取、纯化和/或扩增的至少一种核酸接触；以及
(c)检测从步骤(b)中的接触产生的任何结合，由此当检测到结合时A和/或B型流感病毒存在。
根据一个方面，本发明提供了至少一种扩增A和/或B型流感病毒核酸的方法，其中，所述方法包括使用至少一种根据本发明任一方面的正向引物和至少一种根据本发明任一方面的反向引物进行聚合酶链式反应。
根据另一个方面，本发明提供了至少一种检测A和/或B型流感病毒的试剂盒，该试剂盒包括根据本发明任一方面的至少一种寡核苷酸、一对寡核苷酸或者一组寡核苷酸。所有引物和探针可以混合从而在单管中构成具有高度特异和灵敏的基于多重一步荧光探针的实时PCR。
根据一个特别的方面，提供了用于能检测患者样本中A和/或B型流感病毒DNA的PCR的方法中的高度灵敏和特异的引物、其片段和/或衍生物。该测试可以用于检查来自携带A和/或B型流感病毒患者的样品。该引物可以是灵敏和特异的。而且，可以在每个反应中包括至少一种IC分子从而监测PCR的进行。
附图说明
图1为显示检测(A)(FAM)A型流感；(B)(HEX)猪H1N1；(C)(TexRD)B型流感；(D)(CY5)A型H3N2流感的4-重RT-PCR的结果的图。
图2为显示通过溴化乙锭分析的显示PCR产物大小的琼脂糖凝胶电泳的结果的照片。
具体实施方式
为方便起见，本说明书中涉及的参考文献以文献列表的形式列出并加入到实施例后面。这些参考文献的全部内容在此处通过引用的方式并入。
定义
本文所用术语“生物样本”定义为来自至少一种动物和/或植物的任何组织和/或流体的样本。生物样本可以是动物(包括人)的流体、固体(例如，粪便)或者组织，以及液体和固体食物和饲料产品和原料，如乳制品、蔬菜、肉和肉类加工副产品以及废料。生物样本可以从所有各种各样的家畜以及野化家畜或者野生动物中获得，包括，但不限于，这些动物，如有蹄类动物、熊、鱼、兔形动物、啮齿动物等等。环境样本包括环境材料，如表面物质、土壤、水、空气和工业样本，以及从食物、乳品加工器械、设备、装备、器具、一次性和非一次性产品中得到的样本。这些实例并不解释为限制可适用于本文中所公开方法的样本类型。特别是，生物样本可以是至少来自人类的任何组织和/或流体。
本文所用术语“互补”是指与碱基配对规则有关的多核苷酸(即，如寡核苷酸或靶核酸的核苷酸序列)。例如，“5′-A-G-T-3′”序列与“3′-T-C-A-5′”序列互补。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间的杂交的效率和强度具有显著作用。这在扩增反应以及依赖于核酸之间结合的检测方法中尤为重要。特别是，“互补序列”是指一种处于“反向平行联会”的寡核苷酸，此时其与核酸序列排列以使一种序列的5′末端与另一序列的3′末端配对。一些在天然核酸中不常发现的碱基可以被包含在本文所公开的核酸中，并且包括，例如，次黄嘌呤核苷和7-脱氮鸟嘌呤(7-deazaguanine)。互补性无需是完全的；稳定的双链体可以包含错配碱基对或不匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员可以凭经验考虑一些变量来确定双链体的稳定性，所述变量包括，例如，寡核苷酸的长度、寡核苷酸的碱基组成和序列、离子强度和错配碱基对的发生率。在第一寡核苷酸与靶核酸的区域互补并且第二寡核苷酸与相同区域(或者该区域的部分)具有互补性的情况下，沿所述靶核酸的这一位置处就存在一种“重叠区”。重叠程度可以根据互补性的范围而变化。
本文所用术语“包含(包括)”定义为“主要包含(包括)，但不是必须唯一的”。而且，本领域技术人员会自发地将术语“包含(包括)”解读为包括“由……组成”。词语“包含(包括)”的变形，如“包含(包括)(动词原形)”以及“包含(包括)(第三人称单数)”，具有相应的各种含义。
本文所用术语“衍生物”定义为本发明的寡核苷酸的化学修饰，或者与所述寡核苷酸互补的多核苷酸序列的化学修饰。多核苷酸序列的化学修饰可以包括，例如，由烷基、酰基或氨基取代氢。
本文所用术语“片段”定义为一种寡核苷酸的全序列的不完整的或分离的部分，其包括赋予序列所述寡核苷酸的特征和功能的活性/结合位点。特别是，其可以短至少一个核苷酸或者氨基酸。更特别的是，所述片段包含能够使所述寡核苷酸与流感病毒结合的结合位点。例如，正向引物的片段可以包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：16的至少10、12、15、18或19个连续的核苷酸，和/或反向引物的片段可以包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18的至少10、12、15、18、19、20、22或24个连续的核苷酸。更特别的是，引物片段的长度可以为至少15个核苷酸。
本文所用术语“内对照(IC)分子”定义为体外转录的寡核苷酸分子，所述寡核苷酸分子是通过本发明的方法中使用的针对流感病毒的相同引物组进行共扩增的。特别是，所述IC可以在反应混合物中混合以监测PCR的运行，从而避免假阴性结果。用于检测该IC分子的探针可以特异性针对该分子的内部。该内部可以为人工设计的并且在自然界不会发生。
本发明上下文中使用的术语“流感病毒”包括所有落入“禽流感病毒”和“人流感病毒”范畴的流感病毒的亚型。所述流感病毒可以是A、B或C型流感病毒。特别是，所述A型流感病毒可以包括，但不限于H1N1、H3N2、H5N1、H5N2、H5N8、H5N9、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7和H9N2等。
本文所用术语“突变”定义为在核酸序列中一定长度的核苷酸的改变。本领域技术人员将理解的是，小的突变，特别是置换、缺失和/或插入的点突变对核苷酸的延长影响不大，特别是在所述核酸是用作探针时。因此，根据本发明的寡核苷酸包括至少一个核苷酸的替换、缺失和/或插入的突变。而且，根据本发明的寡核苷酸及其衍生物也可以用作探针，因此，本文所涉及的任何寡核苷酸也包括它们的突变和衍生物。例如，如果突变发生在靶基因的任何引物杂交位点的几个碱基位置处，特别是在5′-末端，引物的序列不会影响引物的灵敏性和特异性。
术语“生物样本中的核酸”是指任何包含核酸(RNA或DNA)的样本。特别是，核酸的来源是包括但不限于血液、唾液、脑脊髓液、胸膜腔积液、乳汁、淋巴液、痰和精液的生物样本。
根据一个方面，本发明提供了至少一种分离的寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：19、其片段、衍生物、突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列，基本由选自SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：19、其片段、衍生物、突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列组成，或者由选自SEQ IDNO：1到SEQ ID NO：19、其片段、衍生物、突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列组成。所述寡核苷酸可以能够与流感病毒结合和/或从流感病毒中被扩增。所述流感病毒可以选自A和/或B型流感病毒中。特别是，所述寡核苷酸可以用作引物和/或探针并且可用于特异性检测样本中的A和/或B型流感病毒的方法中，所述样本含有流感病毒株和/或其他不相关病毒/显微生物中的任一种或两种。这些本发明的引物和探针的核苷酸序列被设计成特异性地与A型流感病毒基因组和B型流感病毒基因组的区域杂交，所述区域相对于各个毒株的基因组是独特的，但是在各个毒株内很多病毒交叉中又是保守的。
根据本发明任一方面的引物可以用于区分A型流感和B型流感的基因型。特别是，根据本发明的引物可以用于区分A型流感病毒的不同亚型的基因型。甚至更特别的是，所述引物可以用于区分A型流感病毒和/或B型流感病毒的猪源H1N1分型确定、季节性H1N1和季节性H3N2等。
流感病毒可以为耐药性毒株。所述流感病毒的耐药性毒株可以对选自金刚烷胺(aantadine)、奥司他韦(oeltamivir)、金刚乙胺(rimantadine)和扎那米韦(zanamivir)等中的一种或多种药物有耐药性。所述流感病毒的耐药性毒株可以是对多种药物有耐药性的多药耐药性毒株。
所述寡核苷酸序列的长度可以在13至35个连接的核苷酸之间并且可以包含与选自SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：19中的任意序列的至少70％序列同一性。本领域技术人员将理解的是，给出的引物无需以100％的互补性杂交以有效地启动扩增反应中互补核酸链的合成。引物可以在一种或多种片段上杂交，以使插入片段或相邻片段没有参与杂交事件(例如，环结构或发夹结构)。特别是，所述寡核苷酸的序列可以具有与选自SEQ ID NO：1到SEQ IDNO：19中的任一序列的80％、85％、90％，、95％或98％的序列同一性。
序列同一性的70％到100％的变化范围，或者这其中的任何范围可以与公开的特异性引物序列相关。下述实例中描述了序列同一性的确定：一种长度为20个核苷酸的引物与另一种具有两个非全同残基的长度为20个核苷酸的引物一致，20个中具有18个相同残基(18/20＝0.9或90％序列同一性)。另一个实例中，一种长度为15个核苷酸的引物的所有残基与一种长度为20个核苷碱基的引物中的15个核苷酸的片段一致，就会与20个核苷酸的引物具有15/20＝0.75或75％的序列同一性。
同源性、序列同一性或者互补性的百分比可以通过，例如使用默认设置的Gap程序(Wisconsin序列分析包，UNIX版本8，遗传学计算机组，大学研究园，Madison WI)来确定，其采用Smith和Waterman的运算法则(Adv.Appl.Math.，1981，2，482-489)。技术人员能够计算出序列同一性百分比或者序列同源性百分比，并能够无需过多实验就能确定引物序列同一性的变化对引物行使其启动用于制备扩增产物的核酸互补链的合成的功能的影响。
根据另一个方面，本发明提供了至少一对寡核苷酸，其包括至少一种正向引物和至少一种反向引物，其中，所述正向引物包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：16，其片段，衍生物，突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列，基本由选自SEQID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQID NO：16，其片段，衍生物，突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列组成；或者由选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQID NO：13、SEQ ID NO：16，其片段，衍生物，突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列组成；以及所述反向引物包含选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18，其片段，衍生物，突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列；基本由选自SEQID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQID NO：17、SEQ ID NO：18，其片段，衍生物，突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列组成；或者由选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18，其片段，衍生物，突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列组成。
根据又一个方面，本发明提供了至少一组寡核苷酸，其包括根据本发明任一方面的一对寡核苷酸和至少一种探针。
所述探针可以包含选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQID NO：12、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：19，其片段，衍生物，突变和互补序列中的能够与扩增子结合的核苷酸序列；基本由选自SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：19，其片段，衍生物，突变和互补序列中的能够与扩增子结合的核苷酸序列组成；或者由选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQID NO：15和SEQ ID NO：19，其片段，衍生物，突变和互补序列中的能够与扩增子结合的核苷酸序列组成。
所述探针可以用荧光染料在其5′和3′末端标记。5′-标记荧光染料的实例可以包括，但不限于，6-羧基荧光素(FAM)、六氯-6-羧基荧光素(HEX)、四氯-ó-羧基荧光素和花青-5(Cy5)。3′-标记荧光染料的实例可以包括，但不限于，5-羧基四甲基若丹明(TAMRA)和黑洞猝灭剂-1，2，3(BHQ-1，2，3)。
本发明的寡核苷酸可以用于本领域中已知的各种核酸扩增技术，如，举例来说，聚合酶链式反应(PCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、耐热SDA(tSDA)或连接介导的扩增(LMA)。本发明的寡核苷酸也可以用于本领域普通技术人员已知的在不扩增的情况下通过直接与病毒核酸杂交来直接检测A和B型流感的各种方法中，或者用于检测病毒核酸的DNA或RNA拷贝或它们的互补。
根据本发明任一方面的寡核苷酸可以用于检测临床或培养样本的流感的方法中，其中，所述临床样本包括但不限于，鼻咽拭子、鼻拭子和咽喉拭子以及鼻咽分泌物和清洗物。所述临床样本可以在测试以前进行初步处理从而使病毒核酸的检测更有效。例如，可以收集样本并加入到运送培养基中以使病毒稳定。可以将鼻咽拭子、鼻拭子和咽喉拭子加入到运送培养基中。鼻咽分泌物和清洗物可以或不可以通过添加运送培养基而稳定。测试实验室一旦收到病毒，就可以将其灭活并溶解以释放病毒RNA。核酸可以任选地随后被提取从而除去后来的测试步骤的潜在的抑制剂或其他干扰剂。为了进行本发明的方法，可以将病毒核酸与对于特异性检测A型流感和/或B型流感必不可少的组分混合。
根据再一个方面，本发明提供了至少一种使用根据本发明任一方面的至少一种正向引物和至少一种反向引物从流感扩增的扩增子。
根据一个方面，本发明提供了至少一种检测和/或定量生物样本中流感病毒的存在的方法，所述方法包括步骤：
(a)提供至少一种生物样本；
(b)使根据本发明的任一方面的至少一种寡核苷酸、一对寡核苷酸或一组寡核苷酸，与生物样本中的至少一种核酸接触，和/或与从生物样本中提取、纯化和/或扩增的至少一种核酸接触；以及
(c)检测和/或定量从步骤(b)中的接触产生的任何结合，由此当检测到结合时流感病毒存在。
根据一个方面，本发明提供了至少一种扩增A和/或B型流感病毒核酸的方法，其中，所述方法包括：使用至少一种根据本发明任一方面的正向引物和根据本发明任一方面的反向引物进行聚合酶链式反应。
根据另一个方面，本发明提供了至少一种用于检测A和/或B型流感病毒的试剂盒，该试剂盒包括根据本发明任一方面的至少一种寡核苷酸、一对寡核苷酸或一组寡核苷酸。临床医生可以使用该试剂盒检测患有流感症状的患者中的人和禽流感病毒。这样的试剂盒将包括用于检测A型禽流感、A型流感或B型人流感的一种或多种引物和探针组。
用于检测A型禽流感、A型流感或B型人流感的引物和/或探针组可见于表1。
Figure BDA0000141413130000111
Figure BDA0000141413130000131
表1检测A型禽流感、A型流感或B型人流感的5组引物和/或探针。“Y”代表核苷酸C/T，“K”代表r G/T以及“R”代表核苷酸A/G。
一个方面，本发明提供了至少一组寡核苷酸，其包括：
-正向引物，其包含SEQ ID NO：1、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列，基本由SEQ ID NO：1、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成，或者由SEQ ID NO：1、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成；
-反向引物，其包含SEQ ID NO：2、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列，基本由SEQ ID NO：2、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成，或者由SEQ ID NO：2、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成；以及
-探针，其包含SEQ ID NO：3、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列，基本由SEQ ID NO：3、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成，或者由SEQ ID NO：3、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成。
根据本发明这方面的组能够与来自样本的A型流感病毒结合或者检测样本中的A型流感病毒。
根据另一个方面，本发明提供了至少一组寡核苷酸，其包括：
-正向引物，其包含SEQ ID NO：4、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列，基本由SEQ ID NO：4、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成，或者由SEQ ID NO：4、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成；
-反向引物，其包含SEQ ID NO：5、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列，基本由SEQ ID NO：5、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成，或者由SEQ ID NO：5、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成；以及
-探针，其包含SEQ ID NO：6、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列，基本由SEQ ID NO：6、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成，或者由SEQ ID NO：6、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成。
根据本发明的这方面的组能够与A型流感病毒结合和/或检测A型流感病毒。所述A型流感病毒可以是A型流感病毒的H1N1亚型。所述A型流感病毒可以是A型流感病毒的猪源H1N1亚型。
根据又一个方面，本发明提供了至少一组寡核苷酸，其包括：
-正向引物，其包含SEQ ID NO：7、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列，基本由SEQ ID NO：7、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成，或者由SEQ ID NO：7、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成；
-反向引物，其包含SEQ ID NO：8、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列，基本由SEQ ID NO：8、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成，或者由SEQ ID NO：8、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成；以及
-探针，其包含SEQ ID NO：9、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列，基本由SEQ ID NO：9、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成，或者由SEQ ID NO：9、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成。
根据本发明的这方面的组能够与A型流感病毒结合和/或检测A型流感病毒。所述A型流感病毒可以是A型流感病毒的H1N1亚型。所述A型流感病毒可以是A型流感病毒的猪源H1N1亚型。
根据又一个方面，本发明提供了至少一组寡核苷酸，其包括：
-正向引物，其包含SEQ ID NO：10、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列，基本由SEQ ID NO：10、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成，或者由SEQ ID NO：10、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成；
-反向引物，其包含SEQ ID NO：11、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列，基本由SEQ ID NO：11、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成，或者由SEQ ID NO：11、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成；以及
-探针，其包含SEQ ID NO：12、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列，基本由SEQ ID NO：12、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成，或者由SEQ ID NO：12、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成。
根据本发明的这方面的组能够与A型流感病毒结合和/或检测A型流感病毒。所述A型流感病毒可以是A型流感病毒的H1N1亚型。所述A型流感病毒可以是季节性H1N1。
根据一个方面，本发明提供了至少一组寡核苷酸，其包括：
-正向引物，其包含SEQ ID NO：13、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列，基本由SEQ ID NO：13、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成，或者由SEQ ID NO：13、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成；
-反向引物，其包含SEQ ID NO：14、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列，基本由SEQ ID NO：14、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成，或者由SEQ ID NO：14、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成；以及
-探针，其包含SEQ ID NO：15、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列，基本由SEQ ID NO：15、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成，或者由SEQ ID NO：15、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成。
根据本发明的这方面的组能够与A型流感病毒结合和/或检测A型流感病毒。所述A型流感病毒可以是A型流感病毒的H3N2亚型。所述A型流感病毒可以是A型流感病毒的猪源H3N2亚型。
根据再一个方面，本发明提供了至少一组寡核苷酸，其包括：
-正向引物，其包含SEQ ID NO：16、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列，基本由SEQ ID NO：16、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成，或者由SEQ ID NO：16、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成；
-反向引物，其包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列，基本由SEQ ID NO：17或SEQ IDNO：18、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成，或者由SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成；以及
-探针，其包含SEQ ID NO：19、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列，基本由SEQ ID NO：19、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成，或者由SEQ ID NO：19、其片段、衍生物、突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列组成。
根据本发明的这方面的组能够与B型流感病毒结合和/或检测B型流感病毒。
根据一个方面，本发明提供了至少一种扩增流感病毒核酸的方法，其中，所述方法包括使用根据本发明任一方面的寡核苷酸进行聚合酶链式反应。
根据本发明任一方面的方法可以进一步包括将内分子(IC)和特异性针对所述IC的探针与生物样本混合的步骤。使用IC可以提高流感诊断的效率，增加结果的准确性。
可以认为，通过参照经由举例所提供的下列实施例，将更加容易地理解上述内容，但是并不意欲限制本发明。
实施例
本领域已知的和未被具体说明的标准分子生物学技术通常在Sambrook和Russel的分子克隆：实验室指南，冷泉港实验室(Cold Springs HarborLaboratory)，纽约(2001)中描述。
实施例1
现已一般性地描述了本发明，通过参照经由举例所提供的下列实施例，将更加容易地理解本发明，但是并不意欲限制本发明。
4重检测
在热循环仪中，使用SuperScriptTM III RT/
Figure BDA0000141413130000171
Taq Mix(目录号11732-20，Invitrogen，USA)，在含有2.5μl的RNA样本、4对正向/反向引物(各引物的终浓度为0.15μM)、终浓度为0.1μM的所有4种探针的25μl的反应体积中进行基于荧光探针的实时一步RT-PCR。通过使用StratageneMx3000P(Stratagene，La Jolla，USA)进行热循环。随后在每个循环中读出荧光检测从而揭示阳性样本。所述4种引物对包括A145F/R(分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)、H1s142F/R(分别为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8)、H3-116F/R(分别为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14)以及B188F/R1，R2(分别为SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18)。4种相应的荧光探针包括A145-FAM(SEQ ID NO：3)、H1s142-HEX(SEQ ID NO：9)、H3-116-Cy5(SEQID NO：15)和B188-TxRd(SEQ ID NO：19)。
所述Stratagene Mx3000P(Stratagene，La Jolla，USA)采用下列步骤和条件使用：在55℃逆转录10分钟；在95℃初始激活Taq DNA聚合酶2.5分钟，随后进行42个循环：95℃变性17秒，55℃退火31秒和68℃延伸32秒。将荧光数据采集点设置在每个循环的55℃平稳的退火步骤。
对以下样本进行RT-PCR。
1.猪样H1N1，WHO从A/奥克兰/3/2009H1N1猪样流感提取的纯化RNA，澳大利亚。
从原种(-5)：10-5稀释，(-6)：10-6稀释，(-7)：10-7稀释。
2.H3N2，从患者提取的纯化RNA。
(-2)：10-2稀释，(-3)：10-3稀释。
3.B型流感，从由ATCC获得的病毒原种(VR-786)提取的纯化RNA。
(-5)：10-5稀释，(-6)：10-6稀释。
4.NTC，水。
结果示于表2中。针对循环数绘制循环阈值(Ct)并示于图1。
Figure BDA0000141413130000181
表2使用引物SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ IDNO：18的RT-PCR结果。
实施例2
用于凝胶电泳的H1s138引物对(SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5)
使用酶混合物、含有引物对(H1s138引物对(即SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5))的III
Figure BDA0000141413130000183
One-Step qRT-PCR试剂盒(目录号：11732-20)进行单重一步RT-PCR。通过溴化乙锭-琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
用以下样本进行PCR：
1.猪样H1N1，WHO从A/奥克兰/3/2009H1N1猪样流感提取的纯化RNA，澳大利亚，从原种(-6)：10-6稀释；
2.患者样本；以及
3.阴性对照，水。
结果示于表3中。电泳的结果示于图2。PCR产物的预期长度是138bp。从图2可以看出，引物特异性针对靶并且导致阳性对照和一些患者样本得到138bp条带。
预期重量：138bp
表3患者样本的电泳和4重(如实施例1)结果。
对同一患者样本使用如实施例1中解释的4重RT-PCR。结果示于表2中。可以看出，由于图2中呈阳性的患者样本(即，显示138bp条带)确定具有猪源H1N1，电泳的结果符合4重RT-PCR的结果。
参考文献
Sambrook and Russel，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSprings Harbor Laboratory，New York(2001).
Smith and Waterman Adv.Appl.Math.，1981，2，482-489.
Figure IDA0000141413190000011
Figure IDA0000141413190000021
Figure IDA0000141413190000031
Figure IDA0000141413190000041

Claims (39)

1.一种分离的寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：19、其片段、衍生物和互补序列中的至少一种核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸序列的长度在13至35个连接的核苷酸之间并且包含与SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：19中的任一序列的至少70％序列同一性。
3.一种分离的寡核苷酸，其由选自SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：19、其片段、衍生物和互补序列中的至少一种核苷酸序列组成。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的分离的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸能够与A和/或B型流感病毒结合和/或者从A和/或B型流感病毒扩增。
5.一对寡核苷酸，其包括至少一种正向引物和至少一种反向引物，其中，所述正向引物包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：16，其片段，衍生物和互补序列中的至少一种核苷酸序列；以及所述反向引物包含选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18，其片段，衍生物和互补序列中的至少一种核苷酸序列。
6.一对寡核苷酸，其包括至少一种正向引物和至少一种反向引物，其中，所述正向引物由选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：16，其片段，衍生物和互补序列中的至少一种核苷酸序列组成；以及所述反向引物由选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQID NO：18，其片段，衍生物和互补序列中的至少一种核苷酸序列组成。
7.一对寡核苷酸，其包括至少一种正向引物和至少一种反向引物，其中，所述正向引物包含SEQ ID NO：1、其片段、衍生物或互补序列，以及所述反向引物包含SEQ ID NO：2、其片段、衍生物或互补序列。
8.根据权利要求7所述的一对寡核苷酸序列，其能够与A型流感病毒结合和/或从A型流感病毒扩增。
9.一组寡核苷酸，其包括根据权利要求7或8所述的一对寡核苷酸和至少一种探针，所述探针包含SEQ ID NO：3、其片段、衍生物或互补序列的核苷酸序列。
10.一对寡核苷酸，其包括至少一种正向引物和至少一种反向引物，其中，所述正向引物包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7，其片段，衍生物和互补序列中的至少一种核苷酸序列；以及所述反向引物包含SEQ ID NO：5、SEQID NO：8，其片段，衍生物，突变或互补序列中的至少一种核苷酸序列。
11.根据权利要求10所述的一对寡核苷酸，其中，所述正向引物包含SEQ ID NO：4、其片段、衍生物或互补序列，以及所述反向引物包含SEQ IDNO：5、其片段、衍生物或互补序列。
12.根据权利要求10所述的一对寡核苷酸，其中，所述正向引物包含SEQ ID NO：7、其片段、衍生物或互补序列，以及所述反向引物包含SEQ IDNO：8、其片段、衍生物或互补序列。
13.根据权利要求10～12中任一项所述的一对寡核苷酸，其能够与A型流感病毒结合和/或者从A型流感病毒扩增。
14.根据权利要求13所述的一对寡核苷酸，其中，所述A型流感病毒是A型流感病毒的H1N1亚型。
15.根据权利要求13或14所述的一对寡核苷酸，其中，所述A型流感病毒是A型流感病毒的猪源H1N1亚型。
16.一组寡核苷酸，其包括根据权利要求10～15中任一项所述的一对寡核苷酸和至少一种探针，所述探针包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9、其片段、衍生物或互补序列的核苷酸序列。
17.一组寡核苷酸，其包括根据权利要求11所述的一对寡核苷酸和至少一种探针，所述探针包含SEQ ID NO：6、其片段、衍生物或互补序列的核苷酸序列。
18.一组寡核苷酸，其包括根据权利要求12所述的一对寡核苷酸和至少一种探针，所述探针包含SEQ ID NO：9、其片段、衍生物或互补序列的核苷酸序列。
19.一对寡核苷酸，其包括至少一种正向引物和至少一种反向引物，其中，所述正向引物包含SEQ ID NO：10、其片段、衍生物或互补序列，以及所述反向引物包含SEQ ID NO：11、其片段、衍生物或互补序列。
20.根据权利要求19所述的一对寡核苷酸，其能够与A型流感病毒结合和/或者从A型流感病毒扩增。
21.根据权利要求20所述的一对寡核苷酸，其中，所述A型流感病毒是A型流感病毒的季节性H1N1亚型。
22.一组寡核苷酸，其包括根据权利要求19～21中任一项所述的一对寡核苷酸和至少一种探针，所述探针包含SEQ ID NO：12、其片段、衍生物或互补序列的核苷酸序列。
23.一对寡核苷酸，其包括至少一种正向引物和至少一种反向引物，其中，所述正向引物包含SEQ ID NO：13、其片段、衍生物或互补序列，以及所述反向引物包含SEQ ID NO：14、其片段、衍生物或互补序列。
24.根据权利要求23所述的一对寡核苷酸，其能与A型流感病毒结合和/或者从A型流感病毒扩增。
25.根据权利要求24所述的一对寡核苷酸，其中，所述A型流感病毒是A型流感病毒的季节性H3N2亚型。
26.一组寡核苷酸，其包括根据权利要求23～25中任一项所述的一对寡核苷酸和至少一种探针，所述探针包含SEQ ID NO：15、其片段、衍生物或互补序列的核苷酸序列。
27.一对寡核苷酸，其包括至少一种正向引物和至少一种反向引物，其中，所述正向引物包含SEQ ID NO：16、其片段、衍生物或互补序列；以及所述反向引物包括SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18，其片段，衍生物或互补序列中的至少一种核苷酸序列。
28.根据权利要求27所述的一对寡核苷酸，其能与B型流感病毒结合和/或者从B型流感病毒扩增。
29.一组寡核苷酸，其包括根据权利要求27或28所述的一对寡核苷酸和至少一种探针，所述探针包含SEQ ID NO：19、其片段、衍生物或互补序列的核苷酸序列。
30.一种使用至少一种正向引物和至少一种反向引物从A和/或B型流感病毒扩增的扩增子，其中，所述正向引物包含选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：16，其片段，衍生物和互补序列中的至少一种核苷酸序列；所述反向引物包含选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18，其片段，衍生物和互补序列中的核苷酸序列。
31.根据权利要求30所述的扩增子，其中，至少一种探针能够与所述扩增子结合，所述探针包含选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：19，其片段，衍生物和互补序列中的核苷酸序列。
32.一种检测和/或定量生物样本中流感存在的方法，该方法包括步骤：
(a)提供至少一种生物样本；
(b)使至少一种根据权利要求1～4中任一项所述的寡核苷酸，与生物样本中的至少一种核酸接触，和/或与从生物样本中提取、纯化和/或扩增的至少一种核酸接触；以及
(c)检测和/或定量从步骤(b)中的接触产生的任何结合，由此当检测到结合时所述病毒存在。
33.一种检测和/或定量生物样本中A和/或B型流感病毒存在的方法，该方法包括步骤：
(a)提供至少一种生物样本；
(b)使根据权利要求9、16～18、22、26或29中任一项所述的一组寡核苷酸，与生物样本中的至少一种核酸接触，和/或与从生物样本中提取、纯化和/或扩增的至少一种核酸接触；以及
(c)检测和/或定量从步骤(b)中的接触产生的任何结合，由此当检测到结合时所述病毒存在。
34.根据权利要求32或32所述的方法，其中，所述流感病毒是A型流感病毒或B型流感病毒。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述A型流感病毒的亚型选自猪源H1N1、季节性H1N1和季节性H3N2中。
36.根据权利要求32～35中任一项所述的方法，其进一步包括在步骤(a)之后将内分子(IC)和特异性针对所述IC的探针与生物样本混合的步骤。
37.一种用于检测A和/或B型流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包括至少一种根据权利要求1～4中任一项所述的寡核苷酸。
38.一种用于检测A和/或B型流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包括至少一对根据权利要求5～8、10～15、19～21、23～25或27～28中任一项所述的寡核苷酸。
39.一种用于检测A和/或B型流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包括至少一组根据权利要求9、16～18、22、26或29中任一项所述的寡核苷酸。
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