CN106636472A - 检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂与方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂与方法。本发明公开的检测或辅助检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂，由名称为M‑P的引物对和名称为ChPV‑P的引物对组成；M‑P由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成；ChPV‑P由序列表中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链DNA组成。实验证明，本发明的检测或辅助检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂和方法特异好，能特异检测禽流感病毒与鸡细小病毒，敏感性高，检测禽流感病毒与鸡细小病毒的敏感性均为100fg，准确性好，可用于检测禽流感病毒与鸡细小病毒。

Description

检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂与方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂与方法。
背景技术
禽流感(Avian influenza，AI)是禽流行性感冒的简称，是一种由A型流感病毒引起的禽类(包括家禽和野禽)的感染，被世界动物卫生组织(OIE)和我国规定为A类动物疫病。根据禽流感致病性的不同，可分为高致病性禽流感(HPAI)和低致病性禽流感(LPAI)，其中以高致病性禽流感最为严重，该病毒不仅会在家禽中迅速传播，造成极高的死亡率，还会跨越物种传染屏障，从禽类传染到了人类。随着禽流感在我国以及全球频繁暴发，疫情范围不断扩大，禽流感暴发对经济和社会的影响已成共识，其影响程度将随着全球化发展日益加剧。鸡细小病毒(Chincken parvovirus，ChPV)是一种线性单链DNA病毒，ChPV是引发病毒性肠道疾病的病原体之一，其特征是发育不良、腹泻、饲料转化率低、高死亡率，尤其在幼禽肠炎中表现更高的死亡率。可见，这两种病毒引发的疾病对养禽业的发展造成严重的危害。
病原分离鉴定是针对病毒性疾病诊断常规的方法，但是该方法耗时长，针对多种病毒混合感染时又难以进行快速鉴别诊断。由于ChPV复制方式上具有独特性，在鸡胚和细胞中难以正常增殖，进一步加大该病毒的诊断难度。PCR技术直接以病原体的RNA或DNA为研究对象，检测组织中是否存在病原的核酸，可以快速准确的诊断出其有无病原体感染。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何同时检测禽流感病毒与鸡细小病毒。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测或辅助检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂。
本发明所提供的检测或辅助检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂，由名称为M-P的引物对和名称为ChPV-P的引物对组成；
所述M-P由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA(即M-F和M-R)组成；所述ChPV-P由序列表中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链DNA组成(即ChPV-F和ChPV-R)。
上述成套试剂中，所述M-P与所述ChPV-P均可独立包装。所述M-P的两条单链DNA均可独立包装。所述M-P的两条单链DNA的摩尔比可为1:1。所述ChPV-P的两条单链DNA均可独立包装。所述ChPV-P的两条单链DNA的摩尔比可为1:1。
上述成套试剂中，所述M-P与所述ChPV-P可以单独使用分别进行单独的PCR，也可以组合使用进行二重PCR。
这两种引物对单独使用时，本申请的检测或辅助检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂中这两种引物对的配比没有要求。这两种引物对组合使用时，所述M-P与所述ChPV-P的摩尔比为3：5。
为解决上述技术问题，本发明还提供了PCR引物对。
本发明所提供的PCR引物对为所述M-P和所述ChPV-P。所述M-P为检测或辅助检测禽流感病毒的引物对，所述ChPV-P为检测或辅助检测鸡细小病毒的引物对ChPV-P。
为解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测禽流感病毒与鸡细小病毒的系统。
本发明所提供的检测或辅助检测禽流感病毒与鸡细小病毒的系统含有所述成套试剂。
为解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测禽流感病毒的系统。
本发明所提供的检测或辅助检测禽流感病毒的系统含有所述M-P。
为解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测鸡细小病毒的系统。
本发明所提供的检测或辅助检测鸡细小病毒的系统含有所述ChPV-P。
上述各系统均还可包括DNA聚合酶。所述DNA聚合酶具体可为北京全式金生物技术有限公司的2×Easy Taq PCR Super Mix中DNA聚合酶。
上述各系统还均可包括进行PCR扩增的仪器。
所述检测或辅助检测禽流感病毒与鸡细小病毒的系统可由所述成套试剂与所述DNA聚合酶组成。所述检测或辅助检测禽流感病毒的系统可由所述M-P与所述DNA聚合酶组成。所述检测或辅助检测鸡细小病毒的系统可由所述ChPV-P与所述DNA聚合酶组成。
上述各系统均可为试剂或试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明还提供了非诊断目的的检测禽流感病毒和鸡细小病毒的方法。
本发明所提供的非诊断目的的检测禽流感病毒和鸡细小病毒的方法，包括：利用所述成套试剂对待测样品进行二重PCR扩增，根据PCR产物确定所述待测样品是否含有禽流感病毒和鸡细小病毒：所述PCR产物含有658bp和305bp的DNA片段，所述待测样品含有或候选含有禽流感病毒和鸡细小病毒；所述PCR产物含有658bp的DNA片段且不含305bp的DNA片段，所述待测样品含有或候选含有禽流感病毒且不含或候选不含鸡细小病毒；所述PCR产物不含658bp的DNA片段且含有305bp的DNA片段，所述待测样品不含或候选不含禽流感病毒且含有或候选含有鸡细小病毒；所述PCR产物不含658bp和305bp的DNA片段，所述待测样品不含或候选不含禽流感病毒和鸡细小病毒。
上述方法中，所述利用所述成套试剂对待测样品进行二重PCR扩增可为在同一个PCR扩增体系中，以所述待测样品的核酸(RNA或DNA)为模板，选用56-59℃的退火温度，用所述成套试剂进行PCR扩增得到PCR产物。所述退火温度具体可为56℃、57℃、58℃或59℃。
所述PCR扩增体系中，所述M-P的两条单链DNA的浓度均可为0.3-0.5pmol/μL，如0.3pmol/μL、0.4pmol/μL或0.5pmol/μL。所述ChPV-P的两条单链DNA的浓度均可为0.3-0.7pmol/μL，如0.5pmol/μL。
所述PCR扩增体系具体可含有：2×Easy Taq PCR Super Mix(北京全式金生物技术有限公司)；所述M-P的两条单链DNA；所述ChPV-P的两条单链DNA；所述待测样品，超纯水。
所述PCR扩增的反应条件具体可为：95℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s,72℃延伸1min，共30-35个循环；72℃延伸10min；4℃结束扩增。所述30-35个循环具体可为35、30、32或34个循环。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述X1或X2的方法：
X1、非诊断目的的检测禽流感病毒的方法，包括：利用所述M-P对待测样品进行PCR扩增，根据PCR产物确定所述待测样品是否含有禽流感病毒：所述PCR产物含有658bp的DNA片段，所述待测样品含有或候选含有禽流感病毒；所述PCR产物不含658bp的DNA片段，所述待测样品不含或候选不含禽流感病毒；
X2、非诊断目的的检测鸡细小病毒的方法，包括：利用所述ChPV-P对待测样品进行PCR扩增，根据PCR产物确定所述待测样品是否含有鸡细小病毒：所述PCR产物含有305bp的DNA片段，所述待测样品含有或候选含有鸡细小病毒；所述PCR产物不含305bp的DNA片段，所述待测样品不含或候选不含鸡细小病毒。
上述X1的方法中，所述利用所述M-P对待测样品进行PCR扩增可为以所述待测样品的核酸(RNA或DNA)为模板，选用56-59℃的退火温度，用所述成套试剂进行PCR扩增得到PCR产物。所述退火温度具体可为56℃、57℃、58℃或59℃。
所述PCR扩增体系中，所述M-P的两条单链DNA的浓度均可为0.3-0.5pmol/μL，如0.3pmol/μL、0.4pmol/μL或0.5pmol/μL。
所述PCR扩增体系具体可含有：2×Easy Taq PCR Super Mix(北京全式金生物技术有限公司)；所述M-P的两条单链DNA；所述待测样品，超纯水。
上述X2的方法中，所述利用所述ChPV-P对待测样品进行PCR扩增可为以所述待测样品的核酸(RNA或DNA)为模板，选用56-59℃的退火温度，用所述成套试剂进行PCR扩增得到PCR产物。所述退火温度具体可为56℃、57℃、58℃或59℃。
所述PCR扩增体系中，所述ChPV-P的两条单链DNA的浓度均可为0.3-0.7pmol/μL，如0.5pmol/μL。
所述PCR扩增体系具体可含有：2×Easy Taq PCR Super Mix(北京全式金生物技术有限公司)；所述ChPV-P的两条单链DNA；所述待测样品，超纯水。
上述X1和X2的方法中，所述PCR扩增的反应条件具体可为：95℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s,72℃延伸1min，共30-35个循环；72℃延伸10min；4℃结束扩增。所述30-35个循环具体可为35、30、32或34个循环。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述成套试剂或所述检测或辅助检测禽流感病毒与鸡细小病毒的系统的制备方法。
本发明所提供的所述成套试剂或所述检测或辅助检测禽流感病毒与鸡细小病毒的系统的制备方法，包括将所述成套试剂中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述PCR引物对或所述检测或辅助检测禽流感病毒的系统或所述检测或辅助检测鸡细小病毒的系统的制备方法，包括将所述PCR引物对中的所述两条单链DNA分别单独包装。
本发明中，658bp的DNA片段和305bp的DNA片段均可通过电泳进行检测。在电泳中，658bp的DNA片段可体现为在600-700bp间有一条带，305bp的DNA片段可体现为在300-400bp间有一条带。
本发明提供了检测或辅助检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂，并通过优化反应条件，建立了禽流感病毒与鸡细小病毒二重PCR检测方法。实验证明，本发明的检测或辅助检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂和方法特异好，能特异检测禽流感病毒与鸡细小病毒，并且一管反应就能同时检测禽流感病毒与鸡细小病毒，本发明的成套试剂与其它常见的禽病病原体均不反应；敏感性高，检测禽流感病毒与鸡细小病毒的敏感性均为100fg；准确性好，对159份临床样品检测结果与利用现有技术中的方法进行检测的结果一致。本发明建立的检测或辅助检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂与方法具有特异性好、灵敏度高的特点，能够快速、便捷、直观地检测禽流感病毒与鸡细小病毒，为同时检测这两种病毒具有重要的临床意义，对禽流感病毒与鸡细小病毒的防制具有重大意义。本发明采用多重PCR可以克服常规PCR存在对多种病原体混合感染检测时需要对样品进行逐项检测耗时耗力的缺点。
附图说明
图1为二重PCR扩增结果。
图2为特异性检测结果。
图3为敏感性试验结果。
图4为临床样品检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的H1N1亚型、H3N2亚型、H4N6亚型、H6N6亚型、H9N2亚型和H11亚型禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)和鸡细小病毒(ChPV)公众可从申请人处获得；H5N2、H7N2、H9N6、H14N5、H15N9和H16N3亚型禽流感病毒AIV灭活抗原经美国康涅狄格州大学禽病诊断研究室同意后，公众可从申请人处获得；H2N3、H8N4、H10N3、H12N5和H13N6亚型禽流感病毒AIV经香港大学同意后，公众可从申请人处获得。以上生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
H1N1亚型AIV:参考文献：Yi P,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection ofH3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification assay[J].Virology Journal,2011,8(1):1-10.，H1N1亚型AIV在该参考文献中的名称为“A/Duck/Guangxi/030D/2009(H1N1)”。
H2N3亚型AIV：参考文献：Yi P,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection ofH3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification assay[J].Virology Journal,2011,8(1):1-10.，H2N3亚型AIV在该参考文献中的名称为“A/Mallard/Alberta/77(H2N3)”。
H3N2亚型AIV：参考文献：Yi P,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection ofH3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification assay[J].Virology Journal,2011,8(1):1-10.，H3N2亚型AIV在该参考文献中的名称为“A/Duck/Guangxi/N42/2009(H3N2)”。
H4N6亚型AIV：参考文献：Luo S,Xie Z,Xie L,et al.Reverse-transcription,loop-mediated isothermal amplification assay for the sensitive and rapiddetection of H10 subtype avian influenza viruses[J].Virology Journal,2014,12(12):1-7.，H4N6亚型AIV在该参考文献中的名称为“A/Duck/Guangxi/070D/2010(H4N6)”。
H5N2亚型AIV：参考文献：Yi P,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection ofH3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification assay[J].Virology Journal,2011,8(1):1-10.，H5N2亚型AIV在该参考文献中的名称为“A/Turkey/GA/209092/02(H5N2)”。
H6N6亚型AIV：参考文献：Luo S,Xie Z,Xie L,et al.Reverse-transcription,loop-mediated isothermal amplification assay for the sensitive and rapiddetection of H10 subtype avian influenza viruses[J].Virology Journal,2014,12(12):1-7.，H6N6亚型AIV在该参考文献中的名称为“A/duck/Guangxi/GXd-4/2009(H6N6)”。
H7N2亚型AIV：参考文献：Luo S,Xie Z,Xie L,et al.Reverse-transcription,loop-mediated isothermal amplification assay for the sensitive and rapiddetection of H10 subtype avian influenza viruses[J].Virology Journal,2014,12(12):1-7.，H7N2亚型AIV在该参考文献中的名称为“A/Chicken/NY/273874/03(H7N2)”。
H8N4亚型AIV：参考文献：Yi P,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection ofH3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification assay[J].Virology Journal,2011,8(1):1-10.，H8N4亚型AIV在该参考文献中的名称为“A/Turkey/Ontario/6118/67(H8N4)”。
H9N2亚型AIV：参考文献：Yi P,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection ofH3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification assay[J].Virology Journal,2011,8(1):1-10.，H9N2亚型AIV在该参考文献中的名称为“A/Duck/Guangxi/RX/09(H9N2)”。
H10N3亚型AIV：参考文献：Xie Z，Pang Y S，Liu J,et al.A multiplex RT-PCRfor detection of type a influenza virus and differentiation of avian H5,H7andH9 hemagglutinin subtypes[J].Mol Cell Probes，2006，20(3-4)：245-249.，H10N3亚型AIV在该参考文献中的名称为“A/duck/HK/876/80(H10N3)”。
H11亚型AIV：参考文献：Yi P,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection ofH3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification assay[J].Virology Journal,2011,8(1):1-10.，H11亚型AIV在该参考文献中的名称为“A/Chicken/Guangxi/43C/09(H11)”。
H12N5亚型AIV：参考文献：Yi P,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection ofH3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification assay[J].Virology Journal,2011,8(1):1-10.，H12N5亚型AIV在该参考文献中的名称为“A/Duck/Alberta/60/76(H12N5)”。
H13N6亚型AIV：参考文献：Yi P,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection ofH3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification assay[J].Virology Journal,2011,8(1):1-10.，H13N6亚型AIV在该参考文献中的名称为“A/Gull/MD/704/77(H13N6)”。
H14N5亚型AIV：参考文献：Luo S,Xie Z,Xie L,et al.Reverse-transcription,loop-mediated isothermal amplification assay for the sensitive and rapiddetection of H10 subtype avian influenza viruses[J].Virology Journal,2014,12(12):1-7.，H14N5亚型AIV在该参考文献中的名称为“A/mallard duck/Astrakhan/263/1982(H14N5)”。
H15N9亚型AIV：参考文献：Luo S,Xie Z,Xie L,et al.Reverse-transcription,loop-mediated isothermal amplification assay for the sensitive and rapiddetection of H10 subtype avian influenza viruses[J].Virology Journal,2014,12(12):1-7.，H15N9亚型AIV在该参考文献中的名称为“A/wedge-tailed shearwater/Western Australia/2576/1979(H15N9)”。
H16N3亚型AIV：参考文献：Luo S,Xie Z,Xie L,et al.Reverse-transcription,loop-mediated isothermal amplification assay for the sensitive and rapiddetection of H10 subtype avian influenza viruses[J].Virology Journal,2014,12(12):1-7.，H16N3亚型AIV在该参考文献中的名称为"A/shorebird/Delaware/168/2006(H16N3)”。
新城疫病毒(NDV)：参考文献：Yi P,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection ofH3 subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification assay[J].Virology Journal,2011,8(1):1-10.，新城疫病毒(NDV)在该参考文献中的名称为“Newcastle disease virus(Lasota)”。
鸡细小病毒(ChPV)GX-CH-PV-7和GX-Tu-PV-2：参考文献：Genetic andphylogenetic analysis of a novel parvovirus isolated from chickens inGuangxi,China[J].Arch Virol(2016)161:3285–3289.。
实施例1、检测或辅助检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂的制备
本发明所提供的检测或辅助检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂，由检测或辅助检测禽流感病毒的引物对M-P和检测或辅助检测鸡细小病毒的引物对ChPV-P组成；M-P由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA(M-F)和SEQ ID No.2所示的单链DNA(M-R)组成，M-P可从禽流感病毒中扩增出大小为658bp的条带；ChPV-P由序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA(ChPV-F)和SEQ ID No.4所示的单链DNA(ChPV-R)组成，ChPV-P可从鸡细小病毒中扩增出大小为305bp的条带。SEQ ID No.3中，S为C或G。
上述检测或辅助检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂中，M-P和ChPV-P独立包装。每种引物对中的两条单链DNA的摩尔比均为1：1。
实施例2、检测或辅助检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂检测条件的优化
提取H1N1亚型AIV的基因组RNA和鸡细小病毒(ChPV)的基因组DNA，并将对H1N1亚型AIV的基因组RNA进行反转录得到cDNA，检测或辅助检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂的检测条件进行优化。
25μL二重PCR扩增体系：2×Easy Taq PCR Super Mix(北京全式金生物技术有限公司)12.5μL；M-F和M-R；ChPV-F和ChPV-R；模板(H1N1亚型AIV的基因组cDNA 1μL，鸡细小病毒(ChPV)的基因组DNA等体积混合)2μL，以超纯水补足25μL。
反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，退火温度56℃退火30s,72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min；4℃结束扩增。
1、引物浓度的优化
按照上述反应体系，调整M-F和M-R以及ChPV-F和ChPV-R在反应体系中的浓度，共有以下浓度：①M-F和M-R浓度均为0.5pmol/μL,ChPV-F和ChPV-R浓度均为0.5pmol/μL；②固定ChPV-F和ChPV-R浓度均为0.5pmol/μL,M-F和M-R浓度均为0.1、0.2、0.3和0.4pmol/μL。
结果：①当M-F和M-R浓度均为0.5pmol/μL，ChPV-F和ChPV-R浓度均为0.5pmol/μL时，AIV和ChPV均出现目的条带，但ChPV目的条带亮度低于AIV目的条带，进一步推断ChPV目的条带扩增效率低于AIV目的条带扩增效率；②当ChPV-F和ChPV-R浓度均为0.5pmol/μL,M-F和M-R浓度均为0.1和0.2pmol/μL时，未扩增出AIV目的条带，进一步推断M-F和M-R引物浓度过低；③当ChPV-F和ChPV-R浓度均为0.5pmol/μL M-F和M-R浓度均为0.4pmol/μL时，ChPV目的条带亮度低于AIV目的条带，进一步推断ChPV目的条带扩增效率低于AIV目的条带扩增效率；④当ChPV-F和ChPV-R浓度均为0.5pmol/μL M-F和M-R浓度均为0.3pmol/μL时，ChPV和AIV两条目的条带亮度一致，具有良好的扩增效率。
2、退火温度的优化
按照上述反应程序，调整退火温度，共有以下退火温度：53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃。
结果：当退火温度为53℃、54℃、55℃时，PCR扩增产物的特异性低、背景深；当退火温度为57℃、58℃、59℃时，PCR扩增产物目的条带亮度较暗；当退火温度为56℃时，PCR扩增产物的目的条带清晰、特异性强。
3、扩增循环数的优化
按照上述反应程序，调整扩增循环数，共有以下扩增循环数：30、32、34、35、36。
结果：当扩增循环数在30、32、34时，PCR扩增产物目的条带亮度较暗；当扩增循环数在36时，出现非特异性扩增；当扩增循环数在35时，PCR扩增产物的目的条带清晰，无非特异性扩增。
通过对引物浓度、扩增温度和扩增循环数的优化，最终确定二重PCR中最佳反应体系(25μL)为：2×Easy Taq PCR 12.5μL；M-F和M-R(25pmol/μL)各0.3μL；ChPV-F和ChPV-R(25pmol/μL)各0.5μL；模板(H1N1亚型AIV的基因组cDNA和鸡细小病毒(ChPV)的基因组DNA等体积混合)2μL，以超纯水补足25μL。
二重PCR最佳扩增反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s,72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min；4℃结束扩增。
利用最佳反应体系与最佳扩增反应程序对AIV和ChPV基因组核酸扩增，所用模板分别为H1N1亚型AIV的基因组cDNA和鸡细小病毒(ChPV)的基因组DNA等体积混合(图1中泳道1)、H1N1亚型AIV的基因组RNA(图1中泳道2)和鸡细小病毒(ChPV)的基因组DNA(图1中泳道3)，其结果与大小均与预期一致(图1)。图1中，M为DNA分子量标准；N为阴性对照(以水代替模板)。
实施例3、检测或辅助检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂的特异性
提取H1-H16AIV(H1N1亚型AIV、H2N3亚型AIV、H3N2亚型AIV、H4N6亚型AIV、H5N2亚型AIV、H6N6亚型AIV、H7N2亚型AIV、H8N4亚型AIV、H9N2亚型AIV、H10N3亚型AIV、H11亚型AIV、H12N5亚型AIV、H13N6亚型AIV、H14N5亚型AIV、H15N9亚型AIV和H16N3亚型AIV)以及新城疫病毒(NDV)的基因组RNA，并反转录得到cDNA，提取鸡细小病毒(ChPV)的基因组DNA，检测实施例1的成套试剂的特异性。
按照实施例2的最佳反应体系，将模板分别替换为模板1、模板2、模板3、模板4、ChPV基因组DNA 1、ChPV基因组DNA 2、H1N1亚型AIV、H2N3亚型AIV、H3N2亚型AIV、H4N6亚型AIV、H5N2亚型AIV、H6N6亚型AIV、H7N2亚型AIV、H8N4亚型AIV、H9N2亚型AIV、H10N3亚型AIV、H11亚型AIV、H12N5亚型AIV、H13N6亚型AIV、H14N5亚型AIV、H15N9亚型AIV和H16N3亚型AIV基因组RNA的反转录产物以及NDV基因组RNA的反转录产物，按照实施例2的最佳扩增反应程序进行二重PCR扩增，将得到的PCR扩增产物进行电泳，结果如图2所示。其中，模板1为H1N1亚型AIV基因组cDNA与ChPV基因组DNA 1等体积混合物，模板2为H3N2亚型AIV基因组cDNA与ChPV基因组DNA 1等体积混合物，模板3为H1N1亚型AIV基因组cDNA与ChPV基因组DNA 2等体积混合物，模板4为H3N2亚型AIV基因组cDNA与ChPV基因组DNA 2等体积混合物，ChPV基因组DNA 1为鸡细小病毒GX-CH-PV-7的基因组DNA，ChPV基因组DNA 2为鸡细小病毒GX-Tu-PV-2的基因组DNA。
图2中，M为DNA分子量标准；泳道1-4分别为模板1-4；泳道5和6分别为ChPV基因组DNA 1和ChPV基因组DNA 1；泳道7-22分别为H1N1亚型AIV、H2N3亚型AIV、H3N2亚型AIV、H4N6亚型AIV、H5N2亚型AIV、H6N6亚型AIV、H7N2亚型AIV、H8N4亚型AIV、H9N2亚型AIV、H10N3亚型AIV、H11亚型AIV、H12N5亚型AIV、H13N6亚型AIV、H14N5亚型AIV、H15N9亚型AIV和H16N3亚型AIV；泳道23为NDV；泳道24为阴性对照(以水代替模板)。
结果显示，泳道1-4均含有大小分别为658bp和305bp的两条带；泳道5和6均只含有大小为305bp的条带；泳道7-22均只含有大小为658bp的条带；泳道23和24均不含有任何条带。表明本发明的成套试剂可用来检测禽流感病毒与鸡细小病毒：PCR产物中若有大小分别为658bp和305bp的条带，表明待测样品中含有禽流感病毒与鸡细小病毒；PCR产物中若含有658bp的条带不含有305bp的条带，表明待测样品中含有禽流感病毒；PCR产物中若含有305bp的条带不含有658bp的条带，表明待测样品中含有鸡细小病毒；PCR产物中若无658bp和305bp的任何条带，表明待测样品中不含有禽流感病毒与鸡细小病毒。该实验结果说明实施例1的成套试剂能特异性地检测禽流感病毒与鸡细小病毒。
实施例4、检测或辅助检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂的敏感性
提取H1N1亚型AIV的基因组RNA，并反转录得到cDNA，提取鸡细小病毒(ChPV)的基因组DNA，将H1N1亚型AIV的基因组cDNA与鸡细小病毒(ChPV)的基因组DNA等量混合，得到H1N1亚型AIV cDNA与ChPV DNA浓度相同的混合物，将该混合用去离子水按10倍倍比稀释后作为模板，模板为以下模板A-G：模板A中H1N1亚型AIV cDNA与ChPV DNA浓度均为10ng/2μL，模板B中H1N1亚型AIV cDNA与ChPV DNA浓度均为1ng/2μL，模板C中H1N1亚型AIV cDNA与ChPV DNA浓度均为100pg/2μL，模板D中H1N1亚型AIV cDNA与ChPV DNA浓度均为10pg/2μL，模板E中H1N1亚型AIV cDNA与ChPV DNA浓度均为1pg/2μL，模板F中H1N1亚型AIV cDNA与ChPV DNA浓度均为100fg/2μL，模板G中H1N1亚型AIV cDNA与ChPV DNA浓度均为10fg/2μL，检测实施例1的成套试剂的敏感性。其中，模板A中每微升H1N1亚型AIV cDNA的含量相当于1.03×107拷贝H1N1亚型AIV，ChPV DNA的含量相当于1.03×107拷贝ChPV；模板B中每微升H1N1亚型AIV cDNA的含量相当于1.03×106拷贝H1N1亚型AIV，ChPV DNA的含量相当于1.03×106拷贝ChPV；模板C中每微升H1N1亚型AIV cDNA的含量相当于1.03×105拷贝H1N1亚型AIV，ChPV DNA的含量相当于1.03×105拷贝ChPV；模板D中每微升H1N1亚型AIV cDNA的含量相当于1.03×104拷贝H1N1亚型AIV，ChPV DNA的含量相当于1.03×104拷贝ChPV；模板E中每微升H1N1亚型AIV cDNA的含量相当于1.03×103拷贝H1N1亚型AIV，ChPV DNA的含量相当于1.03×103拷贝ChPV；模板F中每微升H1N1亚型AIV cDNA的含量相当于1.03×102拷贝H1N1亚型AIV，ChPV DNA的含量相当于1.03×102拷贝ChPV；模板G中每微升H1N1亚型AIV cDNA的含量相当于10.3拷贝H1N1亚型AIV，ChPV DNA的含量相当于10.3拷贝ChPV。
按照实施例2的最佳反应体系，将模板分别替换为模板A-G，按照实施例2的最佳扩增反应程序进行二重PCR扩增，将得到的PCR扩增产物进行电泳，结果如图3所示。图3中，M为DNA分子量标准；泳道1-7分别为模板A-G；泳道8为阴性对照(以水代替模板)。
结果显示，对模板A-F进行扩增均可以扩增出大小分别为658bp和305bp的目的条带，对模板G进行扩增不能扩增出目的条带，表明，实施例1的成套试剂检测AIV的敏感性为100fg/25μL的AIV基因组cDNA，检测ChPV的敏感性为100fg/25μL的ChPV基因组DNA。
实施例5、利用检测或辅助检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂检测实际样品
1、样品采集
从活禽市场采集鸡口腔和泄殖腔棉拭子159份，分别用含有抗生素的PBS溶液(PBS溶液中青霉素的浓度为0.8万单位/mL，硫酸链霉素的浓度为1.0万单位/mL，庆大霉素的浓度为0.5mg/mL，制霉菌素的浓度为0.5mg/mL)充分浸泡棉拭子(约4小时)，反复挤压和清洗棉拭子，8000rpm/min离心5min，得到159份棉拭子的上清液。
2、二重PCR检测禽流感病毒与鸡细小病毒
取步骤1的159份棉拭子的上清液(样品1-159)，按照MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction试剂盒说明书，分别提取并得到159份样品的核酸，对159份样品的核酸消化DNA后进行反转录，得到159份样品的cDNA，分别调整每份样品cDNA的浓度，使这159份样品的cDNA的浓度均为50ng/μL。对159份样品的核酸消化RNA后得到159份样品的基因组DNA，调整每份样品基因组DNA的浓度，使这159份样品的基因组DNA的浓度均为50ng/μL。
将同一样品编号的cDNA与基因组DNA等体积混合，作为模板，按照实施例2的最佳反应体系与最佳扩增反应程序进行PCR扩增，将得到的PCR扩增产物进行电泳，并将159份样品的PCR产物进行测序。重复检测3次以确保试验的准确性。利用实施例2中H1N1亚型AIV的基因组cDNA和鸡细小病毒(ChPV)的基因组DNA等体积混合液作为阳性对照。
根据电泳结果统计，159份临床样品中，3份样品(标注样品1-3)均含有658bp与305bp的条带，表明样品1-3为AIV与ChPV混合感染样品；44份样品(标注样品4-47)含有658bp的条带、不含有305bp的条带，表明样品4-47为AIV感染样品；21份样品(标注样品48-68)不含有658bp的条带、含有305bp的条带，表明样品48-68为ChPV感染样品，剩余91份样品(标注样品69-159)不含有658bp与305bp的条带，表明样品69-159既不含禽流感病毒，也不含鸡细小病毒(表1)；测序结果显示，样品1-3以及样品4-47的658bp的DNA片段的序列与AIV的目的片段的同源性均高达99％以上，样品1-3以及样品48-68的305bp的DNA片段的序列与ChPV的目的片段的同源性高达98％以上，表明所建立二重PCR具有较好的临床实用性。部分临床样品电泳检测结果如图4所示。图4中，M为DNA分子量标准；N为阴性对照(以水代替模板)；P为阳性对照；泳道6和11为含有AIV和ChPV的样品的结果；泳道2、8和12为只含有AIV的样品的结果；4和9为只含有ChPV的样品的结果；1、3、5、7、10和13为不含有AIV和ChPV的样品的结果。
3、常规方法检测禽流感病毒与鸡细小病毒
按照如下病毒分离方法检测棉拭子的上清液中AIV：取步骤1的159份棉拭子的上清液(样品1-159)分别接种SPF鸡胚，收集24-96h致死的鸡胚尿囊液和96h以上未致死的鸡胚尿囊液，取尿囊液进行血凝试验。结果显示(表1)，样品1-47具有血凝性，表明样品1-47含有禽流感病毒。
同时对相同159份样品用L.Zsak等人《Partial genome sequence analysis ofparvoviruses associated with enteric disease in poultry》文中引物(NS1F:5’-TATGATCTGTCAATGATTGACCAGCTGA-3’；NS2R:5’-GTACCACTCGAGAGGGTTCAGGGAGAT-3’)及反应条件(94℃预变性15min；94℃变性30s，55℃退火1min,68℃延伸3min，共33个循环；72℃延伸10min；4℃结束扩增)进行PCR扩增；PCR阳性产物送去上海Invitrogen公司进行序列鉴定。
结果显示，样品1-3与样品48-68均含有目的条带，用本发明的成套试剂进行检测ChPV结果与L.Zsak等人文献中检测ChPV的结果完全一致。
结果表明，用实施例1的成套试剂检测禽流感病毒与鸡细小病毒结果与利用现有技术中的方法确定的禽流感病毒与鸡细小病毒结果是完全一致的。因此，实施例1的成套试剂可以用来检测禽流感病毒与鸡细小病毒。
表1、159份棉拭子中禽流感病毒与鸡细小病毒的检测
注：常规方法中“+”表示含有相应病毒，“-”表示不含相应病毒；二重PCR中，“658bp”和“305bp”列中“+”表示含有相应条带，“-”表示不含相应条带，“检测结果”列中“+”表示含有相应病毒，“-”表示不含相应病毒。
对比例1、利用AIV对比引物和ChPV对比引物检测AIV和ChPV
利用表2中的引物检测AIV和ChPV，模板均为实施例3中H1-H16AIV(H1N1亚型AIV、H2N3亚型AIV、H3N2亚型AIV、H4N6亚型AIV、H5N2亚型AIV、H6N6亚型AIV、H7N2亚型AIV、H8N4亚型AIV、H9N2亚型AIV、H10N3亚型AIV、H11亚型AIV、H12N5亚型AIV、H13N6亚型AIV、H14N5亚型AIV、H15N9亚型AIV和H16N3亚型AIV)，ChPV基因组DNA 1、ChPV基因组DNA 2进行PCR扩增后，然后进行1.5％凝胶电泳。
PCR扩增的反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s,72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min；4℃结束扩增。
表2、AIV对比引物和ChPV对比引物
结果显示，引物对ChPV-F1与ChPV-R1和引物对ChPV-F2与ChPV-R2对ChPV基因组DNA 1和ChPV基因组DNA 2进行扩增均未扩增出目的条带；引物对AIV-F1与AIV-R1对H12N5亚型AIV、H13N6亚型AIV、H14N5亚型AIV、H15N9亚型AIV和H16N3亚型AIV进行扩增均未扩增出目的条带；引物对AIV-F2与AIV-R2对H7N2亚型AIV、H8N4亚型AIV、H12N5亚型AIV进行扩增均未扩增出目的条带。
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<120> 检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂与方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
cttctaaccg aggtcgaaac gta 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
gagtcccaat tgttctcatt gcc 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
asggcattcc aaacgtggat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
taagattggg gcctcaggga 20

Claims (10)

1.检测或辅助检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂，由名称为M-P的引物对和名称为ChPV-P的引物对组成；
所述M-P由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成；所述ChPV-P由序列表中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链DNA组成。
2.PCR引物对，为检测或辅助检测禽流感病毒的引物对M-P或检测或辅助检测鸡细小病毒的引物对ChPV-P，其特征在于：所述M-P由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成；所述ChPV-P由序列表中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链DNA组成。
3.检测或辅助检测禽流感病毒与鸡细小病毒的系统，其特征在于：所述系统含有权利要求1所述的成套试剂。
4.检测或辅助检测禽流感病毒的系统，其特征在于：所述系统含有权利要求2中所述M-P。
5.检测或辅助检测鸡细小病毒的系统，其特征在于：所述系统含有权利要求2中所述ChPV-P。
6.根据权利要求3或4或5所述的系统，其特征在于：所述系统还包括DNA聚合酶。
7.检测禽流感病毒和鸡细小病毒的方法，包括：利用权利要求1所述成套试剂对待测样品进行二重PCR扩增，根据PCR产物确定所述待测样品是否含有禽流感病毒和鸡细小病毒：所述PCR产物含有658bp和305bp的DNA片段，所述待测样品含有或候选含有禽流感病毒和鸡细小病毒；所述PCR产物含有658bp的DNA片段且不含305bp的DNA片段，所述待测样品含有或候选含有禽流感病毒且不含或候选不含鸡细小病毒；所述PCR产物不含658bp的DNA片段且含有305bp的DNA片段，所述待测样品不含或候选不含禽流感病毒且含有或候选含有鸡细小病毒；所述PCR产物不含658bp和305bp的DNA片段，所述待测样品不含或候选不含禽流感病毒和鸡细小病毒。
8.下述X1或X2的方法：
X1、检测禽流感病毒的方法，包括：利用权利要求1中所述M-P对待测样品进行PCR扩增，根据PCR产物确定所述待测样品是否含有禽流感病毒：所述PCR产物含有658bp的DNA片段，所述待测样品含有或候选含有禽流感病毒；所述PCR产物不含658bp的DNA片段，所述待测样品不含或候选不含禽流感病毒；
X2、检测鸡细小病毒的方法，包括：利用权利要求1中所述ChPV-P对待测样品进行PCR扩增，根据PCR产物确定所述待测样品是否含有鸡细小病毒：所述PCR产物含有305bp的DNA片段，所述待测样品含有或候选含有鸡细小病毒；所述PCR产物不含305bp的DNA片段，所述待测样品不含或候选不含鸡细小病毒。
9.权利要求1所述的成套试剂或权利要求3或6所述的系统的制备方法，包括将权利要求1所述成套试剂中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装。
10.权利要求2所述的PCR引物对或权利要求4或5或6述的系统的制备方法，包括将权利要求2所述的PCR引物对中的所述两条单链DNA分别单独包装。
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