CN109609690A - 用于检测禽流感病毒和/或禽流感病毒耐药性的核酸试剂、试剂盒、系统及方法 - Google Patents

用于检测禽流感病毒和/或禽流感病毒耐药性的核酸试剂、试剂盒、系统及方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种用于检测禽流感病毒和/或禽流感病毒耐药性的核酸试剂、试剂盒、系统及方法，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1‑8所示的引物和SEQ ID NO.11‑15所示的探针。本公开通过以上所述的引物和探针建立了检测禽流感病毒及其携带的常见耐药基因的核酸试剂、试剂盒、系统及方法，能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对禽流感病毒及其耐药性进行检测的敏感性、特异性和简便性。

Description

用于检测禽流感病毒和/或禽流感病毒耐药性的核酸试剂、试 剂盒、系统及方法
技术领域
本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种用于检测禽流感病毒和/或禽流感病毒耐药性的核酸试剂、试剂盒、系统及方法。
背景技术
每年冬春季节的禽流感病毒流行高峰，都对养殖业造成巨大威胁，而且会导致人的感染及死亡，人感染高致病性禽流感病毒的病死率高达50％。
迄今为止，高致病性禽流感均是由的H5和H7亚型禽流感病毒引起的。通常情况下，H5和H7亚型病毒以低致病性的形式稳定存在于自然宿主体内然而，仅有少部分H5和H7亚型禽流感毒株出现高致病性。这些病毒通过多种不同途径从贮存宿主向家禽传播。在易感家禽体内经过数轮循环感染之后(也可能是发生了适应性变异)，这些病毒会以跃进的方式突变为高致病性的形式。
核苷酸测序的研究表明，绝大多数高致病性禽流感病毒的HA基因具有共同的特征，HA正是病毒毒力的标签之一。人感染高致病性禽流感病毒后病情异常严重，被归因于HA蛋白切割位点增加的多个碱性氨基酸，这些碱性氨基酸使得HA被不同组织中的蛋白酶切割，有广泛的组织嗜性，能够形成肺外传播，造成更严重的症状和更高的病死率。
对流感病毒的治疗，目前针对性的抗病毒药物有金刚烷胺和奥司他韦，但近年来文献报道不断有新型耐药毒株出现。目前没有针对高致病性禽流感病毒的疫苗可供使用，缺少有针对性的防控手段，因此建立一种快速、准确、一体化的高致病性禽流感病毒的筛检方案，对于快速识别高致病性禽流感毒株和感染者，是应对高致病性禽流感病毒的最有力手段。快速鉴定高致病性病毒的耐药性，可为临床诊断治疗提供可行的技术支持。
当前流感病毒检测方法主要包括三类：抗原快速检测方法、病毒分离培养、血清学检测、核酸检测方法。病毒分离培养是病毒性疾病诊断的金标准，但其操作繁琐，检测时间长，且阳性率较低。免疫学方法(包括抗原检测、血清学检测方法)为传统分型的主要方法，但抗血清的来源很有限，无法满足临床病原诊断的要求，且免疫学方法无法对毒株的耐药性进行检测。而基于PCR等相关技术的分子生物学方法以其灵敏、快捷等优势得到极大发展。常用的PCR检测需要前期复杂的样本处理过程、繁琐的试验程序及复杂的结果判断。此外，高致病性突变和耐药突变的形式含点突变、插入片段、缺失片段等，普通TaqMan探针对点突变检测不够敏感，因而不能识别；插入片段和缺失片段会造成TaqMan探针法无法识别，无法获得可供判断的结果，造成假阴性或者误判。MGB探针能否较好的识别SNP位点，但整体通量有限，反应体系中不能加入超过两条以上的MGB探针；且MGB探针同样无法识别插入片段和缺失片段，无法获得可供判断的结果，造成假阴性或者误判。
常规的核酸类检测产品仅能判定是否是已知的病原或对已经的耐药位点进行检测，无法对新型的变异进行判定。
发明内容
本公开的目的是提供一种快速、准确的检测禽流感病毒和/或禽流感病毒耐药性的核酸试剂、试剂盒、系统及方法。
为了实现上述目的，本公开第一方面：提供一种用于检测禽流感病毒和/或禽流感病毒耐药性的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1-8所示的引物和SEQ ID NO.11-15所示的探针。
可选地，相对于1μM的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.2-8所示的引物的含量各自为0.05～0.5μM、0.5～1.5μM、0.05～0.5μM、0.5～1.5μM、0.05～0.5μM、0.5～1.5μM和0.05～0.5μM，分别由SEQ ID NO.11-15所示的探针的含量各自独立地为0.05～0.5μM。
可选地，所述核酸试剂还包括阳性内质控；
所述阳性内质控含有SEQ ID NO.9-10所示的引物和SEQ ID NO.16所示的探针。
可选地，SEQ ID NO.12-13所示的探针具有第一荧光标记；SEQ ID NO.11所示的探针具有第二荧光标记；SEQ ID NO.14所示的探针具有第三荧光标记；SEQ ID NO.15-16所示的探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自FAM荧光标记、JOE荧光标记、TAMRA荧光标记、CY5荧光标记、ROX荧光标记和Quasar670荧光标记中的一种。
可选地，所述禽流感病毒包括高致病性H5亚型禽流感病毒和/或高致病性H7亚型禽流感病毒，所述禽流感病毒耐药性包括禽流感病毒奥司他韦耐药性和/或禽流感病毒金刚烷胺耐药性。
本公开第二方面：提供一种用于检测禽流感病毒和/或禽流感病毒耐药性的试剂盒，该试剂盒含有本公开第一方面所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、DNA聚合酶、逆转录酶、镁离子、RNA酶抑制剂、dNTP和水中的至少一种。
本公开第三方面：提供本公开第一方面所述的核酸试剂在制备用于检测禽流感病毒和/或禽流感病毒耐药性的试剂盒中的用途。
本公开第四方面：提供一种用于检测禽流感病毒和/或禽流感病毒耐药性的系统，该系统包括装载有本公开第一方面所述的核酸试剂的PCR仪、计算装置和输出装置，所述PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道，所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为FAM荧光通道、JOE荧光通道、TAMRA荧光通道、CY5荧光通道、ROX荧光通道或Quasar670荧光通道；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
若第一荧光通道有Tm值为56.7℃对应的溶解峰曲线则判定为高致病性H7亚型禽流感病毒阳性；若第一荧光通道有Tm值为65.2℃对应的溶解峰曲线则判定为非高致病性H7亚型禽流感病毒阳性；
若第二荧光通道有Tm值为52.3℃对应的溶解峰曲线则判定为高致病性H5亚型禽流感病毒阳性；若第二荧光通道有Tm值为59.2℃对应的溶解峰曲线判定为非高致病性H5亚型禽流感病毒阳性；
若第三荧光通道有Tm值为52.4℃对应的溶解峰曲线判定样品具有奥司他韦耐药性；若第三荧光通道有Tm值为62.7℃对应的溶解峰曲线判定样品不具有奥司他韦耐药性；
若第四荧光通道有Tm值为54.9℃对应的溶解峰曲线判定样品具有金刚烷胺耐药性；若第四荧光通道有Tm值为62.5℃对应的溶解峰曲线判定样品不具有金刚烷胺耐药性；若第四荧光通道有Tm值为46℃对应的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格。
本公开第四方面：提供一种用于检测禽流感病毒和/或禽流感病毒耐药性的方法，其中，该方法包括：采用本公开第一方面所述的核酸试剂，对待测样本的核酸进行PCR扩增；进行所述PCR扩增的PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地选自FAM荧光通道、JOE荧光通道、TAMRA荧光通道、CY5荧光通道、ROX荧光通道或Quasar670荧光通道；并且进行如下的判别：
若第一荧光通道有Tm值为56.7℃对应的溶解峰曲线则判定为高致病性H7亚型禽流感病毒阳性；若第一荧光通道有Tm值为65.2℃对应的溶解峰曲线则判定为非高致病性H7亚型禽流感病毒阳性；
若第二荧光通道有Tm值为52.3℃对应的溶解峰曲线则判定为高致病性H5亚型禽流感病毒阳性；若第二荧光通道有Tm值为59.2℃对应的溶解峰曲线判定为非高致病性H5亚型禽流感病毒阳性；
若第三荧光通道有Tm值为52.4℃对应的溶解峰曲线判定样品具有奥司他韦耐药性；若第三荧光通道有Tm值为62.7℃对应的溶解峰曲线判定样品不具有奥司他韦耐药性；
若第四荧光通道有Tm值为54.9℃对应的溶解峰曲线判定样品具有金刚烷胺耐药性；若第四荧光通道有Tm值为62.5℃对应的溶解峰曲线判定样品不具有金刚烷胺耐药性；若第四荧光通道有Tm值为46℃对应的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格。
本公开的有益效果在于：
本公开通过ParaDNA及Hybeacon探针技术检测高致病性禽流感病毒及其耐药毒株，能够实现形态学、免疫学及RT-PCR检测所无法完成的快速、全面、敏感、特异、自动的结果判定，达到如下的检测效果：
(一)较高的高致病性禽流感检测能力
本公开所建立的方法，不仅克服传统taqman和MGB探针在识别插入和缺失等突变形式上检测能力不足，有效区分高致病性和非高致病性的禽流感病毒株；同时在检测通量上较taqman和MGB探针也有大幅提升，与taqman探针最多检测4-5个目标，MGB探针检测两个目标相比，本公开所建立的方法，在识别高致病性与非高致病性H5、H7亚型禽流感病毒的基础上，还可在一次的反应中检出耐药相关毒株。
(二)发现新的高致病性禽流感毒株和新的耐药突变
本公开所建立的方法，可识别在探针方案覆盖位点出现的新突变，毒株中引入新的突变会产生不同的溶解曲线，借此帮助研究者发现新的高致病突变或者耐药位点。
(三)简易的操作环节
便悬液样本可通过采样器直接放置于ParaDNA的反应器中直接检测即可获得可靠的结果，避免了昂贵费时的样本提取步骤，实现了除专业实验室外的应急检测。
(四)较高程度的检测一体化
本公开针对多种病原体检测的需求，提供了一套全面、快速、准确及操作简便的检测高致病性禽流感病毒的一体化解决方案，包括了核酸的快速提取、荧光PCR扩增及自动化结果的判定。
(五)特异性好
Hybeacon探针可识别引物结合区的SNP，使得其对非检测目标有极强的辨识能力。本公开所建立的检测方法特异性体现在一整套引物探针的特异性：所有引物探针都经过blast比对分析，具有高度的保守性和特异性；同时经过特异性实验验证能够很好的区分包括甲型H1N1亚型流感病毒、季节性H3亚型流感病毒、H9亚型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒、博卡病毒、B族链球菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等在内的多种病原体。
(六)最低检出限
本公开所建立的检测方法的最低检出限可达到10拷贝/反应。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开第一方面：提供一种用于检测禽流感病毒和/或禽流感病毒耐药性的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1-8所示的引物和SEQ ID NO.11-15所示的探针。
本公开通过ParaDNA及Hybeacon探针技术检测禽流感病毒和/或禽流感病毒耐药性，可快速、准确、一体化地检测高致病性H5亚型和H7亚型禽流感病毒及其耐药株。
Hybeacon探针技术对探针的要求较高，探针的Tm值尤为重要；此外，探针与引物的组合效果对扩增效果也有重要的影响。上述引物和探针在设计过程中，不仅考虑到了不同目标基因的引物和探针在一个反应体系内共扩增的问题，即评估Tm值、目标对应探针的Tm值的差值、GC含量、避免出现发夹结构及二聚体等情况，而且要保证备选引物和探针区段分别能够全面覆盖上述多种禽流感病毒，特异性良好并且覆盖度高。
进一步地，相对于1μM的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.2-8所示的引物的含量各自可以为0.05～0.5μM、0.5～1.5μM、0.05～0.5μM、0.5～1.5μM、0.05～0.5μM、0.5～1.5μM和0.05～0.5μM，分别由SEQ ID NO.11-15所示的探针的含量各自独立地可以为0.05～0.5μM。
根据本公开，为做好质量控制，所述核酸试剂还可以包括阳性内质控。进一步地，所述阳性内质控可以含有SEQ ID NO.9-10所示的引物和SEQ ID NO.16所示的探针。这时，相对于1μM的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.9-10所示的引物的含量各自可以为0.5～1.5μM和0.05～0.5μM，由SEQ ID NO.16所示的探针的含量可以为0.05～0.3μM。通过加入所述阳性内质控，可以有效地提示因为操作失误、PCR抑制物等原因造成的假阴性检测结果。
根据本公开，可以根据探针各自的Tm值进行荧光标记的排列组合，使得同一体系中的不同探针的扩增被分别识别。其中，SEQ ID NO.12-13所示的探针可以具有第一荧光标记；SEQ ID NO.11所示的探针可以具有第二荧光标记；SEQ ID NO.14所示的探针可以具有第三荧光标记；SEQ ID NO.15-16所示的探针可以具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自FAM荧光标记、JOE荧光标记、TAMRA荧光标记、CY5荧光标记、ROX荧光标记和Quasar670荧光标记中的一种。作为一种特别优选的实施方式，SEQ ID NO.12-13所示的探针具有FAM荧光标记；SEQ ID NO.11所示的探针具有JOE荧光标记；SEQ ID NO.14所示的探针具有TAMRA荧光标记；SEQ ID NO.15-16所示的探针具有CY5荧光标记。探针中FAM为6-羧基荧光素，JOE为2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素，TAMRA为6-羧基四甲基罗丹明，CY5为5H-吲哚菁，ROX为6-羧基-X-罗丹明。
根据本公开，所述禽流感病毒可以包括高致病性H5亚型禽流感病毒和/或高致病性H7亚型禽流感病毒，所述禽流感病毒耐药性可以包括禽流感病毒奥司他韦耐药性和/或禽流感病毒金刚烷胺耐药性。
本公开第二方面：提供一种用于检测禽流感病毒和/或禽流感病毒耐药性的试剂盒，该试剂盒含有本公开第一方面所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、DNA聚合酶、逆转录酶、镁离子、RNA酶抑制剂、dNTP和水中的至少一种。
本公开的试剂盒能够实现快速、准确、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对禽流感病毒和/或禽流感病毒耐药性同时进行检测的敏感性、特异性和简便性。
本公开第三方面：提供本公开第一方面所述的核酸试剂在制备用于检测禽流感病毒和/或禽流感病毒耐药性的试剂盒中的用途。
本公开第四方面：提供一种用于检测禽流感病毒和/或禽流感病毒耐药性的系统，该系统包括装载有本公开第一方面所述的核酸试剂的PCR仪、计算装置和输出装置，所述PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道，所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为FAM荧光通道、JOE荧光通道、TAMRA荧光通道、CY5荧光通道、ROX荧光通道或Quasar670荧光通道；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
若第一荧光通道有Tm值为56.7℃对应的溶解峰曲线则判定为高致病性H7亚型禽流感病毒阳性；若第一荧光通道有Tm值为65.2℃对应的溶解峰曲线则判定为非高致病性H7亚型禽流感病毒阳性；
若第二荧光通道有Tm值为52.3℃对应的溶解峰曲线则判定为高致病性H5亚型禽流感病毒阳性；若第二荧光通道有Tm值为59.2℃对应的溶解峰曲线判定为非高致病性H5亚型禽流感病毒阳性；
若第三荧光通道有Tm值为52.4℃对应的溶解峰曲线判定样品具有奥司他韦耐药性；若第三荧光通道有Tm值为62.7℃对应的溶解峰曲线判定样品不具有奥司他韦耐药性；
若第四荧光通道有Tm值为54.9℃对应的溶解峰曲线判定样品具有金刚烷胺耐药性；若第四荧光通道有Tm值为62.5℃对应的溶解峰曲线判定样品不具有金刚烷胺耐药性；若第四荧光通道有Tm值为46℃对应的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格；
在各检测通道中出现非目标Tm值的溶解峰曲线，提示具有新的变异。
本公开第五方面：提供一种用于检测禽流感病毒和/或禽流感病毒耐药性的方法，其中，该方法包括：采用本公开第一方面所述的核酸试剂，对待测样本的核酸进行PCR扩增；进行所述PCR扩增的PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为FAM荧光通道、JOE荧光通道、TAMRA荧光通道、CY5荧光通道、ROX荧光通道或Quasar670荧光通道；并且进行如下的判别：
若第一荧光通道有Tm值为56.7℃对应的溶解峰曲线则判定为高致病性H7亚型禽流感病毒阳性；若第一荧光通道有Tm值为65.2℃对应的溶解峰曲线则判定为非高致病性H7亚型禽流感病毒阳性；
若第二荧光通道有Tm值为52.3℃对应的溶解峰曲线则判定为高致病性H5亚型禽流感病毒阳性；若第二荧光通道有Tm值为59.2℃对应的溶解峰曲线判定为非高致病性H5亚型禽流感病毒阳性；
若第三荧光通道有Tm值为52.4℃对应的溶解峰曲线判定样品具有奥司他韦耐药性；若第三荧光通道有Tm值为62.7℃对应的溶解峰曲线判定样品不具有奥司他韦耐药性；
若第四荧光通道有Tm值为54.9℃对应的溶解峰曲线判定样品具有金刚烷胺耐药性；若第四荧光通道有Tm值为62.5℃对应的溶解峰曲线判定样品不具有金刚烷胺耐药性；若第四荧光通道有Tm值为46℃对应的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格；
在各检测通道中出现非目标Tm值的溶解峰曲线，提示具有新的变异。
其中，所述PCR扩增的条件可以为：45℃-55℃，7-10min，98℃，60s，(98℃，10s，65℃，10s，30-40个循环)；溶解曲线分析：98℃，60s，35℃，60s，降率为1.0℃/s；80℃，5s，升率为0.5℃/s，该阶段收集荧光。
本公开的方法能快速敏感特异地实现高致病性H5亚型禽流感病毒、高致病性H7亚型禽流感病毒、奥司他韦耐药基因和金刚烷胺耐药基因的系统筛检，检测流程简单，结果自动判读且可靠，节省了时间、人力和试剂成本。
以下通过实施例进行进一步详细说明本公开，但是本公开并不因此受到任何限制。
以下实施例中试剂均为商购产品，引物、探针均在Biosearch(USA)公司合成。
实施例
1、引物、探针合成
按照表1所示的引物序列和表2所示的探针序列，进行序列合成。序列中Y代表简并碱基T/C；R代表简并碱基A/G；W代表简并碱基A/T；探针中FAM为6-羧基荧光素，JOE为2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素，TAMRA为6-羧基四甲基罗丹明，CY5为5H-吲哚菁。表2的探针序列中的括号表示括号左侧的t具有荧光标记，括号中的内容表示荧光标记的选择。
表1
表2
2、样本处理
使用与ParaDNA配套的采样器采集样本后，直接置于ParaDNA的反应器中即可扩增。
3、构建Hybeacon探针技术检测体系
聚合酶Phire Hot Start II DNA Polymerase(货号F122L)，Mg2+、dNTPS购自ThermoFisher公司，其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯；荧光检测仪为ParaDNA。
反应体系的配制如下：
按照如下操作配制反应体系：总体系30μL。5×Goscript Buffer 6μL，Phire HotStart II DNA Polymerase1-1.2μL，氯化镁溶液0.2μL(25mM)，dNTPS为0.4μL(10mM)，上游引物3μL(10μM)，下游引物0.9μL(10μM)，Hybeacon探针0.6μL(10μM)，逆转录酶1μL，模板10μL，剩余用水补足。
选择FAM、JOE、TAMRA、CY5作为报告基团，反应程序如下：50℃，10min，98℃，60s，(98℃，10s，65℃，10s，35个循环)；溶解曲线分析：98℃，60s，35℃，60s，降率为1.0℃/s；80℃，5s，升率为0.5℃/s，该阶段收集荧光。
反应结果判断：若FAM荧光通道有Tm值为56.7℃对应的溶解峰曲线则判定为高致病性H7亚型禽流感病毒阳性；若FAM荧光通道有Tm值为65.2℃对应的溶解峰曲线则判定为非高致病性H7亚型禽流感病毒阳性；
若JOE荧光通道有Tm值为52.3℃对应的溶解峰曲线则判定为高致病性H5亚型禽流感病毒阳性；若JOE荧光通道有Tm值为59.2℃对应的溶解峰曲线判定为非高致病性H5亚型禽流感病毒阳性；
若TAMRA荧光通道有Tm值为52.4℃对应的溶解峰曲线判定样品具有奥司他韦耐药性；若TAMRA荧光通道有Tm值为62.7℃对应的溶解峰曲线判定样品不具有奥司他韦耐药性；
若CY5荧光通道有Tm值为54.9℃对应的溶解峰曲线判定具有金刚烷胺耐药性；若CY5荧光通道有Tm值为62.5℃对应的溶解峰曲线判定样品不具有金刚烷胺耐药性；若CY5荧光通道有Tm值为46℃对应的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格。
4、特异性验证
选择含甲型H1N1亚型流感病毒、H5亚型禽流感病毒、季节性H3亚型流感病毒、H9亚型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒、博卡病毒、B族链球菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等病原的拭子样本(上述样本均来源于国家CDC)作为特异性评估样本，采用系统检测中的采样器采集拭子样本后，利用前期建立和优化的反应条件在ParaDNA上进行检测。
结果显示在阳性对照成立的条件下，待检目标均无特异性的溶解峰，表明本公开的核酸试剂能够有效区分检测目标与非检测目标，具有较好的特异性。
5、最低检出限验证
评估用检测样本：选取初始浓度为105拷贝/ul的高致病性H7亚型、H5亚型禽流感病毒核酸梯度稀释为104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、101拷贝/μL、2拷贝/μL，1拷贝/μL作为最低检出限评估的模板。
结果显示本公开试剂盒的最低检出限可达到10拷贝/反应。
6、覆盖度验证
选择10种来源不同的含高致病性H7亚型、H5亚型禽流感病毒样本核酸作为覆盖度评估用模板。按照以上所述反应体系及反应程序进行试验。
结果显示对所有来源的含高致病性H7亚型禽流感病毒样本均可覆盖检测出。
7、试剂盒的保存期试验
以100拷贝/μL的含高致病性H5亚型和H7亚型禽流感病毒及其耐药株样本作为评估用样本。在第0天时，分装成10份冻存于-70℃冰箱中。将组建完毕的试剂盒放置于-20℃保存，分别取0、10、15、30、60、90、120、150、180和360天的试剂盒进行保存期试验。
结果显示本公开试剂盒保存在-20℃冰箱，在不同保存期检测均为阳性，表明该试剂盒的保存期至少为一年。
对比例
1、引物、探针合成
按照表3和表4所示的引物、探针序列，进行序列合成。序列中Y代表简并碱基T/C；R代表简并碱基A/G；W代表简并碱基A/T；探针中FAM为6-羧基荧光素，JOE为2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素，TAMRA为6-羧基四甲基罗丹明，CY5为5H-吲哚菁。表4的探针序列中的括号表示括号左侧的t具有荧光标记，括号中的内容表示荧光标记的选择。
表3
表4
2、特异性验证
按照实施例的方法进行特异性验证。结果显示，对比例的引物、探针的反应结果均为阴性。
3、最低检出限验证
按照实施例的方法进行最低检出限验证。实施例与对比例的最低检出限对比如下表5。
表5
由表5可知，对于样本中痕量的高致病性禽流感病毒及其耐药毒株，本公开试剂盒比对比例有更强的检测能力。
4、覆盖度验证
按照实施例的方法进行覆盖度验证。实施例与对比例的覆盖度对比如下表6。
表6
实施例Tm(℃) 对比例Tm，(℃)
高致病性禽流感病毒H5亚型 52.3 54.6
非高致病性禽流感病毒H5亚型 59.2 55.4
人工合成——H5亚型探针覆盖位点有SNP位点 55.0 53.6
人工合成——H5亚型探针覆盖位点有插入位点 54.8 54.6
人工合成——H5亚型探针覆盖位点有缺失位点 49.8 ——
高致病性禽流感病毒H7亚型 56.7 60.1
非高致病性禽流感病毒H7亚型 65.2 64.1
人工合成——H7亚型探针覆盖位点有SNP位点 62.8 62.7
人工合成——H7亚型探针覆盖位点有插入位点 62.3 60.9
人工合成——H7亚型探针覆盖位点有缺失位点 59.2 60.1
奥司他韦耐药非高致病性禽流感病毒H5亚型 52.4 55.9
奥司他韦不耐药非高致病性禽流感病毒H5亚型 62.7 57.3
人工合成——奥司他韦耐药探针覆盖位点有SNP位点 58.6 56.8
人工合成——奥司他韦耐药探针覆盖位点有插入位点 57.6 ——
人工合成——奥司他韦耐药探针覆盖位点有缺失位点 56.9 56.4
金刚烷胺耐药非高致病性禽流感病毒H5亚型 54.9 61.3
金刚烷胺不耐药非高致病性禽流感病毒H5亚型 62.5 60.7
人工合成——金刚烷胺耐药探针覆盖位点有SNP位点 58.3 60.2
人工合成——金刚烷胺耐药探针覆盖位点有插入位点 57.1 ——
人工合成——金刚烷胺耐药探针覆盖位点有缺失位点 56.2 58.2
由表6可知，本试剂盒检测是否为高致病性禽流感病毒、分辨是否耐药毒株的分辨率(Tm差值)远远大于对比例。同时，本公开对未知新型变异的检测能力也优于对比例。本公开试剂盒的检测覆盖度远远大于对比例的检测覆盖度。
由实施例和对比例的对比可以看出，本公开可以检测出禽流感病毒及其携带的耐药基因，特异性高，最低检出限更低，覆盖度更广。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司
<120> 用于检测禽流感病毒和/或禽流感病毒耐药性的核酸试剂、试剂盒、系统及方法
<130> 12327ABT
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atacaccctc tcaccatcg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgccatcct ccctctataa 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcaacaggga tgaagaatgt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggccttccca tccattttca 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtaatggaca ggcctcatac aa 22
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccagttatcc ctgcacaca 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cctatcagaa acgaatggg 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gacgatcaag aatccacaa 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caaataatcc tctctttttt cttcttctct c 31
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggaagaggcc tatttggtgc tatagcg 27
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcctctcgca gtccgttttc 20
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccctaattat cactatgagg aatgctcct 29
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcgagtatca ttgggatctt gcac 24
<210> 16
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acctgaaggc tc 12
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acaccctctc accatcg 17
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gccatcctcc ctctataa 18
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cagttggaaa atgtccgaga t 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aattaggcct tcccatccat t 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
caagatcttc agaatagaaa a 21
<210> 22
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cctgcacaca catgtga 17
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtgcagatgc aacgattc 18
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aagacgatca agaatccaca a 21
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tccaagaaag ccaagtgtg 19
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tttgttgtgg ctgatgaact 20
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
taatcctctc ttttttcttc ttctctc 27
<210> 28
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gcctatttgg tgctatagcg ggtttc 26
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cgcagtccgt tttctctttg g 21
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ctaattatca ctatgaggaa tgctcc 26
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gttgctgcga gtatcattgg gat 23
<210> 32
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gtctctgtca g 11

Claims (9)

1.一种用于检测禽流感病毒和/或禽流感病毒耐药性的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1-8所示的引物和SEQ IDNO.11-15所示的探针。
2.根据权利要求1所述的核酸试剂，其中，相对于1μM的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.2-8所示的引物的含量各自为0.05～0.5μM、0.5～1.5μM、0.05～0.5μM、0.5～1.5μM、0.05～0.5μM、0.5～1.5μM和0.05～0.5μM，分别由SEQ ID NO.11-15所示的探针的含量各自独立地为0.05～0.5μM。
3.根据权利要求1所述的核酸试剂，其中，所述核酸试剂还包括阳性内质控；
所述阳性内质控含有SEQ ID NO.9-10所示的引物和SEQ ID NO.16所示的探针。
4.根据权利要求1所述的核酸试剂，其中，SEQ ID NO.12-13所示的探针具有第一荧光标记；SEQ ID NO.11所示的探针具有第二荧光标记；SEQ ID NO.14所示的探针具有第三荧光标记；SEQ ID NO.15-16所示的探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自FAM荧光标记、JOE荧光标记、TAMRA荧光标记、CY5荧光标记、ROX荧光标记和Quasar670荧光标记中的一种。
5.根据权利要求1～4中任意一项所述的核酸试剂，其中，所述禽流感病毒包括高致病性H5亚型禽流感病毒和/或高致病性H7亚型禽流感病毒，所述禽流感病毒耐药性包括禽流感病毒奥司他韦耐药性和/或禽流感病毒金刚烷胺耐药性。
6.一种用于检测禽流感病毒和/或禽流感病毒耐药性的试剂盒，该试剂盒含有权利要求1～5中任意一项所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、DNA聚合酶、逆转录酶、镁离子、RNA酶抑制剂、dNTP和水中的至少一种。
7.权利要求1～5中任意一项所述的核酸试剂在制备用于检测禽流感病毒和/或禽流感病毒耐药性的试剂盒中的用途。
8.一种用于检测禽流感病毒和/或禽流感病毒耐药性的系统，该系统包括装载有权利要求1～5中任意一项所述的核酸试剂的PCR仪、计算装置和输出装置，所述PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道，所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为FAM荧光通道、JOE荧光通道、TAMRA荧光通道、CY5荧光通道、ROX荧光通道或Quasar670荧光通道；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
若第一荧光通道有Tm值为56.7℃对应的溶解峰曲线则判定为高致病性H7亚型禽流感病毒阳性；若第一荧光通道有Tm值为65.2℃对应的溶解峰曲线则判定为非高致病性H7亚型禽流感病毒阳性；
若第二荧光通道有Tm值为52.3℃对应的溶解峰曲线则判定为高致病性H5亚型禽流感病毒阳性；若第二荧光通道有Tm值为59.2℃对应的溶解峰曲线判定为非高致病性H5亚型禽流感病毒阳性；
若第三荧光通道有Tm值为52.4℃对应的溶解峰曲线判定样品具有奥司他韦耐药性；若第三荧光通道有Tm值为62.7℃对应的溶解峰曲线判定样品不具有奥司他韦耐药性；
若第四荧光通道有Tm值为54.9℃对应的溶解峰曲线判定样品具有金刚烷胺耐药性；若第四荧光通道有Tm值为62.5℃对应的溶解峰曲线判定样品不具有金刚烷胺耐药性；若第四荧光通道有Tm值为46℃对应的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格。
9.一种用于检测禽流感病毒和/或禽流感病毒耐药性的方法，其中，该方法包括：采用权利要求1～5中任意一项所述的核酸试剂，对待测样本的核酸进行PCR扩增；进行所述PCR扩增的PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为FAM荧光通道、JOE荧光通道、TAMRA荧光通道、CY5荧光通道、ROX荧光通道或Quasar670荧光通道；并且进行如下的判别：
若第一荧光通道有Tm值为56.7℃对应的溶解峰曲线则判定为高致病性H7亚型禽流感病毒阳性；若第一荧光通道有Tm值为65.2℃对应的溶解峰曲线则判定为非高致病性H7亚型禽流感病毒阳性；
若第二荧光通道有Tm值为52.3℃对应的溶解峰曲线则判定为高致病性H5亚型禽流感病毒阳性；若第二荧光通道有Tm值为59.2℃对应的溶解峰曲线判定为非高致病性H5亚型禽流感病毒阳性；
若第三荧光通道有Tm值为52.4℃对应的溶解峰曲线判定样品具有奥司他韦耐药性；若第三荧光通道有Tm值为62.7℃对应的溶解峰曲线判定样品不具有奥司他韦耐药性；
若第四荧光通道有Tm值为54.9℃对应的溶解峰曲线判定样品具有金刚烷胺耐药性；若第四荧光通道有Tm值为62.5℃对应的溶解峰曲线判定样品不具有金刚烷胺耐药性；若第四荧光通道有Tm值为46℃对应的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格。
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