CN102251060A - A型流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片的制备和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种A型流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片的制备和使用方法。本发明基因芯片包括对季节性H1N1、甲型H1N1、季节性H3N2三种流感亚型进行奥司他韦和金刚胺类耐药检测的29条特异性寡核苷酸探针及1条质控探针、9条RT-PCR扩增用特异性引物和载体，全部探针分布在载体上。本发明还包括了基因芯片的制备方法，包括：1.引物探针的设计；2.探针的合成；3.芯片的制备。本发明还包括了基因芯片的使用方法，包括：1.流感病毒基因组RNA的提取；2.两组RT-PCR扩增；3.芯片杂交；4.杂交后清洗；5.芯片扫描；6.数据分析。本发明具有快速、准确、高通量、高灵敏度、高特异性的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种A型流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片的制备及使用方法，属生物芯片领域。
背景技术
流感病毒(influenza virus)根据病毒分类学属正粘病毒科(Orthomyxoviridae)。它的基因组是分节段的单股负链RNA。根据病毒核蛋白(NP)和膜蛋白(MP)抗原特性及其基因特性不同，把流感分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。其中A型流感病毒根据其表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白结构及其基因特征可以分为多个亚型，至今A型流感病毒已发现的血凝素有16个亚型(H1-16)，神经氨酸酶有9个亚型(N1-9)。由于流感病毒基因组RNA是分节段的，因此易产生同型不同株间基因重配。尤其是人A型流感病毒HA基因经常发生点突变，导致其编码的HA蛋白分子上的氨基酸序列发生替换，造成其抗原性经常不断的发生漂移，而每次抗原性漂移常常带来不同程度的流感流行。
流行性感冒(influenza)(简称流感)是第一个实行全球性监测的病毒性急性呼吸道传染病，近100年来，已经出现了数次不同亚型的流感病毒全球大流行。1918年西班牙流感(H1N1)，造成5000-6000万人死亡；1957年亚洲流感(H2N2)，至少200万人死亡；1968年香港流感(H3N2)，死亡人数超过100万；1997年香港禽流感(H5N1)，死亡人数虽不比前几次流感，但死亡率高达32％。2009年3月，在墨西哥爆发甲型H1N1流感，并迅速在全球范围流行，截至2010年5月2日，至少造成18001人死亡。随着全球人口流动型的不断增加，流感病毒交替、混合流行将成为常态。
在流感患者的临床治疗过程中和流感的疫情防控中，流感病毒产生耐药性是治疗和防控失败的最主要原因。目前有两类正式上市的药物可以用于治疗流感病毒感染，一类是神经氨酸酶抑制剂，包括磷酸奥司他韦(oseltamivir/
/达菲)和扎那米韦(zanamivir/
/乐感清)；另一类是M2通道阻滞，包括金刚烷胺(amantadine)和金刚乙胺(rimantadine)。由于流感病毒为节段型RNA病毒，突变发生率很高；随着抗病毒治疗的展开，药物选择压力等因素导致病毒耐药性不可避免地出现。据调查显示，目前北美地区98％的季节性H3N2流感病毒对金刚烷胺耐药，98％的季节性H1N1流感病毒对达菲耐药；禽流感H5N1病毒对达菲的耐药也屡有报道。2009年6月丹麦报告了全球第一例甲型H1N1流感病毒达菲耐药病例后，截至2010年2月3日，全球已有20个国家报告了达菲耐药的甲型H1N1流感病例至少225例。
流感病毒耐药的有效检测技术对于指导流感预防和临床治疗具有重要意义，同时也是流感病毒流行性监测和控制的重要技术支撑。目前流感病毒临床诊断主要依靠的方法有：病原分离和鉴定、血清学方法检测感染者抗体、神经氨酸酶抑制试验、RT-PCR诊断技术、基因测序技术。上述技术由于受到其自身特点限制，有的不能实现流感病毒耐药性检测，有的不能达到快速、高通量的临床检测和疾病防控的需求。
基因芯片，即DNA微阵列(DNA microarray)，自20世纪80年代末兴起以来，广泛用于医学和生命科学的各个领域。与传统的检测方法相比，具有快速、高灵敏度、高特异、高通量的特点，特别适合于对大量样品进行平行快速高通量的分析。目前已有多种病原微生物的检测使用了基因芯片技术。目前已有使用基因芯片技术检测流感病毒耐药位点突变情况的报道，如Michael B等采用基因芯片技术检测季节性H3N2和季节性H1N1流感病毒金刚烷胺耐药，可以检测病毒M2基因上V27A和S31N位点突变。但是，在一次检测中既可以同时区分患者感染的流感病毒为季节性H1N1、甲型H1N1、季节性H3N2三种亚型的中哪一种或多种，又同时可以检测所感染的流感病毒是否对奥司他韦和金刚胺类药物耐药的基因芯片未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种A流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片，该芯片能同时分析人源季节性H1N1、甲型H1N1、季节性H3N2三种亚型流感病毒是否对奥司他韦和金刚胺类药物耐药。
本发明采用了以下技术方案：一种A流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片，包含对季节性H1N1、甲型H1N1、季节性H3N2进行奥司他韦和金刚胺类耐药检测的29条特异性寡核苷酸探针(表1-表3)、一条质控探针(表4)和载体，全部探针均分布在载体上。此外还包括用于奥司他韦耐药相关NA基因和金刚胺类耐药相关M基因耐药突变位点序列扩增的特异性引物9条(表5-表6)。
表1对季节性H1N1进行耐药检测的特异性寡核苷酸探针序列
| 1 | H1N1-27-W1 | ACCCTCTTGTTGTTGCC | 17 | V27野生 |
| 2 | H1N1-27-W2 | ATCCTCTTGTTGTTGCC | 17 | V27野生 |
| 3 | H1N1-27-W3 | ATCCTCTCGTTATTGCC | 17 | V27野生 |
| 4 | H1N1-27-M1 | ACCCTCTTGCTGTTGCC | 17 | V27突变 |
| 5 | H1N1-27-M2 | ATCCTCTTGCTGTTGCC | 17 | V27突变 |
| 6 | H1N1-27-M3 | ATCCTCTCGCTATTGCC | 17 | V27突变 |
| 7 | H1N1-31-W1 | TTGCCGCAAGTATAATTG | 18 | S31野生 |
| 8 | H1N1-31-W2 | TTGCCGCAAGTATCATTG | 18 | S31野生 |
| 9 | H1N1-31-W3 | TTGCCGCAAGTATAGTTG | 18 | S31野生 |
| 10 | H1N1-31-M1 | TTGCCGCAAATATAATTG | 18 | S31N突变 |
| 11 | H1N1-31-M2 | TTGCCGCAAATATCATTG | 18 | S31N突变 |
| 12 | H1N1-DF-W | ACCCAATTTTCATTATGAGGA | 21 | H274野生 |
| 13 | H1N1-DF-M | ACCCAATTTTTATTATGAGG | 20 | H274耐药 |
表2对甲型H1N1进行耐药检测的特异性寡核苷酸探针序列
| 13 | PH1N1-27-W | TCCTCTCGTCATTGCAG | 17 | V27野生 |
| 15 | PH1N1-27-M | ATCCTCTCGCCATTGCA | 17 | V27突变 |
| 16 | PH1N1-31-W | TGCAGCAAGTATCATTGG | 18 | S31野生 |
| 17 | PH1N1-31-M | TTGCAGCAAATATCATTGG | 19 | S31突变 |
| 18 | PH1N1-DF-W | CCCTAATTATCACTATGAGGA | 21 | H274野生 |
| 19 | PH1N1-DF-M | CCCTAATTATTACTATGAGG | 20 | H274耐药 |
表3对季节性H3N2进行耐药检测的特异性寡核苷酸探针序列
| 20 | H3N2-27-W1 | ACCCGCTTGTTGTTGCC | 17 | V27野生 |
| 21 | H3N2-27-W2 | ACCCGCTTGTTGTTGCT | 17 | V27野生 |
| 22 | H3N2-27-M1 | ACCCGCTTGCTGTTGCC | 17 | V27突变 |
| 23 | H3N2-27-M2 | ACCCGCTTGCTGTTGCT | 17 | V27突变 |
| 24 | H3N2-31-W1 | TTGCCGCGAGTATCATTG | 18 | S31野生 |
| 25 | H3N2-31-W2 | TTGCTGCGAGTATCATTG | 18 | S31野生 |
| 26 | H3N2-31-M1 | TTGCCGCGAATATCATTG | 18 | S31N突变 |
| 27 | H3N2-31-M2 | TTGCTGCGAATATCATTG | 18 | S31N突变 |
| 28 | H3N2-DF-W | GTGACAAGAGAACCTTATGTG | 21 | E119野生 |
| 29 | H3N2-DF-M | GTGACAAGAGTACCTTATGT | 20 | E119耐药 |
表4质控探针
| 30 | Control-1 | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT | 12 |
表5NA基因扩增特异引物
| 31 | NF11 | CAAGAGTCTGAATGTGCATG | 20 | 正向引物 |
| 32 | NF12 | CAAGAGTCTGAATGTATCTG | 20 | 正向引物 |
| 33 | NF5 | CTGACCAACACCACCATA | 18 | 正向引物 |
| 34 | NR21 | GGATCCCAAATCATCTCAAA | 20 | 反向引物 |
| 35 | NR5 | CATCAATAGGGTCCGATA | 18 | 反向引物 |
表6M基因扩增特异引物
| 36 | MF2-1 | CGAATGGGGGTGCAGATGC | 19 | 正向引物 |
| 37 | MF2-2 | CGAATGGGAGTGCAGATGC | 19 | 正向引物 |
| 38 | MR3-1 | TCCACAGCATTCTGCTGTTCC | 21 | 反向引物 |
| 39 | MR3-2 | TCCACAGCACTCTGCTGTTCC | 21 | 反向引物 |
本发明所述的载体为醛基化修饰玻璃基片、硅片、聚苯乙烯基片或尼龙基片。
一种A型流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，探针的设计：根据NCBI网站上Genbank中的Influenza Virus Resource数据库，对大量的A型流感序列进行比对，确定检测的耐药位点分别为，奥司他韦N1型耐药突变位点为NA基因H274Y，N2型耐药突变位点为NA基因E119V；金刚胺类耐药突变位点为M基因V27A和S31N。确定检测的耐药突变位点后，覆盖耐药突变位点设计了29条特异性寡核苷酸探针(表1-表3)以及1条片基质控探针(表4)；
步骤二，探针的合成，每条探针的3’端加入12个碱基T且3’末端T氨基修饰作为连接臂，以使其能固定在醛基化修饰玻璃基片上；质控探针除3’端加入12个T且末端T进行氨基修饰外，5’端同时标记CY3；
步骤三，芯片的制备：将合成后的探针用去离子水稀释成100μM，分别取10μL探针溶液，和10μL体积芯片点样液混匀，使探针点样终浓度为50μM，装于384孔板，将芯片表面贴上10样品孔阵列膜，用pixsys 5000芯片制备仪(Cartesian Technologies)，采用接触式点样方式，将探针点制在载体上，点样过程中保持一定湿度，点样完成后将芯片置于干燥器中避光常温静置48h，使探针和芯片表面醛基脱去1分子水后共价结合，点制好的芯片常温干燥保存。
在本发明制备方法步骤一中29条特异性寡核苷酸探针长度在17-21nt，每条探针之间的Tm值相差在5℃之内。在本发明制备方法步骤二种所述的载体为醛基化玻璃片基、硅片、聚苯乙烯基片、尼龙基片。
本发明一种A型流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片的使用方法，其特征是包括以下步骤：
步骤一，流感病毒RNA的提取，使用市售商品化病毒基因组RNA提取试剂盒提取病毒RNA；
步骤二，RT-PCR扩增：使用TaKaRa的一步法RT-PCR试剂，使用两组扩增体系分别扩增NA基因、M基因含耐药突变位点片段扩增，使用引物见表5和表6。按以下循环参数进行扩增：50℃反转录30min，94℃预变性2min，45个循环为94℃变性20S、55℃退火20S、72℃延伸20S，最后72℃延伸反应5min，4℃保存或进行下一步实验。
步骤三，芯片杂交：将基因芯片分别置0.2％SDS和去离子水中分别清洗30S，离心或氮气吹干备用；将步骤二得到的RT-PCR产物在95℃变性5min后立即置于冰浴中5min，分别取同一模版NA基因、M基因扩增产物各2.5μL与5μL杂交液混匀，使用加样器加于芯片加样孔使其均匀覆盖于阵列表面，将基因芯片放入杂交盒内在45℃杂交1h。
步骤四，杂交后清洗基因芯片：基因芯片杂交完成后，从杂交盒中取出芯片，并立即依次在洗液1×SSC+0.2％SDS、0.2×SSC和0.1×SSC中各清洗30S，最后将基因芯片表明液体离心干燥或氮气吹干。
步骤五，扫描：将步骤四中清洗后的基因芯片通过GenePix 4000B芯片扫描仪对其进行扫描，扫描参数PMT Gain设置为550，Pixel size设置为20μm，其余参数为默认，波长532nm扫描，同时保存扫描图像数据。扫描的图像用扫描仪自带的图像分析软件对扫描结果进行定量分析。
步骤六，数据分析：每条探针的信号取其三个重复点的平均值，检测结果信号值＞2000初步判读为阳性信号，只有当同一亚型的V27A、S31N、H274Y或E119V三个位点同时出现阳性信号时(野生耐药均可)，则认为该模板毒株为相应亚型且RT-PCR和芯片检测均成功。各个耐药位点的野生和耐药情况根据相应位点野生探针与其对应的突变探针的比值来判定，如果同一位点多条野生或耐药探针出现信号，则将信号值均值大的探针作为判读野生和耐药的探针。当同一耐药突变位点相应探针对的野生探针信号值/耐药探针信号值＞2，则该位点判断为野生型；当野生探针信号值/耐药探针信号值＜0.5则该位点判断为耐药型。当M基因V27A和S31N至少一个突变出现时，则认为该毒株对金刚胺类耐药。当NA基因H274Y或E119V出现突变时则认为该毒株对达菲耐药。
本发明使用方法的步骤二中RT-PCR使用的反向引物修饰分子可以是CY3、CY5、生物素、纳米金。本发明使用方法步骤三中使用的杂交液组分为8×SSC，0.6％SDS，10％甲酰胺，10×Denhardt。
本发明具有以下有益效果：
1)本发明涉及的基因芯片可以产业化生产，对人和环境无污染。其精确度、稳定性和检测效率比传统病毒耐药检查方法均有较大提高，芯片制备和使用方法简便；
2)本发明的流感病毒耐药检测方法操作简单快速方便，有效克服了传统病毒耐药检测方式费时费力的问题，一次检测即可同时快速有效对A型流感病毒流行毒株奥司他韦和金刚胺类耐药同时检测。具有高通量、高特异、高灵敏度的特点，检测效率是传统检测方法的5倍以上。
附图说明
图1：为本发明A型流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片的阵列示意图，每张芯片上分布有10个相同阵列。
图2：为每个阵列上各流感亚型野生和耐药探针具体排列布局。
图3：为一株典型的季节性H1N1流感病毒芯片检测图，该病毒毒株对达菲和金刚胺类均敏感。
图4：为一株典型的甲型H1N1流感病毒芯片检测图，该病毒毒株对达菲敏感，对金刚胺类耐药。
图5：为一株典型的季节性H3N2流感病毒芯片检测图，该病毒毒株对达菲敏感，对金刚胺类耐药。
图6：为季节性H1N1和季节性H3N2共感染的病例，其中季节性H1N1病毒毒株对达菲敏感，对金刚胺类耐药，而季节性H3N2对达菲和金刚胺类均敏感。
图7：为阴性对照的芯片检测图。
具体实施方式
实施例1
A型流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片的研制
一、引物的设计
登陆NCBI网站，在GenBank检索季节性H1N1、甲型H1N1、季节性H3N2三种流感病毒亚型NA基因和M基因全序列。借助生物信息学软件对三种流感病毒亚型的NA基因和M基因进行序列比对，找到NA基因上奥司他韦耐药位点和M基因上金刚胺类耐药位点。确定检测的耐药位点分别为，奥司他韦N1型耐药突变位点为NA基因H274Y，N2型耐药突变位点为NA基因E119V；金刚胺类耐药突变位点为M基因V27A和S31N。在耐药位点上下游保守区域设计RT-PCR特异性上下游引物多条，经过筛选最终确定共9条上下游引物为芯片使用引物，并且将反相引物进行CY3或CY5荧光标记，作为芯片检测用引物。
二、野生和耐药质粒的构建和RNA体外转录
使用筛选好的引物分别扩增季节性H1N1、甲型H1N1、季节性H3N2三种流感病毒亚型NA基因和M基因，使用TIANGEN pGM-T克隆试剂盒对扩增的基因进行质粒构建和测序，并根据测序结果采用重叠延伸定点诱变的方法构建季节性H1N1、甲型H1N1、季节性H3N2三种亚型奥司他韦和金刚胺类野生和耐药质粒。以构建好的质粒为模板，使用Promega Large Scale RNAProduction System-T7体外转录试剂盒进行体外转录，转录出的RNA纯化后经紫外定量计算相应拷贝数，作为标准的RNA模板使用。
三、探针的设计
经过对季节性H1N1、甲型H1N1、季节性H3N2三种流感病毒亚型NA基因和M基因序列比对，在耐药位点附近设计一系列不同长度(15-21nt)特异性的野生型和耐药型寡核苷酸探针，探针的3’端加入12个碱基T作为连接臂，且3’末端T进行氨基修饰，以便使得探针可以固定在芯片载体上。
四、芯片制备
首先将装有探针(干粉)的离心管置高速离心机上12000转/分钟，离心5分钟(探针在离心前不能打开离心管盖子)，加入去离子水溶解至浓度为100μM，用振荡器震荡混匀后快速离心收集管壁上的液体。将混匀的探针溶液放置1小时后，分别取10μl，与10μl点样缓冲液混匀后加入到384孔板中，使用Pixsys 5000芯片制备仪(Cartesian Technologies)将各探针点到醛基化玻片上，芯片点制过程中保持一定的湿度，点制后的芯片置干燥器重放置48h以上，室温干燥储存备用。
五、流感病毒基因组RNA的提取
使用TIANGEN病毒基因组RNA提取试剂盒进行流感病毒基因组RNA的提取，操作按说明书要求进行。
六、RT-PCR扩增
采用一步法RT-PCR方法，条件优化后，采用TaKaRa公司的PrimeScript one Step RT-PCRKit Ver.2试剂，反应体系20ul，共需两组反应体系。
第一组反应体系(扩增NA基因)
第二组反应体系(扩增M基因)
七、RT-PCR扩增循环参数
将PCR管置于PCR热循环仪中，按以下循环参数进行扩增：50℃反转录30min，94℃预变性2min，45个循环为94℃变性20S、55℃退火20S、72℃延伸20S，最后72℃延伸反应5min，4℃保存或进行下一步实验。
八、芯片杂交
杂交前准备
将RT-PCR产物置95℃变性5min，立即置冰浴中静置5min，将点制好的基因芯片分别置0.2％SDS和双蒸水中分别清洗30S，离心干燥或氮气吹干。
芯片杂交反应
将杂交液置45℃水浴中加热完全溶解，分别取同一个模版变性后的第一组反应产物和第二组反应产物各2.5μl与5μl杂交液混匀后，用移液器将混合物加入到芯片检测区域。记录芯片编号、阵列位置及对应的样品编号，将芯片置于杂交盒中，放入到45℃杂交仪或水浴锅中杂交1h.
芯片的洗涤与干燥
杂交反应结束后，取出芯片，立即将芯片依次在洗液1×SSC+0.2％SDS、0.2×SSC和0.1×SSC中各清洗30S，最后将基因芯片表面液体离心干燥或氮气吹干。
芯片扫描
将清洗后的基因芯片用GenePix 4000B芯片扫描仪对其进行扫描，扫描参数PMT Gain设置为550，Pixel size设置为20μm，其余参数为默认，波长为532nm，同时保存扫描图像数据；扫描的图像用扫描仪自带的图像分析软件对扫描结果进行定量分析。
九、结果分析与探针的筛选
每条探针的信号取其三个重复点的平均值，检测结果信号绝对值＞2000初步判读为阳性信号，各个耐药位点的野生和耐药情况根据相应位点野生探针与其对应的突变探针的比值来判定，如果同一位点多条野生或耐药探针出现信号，则将信噪比均值大的探针作为判读野生和耐药的探针。设计的多条季节性H1N1、甲型H1N1、季节性H3N2三种流感病毒亚型NA基因和M基因的野生型和耐药型探针的筛选取决于其对野生型标准品和耐药型标准品的分型比值大小，即当野生型探针检测野生型标准品的信号绝对值与检测耐药型标准品的信号绝对值比值大于2.5时认为该探针符合检测要求；同样当耐药探针检测耐药标准品的信号绝对值与检测野生型标准品的信号绝对值比值大于2.5时认为该探针符合检测要求。最终从候选的多条探针中确定29条特异性寡核苷酸探针、一条质控探针作为本发明A型流感病毒流行毒株奥司他韦及金刚胺类耐药检测基因芯片的探针。
实例2
临床流感病毒咽拭子样本的检测
临床患者咽拭子培养样本由浙江义乌CDC提供，用本发明的方法对该临床样本进行分型检测。
一、芯片的制备
首先将装有探针(干粉)的离心管置高速离心机上12000转/分钟，离心5分钟(探针在离心前不能打开离心管盖子)，加入去离子水溶解至浓度为100μM，用振荡器针对混匀后快速离心收集管壁上的液体。将混匀的探针溶液放置1小时后，分别取10μl，与10μl点样缓冲液混匀后加入到384孔板中，使用Pixsys 5000芯片制备仪(Cartesian Technologies)将各探针点到醛基化玻片上，芯片点制过程中保持一定的湿度，点制后的芯片置干燥器重放置48h以上，室温干燥储存备用，芯片示意图见图1、阵列图见图2。
二、病毒基因组RNA的提取
使用TIANGEN病毒基因组RNA提取试剂盒对咽拭子培养样本中的流感病毒基因组RNA进行提取，提取方式按说明书要求进行。
三、RT-PCR扩增
采用一步法RT-PCR扩增，反应体系20ul.条件优化后，采用TaKaRa公司的PrimeScript oneStep RT-PCR Kit Ver.2，共需两组反应体系。
第一组反应体系(扩增NA基因)
第二组反应体系(扩增M基因)
RT-PCR扩增循环参数
将PCR管置于PCR热循环仪中，按以下循环参数进行扩增：50℃反转录30min，94℃预变性2min，45个循环为94℃变性20S、55℃退火20S、72℃延伸20S，最后72℃延伸反应5min，4℃保存或进行下一步实验。
四、芯片杂交
杂交前准备
将RT-PCR产物置95℃变性5min后立即置冰浴中静置5min。将点制好的基因芯片分别置0.2％SDS和双蒸水中清洗30S，离心干燥或氮气吹干。
芯片杂交反应
将杂交液置45℃水浴中加热完全溶解，分别取同一个模版变性后的第一组反应产物和第二组反应产物各2.5μl与5μl杂交液混匀后，用移液器将混合物加入到芯片检测区域。记录芯片编号、阵列位置及对应的样品编号，将芯片置于杂交盒中，放入到45℃杂交仪或水浴锅中杂交1h.
芯片的洗涤与干燥
杂交反应结束后，取出芯片，立即将芯片依次在洗液1×SSC+0.2％SDS、0.2×SSC和0.1×SSC中各清洗30S，最后将基因芯片表面液体离心干燥或氮气吹干。
五、芯片扫描于样本结果分析
将清洗后的基因芯片用Gene Pix 4000B芯片扫描仪对其进行扫描，波长为532nm，同时保存扫描图像数据；扫描的图像用扫描仪自带的图像分析软件对扫描结果进行定量分析。
样本结果分析
图3为一株典型的季节性H1N1流感病毒芯片检测图，该病毒毒株对达菲和金刚胺类均敏感。
图4为一株典型的甲型H1N1流感病毒芯片检测图，该病毒毒株对达菲敏感，对金刚胺类耐药。
图5为一株典型的季节性H3N2流感病毒芯片检测图，该病毒毒株对达菲敏感，对金刚胺类耐药。
图6为季节性H1N1和季节性H3N2共感染的病例，其中季节性H1N1病毒毒株对达菲敏感，对金刚胺类耐药，而季节性H3N2对达菲和金刚胺类均敏感。
图7为阴性对照的芯片检测图。
Claims (9)
1.一种A型流感病毒流行毒株耐药检测的基因芯片，其特征是它包括对季节型H1N1、甲型H1N1、季节型H3N2三种l流感亚型进行奥司他韦及金刚胺类耐药检测的29条特异性寡核苷酸探针、1条质控探针和载体，全部探针均分布于载体上；用于NA基因和M基因耐药突变位点序列扩增的通用引物9条。
对季节型H1N1进行耐药检测的特异性寡核苷酸探针序列
对甲型H1N1进行耐药检测的特异性寡核苷酸探针序列
对季节型H3N2进行耐药检测的特异性寡核苷酸探针序列
质控探针
NA基因扩增特异引物
M基因扩增特异引物
2.根据权利1所述的A型流感流行毒株耐药检测基因芯片，其特征是所述的载体为醛基化修饰的玻璃片、硅片、聚苯乙稀基片、尼龙基片。
3.一种A型流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，探针的设计：根据NCBI网站中Genbank中的Influenza Virus Resource数据库，对大量的季节性H1N1、甲型H1N1、季节性H3N2流感亚型序列进行比对，确定检测的耐药位点，然后设计29条特异性寡核苷酸探针以及1条片基质控探针；
步骤二，探针的合成，每条探针的3’端加入12个T且末端T进行氨基修饰，以使其能固定在醛基化修饰玻璃基片上；质控探针除3’端加入12个T且末端T进行氨基修饰外，5’端同时标记CY3；
步骤三，芯片的制备：将合成后的探针用去离子水稀释成100μM，分别取10μL，和10μL体积芯片点样液混匀，使探针点样终浓度为50μM，装于384孔板，将芯片表面贴上10样品孔膜，用pixsys 5500芯片制备仪(Catesian Technologies)将探针点于载体上，点样过程中保持一定湿度，点样完成后将芯片置于干燥器中避光常温静置48h，使探针和芯片表面醛基脱去1分子水后共价结合，点制好的芯片常温干燥保存。
4.根据权利要求3所述的A型流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片的制备方法，其特征是步骤一中29条特异性寡核苷酸探针以及1条片基质控探针，探针长度在17-21nt，每条探针之间的Tm值相差在5℃之内。
5.根据权利要求3所述的A型流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片的制备方法，其特征是步骤二种所述的载体为醛基化玻璃片基或硅片、聚苯乙烯基片、尼龙基片。
6.一种A型流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片的使用方法，其特征是包括以下步骤：
步骤一，流感病毒RNA的提取，使用市售商品化病毒基因组RNA提取试剂盒提取病毒RNA；
步骤二，RT-PCR：使用市售的一步法RT-PCR试剂，使用权利要求1中所述的特异性引物进行NA基因、M基因含耐药突变位点片段扩增。
步骤三，杂交：将基因芯片分别置0.2％SDS和双蒸水中各清洗30S，离心或氮气吹干备用；
将步骤二得到的RT-PCR产物在95℃变性5min后立即置于冰浴中5min，分别取同一模板NA基因、M基因扩增产物各2.5μL与5μL杂交液混匀，加于芯片加样孔使其均匀覆盖于阵列表面，将基因芯片放入杂交盒内，45℃杂交1h。
步骤四，杂交后清洗基因芯片：基因芯片杂交完成后，将芯片依次在洗液1*SSC+0.2％SDS、0.2*SSC和0.1*SSC中各清洗30S，最后将基因芯片表明液体离心或氮气吹干。
步骤五，扫描：将步骤五中清洗后的基因芯片通过荧光扫描仪进行扫描，同时保存扫描图像数据；
步骤六，数据分析：根据扫描图像，根据相应野生型探针与耐药型探针信号的比值大小来确定所检测样本中流感病毒的亚型及耐药情况。
7.根据权利要求6所述的A型流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片的使用方法，其特征是步骤二中使用的NA基因、M基因扩增的反相引物5’端进行修饰。
8.根据权利要求7所述的反向引物5’端修饰分子可以是CY3、CY5、生物素、纳米金。
9.根据权利要求6所述的A型流感病毒流行毒株耐药检测基因芯片的使用方法，其特征是步骤三中使用的杂交液组分为8*SSC，0.6％SDS，10％甲酰胺，10*Denhardt。
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