CN111172242A - 一种基于双扩增技术联合检测甲、乙型流感病毒的试剂盒及其应用 - Google Patents

一种基于双扩增技术联合检测甲、乙型流感病毒的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于双扩增技术联合检测甲、乙型流感病毒的试剂盒及其应用。将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物加入到包被有包被探针的微孔中，同时加入特异探针及放大探针，其中包被探针可与特异探针CES的一端结合固定扩增产物RNA；特异探针LES的一端结合到RNA产物上，另一端与放大探针结合，实现信号放大。标记有多生物素的放大探针随后与链霉亲和素‑HRP酶联物结合，最后加入HRP酶化学发光底物，在化学发光仪上进行检测。本发明无需RNA提取，在检测中不易污染，灵敏度高、特异性强，可广泛用于甲、乙型流感病毒核酸检测。

Description

一种基于双扩增技术联合检测甲、乙型流感病毒的试剂盒及 其应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于双扩增(RNA恒温扩增+ 多生物素信号放大)技术联合检测甲、乙型流感病毒核酸的试剂盒及其应用。
背景技术
流感病毒包括甲、乙、丙三型，甲型最容易引起流行，乙型次之，丙型极少引起流行。依据病毒颗粒外膜血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白抗原性的不同，甲型流感病毒目前可分为18个H亚型(H1-H18)和11个N亚型(N1-N11)，目前已有H1、H2、H3、H5、H7和H9等亚型有感染人的报道。由于编码HA 和(或)NA的核苷酸序列容易发生突变，致使HA和(或)NA的抗原表位发生改变，这种抗原性的改变使人群原有的特异性免疫力失效，故甲型流感病毒常引起较大规模甚至世界性的流感流行。按照流行特点，造成人间流感流行的流感病毒可区分为季节性流感病毒和新型甲型流感病毒。季节性流感病毒通常在年度间发生小范围的基因变异，这种基因变异会导致微小的抗原性改变，称为抗原漂移(antigenic drift)。因此，季节性流感病毒虽具有年度特异性且抗原性的改变使感染者不易获得持久免疫力，但传播范围通常局限于较小的人群范围，一般不会造成太高的发病率和死亡率，易感人群多为老年人(>65岁)和婴幼儿(<6 岁)。在过去的几十年中，季节性流感病毒主要集中在甲型H3N2和H1N1亚型。近年来，新型甲型流感病毒亚型暴发流行的案例时有发生。例如，2009年新型甲型H1N1流感病毒造成全球性流感大流行；人感染高致病性禽流感(H5亚型) 病毒的病例时有报道，禽类甲型H5N1亚型流感病毒被认为具有造成人间大范围流感流行的潜力。新型甲型流感病毒通常由于基因的节段性重组所致，这种大范围的基因改变易导致病毒抗原特性的重大改变，称为抗原转变(antigenic shift)。新型甲型H1N1流感病毒(2009)即同时包含了禽流感、猪流感和人季节性流感的基因片段从而导致病毒在抗原水平发生了明显改变。由于抗原性的明显改变以及可能由此造成的病毒毒力的增强，病毒的传染性和致病严重程度都有所增加，故新型甲型流感病毒可能造成更高的发病率和死亡率。
流感病毒传播途径主要以空气飞沫传播为主，常引起发热、乏力、肌肉酸痛以及轻到中度的呼吸道症状，重者可致肺炎、心肌炎和心衰。流感病毒核酸检测试剂可用于流感的辅助诊断。现在常用的甲乙型流感病毒核酸检测都是基于 RT-PCR的方法，这些方法需要复杂的RNA提取过程，特殊的PCR扩增条件，专门的实验室和荧光定量PCR仪，而且在检测过程中极易产生污染。因此在RNA 恒温扩增技术的基础上，结合多生物素信号放大技术，建立单管联合检测甲、乙型流感病毒核酸的方法具有非常重要的意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测甲、乙型流感病毒核酸的试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和T7RNA聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物加入到包被有包被探针的微孔中进行杂交，同时加入的还有该包被探针对应的特异探针及放大探针。其中包被探针可以和每个指标的 CES系列探针一端序列互补配对结合，CES系列探针的另一端可结合到RNA产物上，使RNA产物锚定到微孔中；每个指标的LES系列探针的一端可结合到RNA产物上，另一端与放大探针结合，实现信号放大过程。标记有多生物素的放大探针随后与链霉亲和素-HRP酶联物结合，最终形成包被探针-特异探针 -RNA扩增产物-特异探针-放大探针-链霉亲和素-HRP酶联物复合体，最后加入 HRP酶化学发光底物，在化学发光仪上进行检测。实现病原体核酸的检测。因此，本发明没有复杂的RNA提取过程，即使是一个水浴锅都能实现扩增反应，基于RNA分子易降解的特点，本发明在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，使甲、乙型流感病毒核酸检测得到广泛应用成为一种可能。
为了实现上述目标，本发明采用如下技术方案：
第一方面，提供一种基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测甲、乙型流感病毒核酸的试剂盒，包括：
1)扩增反应液：含40mM Tris-HCl(pH 8.0)，12mM MgCl2，70mM KCl， 15％DMSO，5mM DTT，每种dNTP各1mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2μM，其中扩增引物包括三对：甲型流感病毒、乙型流感病毒和人内参基因，具体的：
(1)甲型流感病毒(NP基因一段保守区序列)的扩增引物：
FluA-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGATGTCHTTC CAGGGGCGGG；
注：本发明中的简并碱基H代表A/T/C；
FluA-F引物(5’-3’)：TACTCCTCTGCATTGTCTCC；
(2)乙型流感病毒(M基因一段保守区序列)的扩增引物：
FluB-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGACACTGTTG GTTCGGTGGGA；
FluB-F引物(5’-3’)：TTCCTGGTCTTTGGGTTTT；
3)内参基因(人18SrRNA一段保守区序列)的扩增引物：
内参-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGACACCAGA CTTGCCCTCCA；
内参-F引物(5’-3’)：AGAAACGGCTACCACATCC；
由于甲流序列变异较大，在设计引物时必须保证能够扩增出所有常见的亚型流行株核酸，本发明在设计甲流扩增引物时R引物设计成简并碱基，对甲流常见流行株进行了全覆盖。在设计引物时同时要保证各自单项引物扩增效率高、不同引物彼此之间无干扰。三对引物的R引物5’端都引入了T7 RNA聚合酶启动子序列。
2)扩增酶：包含三种，逆转录酶(如AMV或M-MLV)、T7 RNA聚合酶和RnaseH；
3)细胞裂解液：购至美国Signosis公司，货号CL-0001，可以裂解细胞，释放核酸；
4)放大探针：一种标有生物素的核酸序列，该探针可以和特异探针的LES 系列的一端结合，具体序列(5’-3’)为:AGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC- Biotin-ACCCGATGGATAGGTCGGTGAA-Biotin-TAAGCATCGTGCCCTTTCG CAG-biotin-ACCACGTTCGCGTTCTCACATG；
5)特异探针：每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体(5’-3’)如下：
(1)甲型流感病毒特异探针
甲流CES1：TTCCAGGGGCGGGGAGttttCTGTACGTATGTATGT；
甲流CES2：TCTTYGAGCTCTCGGAttttCTGTACGATTGTATGT；
注：本发明中的简并碱基Y代表T/C；
甲流LES1：CGAAARGGCARCGARCttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
注：本发明中的简并碱基R代表A/G；
甲流LES2：CCGATCGTGCCYTCCTttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
甲流LES3：TTGACATGARTAAYGAttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
(2)乙型流感病毒特异探针
乙流CES1：AAGAATTTGACCTAGACTttttCTGTACGTATGTATGT；
乙流CES2：CTGCCTTGGAATGGATAAttttCTGTACGATTGTATGT；
乙流LES1：AAAACAAAAGATGCTTAAttttCATGAGAACGCGAACGTGG T；
乙流LES2：CTGATATACAGAAAGCACttttCATGAGAACGCGAACGTGG T；
乙流LES3：TAATTGGTGCATCTATCTttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
(3)内参特异探针
内参CES1：AAGGAAGGCAGCAGGCttttCTGTACGTATGTATGT；
内参CES2：GCGCAAATTACCCACTttttCTGTACGATTGTATGT；
内参LES1：CCCGACCCGGGGAGGTttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
内参LES2：AGTGACGAAAAATAACttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
内参LES3：AATACAGGACTCTTTCttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
6)微孔板：每个微孔中包被包被探针，该包被探针可以和每个指标的CES 系列探针一端序列互补配对结合，具体序列(5’-3’)为：ACATACATACGT ACAG；
7)HRP-链霉亲和素酶联物：标记有链霉亲和素的HRP酶联物，该酶联物可以和放大探针上生物素结合；
8)配制杂交液、洗液A(5×)、洗液B(5×)、封闭液、底物稀释液，杂交液：含0.1％SDS的5×SSC；洗液A(5×)：含0.5％SDS的5×SSC；洗液B (5×)：含0.5％SDS的5×PBS；封闭液：含0.5％BSA、1×PBS；底物稀释液： 50mM pH 8.5Tris-HCl；
9)底物：鲁米诺化学发光底物(购至Thermo Fisher，货号37075)，遇到 HRP酶催化后能够产生化学发光信号，被仪器检测到。
本发明提供利用上述基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测甲、乙型流感病毒核酸的试剂盒检测甲、乙型流感病毒核酸的方法，包括如下步骤：
(1)RNA恒温扩增
本发明检测指标有三个：甲型流感病毒、乙型流感病毒和人内参基因。针对每个指标设计一对(F/R引物)扩增引物，其中R引物5’端带有T7 RNA聚合酶启动子。本发明在同一扩增管内实现各个指标核酸的扩增，具体如下：扩增时，在带有T7启动子的R引物和逆转录酶的作用下，将待测RNA转化为RNA:cDNA 杂合体；扩增酶中的RnaseH消化RNA:cDNA中的RNA，得到单链cDNA；在 F引物和反转录酶的DNA聚合酶功能的作用下合成第二链，形成带有T7启动子的双链DNA；带有T7启动子的双链DNA在T7 RNA聚合酶的作用下转录生成 RNA分子产物。转录的RNA分子产物可以进入循环扩增过程，首先F引物会结合转录的RNA分子产物，在逆转录酶的作用下将转录的RNA转化为RNA:cDNA 杂合体；扩增酶中的RnaseH消化RNA:cDNA中的RNA，得到单链cDNA；接着R引物会结合到单链cDNA上，在反转录酶的DNA聚合酶功能的作用下合成第二链，再次富集合成更多的带有T7启动子的双链DNA分子，为T7 RNA聚合酶提供更多的转录模板，进而在T7 RNA聚合酶的作用下转录生成大量的RNA 分子产物(如图1)。
本发明设计人内参基因检测的目的是为了监测样本采集的有效性、扩增体系的有效性。当样本采集合格时样本中一定会含有人脱落细胞，在检测时一定会被检测到，样本检测阴性时内参应该为阳性，否则整个检测需要重新采样进行重测。
(2)多生物素信号放大
a，设计特异探针、放大探针和包被探针
特异探针：每个指标特异探针包括在两种：CES系列和LES系列，每种探针可以设计多条。其中CES探针包含两个部分，一端可以和扩增的RNA产物特异性结合，另一端可以和包被在微孔板中的包被探针集合，起到固定扩增产物 RNA的作用，这两个部分用4～5个T链接。每条LES探针也包含两个部分，一端可以和扩增的RNA产物特异性结合，另一端可以和放大探针结合，起到连接放大探针的作用，这两个部分用4～5个T链接。
放大探针：放大探针为含有多个生物素的探针，该探针可以和特异探针LES 的一端结合，探针上的生物素可以和HRP-链霉亲和素酶联物结合。
包被探针：包被探针被固定在微孔板中，可以和特异探针CES的一端结合，起到固定的作用。
所述特异探针在设计时必须要求同种指标不同探针之间无交叉，CES系列同放大探针以及包被探针无交叉，以保证检测的特异性。
所述特异探针的CES系列和LES系列设计多条的目的是为了提高多生物素放大步骤的灵敏度，从而增加检测体系的灵敏度。
b，检测结果判断
扩增检测时同时设置阴性对照，即在检测样本的同时也扩增阴性质控物(细胞裂解液，购至美国Signosis公司，货号CL-0001)。每管扩增产物会被均分到三个微孔板微孔中，其中FluA微孔在杂交时会加入甲型流感病毒特异探针；FluB 微孔在杂交时会加入乙型流感病毒特异探针、内质控微孔在杂交时会加入内参特异探针。杂交洗涤后加入化学发光底物，并进行化学发光值测定，对样本检测指标的比值R进行计算，其中R＝待测样本检测指标相对光单位(RLU)/(5×阴性质控物检测指标相对光单位(RLU)值)；根据比值R对样本进行定性判断，比值R大于1.0则判断为阳性，小于等于1.0则为阴性。
结合上述原理，对本发明上述方法的工作过程介绍如下：
(1)核酸提取
采集疑似流感患者的咽拭子样本，使用细胞裂解液裂解的方法释放病毒 RNA分子。
(2)RNA恒温扩增
向17μL的含有甲型流感病毒、乙型流感病毒和内参引物的扩增反应液中加入2μL核酸提取物，95℃加热两分钟，42℃预热2分钟，加入1μL扩增酶，42℃恒温扩增1小时。待测样本中若有流感病毒核酸，扩增时会对指标RNA分子进行大量扩增富集。
(3)多生物素信号放大
a，将RNA恒温扩增产物与特异探针(包括CES系列探针与LES系列探针)、放大探针及杂交液同时加入到微孔板中，50℃恒温孵育1小时。
扩增出的RNA分子与特异探针(包括CES系列探针与LES系列探针)互补配对结合。CES系列探针一端同RNA分子杂交互补配对，另一端同微孔板中的包被探针结合，可以将RNA分子固定在微孔板中；LES系列探针一端同RNA 分子杂交互补配对，另一端可以与放大探针互补配对，形成CES探针-RNA分子 -LES探针-放大探针复合物，该复合物被固定在微孔板上(如图2)。
b，用洗液A洗去未结合于微孔板上的RNA分子、特异探针和放大探针。
c，加入封闭液，室温封闭1～2分钟，封闭非特异性位点。
d，将HRP-链霉亲和素酶联物加入微孔板孵育，该酶联物可以和放大探针上的生物素结合，最终形成CES探针-RNA分子-LES探针-放大探针-HRP-链霉亲和素酶联物，并被固定在微孔板上。
e，用洗液B洗去游离的HRP-链霉亲和素酶联物。
f，按照底物A:底物B:底物稀释液＝1:1:8的比例配置底物，向每个微孔加入 95μL混合后的底物，并进行化学发光值测定(测试仪器：厦门天众达科技股份有限公司的化学发光免疫分析仪，型号TZD-CL-200G)。
g，计算待测样本各个标的比值R。
R＝待测样本检测指标相对光单位(RLU)/(5×阴性质控物检测指标相对光单位(RLU)值)。
比值R大于1.0则判断为阳性，小于等于1.0则为阴性。
第二方面，提供上述基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测甲、乙型流感病毒核酸的试剂盒在制备甲型和/或乙型流感病毒检测试剂中的应用。
本发明和现有技术相比较，具有如下有益效果：
1、本发明通过RNA恒温扩增的方法在同一管内能够同时扩增甲型流感病毒、乙型流感病毒和内参基因三种指标，所扩增出的核酸产物为RNA，RNA在自然环境中容易降解，相比较于PCR的方法扩增出DNA更容易起到防止污染的效果。RNA恒温扩增是在42℃环境中进行，即使是一个水浴锅都能实现扩增反应，最大限度的降低了实验仪器的要求。
2、由于甲流序列变异较大，本发明在设计引物时必须保证能够扩增出所有常见的亚型流行株核酸，所选基因区域较为保守，甲型流感病毒R引物设计成简并碱基，可以对甲型流感病毒常见流行株进行全覆盖。同时本发明在设计引物时同时经过多伦测试，保证了各单项引物扩增效率高、不同引物彼此之间无干扰，整体扩增效果好。由表6可知本发明试剂盒对28株不同来源的常见流感病毒亚型BV、BY、甲型H1N1、季节性H1N1、H7N9、H5N1具有很好的检出能力。
3、本发明在设计时引入的特异探针CES系列和特异探针LES系列有桥分子成分的作用，两种探针成功的将放大探针和RNA核酸扩增片段串联结合到一块，实现指标RNA核酸片段的特异检测。正是这种两套探针的使用，使得其中任何一套探针和指标核酸扩增片段杂交失败，都不能够被成功的固定在微孔板上，也就出现不了阳性检测结果，保证了检测的特异性。本发明试剂盒对表4 所列的34种其它微生物的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其它微生物之间没有交叉反应。其中每套探针都可以设计两条以上，这样的设计又有利于提高试纸条的灵敏度。本发明试剂盒对H1N1(ATCC VR-1469)的最低检测限为 1×10TCID50/mL、H3N2(ATCC VR-1680D)的最低检测限为1×10TCID50/mL、 FluB(ATCC VR-1735)的最低检测限为1TCID50/mL。对于452份诊断结果均与呼吸道感染相关临床样本的甲型和/或乙型流感病毒检测灵敏度、特异性高于某商品化检测甲、乙型流感病毒荧光定量PCR试剂盒。
附图说明
图1 RNA恒温扩增原理图；
图2多生物素信号放大原理图；
图3 96孔微孔板布板示意图。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。实施例中所用的化学发光检测仪器为厦门天众达科技股份有限公司的化学发光免疫分析仪，型号TZD-CL-200G。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室指南》第3版(New York:Cold Spring Harbor laboratory Press,2005) 中所述的条件进行。
【实施例1】灵敏度测试
将ATCC来源的H1N1(ATCC编号VR-1469)、H3N2(ATCC编号VR-1680D)、 FluB(ATCC编号VR-1735)的病毒原液进行梯度稀释液进行最低检测限确定，每个梯度的病毒稀释液重复3～5份，每份进行20次的重复检测，将具有90％～ 95％阳性检出率的病毒水平作为最低检测限。检出结果如下：
H1N1最低检测限检测
表1.1不同滴度H1N1的检测实验数据
Figure BDA0002325497710000091
表1.2 H1N1最低检测限实验数据
Figure BDA0002325497710000092
Figure BDA0002325497710000101
H3N2最低检测限检测
表2.1不同滴度H3N2的检测实验数据
Figure BDA0002325497710000102
表2.2 H3N2最低检测限实验数据
Figure BDA0002325497710000103
Figure BDA0002325497710000111
FluB最低检测限检测
表3.1不同滴度FluB的检测实验数据
Figure BDA0002325497710000112
表3.2 FluB最低检测限实验数据
Figure BDA0002325497710000113
Figure BDA0002325497710000121
最终确定本发明试剂盒的检测灵敏度为：
检测指标 病毒株 最低检测限
H1N1 ATCC VR-1469 1×10TCID<sub>50</sub>/mL
H3N2 ATCC VR-1680D 1×10TCID<sub>50</sub>/mL
FluB ATCC VR-1735 1TCID<sub>50</sub>/mL
【实施例2】特异性验证
1，测试菌株
将不同的微生物提取核酸后检测，验证本发明试剂盒引物及探针设计的特异性。相关病原体及滴度如下：
表4特异性验证测试菌株信息
Figure BDA0002325497710000122
Figure BDA0002325497710000131
2，测试结果
测试结果如下：
表5特异性验证测试结果
Figure BDA0002325497710000132
Figure BDA0002325497710000141
3，结论
从以上数据可以看出，本发明试剂盒对这些微生物的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其他微生物之间没有交叉反应，体现试剂盒检测病原体的特异性强。
【实施例3】病原体检出力验证
使用本发明试剂盒对28株常见流感病毒株进行检测，验证本试剂盒对不同流感病毒株的检出能力。检测结果如下：
表6不同病毒株检测结果
Figure BDA0002325497710000142
Figure BDA0002325497710000151
从以上结果可以看出，本试剂盒对常见流感病毒亚型具有很好的检出能力。
【实施例4】临床样本的验证
1，临床样本信息
在湖北省预防医学科学院/疾病预防控制中心共检测样本452份，其中男性标本和女性标本分别为250例和202例，分别占比为55.31％和44.69％。452例标本中，患者年龄最大为68岁，最小为1个月，平均年龄为11.13岁，标准差为13.5 岁，中位数为6岁。入组患者的诊断结果均与呼吸道感染相关，具体分布情况如下：疑似流感195例，(急性)上呼吸道感染129例，(感染性)发热61例，(急性、喘息性)支气管炎29例，流行性感冒21例，其他17例。
2，检测结果
(1)甲型流感病毒检测结果
检测时同时使用本发明试剂盒和某商品化检测甲、乙型流感病毒荧光定量 PCR试剂盒同时对样本进行检测，将检测结果汇总成四格表，如下：
Figure BDA0002325497710000152
对452份样本采用“基因测序法”进行检测，并对阳性样本进行分型鉴定，测序成功112例，其中H1N1阳性样本71例，H3N2阳性样本40例，H7N9阳性样本2例，这112例样本与本试剂盒检测结果一一对应。
对于不一致的3例样本，某商品化检测甲、乙型流感病毒荧光定量PCR试剂盒漏检一例，假阳2例，显而易见，本发明专利试剂盒检测临床样本甲流检测检测灵敏度更高，特异性更强。
(2)乙型流感病毒检测结果
检测时同时使用本发明试剂盒和某商品化检测甲、乙型流感病毒荧光定量 PCR试剂盒同时对样本进行检测，将检测结果汇总成四格表，如下：
Figure BDA0002325497710000161
对452份样本采用“基因测序法”进行检测，测序成功122例，其中包括 117例两种方法学共同阳性样本，4例本发明试剂盒检测阳性某商品化荧光定量 PCR试剂盒检测阴性样本，1例本发明试剂盒检测阴性某商品化荧光定量PCR 试剂盒检测阳性样本。
对于不一致的11例样本进行测序结果分析，显而易见，本发明专利试剂盒检测临床样本时乙流检测检测灵敏度更高，特异性更强。
序列表
<110> 武汉中帜生物科技股份有限公司
<120> 一种基于双扩增技术联合检测甲、乙型流感病毒的试剂盒及其应用
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)
<223> h=a或t或c
<400> 1
taatacgact cactataggg agatgtchtt ccaggggcgg g 41
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tactcctctg cattgtctcc 20
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taatacgact cactataggg agacactgtt ggttcggtgg ga 42
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttcctggtct ttgggtttt 19
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taatacgact cactataggg agacaccaga cttgccctcc a 41
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agaaacggct accacatcc 19
<210> 7
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(23)
<223> 两个碱基之间用biotin连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(45)
<223> 两个碱基之间用biotin连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (66)..(67)
<223> 两个碱基之间用biotin连接
<400> 7
agaaggcgtc cgtctttgag gcacccgatg gataggtcgg tgaataagca tcgtgccctt 60
tcgcagacca cgttcgcgtt ctcacatg 88
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttccaggggc ggggagtttt ctgtacgtat gtatgt 36
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)
<223> y=t或c
<400> 9
tcttygagct ctcggatttt ctgtacgatt gtatgt 36
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)
<223> r=a或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)
<223> r=a或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)
<223> r=a或g
<400> 10
cgaaarggca rcgarctttt catgagaacg cgaacgtggt 40
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)
<223> y=t或c
<400> 11
ccgatcgtgc cytccttttt catgagaacg cgaacgtggt 40
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)
<223> r=a或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)
<223> y=t或c
<400> 12
ttgacatgar taaygatttt catgagaacg cgaacgtggt 40
<210> 13
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aagaatttga cctagacttt ttctgtacgt atgtatgt 38
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctgccttgga atggataatt ttctgtacga ttgtatgt 38
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aaaacaaaag atgcttaatt ttcatgagaa cgcgaacgtg gt 42
<210> 16
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctgatataca gaaagcactt ttcatgagaa cgcgaacgtg gt 42
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
taattggtgc atctatcttt ttcatgagaa cgcgaacgtg gt 42
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aaggaaggca gcaggctttt ctgtacgtat gtatgt 36
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcgcaaatta cccacttttt ctgtacgatt gtatgt 36
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cccgacccgg ggaggttttt catgagaacg cgaacgtggt 40
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
agtgacgaaa aataactttt catgagaacg cgaacgtggt 40
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aatacaggac tctttctttt catgagaacg cgaacgtggt 40
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acatacatac gtacag 16

Claims (2)

1.一种基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测甲、乙型流感病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
1）扩增反应液：含40 mM Tris-HCl (pH 8.0)，12 mM MgCl2，70 mM KCl，15% DMSO，5mMDTT，每种dNTP各1 mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2 µM，其中扩增引物包括三对：甲型流感病毒、乙型流感病毒和人内参基因，具体的：
（1）甲型流感病毒的扩增引物：
FluA-R引物（5’-3’）：TAATACGACTCACTATAGGGAGATGTCHTTCCAGGGGCGGG；其中，H=A/T/C；
FluA-F引物（5’-3’）：TACTCCTCTGCATTGTCTCC；
（2）乙型流感病毒的扩增引物：
FluB-R引物（5’-3’）：TAATACGACTCACTATAGGGAGACACTGTTGGTTCGGTGGGA；
FluB-F引物（5’-3’）：TTCCTGGTCTTTGGGTTTT；
3）内参基因的扩增引物：
内参-R引物（5’-3’）：TAATACGACTCACTATAGGGAGACACCAGACTTGCCCTCCA；
内参-F引物（5’-3’）：AGAAACGGCTACCACATCC；
2）扩增酶：包含三种，逆转录酶、T7 RNA聚合酶和RnaseH；优选地，所述逆转录酶为AMV或M-MLV；
3）细胞裂解液：购至美国Signosis公司，货号CL-0001；
4）放大探针：一种标有生物素的核酸序列，该探针可以和特异探针的LES系列的一端结合，具体序列（5’-3’）为: AGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-Biotin-ACCCGATGGATAGGTCGGTGAA-Biotin-TAAGCATCGTGCCCTTTCGCAG-biotin-ACCACGTTCGCGTTCTCACATG；
5）特异探针：每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体（5’-3’）如下：
（1）甲型流感病毒特异探针
甲流CES1：TTCCAGGGGCGGGGAGttttCTGTACGTATGTATGT；
甲流CES2：TCTTYGAGCTCTCGGAttttCTGTACGATTGTATGT；
其中，Y=T/C；
甲流LES1：CGAAARGGCARCGARCttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
其中，R=A/G；
甲流LES2：CCGATCGTGCCYTCCTttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
甲流LES3：TTGACATGARTAAYGAttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
（2）乙型流感病毒特异探针
乙流CES1：AAGAATTTGACCTAGACTttttCTGTACGTATGTATGT；
乙流CES2：CTGCCTTGGAATGGATAAttttCTGTACGATTGTATGT；
乙流LES1：AAAACAAAAGATGCTTAAttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
乙流LES2：CTGATATACAGAAAGCACttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
乙流LES3：TAATTGGTGCATCTATCTttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
（3）内参特异探针
内参CES1：AAGGAAGGCAGCAGGCttttCTGTACGTATGTATGT；
内参CES2：GCGCAAATTACCCACTttttCTGTACGATTGTATGT；
内参LES1：CCCGACCCGGGGAGGTttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
内参LES2：AGTGACGAAAAATAACttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
内参LES3：AATACAGGACTCTTTCttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
6）微孔板：每个微孔中包被包被探针，该包被探针可以和每个指标的CES系列探针一端序列互补配对结合，具体序列（5’-3’）为：ACATACATACGTACAG；
7）HRP-链霉亲和素酶联物：标记有链霉亲和素的HRP酶联物；
8）配制杂交液、洗液A（5×）、洗液B（5×）、封闭液、底物稀释液
杂交液：含0.1% SDS的5×SSC；洗液A（5×）：含0.5% SDS的5×SSC；洗液B（5×）：含0.5%SDS的5×PBS；封闭液：含0.5% BSA、1 × PBS；底物稀释液：50mM pH 8.5 Tris-HCl；
9）底物：购至Thermo Fisher，货号37075的鲁米诺化学发光底物，遇到HRP酶催化后能够产生化学发光信号，被仪器检测到。
2.权利要求1所述的试剂盒在制备甲型和/或乙型流感病毒检测试剂中的应用。
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