CN101899531A

CN101899531A - 检测人甲型流感病毒h1和/或h3亚型的引物及方法

Info

Publication number: CN101899531A
Application number: CN2009103031119A
Authority: CN
Inventors: 严安; 丁国徽; 董辉; 熊慧; 金维荣; 赵国屏; 李亦学; 车小燕; 吴凡; 童光志
Original assignee: Shanghai Human Genome Research Center
Current assignee: Shanghai Human Genome Research Center
Priority date: 2009-05-25
Filing date: 2009-06-10
Publication date: 2010-12-01
Anticipated expiration: 2029-06-10
Also published as: CN101899531B

Abstract

本发明涉及一种检测人甲型流感病毒H1和/或H3亚型的引物及检测方法，本发明的检测人甲型流感病毒的引物，包含由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6所示的任一核苷酸序列。本发明的技术方案，不仅可以对此次流行的新型甲型H1N1流感病毒进行确诊，且可通过生物信息学对其重要变异进行分析，进而为国家制定有效防控措施提供科学依据。

Description

检测人甲型流感病毒H1和/或H3亚型的引物及方法

技术领域

本发明涉及一种检测人甲型流感病毒H1和/或H3亚型的引物及检测方法。

背景技术

流感是一种由流感病毒引起的、通过呼吸道传播的传染性疾病。历史上流感的大流行曾经给人类造成过很严重的后果，例如1918年爆发的由H1N1亚型流感病毒引起的“西班牙流感”。它是20世纪最具灾难性的流感病毒，在不到一年时间里感染了全世界一半的人口，导致数千万人死亡。流感大流行通常是由一种新出现的或者以前人未曾感染过的病毒引起的，人体对这种新病毒没有免疫力，再加上其传播范围广、速度快，而疫苗的研制和生产又很难立即跟上，所以容易造成许多人感染甚至死亡。近年来，随着全球经济发展的一体化程度的不断加深，世界各国之间的人员往来和流动日益频繁和密切，从而使流感病毒在全球的播散和蔓延速率进一步加快，一旦某个国家或地区流感爆发，疫情将会在短时间内迅速播散至世界各地。2009年发生的新型甲型H1N1型流感疫情正是如此。

2009年4月，墨西哥确诊了首例新型甲型H1N1型流感病例。在随后的4月至5月期间，新型甲型H1N1型流感疫情在世界范围内迅速蔓延，仅仅一个多月的时间内，全球多个国家和地区均发生了新型甲型H1N1型流感疫情。以疫情最为严重的墨西哥和美国为例，截至2009年5月14日，墨西哥全国确诊新型甲型H1N1流感病例上升至2720例，其中死亡人数上升至64人；而在美国五十个州中，已有四十七个州宣布发现新型甲型H1N1流感病例，患者总数也上升至4298人，比前一天增加946人。我国内地也于5月11日确诊了首例新型甲型H1N1流感病例，截至2009年5月19日，已经出现4例新型甲型H1N1流感病例，均为输入性流感病例。世界卫生组织已于2009年4月29日宣布全球流感大流行警告级别为5级，并且随着新型甲型H1N1流感疫情在世界范围内的不断蔓延，爆发全球流感大流行的风险日益提升，世界卫生组织已于5月初明确表示不排除把警告级别升至6级，即宣布流感大流行到来的可能性。

此次新型甲型H1N1型流感疫情发生后，世界各国的科学家们立即展开了相关的科学研究工作。最新的调查和研究结果显示，每个感染新型甲型H1N1型流感的墨西哥患者都会导致增加1.2至1.6个新病例，证明流感病毒的人际传播在不断发生。这一流感病毒的传染率，到目前为止是1/3，全球范围内可能会有20亿人受到这种流感病毒的感染，一场全球性大流感现在已经初见端倪。但是由于目前尚不能确定新型甲型H1N1型流感病毒的毒性、可传播性和病毒的起源，并且该病毒的潜伏期和传染期也不是很明确，因此科学家们还无法判断其在世界范围内扩散的程度。

尽管目前新型甲型H1N1流感病毒仍在扩散，而且如何演变尚不可预知，但只要全球通力合作，充分做好疫情的监控和防范工作，就可以最大限度地减少流感病毒对人类的危害。早期确诊新型甲型H1N1流感病毒感染病例，及时进行病例的隔离和治疗，是阻止流感疫情蔓延的重要措施。然而，随着流感病毒不断地在人际之间传播，其发生变异以及毒力由弱变强的可能性都是存在的，特别是病毒血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因的具有高度的变异性和变异的不确定性的特点，使得流感病毒的诊断和分型方法一直滞后于其疫情的爆发。因此，在较短的时间内研制出快速、特异、灵敏的检测方法和诊断试剂，是对抗新型甲型H1N1流感病毒的首要任务。

由于单克隆抗体技术的普遍应用，许多以单抗为基础、针对甲型流感病毒的ELISA和胶体金诊断试剂盒已研制成功，例如甲型流感病毒胶体金诊断试剂对来自疫区飞机的乘客进行快速筛查，不失为一种有价值的方法

随着现代生物技术的发展，分子生物学技术已被大量应用于甲型流感病毒的快速诊断。此次疫情爆发后世界卫生组织陆续公布的流感病毒快速检测方法，均是基于新型甲型H1N1流感病毒核酸的荧光定量RT-PCR检测技术。该技术设计的试剂易于制备，且具有快速、灵敏、易于在基层推广的优点。但是这些方法还存在一定的缺陷，如所使用的引物和探针的序列特异性低，难以对当前新型甲型H1N1流感病毒的基因组散在的多处变异进行特异性诊断，易于与以往的季节性甲型H1N1流感病毒产生交叉反应或不能扩增出在引物或探针位置出现变异的新型甲型H1N1流感病毒株，从而导致假阳性或假阴性结果。因此，WHO不将其作为确诊的诊断方法。基于这些实际问题，我们根据以往的流感病毒和最新公布的新型H1N1流感病毒基因组序列，在各型流感病毒基因组的相对保守区域设计引物，通过对扩增片段的序列测定和生物信息学分析，可以准确地检测H1、H3、H5、H9等具有爆发潜力的流感病毒及其亚型。这种基于流感病毒核酸序列测定的特异性检测方法，不仅可以用于新型H1N1病毒的快速诊断和分型，并且在今后还可以推广至其它具有爆发潜力的流感病毒的监测工作中去。

发明内容

本发明的发明目的在于提出一种检测人甲型流感病毒H1和/或H3亚型的引物。

本发明的又一发明目的在于提出一种检测人甲型流感病毒H1和/或H3亚型的方法。

为了完成本发明的发明目的，本发明采用的技术方案为：

本发明涉及一种检测人甲型流感病毒H1和/或H3亚型的引物，包含由SEQ ID NO：1至SEQID NO：6所示的任一核苷酸序列。

其中，本发明的检测人甲型流感病毒引物的第一优选方案为：检测人甲型流感病毒H1和/或H3亚型的引物选自下述四组引物中的至少一组：

(1)用于扩增甲型流感病毒H1靶核酸序列的引物对：包括由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的核酸引物、由SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的核酸引物和由SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的核酸引物；

(2)用于扩增甲型流感病毒H3靶核酸序列的引物对：包括由SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的核酸引物、由SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的核酸引物和由SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的核酸引物；

本发明的检测人甲型流感病毒引物的第二优选方案为：检测人甲型流感病毒H1和/或H3亚型的引物选自下述四组引物中的至少一组：

(1)用于扩增甲型流感病毒H1靶核酸序列的引物对：包括由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的核酸引物、由SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的核酸引物和由SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的核酸引物；

(2)用于扩增甲型流感病毒H3靶核酸序列的引物对：包括由SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的核酸引物、由SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的核酸引物和由SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的核酸引物；

本发明还涉及一种检测人甲型流感病毒H1和/或H3亚型的方法，包括以下步骤：

(1)提取核酸样本；

(2)以步骤(1)提取的核酸为模板，用本发明的引物序列，PCR扩增病原体的靶核酸序列；

(3)对扩增产物进行序列测定，并分析结果。

基因测序技术由于具备特异、准确的优势，被WHO推荐为诊断新型甲型H1N1流感的确诊方法。因此，根据以往的流感病毒和WHO最新公布的新型甲型H1N1流感病毒基因组序列，在甲型流感病毒各亚型基因组的相对保守区域设计特异引物，使用RT-PCR扩增病毒HA基因序列，然后使用测序后的数据分析方法，鉴定序列对应的病毒类型。

基于上述策略，相关引物设计原则是：1)引物选在H1、H3等病毒亚型某个相对保守的位置；2)引物扩增片段信息可用以区分H1，H3，H5，H9四种感染人的亚型，特别是能区分2009年北美新型甲型流感病毒和常规H1N1流感病毒；3)引物应符合常规的PCR引物设计原则。我们选择H1，H3，H5和H9作为区分对象，因为这几种亚型已经发现可以感染人群，现在或者将来已经或可能在人间传播，有的还具有爆发的潜力。

从NCBI的Influenza Virus Resource下载了最新的流感病毒序列数据及相关的描述信息(截至2009年5月；共187327个序列条目，涉及到的样本为23094个)，同时构建了本地的流感综合信息系统(http://lifecenter.sgst.cn/flu)。由于流感序列很多，并且各种亚型在数据库里面存储的数目不一致，因此，为保证计算上可行，我们通过本地系统，对各种亚型分别按时间顺序选择了最近的50条样本信息详细并且序列数据完整的HA序列。汇总后，共得到300条HA序列，其中，宿主是禽类的197个，是人的69个，是猪的15个，宿主是鼠兔(Plateau pika)的1个，以及宿主标注为环境的18个。随后，利用并行化的Clustalw软件(Bioinformatics，2003，19(12)，1585-1586)对这300条序列进行多重比对，在相对保守区域选择候选引物。

据此，我们选取了HA序列的联配位置750nt和1100nt附近的序列分别作为正向和反向引物。该正反引物直接的序列的联配情况见图1。图1中框线区域就是现今流行的新型甲型H1N1流感病毒HA基因的部分区域。由于本文设计的甲型流感病毒的鉴定方法是基于对正反引物间的序列测序来实现，所以我们对图1中的序列根据序列相似性绘制聚类树以判断引物间的序列对病毒分型的效果(见图2)。从图2可以看出，我们选取的引物间的序列在理论上可以很好地区分H1，H2，H3，H5，H7和H9(选取的300条序列，全部正确的分到所该分的亚型中)。另外，如箭头所指位置，2009年新型甲型H1N1流感病毒独立分成一簇，和其它H1亚型病毒明显区分开了。这说明在该区域两侧设计保守引物，对相应产物的序列进行测序可以把H1，H2，H3，H5，H7和H9区分开，特别是还可以鉴定出新型甲型H1N1流感病毒。

WHO在2009年4月28日，公布了检测甲型流感病毒H1N1的荧光定量PCR方法，该试剂易于制备，且具有快速、灵敏、易于在基层推广的优点。但是，应用荧光定量PCR方法，所设计探针序列的特异性低，难以区别不同的甲型H1N1流感病毒的基因组，因此易于与以往的季节性甲型H1N1流感病毒产生交叉反应，而导致假阳性的结果。此外，由于流感病毒的变异是非常常见的，引物或探针出的变异，会导致不能扩增出在引物或探针位置出现变异的新型甲型H1N1流感病毒株，而产生假阴性结果。

测序技术由于具备特异、准确的优势，被WHO推荐为诊断新型甲型H1N1流感的确诊方法。因此，我们根据以往的流感病毒和WHO最新公布的新型甲型H1N1流感病毒基因组序列，在甲型流感病毒各亚型基因组的相对保守区域设计特异引物，使用RT-PCR扩增病毒HA基因序列，然后使用测序后的数据分析方法，鉴定序列对应的病毒类型。

应用本发明的技术方案，不仅可以对此次流行的新型甲型H1N1流感病毒进行确诊，且可通过生物信息学对其重要变异进行分析，进而为国家制定有效防控措施提供科学依据。例如，由于流感病毒的高变异型，发生在流感病毒唾液酸结合位点(HA蛋白上)的变异，将可能影响病毒的侵袭力的强弱。另外，这种基于测序获得的抗原表位信息，无疑对有效疫苗和药物的研制有着重要的参考价值。

附图说明

图1是引物扩增区域的序列对比图；

图2是各分型引物之间的序列根据相似性对病毒分型的效果图；

图3是不同标本的H1和H3分型引物PCR产物电泳图；

图4是引物敏感度性优化实验的电泳图；

图5是人和猪甲型流感病毒H1和H3多变区域测序后的分型情况。

具体实施方式

本发明提出的具体实施方式，仅限于对本发明的技术方案做进一步的解释和说明，并不对本发明的技术方案做出限制。

实施例1

1.材料

1.1毒株样本、RNA和cDNA

人来源：

H1亚型流感病毒标准株(上海疾病预防控制中心，广州疾病预防控制中心)

H3亚型流感病毒标准株(上海疾病预防控制中心，广州疾病预防控制中心)

猪来源：

H1N1型毒株亚型标准株cDNA(中国农业科学院上海兽医研究所)

H1N1型毒株HA基因克隆质粒(中国农业科学院上海兽医研究所)

H3N2型毒株HA基因克隆质粒(中国农业科学院上海兽医研究所)

1.2主要仪器和试剂

干式恒温加热器(GL-150，海门其林贝尔仪器制造有限公司)，透射式紫外分析仪(天能2500，Tanon)，高速冷冻离心机(Eppendorf，5810R)，台式高速冷冻离心机(Eppendorf，5417R)，低温冰箱(SanYo Medical freezer)，电子分析天平(JT601N，精天)，数显pH计(PSH-37，上海天达仪器有限公司)，核酸电泳仪(HE-120，Tanon)，洁净工作台(SDJ-DS，上海淀山湖洁净设备厂)，分光光度计(98090A，Agilent)；taq DNA聚合酶、M-MLVRM逆转录酶等常用酶均购自Takara及Invitrogen公司；Trizol试剂盒购自Invitrogen公司；其他常用生化试剂皆为分析纯，购自上海人类基因组研究中心仓库。

1.3引物序列

表1

注：实验中引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2等比例混合，作为H1分型反应上游引物，引物SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6等比例混合，作为H3分型反应下游引物。

2.方法

2.1毒株总RNA的cDNA的获取和采集

采用Invitrogen公司的Trizol试剂盒，处理来自疾病预防控制中心保存的各流感亚型毒株培养物上清，抽提并纯化总RNA，整个操作步骤按照厂家的说明书进行。在1％琼脂糖电泳上鉴定上述纯化总RNA的质量后，按照生产商说明书用Invitrogen公司的反转录酶进行反转录，获得总RNA的cDNA。

2.2引物合成：由上海超世生物科技有限公司完成(合成方法参考现代分子生物学实验技术(第二版)卢圣栋主编)

2.3进行引物特异性分析

利用合成好的H1和H3亚型分型引物，检验引物的特异性。以上述含有HA不同亚型的cDNA或者质粒为模板，分别选取H1分型上游引物(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2混合引物)和下游引物SEQ ID NO：3，以及H3分型引物上游引物SEQ ID NO：4和下游引物(SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6混合引物)以上述所有cDNA为模板进行PCR扩增。

PCR反应体系

成分	体积
		cDNA 100倍稀释液	2μl

10×Taq buffer	2μl
		dNTP(25mM)	2μl
上游引物(10μM)	0.6μl
		下游引物(10μM)	0.6μl
Taq聚合酶(5U/μl)	0.3μl
		H₂O	12.5μl

以上体系的PCR反应条件：94℃预变性5min；然后按以下条件进行35个循环反应，94℃30s，58℃30s，72℃30s；最后72℃延伸5m；琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物。电泳图如图3。

试验结果如图3所示：A图为H1分型引物对应的PCR产物；B图为H3分型引物对应的PCR产物；1泳道：100bp DNA Ladder；2-8泳道为不同模板的PCR产物，2为去离子水，3为人H1亚型标准株cDNA，4为人H1亚型病毒株cDNA，5为猪H1N1亚型标准株cDNA，6为猪H1N1亚型HA基因克隆质粒，7为人H3亚型标准株cDNA，8为猪H3N2亚型HA基因克隆质粒。结果表明，H1分型引物和H3分型引物均能很好的特异性扩增各自对应的H1和H3亚型毒株的cDNA；而H1分型引物以H3亚型毒株的cDNA为模板，不能得到有效扩增产物，H3引物也不能以H1亚型毒株的cDNA为模板进行有效片断的扩增。这说明，H1和H3分型引物相互没有交叉扩增反应，具有亚型的专一性。

2.4PCR产物测序：

PCR产物中加入3μl Exo SAP-IT，进行消化反应：37℃20分钟，80℃15分钟。消化后产物与Sequencing Mix混合后，进行测序反应。H1分型反应用H1R1062作为测序引物，H3分型反应用H3F731作为测序引物。

软件分析：

对于PCR的两段产物测序后，用Fasta包里面的ssearch对二者进行比对和拼接。拼接后的序列和基准序列混在一起，利用并行化的Clustalw(Bioinformatics，2003，19，1585-1586)，对这些序列进行多重序列联配(multiplesequence alignment)，根据绘制的聚类树(图2)判断所测序列属于何种流感病毒。

通过序列相似性聚类，可以把测试用的病毒株准确无误的归类到预想的分枝中。图5是甲型流感病毒H1和H3多变区域测序后的分型情况。A，B子图是图2中分类树的H1和H3分枝。本实验中的3～8(3为人H1亚型标准株cDNA、4为人H1亚型病毒株cDNA、5为猪H1N1亚型标准株cDNA、6为猪H1N1亚型HA基因克隆质粒、7为人H3亚型标准株cDNA、8为猪H3N2亚型HA基因克隆质粒)病毒株序列与300条基准HA序列进行聚类分析可以看出，3～8病毒株可以准确地归类到预想的聚类树位置上。因此，应用该系列引物不仅可以对此次流行的新型甲型H1N1流感病毒进行确诊，而且有可能对其他人易感的季节性甲型流感病毒HA亚型(如H3型)进行确诊。此外，这种方法还应该可以发现在甲型流感病毒HA亚型中的新变异株，通过生物信息学分析此类“新”变异的进化规律，对于认识和预测病毒的变异和流行趋势具有潜在的应用价值；长期积累数据和研究，可能为国家制定有效防控措施提供科学依据。

实施例2引物灵敏度检测

1.材料和仪器同实施例1，

2.引物合成：由上海超世生物科技有限公司完成

将人源H1和H3亚型标准毒株的cDNA产物进行倍比稀释，分别为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，并且分别取2ul作为模板，分别选取H1分型上游引物(SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2混合引物)和下游引物SEQ ID NO：3，以及H3分型引物上游引物SEQ ID NO：4和下游引物(SEQ ID NO：5和HSEQ ID NO：6混合引物)。

PCR反应体系

成分	体积
		cDNA 100倍稀释液	2μl
10×Taq buffer	2μl
		dNTP(25mM)	2μl
上游引物(10μM)：SEQ ID NO：1和2；4	各0.2μl
		下游引物(10μM)：SEQ ID NO：3；5和6	各0.2μl
Taq聚合酶(5U/μl)	0.3μl
		H₂O	12.5μl

以上体系的PCR反应条件：94℃预变性5min；然后按以下条件进行35个循环反应，94℃30s，58℃ 30s，72℃ 30s；最后72℃延伸5m；琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物。电泳图如图4。

试验结果：如图4所示，在10^-5稀释度，仍可见清晰目标条带，并可以获得清晰的测序结果，提示该组引物具有较高的灵敏度。

Claims

1.一种检测人甲型流感病毒H1和/或H3亚型的引物，其特征在于，包含由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6所示的任一核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的检测人甲型流感病毒H1和/或H3亚型的引物，其特征在于，所述引物选自下述两组引物中的至少一组：

(2)用于扩增甲型流感病毒H3靶核酸序列的引物对：包括由SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的核酸引物、由SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的核酸引物和由SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的核酸引物。

3.根据权利要求2所述的检测人甲型流感病毒H1和/或H3亚型的引物，其特征在于，所述引物选自下述两组引物中的至少一组：

(2)用于扩增甲型流感病毒H3靶核酸序列的引物对：包括由SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的核酸引物、由SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的核酸引物和由SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的核酸引物。

4.一种检测人甲型流感病毒H1和/或H3亚型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取核酸样本；

(2)以步骤(1)提取的核酸为模板，用权利要求1至3任意一项所述的引物序列，PCR扩增病原体的靶核酸序列；

(3)对扩增产物进行序列测定，并分析结果。

5.根据权利要求4所述的检测人甲型流感病毒H1和/或H3亚型的方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应体系为

cDNA 100倍稀释液：2μl

10×Taq buffer：2μl

dNTP(25mM)：2μl

上游引物(10μM)：0.6μl

下游引物(10μM)：0.6μl

Taq聚合酶(5U/μ1)：0.3μl

H2O：12.5μl。

6.根据权利要求4所述的检测人甲型流感病毒H1和/或H3亚型的方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃ 30秒、58℃ 30秒、72℃ 30秒重复反应35～40个循环；最后72℃延伸5分钟。