CN108085422B - 质谱法检测甲型流感病毒h1n1片段多重pcr产物的方法及其产品 - Google Patents
质谱法检测甲型流感病毒h1n1片段多重pcr产物的方法及其产品 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108085422B CN108085422B CN201810069462.7A CN201810069462A CN108085422B CN 108085422 B CN108085422 B CN 108085422B CN 201810069462 A CN201810069462 A CN 201810069462A CN 108085422 B CN108085422 B CN 108085422B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- virus
- influenza
- seq
- primer
- fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 60
- 241000197306 H1N1 subtype Species 0.000 title claims abstract description 24
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 title claims description 44
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 claims abstract description 52
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 36
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 28
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 37
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 19
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 19
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 15
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 14
- BRARRAHGNDUELT-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypicolinic acid Chemical compound OC(=O)C1=NC=CC=C1O BRARRAHGNDUELT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 8
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 58
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 25
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 abstract 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 67
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 47
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 36
- 241001473385 H5N1 subtype Species 0.000 description 24
- 241000342557 H7N9 subtype Species 0.000 description 23
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 18
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 16
- 241000252870 H3N2 subtype Species 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 13
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 12
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 10
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 7
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 6
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 5
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 4
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 3
- 241000725681 Swine influenza virus Species 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000001196 time-of-flight mass spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 2
- 101710199771 Matrix protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 241000252843 H5N2 subtype Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010000178 IGF-I-IGFBP-3 complex Proteins 0.000 description 1
- 241001300590 Influenza A virus (A/Fujian/S03/2015(H7N9)) Species 0.000 description 1
- 241001082340 Influenza A virus (A/Qingyuan/GIRD01/2017(H7N9)) Species 0.000 description 1
- 241001647243 Influenza A virus (A/bar-headed goose/Qinghai/13/2008(H5N1)) Species 0.000 description 1
- 241001104187 Influenza A virus (A/blue-winged teal/Guatemala/CIP049H108-45/2012(H3N2)) Species 0.000 description 1
- 241000774625 Influenza A virus (A/canine/Beijing/cau9/2009(H1N1)) Species 0.000 description 1
- 241000389759 Influenza A virus (A/chicken/France/150169a/2015(H5N1)) Species 0.000 description 1
- 241001669526 Influenza A virus (A/chicken/Ganzhou/GZ79/2016(H7N9)) Species 0.000 description 1
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 1
- 238000000752 ionisation method Methods 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000001254 matrix assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- -1 salt ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 206010041232 sneezing Diseases 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种通过质谱法直接检测甲型流感病毒的多重PCR产物的方法,包括使用特定引物对病毒DNA进行多重PCR扩增,并通过MALDI‐TOF MS检测多重PCR产物的片段的大小。该方法可检测选自H1N1亚型甲型流感病毒的多个片段。本发明还保护相关检测产品。本发明方法将多重PCR和MALDI‐TOF MS相结合用于临床病原微生物鉴定,不仅快速、简便,还易观察、直观、准确性高。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测的技术领域,涉及一种利用质谱特征峰图检测多重PCR产物的方法及其产品。本发明还涉及使用多重PCR扩增技术检测甲型流感的引物组和试剂盒。
背景技术
流行性感冒简称“流感”,是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,具有突然爆发、迅速蔓延、波及面广的特点,主要通过咳嗽和打喷嚏传播。流感在人类历史上已存在很长时间,早在1580年就有了全球性流感记录。20世纪共爆发过四次:1918-1920年的西班牙流感(H1N1),1957年的亚洲流感(H2N2),1968年的我国香港地区流感(H3N2)和1977年的俄罗斯流感(H1N1再次爆发)。我国在近半个世纪以来(1953年至今),共发生大中小规模的流感17次,其中2次为大流行。
引起流感的病毒是单链核糖核酸病毒,有球形及多形性,直径约80-100nm。也有细丝状的,直径可能就几微米大小。根据其核蛋白(NP)和基质蛋白(M)抗原性的不同被分为甲、乙、丙三型,其中甲型流感病毒具有很强的变异性,是引起人类、家畜及禽类流感流行的主要病毒。
甲型流感病毒属于正黏病毒科流感病毒属,为有包膜分节段的单负链RNA病毒。其基因组由8个单股负链RNA片段组成,每个基因在3′末端和5′末端都带有12-13个保守核苷酸序列。这8个片段可编码10种蛋白,其中,8个蛋白(HA、NA、PB1、PB2、NP、M1、M2和PA)为结构蛋白,NS1和NS2为非结构蛋白,位于宿主细胞的胞质中。根据HA和NA抗原性的差异,甲型流感病毒可分为若干亚型,迄今已发现有18种HA亚型(H1-H18)和11种NA亚型(N1-N11)。任何一对HA和NA均可组合成一个亚型,如H1N1、H3N2、H5N1和H7N9等。
甲型流感病毒能产生低保真RNA聚合酶。低保真RNA聚合酶可引起流感病毒的高突变率以及基因重组,可使流感病毒呈现分子多样性,使每个病毒亚型可进化为多个分支。甲型H1N1流感病毒由经典猪流感病毒、人H3N2型流感病毒、北美禽流感病毒在20世纪90年代后期经过“三重配”后再与北美猪群中流行的H3N2和H1N2猪流感病毒及Eurasia avian-like猪流感病毒重配后而产生,HA和NA抗原的持续变异是引起病毒流行的主要原因。同样地,在家禽市场中,H5N2也会出现持续的重组变异。2012年在西藏的鸡群中就分离到一株天然的H9N2和H5N1重组的H5N2亚型流感病毒。近期报道表明,对水禽长期使用某种药物会导致H5N2亚型流感病毒发生突变进而更易于感染人类。而2013年3月底在上海发现的新型禽流感H7N9病毒是由5个病毒经过4次重组产生,产生两个主要流行株A和B型。即由野鸟H7N9(NA节段)、浙江的H7N3病毒(HA节段)及北京、江苏、上海浙江的家禽H9N2病毒(除HA和NA节段外)重组而产生。由于RNA聚合酶缺乏校正和修复功能,每个核苷酸在复制周期中突变率极高。另外,流感病毒宿主种类繁多,而且分段基因组复制周期短,感染频率高,因此在复制过程中极易发生变异,产生新毒株或新的亚型变种,这种情况在甲型性流感病毒中表现最为突出。并且,这种快速而持续的变异,使得机体免疫系统不能对流感病毒产生长期的免疫力,从而导致流感的反复流行和难以控制。
流感的确诊需要实验室检查证实,目前较为常见的检测方法有病毒分离培养、病毒核酸检测、血清学检测、病毒抗原检测、基因芯片技术等。快速检测方法包括酶联免疫法(ELISA)、流感抗原快速检测试剂盒等、直接和间接免疫荧光法、基于PCR的方法、测序法、寡核苷酸微阵列芯片法和核酸扩增产物质谱检测法等。
目前国内外有一些针对人甲型流感筛查的商品化试剂盒,灵敏度、特异度较高,常见的主要为抗原检测试剂盒(胶体金法)和荧光定量PCR(双重或多重)这2种商品。目前市场上已出现大量利用多重荧光PCR和胶体金的试剂盒可检测一种流感病毒,对甲乙型流感进行分型。
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱,即Matrix-Assisted Laser DesorptionIonisation-Time-Of-Flight Mass Spectrometry(MALDI-TOF MS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱。仪器主要由两部分组成:基质附助激光解吸电离离子源(MALDI)和飞行时间质量分析器(TOF)。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜,基质从激光中吸收能量传递给生物分子,而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子,而使生物分子电离的过程。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道,根据到达检测器的飞行时间不同而被检测,即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比。MALDI-TOF这种软电离技术,适用于混合物及生物大分子的测定,不产生或产生较少的碎片离子。
Chou等([J].J Nanotechnology,2011,9:52)报道了联合使用抗体-磁珠和MALDI-TOF MS以提高对流感病毒检测的敏感性和特异性,该方法使用抗病毒单克隆抗体包被的磁珠作为特异性探针吸附病毒,经过聚丙烯酰胺凝胶电泳提取蛋白质,然后采用MALDI-TOFMS测定其蛋白质构成,得出鉴定结论。此方法可在1h内完成流感病毒的诊断,适用于快速筛查和早期确诊,对流感病毒的预防,疫苗接种和早期治疗具有重要意义。然而,该方法涉及免疫处理,过程复杂,因此限制其大规模应用。
此外,使用MALDI质谱检测大分子核酸时,由于样品离子化程度弱,获得样品信号峰困难,因此,有关MALDI质谱检测大分子核酸的研究报道并不多。1994年,唐凯等报道了大分子核酸质谱检测的相关工作,他们使用MALDI质谱,成功检测到了片段大小为500bp的大分子核酸,该研究拓宽了MALDI质谱检测核酸样品的质量范围。
中国专利申请201210272533.6“建立幽门螺杆菌核酸指纹图谱的方法及其产品”,公开了一种基于质谱技术快速鉴定幽门螺杆菌的方法,包括PCR扩增、SAP酶消化、转录和核酸酶切、纯化、质谱仪检测等步骤。该方法利用飞行时间质谱技术,对分子量和丰度各异的核酸片段进行检测,并形成谱图。但是,该方法中核酸片段经PCR的单碱基延伸扩增后,还需经过SAP酶消化、转录和核酸酶切,仅能识别单个碱基的变化,无法检测有特征序列的长片段DNA。
此外,基于MALDI-TOF MS,开发了一些核酸检测方法,如美国Agena公司的hME和iPLEX方法,德国Bruker公司的GOOD assay方法,韩国GeneMatrix公司的RFMP方法。各公司为了提高质谱仪的分辨率,对目标位点进行检测倾向于检测分子量较小的寡核苷酸片段,如RFMP方法通过对含单核苷酸多态性(SNP)位点的多重PCR产物进行限制性酶切,产生2000~4000Da左右的寡核苷酸片段进行检测,而GOOD assay方法通过磷酸二酯酶(Phosphodiesterase,PDE)将含SNP位点的寡核苷酸片段切割成1000~2000Da左右的小片段进行检测。然而,以上方法,都不可避免地存在操作复杂,耗时长等问题。
此外,美国Sampath等([J].PLoS One,2007,2(5):e489)报道了将RT-PCR和电喷雾色谱相结合的技术(reverse transcription PCR/electrospray-ionization massspectrometry,RT-PCR/ESI-MS)。该方法可快速检测出92种哺乳类动物及禽类流感分离株,推断出30种不同的H及N型病毒(其中包括29种AIV H5N1分离株),准确率高达97%,时间只要短短几小时。同时该技术可以检测混合感染的病毒样品且可用于病毒的各个亚型及未知核酸序列病毒新变异株的大规模检测。但该技术所需的质谱仪价格昂贵,目前还只局限于在少数的研究机构中使用。
中国专利申请200880121570、发明名称“用于诊断和监测精神疾病的方法和生物标志物”报道了可以通过MALDI-TOF质谱技术,检测包括流感病毒在内的近百种与精神疾病相关的生物肽。然而,该方法仅仅简单概括了各种可能的技术,其既没有报道具体方案,也没有报道流感病毒的特定靶点,因此难以教导研究者通过MALDI-TOF质谱技术来检测流感病毒。
因此,目前需要一种能够利用MALDI-TOF质谱技术来改进检测流感病毒的新方法。
发明内容
本发明原理之一在于首次将MALDI-TOF质谱与多重PCR联用,通过优化多重PCR体系,获得靶点扩增产物后,即可直接将扩增产物进行MALDI-TOF MS检测。更具体的说,本方法利用多重PCR特异性地扩增多个大小不同的寡核苷酸片段,利用不同的寡核苷酸片段在质谱分型过程中生成的不同的时间飞行质谱特征峰图,针对多重核酸扩增产物的多个目的基因片段同时进行检测。
本发明原理之二在于,在多重PCR体系优化过程中,通过对目标核酸的全序列进行分析,选取保守序列设计引物进行多重PCR扩增,并且针对PCR扩增结果对引物进行改进,最终选定对于特异性扩增有效的引物序列;为了区分大小相近的PCR产物,在引物中引入不影响PCR扩增的tag序列;将多重PCR产物经纯化后直接进行MALDI-TOF MS分析,从而成功实现了目标核酸的快速检测。
因此,本发明第一个目的是提供一种使用MALDI-TOF MS检测流感病毒多重PCR产物的方法,其特征在于,包括如下步骤:
使用经设计的引物组合对流感病毒DNA进行多重PCR扩增;
将多重PCR产物通过吸附柱进行纯化;
将纯化后的多重PCR产物点样于基质结晶上,通过MALDI-TOF MS检测多重PCR产物的片段的大小;其中,
所述流感病毒选自H1N1、H3N2、H5N1和/或H7N9亚型甲型流感病毒,以及任意两种以上的组合。
在一个实施方案中,所述引物组合为扩增H1N1亚型甲型流感病毒的H1片段的特异性引物与扩增甲型流感病毒M片段的特异性引物的组合,其中用于扩增H1片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2;用于扩增甲型流感病毒M片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
在另一实施方案中,所述引物组合为扩增H3N2亚型甲型流感病毒的H3-1片段、N2片段的特异性引物与扩增甲型流感病毒M片段的特异性引物的组合,其中用于扩增H3-1片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6;用于扩增甲型流感病毒N2片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。
还在另一实施方案中,所述引物组合为扩增H3N2亚型甲型流感病毒的H3-1片段、N2片段的特异性引物、扩增甲型流感病毒M片段的特异性引物的组合,其中用于扩增H3-1片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6;用于扩增甲型流感病毒N2片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10,以及用于扩增甲型流感病毒M片段的特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
在一个具体实施方案中,用于扩增H3-2片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8;用于扩增甲型流感病毒N2片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10,以及用于扩增甲型流感病毒M片段的特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQID NO.4。
在其他的实施方案中,所述引物组合为扩增H5N1亚型甲型流感病毒的H5片段、N1片段的特异性引物的组合,其中用于扩增H5片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.11和SEQID NO.12;用于扩增甲型流感病毒N1片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14。
在另一实施方案中,所述引物组合为扩增H7N9亚型甲型流感病毒的H7片段、N9片段的特异性引物与扩增甲型流感病毒M片段的特异性引物的组合,其中用于扩增H7片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、用于扩增甲型流感病毒N9片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18,以及用于扩增甲型流感病毒M片段的特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
上述任一实施方案中,其中所述引物组合可根据需要加入tag序列,使多重PCR产物的大小能够容易地由MALDI-TOF MS进行区分。在一个具体实施方案中,所述tag序列为ACGTTGGATG。在优选的实施方案中,扩增H3N2亚型甲型流感病毒的H3-2片段、扩增H5N1亚型甲型流感病毒的N1片段,以及扩增H7N9亚型甲型流感病毒的N9片段的两个引物都含有tag序列。
上述任一实施方案中,其中在所述PCR扩增的反应体系25μl中含有:
每组引物0.5-1μl
dNTP与Taq酶预混物12.5μl
DNA模板1-3μl
余量为双蒸水。
在一个优选实施方案中,其中每组引物对的浓度控制在10-20μM之间。
在另一优选实施方案中,其中在PCR扩增反应程序为:94-95℃预变性5min;94-95℃变性30s,55-60℃退火30s,72-75℃延伸40-60s,进行35-45个循环;然后,72-75℃延伸5min。
在上述任一实施方案中,其中在所述MALDI-TOF MS检测中所使用的点样基质中含有甲酸。在一个具体实施方案中,在所述MALDI-TOF MS检测中所使用的点样基质的组成为,3-HPA∶DHC∶甲酸=4∶2∶1。
本发明第二目的是提供用于上述MALDI-TOF MS检测流感病毒的多重PCR产物的引物组合,其中该流感病毒选自H1N1、H3N2、H5N1和/或H7N9亚型甲型流感病毒,以及任意两种以上的组合,并且该引物组合包括,
用于扩增H1N1亚型甲型流感病毒的H1片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2;
用于扩增甲型流感病毒M片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4;
用于扩增H3N2亚型甲型流感病毒的H3-1片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6;
用于扩增H3N2亚型甲型流感病毒N2片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.9和SEQID NO.10;
用于扩增甲型流感病毒M片段的特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQID NO.4;
用于扩增H3N2亚型甲型流感病毒的H3-2片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8;
用于扩增H3N2亚型甲型流感病毒N2片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.9和SEQID NO.10;
用于扩增甲型流感病毒M片段的特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQID NO.4。
用于扩增H5N1亚型甲型流感病毒的H5片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12;
用于扩增H5N1亚型甲型流感病毒的N1片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14;
用于扩增H7N9亚型甲型流感病毒的H7片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16;
用于扩增H7N9亚型甲型流感病毒的N9片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18;
以及用于扩增甲型流感病毒M片段的特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
上述任一实施方案中,其中所述引物组合可根据需要加入tag序列,使多重PCR产物的大小能够容易地由MALDI-TOF MS进行区分。在一个具体实施方案中,所述tag序列为ACGTTGGATG。在优选的实施方案中,扩增H3N2亚型甲型流感病毒的H3-2片段、扩增H5N1亚型甲型流感病毒的N1片段,以及扩增H7N9亚型甲型流感病毒的N9片段的两个引物都含有tag序列。
本发明第三个目的是提供用于上述质谱法(MALDI-TOF MS)检测流感病毒的多重PCR产物的质谱试剂盒,其中该流感病毒选自H1N1、H3N2、H5N1和/或H7N9亚型甲型流感病毒,以及任意两种以上的组合,并且该试剂盒包含上述用于扩增上述病毒的特异性引物组合、质谱专用点样基质。
在一个实施方案中,所述点样基质的组成为,3-HPA∶DHC∶甲酸=4∶2∶1。
在另一实施方案中,所述引物组合为扩增H1N1亚型甲型流感病毒的H1片段的特异性引物与扩增甲型流感病毒M片段的特异性引物的组合,其中用于扩增H1片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2;用于扩增甲型流感病毒M片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
在另一实施方案中,所述引物组合为扩增H3N2亚型甲型流感病毒的H3片段、N2片段的特异性引物与扩增甲型流感病毒M片段的特异性引物的组合,其中用于扩增H3-1片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6;用于扩增甲型流感病毒N2片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。
还在另一实施方案中,所述引物组合为扩增H3N2亚型甲型流感病毒的H3片段、N2片段的特异性引物、扩增甲型流感病毒M片段的特异性引物的组合,其中用于扩增H3-1片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6;用于扩增甲型流感病毒N2片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10,以及用于扩增甲型流感病毒M片段的特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
在一个具体实施方案中,用于扩增H3-2片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8;用于扩增甲型流感病毒N2片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10,以及用于扩增甲型流感病毒M片段的特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQID NO.4。
在其他的实施方案中,所述引物组合为扩增H5N1亚型甲型流感病毒的H5片段、N1片段的特异性引物的组合,其中用于扩增H5片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.11和SEQID NO.12;用于扩增甲型流感病毒N1片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14。
在另一实施方案中,所述引物组合为扩增H7N9亚型甲型流感病毒的H7片段、N9片段的特异性引物与扩增甲型流感病毒M片段的特异性引物的组合,其中用于扩增H7片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、用于扩增甲型流感病毒N9片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18,以及用于扩增甲型流感病毒M片段的特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
上述任一实施方案中,其中所述引物组合可根据需要加入tag序列,使多重PCR产物的大小能够容易地由MALDI-TOF MS进行区分。在一个具体实施方案中,所述tag序列为ACGTTGGATG。在优选的实施方案中,扩增H3N2亚型甲型流感病毒的H3片段、扩增H5N1亚型甲型流感病毒的N1片段,以及扩增H7N9亚型甲型流感病毒的N9片段的两个引物都含有tag序列。
上述任一实施方案中,其中在所述PCR扩增的反应体系25μl中含有:
每组引物0.5-1μl
dNTP与Taq酶预混物12.5μl
DNA模板1-3μl
余量为双蒸水。
在一个优选实施方案中,其中每组引物对的浓度控制在10-20μM之间。
在另一优选实施方案中,其中在PCR扩增反应程序为:94-95℃预变性5min;94-95℃变性30s,55-60℃退火30s,72-75℃延伸40-60s,进行35-45个循环;然后,72-75℃延伸5min。
在上述任一实施方案中,所述试剂盒还包括质谱专用微阵列芯片、质谱内标标准品、质谱外标标准品。
在上述任一实施方案中,其中所述试剂盒是用于检测一种或多种甲型流感病毒的试剂盒。
技术效果
本发明首次实践了将多重PCR产物纯化后直接应用于MALDI-TOF MS并成功分离多重PCR产物的方法,与现有技术相比,本发明具有以下优点:
1、本发明首次提出利用多重PCR结合临床质谱实现对流感病毒的多重检测,具有极高的生物学价值。除上述的临床意义之外,此项研究还将在病毒学研究领域为以流感病毒为代表的RNA病毒提供新的方法,并为发现复杂多变的新型病毒提供研究方法和线索。
2、本发明检测甲型流感病毒快速方便,一次性上机就可以同时完成多个样品多个亚型的甲型流感病毒核酸检测;成本低,内含甲型病毒各个亚型的特异性引物,无需设计合成探针即可完成鉴定;选择性多,既可以单重检测引物,也可以双重以及多重检测引物。
3、本发明的引物组合特异性好,扩增效率高,可以很好地应用于多重PCR产物的扩增,并且,多重PCR产物经纯化后可以直接通过MALDI-TOF MS对纯化的多重PCR产物进行检测。通过MALDI-TOF MS准确快速地检测多重PCR产物,可以避免临床上因诊断不及时而延误病情。
4、在进行检测分析时,若2重PCR产物质谱检测出预期的两个峰信号则表明检测到目标DNA;若3重PCR产物质谱检测出预期的三个峰信号则表明检测到目标DNA。可以通过目标产物的大小对检测结果进行进一步的确认。检测结果通过质谱图可以容易地观测到,操作方便快捷。即使是没有受过特别训练的非专业人员,也可以在说明书的指导下成功实施本发明的检测方法。
5、本发明除了具有较强的可操作性、提高了检测效率、缩短了检测时间,提高了检测结果的可信度之外,本发明实施的多重PCR是在同一个PCR体系中完成,节约了样本DNA以及PCR扩增体系各试剂特别是Taq的使用量,大大降低了检测成本,可广泛应用于临床多种传染性疾病的快速诊断。
6、另外,本发明可用于检测有特征序列的长片段DNA而非识别单个碱基的变化,能够实现最大能够检测到长度为600bp的单链信号峰,拓宽了MALDI-TOF MS检测核酸样品的质量范围,使得质谱检测大分子核酸样品成为可能。同时,该方法克服了多管增加污染的概率,简化了操作,可同时检测多个样本,缩短了检测时间,保持了检测灵敏度和特异性,在临床具有较高的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例2中Clin-ToF-Ⅱ检测H1N1的H1和M的2重PCR产物结果图。
图2为本发明实施例3中Clin-ToF-Ⅱ检测H3N2的H3-1、N2和M的3重PCR产物结果图。
图3为本发明实施例4中Clin-ToF-Ⅱ检测H3N2的H3-2、N2和M的3重PCR产物结果图。
图4为本发明实施例5中Clin-ToF-Ⅱ检测H5N1的H5和N1的2重PCR产物的结果图。
图5为本发明实施例6中Clin-ToF-Ⅱ检测H7N9的H7、N9和M的3重PCR产物的结果图。
图6为对照实施例针对实施例2的PCR扩增结果的电泳图。
图7为对照实施例针对实施例6的PCR扩增结果的电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件实施。
需特别指出的是,尽管本发明的实施例中呈现的是50,000Da以下多重PCR产物的质谱检测数据,但50,000-100,000Da之间的多重PCR产物也可检测到,因此应用本发明对50,000-100,000Da之间的多重PCR产物质谱检测也包括在本发明所要求的权利范围之内。
实施例1.引物设计
为了检测甲型流感病毒,共搜集了H1N1、H3N2、H5N1和H7N9这4种常见亚型的甲型流感病毒的下述9个核酸序列。提取病毒RNA,针对目的检测区段(M、H1、H3、H5、H7、N1、N2、N9等)设计反转录引物,并把这些片段反转录为cDNA后,连接到质粒载体PmdTM19-T SimpleVector上进行转化,合成了分别包含该9个核酸序列的9个质粒。
经鉴定后提取质粒DNA,利用NanoDrop ND-2000核酸检测仪测量质粒DNA的浓度,确定DNA的拷贝数作为敏感度的标准品定量母液。
在以下序列中,将本发明选取的引物所对应的序列以下划线表示。
(1)H1N1的H1片段
Influenza A virus(A/canine/Beijing/cau9/2009(H1N1))segment4hemagglutinin(HA)gene,partial cds
GenBank:JN540094.1
AGTGAGGGATCACGAAGGGAGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTAGAAGCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCGCAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAGACACCCAAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATATACATCCGATCACAATTGGAACATGTCCAAAATATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAATGTCCCGTCTATTCAATCTAGAGGCCTATTTGGGGCCATTGCCGGT
引物序列来源:几种甲型H1N1流感病毒SYBR Green I荧光RT-PCR检测方法的验证,《口岸卫生控制》,2013,18(6),28-33
(2)H3N2的H3片段
①Influenza A virus(A/JiangxiDonghu/110.44/2010(H3N2))segment4hemagglutinin(HA)gene,partial cds
GenBank:KR870226.1
CAACAGGTAAAATATGCGACAGTCCTCATCAGATCCTTGATGGAAAAAACTGCACACTAATAGATGCTCTATTGGGAGACCCTCAGTGTGATGGCTTCCAAAATAAGAAATGGGACCTTTTTGTTGAACGCAGCAAAGCCTACAGC AACTGTTACCCTTATGATGTGCCGGATTATGCCTCCCTTAGGTCACTAGTTGCCTCATCCGGCACACTGGAGTTTAACAATGAAAGCTTCAATTGGACTGGAGTCACTCAAAACGGAACAAGCTCTGCTTGCATAAGGGGATCTAAAAACAGTTTCTTTAGTAGATTGAATTGGTTGACCCACTTAAACTTCAAATACTCAGCATT
引物序列来源:五重荧光定量RT-PCR检测甲型流感病毒方法的建立和应用及2010-2013年杭州地区人H3N2病毒流行病学分析,浙江大学医学院硕士学位论文(2015),临床检验诊断学
②Influenza A virus(A/chicken/Ganzhou/GZ157/2016(H3N2))segment4hemagglutinin(HA)gene,complete cds
GenBank:KY415634.1
CACAAATGTGACAATGTTTGCATAGAGTCAATTAGAAATGGGACTTATGACCATGACGTATACAGGGATGAGGCATTGAACAACCGGTTCCAAATCAAAGGTGTTGAGCTAAAATCTGGGTACAAAGACTGGATCCTGTGGATTTCCTTTGCCATATCATGCTTTTTGCTTTGTGTTGTTTTGCTGGGGTTCATTATGTGGGCCTGCCAGAGAGGCAACATTAGGTGCAACATTTGCATTTGAGTATACTAATAATTAAAAACACCCTTGTTTCTACT
引物序列来源:H3N2亚型禽流感病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立,动物医学进展,2015,36(9):28-32
(3)H3N2的N2片段
Influenza A virus(A/blue-winged teal/Guatemala/CIP049H108-45/2012(H3N2))segment 6neuraminidase(NA)gene,complete cds
GenBank:KY644439.1
ACGCTGAACAACAAACACTCAAACGGTACAATACATGATAGGATCCCACACCGGACCCTTTTAATGAGTGAATTGGGTGTTCCGTTTCATTTGGGAACCAAACAAGTGTGCATAGCATGGTCCAGCTCAAGTTGCCATGATGGGAAAGCATGGTTGCATGTCTGTGTCACTGGGGATGATAGAAATGCAACTGCTAGTTTCATTTATGATGGGATGCTTGTTGACAGTATTGGTTCATGGTCTCAAAATATCCTCAGGACTCAGGAGTCAGAATGTGTTTCTATCATCCCCAGTGACACAG
引物序列来源:H3N2亚型禽流感病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立,动物医学进展,2015,36(9):28-32
(4)通用M片段(除H5N1外)
Influenza A virus(A/Fujian/S03/2015(H7N9))segment 7matrix protein 2(M2)and matrix protein 1(M1)genes,complete cds
GenBank:KY286430.1
>KY286430.1Influenza A virus(A/Fujian/S03/2015(H7N9))segment 7matrixprotein2(M2)and matrix protein 1(M1)genes,complete cds
CGCGCAGAGACTTGAGGATGTTTTTGCAGGGAAGAACGCAGATCTTGAGGCTCTCATGGAGTGGATAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTTAGGGTTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGGTTTGTTCAAAACGCCCTAAATGGGAATGGAGACCCAAACAACAT
引物序列来源:五重荧光定量RT-PCR检测甲型流感病毒方法的建立和应用及2010-2013年杭州地区人H3N2病毒流行病学分析,浙江大学医学院硕士学位论文(2015),临床检验诊断学,戴玉柱,导师:陈瑜
(5)H5N1的H5片段
Influenza A virus(A/bar-headed goose/Qinghai/13/2008(H5N1))segment4hemagglutinin(HA)gene,complete cds
GenBank:FJ602828.1
CATACTGGAAAAGACACACAACGGGAAGCTCTGCGATCTAAATGGAGTAAAGCCTCTCATTATGAGAGATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTCCTCGGAAACCCTATGTGTGACGAATTCACCAATGTGCCGGAATGGTCTTACATAG TGGAGAAGGCCAGTCCAGCCAATGACCTCTGTTACCCAGGGGATTTCAACGACTATGAAGAACTGAAACACCTATTGAGCAGAATAAACCATTTTGAGAAAATTCAGATCATCCCCAAAAGTTCTTGGTCCAA
引物序列来源:建立实时荧光定量PCR技术检测H5N1亚型高致病力禽流感病毒,中华检验医学杂志,2009,32(1):68-71
(6)H5N1的N1片段
Influenza A virus(A/chicken/France/150169a/2015(H5N1))segment6neuraminidase(NA)gene,complete cds
GenBank:KU310449.1
TCTATTGAATGACAAACACTCCAATGGGACCGTCAAAGATAGAAGCCCCTACAGAACTTTGATGAGTTGTCCCGTGGGTGAGGCTCCTTCCCCATACAATTCAAGATTTGAGTCTGTTGCTTGGTCGGCAAGTGCCTGTCATGATG GCATCAATTGGTTGACAATCGGGATTTCTGGTCCAGACAATGGGGCTGTGGCTGTATTGAAGTACAATGGCATAATAACGGACACTATCAAGAGTTGGAGAAATAACATTTTGAGGACTCAAGAATCTGAGT
引物序列来源:建立实时荧光定量PCR技术检测H5N1亚型高致病力禽流感病毒,中华检验医学杂志,2009,32(1):68-71
(7)H7N9的H7片段
Influenza A virus(A/Qingyuan/GIRD01/2017(H7N9))segment 4hemagglutinin(HA)gene,complete cds
GenBank:KY621542.1
GATTCACATACAATGGAATAAGAACTAATGGGGTGACCAGTGCATGTAGGAGATCAGGATCTTCATTCTATGCAGAAATGAAATGGCTCCTGTCAAACACAGATAATGCTGCATTCCCGCAGATGACTAAGTCATATAAAAATACA AGAGAAAGCCCAGCTATAATAGTATGGGGGATCCATCATTCCGTTTCAACTGCAGAGCAAACCA
引物序列来源:H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立,中国农业科学,2015,48(15):3050-5
(8)H7N9的N9片段
Influenza A virus(A/chicken/Ganzhou/GZ79/2016(H7N9))segment6neuraminidase(NA)gene,complete cds
GenBank:KY415729.1
ATATTATTTCAAAGAGGGAAAAATATTGAAATGGGAGTCTCTGACAGGAACTGCCAAGCATATTGAGGAATGCTCATGTTACGGGGAACGAACAGGAATTACTTGCACATGTAGAGACAATTGGCAGGGCTCAAATAGACCAGTAATTCAAATAGATCCAGTGGCAATGACACACACTAGTCAGTATATATGCAGTCCTGTTCTCACAGACAATCCCCGACCGAATGACCCAAATGTAGGTAAGTGTAACGATCCTTATCCAGGTAATAATAACAATGGAGTCAAAGGGTTCTCATACCTGGATGGGGTTAACACGTGGCTAGGGAGGACAATAAGCACAGCTTCGAGGTCTGGATATGAGATGCTAAAAGTGCCAAATGCATTGACAGATGATAGATCAAAGCCCATTCAAGGTC
引物序列来源:H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立,中国农业科学,2015,48(15):3050-5
引物来自于目标DNA的保守序列,可选地根据需要加入tag序列,使多重PCR产物的大小能够容易地由MALDI-TOF MS进行区分。
每个质粒对应的特异性PCR引物信息如表1。
其中H3-2、N1和N9的引物均附加了10bp的tag序列ACGTTGGATG,该序列为Agena验证的对PCR扩增无影响的一段很稳定的序列。其中,需要说明的是,甲型流感病毒的M片段特异性引物为甲型流感病毒通用引物。
表1.引物信息表
实施例2.H1N1亚型甲型流感病毒的2重PCR扩增
1.合成H1N1亚型甲型流感病毒的H1和M两个片段的质粒,并设计与其保守序列对应的特异性引物,质粒、特异性引物全部由上海捷瑞生物工程有限公司合成。质粒配成10ng/μL的工作液,引物配成10μM的工作液。
如表1所示,使用下述引物对。
第一引物对H1:
上游引物:
SEQ ID NO.1:5′-TGCTGGATCTGGTATTATC-3′,
下游引物:
SEQ ID NO.2:5′-TGGGAGGCTGGTGTTTATAG-3′;
第二引物对M:
上游引物:
SEQ ID NO.3:5′-GGCGTTTTGAACAAACCGTC-3′,
下游引物:
SEQ ID NO.4:5′-CAATCCTGTCACCTCTGACT-3′。
2.PCR扩增
1)PCR反应体系的组成如下:
第一引物对 1μl
第二引物对 1μl
dNTP与Taq酶预混物12.5μl
质粒H1 1μl
质粒M1μl
双蒸水8.5μl
引物浓度在10-20μM之间。
2)PCR扩增反应程序如下:
使用SMART PCR仪对DNA进行扩增,95℃预变性5min;95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,进行45个循环,最后72℃延伸5min。
实施例3.H3N2的3重PCR扩增
1.合成H3N2亚型甲型流感病毒的H3、N2和M三个片段的质粒,并设计与其保守序列对应的特异性引物,质粒、特异性引物全部由上海捷瑞生物工程有限公司合成。质粒配成10ng/μL的工作液,引物配成10μM的工作液。如表1所示,使用下述引物对。
第一引物对H3-1:
上游引物:
SEQ ID NO.5:5′-CCGGATGAGGCAACTAGTGA-3′,
下游引物:
SEQ ID NO.6:5′-GCAGCAAAGCCTACAGCAAC-3′;
第二引物对N2:
上游引物:
SEQ ID NO.9:5′-TATCATCCCCAGTGACACAG-3′,
下游引物:
SEQ ID NO.10:5′-TGGGAACCAAACAAGTGTGC-3′;
第三引物对M:
上游引物:
SEQ ID NO.3:5′-GGCGTTTTGAACAAACCGTC-3′,
下游引物:
SEQ ID NO.4:5′-CAATCCTGTCACCTCTGACT-3′。
2.PCR扩增
1)PCR反应体系的组成如下:
第一引物对0.5μl
第二引物对0.5μl
第三引物对0.5μl
dNTP与Taq酶预混物12.5μl
质粒H31μl
质粒N21μl
质粒M1μl
双蒸水8μl
引物浓度在10-20μM之间。
2)PCR扩增反应程序如下:
使用SMART PCR仪对DNA进行扩增,95℃预变性5min;95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,进行45个循环,最后72℃延伸5min。
实施例4.使用带有tag的引物的H3N2的3重PCR扩增
1.合成H3N2亚型甲型流感病毒的H3、N2和M三个片段的质粒,并设计与其保守序列对应的特异性引物,质粒、特异性引物全部由上海捷瑞生物工程有限公司合成。质粒配成10ng/μL的工作液,引物配成10μM的工作液。如表1所示,使用下述引物对。
第一引物对H3-2:
上游引物:
SEQ ID NO.7:5′-ACGTTGGATGGGTGTTGAGCTAAAATCTGG-3′,
下游引物:
SEQ ID NO.8:5′-ACGTTGGATGGAACCCCAGCAAAACAACAC-3′;
第二引物对N2:
上游引物:
SEQ ID NO.9:5′-TATCATCCCCAGTGACACAG-3′,
下游引物:
SEQ ID NO.10:5′-TGGGAACCAAACAAGTGTGC-3′;
第三引物对M:
上游引物:
SEQ ID NO.3:5′-GGCGTTTTGAACAAACCGTC-3′,
下游引物:
SEQ ID NO.4:5′-CAATCCTGTCACCTCTGACT-3′。
2.PCR扩增
1)PCR反应体系的组成如下:
第一引物对0.5μl
第二引物对0.5μl
第三引物对0.5μl
dNTP与Taq酶预混物12.5μl
质粒H31μl
质粒N21μl
质粒M1μl
双蒸水8μl
引物浓度在10-20μM之间。
2)PCR扩增反应程序如下:
使用SMART PCR仪对DNA进行扩增,95℃预变性5min;95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,进行45个循环,最后72℃延伸5min。
实施例5.H5N1的2重PCR扩增
1.合成H5N1亚型甲型流感病毒的H5和N1两个片段的质粒,并设计与其保守序列对应的特异性引物,质粒、特异性引物全部由上海捷瑞生物工程有限公司合成。质粒配成10ng/μL的工作液,引物配成10μM的工作液。如表1所示,使用下述引物对。
第一引物对H5:
上游引物:
SEQ ID NO.11:5′-GGCCTTCTCCACTATGTAAG-3′,
下游引物:
SEQ ID NO.12:5′-TGGCTCCTCGGAAACCCTAT-3′;
第二引物对N1:
上游引物:
SEQ ID NO.13:5′-ACGTTGGATGTTGATGCCATCATGACAGG-3′,
下游引物:
SEQ ID NO.14:5′-ACGTTGGATGGAGGCTCCTTCCCCATACAA-3′。
2.PCR扩增
1)PCR反应体系的组成如下:
第一引物对1μl
第二引物对1μl
dNTP与Taq酶预混物12.5μl
质粒H51μl
质粒N1 1μl
双蒸水8.5μl
引物浓度在10-20μM之间。
2)PCR扩增反应程序如下:
使用SMART PCR仪对DNA进行扩增,95℃预变性5min;95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,进行45个循环,最后72℃延伸5min。
实施例6.H7N9的3重PCR扩增
1.合成H7N9甲流病毒的H7、N9和M片段的质粒,并设计与其保守序列对应的特异性引物,质粒、特异性引物全部由上海捷瑞生物工程有限公司合成。质粒配成10ng/μL的工作液,引物配成10μM的工作液。如表1所示,使用下述引物对。
第一引物对H7:
上游引物:
SEQ ID NO.15:5′-GCTGGGCTTTCTCTTGTATT-3′,
下游引物:
SEQ ID NO.16:5′-GAAATGAAATGGCTCCTGTC-3′;
第二引物对N9:
上游引物:
SEQ ID NO.17:5′-ACGTTGGATGCAATGACACACACTAGTCAG-3′,
下游引物:
SEQ ID NO.18:5′-ACGTTGGATGACCTGGATAAGGATCGTTAC-3′;
第三引物对M:
上游引物:
SEQ ID NO.3:5′-GGCGTTTTGAACAAACCGTC-3′,
下游引物:
SEQ ID NO.4:5′-CAATCCTGTCACCTCTGACT-3′。
2.PCR扩增
1)PCR反应体系:
第一引物对 1μl
第三引物对 1μl
第四引物对 1μl
dNTP与Taq酶预混物12.5μl
质粒M1μl
质粒H7 1μl
质粒N91μl
双蒸水6.5μl
引物浓度在10-20μM之间。
2)扩增反应程序:
使用SMART PCR仪对DNA进行扩增,95℃预变性5min;95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,进行45个循环,最后72℃延伸5min;
实施例7.多重PCR产物的纯化
将多重PCR产物通过DNA吸附柱进行纯化以去除样品内的盐离子和金属离子。多重PCR产物的纯化使用Zymo-DNA纯化浓缩试剂盒,可以按照如下操作进行:
按照DNA Binding Buffer∶多重PCR产物=5∶1的体积比向多重PCR产物中加入Binding Buffer后混匀;将上述混合液转移至吸附柱,吸附柱于收集管内,使用离心机10,000g离心30s,弃掉废液;加200μl DNA Wash Buffer于吸附柱中,使用离心机10,000g离心30s,重复该洗涤1次;加≥6μl的ddH2O于吸附柱中,室温放置1min后转移至新的1.5ml离心管中10,000g离心30s获得纯化后的产物。
按照上述操作步骤操作即可完成质谱检测所需的纯化后的多重PCR产物。
实施例8.质谱检测
将上述多重PCR产物进行纯化后使用临床飞行时间质谱Clin-TOF-Ⅱ(MALDI-TOFMS)质谱仪进行检测,点样基质的组成为,3-HPA∶DHC∶甲酸=4∶2∶1。点样基质中,所使用的3-HPA和DHC浓度分别为60mg/ml和25mg/ml,溶剂均为40%的乙腈水溶液,所使用的甲酸纯度大于98%。基质点样体积为1.5μl/孔,样品的上样体积为1μl/孔。
使用含甲酸的点样基质能够检测到目标信号。如果使用不含甲酸的点样基质(3-HPA∶DHC=4∶2),则基本检测不到信号,说明甲酸的添加能够辅助目标信号的检测。
质谱的具体检测结果参见图1至图5。
图1为本发明实施例2(H1N1)中MALDI-TOF MS检测的图谱。点样基质为3-HPA∶DHC∶甲酸=4∶2∶1。图1显示,实施例2(H1N1)的多重PCR产物在29,286Da和31,500Da处检测到峰信号。
图2为本发明实施例3(H3N2)中MALDI-TOF MS检测的图谱。点样基质为3-HPA∶DHC∶甲酸=4∶2∶1。图2显示,实施例3(H3N2)的多重PCR产物在25,092Da、28,325Da和31,868Da处检测到峰信号。
图3为本发明实施例4(H3N2)中MALDI-TOF MS检测的图谱。点样基质为3-HPA∶DHC∶甲酸=4∶2∶1。图3显示,实施例4(H3N2)的多重PCR产物在28,077、31,729Da和36,375Da处检测到峰信号。
图4为本发明实施例5(H5N1)中MALDI-TOF MS检测的图谱。点样基质为3-HPA∶DHC∶甲酸=4∶2∶1。图4显示,实施例5(H5N1)的多重PCR产物在22,799Da和29,490Da处检测到峰信号。
图5为本发明实施例6(H7N9)中MALDI-TOF MS检测的图谱。点样基质为3-HPA∶DHC∶甲酸=4∶2∶1。图5显示,实施例6(H7N9)的多重PCR产物在27,072Da、31,740Da和38,075Da处检测到峰信号。
为检测多重PCR产物在MALDI-TOF MS上的灵敏度,将不同片段大小的多重PCR产物进行稀释,结果表明MALDI-TOF MS的检测下限(灵敏度)为305fmol的多重PCR产物(单链)及152fmol的多重PCR产物(双链)。
工业实用性
本发明是将多重核酸扩增产物直接进行质谱检测的方法,更具体的说,本方法利用不同的寡核苷酸片段在质谱分型过程中生成的不同的时间飞行质谱特征峰图,针对多重核酸扩增产物的多个目的基因片段同时进行检测。本检测方法操作简便,检测效率高,且该检测方法具有很高的敏感性、准确性以及应用性,可良好的用于临床多种感染性疾病的鉴定,适于大范围推广应用。本方法能够减少污染的概率,缩短检测时间,保持检测灵敏度和特异性,在临床上具有较高的应用前景。
对照实施例:多重PCR扩增产物的电泳结果
根据本发明的方法,依照实施例1-8中所描述的操作步骤,对上述实施例2和6的扩增结果进行纯化和电泳检测,步骤如下:
按照DNA Binding Buffer:PCR产物=5:1的体积比往PCR产物中加入BindingBuffer后混匀;
将上述混合液转移至吸附柱,吸附柱于收集管内,10,000g离心30s,弃掉废液;加200μL DNA Wash Buffer于吸附柱中,10,000g离心30s,重复该洗涤1次;加≥6μL的ddH2O于吸附柱中,室温放置1min后转移至新的1.5mL离心管中10,000g离心30s,获得纯化后的产物。
取反应产物5μl加在1.0%琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml EB)板上,在TAE电泳液中电泳观察结果。
电泳结果显示,实施例2的2重PCR扩增产物中,扩增出94bp和101bp的两条条带,经过和表1进行比较,判断该片段为H1片段和M片段,见图6。
实施例6的3重PCR扩增产物中,扩增出86bp、101bp和121bp的3条带,经过和表1进行比较,判断该片段为H7片段、N9和M片段,见图7。
由此可见,本发明质谱法既能对多重PCR的产物进行准确定量,同时由能联合多重PCR方法快速获得检测结果,而避免了小分子片段电泳时间过长、分辨率低的缺点。
序列表
<110> 北京毅新博创生物科技有限公司
<120> 质谱法检测甲型流感病毒H1N1片段多重PCR产物的方法及其产品
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 1
tgctggatct ggtattatc 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 2
tgggaggctg gtgtttatag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 3
ggcgttttga acaaaccgtc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 4
caatcctgtc acctctgact 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 5
ccggatgagg caactagtga 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 6
gcagcaaagc ctacagcaac 20
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 7
acgttggatg ggtgttgagc taaaatctgg 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 8
acgttggatg gaaccccagc aaaacaacac 30
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 9
tatcatcccc agtgacacag 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 10
tgggaaccaa acaagtgtgc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 11
ggccttctcc actatgtaag 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 12
tggctcctcg gaaaccctat 20
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 13
acgttggatg ttgatgccat catgacagg 29
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 14
acgttggatg gaggctcctt ccccatacaa 30
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 15
gctgggcttt ctcttgtatt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 16
gaaatgaaat ggctcctgtc 20
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 17
acgttggatg caatgacaca cactagtcag 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 18
acgttggatg acctggataa ggatcgttac 30
<210> 19
<211> 349
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 19
agtgagggat cacgaaggga gaatgaacta ttactggaca ctagtagagc cgggagacaa 60
aataacatta gaagcaactg gaaatctagt ggtaccgaga tatgcattcg caatggaaag 120
aaatgctgga tctggtatta tcatttcaga tacaccagtc cacgattgca atacaacttg 180
tcagacaccc aagggtgcta taaacaccag cctcccattt cagaatatac atccgatcac 240
aattggaaca tgtccaaaat atgtaaaaag cacaaaattg agactggcca caggattgag 300
gaatgtcccg tctattcaat ctagaggcct atttggggcc attgccggt 349
<210> 20
<211> 352
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 20
caacaggtaa aatatgcgac agtcctcatc agatccttga tggaaaaaac tgcacactaa 60
tagatgctct attgggagac cctcagtgtg atggcttcca aaataagaaa tgggaccttt 120
ttgttgaacg cagcaaagcc tacagcaact gttaccctta tgatgtgccg gattatgcct 180
cccttaggtc actagttgcc tcatccggca cactggagtt taacaatgaa agcttcaatt 240
ggactggagt cactcaaaac ggaacaagct ctgcttgcat aaggggatct aaaaacagtt 300
tctttagtag attgaattgg ttgacccact taaacttcaa atactcagca tt 352
<210> 21
<211> 278
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 21
cacaaatgtg acaatgtttg catagagtca attagaaatg ggacttatga ccatgacgta 60
tacagggatg aggcattgaa caaccggttc caaatcaaag gtgttgagct aaaatctggg 120
tacaaagact ggatcctgtg gatttccttt gccatatcat gctttttgct ttgtgttgtt 180
ttgctggggt tcattatgtg ggcctgccag agaggcaaca ttaggtgcaa catttgcatt 240
tgagtatact aataattaaa aacacccttg tttctact 278
<210> 22
<211> 301
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 22
acgctgaaca acaaacactc aaacggtaca atacatgata ggatcccaca ccggaccctt 60
ttaatgagtg aattgggtgt tccgtttcat ttgggaacca aacaagtgtg catagcatgg 120
tccagctcaa gttgccatga tgggaaagca tggttgcatg tctgtgtcac tggggatgat 180
agaaatgcaa ctgctagttt catttatgat gggatgcttg ttgacagtat tggttcatgg 240
tctcaaaata tcctcaggac tcaggagtca gaatgtgttt ctatcatccc cagtgacaca 300
g 301
<210> 23
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 23
cgcgcagaga cttgaggatg tttttgcagg gaagaacgca gatcttgagg ctctcatgga 60
gtggataaag acaagaccaa tcctgtcacc tctgactaag gggattttag ggtttgtgtt 120
cacgctcacc gtgcccagtg agcgaggact gcagcgtaga cggtttgttc aaaacgccct 180
aaatgggaat ggagacccaa acaacat 207
<210> 24
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 24
catactggaa aagacacaca acgggaagct ctgcgatcta aatggagtaa agcctctcat 60
tatgagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcggaaac cctatgtgtg acgaattcac 120
caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccagt ccagccaatg acctctgtta 180
cccaggggat ttcaacgact atgaagaact gaaacaccta ttgagcagaa taaaccattt 240
tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccaa 279
<210> 25
<211> 278
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 25
tctattgaat gacaaacact ccaatgggac cgtcaaagat agaagcccct acagaacttt 60
gatgagttgt cccgtgggtg aggctccttc cccatacaat tcaagatttg agtctgttgc 120
ttggtcggca agtgcctgtc atgatggcat caattggttg acaatcggga tttctggtcc 180
agacaatggg gctgtggctg tattgaagta caatggcata ataacggaca ctatcaagag 240
ttggagaaat aacattttga ggactcaaga atctgagt 278
<210> 26
<211> 210
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 26
gattcacata caatggaata agaactaatg gggtgaccag tgcatgtagg agatcaggat 60
cttcattcta tgcagaaatg aaatggctcc tgtcaaacac agataatgct gcattcccgc 120
agatgactaa gtcatataaa aatacaagag aaagcccagc tataatagta tgggggatcc 180
atcattccgt ttcaactgca gagcaaacca 210
<210> 27
<211> 416
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 27
atattatttc aaagagggaa aaatattgaa atgggagtct ctgacaggaa ctgccaagca 60
tattgaggaa tgctcatgtt acggggaacg aacaggaatt acttgcacat gtagagacaa 120
ttggcagggc tcaaatagac cagtaattca aatagatcca gtggcaatga cacacactag 180
tcagtatata tgcagtcctg ttctcacaga caatccccga ccgaatgacc caaatgtagg 240
taagtgtaac gatccttatc caggtaataa taacaatgga gtcaaagggt tctcatacct 300
ggatggggtt aacacgtggc tagggaggac aataagcaca gcttcgaggt ctggatatga 360
gatgctaaaa gtgccaaatg cattgacaga tgatagatca aagcccattc aaggtc 416
Claims (4)
1.一种非诊断目的质谱法检测流感病毒多重PCR产物的方法,包括如下步骤:
使用经设计的引物组合对流感病毒DNA进行多重PCR扩增;
将多重PCR产物通过吸附柱进行纯化;
将纯化后的多重PCR产物点样于基质结晶上,通过MALDI-TOF MS检测多重PCR产物的片段的大小;其中,
所述引物组合为扩增H1N1亚型甲型流感病毒的H1片段的特异性引物与扩增甲型流感病毒M片段的特异性引物的组合,其中用于扩增H1片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2;用于扩增甲型流感病毒M片段的特异性引物序列为SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4;
所述点样基质的组成为,3-HPA∶DHC∶甲酸=4∶2∶1。
2.权利要求1的方法,其中序列为SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2,SEQ ID NO.3,SEQ IDNO.4的引物上添加tag序列ACGTTGGATG。
3.权利要求1-2任一所述的方法,其中在所述PCR扩增的反应体系25μl中含有:
每组引物0.5-1μl,浓度控制在10-20μM之间,
dNTP与Taq酶预混物12.5μl,
DNA模板1-3μl,
余量为双蒸水。
4.权利要求3的方法,其中在PCR扩增反应程序为:94-95℃预变性5min;94-95℃变性30s,55-60℃退火30s,72-75℃延伸40-60s,进行35-45个循环;然后,72-75℃延伸5min。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810069462.7A CN108085422B (zh) | 2018-01-24 | 2018-01-24 | 质谱法检测甲型流感病毒h1n1片段多重pcr产物的方法及其产品 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810069462.7A CN108085422B (zh) | 2018-01-24 | 2018-01-24 | 质谱法检测甲型流感病毒h1n1片段多重pcr产物的方法及其产品 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108085422A CN108085422A (zh) | 2018-05-29 |
CN108085422B true CN108085422B (zh) | 2021-08-06 |
Family
ID=62182666
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810069462.7A Active CN108085422B (zh) | 2018-01-24 | 2018-01-24 | 质谱法检测甲型流感病毒h1n1片段多重pcr产物的方法及其产品 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108085422B (zh) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101251510A (zh) * | 2008-03-14 | 2008-08-27 | 毅新兴业(北京)科技有限公司 | 一种联合限制性酶切法和质谱法以检测snp的方法 |
CN101899531A (zh) * | 2009-05-25 | 2010-12-01 | 上海人类基因组研究中心 | 检测人甲型流感病毒h1和/或h3亚型的引物及方法 |
CN106834478A (zh) * | 2017-02-24 | 2017-06-13 | 北京毅新博创生物科技有限公司 | 利用质谱进行叶酸遗传代谢能力和钙吸收遗传检测 |
CN107447051A (zh) * | 2017-09-13 | 2017-12-08 | 北京美康基因科学股份有限公司 | 甲型h3/h1n1(2009)/h1n1流感病毒多重荧光pcr检测试剂盒及其用途 |
-
2018
- 2018-01-24 CN CN201810069462.7A patent/CN108085422B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101251510A (zh) * | 2008-03-14 | 2008-08-27 | 毅新兴业(北京)科技有限公司 | 一种联合限制性酶切法和质谱法以检测snp的方法 |
CN101899531A (zh) * | 2009-05-25 | 2010-12-01 | 上海人类基因组研究中心 | 检测人甲型流感病毒h1和/或h3亚型的引物及方法 |
CN106834478A (zh) * | 2017-02-24 | 2017-06-13 | 北京毅新博创生物科技有限公司 | 利用质谱进行叶酸遗传代谢能力和钙吸收遗传检测 |
CN107447051A (zh) * | 2017-09-13 | 2017-12-08 | 北京美康基因科学股份有限公司 | 甲型h3/h1n1(2009)/h1n1流感病毒多重荧光pcr检测试剂盒及其用途 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
Application of multiplex PCR coupled with matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight analysis for simultaneous detection of 21 common respiratory viruses.;Zhang C et al.;《J Clin Microbiol》;20150720;第53卷;第E060-44页 * |
双重实时荧光PCR 对流感病毒检测及分型方法的研究;沃恩康 等;《中国卫生检验杂志》;20130120;第23卷(第1期);第2页左栏第1段, 第2页右栏第2段,第3页第1.4节,表1 * |
基于PCR结合MALDI-TOF MS技术检测胶质瘤IDH突变的研究;刘永涛;《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》;20170215;第E072-2042页 * |
新型快速检测甲型H1N1流感病毒方法的建立及应用;顿博影;《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》;20111215;第2549–2554.页 * |
沃恩康 等.双重实时荧光PCR 对流感病毒检测及分型方法的研究.《中国卫生检验杂志》.2013,第23卷(第1期),第1-4,8页. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN108085422A (zh) | 2018-05-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106435024B (zh) | 检测禽流感病毒亚型的荧光定量pcr引物、探针和试剂盒及检测方法 | |
CN111876524A (zh) | 基于多重pcr-飞行时间质谱检测34种呼吸道病原微生物的引物和探针组合及试剂盒 | |
CN112063765B (zh) | 一种核酸抗体双重检测病毒的试剂盒及其制备方法 | |
CN102803512A (zh) | 检测呼吸道病原体的方法和试剂盒 | |
CN106636472B (zh) | 检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂与方法 | |
US20170152577A1 (en) | GeXP Rapid Detection Primer Set for Simultaneously Identifying Gene HA of Eight Different Human-Infected Subtypes of Avian Influenza Virus, Kit and Use Thereof | |
CN108034770B (zh) | 质谱法检测甲型流感病毒h7n9多重pcr产物的方法及其产品 | |
Alvarez et al. | A broad spectrum, one-step reverse-transcription PCR amplification of the neuraminidase gene from multiple subtypes of influenza A virus | |
CN112280901B (zh) | 一种改进的核酸检测技术在制备病毒检测试剂盒中的用途 | |
CN108359744B (zh) | 检测h3n2片段多重pcr产物的质谱方法及其产品 | |
CN108085421B (zh) | 质谱法检测甲型流感病毒多重pcr产物的方法及其产品 | |
CN104498622A (zh) | 用于检测流感病毒分型的引物、探针及方法 | |
CN106636473B (zh) | 检测h5亚型禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂与方法 | |
CN111518954A (zh) | H5和n8亚型禽流感病毒双重纳米pcr检测的引物组、试剂盒及方法 | |
CN108034769A (zh) | 质谱检测甲型流感病毒h3n2多重pcr产物的方法及其产品 | |
CN110669872A (zh) | H9和h10亚型禽流感病毒三重rt-pcr检测引物组、试剂盒及方法 | |
CN108085422B (zh) | 质谱法检测甲型流感病毒h1n1片段多重pcr产物的方法及其产品 | |
CN108251559B (zh) | 质谱法检测甲型流感病毒h5n1多重pcr产物的方法及其产品 | |
CN113817870B (zh) | 同时检测七种呼吸道相关病毒的引物组合物及其应用 | |
KR101310873B1 (ko) | A형 인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 a형 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물 및 키트, 및 이를 이용한 a형 인플루엔자 바이러스 검출 방법 | |
CN113215321B (zh) | Maldi-tof ms检测生殖道病原体的检测产品及用途 | |
CN111518953A (zh) | H7和n2亚型禽流感病毒双重纳米pcr检测的引物组、试剂盒及方法 | |
CN103789453B (zh) | 一种甲型流感病毒亚型检测微孔板芯片 | |
CN113215329A (zh) | 呼吸道7种亚型流感病毒多重pcr检测的引物、探针和试剂盒 | |
CN107988341B (zh) | 质谱鉴定霍乱弧菌分型的方法及产品 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |