CN104498622A - 用于检测流感病毒分型的引物、探针及方法 - Google Patents

用于检测流感病毒分型的引物、探针及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一组用于检测流感病毒分型的特异性引物对和特异性探针及将其用于检测流感病毒分型的方法，具有快速、简便、成本低、特异性高、灵敏度高的特点，适合大范围推广应用，在对临床乙型流感病毒以及甲型流感病毒中重要亚型进行快速检测和早期诊断方面具有重要的应用价值。

Description

用于检测流感病毒分型的引物、探针及方法
技术领域
本发明属于病毒检测领域，具体地说，是关于用于检测流感病毒分型的引物、探针及方法。
背景技术
流感病毒属于RNA病毒的正粘病毒科，分为甲、乙、丙三种类型。流感病毒的基因组由8个负链的单链RNA片段组成，这8个片段编码10个病毒蛋白，其中8个(HA、NA、NP、M1、M2、PB1、PB2和PA)是病毒粒子的组成成分，另外2个是非结构蛋白NS1和NS2。流感病毒基因组的第4条片段编码叫做血凝素(HA)的主要表面糖蛋白，它负责协助病毒附着宿主细胞表面的唾液酸残基并促使病毒的包膜与宿主细胞膜融合，帮助病毒的基因组进入宿主细胞。第6条片段编码另一种被称为神经氨酸酶(NA)的表面糖蛋白，它能切割宿主细胞表面上糖蛋白和糖脂上的唾液酸残基，从而帮助病毒颗粒从被感染细胞中释放。禽流感病毒属于甲型流感病毒，甲型流感病毒根据HA、NA抗原性差异分为不同亚型，目前已有17个血凝素血清型和10个神经氨酸酶型血清型。其中H1至H3这三个亚型的流感病毒已成为引起人类流感的稳定病毒谱系，尤其是H1N1和H3N2。近些年一些高致病性H5和H7禽流感病毒，如H5N1和H7N9，不仅能导致感染禽类的大量死亡，而且还能引起人类严重的呼吸道疾病甚至导致死亡。由于禽流感病毒抗原变异性强，宿主范围广，各亚型间几乎没有交叉保护性，使得禽流感难以控制和频繁爆发，对世界养禽业及人类健康构成了严重威胁。因此，快速、灵敏、特异可靠的甲型流感病毒分型的早期诊断技术对于临床采取正确的治疗方案和及时应对措施以及防止疾病的传播至关重要。
目前临床用于流感病毒分型检测的技术主要分为免疫学检测技术和分子生物学检测技术。早期的免疫学检测技术，检测周期长且操作繁琐，在准确度和标准化方面有较大缺陷，不能为疾病作出早期、明确的诊断；后来发展酶联免疫吸附检测技术敏感性和特异性较强，但检测需要材料较多且测定结果与抗体来源及亲和力有关。随着流感病毒相关分子生物学研究的深入，流感病毒的鉴别诊断技术也向分子水平发展，建立了依赖核酸序列的扩增技术、核酸探针技术和基因芯片等技术，这些分子生物学检测技术能在较短的时间内准确地检测并确定流感病毒的亚型，检测灵敏度高，但这些分子诊断技术对检测人员的要求较高，不宜普及以及大规模应用。
MASA液相芯片(Multi-Analyte Suspension Array，多功能悬浮点阵仪)技术是20世纪90年代后期发展起来的一种新型芯片技术。该技术将流式检测技术与芯片技术有机的结合在一起，具有高灵敏性，高异性，高通量，操作简单的特点。液相芯片体系由许多大小均一的圆形微球构成，每种微球上固定有不同的探针分子，不同种类的微球带有不同的荧光染料编码，分子杂交在悬浮溶液中进行。检测过程中目的分子能够与偶联在微球上的探针特异性结合，使交联探针的微球携带上报告分子藻红蛋白，当微球通过Luminex检测仪时，该检测仪上的红色和绿色激光分别对单个微球上的编码荧光和报告分子藻红蛋白进行检测，检测结果通过荧光值直接判读。由于液相芯片具有准确性高，灵活性好，操作简单，通量大等特点，目前已被广泛用在细胞因子的检测、激酶的检测、抗原决定簇的筛选、疾病病原体的检测以及与各种抗原抗体反应相关的检测当中。
发明内容
本申请的发明人在对流感病毒分型检测的长期研究过程中，提供了一组利用液相芯片技术快速对乙型流感病毒以及甲型流感病毒中的9个目标靶点进行检测的特异性引物对和特异性探针，并提供了一种利用上述特异性引物对和特异性探针检测乙型流感病毒以及甲型流感病毒分型的方法。
因此，本发明的目的在于提供一组用于检测流感病毒分型的特异性引物对和特异性探针。
本发明的另一个目的在于提供一种利用上述特异性引物对和特异性探针检测流感病毒分型的方法。
为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
根据本发明的第一个方面，用于检测流感病毒分型的特异性引物对和特异性探针，包括：
(1)用于检测甲型流感病毒的H1亚型的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，用于检测甲型流感病毒的H1亚型的特异性探针的核苷酸序列如SEQID NO：3所示；
(2)用于检测甲型流感病毒的H3亚型的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，用于检测甲型流感病毒的H3亚型的特异性探针的核苷酸序列如SEQID NO：6所示；
(3)用于检测甲型流感病毒的H5亚型的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，用于检测甲型流感病毒的H5亚型的特异性探针的核苷酸序列如SEQID NO：9所示；
(4)用于检测甲型流感病毒的H7亚型的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示，用于检测甲型流感病毒的H7亚型的特异性探针的核苷酸序列如SEQID NO：12所示；
(5)用于检测甲型流感病毒H5N1亚型中的N1亚型的特异性引物对的核苷酸序列如SEQID NO：13和SEQ ID NO：14所示，用于检测甲型流感病毒H5N1亚型中的N1亚型的特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示；
(6)用于检测甲型流感病毒的N2亚型的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示，用于检测甲型流感病毒的N2亚型的特异性探针的核苷酸序列如SEQID NO：18所示；
(7)用于检测甲型流感病毒的N9亚型的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示，用于检测甲型流感病毒的N9亚型的特异性探针的核苷酸序列如SEQID NO：21所示；
(8)用于检测甲型流感病毒的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：22和SEQ IDNO：23所示，用于检测甲型流感病毒的特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示；和
(9)用于检测乙型流感病毒的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：25和SEQ IDNO：26所示，用于检测乙型流感病毒的特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示；
其中，所述特异性探针的5’端结合NH2-(CH2)12基团。
根据本发明的第二个方面，用于检测流感病毒分型的方法，包括以下步骤：
A)提取流感病毒样本的总RNA；
B)以步骤A)中获得的总RNA为模板，使用上述的特异性引物对进行RT-PCR扩增；
C)以步骤B)中获得的RT-PCR扩增产物为模板，使用带有生物素标记的通用引物对进行PCR扩增，所述通用引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29所示，其中，所述如SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列的5’端结合有生物素；
D)将上述的特异性探针以共价方式偶联在结合有羧基的微球表面上；
E)将步骤C)中获得的PCR产物与步骤D)中的偶联有特异性探针的微球进行分子杂交；
F)将步骤E)中获得的分子杂交产物与报告分子亲和素-藻红蛋白孵育；
G)将步骤F)中获得的孵育产物检测荧光信号。
根据本发明，所述步骤B)中所述RT-PCR扩增的反应条件如下：50℃，30分钟，1个循环；95℃，15分钟，1个循环；94℃，45秒，56℃，20秒，72℃，30秒，29个循环；72℃，10分钟，1个循环。
根据本发明，所述步骤C)中所述PCR扩增的反应条件如下：94℃，5分钟，1个循环；94℃，15秒，56℃，30秒，72℃，30秒，29个循环；72℃，10分钟，1个循环。
根据本发明，所述步骤E)中所述分子杂交的反应条件如下：避光，95℃下保温5min，56℃下保温15min。
根据本发明，所述步骤F)中所述孵育的反应条件如下：56℃下保温5min。
根据本发明的第三个方面，上述的特异性引物对和特异性探针可用于检测流感病毒分型。
有益效果：本发明提供的使用液相芯片检测乙型流感病毒以及甲型流感病毒中重要亚型的方法，不仅检测速度快，完成一次检测仅需3.5小时，一次检测可以完成多个目的病原体的同时检测，且操作简单，检测费用低，对每种亚型的检测成本仅5元人民币，具有快速、简便、成本低、特异性高、灵敏度高的特点，适合大范围推广应用，能为常见乙型流感病毒以及甲型流感病毒中重要亚型的早期诊断和治疗及防止流感病毒的传播和大规模爆发作出重要贡献。
本发明在对临床乙型流感病毒以及甲型流感病毒中重要亚型进行快速检测和早期诊断方面具有重要的应用价值。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
实施例1、特异性引物对和特异性探针的设计
针对乙型流感病毒以及甲型流感病毒中4种重要亚型H1N1、H3N2、H5N1、H7N9，根据基因库中能够检索到的目标病毒所有的核苷酸序列分别进行同源性分析和设计，设计用于液相芯片技术检测的9组特异性引物对和对应的特异性探针，具体如下，其中，R＝A/G，Y＝C/T，K＝G/T，W＝A/T，S＝C/G。
(1)用于检测甲型流感病毒的H1亚型的特异性引物对和特异性探针的核苷酸序列如下：
InfV A H1-F：5’-TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAAGAATGTRACAGTRACACACTC-3’(SEQ ID NO：1)
InfV A H1-R：5’-CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAGCCATAKYAAATTTTTGTARAA-3’(SEQ ID NO：2)
InfV A H1-probe：5’-NH2-(CH2)12TATGAAGAGCTAAGAGAGCAAYTGAGCTCAGTGTCATCATT-3’(SEQID NO：3).
(2)用于检测甲型流感病毒的H3亚型的特异性引物对和特异性探针的核苷酸序列如下：
InfV A H3-F：5’-TACAGTCGGTCGCGTGCCTCACTGCACACTRATAGATGCYCTA-3’(SEQ ID NO：4)
InfV A H3-R：5’-CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCCTGAKGCTTGARCATAYAGG-3’(SEQ ID NO：5)
InfV A H3-probe：5’-NH2-(CH2)12GCTTTCAGCAATTGTTACCCTTATGATGTRCCAGAYTATG-3’(SEQ IDNO：6)
(3)用于检测甲型流感病毒的H5亚型的特异性引物对和特异性探针的核苷酸序列如下：
InfV A H5-F：5’-TACAGTCGGTCGCGTGCCTCYTCGACAGARCAGGTTGACAC-3’(SEQ ID NO：7)
InfV A H5-R：5’-CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCACCCCTRATGAGGCWTCATG-3’(SEQ ID NO：8)
InfV A H5-probe：5’-NH2-(CH2)12GATTGYAGTGTAGCWGGATGGCTCCTCGGRAACCCAATGT-3’(SEQ IDNO：9)
(4)用于检测甲型流感病毒的H7亚型的特异性引物对和特异性探针的核苷酸序列如下：
InfV A H7-F：5’-TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCACATTAACTGAAAGAGGAGTG-3’(SEQ ID NO：10)
InfV A H7-R：5’-CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGCACTGGTTGCTCCATTAGTTC-3’(SEQ ID NO：11)
InfV A H7-probe：5’-NH2-(CH2)12TTGACCTCGGTCAATGTGGACTCCTGGGGACAATCACTGG-3’(SEQ IDNO：12)
(5)用于检测甲型流感病毒H5N1分型的N1亚型的特异性引物对和特异性探针的核苷酸序列如下：
InfV A N1-F：5’-TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTGGGTRAATCASACATATGTTAA-3’(SEQ ID NO：13)
InfV A N1-R：5’-CTGGTCCGTACTTCCGAGCGRCACATTCAGACTCTTGTGTTC-3’(SEQ ID NO：14)
InfV A N1-probe：5’-NH2-(CH2)12 GTGGATGGGCTATATACACAAAAGACAACAGCATAAGAAT-3’(SEQID NO：15)
(6)用于检测甲型流感病毒的N2亚型的特异性引物对和特异性探针的核苷酸序列如下：
InfV A N2-F：5’-TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGTGTGAACCAAYAATAATAGAAAG-3’(SEQ ID NO：16)
InfV A N2-R：5’-CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCATGCAGCCATGCTTTTCCATC-3’(SEQ ID NO：17)
InfV A N2-probe：5’-NH2-(CH2)12AGAGAACCTTATGTGTCATGCGATCCTGRCAAGTGTTATC-3’(SEQ IDNO：18)
(7)用于检测甲型流感病毒的N9亚型的特异性引物对和特异性探针的核苷酸序列如下：
InfV A N9-F：5’-TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCTGTACTATAAATTCATGGCAC-3’(SEQ ID NO：19)
InfV A N9-R：5’-CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGCAGACCCATCKGTGAACAC-3’(SEQ ID NO：20)
InfV A N9-probe：5’-NH2-(CH2)12CAGATGARTGCAGGTTCTATGCTCTCAGCCAAGGAACAA-3’(SEQ IDNO：21)
(8)用于检测甲型流感病毒的特异性引物对和特异性探针的核苷酸序列如下：
InfV A-F：5’-TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCTTCTAACCGAGGTCGAAACG-3’(SEQ ID NO：22)
InfV A-R：5’-CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAGGGCATTTTGGACAAAGCGTCTA-3’(SEQ ID NO：23)
InfV A-probe：5’-NH2-(CH2)12 CCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGARATCGCGCAGAGACTTGA-3’(SEQ IDNO：24)
(9)用于检测乙型流感病毒的特异性引物对和特异性探针的核苷酸序列如下：
InfV B-F：5’-TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAAAGAATTTGACCTAGACTCTGC-3’(SEQ ID NO：25)
InfV B-R：5’-CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTTCCTAGTTTTACTTGCATTGAATA-3’(SEQ ID NO：26)
InfV B-probe：5’-NH2-(CH2)12CATGAAGCATTTGAAATAGCAGAAGGCCATGAAAGCTCAG-3’(SEQ IDNO：27)。
实施例2、利用液相芯片检测流感病毒分型
采用实施例1中设计的特异性引物对和特异性探针，利用液相芯片对乙型流感病毒以及甲型流感病毒中4种重要亚型进行检测，包括两轮PCR反应、分子杂交和检测的步骤，从而确定样本中所含流感病毒的类型。具体地说，第一轮PCR反应使用特异性引物对进行RT-PCR扩增目标基因片段，第二轮PCR反应利用生物素标记的通用引物对以第一轮PCR反应产物为模板进行PCR，使所获得PCR产物带有生物素标记，同时第二轮PCR反应具有将第一轮PCR信号放大的作用，增加检测的灵敏度，然后将第二轮PCR反应获得的PCR产物与偶联在不同微球上的特异性探针进行分子杂交，杂交产物与报告分子亲和素-藻红蛋白孵育，亲和素-藻红蛋白可与杂交产物上的生物素特异性结合，使之带有荧光，最后使用Luminex100系统进行检测荧光信号。具体步骤如下。
2.1、第一轮PCR反应
本实施例中使用的H1N1、H3N2、H5N1、H7N9流感病毒株样品来源自中国科学院武汉病毒研究所微生物菌毒种资源保藏中心，其中，H1N1流感病毒株编号为IVCAS 6.2294，H3N2流感病毒株编号为IVCAS 6.2353，H5N1流感病毒株编号为IVCAS 6.2191，H7N9流感病毒株编号为IVCAS 6.6083。本实施例中的H5N6和H7N7流感病毒株样品来源自禽类(鸡、野生鸟类)的粪便中分离到的病毒。本实施例中的INFA和INFB流感病毒株样品来源自临床由人体中分离并已确定分型的病毒。
使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(购自QIAGEN公司)提取样本中总RNA，以提取的样本总RNA为模板，进行一步法RT-PCR，所用引物分别为实施例1中所述的9组特异性引物对。
配制PCR反应液(PCR反应试剂来源自QIAGEN公司的QIAGEN Onestep RT-PCR Kit)：5×RT-PCR缓冲液5μL、浓度为10mM每种的dNTP 1μL、RT-PCR酶1μL、RNA酶抑制剂0.1μL、浓度为20μmol/L PCR特异性引物对各5μL、RNA模板2μL，加入双蒸水补足至25μL，所得的产物为第一轮PCR扩增的目标基因片段。
第一轮PCR反应条件为：50℃，30分钟，1个循环；95℃，15分钟，1个循环；94℃，45秒，56℃，20秒，72℃，30秒，29个循环；72℃，10分钟，1个循环。
2.2、第二轮PCR反应：
实施例1中所述9种特异性引物对的5’端具有通用引物结合序列，可利用通用引物对扩增获得目的基因片段。以实施例2.1中获得的第一轮PCR扩增的目标基因片段为模板进行第二轮PCR，用于第二轮PCR的通用引物对(生物素修饰的通用引物对)序列为：
Universal-F：5’-TACAGTCGGTCGCGTGCCTC-3’(SEQ ID NO：28)
Universal-R：5’-生物素(biotin)-CTGGTCCGTACTTCCGAGCG-3’(SEQ ID NO：29)
配制PCR反应液：10×PCR缓冲液5μL，浓度为10mM每种的dNTP 1μL，浓度为20μmol/L的通用引物对各1μL，Taq DNA聚合酶1μL，第一轮PCR的产物2μL，加入双蒸水补足至50μL，得到第二轮PCR的产物为带有生物素标记的目标基因溶液。
第二轮PCR反应条件为：94℃，5分钟，1个循环；94℃，15秒，56℃，30秒，72℃，30秒，29个循环；72℃，10分钟，1个循环。
2.3、分子杂交
实施例1中所述9种特异性探针的5’端结合有氨基化修饰的碳臂NH2-(CH2)12基团，将特异性探针以共价方式结合到给定颜色的微球表面的羧基上，用杂交缓冲液(1.5×TMAC(氯化四甲铵))稀释，使得每微升含有100个微球；将带有生物素标记的PCR产物分别与偶联了特异性探针的微球在避光的反应容器中进行杂交，得到荧光标记的目标基因与探针结合的产物。
杂交体系为50μL，其中微球33μL，PCR反应产物5μL，加入1×TE缓冲液(pH8.0)补充体积至50μL；95℃下保温5min后，56℃下保温15min，然后加入亲和素-藻红蛋白于56℃下保温5min。
2.4、检测及结果
先用Luminex100仪器分别读取经过杂交后的9种微球上的目标基因与探针结合的产物的荧光检测值，然后根据荧光检测值判断是否含探针对应的病毒类型，所测结果平均荧光值大于200，即判定为阳性。同时以双蒸水作为空白对照。结果如表1～表7所示。
表1、
表2、
表3、
表4、
表5、
表6、
表7、
由表1～表7的检测结果可知，采用本发明设计的针对乙型流感病毒和甲型流感病毒重要亚型的9种特异性引物对及其对应的探针，并结合液相芯片检测技术，能够准确、快速、灵敏地区分乙型流感病毒及甲型流感病毒中的H1、H3、H5、H7、H5N1中的N1、N2、N9亚型，对于临床流感病毒样品分型检测具有广泛的应用价值。
本发明设计了针对乙型流感病毒以及甲型流感病毒中重要亚型的特异性引物对和特异性探针，以及使用9种荧光编码微球，利用液相芯片技术对流感病毒标本进行检测分析的方法，具有快速、简便、成本低、特异性高、灵敏度高的特点，对乙型流感病毒以及甲型流感病毒中重要亚型可进行区分。

Claims (7)

1.用于检测流感病毒分型的特异性引物对和特异性探针，其特征在于，包括：
(1)用于检测甲型流感病毒的H1亚型的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，用于检测甲型流感病毒的H1亚型的特异性探针的核苷酸序列如SEQID NO：3所示；
(2)用于检测甲型流感病毒的H3亚型的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，用于检测甲型流感病毒的H3亚型的特异性探针的核苷酸序列如SEQID NO：6所示；
(3)用于检测甲型流感病毒的H5亚型的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，用于检测甲型流感病毒的H5亚型的特异性探针的核苷酸序列如SEQID NO：9所示；
(4)用于检测甲型流感病毒的H7亚型的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示，用于检测甲型流感病毒的H7亚型的特异性探针的核苷酸序列如SEQID NO：12所示；
(5)用于检测甲型流感病毒H5N1亚型中的N1亚型的特异性引物对的核苷酸序列如SEQID NO：13和SEQ ID NO：14所示，用于检测甲型流感病毒H5N1亚型中的N1亚型的特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示；
(6)用于检测甲型流感病毒的N2亚型的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示，用于检测甲型流感病毒的N2亚型的特异性探针的核苷酸序列如SEQID NO：18所示；
(7)用于检测甲型流感病毒的N9亚型的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示，用于检测甲型流感病毒的N9亚型的特异性探针的核苷酸序列如SEQID NO：21所示；
(8)用于检测甲型流感病毒的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：22和SEQ IDNO：23所示，用于检测甲型流感病毒的特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示；和
(9)用于检测乙型流感病毒的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：25和SEQ IDNO：26所示，用于检测乙型流感病毒的特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示；
其中，所述特异性探针的5’端结合NH2-(CH2)12基团。
2.用于检测流感病毒分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)提取流感病毒样本的总RNA；
B)以步骤A)中获得的总RNA为模板，使用如权利要求1中所述的特异性引物对进行RT-PCR扩增；
C)以步骤B)中获得的RT-PCR扩增产物为模板，使用带有生物素标记的通用引物对进行PCR扩增，所述通用引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29所示，其中，所述如SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列的5’端结合有生物素；
D)将如权利要求1中所述的特异性探针以共价方式偶联在结合有羧基的微球表面上；
E)将步骤C)中获得的PCR产物与步骤D)中的偶联有特异性探针的微球进行分子杂交；
F)将步骤E)中获得的分子杂交产物与报告分子亲和素-藻红蛋白孵育；
G)检测步骤F)中获得的孵育产物的荧光信号。
3.如权利要求2所述的用于检测流感病毒分型的方法，其特征在于，所述步骤B)中所述RT-PCR扩增的反应条件如下：50℃，30分钟，1个循环；95℃，15分钟，1个循环；94℃，45秒，56℃，20秒，72℃，30秒，29个循环；72℃，10分钟，1个循环。
4.如权利要求2所述的用于检测流感病毒分型的方法，其特征在于，所述步骤C)中所述PCR扩增的反应条件如下：94℃，5分钟，1个循环；94℃，15秒，56℃，30秒，72℃，30秒，29个循环；72℃，10分钟，1个循环。
5.如权利要求2所述的用于检测流感病毒分型的方法，其特征在于，所述步骤E)中所述分子杂交的反应条件如下：避光，95℃下保温5min，56℃下保温15min。
6.如权利要求2所述的用于检测流感病毒分型的方法，其特征在于，所述步骤F)中所述孵育的反应条件如下：56℃下保温5min。
7.如权利要求1所述的特异性引物对和特异性探针用于检测流感病毒分型的应用。
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