CN101717830A - 利用液相芯片检测流感病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用液相芯片检测流感病毒的方法。该检测方法对所有流感病毒A型、流感病毒B型的Non Structural核酸序列及流感病毒A型的H1、H2、H3、H5、H7、H9和N1、N2亚型进行同源性分析，设计出针对相应基因片段的引物和特异性探针；采用一种改良的巢式PCR方法即使用不同长度的嵌套式引物进行PCR扩增；特异性探针5’端进行氨基化处理，与荧光编码的微球进行偶联；将PCR扩增产物与偶联有特异性探针的混合微球温育杂交，最后用Luminex 100进行检测。本发明的检测方法具有较高的特异性及灵敏度，并且检测速度快，能够对流感病毒的流行进行识别和监控。

Description

利用液相芯片检测流感病毒的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种检测病毒的方法，特别涉及一种利用液相芯片检测流感病毒的方法。

(二)背景技术

流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。自2005年，家禽及人感染流感病毒的病例在世界各地不断发生，禽流感继SARS之后给全世界人民造成了巨大的恐慌。控制流感流行的一个关键问题就是及时、准确的鉴别诊断，这就需要非常准确并且灵敏的诊断方法。

流感病毒属于正粘病毒(Orthomyxovirus)，按核蛋白的可溶性补体结合抗原的不同，流感病毒可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。A型流感病毒又根据表面血凝素(Hemagglutinin HA)及神经氨酸酶(Neuraminidase NA)抗原性的不同再分为若干亚型，目前已知的HA有16个亚型(H1-H16)，NA有9个亚型(N1-N9)。由于HA、NA的抗原决定簇容易发生某些改变，导致流感病毒的不断流行，所以鉴别流感病毒的具体亚型是十分重要的。

目前有三种流感病毒诊断方法：ELISA(酶联免疫吸附法)、细胞培养法和分子法。每种方法都有它们各自的优势和缺点：

(1)ELISA(Enzyme Linked ImmunoSorbant Assay)是抗体检测，这种方法所检测的流感病人的血清中的抗体是出现临床症状10天才有的。ELISA法是特异的，但检测太迟了。它不能够提供更多早期的信息以预防疾病的传播。

(2)细胞培养能检测到活病毒。禽流感标本中的病毒能够通过被感染细胞的扩增而增殖，并且能被检测。细胞培养是一个要求严格且危险的测试方法，但它只能表明活病毒的存在。而且此类方法花费时间比较长，无法快速的对流感病毒进行检测和分型。

(3)分子法是采用聚合酶链式反应(PCR)。PCR(如逆转录PCR、多重逆转录PCR、酶免PCR、real time PCR等)能够检测各种标本(血液、排泄物、呼吸分泌物或身体组织)中的流感病毒的遗传物质。现有的PCR检测特异性很好，但是缺少敏感性，这是因为在病人的标本中可能没有病毒，或者由于扩增或检测失败而不能鉴别遗传物质。而一个阴性的检测不能排除一个病人出现流感病毒的可能。而且它们不能对流感病毒进行快速准确的分型。

从疾病预防和治疗的观点来看更为合理的鉴别诊断是非常重要的，我们需要知道谁是真正需要隔离和治疗的流感病人。因此开发一种快速的、可靠的、可对流感病毒进行识别和亚型分析，从而可对流感病毒的流行进行识别和监控的检测方法就非常重要了。

液相芯片(Multi-Analyte Suspension Array，MASA)是新一代的生物芯片诊断技术平台。该技术平台的核心技术是xMAP技术，其原理是把微小的乳胶颗粒(微球)分别染成不同的荧光色，然后再把针对不同检测物的核酸探针分别以共价方式吸附到不同荧光色的微球上。应用时，先把针对不同检测物的不同荧光色的微球混合，再加入被检测物。在悬液中偶联有特异性探针的微球与病人标本特异性地结合(杂交仅需十几分钟)，并加上荧光标记。然后，微球被微量液体传送系统排成单列通过两束激光，一束判定颗粒的颜色从而决定被测物的特异性(定性)；另一束测定微粒上的荧光标记强度从而给被测物定量，所得到的数据经电脑处理后可以直接用来判断结果。该技术具有高通量、高速度、敏感性高等特点，已在基因分型、组织分型、感染性疾病监测等方面广泛应用。

(三)发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种能够对流感病毒的流行进行识别和监控的利用液相芯片检测流感病毒的方法，该方法利用液相芯片技术建立一个可识别流感病毒A型及流感病毒B型，并对流感病毒A型的H1、H2、H3、H5、H7，H9和N1、N2亚型进行鉴别检测。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种利用液相芯片检测流感病毒的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)利用生物信息学知识和相关的生物信息学软件，对Genbank中能够检索到的所有流感病毒A型、流感病毒B型的Non Structural核酸序列及流感病毒A型的H1、H2、H3、H5、H7、H9的Hemagglutinin靶基因序列和N1、N2亚型的Neuraminidase靶基因序列进行同源性分析，找出保守区域，设计出针对相应基因片段的引物和特异性探针；

(2)采用一种改良的巢式PCR方法即使用不同长度的嵌套式引物进行PCR扩增：将巢式PCR的内外引物加以改变，缩短外引物长度(15～20bp)，同时通过在特异性内引物5’端加一段通用引物(15-20bp)的方法延长内引物长度(35～50bp)；PCR扩增时先使外引物在低温退火温度下做10-15个循环扩增，再在高温退火温度下使内引物在外引物扩增的基础上作6-8个循环扩增，然后使用其中一个5’端用biotin标记的通用引物对上述得到的扩增序列进行30-35个循环扩增；

(3)特异性探针5’端进行氨基化处理，与荧光编码的微球进行偶联；将PCR扩增产物与偶联有特异性探针的混合微球温育杂交，最后用Luminex 100进行检测。

本发明对Genbank中能够检索到的所有流感病毒A型、流感病毒B型的NonStructural核酸序列及流感病毒A型的H1、H2、H3、H5、H7、H9和N1、N2亚型进行检测，这样的PCR扩增减少了引物非特异性退火，使靶序列得到高效扩增，而次级结构却很少扩增，提高了扩增效率，特异性强，同时也具有较高的灵敏度。

病原体	靶基因	符号
			流感病毒A型H1	Hemagglutinin	H1
流感病毒A型H2	Hemagglutinin	H2
			流感病毒A型H3	Hemagglutinin	H3
流感病毒A型H5	Hemagglutinin	H5
			流感病毒A型H7	Hemagglutinin	H7

病原体	靶基因	符号
			流感病毒A型H9	Hemagglutinin	H9
流感病毒A型N1	Neuraminidase	N1
			流感病毒A型N2	Neuraminidase	N2
流感病毒A型(无分型)	Non Structural	InfA
			流感病毒B型(无分型)	Non Structural	InfB

本发明的检测方法具有较高的特异性及灵敏度，并且检测速度快，能够对流感病毒的流行进行识别和监控。

(四)具体实施方式

一、引物及探针的合成

利用生物信息学知识和相关的生物信息学软件，对Genbank中能够检索到的所有流感病毒A型、流感病毒B型的Non Structural核酸序列及流感病毒A型的H1、H2、H3、H5、H7、H9和N1、N2亚型核酸序列进行同源性分析，找出保守区域，设计出针对相应基因片段的引物和特异性探针。

引物使用改良的嵌套式引物，即采用较短的外引物(15-20bp)和5’端加有一段通用引物(15-20bp)的较长的内引物(35-50bp)，通用引物的一个5’端用biotin标记。特异性探针5’端进行氨基化处理，与荧光编码的微球进行偶联。

最终合成的引物及探针序列如下：

外引物：

H1：5’-AGG GCA TTT CGC TGA CTA TGA

    5’-ATT TAT GCT TGG CGG GTG AT

H2：5’-TGA TAG GCT TCT AAG GGT G

    5’-CTC CGC TCG TAT TGT TGT

H3：5’-GA ATG TRA CAA TGC CTA AYA A

    5’-CCA GGT TTY ACA ATG GTC C

H5：5’-GG ACA ATT TTR AAR CCR AAT G

    5’-TTA TCG CMC CCA YTG GAG

H7：5’-CTG AAA CGG TGG AAC GAA

    5’-AGT CAT CTG CGG GAA AGC

H9：5’-AGR ART ATG AGA TGG CTG AC

    5’-CCT GGY TTT ART ACY GAC C

N1：5’-GGR AAC AYA ATA TCA RTA TGG

    5’-ACA TCC CCT TTG GAA CCA

N2：5’-GAA TTC CTC ATC GAA CCC TA

    5’-AGT CCC ATT GAT ACA AAC GC

InfA：5’-CTT CTA ACC GAG GTC GAA A

    5’-G GCA TTT TGG ACA AAK CGT

InfB：5’-ACA AAT TGA GGT GGG TCC

    5’-C AGG GTA GTC AAG GGC T

内引物：

H1：5’-acg tgt tac tcg cat agt gc GAC TAT GAG GAA CTG AGG GAG CAA T

    5’-tcc tgt act ctc tta ctg tc GTG ATG AAC ACC CCA TAG TAC AAG G

H2：5’-acg tgt tac tcg cat agt gc TAA GGG TGC CAG AAT GGT CCT ATA T

    5’-tcc tgt act ctc tta ctg tc TTG TTG TAC GAT CCT TTG GCA ACC G

H3：5’-acg tgt tac tcg cat agt gc CTA AYA ATC NCT ART TGC CTC

    5’-tcc tgt act ctc tta ctg tc ATG GTC CCA TTG GRA TGC TYC C

H5：5’-acg tgt tac tcg cat agt gc CCR AAT GTG GAC AAA GTG GAA GAA T

    5’-tcc tgt act ctc tta ctg tc YTG GAG GCA TAC TRG AAT TTA TAG

H7：5’-acg tgt tac tcg cat agt gc GAA CGA ACA AAC GTC TGT GTT TGA C

    5’-tcc tgt act ctc tta ctg tc GAA AGC AGC ATT GTC TGT GTT TGA C

H9：5’-acg tgt tac tcg cat agt gc TGG CTG ACG GGG HAT ACA YCA YCC

    5’-tcc tgt act ctc tta ctg tc ACY GAC CTA CCA HGG RGC AAT TAG

N1：5’-acg tgt tac tcg cat agt gc RTA TGG CAA TTC ATC TCT TTG YCC

    5’-tcc tgt act ctc tta ctg tc GAA CCA CAC CCA CAG GAC AAC TC

N2：5’-acg tgt tac tcg cat agt gc CGA ACC CTA TTA ATG AAT GAG TTG G

    5’-tcc tgt act ctc tta ctg tc TTG ATA CAA ACG CAT TCC GAC TCC T

InfA：5’-acg tgt tac tcg cat agt gc GTC GAA A GAY ACR ATC TGG AAT GT

    5’-tcc tgt act ctc tta ctg tc ACA AAK CGT CAC TTG TTG TKGTGTC

InfB：5’-acg tgt tac tcg cat agt gc GGG TCC ACA ATG GRA TGY TRT G

      5’-tcc tgt act ctc tta ctg tc AAG GGC TCT CAT RCT YCT GTA G

通用引物：

5’-acg tgt tac tcg cat agt gc

5’-biotin-tcc tgt act ctc tta ctg tc

特异性探针序列：

H1：5’-NH2-aaaaa CAT TCT TTC CCG TCA GCC

H2：5’-NH2-GAA ATG TTT TAC GCT GCT GAG GAG AT

H3：5’-NH2-CGA GTA ACA GTY TCA ACA RAA AGA AG

H5：5’-NH2-TAT GCA TAC AAA ATT GTC AAG AAR GG

H7：5’-NH2-TCA ATT CCG CCT GAC TCC CTG AGA A

H9：5’-NH2-AC CCT RTt CAA GAC GCY CAA TAY AC

N1：5’-NH2-AGC ATC AAT TTT TAC ACT GAG CAG G

N2：5’-NH2-GTC CTG AGG ATA TTT TGA GAC CAT GAA C

InfA：5’-NH2-aaaaa TCA GGC CCC CTC AAA GCC GA

InfB：5’-NH2-aaa CTG GAG TGC TAT GAA AGG CTT TC

二、PCR扩增

本试剂盒采用一步法RT-PCR，反应体系为50μl，其中5×RT-PCR Buffer 10μl、dNTP Mix 2μl、RT-PCR Enzyme Mix(包括reverse transcriptases.和HotStarTaqDNA Polymerase)2μl、上文所述所有内外引物xμl(至终浓度0.15μM)、通用引物xμl(至终浓度0.8μM)、RNase inhibitor 5U(可选择不加)、RNA模板1-2μg，用RNase-free水补足体积至50μl。

反应程序如下：(1)反转录：50℃30min；(2)起始PCR活化：95℃15min；

(3)PCR扩增：94℃ 30sec，52℃ 1min，72℃ 1min，进行10-15个循环；94℃ 30sec，65℃ 1min，72℃ 1.5mi n，进行6-8个循环；94℃ 30sec，50℃ 1min，72℃ 1min，进行30-40个循环，最后72℃延伸5min。反应产物置于4℃待杂交检测。

三、探针的偶联

取50μl(1×10⁶个)微球，12000rpm离心1.5min后弃去上清，加入8μlMES(0.1M，pH 4.5)，混匀。再加入2μl探针(用MES稀释到200μM)、1.25μlEDC(10mg/ml)，混匀后避光放置30min，重复加入EDC一次。然后用500μl Tween20(0.02％V/V)和SDS(0.1％W/V)各洗涤一次，最后用200μl TE(pH 8.0)重悬微球，混匀后用血细胞计数器计数，4℃避光保存。

四、温育杂交

混合偶联好不同流感病毒亚型探针的微球，使用1.5×TMAC稀释至每种微球的浓度是150个/μl。在杂交体系中加入混合微球33μl、RT-PCR产物2μl、TE(pH8.0)15μl。96℃变性5min后，59℃杂交15min，再加入70μl SA-PE，52℃杂交10min，最后上机检测。

五、实验结果

1、cut off值的确定

分离流感病毒亚型的核酸，然后按照上文所述比例在单独的反应管中分别加入核酸模板、引物完全混合物、RT-PCR反应试剂进行反应。RT-PCR产物与交联有特异性探针的微球混合物温育杂交，然后上机检测。

在这个多重检测中，每组微球实际上就是一个微小的系统。检测的最终信号强度，以及背景值被许多因素所影响，例如：寡核苷酸探针偶联到微球上的的效率；多重反应中靶序列扩增的效率；以及检测过程中杂交的效率等等，所以每种流感病毒亚型的cut off值必须分别被确定。这里，我们把cut off值定义为所有不包含靶病原体的样品检测结果的平均值加上标准偏差的5倍，认为高于cut off值的为阳性结果，指示特定流感病毒亚型的存在。

样品1-4是阴性对照，其中RT-PCR空白反应中不包含核酸模板，Control反应中加入的是不含任何亚型流感病毒的RT-PCR产物(下同)。

表一

2、特异性实验结果

为了验证本试剂盒检测方法的特异性，我们在一个反应管中加入多个亚型流感病毒的核酸用于多重扩增和随后的检测(将表一中确定的Cut off值用在该检测中)。由下表可见，用本试剂盒提供的方法，在多重引物及多个靶序列存在的情况下靶序列可以被特异性地扩增，并且最终检测的信噪比比较高，可以获得较高的检测特异性。

表二

3、灵敏度、重复性实验结果

为了检验本试剂盒检测方法的灵敏度，对于每种亚型的流感病毒RNA而言，制备五个梯度：10ng、1ng、100pg、10pg、1pg。为了观察测定的可重复性，每一个梯度做三个重复。

对于每种靶标，按照表一确定的cut off值。表三结果显示，随着模板RNA量的降低，检测的荧光强度值也随之降低，检测的低限为10pg，具有较高的灵敏度，并且本实验的重复性也较好。

表三

4、样本检测实验结果

下表是用本试剂盒对一些样本检测的数据结果。其中每一横行代表一种流感病毒亚型指标，每一纵列代表一例检测样本。表中的数值是Luminex 100在检测过程中所获的荧光强度中位值(MFI)。高于Cut off值的为阳性结果。

实验室分离鉴定结果表明本实验结果与实际相符，不存在假阴性和假阳性的情况，可进一步进行临床验证，最终用于流感的监测和控制。

表四

Claims (1)

1.一种利用液相芯片检测流感病毒的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)利用生物信息学知识和相关的生物信息学软件，对Genbank中能够检索到的所有流感病毒A型、流感病毒B型的Non Structural核酸序列及流感病毒A型的H1、H2、H3、H5、H7、H9的Hemagglutinin靶基因序列和N1、N2亚型的Neuraminidase靶基因序列进行同源性分析，找出保守区域，设计出针对相应基因片段的引物和特异性探针；

(2)采用一种改良的巢式PCR方法即使用不同长度的嵌套式引物进行PCR扩增：将巢式PCR的内外引物加以改变，缩短外引物长度(15～20bp)，同时通过在特异性内引物5’端加一段通用引物(15-20bp)的方法延长内引物长度(35～50bp)；PCR扩增时先使外引物在低温退火温度下做10-15个循环扩增，再在高温退火温度下使内引物在外引物扩增的基础上作6-8个循环扩增，然后使用其中一个5’端用biotin标记的通用引物对上述得到的扩增序列进行30-35个循环扩增；

(3)特异性探针5’端进行氨基化处理，与荧光编码的微球进行偶联；将PCR扩增产物与偶联有特异性探针的混合微球温育杂交，最后用Luminex 100进行检测。