CN109112231A - 一种h7亚型禽流感病毒检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于分子生物学的快速检测H7亚型禽流感病毒的方法，以实现对H7亚型禽流感病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。与普通的RT‑PCR法相比，RT‑RAA法是在恒温条件下反应，操作简单，摆脱了复杂仪器的束缚，不需变温，大大缩短了反应时间，非常适用于现场应急快速检测。

Description

一种H7亚型禽流感病毒检测方法

技术领域

本发明属于逆转录重组酶介导等温扩增(Reverse transcription recombinaseaided amplification，RT-RAA)检测技术领域，具体涉及一种H7亚型流感病毒的检测方法，包括检测过程中使用的引物对和探针。

背景技术

禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)为单股负链RNA病毒，由8个独立的RNA节段组成，显著的生物学特征之一是亚型众多，变异频繁。迄今为止从禽类体内已经分离到上千种毒力各异的毒株，根据其病毒粒子表面的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性差异，分为8种HA亚型(H1-H18)和11种NA亚型(N1-N11)。同亚型毒株对宿主的致病力差异显著，在所有HA亚型中，只有H5和H7亚型对禽是高致病性的，称为高致病性禽流感(Highpathogenic avian influenza，HPAI)。近年来时有H7亚型流感病毒爆发，如1999～2000年在意大利爆发的H7N1病毒导致1300多万羽鸡死亡，造成重大经济损失。2003年荷兰爆发了H7N7亚型禽流感，不仅造成了重大的经济损失，而且感染89人。自2013年2月以来，我国华东地区上海市、安徽省、江苏省、浙江省先后发生不明原因重症肺炎病例，于3月31日将其确诊为人感染H7N9亚型禽流感病毒。

目前检测H7亚型禽流感病毒主要是通过实时荧光定量RT-PCR方法和RT-PCR方法，这两种方法均需要精密的实验仪器，且耗时较长，适用于在实验室进行检测，从样品采集、运送至实验室到获得检测结果至少需要一天时间，会延误疫病确认和防控工作。本发明中的检测方法是一种通过逆转录重组酶介导的等温扩增方法，操作简单、用时短，仪器小巧可移动，可在养殖场、活禽交易市场和检疫站等进行该病的现场快速检测，为疫病的早期防控争取宝贵的时间。

发明内容

本发明的目的是提供一种H7亚型禽流感病毒的检测方法，以实现对H7亚型禽流感病毒进行安全、特异、灵敏、快速、方便的检测。

本发明首先提供一种检测H7亚型禽流感病毒的引物对和探针组，分别是鉴定H7亚型禽流感病毒HA基因的引物对H7 forward、H7 reverse和探针H7 probe，其引物对和探针序列信息如下：

正向引物H7 forward：

5′-CCTATGATCACAGYAAATACAGGGAAGAGGCAAT-3′(SEQ ID NO:1)

反向引物H7reverse：

5′-CTAGAAGTATGAAACATGATGCCCCGAAGCTAA-3′(SEQ ID NO:2)

探针H7 probe：

5′-CCGAAGCTAAACCAAAGTATCACATCCT/i6FAMdT//THF//iBHQ1dT/AGCCGCTGCTTAGTTTGAC-3′；

其中探针自5′端起第29位碱基标记FAM发光基团，第29位碱基后连接脱碱基位点四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)，第30位碱基标记BHQ1淬灭基团，3′端进行C3-spacer阻断修饰。

本发明还提供一种用于检测H7亚型禽流感病毒的制品，所述的制品使用了上述的引物对和探针；

所述的制品，还包含有逆转录重组酶介导等温扩增的试剂。

本发明再一个方面提供检测临床样品中H7亚型禽流感病毒的RT-RAA检测方法，包括如下的步骤：

1)配制RT-RAA反应体系

总体系50μL，含有反应缓冲液25μL，10pmol/μL H7 forward 和H7 reverse各2.1μL，10pmol/μL H7 probe 0.6μL，RNase Free dH2O 15.7μL，醋酸镁2.5μL，RT荧光基础反应单元(包含重组酶、逆转录酶和聚合酶的冻干粉)，待检测的样品RNA模板2μL。

2)RT-RAA反应体系扩增

将检测反应条件设置为：在39℃下恒温扩增20min。

3)结果判定

质控标准:阴性对照无扩增曲线，且阳性对照出现扩增曲线，则实验数据有效，否则实验结果视为无效。

结果描述及判定:无扩增曲线，样品判为阴性；出现扩增曲线，样品判为阳性。

本发明提供一种基于分子生物学的快速检测H7亚型禽流感病毒的方法，以实现对H7亚型禽流感病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。与普通的RT-PCR法相比，RT-RAA法是在恒温条件下反应，操作简单，摆脱了复杂仪器的束缚，不需变温，大大缩短了反应时间，非常适用于现场应急快速检测。

附图说明

图1：H7亚型禽流感病毒的RT-RAA优化的引物和探针设计示意图，其中引物由方框圈出，探针由斜体并加下划线表示；

图2：本发明引物和探针的灵敏度检测结果图；

图3：本发明引物和探针的特异性检测结果图。

具体实施方式

逆转录重组酶介导等温扩增(Reverse transcription recombinase aidedamplification，RT-RAA)是一种在恒温核酸快速扩增技术，利用从细菌或真菌中获得的重组酶，在常温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，扩增产物以指数级增长。该技术具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现现场快速检测等特点。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：H7亚型禽流感病毒RT-RAA检测引物及探针设计与筛选

根据H7亚型禽流感病毒血凝素(HA)编码基因HA基因进行引物设计，需要保证引物探针所在区段能够较为全面的覆盖H7亚型禽流感病毒，因此，通过NCBI查找到918条公开的H7亚型禽流感病毒的HA基因序列，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，以位于1451-1640的碱基(参考序列GenBank登录号：KC899669)为目的片段进行荧光定量检测引物和探针设计。同时，RAA方法对引物和探针长度有特定要求，引物长度为30-35bp，探针长度为46-52bp(5’端到THF位点至少30个碱基，THF位点到3’端至少15个碱基)，因为引物和探针长度相对较长，还要注意引物探针的GC含量，以及可能影响实验效果的二级结构和引物二聚体等情况，因此，为保证扩增效率，对引物探针的设计和筛选有较高的要求。

设计2条上游引物和2条下游引物分别组合筛选最佳引物，上游引物所在区域对应的参考序列第1497位碱基，在918条序列中对应该位置的碱基有C和T两种，为提高引物的扩增效率，将引物序列中该位置的碱基设计成简并碱基Y。引物序列如下：

上游引物H7-F：

5′-CCTATGATCACAGYAAATACAGGGAAGAGGCAAT-3′(34bp)

下游引物H7-R1：

5′-CTAGAAGTATGAAACATGATGCCCCGAAGCTAA-3′(33bp)

下游引物H7-R2：

5′-GAAGT ATGAAACATG ATGCC CCGAAGCTAA-3′(30bp)

下游引物H7-R3：

5′-GAAGTATGAAACATGATGCCCCGAAGCTAAAC-3′(32bp)

设计2条探针进行最佳探针筛选，探针H7–P1自5′端起第33位碱基标记FAM发光基团，第34位碱基后连接脱碱基位点四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)，第35位碱基标记BHQ1淬灭基团，3′端进行C3-spacer阻断修饰；探针H7–P2自5′端起第29位碱基标记FAM发光基团，第30位碱基后连接脱碱基位点四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)，第30位碱基标记BHQ1淬灭基团，3′端进行C3-spacer阻断修饰；修饰后探针序列如下：

H7–P1：

5′-CAAAGTATCACATCTTTGTAGCCGCTGCTTAG/i6FAMdT//idSp//iBHQ1dT/GACTGGGTCAATCTG[C3-spacer]-3′

H7-P2：

5′-CCGAAGCTAAACCAAAGTATCACATCCT/i6FAMdT//idSp//iBHQ1dT/AGCCGCTGCTTAGTTTGAC[C3-spacer]-3′

引物和探针分别组合形成6个组合进行最佳引物和探针组合筛选。

组合1：H7-F、H7-R1和H7-P1

组合2：H7-F、H7-R2和H7-P1

组合3：H7-F、H7-R3和H7-P1

组合4：H7-F、H7-R1和H7-P2

组合5：H7-F、H7-R2和H7-P2

组合6：H7-F、H7-R3和H7-P2

引物对和探针的筛选包括如下步骤

1)配制RT-RAA反应体系

总体系50μL，含有反应缓冲液25μL，10pmol/μL H7 forward 和H7 reverse各2.1μL，10pmol/μL H7 probe 0.6μL，RNase Free dH2O 15.7μL，醋酸镁2.5μL，RT荧光基础反应单元(包含重组酶、逆转录酶和聚合酶的冻干粉)，待检测的样品RNA模板2μL。

2)RT-RAA反应体系扩增

将检测反应条件设置为：在39℃下恒温扩增20min。

3)结果判定

质控标准:阴性对照无扩增曲线，且阳性对照出现扩增曲线，则实验数据有效，否则实验结果视为无效。

结果描述及判定:无扩增曲线，样品判为阴性；出现扩增曲线，样品判为阳性。

实验结果表明，相同反应条件，H7组合4的扩增效率优于其他组合，因此将H7组合4的引物对和探针作为优选，最终确定的引物和探针的序列信息如下：

正向引物H7 forward：

5′-CCTATGATCACAGYAAATACAGGGAAGAGGCAAT-3′(SEQ ID NO:1)

反向引物H7 reverse：

5′-CTAGAAGTATGAAACATGATGCCCCGAAGCTAA-3′(SEQ ID NO:2)

探针H7probe：

5′-CCGAAGCTAAACCAAAGTATCACATCCT/i6FAMdT//idSp//iBHQ1dT/AGCCGCTGCTTAGTTTGAC[C3-spacer]-3′

实施例2：引物探针的检测灵敏度和特异性

检测灵敏度

设置6组不同浓度的H7亚型禽流感病毒RNA模板，进行RT-RAA最适条件下的核酸扩增。

参照RNA提取试剂盒说明书提取H7亚型流感病毒RNA，测定所提取的RNA模板原始浓度(1ng/μL)，按照10倍梯度稀释成10^-1ng/μL，10^-2ng/μL，10^-3ng/μL，10^-4ng/μL，10^-5ng/μL，10^-6ng/μL，分别取2μL作为反应模板，按照前述加样方法进行RT-RAA核酸扩增。

结果显示本发明设计的引物和探针组合能够保证检测时的灵敏性，检测灵敏度为RNA终浓度10^-4ng/μL。

检测特异性

根据前述反应体系添加各组分，H7亚型流感病毒RNA模板为1ng，非特异性病毒(H1N2亚型禽流感病毒，H3N2亚型禽流感病毒，H4N2亚型禽流感病毒，H5N1亚型禽流感病毒，H5N2亚型禽流感病毒，H5N6亚型禽流感病毒，H6N2亚型禽流感病毒，H7N3亚型禽流感病毒，H9N2亚型禽流感病毒，H10N7亚型禽流感病毒，H11N2亚型禽流感病毒，新城疫病毒，传染性支气管炎病毒)RNA模板分别为1ng。检测反应条件为：39℃恒温扩增20min。结果显示，除了H7亚型流感病毒RNA模板对应的试验组出现了正常荧光检测曲线，其他非特异性病毒的试验组及阴性对照组均未出现扩增曲线。结果表明，本发明所使用的引物和探针可以实现对H7亚型禽流感病毒的特异性检测，不与其他相关病毒发生交叉反应。

实施例3：对实际样品的检测应用

1.样品采集：

采集某活禽批发市场的各类家禽的咽拭子样品共30份，其中鸡、鸭、鹅各10份。采用PBS液(pH7.0～7.4，0.01mol/L)作为保存液(含青霉素2000IU/mL、链霉素2000IU/mL、制霉菌素1000IU/mL，BSA5mg/mL)。样品采集后置于加冰的保温箱中密封，24h内送至实验室进行处理或置于-70℃保存。

2.样品制备

将棉拭子置于装有1mL样品保存液的离心管中，涡旋混匀后，4℃10000r/min离心5min，取上清进行核酸提取。

3.核酸提取

参照RNA提取试剂盒说明书提取待检的30份临床样品、阳性对照和阴性对照RNA。提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增，长时间保存，须置于-70℃条件下。

4.鉴定

4.1对比方法：参考国家标准《GB/T 19438.3-2004H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》中的荧光RT-PCR检测方法，作为对比方法。根据标准中所注购买了深圳匹基生物工程股份有限公司生产的H7亚型禽流感病毒RT-PCR检测试剂盒。

4.2样品检测

采用国标方法和本专利方法，同时检测此临床样品。

4.3检测结果

结果显示，采用国标方法鉴定结果为3号和10号样品临床样品有FAM荧光信号，Ct值分别为21.8和24.3，判定为H7阳性，其余样品均没有荧光信号；采用本发明中的方法鉴定结果为3号和10号样品临床样品有FAM荧光信号，出现扩增曲线，判定为H7阳性，其余样品均没有出现扩增曲线；阳性对照组两种方法均出现FAM荧光信号，有扩增曲线，结果准确可信。

综上所述，本发明中的方法可以快速、准确的鉴定H7亚型禽流感病毒，对我国当前流行的新型H7N9亚型禽流感病毒也有较高的鉴别准确度，满足了当前对于H7N9亚型禽流感病毒检测的需求。同时，本发明中的方法采用恒温检测技术，操作简单，快速反应，可以实现H7亚型禽流感病毒的现场快速检测。

序列表

<110> 中国动物卫生与流行病学中心

<120> 一种H7亚型禽流感病毒检测方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cctatgatca cagyaaatac agggaagagg caat 34

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctagaagtat gaaacatgat gccccgaagc taa 33

Claims (6)

1.一种检测H7亚型禽流感病毒的引物对和探针组，其特征在于，所述的引物对和探针序列信息如下：

正向引物：

5′-CCTATGATCACAGYAAATACAGGGAAGAGGCAAT-3′；

反向引物：

5′-CTAGAAGTATGAAACATGATGCCCCGAAGCTAA-3′；

探针H7probe：

5′-CCGAAGCTAAACCAAAGTATCACATCCTTTHFTAGCCGCTGCTTAGTTTGAC-3′。

2.如权利要求1所述的引物对和探针组，其特征在于，所述的探针自5′端起第29位碱基标记FAM发光基团，第29位碱基后连接脱碱基位点四氢呋喃THF，第30位碱基标记BHQ1淬灭基团，3′端进行C3-spacer阻断修饰。

3.权利要求1所述的引物对和探针组在制备用于检测H7亚型禽流感病毒的制品中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的制品为逆转录重组酶介导等温扩增检测试剂盒。

5.一种逆转录重组酶介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中使用了权利要求1所述的引物对和探针组。

6.一种检测临床样品中H7亚型禽流感病毒的检测方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)配制RT-RAA反应体系

总体系50μL，含有反应缓冲液25μL，10pmol/μL H7 forward和H7 reverse各2.1μL，10pmol/μL H7 probe 0.6μL，RNase Free dH2O 15.7μL，醋酸镁2.5μL，RT荧光基础反应单元，待检测的样品RNA模板2μL；

2)RT-RAA反应体系扩增

将检测反应条件设置为：在39℃下恒温扩增20min；

3)结果判定

质控标准:阴性对照无扩增曲线，且阳性对照出现扩增曲线，则实验数据有效，否则实验结果视为无效；

结果描述及判定:无扩增曲线，样品判为阴性；出现扩增曲线，样品判为阳性。