CN109468411A - 一种h5亚型禽流感病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种H5亚型禽流感病毒的实时荧光RT‑PCR检测方法，其中使用的引物对和探针组，其中正向引物的序列为SEQ ID NO:1，反向引物的序列为SEQ ID NO:2；探针的序列为SEQ ID NO:3。本发明提供一种基于分子生物学的快速检测H5亚型禽流感病毒的方法，以实现对H5亚型禽流感病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于高通量检测，能够同时检测大量样品并快速判定结果，而且使用TaqMan荧光探针，避免传统SYBR Green染色法造成的污染和低特异性。

Description

一种H5亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法

技术领域

本发明属于荧光定量RT-PCR检测技术领域，具体涉及一种H5亚型流感病毒的实时荧光定量RT-PCR的检测方法，包括鉴定H5亚型流感病毒的引物对和探针。

背景技术

禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)为单股负链RNA病毒，由8个独立的RNA节段组成，显著的生物学特征之一是亚型众多，变异频繁。迄今为止从禽类体内已经分离到上千种毒力各异的毒株，根据其病毒粒子表面的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性差异，分为18种HA亚型(H1-H18)和11种NA亚型(N1-N11)。

Perroncito于1878年在意大利首次报道了H5亚型高致病性禽流感。H5亚型禽流感的发生给养禽业造成严重危害。禽流感爆发对中国家禽养殖农户的生计造成了巨大的冲击，农户的家禽养殖收入和家庭收入均显著下降。H5亚型禽流感病毒还可感染人，可造成人的发病和死亡的公共卫生问题。1997年，我国香港地区首次报道禽流感病毒直接感染人至发病和死亡。此次疫情是高致病性H5N1亚型禽流感病毒首次跨越种属屏障，由家禽感染人类，共计报告18例病例，其中6例死亡。2003年初，香港又再次出现2例人感染H5N1高致病性禽流感个案，其中1例死亡。之后的1年多，人感染H5N1高致病性禽流感病例在东南亚地区多个国家相继出现，包括越南、泰国、中国大陆、柬埔寨。世界卫生组织报道，至2014年全球总共发生感染H5N1禽流感的病例达649例，其中死亡385例，死亡率高达59.32％。我国的H5亚型禽流感病毒近年来变异速率加快，我国主要流行是第7分支、2.3.2.1分支和2.3.4.4分支等，实际应用中需要能够检测所有流行毒株的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种H5亚型禽流感病毒的实时荧光RT-PCR检测方法，以实现对H5亚型禽流感病毒进行安全、特异、灵敏、快速、方便的检测。

本发明首先提供一种检测H5亚型禽流感病毒引物对和探针组，分别是鉴定H5亚型禽流感病毒HA基因的引物对H5forward、H5reverse和探针H5probe，其引物对和探针序列信息如下：

正向引物H5forward：

5′-ACGTATRACTAYCCGCARTATTCA -3′(SEQ ID NO:1)

反向引物H5reverse：

5′-AGACCAGCYAYCATGATTGCC-3′(SEQ ID NO:2)

探针H5probe：

5′-TCAACAGTGGCGAGYTCCCT-3′(SEQ ID NO:3)

其中探针的5′端进行羧基荧光素HEX标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记。

本发明再一个方面提供检测临床样品中H5亚型禽流感病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，包括如下的步骤：

1)配制荧光定量RT-PCR反应体系

反应液每管25μL，含有2×One Step RT-PCR BufferⅢ12.5μL，5U/μL TaKaRa ExTaq HS 0.5μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5μL，10pmol/μL H5forward、H5reverse和H5probe各0.5μL，RNase Free dH2O 8.0μL，待检测的样品RNA模板2μL。

2)荧光定量RT-PCR反应体系扩增

将检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s(收集荧光)，40个循环。保存文件，运行。

3)结果判定

结果分析条件设定：读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果。

质控标准:阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照的Ct值应≤28.0，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。

结果描述及判定:无Ct值并且无扩增曲线，样品判为阴性；Ct值≤36，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。

本发明提供一种基于分子生物学的快速检测H5亚型禽流感病毒的方法，以实现对H5亚型禽流感病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于高通量检测，能够同时检测大量样品并快速判定结果，而且使用TaqMan荧光探针，避免传统SYBR Green染色法造成的污染和低特异性。

附图说明

图1：H5亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR优化的引物和探针设计示意图，其中引物由方框圈出，探针由斜体并加下划线表示；

图2：本发明引物和探针的灵敏度的检测结果图；

图3：本发明引物和探针的特异性检测结果图。

具体实施方式

实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：H5亚型禽流感病毒检测引物及探针设计与筛选

根据H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)编码基因HA基因进行引物设计，通过NCBI查找到4636条公开的H5亚型禽流感病毒的HA基因序列，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，以位于1476-1680的碱基(参考序列GenBank登录号：DQ320884)为目的片段进行荧光定量检测引物和探针设计。

设计2条上游引物和2条下游引物分别组合筛选最佳引物，为提高引物的灵敏度，将上游引物所在区域对应的参考序列第1493位碱基、第1510位碱基和第1521位碱基均设计成简并碱基R，第1515位碱基设计成简并碱基Y；将下游引物所在区域对应的参考序列第1645位碱基和第1647位碱基均设计成简并碱基R。引物序列如下：

上游引物H5-F1：5′-ARAAACGGAACGTATRACTACC-3′(22bp)

上游引物H5-F2：5′-ACGTATRACTAYCCGCARTATTCA-3′(24bp)

下游引物H5-R1：5′-AGACCAGCYACCATGATTGC-3′(22bp)

下游引物H5-R2：5′-AGACCAGCYAYCATGATTGCC-3′(23bp)

设计2条探针进行最佳探针筛选，为提高探针的灵敏度，将探针序列所在区域对应的参考序列第1623位碱基设计成简并碱基Y。探针的5′端进行羧基荧光素HEX标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记。修饰后探针序列如下：

H5-P1：5′-HEX-TTCAACAGTGGCGAGYTCCCTAG-BHQ1-3′(23bp)

H5-P2：5′-HEX-TCAACAGTGGCGAGYTCCCT-BHQ1-3′(20bp)

2对引物和2条探针两两配对形成8个组合进行最佳引物和探针组合筛选。

组合1：H5-F1、H5-R1和H5-P1

组合2：H5-F1、H5-R2和H5-P1

组合3：H5-F2、H5-R1和H5-P1

组合4：H5-F2、H5-R2和H5-P1

组合5：H5-F1、H5-R1和H5-P2

组合6：H5-F1、H5-R2和H5-P2

组合7：H5-F2、H5-R1和H5-P2

组合8：H5-F2、H5-R2和H5-P2

引物对和探针的筛选包括如下步骤

1)配制荧光定量RT-PCR反应体系

反应液每管25μL，含有2×One Step RT-PCR BufferⅢ12.5μL，5U/μL TaKaRa ExTaq HS 0.5μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5μL，10pmol/μL H5 forward、H5 reverse和H5 probe各0.5μL，RNase Free dH2O 8μL，待检测的样品RNA模板2μL。

2)荧光定量RT-PCR反应体系扩增

将检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s(收集荧光)，40个循环。保存文件，运行。

3)结果判定

结果分析条件设定：读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果。

质控标准:阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照的Ct值应≤28.0，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。

结果描述及判定:无Ct值并且无扩增曲线，样品判为阴性；Ct值≤36，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。

实验结果表明，相同反应条件，H5组合8的扩增效率优于其他7个组合，因此将H5组合8的引物对和探针作为优选，最终确定的引物和探针的序列信息如下：

正向引物H5 forward：

5′-ACGTATRACTAYCCGCARTATTCA-3′(SEQ ID NO:1)

反向引物H5 reverse：

5′-AGACCAGCYAYCATGATTGCC-3′(SEQ ID NO:2)

探针H5probe：

5′-TCAACAGTGGCGAGYTCCCT-3′(SEQ ID NO:3)

其中探针的5′端进行羧基荧光素HEX标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记。

实施例2：引物探针的检测灵敏度和特异性

检测灵敏度

设置6组不同浓度的H5亚型禽流感病毒RNA模板，进行荧光定量RT-PCR最适条件下的核酸扩增。

参照RNA提取试剂盒说明书提取H5亚型流感病毒RNA，测定所提取的RNA模板原始浓度(1ng/μL)，按照10倍梯度稀释成10^-1ng/μL，10^-2ng/μL，10^-3ng/μL，10^-4ng/μL，10^-5ng/μL，10^-6ng/μL，分别取2μL作为反应模板，按照前述加样方法进行实时荧光定量RT-PCR核酸扩增。

结果显示本发明设计的引物和探针组合能够保证检测时的灵敏性，检测灵敏度为RNA终浓度10^-5ng/μL。

检测特异性

根据前述反应体系添加各组分，H5亚型流感病毒RNA模板为1ng，非特异性病毒(H1N2亚型禽流感病毒，H3N2亚型禽流感病毒，H4N2亚型禽流感病毒，H5N1亚型禽流感病毒，H5N2亚型禽流感病毒，H5N6亚型禽流感病毒，H6N2亚型禽流感病毒，H7N3亚型禽流感病毒，H9N2亚型禽流感病毒，H10N2亚型禽流感病毒，H11N2亚型禽流感病毒，新城疫病毒，传染性支气管炎病毒)RNA模板分别为1ng。检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s(收集荧光)，40个循环。结果显示，除了H5亚型流感病毒RNA模板对应的试验组出现了正常荧光检测曲线(H5N1亚型禽流感病毒对应Ct值为14.15，H5N2亚型禽流感病毒对应Ct值为14.75，H5N6亚型禽流感病毒对应Ct值为13.78)，其他非特异性病毒的试验组及阴性对照组均未出现扩增曲线。结果表明，此方法可以实现对H5亚型禽流感病毒的特异性检测，不与其他相关病毒发生交叉反应。

实施例3：对实际样品的检测应用

1.样品采集：

采集某活禽批发市场的各类家禽的咽拭子样品共30份，其中鸡、鸭、鹅各10份。采用PBS液(pH7.0～7.4，0.01mol/L)作为保存液(含青霉素2000IU/mL、链霉素2000IU/mL、制霉菌素1000IU/mL，BSA 5mg/mL)。样品采集后置于加冰的保温箱中密封，24h内送至实验室进行处理或置于-70℃保存。

2.样品制备

将棉拭子置于装有1mL样品保存液的离心管中，涡旋混匀后，4℃10000r/min离心5min，取上清进行核酸提取。

3.核酸提取

参照RNA提取试剂盒说明书提取待检的30份临床样品、阳性对照和阴性对照RNA。提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增，长时间保存，须置于-70℃条件下。

4.鉴定

4.1对比方法：参考国家标准《GB/T 19438.3-2004H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》中的荧光RT-PCR检测方法，作为对比方法。根据标准中所注购买了深圳匹基生物工程股份有限公司生产的H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒。

4.2样品检测

采用国标方法和本专利方法，同时检测此临床样品。

4.3检测结果

结果显示，采用国标方法鉴定结果为13号临床样品有FAM荧光信号，Ct值为25.22，判定为H5阳性，其余样品均没有荧光信号；采用本发明中的方法鉴定结果为13号临床样品有HEX荧光信号，Ct值为24.67，判定为H5阳性，其余样品均没有荧光信号；阳性对照组两种方法均出现相应的荧光信号，结果准确可信。

综上所述，这30份临床样品中，13号样品可以判定为H5阳性，其余样品均为阴性。本发明中的方法可以快速、准确的鉴定H5亚型禽流感病毒，满足了当前对于H5亚型禽流感病毒检测的需求。

序列表

<110> 中国动物卫生与流行病学中心

<120> 一种H5亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgtatract ayccgcarta ttca 24

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agaccagcya ycatgattgc c 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcaacagtgg cgagytccct 20

Claims (7)

1.一种检测H5亚型禽流感病毒引物对和探针组，其特征在于，所述的引物对，其正向引物的序列为SEQ ID NO:1，反向引物的序列为SEQ ID NO:2；探针的序列为SEQ ID NO:3。

2.如权利要求1所述的引物对和探针组，其特征在于，所述的探针的5′端进行羧基荧光素HEX标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记。

3.权利要求1或2所述的引物对和探针组在制备用于检测H5亚型禽流感病毒的制品中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的制品为实时荧光RT-PCR检测试剂盒。

5.一种实时荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有权利要求1或2所述的引物对和探针组。

6.权利要求1或2所述的引物对和探针组在非疾病和诊断治疗目的检测H5亚型禽流感病毒中的应用。

7.一种检测临床样品中H5亚型禽流感病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)配制荧光定量RT-PCR反应体系

反应液每管25μL，含有2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5μL，5U/μL TaKaRa ExTaq HS 0.5μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ0.5μL，10pmol/μL权利要求1所述的正向引物、反向引物和探针各0.5μL，RNase Free dH2O 8.0μL，待检测的样品RNA模板2μL；

2)荧光定量RT-PCR反应体系扩增

将检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s收集荧光，40个循环；保存文件，运行；

3)结果判定

结果分析条件设定：读取检测结果，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果；

质控标准:阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照的Ct值应≤28.0，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效；

结果描述及判定:无Ct值并且无扩增曲线，样品判为阴性；Ct值≤36，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。