CN103820430A - 高gc含量或以复杂结构dna为模板的dna片段的重叠延伸pcr法 - Google Patents

Abstract

高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法，根据所需融合的两个DNA小片段设计引物，两个相邻DNA小片段的两对引物的末端设计一个重叠区段；采用所设计的引物，以所需融合的全长基因为模板，分别进行平行的PCR，PCR设置为5-8个循环，得到两组PCR产物所得PCR产物进行等摩尔混合后作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，进行第二轮PCR反应，得到所需融合的目的基因。本发明为高GC含量DNA片段或以复杂结构DNA片段为模板的DNA片段重叠延伸PCR扩增，提供了有效的方法，解决了扩增中出现弥散带、非特异性条带、易发生突变的问题；具有耗时短、循环数少、操作简单的特点。

Description

高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法

技术领域

本发明涉及一种重叠延伸PCR方法，具体的说是一种高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法。

背景技术

自1989年，重叠PCR技术（splicing by overlapping extension PCR，SOE-PCR）被Horton等首次应用于定向诱变和融合基因构建以来，该技术得到了广泛应用。重叠延伸PCR采用具有互补末端的引物，使PCR 产物形成了重叠链，在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来，在进行大片段基因的定点突变、基因片段删除以及多个编码序列嵌合连接上具有独有的优势。重叠PCR不需要限制性内切酶消化和连接酶处理，同时由于中间无任何目的基因以外的其他序列，可避免因加入连接序列导致的表达蛋白的功能异常。具有简便、高效、快速，易于操作等优点。

但是我们在重叠延伸PCR构建融合基因的时候，发现针对某些高GC含量和复杂模板的片段有一定难度，如非特异性条带较多，易发生突变和电泳结果出现弥散带等缺点。同时常规重叠延伸PCR也都有PCR耗时较长、循环数偏多、及其过程中需要复杂的纯化步骤，操作比较繁琐等问题需要解决。

发明内容

本发明的目的是通过对重叠延伸PCR技术的改进，特别是针对某些高GC含量和复杂结构模板的片段的重叠延伸PCR过程中出现的，如非特异性条带较多、易发生突变和电泳结果出现弥散带等问题，建立一种更有效的构建融合基因的方法。

高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法，其具体制备步骤包括：

1、两个DNA小片段的连接，其具体步骤包括：

步骤一、根据所需融合的两个DNA小片段设计引物，两个相邻DNA小片段的两对引物的末端设计一个重叠区段，长度为22-26bp，引物重叠区的Tm值与各引物与模板特异性结合部分的Tm值一致；然后采用所设计的引物，以所需融合的全长基因为模板，分别进行平行的PCR，PCR设置为5-8个循环，得到两组PCR产物；

步骤二、分别取步骤一中所得的两组未纯化的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，在DNA聚合酶的作用下进行第二轮PCR反应，通过DNA小片段重叠末端的延伸使两个DNA小片段连接成所需融合的全长基因。

2、三个DNA小片段的连接，其具体步骤包括：

步骤一、根据所需融合的两个DNA小片段设计引物，相邻的两个DNA小片段的引物末端均设计一个重叠区段，长度为22-26bp，引物重叠区的Tm值与各引物与模板特异性结合部分的Tm值一致；采用所设计的引物，以所需融合的全长基因为模板，分别进行平行的PCR，PCR设置为5-8个循环，得到三组PCR产物；

步骤二、取步骤一所得的三组未纯化的PCR产物中，两个相邻DNA小片段所对应的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，进行PCR循环，PCR设置为5-8个循环，PCR结束后得到将所得PCR产物A；

    步骤三，取步骤二中所得PCR产物A与步骤一所得的另一组未纯化的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，在DNA聚合酶的作用下进行第三轮PCR反应，通过DNA小片段重叠末端的延伸使各DNA小片段连接成所需融合的全长基因。

本发明高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法，还可以用于三个以上小片段的连接。

有益效果是：本发明改进的重叠延伸PCR方法，针对高GC含量或复杂结构模板的DNA片段扩增，提供了有效的扩增手段；高GC含量或复杂结构模板的DNA片段扩增的过程中，容易较多扩增弥散带、非特异性条带，并且易发生突变；而本发明所提供的方法各个DNA小片段的仅5-8个循环扩增即可作为模板，且第一轮PCR产物不必纯化，直接将PCR产物与外侧引物混合，DNA小片段的完整扩增和片段之间的连接同时进行，从而降低了PCR循环数，省略了纯化步骤，因而具有耗时短、循环数少、操作简单的特点，由于循环数少因而也提高了保真度高，因而降低了PCR的工作量，也节省了时间和试剂，通过降低PCR循环数来降低模板浓度以及优化中间引物重叠区长度，因而可以将PCR特别是高GC含量或复杂结构模板PCR扩增弥散带或非特异性条带的加以去除。另外，本发明也适用于改进的重叠延伸PCR方法进行定点突变。

附图说明

图1是例1人BTRCP-N基因的RT-PCR扩增电泳图；其中，泳道1是人BTRCP-N基因的RT-PCR扩增，泳道M是DL2000分子 量标准。

图2是第一轮PCR人CypA 和BTRCP-N基因的扩增产物电泳图；其中，泳道1是人BTRCP -CypA基因的非特异性扩增 PCR产 物，泳道2是人CypA基因的扩增，泳道M是DL2000分子量标准。

图3是人BTRCP--CypA基因的扩增的PCR产物电泳图；其中，泳道1是S0E-PCR第二轮PCR产物人BTRCP -CypA基因的扩增产 物，泳道M是DL2000分子量标准。

图4是人Cbl-N基因的RT-PCR扩增电泳图；其中，泳道1是人Cbl-N基因的RT-PCR扩增，泳道M是DL2000分子 量标准。

图5是Cbl-N1、Cbl-N2基因和人CypA片段的PCR扩增电泳图, 其中M是DL2000分子量标准；泳道1为Cbl-N1片段的PCR扩增；泳道2为人CypA片段的PCR扩增；泳道2为Cbl-N2片段的PCR扩增；

图6 是人Cbl-CypA基因的特异性扩增的PCR产物电泳图，其中泳道1是S0E-PCR产物人CBl-CypA基因的特异性扩增产 物，泳道M是DL2000分子量标准。

具体实施方式

1、两个DNA小片段的连接，其具体步骤包括：

步骤一、根据所需融合的两个DNA小片段设计引物，两个相邻DNA小片段的两对引物的末端设计一个重叠区段，长度为22-26bp，引物重叠区的Tm值与各引物与模板特异性结合部分的Tm值一致；然后采用所设计的引物，以所需融合的全长基因为模板，分别进行平行的PCR，PCR设置为5-8个循环，得到两组PCR产物；

步骤二、分别取步骤一中所得的两组未纯化的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，在DNA聚合酶的作用下进行第二轮PCR反应，通过DNA小片段重叠末端的延伸使两个DNA小片段连接成所需融合的全长基因。

2、三个DNA小片段的连接，其具体步骤包括：

步骤一、根据所需融合的两个DNA小片段设计引物，相邻的两个DNA小片段的引物末端均设计一个重叠区段，长度为22-26bp，引物重叠区的Tm值与各引物与模板特异性结合部分的Tm值一致；采用所设计的引物，以所需融合的全长基因为模板，分别进行平行的PCR，PCR设置为5-8个循环，得到三组PCR产物；

步骤二、取步骤一所得的三组未纯化的PCR产物中，两个相邻DNA小片段所对应的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，进行PCR循环，PCR设置为5-8个循环，PCR结束后得到将所得PCR产物A；

    步骤三，取步骤二中所得PCR产物A与步骤一所得的另一组未纯化的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，在DNA聚合酶的作用下进行第三轮PCR反应，通过DNA小片段重叠末端的延伸使各DNA小片段连接成所需融合的全长基因。

本发明高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法，还可以用于三个以上小片段的连接。

以下实施例如无特殊说明，均为常规实验方法；关于实验材料：HEK-293细胞上海细胞生物学研究所。DMEM培养基购自GIBCO公司；rTaq酶和primestar HS DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司；胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒、质粒提取试剂盒、DNAmarker、PUCm-T载体购自上海生工生物工程有限公司；引物合成和测序由上海生工生物工程有限公司操作完成。

实施例1  BTRCP基因N端部分（该基因起始部分特别是设计引物的部分GC含量偏高，其基因序列如序列表中序列1所示）和人亲环素A（CypA ）基因片段（其基因序列如序列表中序列2所示）的连接

步骤一、根据人BTRCP基因全长序列(GenBank登陆号: BC027994.1)，用 Premier5.0软件设计三对引物B1和B2，B1和B2r，B3和B4，其中B1和B2用于RT-PCR扩增出BTRCP的N端片段，构建PUCm-BTRCP-N重组质粒；以PUCm-BTRCP-N重组质粒为模板，采用引物B1和B2r，PCR扩增出 BTRCP的N端片段；B3和B4扩增CypA片段，各引物序列如表1；

引物	序列(5'to3')
		B1	ATGGACCCGGCCGAGGCGGT
B2	TTCTATTGTCTCAATGTCTTGTATAATT
		B2r	TGATCCTGAGCCTGATCCTGAGCCTTCTATTGTCTCAATGTCTTGTATAATT
B3	GGCTCAGGATCAGGCTCAGGATCAGGCTCAATGGTCAACCCCACCGTG
		B4	CTATTCGAGTTGTCCACAGTCAGCAA

表1引物序列：

注：B2r,下划线部分为引物与B3重叠部分(含丝-甘氨酸结构)，B3下划线为5个丝-甘氨酸结构

步骤二、RT-PCR扩增BTRCP-N基因并构建PUCm-BTRCP-N重组质粒

培养293细胞，用Trizol法抽提RNA。取约1μgRNA进行逆转录反应合成cDNA:总RNA5μL，目的基因反向引物1μL， DEPC treated water 6μL，70°C5min，然后迅速置于冰上冷却。接着在冰浴中依次加5×转录酶缓冲液4μL，10mmol/LdNTP2μL，RNA酶的抑制剂1μL，25°C 5min，再加逆转录酶1μL，使总反应体系为20μL， 然后25°C 10min， 42°C反应1h，最后70°C延伸10min合成cDNA。

  以合成的cDNA为模板进行PCR合成BTRCP-N基因，反应体系和条件如后。反应体系(50μL)：cDNA2μL，5×primeSTAR buffer10μL，2.5mmol/LdNTP2μL，10μM上下游引物(B1、B2)各2μL，PrimeSTAR HS DNA polymerase酶0.5μL，加去离子水到50μL。反应条件: 98°C变性 10s，64°C 15s，再72°C 50s，38个循环。用1%琼脂凝胶电泳检测分析PCR产物，结果如图1所示，与目的基因大小一致，得到了正确了BTRCP-N基因。

 PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物，然后进行加A反应（取PCR纯化产物26μL，10×rTaq buffer 3μL，dNTP1.0μL,rTaq酶 0.3μL, 72°C反应20min），加A反应产物1%琼脂凝胶电泳切胶回收目的片断。按TA克隆试剂盒进行连接反应产物，转化感受态细胞(E.coli Top 10)；进行蓝白斑筛选阳性克隆，做菌液PCR鉴定， 取3个阳性克隆菌液送样测序，得到正确的PUCm-BTRCP-N重组质粒；

步骤三、取提取的PUCm-BTRCP-N重组质粒和PUC-CypA质粒作为模板，分别以B1和B2r、B3和B4为引物，加PrimeSTAR HS DNA polymerase酶等至50μL 体系各1管。扩增条件为：98°C预变性15s，再98°C10s，64°C15s，再72°C48s，5个循环后停止PCR，取部分PCR产物作为模板，剩余的产物继续扩增25-30个循环以便电泳检测PCR扩增结果，得产物BTRCP-N片段、CypA片段。对25-30个循环后的PCR，对PCR产物进行检测，结果如图1所示，分别得到750bp（BTRCP-N）和500bp（CypA）的条带，与预期的结果一致；

步骤四、将上述5个循环后的PCR产物进行等摩尔混合，取混合后的混合物2μL作为模板进行PCR，加两侧引物B1和B4，加PrimeSTAR HS DNA polymerase酶等至50μL 体系。扩增条件为98°C预变性 15s，再98°C10s，64°C 15s，再72°C 90s，30个循环；结果成功扩增出目的片段，结果见附图3。

步骤五、目的基因的检测：PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物，然后进行加A反应（取PCR纯化产物26μL，10×rTaq buffer 3μL，dNTP1.0μL,rTaq酶 0.3μL, 72°C反应20min），加A反应产物1%琼脂凝胶电泳切胶回收目的片断。按TA克隆试剂盒进行连接反应反应产物转化自制的感受态细胞(E.coli Top 10)。蓝白斑筛选阳性克隆，做菌液PCR鉴定， 取3个阳性克隆菌液送样测序； 测序结果表明3个克隆都是正确克隆，其基因序列如序列表中序列16所示。

实施例2  Cbl基因N端部分的Cbl-N1基因片段（该基因起始部分GC含量偏高，其基因序列如序列表中序列8所示）、Cbl-N2基因片段（该基因起始部分GC含量，偏高，其基因序列如序列表中序列9所示）和人亲环素A（CypA ）片段的连接

步骤一、根据人Cbl基因全长序列(GenBank登陆号: NM_005188.2)，用 Premier5.0软件设计引物C1和C6，用来克隆Cbl的N端片段；C1和C2，用来扩增Cbl的N1端片段，C5和C6，用来扩增Cbl的N2端片段， C3和C4，用来扩增CypA片段(CypA片段插入Cbl-N 端的中间位置，CypA 置换其中的SH2结构域)，其引物序列如表2：

表2引物序列

引物	序列(5'to3')
		C1	ATGGCCGGCAACGTGAAGAAGAG
C2	GAAGAACACGGTGGGGTTGACCATAGTTACAGCAAGGCTGTTCCAATTC
		C3	GTAACTATGGTCAACCCCACCGTGTTCTTC
C4	CATTTCGAGTTGTCCACAGTCAGCAATG
		C5	CATTGCTGACTGTGGACAACTCGAATGTGAACCAACTCCCCAAGACC
C6	ctaGCCACTCCCTCTAGGATCAAAC

注：C2和C3下划线部分为引物与B3重叠部分，C5下划线为与C4重叠部分

步骤二、RT-PCR扩增Cbl-N基因并构建PUCm-Cbl-N1重组质粒的构建

培养293细胞，用Trizol法抽提RNA。取约1μgRNA进行逆转录反应合成cDNA:总RNA5μL，目的基因反向引物1μL， DEPC treated water 6μL，70°C5min，然后迅速置于冰上冷却。接着在冰浴中依次加5×转录酶缓冲液4μL，10mmol/LdNTP2μL，RNA酶的抑制剂1μL，25°C 5min，再加逆转录酶1μL，使总反应体系为20μL， 25°C 10min， 42°C反应1h，最后70°C10min合成cDNA。

  以合成的cDNA为模板进行PCR合成Cbl-N1和Cbl-N2基因，反应体系和条件如后。反应体系(50μL)：cDNA2μL，5×primeSTAR buffer10μL，2.5mmol/LdNTP2μL，10μM上下游引物(C 1和C 2 扩增Cbl-N1，C 5和C 6 扩增Cbl-N2)各2μL，PrimeSTAR HS DNA polymerase酶0.5μL，加去离子水到50μL。反应条件: 98°C变性 10s，64°C 15s，再72°C 50s，38个循环。用1%琼脂凝胶电泳检测分析PCR产物，结果如图4所示，与预期结果相符；

 PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物，然后进行加A反应（取PCR纯化产物26μL，10×rTaq buffer 3μL，dNTP1.0μL,rTaq酶 0.3μL, 72°C反应20min），加A反应产物1%琼脂凝胶电泳切胶回收目的片断。按TA克隆试剂盒进行连接反应反应产物转化自制的感受态细胞(E.coli Top 10)。蓝白斑筛选阳性克隆，做菌液PCR鉴定,取3个阳性克隆菌液送样测序，分别命名为PUCm-CBL-N1和PUCm-CBL-N2.测序结果表明CBL-N1和CBL-N2序列完全正确，其中CBL-N1792个碱基CBL-N2共264个碱基。

步骤三、按质粒小提试剂盒说明书提供的方法分别提取质粒PUCm-CBL-N1和PUCm-CBL-N2重组质粒以及PUC-CypA质粒。分别以PUCm-CBL-N1和PUCm-CBL-N2重组质粒为模板，分别以C1和C2、C5和C6为引物，加PrimeSTAR HS DNA polymerase酶等至50μL 体系各1管分别扩增Cbl-N1和Cbl-N2，。扩增条件为：98°C变性 10s，64°C 15s，再72°C50s（Cbl-N1），30s(Cbl-N2)，5个循环（取部分作为模板，剩余的继续反应25-30循环后跑电泳检测）。以 PUC-CypA质粒为模板进行PCR得产物CypA片段。扩增条件为：98°C变性10s，64°C 15s，再72°C 35s，5个循环（取部分作为模板，剩余的继续反应25-30循环后跑电泳检测）。PCR反应25-30循环后，电泳检测结果如图5所示；

步骤四、第一轮PCR进行5个循环后，然后各取Cbl-N2和CypA片段各1μL作为模板，外加C3和C6为引物进行第二轮PCR，扩增条件：98°C变性10s，64°C 15s，再72°C 50s，8个循环，得N2-CypA 片段。

步骤五、将N2-CypA 片段和Cbl-N片段等摩尔混合，取2μL作为模板，加外侧引物C1和C6, 加PrimeSTAR HS DNA polymerase酶等至50μL/管扩增Cbl-CypA .扩增条件为：98°C变性 10s，64°C 15s，再72°C100s，30个循环；电泳结束后，进行电泳检测，结果如图6所示，与预期结果相符；

步骤六、目的基因的检测：PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物，然后进行加A反应（取PCR纯化产物26μL，10×rTaq buffer 3μL，dNTP1.0μL,rTaq酶 0.3μL, 72°C反应20min），加A反应产物1%琼脂凝胶电泳切胶回收目的片断。按TA克隆试剂盒进行连接反应产物转化感受态细胞(E.coli Top 10)。蓝白斑筛选阳性克隆，做菌液PCR鉴定， 取3个阳性克隆菌液送样测序；测序结果表明3个克隆都是正确克隆，其基因序列如序列表中序列17所示。 

SEQUENCE LISTING

 

<110>  河南科技大学

 

<120>  高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法

 

<130>  1

 

<160>  17   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  739

<212>  DNA

<213>  智人种(Homo sapiens sapiens)

 

<400>  1

atggacccgg ccgaggcggt gctgcaagag aaggcactca agtttatgaa ttcctcagag     60

 

agagaagact gtaataatgg cgaaccccct aggaagataa taccagagaa gaattcactt    120

 

agacagacat acaacagctg tgccagactc tgcttaaacc aagaaacagt atgtttagca    180

 

agcactgcta tgaagactga gaattgtgtg gccaaaacaa aacttgccaa tggcacttcc    240

 

agtatgattg tgcccaagca acggaaactc tcagcaagct atgaaaagga aaaggaactg    300

 

tgtgtcaaat actttgagca gtggtcagag tcagatcaag tggaatttgt ggaacatctt    360

 

atatcccaaa tgtgtcatta ccaacatggg cacataaact cgtatcttaa acctatgttg    420

 

cagagagatt tcataactgc tctgccagct cggggattgg atcatattgc tgagaacatt    480

 

ctgtcatacc tggatgccaa atcactatgt gctgctgaac ttgtgtgcaa ggaatggtac    540

 

cgagtgacct ctgatggcat gctgtggaag aagcttatcg agagaatggt caggacagat    600

 

tctctgtgga gaggcctggc agaacgaaga ggatggggac agtatttatt caaaaacaaa    660

 

cctcctgacg ggaatgctcc tcccaactct ttttatagag cactttatcc taaaattata    720

 

caagacattg agacaatag                                                 739

 

 

<210>  2

<211>  498

<212>  DNA

<213>  智人种(Homo sapiens sapiens)

 

<400>  2

atggtcaacc ccaccgtgtt cttcgacatt gccgtcgacg gcgagccctt gggccgcgtc     60

 

tcctttgagc tgtttgcaga caaggtccca aagacagcag aaaattttcg tgctctgagc    120

 

actggagaga aaggatttgg ttataagggt tcctgctttc acagaattat tccagggttt    180

 

atgtgtcagg gtggtgactt cacacgccat aatggcactg gtggcaagtc catctatggg    240

 

gagaaatttg aagatgagaa cttcatccta aagcatacgg gtcctggcat cttgtccatg    300

 

gcaaatgctg gacccaacac aaatggttcc cagtttttca tctgcactgc caagactgag    360

 

tggttggatg gcaagcatgt ggtgtttggc aaagtgaaag aaggcatgaa tattgtggag    420

 

gccatggagc gctttgggtc caggaatggc aagaccagca agaagatcac cattgctgac    480

 

tgtggacaac tcgaataa                                                  498

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

atggacccgg ccgaggcggt                                                 20

 

 

<210>  4

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

ttctattgtc tcaatgtctt gtataatt                                        28

 

 

<210>  5

<211>  52

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

tgatcctgag cctgatcctg agccttctat tgtctcaatg tcttgtataa tt             52

 

 

<210>  6

<211>  48

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

ggctcaggat caggctcagg atcaggctca atggtcaacc ccaccgtg                  48

 

 

<210>  7

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

ctattcgagt tgtccacagt cagcaa                                          26

 

 

<210>  8

<211>  792

<212>  DNA

<213>  智人种(Homo sapiens sapiens)

 

<400>  8

atggccggca acgtgaagaa gagctctggg gccgggggcg gcagcggctc cgggggctcg     60

 

ggttcgggtg gcctgattgg gctcatgaag gacgccttcc agccgcacca ccaccaccac    120

 

caccacctca gcccccaccc gccggggacg gtggacaaga agatggtgga gaagtgctgg    180

 

aagctcatgg acaaggtggt gcggttgtgt cagaacccaa agctggcgct aaagaatagc    240

 

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agatatgagg ggaagatgga gacacttgga gaaaatgagt attttagggt gtttatggag    360

 

aatttgatga agaaaactaa gcaaaccata agcctcttca aggagggaaa agaaagaatg    420

 

tatgaggaga attctcagcc taggcgaaac ctaaccaaac tgtccctcat cttcagccac    480

 

atgctggcag aactaaaagg aatctttcca agtggactct ttcagggaga cacatttcgg    540

 

attactaaag cagatgctgc ggaattttgg agaaaagctt ttggggaaaa gacaatagtc    600

 

ccttggaaga gctttcgaca ggctctacat gaagtgcatc ccatcagttc tgggctggag    660

 

gccatggctc tgaaatccac tattgatctg acctgcaatg attatatttc ggtttttgaa    720

 

tttgacatct ttacccgact ctttcagccc tggtcctctt tgctcaggaa ttggaacagc    780

 

cttgctgtaa ct                                                        792

 

 

<210>  9

<211>  264

<212>  DNA

<213>  智人种(Homo sapiens sapiens)

 

<400>  9

tgtgaaccaa ctccccaaga ccatatcaaa gtgacccagg aacaatatga attatactgt     60

 

gagatgggct ccacattcca actatgtaaa atatgtgctg aaaatgataa ggatgtaaag    120

 

attgagccct gtggacacct catgtgcaca tcctgtctta catcctggca ggaatcagaa    180

 

ggtcagggct gtcctttctg ccgatgtgaa attaaaggta ctgaacccat cgtggtagat    240

 

ccgtttgatc ctagagggag tggc                                           264

 

 

<210>  10

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  10

atggccggca acgtgaagaa gag                                             23

 

 

<210>  11

<211>  49

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  11

gaagaacacg gtggggttga ccatagttac agcaaggctg ttccaattc                 49

 

 

<210>  12

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  12

gtaactatgg tcaaccccac cgtgttcttc                                      30

 

 

<210>  13

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  13

catttcgagt tgtccacagt cagcaatg                                        28

 

 

<210>  14

<211>  47

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  14

cattgctgac tgtggacaac tcgaatgtga accaactccc caagacc                   47

 

 

<210>  15

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  15

ctagccactc cctctaggat caaac                                           25

 

 

<210>  16

<211>  1264

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  16

atggacccgg ccgaggcggt gctgcaagag aaggcactca agtttatgaa ttcctcagag     60

 

agagaagact gtaataatgg cgaaccccct aggaagataa taccagagaa gaattcactt    120

 

agacagacat acaacagctg tgccagactc tgcttaaacc aagaaacagt atgtttagca    180

 

agcactgcta tgaagactga gaattgtgtg gccaaaacaa aacttgccaa tggcacttcc    240

 

agtatgattg tgcccaagca acggaaactc tcagcaagct atgaaaagga aaaggaactg    300

 

tgtgtcaaat actttgagca gtggtcagag tcagatcaag tggaatttgt ggaacatctt    360

 

atatcccaaa tgtgtcatta ccaacatggg cacataaact cgtatcttaa acctatgttg    420

 

cagagagatt tcataactgc tctgccagct cggggattgg atcatattgc tgagaacatt    480

 

ctgtcatacc tggatgccaa atcactatgt gctgctgaac ttgtgtgcaa ggaatggtac    540

 

cgagtgacct ctgatggcat gctgtggaag aagcttatcg agagaatggt caggacagat    600

 

tctctgtgga gaggcctggc agaacgaaga ggatggggac agtatttatt caaaaacaaa    660

 

cctcctgacg ggaatgctcc tcccaactct ttttatagag cactttatcc taaaattata    720

 

caagacattg agacaatagg gctcaggatc aggctcagga tcaggctcaa tggtcaaccc    780

 

caccgtgttc ttcgacattg ccgtcgacgg cgagcccttg ggccgcgtct cctttgagct    840

 

gtttgcagac aaggtcccaa agacagcaga aaattttcgt gctctgagca ctggagagaa    900

 

aggatttggt tataagggtt cctgctttca cagaattatt ccagggttta tgtgtcaggg    960

 

tggtgacttc acacgccata atggcactgg tggcaagtcc atctatgggg agaaatttga   1020

 

agatgagaac ttcatcctaa agcatacggg tcctggcatc ttgtccatgg caaatgctgg   1080

 

acccaacaca aatggttccc agtttttcat ctgcactgcc aagactgagt ggttggatgg   1140

 

caagcatgtg gtgtttggca aagtgaaaga aggcatgaat attgtggagg ccatggagcg   1200

 

ctttgggtcc aggaatggca agaccagcaa gaagatcacc attgctgact gtggacaact   1260

 

cgaa                                                                1264

 

 

<210>  17

<211>  1551

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  17

atggccggca acgtgaagaa gagctctggg gccgggggcg gcagcggctc cgggggctcg     60

 

ggttcgggtg gcctgattgg gctcatgaag gacgccttcc agccgcacca ccaccaccac    120

 

caccacctca gcccccaccc gccggggacg gtggacaaga agatggtgga gaagtgctgg    180

 

aagctcatgg acaaggtggt gcggttgtgt cagaacccaa agctggcgct aaagaatagc    240

 

ccaccttata tcttagacct gctaccagat acctaccagc atctccgtac tatcttgtca    300

 

agatatgagg ggaagatgga gacacttgga gaaaatgagt attttagggt gtttatggag    360

 

aatttgatga agaaaactaa gcaaaccata agcctcttca aggagggaaa agaaagaatg    420

 

tatgaggaga attctcagcc taggcgaaac ctaaccaaac tgtccctcat cttcagccac    480

 

atgctggcag aactaaaagg aatctttcca agtggactct ttcagggaga cacatttcgg    540

 

attactaaag cagatgctgc ggaattttgg agaaaagctt ttggggaaaa gacaatagtc    600

 

ccttggaaga gctttcgaca ggctctacat gaagtgcatc ccatcagttc tgggctggag    660

 

gccatggctc tgaaatccac tattgatctg acctgcaatg attatatttc ggtttttgaa    720

 

tttgacatct ttacccgact ctttcagccc tggtcctctt tgctcaggaa ttggaacagc    780

 

cttgctgtaa ctatggtcaa ccccaccgtg ttcttcgaca ttgccgtcga cggcgagccc    840

 

ttgggccgcg tctcctttga gctgtttgca gacaaggtcc caaagacagc agaaaatttt    900

 

cgtgctctga gcactggaga gaaaggattt ggttataagg gttcctgctt tcacagaatt    960

 

attccagggt ttatgtgtca gggtggtgac ttcacacgcc ataatggcac tggtggcaag   1020

 

tccatctatg gggagaaatt tgaagatgag aacttcatcc taaagcatac gggtcctggc   1080

 

atcttgtcca tggcaaatgc tggacccaac acaaatggtt cccagttttt catctgcact   1140

 

gccaagactg agtggttgga tggcaagcat gtggtgtttg gcaaagtgaa agaaggcatg   1200

 

aatattgtgg aggccatgga gcgctttggg tccaggaatg gcaagaccag caagaagatc   1260

 

accattgctg actgtggaca actcgaatgt gaaccaactc cccaagacca tatcaaagtg   1320

 

acccaggaac aatatgaatt atactgtgag atgggctcca cattccaact atgtaaaata   1380

 

tgtgctgaaa atgataagga tgtaaagatt gagccctgtg gacacctcat gtgcacatcc   1440

 

tgtcttacat cctggcagga atcagaaggt cagggctgtc ctttctgccg atgtgaaatt   1500

 

aaaggtactg aacccatcgt ggtagatccg tttgatccta gagggagtgg c            1551

Claims (2)

1.高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法，其特征在于：其具体步骤包括：

步骤一、根据所需融合的两个DNA小片段设计引物，两个相邻DNA小片段的两对引物的末端设计一个重叠区段，长度为22-26bp，引物重叠区的Tm值与各引物与模板特异性结合部分的Tm值一致；然后采用所设计的引物，以所需融合的全长基因为模板，分别进行平行的PCR，PCR设置为5-8个循环，得到两组PCR产物；

步骤二、分别取步骤一中所得的两组未纯化的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，在DNA聚合酶的作用下进行第二轮PCR反应，通过DNA小片段重叠末端的延伸使两个DNA小片段连接成所需融合的全长基因。

2.如权利要求1所述的高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法，其特征在于：其具体步骤包括：

步骤一、根据所需融合的两个DNA小片段设计引物，相邻的两个DNA小片段的引物末端均设计一个重叠区段，长度为22-26bp，引物重叠区的Tm值与各引物与模板特异性结合部分的Tm值一致；采用所设计的引物，以所需融合的全长基因为模板，分别进行平行的PCR，PCR设置为5-8个循环，得到三组PCR产物；

步骤二、取步骤一所得的三组未纯化的PCR产物中，两个相邻DNA小片段所对应的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，进行PCR循环，PCR设置为5-8个循环，PCR结束后得到将所得PCR产物A；

    步骤三，取步骤二中所得PCR产物A与步骤一所得的另一组未纯化的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，在DNA聚合酶的作用下进行第三轮PCR反应，通过DNA小片段重叠末端的延伸使各DNA小片段连接成所需融合的全长基因。

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