CN103160522A - 一种黄曲霉尿酸氧化酶在巴斯德毕赤酵母中的高效表达与纯化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄曲霉尿酸氧化酶（Uricase）在巴斯德毕赤酵母中的高效表达与纯化的方法。根据Uricase基因的核苷酸组成，将Uricase的双链DNA和α-factor信号肽的双链DNA，经过SOE-PCR将上述两条片段拼接，获得融合基因α-factor-uricase，将融合基因插入质粒pPIC3.5K，获得重组质粒pPIC3.5K-α-factor-uricase，电转化毕赤酵母，得高表达克隆株PichiapastorisSMD1168。表达的重组黄曲霉尿酸氧化酶N端完全天然，无任何多余氨基酸，生产成本低，酶活性高，纯化步骤简便，收率大，纯度高，易于工业化规模生产，具有较大的实际应用价值。

Description

一种黄曲霉尿酸氧化酶在巴斯德毕赤酵母中的高效表达与纯化的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种黄曲霉尿酸氧化酶在巴斯德毕赤酵母菌中的高效表达的方法，还涉及一种黄曲霉尿酸氧化酶的纯化方法。

背景技术

尿酸（又称2，6，8--三氧嘌呤）是人体内嘌呤内化合物代谢的最终产物，血尿酸水平取决于尿酸产生和排泄的动态平衡，而血浆尿酸的饱和度：37℃，PH7.4时为380～420μmol/L(6.4～7.1mg/dL)。

尿酸大多经肝尿酸盐氧化酶(尿酸酶)分解形成尿囊素由尿中排出，人类尿酸为内源性嘌呤，经黄嘌呤氧化酶在肝、肠作用形成最终降解产物。外源性嘌呤亦为尿酸重要来源。国内资料显示，男性平均为5.7㎎/dL，女性4.3mg/dL，其中2/3经尿排除。影响尿酸水平的因素很多，如嘌呤代谢和尿酸合成的酶活性，肾脏滤过及主动转运功能，药物(如长期服用利尿剂)，饮食结构(如酗酒、嘌呤类物质摄入过多)及全身性疾病(如高血压病、全身紫绀性心脏病、慢性阻塞性肺气肿)。

升高的血尿酸在关节中形成尿酸钠水合物的微结晶，会引起痛风性急性关节炎的反复发作，关节、骨骼、软组织的痛风石沉积、痛风石性慢性关节炎和关节畸形，常累积肾脏引起慢性间质性肾炎和尿酸肾结石形成。有资料显示我国20岁以上的人群高尿酸血症的发病率为2.4-5.7%，且有10%会发展成为痛风。

如果血清中的尿酸的浓度高于正常值，就导致高尿酸血症（Hyperuricemia）。高尿酸易在关节中形成尿酸钠水合物的微结晶，会引起痛风性急性关节炎。另外恶性肿瘤的增殖会加快核酸分解代谢，嘌呤代谢产生生大量的尿酸会导致会出现该症状出现。肿瘤放射化疗过程也因为细胞的大量裂解而出现伴随高尿酸血症的肿瘤消退综合症（tumor lysissyndrome,TLS）。TLS会增加胞内物质如钾、磷、钙、尿酸等的浓度，大大超过了人体肾脏的排泄能力，导致高尿酸、高钾、高磷、高钙、高尿酸等症，最后导致肾脏衰竭。我国每年新发的癌症病人约为170万，大部分在发病以后采用化疗和放疗等治疗手段，而化疗和放疗时细胞分裂过剩和急剧破坏，核酸分解突然增多产生大量尿酸，导致尿酸血症，引起结石和肾衰，给病人带来生理和心理上极大的痛苦。

目前控制TLS的有饮食控制、水合、碱化酸毒症，用别嘌呤醇和尿酸氧化酶利尿等手段，但别嘌呤醇是靠抑制黄嘌呤氧化酶的活性从而阻碍黄嘌呤和次黄嘌呤转化为尿酸，干扰6-巯基嘌呤的代谢，影响肿瘤的代谢，而且由于黄嘌呤和次黄嘌呤的氧化受阻，相应的增加了肾脏的负荷，黄嘌呤比尿酸更难容与尿中。用别嘌呤醇治疗的病人可能会出现黄嘌呤肾病和结石。另外，别嘌呤醇对病人体内存留尿酸的排泄没有作用，而且有2%的病人再用别嘌呤醇的治疗过程中会产生过敏反应，甚至出现严重的超敏反应综合症，对于急性高尿酸血症的病人，别嘌呤醇也不能起到及时的治疗效果。

尿酸氧化酶（尿酸氧酶，Urate Oxidase,Uricase）普遍存在与自然界，在大多数动物体内该酶参与嘌呤代谢，将尿酸氧化为尿囊素。尿囊素是一种比较容易排泄的代谢物，其溶解度为尿酸的5-10倍，但在人和一些长灵类体内缺乏这种酶而尿酸作为最终产物而排出体外。1943年，Oppenheimer首次通过实验发现注射尿酸氧化酶可以降低血尿酸水平。1957年，动物来源的尿酸氧化酶用于临床治疗获得了一定的成功。1974年（Current Rheumatology Reports2001,3:29-35）从微生物Aspergillus flavus中提取了尿酸氧化酶治疗痛风，而且这种直接提取的天然尿酸氧化酶也在欧洲上市已有20年，通过注射给药用于白血病化疗的严重高尿酸血症。但从微生物Aspergillus flavus中直接提取酶周期长，发酵过程难于控制，易受病原体污染，产率低，产品纯度不高，在使用中产生还会产生副作用。1992年有人用基因重组的大肠杆菌来尝试对黄曲霉尿酸氧化酶基因进行胞内表达（J.Biol.Chem.1992,267(12):8565-8570），有酶活性，但表达量低，无产业化前景。近几年酿酒酵母表达的基因重组的Aspergillus flavus尿酸氧化酶(Leplatois P.et al.,Gene.,1992,122,139-145)先后在欧洲和美国上市（商品名Fasturtec），用于高尿酸血症的预防和治疗（肿瘤化疗高尿酸血症的治疗和预防），但该方法表达的重组尿酸氧化酶以可溶解的活性形式畜积在胞内空隙中,这增加了提纯到药用级的难度；并且利用酿酒酵母作为宿主菌，会出现糖基化修饰过度的问题，这也增加了蛋白后处理的难度。

目前，国内关于尿酸氧化酶的研究主要集中在从天然微生物中直接提取和在原核菌株中表达,而在酵母中表达该酶的文献很少报道。在微生物中直接提取,不利于纯化,而且该酶的产量往往达不到工业化生产的标准。在原核体系中表达,由于缺少真核微生物中很多亚细胞结构,酶活性没有真核表达得高，且很难做到胞外分泌，增加了纯化的难度。而利用毕赤酵母分泌表达该酶能克服上面的很多难点。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastors）中高效表达天然黄曲霉尿酸氧化酶(Uricase)的方法。根据Uricase基因的核苷酸组成，合成引物后通过RT-PCR扩增获得编码Uricase的双链DNA，同时以质粒pPIC9K为模板设计引物通过PCR扩增获取编码α-factor信号肽的双链DNA，经过SOE-PCR将上述两条片段拼接，获得融合基因α-factor-uricase。EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切处理上述的融合基因和pPIC3.5K质粒，将融合基因插入质粒pPIC3.5K，通过常规克隆手段获得重组质粒pPIC3.5K-α-factor-uricase。此重组质粒经SalⅠ酶切线性化后，电转化毕赤酵母SMD1168，用G418抗性浓度递增法筛选多拷贝克隆，得高表达克隆株Pichia pastoris SMD1168(α-factor-uricase)，该基因工程菌是整合了5’端融合有酿酒酵母α-交配因子（α-factor)信号肽序列的黄曲霉尿酸氧化酶基因（Uricase)的巴斯德毕赤酵母SMD1168。

本发明还有一个目的是提供了一种黄曲霉尿酸氧化酶的纯化方法，方法简单，易行，通过本发明所述的纯化方法，可得到纯度大于99%的白色干粉状高活性黄曲霉尿酸氧化酶。

为达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种利用巴斯德毕赤酵母高效表达黄曲霉尿酸氧化酶的方法，其特征在于，步骤如下：

a.Uricase DNA序列的扩增：

委托专业的生物技术公司化学合成所需的碱基序列：P1—5’端引物(urasoeup)，P2—3’端引物(urasoedown)，引入EcoRⅠ酶切位点。

P1：5’-TCCGCAGTAAAAGCAGCCCGCTACGGC-3’

P2：5’-AGCGAATTCTTATTACAATTTAGACTTCAGAGAGGACCG GCC-3’

EcoRⅠ

以黄曲霉菌丝体总RNA为模板，按RT-PCR试剂盒的操作，进行RT-PCR扩增，反应产物用DNA Gel Extraction Kit回收，获得Uricase DNA片段；

b.α-factor信号肽编码序列的获得：合成碱基序列：P3—5’端引物(afacterup)，引入BamHⅠ酶切位点。P4—3’端引物(afactersoedown)。

P3：5’-TATTCGAAGGATCCAAACGATGAG-3’

BamHⅠ

P4：5’-TGCCGTAGCGGGCTGCTTTTACTGCGGATCTTTTCTCGA

GAGATACCCCTTCTTC-3’

以pPIC9K质粒为模板，以P3、P4为引物进行PCR扩增，反应产物用DNA Gel Extraction Kit回收，获得α-factor信号肽编码DNA片段；

c.通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)进行α-factor-uricase全基因合成：

以上述纯化后的α-factor信号肽DNA片段和Uricase DNA片段为模板，加入P3—5’端引物(afacterup)，P2—3’端引物(urasoedown),经SOE-PCR方法扩增融合基因。反应产物用DNA Gel Extraction Kit回收，获得α-factor-uricase融合DNA片段，其序列为SEQ IDNO.1所示。

d.构建含黄曲霉尿酸氧化酶基因序列的基因工程菌：

用两种限制性内切酶双酶切步骤c获得的α-factor-uricase DNA融合片段的，所述的两种限制性内切酶是EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ，纯化回收大片段，用同样的两种限制性内切酶双酶切质粒pPIC3.5K，纯化回收大片段。连接回收的两组片段，得到含α-factor-uricase DNA片段的重组质粒pPIC3.5K-α-factor-uricase，将重组质粒pPIC3.5K-α-factor-uricase转化到大肠杆菌DH5α，制得5’端融合酿酒酵母α交配因子信号肽DNA的黄曲霉尿酸氧化酶全基因序列、即α-factor-uricase DNA序列的基因工程菌，将该基因工程菌委托专业的生物技术公司测序，证实该基因工程菌含完整的重组α-factor-uricase基因片段；

e.构建高效分泌表达黄曲霉尿酸氧化酶的毕赤酵母基因工程菌：

参考Invitrogen毕赤酵母实验手册，从步骤d构建好的基因工程菌中抽提重组质粒pPIC3.5K-α-factor-uricase，经限制性内切酶SalⅠ酶切线形化后，电击转化毕赤酵母SMD1168，用G418浓度梯增法筛选得到多拷贝高效表达黄曲霉尿酸氧化酶的基因工程菌；

f.液体培养：

参考Invitrogen毕赤酵母实验手册，将构建好的高效表达黄曲霉尿酸氧化酶的基因工程菌接种到YPD培养基中震荡培养过夜。取适量菌体在BMGY液体培养基中培养至OD600nm=2-6时，1500-3000g离心5-10min，收集菌体,BMMY重悬菌体，使菌体初始浓度在OD600=1.0-1.5左右，震荡培养，每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5～1.0%。在培养60-72h后,得到最大浓度的可溶性表达的黄曲霉尿酸氧化酶。

上述构建涉及到的质粒pPIC9K,pPIC3.5K，大肠杆菌DH5α，巴斯德毕赤酵母SMD1168，限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、SalⅠ，DNA连接酶等均可从市场购得。委托合成所述的碱基序列和测序的生物技术公司是南京金斯瑞生物科技有限公司。

一种黄曲霉尿酸氧化酶的纯化方法，其步骤是：

a.硫酸铵分级沉淀：

用冷冻离心机将上述步骤获得的发酵液于0-20℃下以2000-10000g的速度离心5-30min，收集上清液；上清进行0%-30%，30%-60%硫酸铵分级沉淀，30%-60%部分沉淀用磷酸盐缓冲液（pH7.2,20mM）溶解备用。

b.疏水层析：

将步骤a所得初步纯化浓缩的重组黄曲霉尿酸氧化酶溶液进行疏水层析。层析柱预先用含有0.8M硫酸铵的磷酸盐缓冲液（pH7.2,20mM）平衡好备用。将步骤a得到的黄曲霉尿酸氧化酶溶解液加入硫酸铵至终浓度0.8M，上样，然后用此含有0.8M硫酸铵的磷酸盐缓冲液冲洗直至检测基线接近上样前基线，然后以分别含有0.6、0.4、0.2M硫酸铵的磷酸盐缓冲液进行分步洗脱，收集0.2M硫酸铵的洗脱峰，此峰即为初步纯化的重组黄曲霉尿酸氧化酶溶液。将该峰洗脱液用碳酸盐缓冲液（20mM Na₂CO₃/NaHCO₃,2mM EDTA，pH10.0）透析。

c.离子交换层析：

将步骤b所获得的含黄曲霉尿酸氧化酶的透析液进行阴离子柱层析。层析柱先用碳酸盐缓冲液（20mM Na₂CO₃/NaHCO₃,2mM EDTA，pH10.0）平衡好，将上述透析液样品过此柱，然后用上述碳酸盐缓冲液冲洗直至检测基线接近上样前基线，然后以其为流动相加0.1，0.2N NaCL进行分步洗脱，收集由0.2N NaCL的洗脱峰，此峰即为进一步纯化的重组黄曲霉尿酸氧化酶溶液。将该峰洗脱液用磷酸盐缓冲液（pH7.2,20mM）透析，并用截留分子量为10,000的超滤膜进行超滤浓缩。

d.凝胶过滤层析：

将步骤c所得浓缩液经凝胶过滤层析。用平衡液（pH7.2,20mM的磷酸盐缓冲液）平衡，待样品完全进入胶中后，用平衡液从此凝胶过滤介质中洗脱出蛋白质，洗脱特征峰-主峰即为所需的纯重组黄曲霉尿酸氧化酶。

e.冷冻干燥：

将凝胶过滤分离后的收集液于-35℃--45℃下冷冻升华干燥，最终获得酶活30IU/mg、纯度大于99%的白色干粉状高活性黄曲霉尿酸氧化酶，其序列为SEQ ID NO.2所示。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1）目标产物N端天然，药用价值高。

在质粒的构建中，通过SOE-PCR，将酿酒酵母α交配因子信号肽基因序列，黄曲霉尿酸氧化酶基因序列（uricase)连接在一起。转化入毕赤酵母后，经毕赤酵母(SMD1168)同源重组，表达的黄曲霉尿酸氧化酶胞外分泌，且该酶N端天然，有较大的药用前景。

2）目标产物以可溶性形式积累于培养液中，易于提纯，活性高。

由于在重组尿酸氧化酶基因前端拼接了胞外分泌信号肽基因序列（α-factor），所以，目标产物胞外分泌，并以可溶物的形式积累于培养液，而毕赤酵母SMD1168为蛋白酶缺陷型菌株，自身胞外分泌少，所以目标蛋白既易于积累且易于提纯。

同时，作为宿主菌的毕赤酵母（SMD1168），对表达的外源蛋白的糖基化修饰适中，既促使蛋白的正确折叠，又不会像酿酒酵母过度修饰；对表达的外源蛋白的C端有酰胺化修饰能力，能有效地提高该酶的半衰期和增加其于受体的亲和力。

3）工程菌对外源基因遗失率极低、培养成本低、有较大的工业化前景。

通过转化DNA与毕赤酵母基因组中同源序列的同源重组，毕赤酵母与酿酒酵母一样可产生稳定的阳性转化子。这些重组的菌株在无选择压力条件下，即使其携带的基因是多拷贝的，也表现出极度稳定性。毕赤酵母营养要求低、生长快、培养基廉价，便于工业化生产。

4)分离工艺简单、生产周期短

本纯化工艺仅由离子交换、疏水层析和凝胶层析三个操作单元所组成，步骤少，且步骤间衔接紧凑，只需一次透析衔接，操作周期短；

5）纯化活性回收率高，纯度高

在纯化步骤中，将硫酸铵分级沉淀与疏水层析作为纯化的第一步，集样品浓缩与纯化效率高的特点，一步即可除去85%以上的宿主蛋白和部分脂类物质。强阴离子交换层析可进一步去除90%以上的杂蛋白和部分脂类物质。凝胶过滤层析可进一步除去残留的绝大部分杂质，使最终样品纯度大于99%以上，达到电泳纯与色谱纯，完全满足作为注射用针剂原料药的纯度要求。同时，由于纯化工艺操作步骤少，且都为高效的层析方式，因此总体纯化回收率高，平均可达到50%以上；

6)产物生物活性高

由于纯化过程条件温和，蛋白质不变性，产品酶活可达30IU/mg，生物活性与天然产品相当；

7)占地小

本分离操作仅需二十多平米的实验室即可；

8)纯化全过程采用层析分离技术，易于自动化，易于放大到工业化规模生产；

9）条件温和、无环境污染。

因而用本发明提供的基因工程菌生产重组黄曲霉尿酸氧化酶，产量高，纯化工艺简便高效，生产周期短，成本较低。

附图说明

图1为一种重组表达质粒pPIC3.5K-α-factor-uricase的构建示意图。

具体实施方式

下面结合附图，通过实施例来进一步阐述本发明，说明书与实施例中未注明具体条件的实验方法，都按照Sambrook等人编著的《分子克隆：实验室手册》（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989）中所述的条件，或按照厂商所建议的条件。

实施例1：分泌表达黄曲霉尿酸氧化酶的重组质粒pPIC3.5K-α-factor-uricase的构建。

1.Uricase DNA序列的扩增

黄曲霉经培养3天，过滤菌液，收集菌丝体，按Invitrogen公司Trizol RNA试剂盒操作说明提取黄曲霉菌丝体总RNA。以提取的黄曲霉菌丝体总RNA为模板，以urasoeupP1（5’-TCCGCAGTAAAAGCAGCCCGCTACGGC-3’）和urasoedownP2（5’-AGCGAATTCTTATTACAATTTAGACTTCAGAGAGGAC

CGGCC-3’）为引物，按Promega公司的RT-PCR试剂盒的操作说明，进行RT-PCR扩增。经琼脂糖凝胶电泳分离（900bp左右），反应产物用DNA Gel Extraction Kit回收，获得Uricase DAN片段。

2.α交配因子信号肽DNA序列（α-factor)的获得

以Invitrogen公司的质粒pPIC9K为模板，以afacterupP3（5’-TATTCGAAG

GATCCAAACGATGAG-3’）和afactersoedownP4（5’-TGCCGTAGCGGGCT

GCTTTTACTGCGGATCTTTTCTCGAGAGATACCCCTTCTTC-3’）为引物，进行PCR扩增。其PCR扩增详情如下：

PCR扩增的反应程序为:95℃预变性5min；94℃变性30S，52℃退火30S，72℃延伸30S，进行30个循环；最后于72℃延伸7min结束反应。

反应体系：

PCR扩增后的反应产物经琼脂糖凝胶电泳分离（250bp左右），用DNA Gel Extraction Kit回收，获得α交配因子信号肽DNA序列片段。

3.通过SOE-PCR进行α-factor-uricase全基因合成：

以上述纯化后的α-factor DNA片段和Uricase DNA片段为模板，以P3(afacterup)，P2(urasoedown)分别为5’及3’引物，进行SOE-PCR扩增融合基因。其SOE-PCR扩增详情如下：

SOE-PCR扩增的反应程序为:95℃预变性5min；94℃变性30S，52℃退火30S，72℃延伸60S，进行30个循环；最后于72℃延伸7min结束反应。

反应体系：

SOE-PCR扩增后的反应产物经琼脂糖凝胶电泳分离（1200bp左右），用DNA Gel Extraction Kit回收，获得α-factor-uricase全基因片段。

4.重组质粒pPIC3.5K-α-factor-uricase的构建：

使用TaKaRa公司的EcoRⅠ和BamHⅠ限制性内切酶，参考TaKaRa公司双酶切反应通用缓冲液表。双酶切过夜处理步骤3获得的融合基因片段，纯化回收大片段。用同样的两种限制性内切酶，双酶切过夜处理Invitrogen公司的质粒pPIC3.5K，纯化回收大片段。回收的两组片段用T4DNA连接酶连接，得到含α-factor-uricase DNA片段的重组质粒pPIC3.5K-α-factor-uricase。参考《分子克隆：实验室手册》氯化钙转化方法，将该重组质粒转化到大肠杆菌DH5α，涂板，挑取阳性培养皿中的白色单菌落。扩大培养后，参考《分子克隆：实验室手册》中SDS碱裂解法制备质粒DNA的方法，提取质粒pPIC3.5K-α-factor-uricase。用内切酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切鉴定。鉴定正确的质粒委托专业生物技术公司进行全自动序列测定。测定结果有如下特征：在原pPIC3.5K质粒的EcoRⅠ和BamH Ⅰ位点插入了含酿酒酵母α交配因子信号肽序列的黄曲霉尿酸氧化酶的全段DNA序列；在信号肽序列后，紧跟着黄曲霉尿酸氧化酶的DNA序列，插入的全段序列正确无误。

实施例2：工程菌的建立

1.质粒pPIC3.5K-α-factor-uricase的抽提及线性化处理

将实施例1中构建好的pPIC3.5K-α-factor-uricase质粒，使用TaKaRa公司的Sal Ⅰ限制性内切酶酶切过夜，作线性化处理。

2.毕赤酵母SMD1168的电转化

(1)取100μL于-70℃冻存的SMD1168菌株（购自Invitrogen公司）接入5mL

YPD培养基中,30℃/220rpm过夜培养后，于YPD固体培养基上划线，

30℃培养3天。

(2)挑取单菌落接种于10mLYPD培养基中，30℃/220rpm摇床过夜。

(3)以1%接种量转接100mLYPD液体培养基，30℃/220rpm摇床过夜，至菌体浓度在OD=1.3-1.5时停止培养。

(4)4℃离心2500g,5min,弃上清，用100mL冰预冷无菌水将菌体重悬。

(5)4℃离心2500g,10min,弃上清，用50mL冰预冷无菌水将菌体重悬。

(6)4℃离心2500g,10min,弃上清，再用20mL1mol/L的山梨醇洗涤1次。

(7)4℃离心2500g,10min,弃上清，再用200uL1mol/L的冰预冷的山梨醇重悬，冰上放置15min。

(8)将线性化的质粒pPIC3.5K-α-factor-uricase5μl加入在80μl酵母感受态细胞中，冰上放置15min，迅速转入0.2cm电击杯中（冰预冷），电击，迅速加入1mL1mol/L山梨醇，按每平板200μL转化液，涂布4块MD平板，培养3天。

3.甲醇营养型（Mut+）重组毕赤酵母的多拷贝筛选

pPCI3.5K拥有的卡那霉素抗性基因可传递给酵母细胞，从而使转化后的毕赤酵母对抗生素G418产生抗性，随着G418浓度的增加，能存活的毕赤酵母菌株逐渐减小，利用这一原理来筛选高拷贝转化子。然后将获得的重组克隆进行小量发酵表达，筛选出表达量最高的甲醇营养型（Mut+）重组毕赤酵母菌株。

(1)每块转化培养好的MD平板上加入2mL无菌纯水，洗出平板中的菌体，将各平板洗出的菌体液合并之。

(2)吸取200μl菌体液涂布在不同G418浓度（1、2、4、6mg/ml）的YPD平板上，培养3天，挑选出G418浓度在4、6mg/ml两平板上的阳性克隆菌株（共计84株）。

(3)将上述挑选的阳性克隆菌株，置于装有10ml BMGY培养基的100ml摇瓶中，于30°C/250rpm培养至OD600=2-6；

(4)室温下2500g离心5min，收集菌体，用BMMY重悬菌体，使OD600=1.0左右（约10-15ml）；

(5)将BMMY重悬后的菌液置于100L的摇瓶中，用8层纱布封口，放置于30°C/250rpm的摇床上继续生长；

(6)每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5～1.0%；

(7)按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5ml EP管中，最大转速离心2～3min，收集上清，分析目的蛋白的表达量最佳收获时间。取样时间点为：0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h；

(8)经SDS-PAGE电泳分析，发现编号为35的阳性克隆菌株表达量最高。将该菌株命名为Pichia pastoris SMD1168(pPIC3.5K-α-factor-uricase)，用甘油（终浓度15%）-70℃保藏。

实施例3：工程菌发酵：

(1)实施例2的Pichia pastoris SMD1168(pPIC3.5K-α-factor-uricase)菌株，接入装有25ml BMGY培养基的250ml摇瓶中，于30℃/250rpm培养至OD600=2-6；

(2)室温下2500g离心5min，收集菌体，用1L的BMGY重悬菌体，30℃/250rpm培养至OD600=2-6；

(3)室温下2500g离心5min，收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体于摇瓶内，调整OD600至=1.0.用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30°C/250-300rpm的摇床上继续生长；

(4)每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为1.0%，培养72h,可得到最大浓度的可溶性黄曲霉尿酸氧化酶。

实施例4：重组黄曲霉尿酸氧化酶的分离纯化：

a.硫酸铵分级沉淀：

用冷冻离心机将实施例3获得的发酵液于4℃下以10000g的速度离心30min，收集上清液；上清进行0%-30%，30%-60%硫酸铵分级沉淀，30%-60%部分沉淀用磷酸盐缓冲液（pH7.2,20mM）溶解备用。

b.疏水层析：

将步骤a所得初步纯化浓缩的重组尿酸氧化酶溶液用Phenyl Sepharose6Fast Flow(high sub)(H柱，Pharmacia公司产品)进行疏水层析，层析柱1.6*30cm。疏水层析柱预先用含有0.8M硫酸铵的磷酸盐缓冲液（pH7.2,20mM）平衡好备用。将步骤a得到的黄曲霉尿酸氧化酶溶解液加入硫酸铵至终浓度0.8M，上样，然后用此含有0.8M硫酸铵的磷酸盐缓冲液冲洗直至检测基线接近上样前基线，然后以分别含有0.6、0.4、0.2M硫酸铵的磷酸盐缓冲液进行分步洗脱，收集各洗脱峰，用10%（质量体积比）SDS-PAGE证实目的蛋白于0.2M硫酸铵被洗脱，将该峰洗脱液用碳酸盐缓冲液（20mM Na₂CO₃/NaHCO₃,2mMEDTA，pH10.0）透析。

c.离子交换层析：

将步骤b的透析液样品用Q-Sepharose Fast Flow(Q柱，Pharmacia公司产品)进行阴离子交换层析，层析柱1.6*30cm。层析柱先用裂解缓冲液（20mM Na2CO3/NaHCO3,2mM EDTA，pH10.0）平衡好，将上述裂解液样品过此柱，上样速度7mL/分，然后用此裂解液冲洗直至检测基线接近上样前基线，然后以其为流动相加0.1，0.2N NaCL进行分步洗脱，洗脱速度6mL/分，收集各洗脱峰，用10%（质量体积比）SDS-PAGE证实目的蛋白于0.2N NaCL被洗脱，将该峰洗脱液用磷酸盐缓冲液（pH7.2,20mM）透析，并用截留分子量为10,000的超滤膜进行超滤浓缩。

d.凝胶过滤层析：

将步骤c所得浓缩液上样至Sephacryl S-200（S柱，Pharmacia公司产品）凝胶过滤层析柱，层析柱1.6*70cm。凝胶过滤层析柱预先用平衡液（pH7.2,20mM的磷酸盐缓冲液）平衡好，待样品完全进入胶中后，用平衡液从此凝胶过滤介质中洗脱出蛋白质，流速1min/分，洗脱特征峰（主峰）即为所需的纯重组黄曲霉尿酸氧化酶。本步骤可连续进行，即在特征峰（主峰）出现后进行下一次上样和洗脱，无须进行洗柱和再平衡，单次层析时间仅需40分钟左右。

e.冷冻干燥：

将凝胶分离后的收集液于-35℃--45℃下冷冻干燥，最终获得酶活30IU/mg、纯度大于99%的白色干粉状高活性黄曲霉尿酸氧化酶，其序列为SEQ ID NO.2所示。

实施例5：重组黄曲霉尿酸氧化酶的体外生物学活性测定：

在4mL比色杯中加入3mL溶于3mL TEA缓冲液(7.5g/L三乙醇胺，0.38g/L EDTA，pH8.9)的100μmol/L尿酸溶液，再加入1μg纯化后的尿酸氧化酶，25℃条件下反应5min后加0.5mL的20％（质量体积比）KOH终止反应。通过检测292nm处吸光度值的下降所反映的尿酸浓度的降低，从而得出酶的活性。酶活性定义：在pH8.9、30℃条件下，每分钟催化1μmol尿酸氧化所需的酶量为一个单位。最终测得纯化后的黄曲霉尿酸氧化酶比活力为30IU/mg。

以上对本发明较佳实施例的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明的范围。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  湖北工业大学

 

<120>  一种黄曲霉尿酸氧化酶在巴斯德毕赤酵母中的高效表达与纯化的方法 

 

<130>  一种黄曲霉尿酸氧化酶在巴斯德毕赤酵母中的高效表达与纯化的方法 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  1164

<212>  DNA

<213>  黄曲霉

 

<400>  1

atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct     60

 

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt    120

 

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat    180

 

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta    240

 

tctctcgaga aaagatccgc agtaaaagca gcccgctacg gcaaggacaa tgtccgcgtc    300

 

tacaaggttc acaaggacga gaagaccggt gtccagacgg tgtacgagat gaccgtctgt    360

 

gtgcttctgg agggtgagat tgagacctct tacaccaagg ccgacaacag cgtcattgtc    420

 

gcaaccgact ccattaagaa caccatttac atcaccgcca agcagaaccc cgttactcct    480

 

cccgagctgt tcggctccat cctgggcaca cacttcattg agaagtacaa ccacatccat    540

 

gccgctcacg tcaacattgt ctgccaccgc tggacccgga tggacattga cggcaagcca    600

 

caccctcact ccttcatccg cgacagcgag gagaagcgga atgtgcaggt ggacgtggtc    660

 

gagggcaagg gcatcgatat caagtcgtct ctgtccggcc tgaccgtgct gaagagcacc    720

 

aactcgcagt tctggggctt cctgcgtgac gagtacacca cacttaagga gacctgggac    780

 

cgtatcctga gcaccgacgt cgatgccact tggcagtgga agaatttcag tggactccag    840

 

gaggtccgct cgcacgtgcc taagttcgat gctacctggg ccactgctcg cgaggtcact    900

 

ctgaagactt ttgctgaaga taacagtgcc agcgtgcagg ccactatgta caagatggca    960

 

gagcaaatcc tggcgcgcca gcagctgatc gagactgtcg agtactcgtt gcctaacaag   1020

 

cactatttcg aaatcgacct gagctggcac aagggcctcc aaaacaccgg caagaacgcc   1080

 

gaggtcttcg ctcctcagtc ggaccccaac ggtctgatca agtgtaccgt cggccggtcc   1140

 

tctctgaagt ctaaattgta ataa                                          1164

 

 

<210>  2

<211>  301

<212>  PRT

<213>  黄曲霉

 

<400>  2

 

Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr

1               5                   10                  15     

 

 

Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu Met

            20                  25                  30         

 

 

Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys

        35                  40                  45              

 

 

Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile

    50                  55                  60                 

 

 

Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly

65                  70                  75                  80 

 

 

Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala

                85                  90                  95     

 

 

Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp

            100                 105                 110        

 

 

Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg

        115                 120                 125            

 

 

Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser

    130                 135                 140                

 

 

Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp

145                 150                 155                 160

 

 

Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg

                165                 170                 175    

 

 

Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser

            180                 185                 190        

 

 

Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp

        195                 200                 205            

 

 

Ala Thr Ala Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser

    210                 215                 220                

 

 

Ala Ser Val Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala

225                 230                 235                 240

 

 

Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His

                245                 250                 255    

 

 

Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly

            260                 265                 270        

 

 

Lys Asn Ala Glu Val Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile

        275                 280                 285             

 

 

Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu

    290                 295                 300    

 

 

Claims (2)

1.一种利用巴斯德毕赤酵母高效表达黄曲霉尿酸氧化酶的方法，其特征在于，步骤如下：

a. Uricase DNA序列的扩增：

合成碱基序列： 

P1：5’-TCCGCAGTAAAAGCAGCCCGCTACGGC-3’

P2：5’- AGCGAATTCTTATTACAATTTAGACTTCAGAGAGGACCG GCC -3 ’

                   EcoRⅠ

以黄曲霉菌丝体总RNA为模板，按RT-PCR试剂盒的操作，进行RT-PCR扩增，反应产物用DNA Gel Extraction Kit回收，获得Uricase DNA片段；  

    b. α-factor信号肽编码序列的获得：合成碱基序列： 

     P3：5’- TATTCGAAGGATCCAAACGATGAG -3’

                        BamHⅠ

     P4：5’- TGCCGTAGCGGGCTGCTTTTACTGCGGATCTTTTCTCGAGAGATACCCCTTCTTC -3’；

以pPIC9K质粒为模板，以P3、P4为引物进行PCR扩增，反应产物用DNA Gel Extraction Kit回收，获得α-factor 信号肽编码DNA片段；

c. 通过重叠延伸PCR进行α-factor-uricase 全基因合成： 

以上述纯化后的α-factor信号肽DNA片段和Uricase DNA片段为模板，加入P3，P2, 经SOE-PCR方法扩增融合基因，反应产物用DNA Gel Extraction Kit回收，获得α-factor-uricase 融合DNA片段，其序列为SEQ ID NO.1所示；

d. 构建含黄曲霉尿酸氧化酶基因序列的基因工程菌：

用两种限制性内切酶双酶切步骤c获得的α-factor-uricase DNA融合片段的，所述的两种限制性内切酶是EcoR Ⅰ和BamHⅠ，纯化回收大片段，用同样的两种限制性内切酶双酶切质粒pPIC3.5K，纯化回收大片段；连接回收的两组片段，得到含α-factor-uricase DNA片段的重组质粒pPIC3.5K-α-factor-uricase，将重组质粒pPIC3.5K-α-factor-uricase转化到大肠杆菌DH5α，制得5’端融合酿酒酵母α交配因子信号肽DNA的黄曲霉尿酸氧化酶全基因序列、即α-factor-uricase DNA序列的基因工程菌；

e. 构建高效分泌表达黄曲霉尿酸氧化酶的毕赤酵母基因工程菌：

从步骤d构建好的基因工程菌中抽提重组质粒pPIC3.5K-α-factor-uricase ，经限制性内切酶SalⅠ酶切线形化后，电击转化毕赤酵母SMD1168，用G418浓度梯增法筛选得到多拷贝高效表达黄曲霉尿酸氧化酶的基因工程菌；

f. 黄曲霉尿酸氧化酶的表达：

将构建好的高效表达黄曲霉尿酸氧化酶的基因工程菌接种到YPD培养基中震荡培养过夜；取适量菌体在BMGY液体培养基中培养至OD600nm=2-6时，1500-3000g离心5-10min，收集菌体,BMMY重悬菌体，使菌体初始浓度在OD600 =1.0-1.5左右，震荡培养，每24h向培养基中添加100％ 甲醇至终浓度为0.5～1.0%；在培养60-72h后,得到可溶性表达的黄曲霉尿酸氧化酶。

2.权利要求1所述的表达黄曲霉尿酸氧化酶的方法制得的黄曲霉尿酸氧化酶，其纯化步骤是：

a. 硫酸铵分级沉淀：

用冷冻离心机将含有黄曲霉尿酸氧化酶的发酵液于0-20℃下以2000-10000 g的速度离心5-30 min，收集上清液；上清进行0%-30%，30%-60%硫酸铵分级沉淀，30%-60%部分沉淀用pH 7.2, 20 mM的磷酸盐缓冲液溶解备用；

b. 疏水层析：

将步骤a所得初步纯化浓缩的重组黄曲霉尿酸氧化酶溶液进行疏水层析，层析柱预先用含有0.8M 硫酸铵的pH 7.2, 20 mM的磷酸盐缓冲液平衡好备用，将步骤a得到的黄曲霉尿酸氧化酶溶解液加入硫酸铵至终浓度0.8 M，上样，然后用此含有0.8 M硫酸铵的磷酸盐缓冲液冲洗直至检测基线接近上样前基线，然后以分别含有0.6 、0.4、0.2M硫酸铵的磷酸盐缓冲液进行分步洗脱，收集0.2 M 硫酸铵的洗脱峰，此峰即为初步纯化的重组黄曲霉尿酸氧化酶溶液，将该峰洗脱液用碳酸盐缓冲液透析；

c. 离子交换层析：

将步骤b所获得的含黄曲霉尿酸氧化酶的透析液进行阴离子柱层析，层析柱先用碳酸盐缓冲液平衡好，将上述透析液样品过此柱，然后用上述碳酸盐缓冲液冲洗直至检测基线接近上样前基线，然后以其为流动相加0.1，0.2N NaCL进行分步洗脱，收集由0.2N NaCL的洗脱峰，此峰即为进一步纯化的重组黄曲霉尿酸氧化酶溶液，将该峰洗脱液用磷酸盐缓冲液透析，并用截留分子量为10,000的超滤膜进行超滤浓缩；

d. 凝胶过滤层析：

将步骤c所得浓缩液经凝胶过滤层析，用pH 7.2, 20 mM 的磷酸盐缓冲液平衡，待样品完全进入胶中后，用平衡液从此凝胶过滤介质中洗脱出蛋白质，洗脱特征峰-主峰即为所需的纯重组黄曲霉尿酸氧化酶；

e. 冷冻干燥：

将凝胶过滤分离后的收集液于-35℃--45℃下冷冻升华干燥即得白色干粉状高活性黄曲霉尿酸氧化酶。

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