CN111718951A - 重组新型冠状病毒covid-19 s蛋白、其制备方法及应用 - Google Patents

重组新型冠状病毒covid-19 s蛋白、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组新型冠状病毒COVID‑19S蛋白、其制备方法及应用。该制备方法包括：将经过密码子优化的编码COVID‑19S蛋白的核苷酸序列构建入酵母细胞诱导表达载体中，然后转入酵母细胞进行培养后诱导表达，并进行纯化，从而获得重组COVID‑19S蛋白。本发明制备方法设计巧妙，可以获得具有免疫学活性的高纯度的重组COVID‑19S蛋白，该蛋白可以作为一个主要的诊断试剂成分，用于诊断COVID‑19感染病人的IgM和IgG，还有可能成为COVID‑19病毒的亚单位疫苗，用于预防COVID‑19病毒的流行。另外采用以甲醇毕赤酵母为代表酵母蛋白表达，具有表达量高，可诱导，糖基化机制接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化，易实现高密发酵等优点，可应用于大规模工业化发酵生产。

Description

重组新型冠状病毒COVID-19 S蛋白、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及重组新型冠状病毒COVID-19 S蛋白、其制备方法及应用，特别涉及一种COVID-19 S蛋白在酵母细胞内的重组和分泌表达。
背景技术
新型冠状病毒(2019-nCoV)引发的疾病为2019冠状病毒病COVID-19(CoronaVirus Disease 2019)。
冠状病毒人传人的特性是由其衣壳表面棘突蛋白(S蛋白)与宿主细胞表面受体的相互 作用实现的，S蛋白与人体细胞表面的ACE2受体结合进入细胞，而ACE2(血管紧张素转换 酶2)是人类的一个重要的细胞表面受体，广泛分布于人的心脏、肾脏、睾丸、胃肠道大脑和肺内，主要参与心功能、血压调节、血管保护和部分肾脏功能的调节。传染过程是新型冠状病毒利用一种紧密糖基化的、同源三聚体I类融合凸起蛋白(S蛋白)来进入宿主细胞中，S蛋白能以一种相对稳定的融合前构象存在，并经历剧烈的结构重排来促进病毒膜结构与宿 主细胞膜进行融合，这一过程是由病毒S1亚单位与宿主受体的结合所诱发，其能破坏融合前 三聚体的稳定性，从而导致S1亚单位脱落，并促使S2亚单位转变为高度稳定的融合后构象。 因此冠状病毒的S蛋白(spike glycoprotein)是开发新型疫苗、治疗性抗体和诊断技术的关键 靶点。
为了分析研究冠状病毒的S蛋白，蛋白表达技术是一种重要的技术手段，它是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术。在蛋白表达技术中，酵母蛋白表达占着不可忽略的作用，因为酵母是单细胞低等真核生物，既具有原核生物细胞生长速度快、容易培养、操作简单等优点，又具有真核生物表达时对蛋白质的加工和修饰等功能，因此相对于原核表达系统表达出的不具有活性的蛋白，酵母表达出的蛋白是具有生物学活性的，而且酵母表达系统比其他真核表达系统如昆虫、哺乳动物组织等表达系统快速、简便、成本低。
毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母，以甲醇为唯一的碳源，具有强有力的醇氧化酶基因 AOX启动子，是目前最强、调控机制最严格的启动子之一，它能够严格调控外源基因的表达，使外源基因只在含有甲醇的培养基中有效表达。因为基因组中存在两个基因AOX1和AOX2，对AOX基因进行编码，两个基因的同源性为92％，编码蛋白质的同源性高达97％，AOX1启动子受到甲醇的诱导强烈，但是AOX2启动子受甲醇诱导较弱，从而当外源基因整合到毕赤酵母染色体上，随着染色体的复制而复制，遗传性状稳定，并且毕赤酵母在氧气充足时能快速生长，通过连续培养可形成很高的细胞密度。因此，以甲醇毕赤酵母为代表酵母蛋白表达，具有表达量高，可诱导，糖基化机制接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化，易实现高密发酵等优点，可应用于大规模工业化发酵生产。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种重组新型冠状病毒COVID-19 S蛋白、其制备方法及应用，该重组COVID-19 S蛋白具有免疫学活性，可以作为一个主要的诊断试剂成分，用于诊断COVID-19感染病人的IgM和IgG，还有可能成为COVID-19病毒的亚单位疫苗，用于预防COVID-19病毒的流行。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明的一实施方案之中提供的一种重组新型冠状病毒COVID-19 S蛋白的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)将经过密码子优化的COVID-19 S蛋白的核苷酸序列构建入酵母细胞诱导表达载体中；
(2)转入酵母细胞进行培养后诱导表达；
(3)纯化，从而获得所述重组COVID-19 S蛋白。
其中，所述经过密码子优化的COVID-19 S蛋白的核苷酸序列是如SEQ ID NO：3所示的序列，其是通过COVID-19 S蛋白的核苷酸序列(即SEQ ID NO：2所示的序列)经密码子优化设计得到。
所述酵母细胞是甲醇营养型酵母细胞。
本发明的一些实施方案之中还提供了由上述方法制备的重组新型冠状病毒COVID-19 S 蛋白。
本发明的一个实施方案之中还提供了所述重组新型冠状病毒COVID-19 S蛋白的用途。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明的重组COVID-19 S蛋白的制备方法是将经过密码子优化的编码COVID-19 S蛋白的核苷酸序列构建入酵母细胞诱导表达载体中，然后转入酵母细胞进行培养后诱导表达，并进行纯化，从而获得所述重组COVID-19 S蛋白，经检测，不含可以用 SDS-PAGE或HPLC检测到的酵母细胞蛋白或其它残留物，通过实验表明获得的重组 COVID-19 S蛋白具有免疫学活性，因此本发明的重组COVID-19 S蛋白的制备方法设计巧妙，可以获得具有免疫学活性的高纯度的重组COVID-19 S蛋白。
(2)本发明获得的重组COVID-19 S蛋白可以作为一个主要的诊断试剂成分，用于诊断COVID-19感染病人的IgM和IgG，还有可能成为COVID-19病毒的亚单位疫苗，用于预防COVID-19病毒的流行。
(3)本发明采用以甲醇毕赤酵母为代表酵母蛋白表达，具有表达量高，可诱导，糖基化机制接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化，易实现高密发酵等优点，可应用于大规模工业化发酵生产。
附图说明
图1是本发明实施例2中COVID-19 S蛋白在毕赤酵母中表达所用的载体结构图谱。采用AOX1启动子与酵母a-factor secretion signal分泌表达目的蛋白。
图2是本发明实施例2中表达COVID-19 S蛋白的重组Pichia pastoris诱导后的上清液在还原条件下SDS-PAGE结果示意图。图2中从左到右，1为蛋白分子量标准；2为GS115酵母细胞；3-15为挑取的13个在无精氨酸培养板上生长的克隆。
图3是本发明实施例3中离子交换层析图谱，第一峰是上样流穿峰，第二峰为氯化钠洗脱蛋白，此峰洗脱的蛋白为COVID-19 S蛋白；第三峰为氢氧化钠清洗杂蛋白峰。
图4是本发明实施例3中离子交换层析样品SDS-PAGE的结果示意图，从左到右，1：培养上清液；2：离子交换层析流穿液；3：氯化钠洗脱蛋白；4：蛋白分子量标准。
图5是本发明获得的COVID-19 S蛋白HPLC(SEC)图谱，COVID-19 S蛋白为18min 处最高峰。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特列举以下具体实施例详细说明，但这些实施例不应被认为可以对本发明的保护范围构成任何限制。
本发明主要是提供了一种重组COVID-19 S蛋白的制备方法，其制备过程包括如下步骤：
(1)将经过密码子优化的编码COVID-19 S蛋白的核苷酸序列构建入酵母细胞诱导表达载体中；
(2)转入酵母细胞进行培养后诱导表达；
(3)纯化，从而获得所述重组COVID-19 S蛋白。
在步骤(1)中，所述经过密码子优化的COVID-19 S蛋白的核苷酸序列是如SEQ IDNO：3 所示的序列，其是通过COVID-19 S蛋白的核苷酸序列(即SEQ ID NO：2所示的序列)经密码子优化设计得到。
所述经过密码子优化的COVID-19 S蛋白的氨基酸序列是如SEQ ID NO：1所示的序列。
所述酵母细胞是甲醇营养型酵母细胞。
优选的，所述酵母细胞是毕赤酵母细胞(即Pichia pastoris细胞)。
进一步优选的，所述酵母细胞是GS115细胞。
所述酵母细胞诱导表达载体是分泌表达载体。
优选的，所述酵母细胞诱导表达载体是毕赤酵母表达载体，其所用的启动子为AOX1启动子。
进一步优选的，所述酵母细胞诱导表达载体是pPIC9表达载体，其过程是载体转染入毕赤酵母细胞(Pichia pastoris细胞)后与酵母染色体重组整合入酵母染色体中。
在步骤(2)中，所述酵母细胞培养所用的培养基不含任何动物或人来源的物质。
优选的，所述酵母细胞培养的培养基为酵母提取物、甘油、甲醇和含氮盐类中的一种。
进一步优选的，所述酵母细胞培养的培养基为甲醇。
在步骤(3)中，所述纯化方法为细胞培养上清通过离子交换层析柱层析方法将所述重组 COVID-19 S蛋白以单体形式分离。
重组COVID-19 S蛋白纯化后可以进一步超滤浓缩然后添加保护剂和/或冷冻干燥保存。
本发明的重组COVID-19 S蛋白的一个典型用途系作为一个主要诊断试剂成分，用于诊断COVID-19感染病人的IgM和IgG，但也可以应用于其它用途，例如成为COVID-19病毒的亚单位疫苗，用于预防COVID-19病毒的流行。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的具体实施方式进行详细说明。
实施例I：表达序列获取和优化
为了达到使COVID-19 S蛋白在酵母细胞内高表达这个目的，通过查文献得到该完整基因的氨基酸序列(即SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列)。根据这个氨基酸序列，确定编码COVID-19 S蛋白的核苷酸序列(即SEQ ID NO：2所示的序列)，经密码子优化设计了核苷酸序列(即SEQ ID NO：3所示的序列)，将该核苷酸序列插入表达载体，然后转化酵母细胞，使用相应的诱导物进行诱导表达。
实施例2：表达细胞株的构建和表达克隆筛选
含密码子优化的COVID-19 S蛋白的核苷酸序列(即SEQ ID NO：3所示的序列)在5’端加上XhoI位点和AAA AGA核苷酸序列，在3’端加入EcoRI位点。选用pPIC9质粒(Invitrogen)，用XhoI和EcoRI双酶切使之线性化。将具有XhoI和EcoRI酶切获得的 COVID-19 S蛋白DNA与XhoI和EcoRI线性化的pPIC9质粒(Invitrogen)连接(见图1)，然后转化大肠杆菌菌株DH5α(Invitrogen)获得，名称定为pPIC9-COVID-19 S。pPIC9- COVID-19 S用SalI酶切使之成线性，用苯酚：氯仿：异戊醇(phenol：chloroform：isoamyl alcohol) (25∶24∶1)抽提后，上清加乙醇沉淀DNA。沉淀的DNA干燥去乙醇后加10微升TE缓冲液。
表达宿主细胞采用Pichia pastoris细胞株GS115。在长有GS115的YPD(YeastExtract Peptone Dextrose Medium，又叫酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)平板上挑取单克隆细胞接种到含5毫升YPD培养基的50毫升conical(圆锥形)管中，在28-30℃，250-300rpm条件下培养过夜。取0.5毫升过夜的培养细胞接种到含500毫升YPD培养基的2升三角烧杯中，在 28-30℃，250-300rpm条件下培养至OD600＝1.3-1.5。培养液1500g、4℃离心5分钟，弃上清。细胞重悬于500毫升冰2-8℃水中，1500g、4℃离心5分钟，弃上清。细胞重悬于250毫升冰2-8℃水中，1500g、4℃离心5分钟，弃上清。细胞重悬于温度为2-8℃、20毫升1M山梨醇中，1500g、4℃离心5分钟，弃上清。细胞重悬于温度为2-8℃、1毫升1M山梨醇中，此时重悬液的体积为1.5毫升左右。10微克线性化pPIC9-Interferon-alpha-1加入到80微升重悬的GS115细胞中混匀后转移到0.2cm的电转杯中，电转杯在冰浴中放置5分钟，在电转仪上脉冲电击细胞一次。电击后立即加入1毫升冰冻1M山梨醇，并转移到1.5毫升离心管中。
取200微升涂布到RDB板(RDB培养板成分：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖；50mg/L L-谷氨酸；50mg/L L-甲硫氨酸；50mg/L L-赖氨酸；50mg/L L-亮氨酸； 50mg/LL-异亮氨酸；20g/L琼脂)上，RDB板置28-30℃培养5-7天。挑取克隆，同时接种在MD培养板(MD培养板成分：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖，20g/L 琼脂)和MM培养板(MM培养板成分：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；5ml/L甲醇；20g/L琼脂)上，置28-30℃培养2天。两天后比较同一克隆在MD培养板和MM培养板上生长状况，在MD和MM培养板上生长正常的克隆为Mut+，在MD培养板上生长正常，在MM培养板上生长很慢或不生长的克隆为Muts。
挑取Mut+克隆接种在含5毫升YPD培养基(YPD培养基成分：10g/L酵母提取物粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖)的50毫升conical管中，置28-30℃摇床200-250rpm生长2天。离心弃上清，添加含1％甲醇的YP培养基(YP培养基成分：10g/L酵母提取物粉；20g/L蛋白胨)5毫升，置28-30℃摇床200-250rpm生长72小时，在培养24小时和48小时时每管分别加甲醇25微升。72小时后取培养上清，用SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)进行分析。SDS-PAGE参照Sambrook et al.，Molecular Biology：A Laboratory Method，1989上的方法进行。成层胶4％，分离胶12.5％。培养上清50微升和等量SDS-PAGE上样缓冲液混匀后取 20微升上样。电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色，分析结果。从图2中可见，GS115细胞诱导后无19KD处蛋白条带，而在无精氨酸培养板上生长的13克隆大部分在100KD处有蛋白条带，有的克隆表达量高，有的克隆仅微量表达。表达阳性的克隆，在100KD处可见一蛋白条带。
实施例3：COVID-19 S蛋白纯化
取50毫升SP-Sepharose FF装入2.6x10cm层析柱，凝胶先后用2体积1M NaCl，2体积 0.5N NaOH清洗后用pH4.0、50mM醋酸缓冲液平衡。
四个2000毫升三角烧瓶，每个含500毫升YPD培养基，均接种筛选到的最佳COVID-19 S蛋白表达克隆，28-30℃摇床200-250rpm生长48小时，离心弃上清，在无菌条件下各加含 0.5％(v/v)甲醇的YP培养基500毫升，28-30℃摇床200-250rpm生长72小时，每24小时各添加2.5毫升甲醇。72小时后离心取上清，上清用20％醋酸调pH至4.0，加入到已经平衡的SP-Sepharose FF离子交换层析柱中。上样完毕，层析柱用pH4、0.50mM醋酸缓冲液洗涤至OD280小于0.05，接着用pH4、0.50mM醋酸、0.5M氯化钠缓冲液洗脱，收集洗脱获得的蛋白峰，这个蛋白峰即为高纯度重组COVID-19 S蛋白(见图3，第一峰是上样流穿峰；第二峰为氯化钠洗脱蛋白，此峰洗脱的蛋白为COVID-19 S蛋白；第三峰为氢氧化钠清洗杂蛋白峰)。SDS-PAGE中在100KD处有一蛋白条带，未见其它蛋白条带(见图4)。2000毫升培养上清可以获得4毫克COVID-19 S蛋白，表达量可达约2mg/l；经检测，不含可以用 SDS-PAGE或HPLC检测到的酵母细胞蛋白或其它残留物。
序列表
<110> 宁波毓昌生物技术有限公司
<120> 重组新型冠状病毒COVID-19 S蛋白、其制备方法及应用
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<213> gamma-aminobutyric acid
<400> 2
Met Pro Val Pro Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gly Cys Val
1 5 10 15
Ala Leu Thr Thr Ala Thr Gly Leu Pro Pro Ala Thr Thr Ala Ser Pro
20 25 30
Thr Ala Gly Val Thr Thr Pro Ala Leu Val Pro Ala Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gly Ala Leu Pro Leu Pro Pro Pro Ser Ala Val Thr Thr
50 55 60
Pro His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Ala Gly Thr Leu Ala Pro Ala
65 70 75 80
Ala Pro Val Leu Pro Pro Ala Ala Gly Val Thr Pro Ala Ser Thr Gly
85 90 95
Leu Ser Ala Ile Ile Ala Gly Thr Ile Pro Gly Thr Thr Leu Ala Ser
100 105 110
Leu Thr Gly Ser Leu Leu Ile Val Ala Ala Ala Thr Ala Val Val Ile
115 120 125
Leu Val Cys Gly Pro Gly Pro Cys Ala Ala Pro Pro Leu Gly Val Thr
130 135 140
Thr His Leu Ala Ala Leu Ser Thr Met Gly Ser Gly Pro Ala Val Thr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Ala Ala Cys Thr Pro Gly Thr Val Ser Gly Pro Pro Leu
165 170 175
Met Ala Leu Gly Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Ala Leu Ala Gly Pro
180 185 190
Val Pro Leu Ala Ile Ala Gly Thr Pro Leu Ile Thr Ser Leu His Thr
195 200 205
Pro Ile Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly Pro Ser Ala Leu Gly
210 215 220
Pro Leu Val Ala Leu Pro Ile Gly Ile Ala Ile Thr Ala Pro Gly Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Ala Ser Thr Leu Thr Pro Gly Ala Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Thr Thr Ala Gly Ala Ala Ala Thr Thr Val Gly Thr Leu Gly Pro
260 265 270
Ala Thr Pro Leu Leu Leu Thr Ala Gly Ala Gly Thr Ile Thr Ala Ala
275 280 285
Val Ala Cys Ala Leu Ala Pro Leu Ser Gly Thr Leu Cys Thr Leu Leu
290 295 300
Ser Pro Thr Val Gly Leu Gly Ile Thr Gly Thr Ser Ala Pro Ala Val
305 310 315 320
Gly Pro Thr Gly Ser Ile Val Ala Pro Pro Ala Ile Thr Ala Leu Cys
325 330 335
Pro Pro Gly Gly Val Pro Ala Ala Thr Ala Pro Ala Ser Val Thr Ala
340 345 350
Thr Ala Ala Leu Ala Ile Ser Ala Cys Val Ala Ala Thr Ser Val Leu
355 360 365
Thr Ala Ser Ala Ser Pro Ser Thr Pro Leu Cys Thr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Leu Leu Ala Ala Leu Cys Pro Thr Ala Val Thr Ala Ala Ser Pro
385 390 395 400
Val Ile Ala Gly Ala Gly Val Ala Gly Ile Ala Pro Gly Gly Thr Gly
405 410 415
Leu Ile Ala Ala Thr Ala Thr Leu Leu Pro Ala Ala Pro Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Thr Ala Ser Ala Ala Leu Ala Ser Leu Val Gly Gly Ala
435 440 445
Thr Ala Thr Leu Thr Ala Leu Pro Ala Leu Ser Ala Leu Leu Pro Pro
450 455 460
Gly Ala Ala Ile Ser Thr Gly Ile Thr Gly Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Ala Gly Val Gly Gly Pro Ala Cys Thr Pro Pro Leu Gly Ser Thr Gly
485 490 495
Pro Gly Pro Thr Ala Gly Val Gly Thr Gly Pro Thr Ala Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Pro Gly Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Leu
515 520 525
Leu Ser Thr Ala Leu Val Leu Ala Leu Cys Val Ala Pro Ala Pro Ala
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Gly Ser Ala Leu Leu Pro Leu
545 550 555 560
Pro Pro Gly Gly Pro Gly Ala Ala Ile Ala Ala Thr Thr Ala Ala Val
565 570 575
Ala Ala Pro Gly Thr Leu Gly Ile Leu Ala Ile Thr Pro Cys Ser Pro
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Ala Thr Ser Ala Gly Val
595 600 605
Ala Val Leu Thr Gly Ala Val Ala Cys Thr Gly Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Ala Gly Leu Thr Pro Thr Thr Ala Val Thr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Ala Val Pro Gly Thr Ala Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Gly His Val
645 650 655
Ala Ala Ser Thr Gly Cys Ala Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Thr Gly Thr Gly Thr Ala Ser Pro Ala Ala Ala Ala Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gly Ser Ile Ile Ala Thr Thr Met Ser Leu Gly Ala Gly Ala Ser
690 695 700
Val Ala Thr Ser Ala Ala Ser Ile Ala Ile Pro Thr Ala Pro Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Gly Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Leu Thr Ser Val
725 730 735
Ala Cys Thr Met Thr Ile Cys Gly Ala Ser Thr Gly Cys Ser Ala Leu
740 745 750
Leu Leu Gly Thr Gly Ser Pro Cys Thr Gly Leu Ala Ala Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Gly Gly Ala Leu Ala Thr Gly Gly Val Pro Ala Gly
770 775 780
Val Leu Gly Ile Thr Leu Thr Pro Pro Ile Leu Ala Pro Gly Gly Pro
785 790 795 800
Ala Pro Ser Gly Ile Leu Pro Ala Pro Ser Leu Pro Ser Leu Ala Ser
805 810 815
Pro Ile Gly Ala Leu Leu Pro Ala Leu Val Thr Leu Ala Ala Ala Gly
820 825 830
Pro Ile Leu Gly Thr Gly Ala Cys Leu Gly Ala Ile Ala Ala Ala Ala
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gly Leu Pro Ala Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Ala Gly Met Ile Ala Gly Thr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Thr Thr Pro Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gly Ile
885 890 895
Pro Pro Ala Met Gly Met Ala Thr Ala Pro Ala Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gly Ala Val Leu Thr Gly Ala Gly Leu Leu Ile Ala Ala Gly Pro Ala
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Leu Ile Gly Ala Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Leu Leu Gly Ala Val Val Ala Gly Ala Ala Gly Ala Leu Ala
945 950 955 960
Thr Leu Val Leu Gly Leu Ser Ser Ala Pro Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Ala Ala Ile Leu Ser Ala Leu Ala Leu Val Gly Ala Gly Val Gly
980 985 990
Ile Ala Ala Leu Ile Thr Gly Ala Leu Gly Ser Leu Gly Thr Thr Val
995 1000 1005
Thr Gly Gly Leu Ile Ala Ala Ala Gly Ile Ala Ala Ser Ala Ala Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Thr Leu Met Ser Gly Cys Val Leu Gly Gly Ser Leu Ala Val
1025 1030 1035 1040
Ala Pro Cys Gly Leu Gly Thr His Leu Met Ser Pro Pro Gly Ser Ala
1045 1050 1055
Pro His Gly Val Val Pro Leu His Val Thr Thr Val Pro Ala Gly Gly
1060 1065 1070
Leu Ala Pro Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Ala Gly Leu Ala His
1075 1080 1085
Pro Pro Ala Gly Gly Val Pro Val Ser Ala Gly Thr His Thr Pro Val
1090 1095 1100
Thr Gly Ala Ala Pro Thr Gly Pro Gly Ile Ile Thr Thr Ala Ala Thr
1105 1110 1115 1120
Pro Val Ser Gly Ala Cys Ala Val Val Ile Gly Ile Val Ala Ala Thr
1125 1130 1135
Val Thr Ala Pro Leu Gly Pro Gly Leu Ala Ser Pro Leu Gly Gly Leu
1140 1145 1150
Ala Leu Thr Pro Leu Ala His Thr Ser Pro Ala Val Ala Leu Gly Ala
1155 1160 1165
Ile Ser Gly Ile Ala Ala Ser Val Val Ala Ile Gly Leu Gly Ile Ala
1170 1175 1180
Ala Leu Ala Gly Val Ala Leu Ala Leu Ala Gly Ser Leu Ile Ala Leu
1185 1190 1195 1200
Gly Gly Leu Gly Leu Thr Gly Gly Thr Ile Leu Thr Pro Thr Thr Ile
1205 1210 1215
Thr Leu Gly Pro Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
1220 1225 1230
Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Leu Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Leu Pro Ala Gly Ala Ala Ser Gly Pro Val
1250 1255 1260
Leu Leu Gly Val Leu Leu His Thr Thr
1265 1270

Claims (8)

1.一种重组新型冠状病毒COVID-19 S蛋白的制备方法，其特征在于：
该方法包括如下步骤：
(1)将经过密码子优化的COVID-19 S蛋白的核苷酸序列构建入酵母细胞诱导表达载体中；
(2)转入酵母细胞进行培养后诱导表达；
(3)纯化，从而获得所述重组COVID-19 S蛋白；
其中，所述经过密码子优化的COVID-19 S蛋白的核苷酸序列是如SEQ ID NO：3所示的序列，其是通过COVID-19 S蛋白的核苷酸序列(即SEQ ID NO：2所示的序列)经密码子优化设计得到；
所述酵母细胞是甲醇营养型酵母细胞。
2.根据权利要求1所述重组新型冠状病毒COVID-19 S蛋白的制备方法，其特征在于：
所述经过密码子优化的COVID-19 S蛋白的氨基酸序列是如SEQ ID NO：1所示的序列。
3.根据权利要求1所述重组新型冠状病毒COVID-19 S蛋白的制备方法，其特征在于：
所述酵母细胞是毕赤酵母细胞(即Pichia pastoris细胞)；
优选的，所述酵母细胞是GS115细胞。
4.根据权利要求1所述重组新型冠状病毒COVID-19S蛋白的制备方法，其特征在于：
所述酵母细胞诱导表达载体是分泌表达载体；
优选的，所述酵母细胞诱导表达载体是毕赤酵母表达载体，其所用的启动子为AOX1启动子；
进一步优选的，所述酵母细胞诱导表达载体是pPIC9表达载体，其过程是载体转染入毕赤酵母细胞(Pichia pastoris细胞)后与酵母染色体重组整合入酵母染色体中。
5.根据权利要求1所述重组新型冠状病毒COVID-19 S蛋白的制备方法，其特征在于：
在步骤(2)中，所述酵母细胞培养所用的培养基不含任何动物或人来源的物质；
优选的，所述酵母细胞培养的培养基为酵母提取物、甘油、甲醇和含氮盐类中的一种；
进一步优选的，所述酵母细胞培养的培养基为甲醇。
6.根据权利要求1所述重组新型冠状病毒COVID-19 S蛋白的制备方法，其特征在于：
在步骤(3)中，所述纯化方法为细胞培养上清通过离子交换层析柱层析方法将所述重组COVID-19 S蛋白以单体形式分离。
7.一种重组新型冠状病毒COVID-19 S蛋白，其特征在于包含由权利要求1-6中任一项所述方法制备的重组新型冠状病毒COVID-19 S蛋白。
8.如权利要求7所述的重组新型冠状病毒COVID-19 S蛋白的用途，其特征在于：该重组COVID-19 S蛋白可作为一个主要诊断试剂成分，用于诊断COVID-19感染病人的IgM和IgG，也可成为COVID-19病毒的亚单位疫苗，用于预防COVID-19病毒的流行。
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