CN101509012B - 重组羧肽酶g2表达载体及制备重组羧肽酶g2的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了重组羧肽酶G2表达载体及制备重组羧肽酶G2的方法，该重组羧肽酶G2表达载体包含羧肽酶G2基因片段和表达载体，其中表达载体为PET-30a-c(+)。本发明还提供上述重组羧肽酶G2表达载体的构建方法以及包含该重组羧肽酶G2表达载体的表达系统，以及利用该表达系统制备重组羧肽酶G2的方法。本发明所述的重组羧肽酶G2表达系统产物具有天然结构和生物活性，无需变性和复性；培养基简单、价廉，生产成本低，产率高等优点。

Description

重组羧肽酶G2表达载体及制备重组羧肽酶G2的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及新的表达羧肽酶G2的重组表达载体，及其大肠杆菌表达宿主。本发明还涉及利用该大肠杆菌表达系统制备重组羧肽酶G2的方法。

背景技术

羧肽酶G2(Carboxypeptidase G2，简称CPG2)是羧肽酶G家族成员之一，最初是从假单胞菌属菌株RS-16中分离得到的一种细菌酶(Levy&Goldman 1967)。羧肽酶G家族酶可水解叶酸C端谷氨酸残基、叶酸的聚谷氨酰衍生物、叶酸类似物，例如氨甲喋呤(MTX)、以及叶酸的亚片段如对氨基苯甲酰谷氨酸(Chabneret al.1972；Goldman 1975；Kalghatgl & Bertino 1981)。CPG2在物理特性与动力学特征上与羧肽酶G家族另一成员羧肽酶G1(CPG1)类似，但对MTX的亲和力要高于CPG1。

合成的叶酸类似物MTX自1948年已用于临床(Bleyer 1978)，是用于治疗肿瘤的多种化疗药物的重要成分。MTX及其活性代谢产物的细胞毒性效应均是通过抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)而导致DNA合成、修复和细胞复制的抑制。增值活跃的组织如恶性癌细胞通常对这种MTX的干扰更为敏感。此外，MTX具有免疫调节效应，可用于如类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)和牛皮癣的治疗。高剂量MTX通常以长时间输注的方式给药，经常用于治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)以及软组织肿瘤。在对肿瘤细胞产生毒性的同时，以剂量和时间依赖的方式对健康细胞产生毒性。另外，MTX会诱导肾小管阻塞进而引起肾功能障碍而导致患者死亡(Kintzel 2001；Condit 1969)。

由于MTX毒性的致命性后果，在MTX治疗方案中通常包括解救措施。如亚叶酸拯救，但是在高浓度MTX时，亚叶酸钙很难阻止全身毒性的产生(Coldman 1975；Pinedo 1976)；MTX由亚叶酸钙逆转是竞争性的，当MTX浓度升高时需要更高的浓度，当MTX浓度达到100uM时，即使高10倍的亚叶酸钙(1000uM)也很难保护骨髓细胞不受毒性影响(Pinedo 1976)。另外就是通过水合和碱化的方式增强MTX的水溶性来降低MTX肾毒性，可以将毒性影响范围降低到1.5％，但是仍有可能发生因MTX清除延长而导致全身毒性。而CPG2是目前被证明用于MTX大剂量治疗最有效的解救药，CPG2可以特异迅速裂解MTX为谷氨酸和2，4-二氨基-N10-甲基蝶酸(DAMPA)，且不透过血-脑屏障(BBB)，即使BBB的通透性异常时也不透过该细胞膜，因而不会抵消细胞内MTX的作用。CPG2作为MTX治疗解救药国外已完成III期临床，将发展成为替代亚叶酸作为大剂量应用MTX的最有效解救途径。

CPG2还被用于抗体导向酶-前药疗法(ADEPT)。ADEPT利用抗体作为载体携带前药的专一性活化酶，选择性地结合于肿瘤部位，使前药可以区域特异性地在肿瘤组织内转化为活性细胞毒分子，起到专一杀伤肿瘤的作用(Bagshawe1989)。目前用于ADEPT系统活化酶大多数尚处于早期研究阶段，只有CPG2已用于临床研究阶段。最初合成的前药是苯甲酸氮芥的谷氨酰胺衍生物，被活化酶CPG2羧化为活性的苯甲酸氮芥，两者活性差异在100倍以上。后来的研究用活性更强的2-甲磺酰胺来取代一个或两个氯乙基，单2-甲磺酰胺复合物(MMC1)比双2-甲磺酰胺复合物毒性更强，与活化酶选择性更强(Springer 1990)。

CPG2还应用于基因导向性酶前体药物疗法(GDEPT)。目前GDEPT的研究已成为肿瘤防治研究中的一个活跃领域，被广泛应用于各种肿瘤的治疗研究亦称自杀基因疗法(suicide gene therapy)，成为肿瘤生物治疗最引人注目的研究领域。GDEPT的治疗机制很简单，即将非哺乳类动物的基因特异转导入肿瘤细胞，当它在肿瘤细胞中表达时可将全身给药的无毒性或毒性极低的药物前体转变成毒性代谢产物，在肿瘤局部杀伤肿瘤细胞，避免了全身或局部直接给药的副作用。CPG2具有将氮芥类前药活化成细胞毒性药物的功能，这在ADEPT疗法中已得到验证，让CPG2基因在肿瘤细胞靶向表达，就可以使系统给药的前药在肿瘤细胞位置特异活化成毒性物质，实现特异杀伤肿瘤细胞，而对成正常细胞无害，GDEPT是ADEPT疗法进一步发展(Douglas et al.2007；Schepelmann etal.2005)。

CPG2全序列为415个氨基酸，其中包含一个25氨基酸的信号肽序列和390氨基酸的成熟蛋白序列。CPG2活性分子为同源二聚体，分子量83000-84000道尔顿，活性需Zn²⁺，每个单体分子包含4个Zn²⁺。最初CPG2的制备是从原始菌株假单胞菌RS-16发酵而来，但表达量仅为200-300U/L，且CPG2表达量低于可溶蛋白的0.1％，远远不能满足研究开发的需要(Sherwood et al.1985)。因此，用基因工程的方法生产重组羧肽酶G2(rCPG2)是唯一的选择。

利用基因工程技术，以微生物为载体，生产外援蛋白具有广阔的应用前景。到目前为止，已发展多种蛋白表达系统。大肠杆菌表达系统是研究得最清楚的一套原核表达系统：(1)遗传背景和生化特性研究的很透彻，易于控制和操作，是应用最成熟和广泛的一套表达系统；(2)生长迅速、周期短、营养需求简单及表达量大；(3)但是缺少翻译后加工过程，对以表达一些高级结构复杂、需要糖基化的蛋白无能为力，且往往以包涵体形式表达，复性难度大。酵母作为一种简单的单细胞真核生物，兼有原核生物和真核生物的某些特点：(1)酵母是单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度快，能耐受较高的流体静压，表达基因工程产品时，可以大规模发酵培养，有效降低生产成本；(2)酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，具有一定程度的折叠加工和糖基化修饰，特别适合于稳定表达真核生物基因和制备有功能的重组蛋白；(3)酵母表达系统具有分泌表达功能，能将表达的外源蛋白分泌到胞外，使纯化简便；(4)但是对于不同的蛋白，在酵母系统中表达量差别很大，往往成为一个瓶颈问题。哺乳动物细胞表达系统是近年发展起来的高级表达系统，应用比较成熟的是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cell，CHO)表达系统：(1)准确的转录后修饰功能，表达的糖基化蛋白药物分子在结构、理化特性和生物学功能方面接近天然蛋白分子；(2)胞外分泌表达，CHO属于成纤维细胞，很少分泌内源蛋白，便于纯化；(3)贴壁生长，有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可进行悬浮培养或在无血清培养基中高密度培养，体积可以达到1000L以上；(4)但是重组CHO细胞生产效率低，表达产物浓度低，某些糖基化产物不稳定，使纯化难度增大；表达周期长，重组细胞培养费用昂贵，使得成本增加。

不同的基因重组表达系统具有特定的优缺点，只有根据目标蛋白本身的特点来选择最适宜的表达系统。CPG2是来源于细菌的蛋白，分子没有糖基化，也没有二硫键，用原核表达系统是首选。近年来，随着分子生物学的飞速发展，CPG2基因已被克隆，并用基因工程的方法表达重组CPG2(Minton et al.1983；Minton et al.1984)。CPG2的重组在国外已研究多年，但是在原核系统中表达量最高只能占可溶蛋白的20％左右(Chanbers et al.1988；Lancaster et al.1989；Minton et al.1983)。CPG2作为药用开发研究已越来越广泛，CPG2必须已以二聚体形式存在才具有完全的生物学活性。因此在大肠杆菌中以可溶形式表达CPG2，自发形成同源二聚体；在保持生物学活性的同时，提高表达量，是大肠杆菌表达rCPG2进行药用开发研究必须考虑的因素。

发明内容

本发明的目的在于本发明提供了新的含有重组羧肽酶G2的表达载体及其转化的大肠杆菌表达系统(也称为表达宿主)。

本发明的另一目的在于提供利用本发明的表达系统制备重组羧肽酶G2的方法。

本发明所述的重组羧肽酶G2表达载体，包含羧肽酶G2基因片段和表达载体，该表达载体优选为PET-30a-c(+)。

本发明还提供上述的重组羧肽酶G2表达载体的构建方法，主要包含步骤：

1)合成羧肽酶G2基因；

2)合成PCR引物SEQ ID NO：1-2，以步骤1)合成的羧肽酶G2基因为模板进行PCR扩增，得PCR产物；

3)将步骤2)所得PCR产物酶切后，与表达载体PET-30a-c(+)连接，即构建得到重组羧肽酶G2表达载体。

其中步骤3)所述构建得到的重组羧肽酶G2表达载体为PET30-CPG2重组表达载体。

本发明的优选实施例中，上述PET30-CPG2重组表达载体将羧肽酶G2成熟蛋白编码序列通过多克隆位点，例如BglII/NotI位点连接入PET-30a-c(+)载体构建而成。

根据本发明所述的方法，上述羧肽酶G2成熟蛋白N端氨基酸序列为QKRDNVL-。

本发明还提供一种重组羧肽酶G2表达系统，其由上述的重组羧肽酶G2表达载体转化大肠杆菌宿主构建而成。

本发明的优选实施例中，上述大肠杆菌宿主为BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS。

本发明的优选实施例中，上述重组羧肽酶G2表达系统可以为PET30-CPG2/BL21(DE3)或PET30-CPG2/BL21(DE3)pLysS。

本发明还提供上述的重组羧肽酶G2表达载体表达重组羧肽酶G2的方法，其主要包含步骤：

a)按照上述重组羧肽酶G2表达载体的构建方法构建重组羧肽酶G2表达载体；

b)将步骤a)所得的重组羧肽酶G2表达载体转化大肠杆菌宿主，得重组羧肽酶G2大肠杆菌表达系统；

c)培养步骤b)所得重组羧肽酶G2大肠杆菌表达系统，获得重组羧肽酶G2。

d)提取、纯化步骤c)所得的重组羧肽酶G2。

本发明构建的含有CPG2的质粒表达载体PET30-CPG2，是在CPG2成熟蛋白N端引入肠激酶切割位点(-DDDKQKRD-)，以便纯化时将融合部分去除；插入PET-30a-c(+)载体BglII、NotI位点，保证阅读框正确，这样N端融合了载体上自身携带的His·Tag和S·Tag，在增加可溶表达量的同时，利于后续纯化。此表达载体表达的rCPG2与天然的CPG2具有相同的N端序列。

大肠杆菌表达系统优势就是能大量表达所需要的目标蛋白，但往往易形成包涵体表达，包涵体复性困难，且复性后很难得到具有天然活性的蛋白，同时增加成本。本发明针对大肠杆菌表达系统设计的表达载体，构建了表达CPG2的大肠杆菌表达系统，不仅可以高效可溶地表达目标蛋白，而且表达产物具有天然蛋白结构和天然活性。大肠杆菌培养体系经济、简便、生长周期短，高密度发酵一般可到达600克湿重/L培养液，可提高产率，降低生产成本，适合于大规模的工业化生产。

本发明提供了一种用大肠杆菌可溶表达具有天然蛋白结构和生物活性的rCPG2的新的表达系统，该表达系统具有以下优点：

①表达系统构建简单，容易实现；

②表达产率高；

③产物以可溶方式表达，具有天然结构和生物活性，无需变性和复性；

④培养基简单、低廉；

⑤产物收率高，生产成本低。

上述优势使本发明具有明显的技术创新性与工艺先进性，适合于工业化生产重组羧肽酶G2。按照本发明的表达系统和方法，CPG2表达量不低于可溶蛋白的30％，最终得率为500mg/L，可以制备纯度大于98％，生物比活性高于400U/mg蛋白的重组CPG2。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处说描述的具体实施例仅仅以解释本发明，并不用于限定本发明。

附图说明

图1为本发明构建的表达质粒PET30-CPG2的结构图；

图2为本发明获得的CPG2的cDNA序列测定结果及对应的氨基酸序列，☆表示终止密码子；

图3为CPG2纯化后的SDS-PAGE图。泳道1是蛋白Marker，泳道2是表达系统PET30-CPG2/BL21(DE3)表达的rCGP2纯化后样品，泳道3是表达系统PET30-CPG2/BL21(DE3)pLysS表达的rCPG2纯化后样品；

图4为CPG2纯化后的天然PAGE电泳图。泳道1、2是表达系统PET30-CPG2/BL21(DE3)表达的rCGP2纯化后样品，泳道4、5是表达系统PET30-CPG2/BL21(DE3)pLysS表达的rCPG2纯化后样品，泳道3是BSA对照；

图5为表达系统PET30-CPG2/BL21(DE3)表达的rCGP2纯化后样品的HPLC分析图谱，目的蛋白峰保留时间为16.209min；

图6为表达系统PET30-CPG2/BL21(DE3)pLysS表达的rCPG2纯化后样品HPLC分析图谱，目的蛋白峰保留时间为16.222min。

具体实施方式

总技术方案：

根据本方面的一方面，含有重组羧肽酶G2的质粒表达载体PET30-CPG2具有如图1所示结构，是将CPG2成熟蛋白基因序列插入PET-30a-c(+)载体中构建而成。其中PET-30a-c(+)是可购买的商业化载体，多克隆位点含有单一的BglII和NotI酶切位点。将CPG2成熟蛋白基因序列插入BglII和NotI酶切位点之间，并在蛋白N端引入肠激酶切割位点(DDDDK-)，进行融合表达，在胞内获得可溶且具有高生物活性的rCPG2。

根据本发明的另一方面，提供含有本发明的质粒载体的大肠杆菌表达宿主，将本发明构建的表达载体PET30-CPG2转化大肠杆菌即可获得本发明的表达CPG2的大肠杆菌表达系统。适用于PET载体的商业化宿主菌有多种，本发明选用BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS作为优选的宿主菌。

根据本发明的再一方面，提供制备rCPG2的方法，包括下述步骤：

1)将编码CPG2成熟蛋白的基因可操作地连接于表达载体PET-30a-c(+)，构建表达CPG2的重组表达载体；

2)用所述重组表达载体转化大肠杆菌宿主菌，构建表达CPG2的大肠杆菌表达系统；

3)培养所述的大肠杆菌表达系统，获得rCPG2。

其中，所述步骤1)包含下述步骤：

1.1)根据GenBnak中登录的CPG2基因序列(登录号：M12599)进行全基因合成；

1.2)将表达载体PET-30a-c(+)用BglII/NotI进行双酶切，回收纯化备用；

1.3)合成下述引物：依次为SEQ ID NO：1-2

引物1：

5’＞TGAAGATCTGGACGACGACGACAAGCAGAAGCGCGACAACGTG＜3’

引物2：

5’＞ATAGTTTAGCGGCCGCTCACTTACCTGCACCCAGATC＜3’

以步骤1.1)中合成的CPG2基因为模板，用引物1和引物2进行PCR扩增，产物纯化后用BglII/NotI双酶切，电泳分离，切胶回收酶切基因片段，与步骤1.2)BglII/NotI双酶切载体连接，转化DH5α，测序验证，构建CPG2融合表达载体PET30-CPG2。

上述步骤2)中包含下述步骤：

2.1)提取纯化步骤1)中构建的表达载体PET30-CPG2；

2.2)将融合表达载体PET30-CPG2分别转化大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS，依次得到工程菌PET30-CPG2/BL21(DE3)和PET30-CPG2/BL21(DE3)pLysS。

上述步骤3)中包含下述步骤：

3.1)培养2.3)中构建的大肠杆菌表达系统工程菌株PET30-CPG2/BL21(DE3)和PET30-CPG2/BL21(DE3)pLysS；

3.2)从宿主胞质中提取、纯化rCPG2。

本发明所用的试验材料如无特别说明均为市售购买产品，各种试剂和培养基的成分和配制方法可以参见常规试验手册中的描述。

实施例1重组羧肽酶G2大肠杆菌表达载体的构建

1.基因合成

根据GenBnak中登录的CPG2基因序列(登录号：M12599)进行全基因合成(上海生工完成)，序列见图2。

2.PET30-CPG2表达载体构建

2.1PCR扩增

以合成CPG2基因为模板，用引物1和引物2，高保真Taq酶进行PCR扩增。引物1引入BglII酶切位点和肠激酶切割位点，引物2引入NotI酶切位点。PCR扩增参数为：94℃预变性5分钟，然后经过35个循环(94℃30秒，50℃30秒，72℃1.5分钟)，72℃延伸10分钟结束反应。

引物1：

5’＞TGAAGATCTGGACGACGACGACAAGCAGAAGCGCGACAACGTG＜3

’   BglII DDDDK肠激酶位点

引物2：

5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTCACTTACCTGCACCCAGATC_-3’

NotI

2.2基因及载体的酶切

PCR产物用PCR产物纯化试剂盒纯化后，用BglII/NotI双酶切，同时将PET-30a-c(+)载体用BglII/NotI双酶切。在1×TAE配制的1.2％琼脂糖凝胶上电泳，目标带分离较好时，用刀片将目标带所在的胶块切下，尽量切去多余的胶，放在干净的1.5ml eppendorf管中。用凝胶回收试剂盒回收纯化基因及载体。

2.3连接及转化

将切胶回收的经过BglII/NotI双酶切的基因及载体，用T4DNA连接酶16℃连接过夜。连接产物转化DH5α感受态，筛选转化菌株，并进行测序验证，构建得到表达载体PET30-CPG2，具体结构见图1，保存于DH5α菌株中，命名为：PET30-CPG2/DH5α。

实施例2重组羧肽酶G2大肠杆菌表达工程菌株的构建

1.BL21(DE3)及BL21(DE3)pLysS感受态细胞制备

采用氯化钙法制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，其方法如下：

挑取BL21(DE3)单菌落于25ml LB液体培养基中，37℃，250r/min过夜培养；第二天取1ml过夜培养液接种于100ml LB中，37℃，250r/min培养至OD₆₀₀为0.375左右，约2.5小时；将培养液分装到预冷无菌的聚丙烯管中，于冰上放置5-10分钟，然后于4℃，2000r/min离心7分钟；弃上清，用10ml冰冷的CaCl₂溶液重悬菌体沉淀，4℃，1600r/min离心5分钟；弃上清，用10ml冰冷的CaCl₂溶液重悬菌体沉淀，冰上放置过夜，让菌体自然沉降备用。

BL21(DE3)pLysS感受态制备方法同BL21(DE3)。

2.质粒PET30-CPG2的制备

接种PET30-CPG2/DH5α菌株到20mlLB液体(含卡那霉素50ug/mL)，37℃，250rpm培养过夜。收集3mL菌体，用质粒纯化试剂盒制备质粒。

3.工程菌构建

将制备的BL21(DE3)感受态细胞，次日用移液器将大部分上清去掉，剩下约1ml溶液，轻轻混匀，取100μl新鲜制备的感受态细胞到1.5ml离心管中，加入1μl制备的PET30-CPG2质粒，轻混匀，冰上放置30分钟。然后在42℃水浴中热休克90秒，立即放于冰上2分钟，加入800μl室温液体LB培养基于37℃，150r/min培养1.5小时。取50-200μl菌液涂布LB平板(含卡那霉素50ug/mL)，37℃培养16-20小时h。挑取单菌落PCR验证，构建得到大肠杆菌表达工程菌株PET30-CPG2/BL21(DE3)。

大肠杆菌表达系统PET30-CPG2/BL21(DE3)pLysS的构建方法同PET30-proCPG2/BL21(DE3)。

实施例3重组羧肽酶G2的表达及纯化

挑取工程菌PET30-CPG2/BL21(DE3)接种到20ml LB(Kan 50ug/mL)液体培养基中，37℃，250rpm，过夜培养。次日，按1％的比例接种母液到200ml LB(Kan50ug/mL)液体培养基，在1L的锥形瓶中，37℃，250rpm培养，到OD₆₀₀达到0.6后，加入100mM的IPTG至终浓度为0.4mM，30℃继续诱导表达2-3小时。将摇瓶置于冰上5分钟，5000g，4℃，离心5分钟收集菌体。

发酵液菌体按1∶5(w/w)悬浮于裂解液(20mM Tirs-HCl，0.2mM Zn²⁺，pH8.0)中，超声破壁，8,000rpm离心5min收集上清；将此破菌液上清上样于经0.2M NiSO4处理并以20mM Tris-HCl(pH8.0)平衡的Ni²⁺-Chelating Sepharose FastFlow(GE Healthcare)螯合层析介质，分别以50mM和100mM咪唑(含20mMTris-HCl，pH8.0)洗脱，目的蛋白集中于100mM咪唑洗脱部分；收集的目的蛋白以截留分子量10kDa离心超滤管超滤脱盐，置换缓冲为25mM Tris-HCl(含0.2mM Zn²⁺，pH8.0)，按每1mg蛋白加入0.5U肠激酶(50mM Tris-HCl，2mM CaCl2，0.1％Tween-20，pH8.0)在4℃条件下酶切融合蛋白约16h，融合蛋白酶切率达到约80％；此酶切目的蛋白上样于25mM，pH8.5Tirs-HCl，0.2mM Zn²⁺平衡的Q-Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)，用25mM，pH8.5Tris-HCl缓冲液再冲洗5-6个柱床体积后，用50mM Tris-HCl(pHS.0)洗脱杂蛋白，再以0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.2mM Zn²⁺一次性洗脱目的蛋白，收集洗脱蛋白峰。SDS-PAGE检测分子量约42kD，纯度大于95％。反相HPLC分析纯度大于98％。收集到的目的蛋白经检测具有催化MTX降解活性，比活力可达400U/mg。凝胶过滤HPLC及天然PAGE电泳分析rCPG2为天然的同源二聚体结构。

CPG2大肠杆菌表达工程菌株PET30-CPG2/BL21(DE3)pLysS的表达纯化方法同上。

具体结果请参照图3、图4、图5和图6。其中图3为CPG2纯化后的SDS-PAGE图，泳道1是蛋白Marker，泳道2是表达系统PET30-CPG2/BL21(DE3)表达的rCGP2纯化后样品，泳道3是表达系统PET30-CPG2/BL21(DE3)pLysS表达的rCPG2纯化后样品。图4为CPG2纯化后的天然PAGE电泳图，泳道1、2是表达系统PET30-CPG2/BL21(DE3)表达的rCGP2纯化后样品，泳道4、5是表达系统PET30-CPG2/BL21(DE3)pLysS表达的rCPG2纯化后样品，泳道3是BSA对照。图5为表达系统PET30-CPG2/BL21(DE3)表达的rCGP2纯化后样品的HPLC分析图谱，目的蛋白峰保留时间为16.209min，纯度大于98％。图6为表达系统PET30-CPG2/BL21(DE3)pLysS表达的rCPG2纯化后样品HPLC分析图谱，目的蛋白峰保留时间为16.222min，纯度大于98％。

实施例4CPG2酶活性测定

取2.82ml 0.1mol/L Tris-HCl，pH7.3，0.2mmol/L ZnCl₂，加入180μl 1mmol/L氨甲蝶呤(MTX，中国药品生物制品检定所)，即最终3ml反应体系中含：0.1mol/LTris-HCl，PH7.3，0.2mM Zn²⁺，0.06mM MTX。快速加入50μl标准品或待测样品(适当稀释，使其中含0.03-0.06U羧肽酶)，并混匀，倒入比色杯中，于320nm处测其吸光值，每间隔0.25min(即15s)检测一次。用蒸馏水调零。记录吸光值变化。以吸光值A对时间(min)作图，得线性曲线斜率，并按照下式计算活性：

$\mathrm{IU}/\mathrm{ml}=\frac{\mathrm{\ΔA}\×\mathrm{Vt}\×\mathrm{df}}{\mathrm{\ϵ}\×\mathrm{\Δt}\×\mathrm{Vs}}=-k\×7.349\×\mathrm{df}$

ΔA每分钟吸光值变化值

ε-摩尔吸光系数(L/mol·cm)，8300L/mol·cm＝8.3mL/μmol·cm

Vt-反应总体积(L)，3050μL

Δt-测定时间(min)

Vs-反应样品总体积(ml)，50μL

df-样品稀释倍数

k-吸光值变化曲线的斜率

注：加入反应体系中的酶量以1min吸光值变化在0.0204-0.0782之间为宜，否则重新稀释。

活性定义：一个活力单位定义为，37℃，pH7.3条件下，每分钟催化1.0μmol氨甲蝶呤水解所需要的酶量。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。

序列表

<110>重庆科润生物医药研发有限公司

<120>重组羧肽酶G2表达载体及采用该表达载体制备重组羧肽酶G2的方法

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>43

<212>DNA

<213>合成羧肽酶G2基因的PCR引物

<400>1

tgaagatctg gacgacgacg acaagcagaa gcgcgacaac gtg 43

<210>2

<211>37

<212>DNA

<213>合成羧肽酶G2基因的PCR引物

<400>2

atagtttagc ggccgctcac ttacctgcac ccagatc        37

Claims (7)

1.一种重组羧肽酶G2表达载体，其特征在于包含羧肽酶G2基因和表达载体，该表达载体为PET-30a-c(+)。

2.权利要求1所述的重组羧肽酶G2表达载体的构建方法，其特征在于包含步骤：

1)合成羧肽酶G2基因；

2)合成PCR引物SEQ ID NO：1-2，以步骤1)合成的羧肽酶G2基因为模板，进行PCR扩增，得PCR产物；

3)将步骤2)所得PCR产物酶切后，与表达载体PET-30a-c(+)连接，即构建得到重组羧肽酶G2表达载体。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤3)所述构建得到的重组羧肽酶G2表达载体为PET30-CPG2重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述PET30-CPG2重组表达载体将合成羧肽酶G2成熟蛋白编码序列通过多克隆位点连接入PET-30a-c(+)载体构建而成。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述羧肽酶G2成熟蛋白N端氨基酸序列为QKRDNVL-。

6.一种重组羧肽酶G2表达系统，其特征在于由权利要求1所述的重组羧肽酶G2表达载体转化大肠杆菌宿主构建而成，所述大肠杆菌宿主为BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS，所述重组羧肽酶G2表达系统为PET30-CPG2/BL21(DE3)或PET30-CPG2/BL21(DE3)pLysS。

7.采用权利要求1所述的重组羧肽酶G2表达载体表达重组羧肽酶G2的方法，其特征在于包含步骤：

a)按照权利要求2所述的方法构建重组羧肽酶G2表达载体；

b)将步骤a)所得的重组羧肽酶G2表达载体转化大肠杆菌宿主，得重组羧肽酶G2大肠杆菌表达系统；

c)培养步骤b)所得重组羧肽酶G2大肠杆菌表达系统，获得重组羧肽酶G2。

d)提取、纯化步骤c)所得的重组羧肽酶G2。

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