CN102482332B

CN102482332B - 用于获得肉毒杆菌神经毒素的方法和系统

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Publication number: CN102482332B
Application number: CN201080038953.7A
Authority: CN
Inventors: J·L·坦; H·A·帕特尔; R·C·贝茨; W·M·艾哈迈德
Original assignee: Allergan Inc
Current assignee: Allergan Inc
Priority date: 2009-07-13
Filing date: 2010-07-12
Publication date: 2016-08-03
Anticipated expiration: 2030-07-12
Also published as: CN106117325A; KR20190111161A; JP2017070291A; KR20150085140A; KR101784532B1; US11518986B2; PL2454275T3; CY1119519T1; EP2454275A1; US10465178B2; US20170327811A1; US20120156756A1; JP6704329B2; US20220251532A1; JP2012532932A; US8324349B2; US20120123095A1; DK2454275T3; KR102344985B1; EP4141024A1

Abstract

用于获得用于研究、治疗和美容用途的具有高效力、高产率的肉毒杆菌神经毒素的快速且不含动物蛋白质的色谱方法和系统。

Description

用于获得肉毒杆菌神经毒素的方法和系统

交叉参考

本申请要求2009年7月13日提交的美国专利申请第12/502,181号的权益，所述申请的全文以引用的方式并入本文。

背景

本发明涉及用于获得梭菌(Clostridial)神经毒素的系统和方法，用于由其制备药物组合物的方法，和如此制备的药物组合物的治疗和美容用途。具体来说，本发明涉及用于获得具有高效力、高纯度和高产率的生物活性肉毒杆菌(botulinum)神经毒素的快速且不含动物蛋白质的色谱方法和系统。

适于出于治疗、诊断、研究和美容目的施用于人或动物的药物组合物包含活性成分和一种或多种赋形剂、缓冲剂、载剂、稳定剂、张力调节剂、防腐剂和/或增积剂。药物组合物中的活性成分可以是生物制剂，如肉毒杆菌神经毒素。用于获得适用作药物组合物中的活性成分的肉毒杆菌神经毒素的已知方法(如尚茨法(Schantzmethod))是使用动物来源的蛋白质(如培养基和发酵培养基中所用的肉汤和酪蛋白)和动物来源的纯化酶的多周培养、发酵和纯化方法。将通过使用动物来源的产物制备的药物组合物施用至患者可能招致施用病原体或感染原(如朊病毒)的风险。另外，已知用于获得肉毒杆菌毒素的不含动物蛋白质的方法还是具有众多上游(培养和发酵)和下游(纯化)步骤的耗时过程(即，完成需要耗时超过一周)，并且仍然导致获得具有可检测得到的杂质的肉毒杆菌神经毒素。

肉毒杆菌毒素

梭菌属具有超过127种物种，根据形态学及功能分成若干群组。厌氧的革兰氏阳性细菌肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)产生一种有效的多肽神经毒素肉毒杆菌毒素(同义词“毒素”)，其在人和动物体内引起称为肉毒杆菌中毒的神经麻痹性疾病。肉毒杆菌毒素中毒的症状可以从行走、吞咽和说话困难发展为呼吸肌麻痹和死亡。

一个单位的肉毒杆菌毒素定义为向每只体重为约18-20克的雌性瑞士韦伯斯特小鼠(SwissWebstermice)腹膜内注射后的LD₅₀。一个单位的肉毒杆菌毒素是杀死一组雌性瑞士韦伯斯特小鼠中的50％的肉毒杆菌毒素的量。已经表征了7种大体在免疫学上不同的肉毒杆菌神经毒素，它们分别是肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C₁、D、E、F和G，各自通过用类型特异性抗体进行中和加以区分。肉毒杆菌毒素的不同血清型在其所影响的动物物种和其所引起的麻痹的严重程度和持续时间方面有所不同。肉毒杆菌毒素似乎以高亲和力结合胆碱能运动神经元，并且转移至神经元中并阻断乙酰胆碱的突触前释放。

肉毒杆菌毒素已在临床环境中用于治疗例如特征在于骨骼肌活性过高的神经肌肉病症。A型肉毒杆菌毒素已被美国食品药品管理局(U.S.FoodandDrugAdministration；FDA)批准用于治疗年龄超过12岁的患者的自发性眼睑痉挛、斜视和半面痉挛、颈部张力障碍、眉间纹(面部)皱纹和用于治疗多汗。FDA还批准了B型肉毒杆菌毒素用于治疗颈部张力障碍。

尽管所有的肉毒杆菌毒素血清型都明显抑制神经肌肉接点处神经递质乙酰胆碱的释放，但其是通过影响不同神经分泌蛋白和/或在不同位点裂解这些蛋白质来实施这种抑制。A型肉毒杆菌毒素是一种可以特异性水解细胞内囊泡关联蛋白(VAMP，也称为突触小泡蛋白(synaptobrevin))25千道尔顿(kDa)突触体关联蛋白(SNAP-25)的锌内肽酶。E型肉毒杆菌也裂解SNAP-25，但与A型肉毒杆菌毒素相比较，靶向此蛋白质内的不同氨基酸序列。B、D、F和G型肉毒杆菌毒素作用于VAMP，其中各血清型在不同位点裂解所述蛋白质。最后，C₁型肉毒杆菌毒素显示裂解突触融合蛋白(syntaxin)和SNAP-25两者。作用机制上的这些差异可能会影响各种肉毒杆菌毒素血清型作用的相对效力和/或持续时间。

来自肉毒杆菌毒素复合物的活性肉毒杆菌毒素蛋白分子(也称为“纯毒素”或“神经毒性组分”)的分子量对于所有七种已知的肉毒杆菌毒素血清型都是约150kDa。有趣的是，肉毒杆菌毒素由肉毒杆菌以包含神经毒性组分连同一个或多个关联非毒素蛋白的复合物形式释放。因此，肉毒杆菌可以产生900kDa、500kDa和300kDa形式(近似分子量)的A型肉毒杆菌毒素复合物。B型和C₁型肉毒杆菌毒素似乎仅产生为500kDa复合物。D型肉毒杆菌毒素产生为300kDa和500kDa复合物。最后，E型和F型肉毒杆菌毒素仅产生为约300kDa的复合物。复合物(即，分子量大于约150kDa)含有红血球凝集素(HA)蛋白和非毒素非红血球凝集素(NTNH)蛋白。因此，肉毒杆菌毒素复合物可以包含肉毒杆菌毒素分子(神经毒性组分)和一个或多个HA蛋白和/或NTNH蛋白。这两种类型的非毒素蛋白(其可以与肉毒杆菌毒素分子一起构成相关神经毒素复合物)可用于提供防止肉毒杆菌毒素分子变性的稳定性和毒素被摄入时对抗消化酸的保护。另外，有可能较大(大于约150kDa分子量)肉毒杆菌毒素复合物可以导致肉毒杆菌毒素从肌肉内注射肉毒杆菌毒素复合物的部位扩散开来的速率较慢。A型肉毒杆菌毒素治疗多种临床病状的成功导致了对其他肉毒杆菌血清型的关注。因此，至少A型、B型、E型和F型肉毒杆菌毒素已在临床上用于人。另外，神经毒性组分(即，没有关联的非毒素蛋白)的制剂在欧洲以商品名XEOMIN销售(MerzPharmaceuticals，Frankfurt，Germany)。

已知A型肉毒杆菌毒素在pH4-6.8下可溶于稀水溶液中。在pH值高于约7时，起稳定作用的非毒素蛋白从神经毒素解离，特别是随着pH值和温度升高，导致毒性逐渐降低(SchantzE.J.等人，PreparationandcharacterizationofbotulinumtoxintypeAforhumantreatment(特别是第44-45页)，作为Jankovic，J.等人，TherapywithBotulinumToxin，MarcelDekker，Inc，1994的第3章)。

与酶一样，肉毒杆菌毒素(它是细胞内的肽酶)通常至少部分取决于其三维构象。将毫克量的毒素稀释成每毫升含有若干纳克的溶液存在明显的困难，如毒素倾向于粘附于表面并因此减少可获得毒素的量。因为毒素可能在配制含毒素药物组合物的数月或数年后使用，所以用稳定剂(如白蛋白、蔗糖、海藻糖和/或明胶)使毒素稳定。

含肉毒杆菌毒素的市售药物组合物可以商标(A型肉毒杆菌毒素纯化的神经毒素复合物)从Allergan，Inc.(Irvine，California)购得。每100单位小瓶的由约5ng纯A型肉毒杆菌毒素复合物、0.5mg人血清白蛋白和0.9mg氯化钠组成，呈真空干燥形式并且意欲用不含防腐剂的无菌生理盐水(0.9％氯化钠注射液)复原。其它含肉毒杆菌毒素的市售药物组合物包括(肉毒杆菌毒素药物组合物中含A型肉毒梭菌毒素红血球凝集素复合物与人血清白蛋白和乳糖，可以粉末形式从IpsenLimited，Berkshire，U.K.获得，使用前用0.9％氯化钠复原)和MyoBloc^TM(包含B型肉毒杆菌毒素、人血清白蛋白、琥珀酸钠和氯化钠的注射溶液(约pH5.6)，可从SolsticeNeurosciences(SanDiego，California)获得)。神经毒性组分(150kDa毒素分子)和肉毒杆菌毒素复合物(300kDa至900kDa)可从以下来源获得：例如ListBiologicalLaboratories，Inc.，Campbell，California；theCentreforAppliedMicrobiologyandResearch，PortonDown，U.K.；Wako(Osaka，Japan)；以及SigmaChemicals(StLouis，Missouri)。

用于获得肉毒杆菌神经毒素的不含动物蛋白和/或色谱方法公开于美国专利7,445,914；7,452,697；7,354,740；7,160,699；7,148,041；和7,189,541中。以下美国专利申请中也有关注：2006年12月12日提交的11/609,449，名称为“MediaforClostridiumBacterium”；2008年4月7日提交的12/098,896，名称为“AnimalProductFreeMediaandProcessesforObtainingaBotulinumToxin”；2007年10月31日提交的11/932,689，名称为“ChromatographicMethodandSystemforPurifyingaBotulinumToxin”；2007年10月31日提交的11/932,789，名称为“ChromatographicMethodandSystemforPurifyingaBotulinumToxin”；和2008年9月19日提交的12/234,537，名称为“AnimalProductFreeMediaAndProcessesForObtainingABotulinumToxin”。

用于药物组合物中的肉毒杆菌毒素可以使用熟知的尚茨法，通过对肉毒梭菌进行厌氧发酵来获得(参见例如：SchantzE.J.等人，Propertiesanduseofbotulinumtoxinandothermicrobialneurotoxinsinmedicine，MicrobiolRev1992Mar；56(1)：80-99；SchantzE.J.等人，PreparationandcharacterizationofbotulinumtoxintypeAforhumantreatment，JankovicJ编著的NeurologicalDiseaseandTherapy.Therapywithbotulinumtoxin(1994)，NewYork，MarcelDekker；1994中的第3章，第41-49页；和SchantzE.J.等人，UseofcrystallinetypeAbotulinumtoxininmedicalresearch，LewisGEJr编著的BiomedicalAspectsofBotulism(1981)NewYork，AcademicPress，第143-50页)。用于获得肉毒杆菌毒素的尚茨法利用动物产物例如作为试剂以及培养物和发酵培养基的部分。

需要多个步骤来使梭菌毒素药物组合物适于出于治疗、诊断、研究或美容目的施用至人或动物。这些步骤可包括获得纯梭菌毒素并接着混配所述纯梭菌毒素。第一步骤可为在有助于厌氧菌生长的环境中，如在温暖厌氧氛围中，通常在血液琼脂平板上涂铺和培养梭菌菌落。此步骤允许获得具有所需形态和其它特征的梭菌菌落。在第二步骤中，可在第一适合培养基中发酵所选梭菌菌落，并且另外有必要时，在第二发酵培养基中进行发酵。经过一定时间的发酵后，梭菌通常溶解并将梭菌毒素释放至培养基中。第三，可纯化所述培养基以便获得毒素批料。获得毒素批料的培养基纯化一般使用动物来源的酶(如DNA酶和RNA酶，它们用来降解核酸和促进核酸的移除)和其它试剂进行。所得毒素批料可以是具有特定比活性的高纯度毒素。在适合缓冲液中稳定以后，可将所述毒素批料与一种或多种赋形剂混配以制造适合施用至人的梭菌毒素药物组合物。梭菌毒素药物组合物可以包含梭菌毒素作为活性药物成分(API)。药物组合物还可包括一种或多种赋形剂、缓冲剂、载剂、稳定剂、防腐剂和/或增积剂。

梭菌毒素发酵步骤可产生含有完整梭菌、溶解细菌、培养基营养物和发酵副产物的发酵培养基溶液。将此培养物溶液过滤以移除粗大成分，如完整和溶解细菌，将提供收集/澄清培养基。澄清培养基包含梭菌毒素和各种杂质，并且进行处理以获得称为毒素批料的浓缩梭菌毒素。

使用一种或多种动物来源的产物(如牛奶消化酪蛋白、DNA酶和RNA酶)获得梭菌毒素批料的发酵和纯化方法是已知的。用于获得肉毒杆菌毒素复合物的所述已知非不含动物产物(“NAPF”)方法的一个实施例是尚茨法和其修改形式。尚茨法(从最初的涂铺、细胞培养直到发酵和毒素纯化)利用多种从动物来源获得的产物，如培养瓶中的动物来源的细菌熟肉培养基(BactoCookedMeatmedium)、用于菌落生长和选择的哥伦比亚血液琼脂板(ColumbiaBloodAgarplates)，和发酵培养基中的酪蛋白。另外，尚茨毒素批料纯化方法利用来自牛来源的DNA酶和RNA酶来水解含毒素发酵培养基中所存在的核酸。人们已经表现出了对于当在用于获得API的方法和/或使用所述API制备(混配)药物组合物的方法中使用动物产物时，遭受病毒和传染性海绵状脑病(TSE)(如牛海绵状脑病(BSE))污染的可能性的担忧。

已知使用减少量的动物来源的产物获得破伤风类毒素的发酵方法(称为不含动物产物或“APF”发酵方法；APF涵盖不含动物蛋白质)，参见例如美国专利6,558,926。用于获得梭菌毒素的APF发酵方法具有减少接下来的毒素批料受病毒、朊病毒或其它不当成分污染的(已经很低的)可能性的潜在优势，所述不当成分接着可随着活性药物成分梭菌毒素被混配到用于施用至人的药物组合物中而伴随所述梭菌毒素。

可以使用例如色谱(如管柱色谱)在称为分级分离或纯化的过程中从蛋白质、核酸、细胞碎片等的混合物中分离特定蛋白质(如肉毒杆菌神经毒素)。蛋白质混合物一般通过含有例如固体(通常是多孔介质，常称为珠粒或树脂)的玻璃或塑胶管柱。不同蛋白质或其它化合物基于其特定化学特征和这些特征引起其与所用特定色谱介质相互作用的方式以不同速率通过基质。

介质的选择决定了蛋白质借以进行分级分离的化学特征的类型。存在四种管柱色谱的基本类型：离子交换、凝胶过滤、亲和力和疏水相互作用。离子交换色谱是基于表面静电电荷使用以带有正电荷或负电荷的小珠粒填充的管柱实现分级分离。在凝胶过滤色谱中，蛋白质是基于其大小进行分级分离。在亲和力色谱中，蛋白质是基于其与连接至管柱基质中的珠粒的特定化学基团(配基)结合的能力进行分离。配基对于靶蛋白可具有生物特异性。疏水相互作用色谱是基于表面疏水性实现分级分离。

纯化(分级分离)梭菌毒素的管柱色谱是熟知的。参见例如以下出版物：

1.OzutsumiK.等人，Rapid，simplifiedmethodforproductionandpurificationoftetanustoxin，App&EnvironMicro，1985年4月，第939-943页，第49卷，第4期(1985)公开使用高压液相色谱(HPLC)凝胶过滤来纯化破伤风类毒素。

2.SchmidtJ.J.等人，PurificationoftypeEbotulinumneurotoxinbyhigh-performanceionexchangechromatography，AnalBiochem1986年7月；156(1)：213-219公开使用尺寸排阻色谱或离子交换色谱来纯化E型肉毒杆菌毒素。还公开使用硫酸鱼精蛋白替代核糖核酸酶(RNA酶)。

3.SimpsonL.L.等人，IsolationandcharacterizationofthebotulinumneurotoxinsSimpsonLL；SchmidtJJ；MiddlebrookJL，HarsmanS编著MethodsinEnzymology.第165卷，MicrobialToxins：ToolsinEnzymologySanDiego，CA：AcademicPress；第165卷：第76-85页(1988)公开使用重力流色谱、HPLC、使用亲和力树脂的捕捉步骤、尺寸排阻色谱和离子(阴离子和阳离子)交换色谱(包括使用两种不同离子交换管柱)来纯化肉毒杆菌神经毒素。公开了各种Sephadex、Sephacel、Trisacryl、S和Q管柱。

4.ZhouL.等人，ExpressionandpurificationofthelightchainofbotulinumneurotoxinA：AsinglemutationabolishesitscleavageofSNAP-25andneurotoxicityafterreconstitutionwiththeheavychain，Biochemistry1995；34(46)：15175-81(1995)公开使用淀粉亲和力管柱来纯化肉毒杆菌神经毒素轻链融合蛋白。

5.KannanK.等人，MethodsdevelopmentforthebiochemicalassessmentofNeurobloc(botulinumtoxintypeB)，MovDisord2000；15(Suppl2)：20(2000)公开使用尺寸排阻色谱来测定B型肉毒杆菌毒素。

6.WangY-c，ThepreparationandqualityofbotulinumtoxintypeAforinjection(BTXA)anditsclinicaluse，DermatolLasFaciCosmSurg2002；58(2002)公开离子交换色谱来纯化A型肉毒杆菌毒素。此参考文献公开沉淀与色谱技术的组合。

7.JohnsonS.K.等人，Scale-upofthefermentationandpurificationoftherecombinationheavychainfragmentCofbotulinumneurotoxinserotypeF，expressedinPichiapastoris，ProteinExprandPurif2003；32：1-9(2003)公开使用离子交换和疏水相互作用管柱来纯化F型肉毒杆菌毒素的重组重链片段。

8.公布的美国专利申请20030008367A1(Oguma)公开使用离子交换和乳糖管柱来纯化肉毒杆菌毒素。

以上概述的纯化方法涉及小规模纯化肉毒杆菌毒素复合物的神经毒性组分(即，约150kDa神经毒性分子)或所述神经毒性组分的特定组分，而与纯化整个900kDa肉毒杆菌毒素复合物不同。

此外，用于获得适于混配到肉毒杆菌毒素药物组合物中的肉毒杆菌毒素的现有方法(包括工业规模方法)一般包括一系列沉淀步骤以分离毒素复合物与来自发酵过程的伴随肉毒杆菌毒素的杂质。显然，沉淀技术在生物医药工业中广泛用于纯化肉毒杆菌毒素。举例来说，使用冷醇分级分离(科恩法(Cohn’smethod))或沉淀来移除血浆蛋白质。不幸的是，先前用于纯化肉毒杆菌毒素的沉淀技术具有低解析度、低生产力、难以操作、难以控制和/或验证和/或难以进行规模的扩大或缩小的缺点。先前公布的美国专利申请No.11/452,570(2006年10月12日公布)公开各种不含动物蛋白质和NAPF方法中所利用的多个步骤，如离心、酸沉淀、乙醇沉淀、酸化步骤和硫酸铵沉淀(关于详细论述，请参见美国公开专利申请No.2006/0228780，其全文以引用的方式并入本文)。其中展示了用于获得肉毒杆菌神经毒素的非不含动物蛋白质方法与不含动物蛋白质方法之间的一些区别。

因此需要用于获得具有高纯度且高度有效的肉毒杆菌神经毒素的快速、规模相对较小但产率高的系统和方法，所述肉毒杆菌神经毒素可用于研究目的和/或制造药物组合物。

概述

本发明满足此需要并且提供可通过快速、规模较小、商业上适用、产率高且不含动物蛋白质的色谱系统和方法获得的高纯度且高度有效的肉毒杆菌神经毒素。所得肉毒杆菌神经毒素适用于制造药物组合物。通过实施本发明获得梭菌毒素优选为肉毒杆菌神经毒素并且最优选为约900kDa的A型肉毒杆菌神经毒素复合物或其中的150kDa神经毒性组分。本发明不需要NAPF试剂，如DNA酶和RNA酶。

定义

本文中使用的以下用词和术语具有以下定义。

“约”意谓所修饰的条目、参数或术语涵盖在所述条目、参数或术语的值上方和下方加上或减去百分之十的范围。

“施用(Administration/toadminister)”意谓对受试者给予(即，施用)药物组合物或活性成分的步骤。本文公开的药物组合物是通过例如肌肉内(i.m.)、皮内、皮下施用、鞘内施用、颅内、腹膜内(i.p.)施用、局部外表(透皮)和植入(即，植入缓慢释放装置，如聚合植入物或微型渗透泵)施用途径进行“局部施用”。

“不含动物产物”或“基本上不含动物产物”分别涵盖“不含动物蛋白质”或“基本上不含动物蛋白质”并且意谓不存在或基本上不存在血液来源的、血液汇集的和其它动物来源的产物或化合物。“动物”意谓哺乳动物(如人)、鸟、爬行动物、鱼、昆虫、蜘蛛或其它动物物种。“动物”不包括微生物，如细菌。因此，本发明范围内的APF培养基或方法或基本上APF培养基或方法可包括肉毒杆菌毒素或肉毒杆菌细菌。举例来说，APF方法或基本上APF方法意谓基本上不含或基本上不含或完全不含动物来源的蛋白质(如免疫球蛋白、肉消化产物、肉副产物和奶或乳制品或消化产物)的方法。

“肉毒杆菌毒素”或“肉毒杆菌神经毒素”意谓由肉毒梭菌产生的神经毒素，以及经过修饰的、重组的、杂交的和嵌合的肉毒杆菌毒素。重组肉毒杆菌毒素可具有由非梭菌物种重组制造的轻链和/或重链。如本文所用的“肉毒杆菌毒素”涵盖肉毒杆菌毒素血清型A、B、C、D、E、F和G。如本文所用的“肉毒杆菌毒素”还涵盖肉毒杆菌毒素复合物(即，300、600和900kDa复合物)以及纯肉毒杆菌毒素(即，约150kDa神经毒性分子)，它们均适用于实施本发明。“纯化的肉毒杆菌毒素”意谓与在由培养物或发酵过程获得肉毒杆菌毒素时可能伴随肉毒杆菌毒素的其它蛋白质和杂质分离或基本上分离的纯肉毒杆菌毒素或肉毒杆菌毒素复合物。因此，纯化的肉毒杆菌毒素可以有至少90％，优选大于95％，且最优选大于99％的非肉毒杆菌毒素蛋白质和杂质被移除。肉毒杆菌C₂和C₃细胞毒素(不是神经毒素)不包括在本发明的范围内。

“梭菌神经毒素”意谓由梭菌细菌(如肉毒梭菌、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)或巴氏梭菌(Clostridiumberatti))产生或所述梭菌细菌天然具有的神经毒素，以及由非梭菌物种重组制造的梭菌神经毒素。

“完全不含”(“由......组成”术语)意谓在所用仪器或方法的检测范围内，物质不能被检测到或不能确认其存在。

“基本上不含”(或“基本上由......组成”)意谓仅可以检测到微量物质。

“经过修饰的肉毒杆菌毒素”意谓与天然肉毒杆菌毒素相比，至少一个氨基酸被缺失、修饰或置换的肉毒杆菌毒素。另外，经过修饰的肉毒杆菌毒素可以是重组产生的神经毒素，或重组制造的神经毒素的衍生物或片段。修过修饰的肉毒杆菌毒素保留天然肉毒杆菌毒素的至少一种生物活性，如结合肉毒杆菌毒素受体的能力或抑制神经递质从神经元释放的能力。经过修饰的肉毒杆菌毒素的一个实施例是轻链是来自一种肉毒杆菌毒素血清型(如血清型A)而重链是来自一不同肉毒杆菌毒素血清型(如血清型B)的肉毒杆菌毒素。经过修饰的肉毒杆菌毒素的另一实施例是与神经递质(如物质P)偶合的肉毒杆菌毒素。

“药物组合物”意谓活性成分可以是肉毒杆菌毒素的制剂。用词“制剂“意谓在药物组合物中，除肉毒杆菌神经毒素活性成分外，还存在至少一种其它成分(如且不限于白蛋白[如人血清白蛋白或重组人白蛋白]和/或氯化钠)。因此药物组合物是适于在诊断、治疗或美容上施用(例如通过肌肉内或皮下注射或通过插入储集器或植入物)于受试者(如人患者)的制剂。药物组合物可以是：在冻干或真空干燥条件下是在用例如盐水或水复原冻干或真空干燥的药物组合物后形成的溶液；或者是不需要复原的溶液。活性成分可以是肉毒杆菌毒素血清型A、B、C₁、D、E、F或G或肉毒杆菌毒素之一，它们都可以由梭菌细菌天然产生。如所述，药物组合物可以是例如真空干燥的液体或固体。配制肉毒杆菌毒素活性成分药物组合物的示例性方法公开于2002年11月5日提交的公布的美国专利申请20030118598中，所述申请的全文以引用的方式并入本文。

“基本上不含”意谓在评估了物质(如动物产物、动物蛋白质或动物来源的产物或蛋白质)的重量百分比的培养基、发酵培养基、药物组合物或其它材料中，存在水平少于所述材料重量的百分之一。

“治疗制剂”意谓制剂可用于治疗并由此缓解病症或疾病和/或其相关症状，如特征在于周边肌肉或腺体(例如汗腺)机能亢进(例如痉挛状态)的病症或疾病。

“治疗有效量”意谓治疗疾病、病症或病状而不引起显著负面或不良副作用所需的药剂(如肉毒杆菌毒素或包含肉毒杆菌毒素的药物组合物)的水平、量或浓度。

“治疗(Treat/treating/treatment)”意谓减轻或减少(其包括部分减少、显著减少、接近完全减少和完全减少)、解决或预防(暂时性或永久性)疾病、病症或病状(如臀部畸形)，以便达成所要治疗或美容结果，如通过治愈损伤或损坏的组织，或通过改造、改变、增强、改良、改善和/或美化现有的或感觉到的疾病、病症或病状。治疗效果(如通过施用肉毒杆菌神经毒素获得的减轻效果)例如在向患者施用肉毒杆菌神经毒素后1天至7天之间在临床上可能不明显，并且取决于所治疗的病状和特定病例，可以具有约1个月至约1年或其间的任何时间范围的效果持续时间。

除非另外说明，否则百分比是基于每体积的重量。

APF意谓不含动物产物/蛋白质。

CV意谓管柱体积。

DF意谓渗滤。

ELISA意谓酶联免疫吸附测定。

如在“IAPF系统”或“IAPF方法”中的IAPF意谓“改良的不含动物蛋白质”的系统或方法。IAPF系统或方法包括使用两种色谱介质或三种色谱介质来纯化肉毒杆菌毒素或神经毒素组分，如本文所具体详细描述。色谱介质包括本领域中已知的色谱树脂。通过使用两种色谱介质获得的肉毒杆菌神经毒素批料在本文中称为IAPF。

如在“FAPF系统”或“FAPF方法”中的FAPF意谓“进一步改良的不含动物蛋白质”的系统或方法。因此，FAPF是IAPF方法，并且FAPF系统或方法意谓使用三种色谱介质来纯化肉毒杆菌毒素或神经毒素组分。通过使用三种色谱介质获得的肉毒杆菌神经毒素批料在本文中称为FAPF。

NAPF意谓非不含动物蛋白质。

SDS-PAGE意谓十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。

SEC-HPLC意谓尺寸排阻高效液相色谱。

UF意谓超滤。

在本发明的一个实施方案中，提供用于获得生物活性肉毒杆菌神经毒素的基本上APF色谱方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供基本上APF发酵培养基；(b)在所述发酵培养基中发酵肉毒梭菌细菌；和(c)通过使所述发酵培养基与阴离子交换色谱接触，接着使来自所述阴离子交换色谱介质的洗提液与阳离子交换色谱介质接触从所述发酵培养基回收生物活性肉毒杆菌神经毒素，由此从所述基本上APF色谱方法获得生物活性肉毒杆菌神经毒素。在具体实施方案中，所述方法可提供包含少于一个百万分率(ppm)残余核酸的肉毒杆菌神经毒素，即，每毫克所得肉毒杆菌神经毒素包含1纳克或更少的残余核酸。在另一方面，所述方法是在一周或短于一周内完成。

在一个实施例中，具有3∶1∶1比率的培养基意谓含有3％HySoy、1％HyYeast和1％葡萄糖的肉毒杆菌毒素培养/发酵培养基。HySoy(Quest产品编号5X59022)是通过对大豆进行酶促水解制造的肽源。HyYeast(HyYest，Quest产品编号5Z10102或5Z10313)是面包酵母提取物。在另一个实施例中，具有5∶1∶1比率的培养基意谓含有5％HySoy、1％HyYeast和1％葡萄糖的肉毒杆菌毒素培养/发酵培养基。

另一个实施方案提供用于获得生物活性A型肉毒杆菌神经毒素复合物的基本上APF色谱方法，所述方法按序包括以下步骤：在基本上APF培养基中培养基肉毒梭菌细菌；在约2L至约75L基本上APF发酵培养基中，更优选在约2L至约50L基本上APF发酵培养基中，甚至更优选在约2L至约30L基本上APF发酵培养基中发酵来自所述培养基的肉毒梭菌细菌(具体实施方案具有包括植物蛋白和/或植物蛋白衍生物(例如水解植物蛋白)的培养基和发酵培养基中的至少一者)；通过使用过滤或离心移除存在于发酵培养基中的细胞碎片收集发酵培养基；通过过滤，如通过超滤浓缩所收集的发酵培养基；通过添加缓冲液稀释所浓缩的发酵培养基。用缓冲液稀释后，进行第一接触步骤，其中使经过稀释的所收集发酵培养基与阴离子交换介质接触以便使生物活性肉毒杆菌神经毒素被阴离子交换介质捕捉；接着从所述阴离子交换介质洗提所捕捉的肉毒杆菌神经毒素，由此获得含有肉毒杆菌毒素的第一洗提液；进行第二接触步骤，其中使第一洗提液与阳离子交换介质接触以从第一洗提液移除杂质，由此获得含有肉毒杆菌毒素的第二洗提液；接着通过渗滤(DF)处理第二洗提液；和过滤处理过的第二洗提液，由此使用基本上APF色谱方法获得生物活性A型肉毒杆菌神经毒素复合物。所获得的A型肉毒杆菌神经毒素复合物可具有每毫克A型肉毒杆菌神经毒素复合物约2.0×10⁷个单位至约6.0×10⁷个单位的效力。在具体实施例中，可获得例如具有每毫克约2.4×10⁷个单位至每毫克约5.9×10⁷个单位之间的效力的A型肉毒杆菌神经毒素复合物。

在一个具体实施方案中，所述方法利用包含不超过约5％w/v植物来源的蛋白质产物、不超过约2％w/v酵母提取物和不超过约2％w/v葡萄糖的发酵培养基，并且其中在发酵步骤开始时发酵培养基的pH值水平为约6.5至约pH8.0，更优选为约pH6.8至约pH7.6。在一个具体实施方案中，进行培养步骤直至培养基在约540纳米(nm)下的光学密度在约0.8个吸光度单位(AU)与约4.5AU之间。优选通过将肉毒梭菌APF工作细胞库内含物引入培养基中起始培养步骤，其中所述工作细胞库内含物包含每毫升工作细胞库至少约1×10⁴个菌落形成单位，优选约1×10⁴个至约5×10⁷个菌落形成单位的肉毒梭菌，并且其中所述工作细胞库中的肉毒梭菌细菌具有基本上均一的形态。在另一实施方案中，发酵步骤进行约60小时至80小时并且直至发酵培养基在约890nm下的光学密度降至约0.05AU至约0.7AU之间。在一方面，通过基本上APF色谱方法获得的肉毒杆菌神经毒素包含少于1ppm残余核酸并且所述方法在一周或短于一周内完成。

在另一个实施方案中，提供用于获得生物活性肉毒杆菌神经毒素的利用色谱的APF方法，所述方法按序包括以下步骤：(a)将来自APF工作细胞库的肉毒梭菌细菌添加至APF培养基中；(b)在培养基中培养肉毒梭菌细菌；(c)在APF发酵培养基中发酵来自步骤(b)的肉毒梭菌细菌直至发生肉毒梭菌细胞溶解；(d)收集发酵培养物以提供收集的发酵培养基；(e)通过过滤对所收集的发酵培养基进行浓缩；(f)通过添加缓冲液稀释经过过滤的发酵培养基以获得经过稀释的发酵培养基；(g)第一接触步骤，其中使经过稀释的发酵培养基与捕获色谱介质接触，其中所述捕获色谱介质是阴离子交换介质；(h)第二接触步骤，其中使来自第一接触步骤的洗提液与精制色谱介质接触，其中所述精制色谱介质是阳离子交换介质；和(i)过滤来自第二接触步骤的洗提液，由此通过改良的APF方法获得生物活性肉毒杆菌神经毒素，其中所获得的肉毒杆菌神经毒素包含1ppm的残余核酸或少于1ppm的残余核酸并且所述方法在一周或短于一周内完成。

在一方面，提供用于获得生物活性肉毒杆菌神经毒素的基本上不含动物产物(APF)的色谱系统，所述系统包括基本上APF发酵培养基，用于在所述发酵培养基中发酵的肉毒梭菌细菌，用于从发酵培养基中回收生物活性肉毒杆菌神经毒素的阴离子交换色谱介质，和用于从来自阴离子交换色谱介质的洗提液进一步回收生物活性肉毒杆菌神经毒素的阳离子交换色谱介质，由此从基本上APF色谱方法获得生物活性肉毒杆菌神经毒素。在特定配置中，所述系统可进一步包括用于在基本上APF培养基中厌氧培养肉毒梭菌细菌的第一装置，并且可进一步包括用于在基本上APF发酵培养基中厌氧发酵肉毒梭菌细菌的第二装置，其中所述肉毒梭菌细菌是从第一装置获得。为进行澄清，所述系统可包括用于从获自第二装置的发酵培养基移除细胞碎片的收集装置，由此提供收集的发酵培养基。可使所收集的发酵培养基通过浓缩和稀释装置以浓缩并随后稀释所收集的发酵培养基。在一个具体实施例中，所述系统还可包括用于从来自阳离子交换色谱介质的洗提液回收经过进一步纯化的生物活性肉毒杆菌神经毒素的疏水相互作用介质。另外，还可用用于降低所获得的生物活性肉毒杆菌神经毒素中的生物负载量的过滤装置补充所述系统，以便降低利用两种或三种色谱介质获得的生物活性肉毒杆菌神经毒素的生物负载量。在一个具体实施例中，可利用在工作空间中具有整合高效微粒空气过滤器的用于在基本上APF培养基中培养肉毒梭菌细菌的厌氧培养室。示例性系统可提供效力为每毫克肉毒杆菌神经毒素至少约2.0×10⁷个单位的肉毒杆菌神经毒素，并且所获得的肉毒杆菌神经毒素在每毫克所获得的肉毒杆菌神经毒素中包含1纳克或少于1纳克的残余核酸。在具体实施方案中，所提供基本上APF发酵培养基的量是约2L至约75L；并且利用约200mL至约1L的基本上APF培养基。

在本发明的另一方面，提供用于获得生物活性肉毒杆菌神经毒素的使用色谱的基本上APF系统，所述系统包括用于培养肉毒梭菌细菌的第一装置，所述第一装置能够容纳基本上APF培养基；用于发酵已在第一装置中培养的肉毒梭菌细菌的第二装置，所述第二装置能够容纳基本上APF发酵培养基；用于收集发酵培养基的第三装置；用于浓缩所收集的发酵培养基和稀释经过过滤的发酵培养基的第四装置；用于从所收集的培养基进行肉毒杆菌神经毒素的第一次纯化的第五装置，其中所述第五装置包括阴离子交换色谱介质，由此获得经过第一次纯化的肉毒杆菌神经毒素；和用于进行肉毒杆菌神经毒素的第二次纯化的第六装置，其中所述第六装置包括阳离子交换色谱介质，由此获得经过第二次纯化的肉毒杆菌神经毒素，其中所获得的肉毒杆菌神经毒素具有每毫克肉毒杆菌神经毒素至少约2.0×10⁷个单位至每毫克肉毒杆菌神经毒素至少约5.9×10⁷个单位的效力，所获得的肉毒杆菌神经毒素在每毫克所获得肉毒杆菌神经毒素中包含1纳克或少于1纳克的残余核酸，并且所述方法在一周或短于一周内完成。在具体实施方案中，所获得的肉毒杆菌神经毒素可具有每毫克肉毒杆菌神经毒素至少4.4×10⁷个单位的效力。在所述系统的一个具体实施方案中，所述系统可进一步包括用于对从第六装置获得的肉毒杆菌神经毒素进行进一步纯化的第七装置，其中所述第七装置包括疏水相互作用介质，由此获得经过第三次纯化的肉毒杆菌神经毒素。在另一实施方案中，所述系统可进一步包括第八装置，其包括用于过滤来自第七装置的洗提液的膜。

本发明的另一方面包括用于获得生物活性肉毒杆菌神经毒素的基本上APF色谱系统，其包括用于厌氧培养肉毒梭菌细菌的第一装置，所述第一装置能够容纳约200mL至约1L基本上APF培养基；在能够容纳所述第一装置的培养室内具有整合高效微粒空气过滤器的厌氧培养室的第二装置；用于厌氧发酵已在所述第一装置中培养的肉毒梭菌细菌的第三装置，所述第三装置能够容纳约2L至约75L基本上APF发酵培养基，优选约2L至约30L基本上APF发酵培养基且包括至少一个选自由还原氧化探测器、pH值探测器和浊度探测器组成的群组的一次性探测器；用于收集发酵培养基的第四装置；用于浓缩所收集的发酵培养基和稀释经过过滤的发酵培养基的第五装置；用于对从所收集的发酵培养基获得的肉毒杆菌神经毒素进行第一次纯化的第六装置，所述第六装置包括阴离子交换色谱介质，由此获得经过第一次纯化的肉毒杆菌神经毒素；用于对肉毒杆菌神经毒素进行第二次纯化的第七装置，所述第七装置包括阳离子交换色谱介质，由此获得经过第二次纯化的肉毒杆菌神经毒素；用于对经过第二次纯化的肉毒杆菌神经毒素进行第三次纯化的第八装置，所述第八装置包括疏水相互作用介质，由此获得经过第三次纯化的肉毒杆菌神经毒素；和用于过滤经过第三次纯化的肉毒杆菌神经毒素的第九装置，所述第九装置包括过滤膜，其中所获得的肉毒杆菌神经毒素具有每毫克肉毒杆菌神经毒素约2.4×10⁷个单位至每毫克肉毒杆菌神经毒素约5.9×10⁷个单位的效力，所获得的肉毒杆菌神经毒素在每毫克所获得的肉毒杆菌神经毒素中包含1纳克或少于1纳克残余核酸并且所述方法在一周或短于一周内完成。根据所述方法，由此获得生物活性肉毒杆菌神经毒素，并且在具体实施例中，所获得的肉毒杆菌神经毒素具有每毫克肉毒杆菌神经毒素至少约4.4×10⁷个单位的效力。

根据本文中公开的方法和系统，由此获得生物活性肉毒杆菌神经毒素。在具体实施方案中，通过本文中公开的方法和系统获得生物活性肉毒杆菌神经毒素具有约900kDa的分子量。

本发明进一步包括用于制备活性成分为生物活性肉毒杆菌神经毒素的基本上APF药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)通过以下步骤获得生物活性肉毒杆菌神经毒素：(i)提供基本上不含动物产物的发酵培养基；(ii)在所述发酵培养基中发酵肉毒梭菌细菌；和(iii)使用阴离子交换色谱介质接着使用阳离子交换色谱介质从所述发酵培养基回收生物活性肉毒杆菌神经毒素，其中所回收的肉毒杆菌神经毒素具有每毫克肉毒杆菌神经毒素至少约2.0x10⁷个单位，优选每毫克肉毒杆菌神经毒素约2.4×10⁷个单位至每毫克肉毒杆菌神经毒素约5.9×10⁷个单位，在一些实施方案中每毫克肉毒杆菌神经毒素至少约4.4×10⁷个单位的效力，所述肉毒杆菌神经毒素在每毫克肉毒杆菌神经毒素中包含1纳克或少于1纳克的残余核酸，并且步骤(i)至(iii)在一周或短于一周内完成；和(b)混配所述肉毒杆菌神经毒素与至少一种适合赋形剂，由此制备基本上APF药物组合物。在一个具体实施方案中，混配步骤包括通过选自由冷冻干燥、冻干和真空干燥组成的方法群组的方法干燥肉毒杆菌神经毒素的步骤，并且其中所述适合赋形剂选自由白蛋白、人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、明胶、蔗糖、海藻糖、羟乙基淀粉、胶原蛋白、乳糖、蔗糖氯化钠、多糖、辛酸盐、聚乙烯吡咯烷酮和钠组成的群组。因此，本发明的一个方面还提供通过混配由本文中公开的方法和系统获得的生物活性肉毒杆菌神经毒素制备的基本上APF药物组合物。

另外，本发明还提供用于治疗患者的病状的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的通过用于制备活性成分为由本文中公开的APF方法(即，IAPF和FAPF方法)获得的生物活性肉毒杆菌神经毒素的基本上APF药物组合物的方法制备的药物组合物的步骤。所欲治疗的病状的实施例选自由以下组成的群组：例如头痛、偏头痛、紧张性头痛、窦性头痛、颈源性头痛、出汗病症、腋窝多汗症、手掌多汗症、足底多汗症、弗雷氏综合征(Frey’ssyndrome)、皮纹过动症、面部皱纹、眉间纹、乌鸦足、木偶纹、鼻唇沟、皮肤病症、失弛缓症、斜视、慢性肛裂、眼睑痉挛、肌肉骨骼疼痛、纤维肌痛、胰腺炎、心动过速、前列腺肿大、前列腺炎、尿潴留、尿失禁、膀胱过动症、半面痉挛、震颤、肌阵挛、胃肠病症、糖尿病、流涎症、逼尿肌-括约肌协同失调、中风后痉挛、创伤愈合、青少年大脑性瘫痪、平滑肌痉挛、再狭窄、局限性肌张力障碍、癫痫、颈部张力障碍、甲状腺病症、高钙血症、强迫症、关节炎性疼痛、雷诺氏综合征(Raynaud’ssyndrome)、萎缩纹、腹膜粘连、血管痉挛、鼻漏、肌肉挛缩、肌肉受损、喉肌痉挛、书写痉挛和腕隧道综合征。

在一个实施方案中，用于治疗患者的病状的方法，所述方法包括向所述患者局部施用有效量的基本上APF药物组合物的步骤，所述基本上APF药物组合物是通过包括以下步骤的方法制造：(a)通过以下方式获得生物活性肉毒杆菌神经毒素：(i)提供基本上不含动物产物的发酵培养基；(ii)在所述发酵培养基中发酵肉毒梭菌细菌；和(iii)使用阴离子交换色谱介质，接着使用阳离子交换色谱介质从所述发酵培养基回收生物活性肉毒杆菌神经毒素，其中所回收的肉毒杆菌神经毒素具有每毫克肉毒杆菌神经毒素至少约2.0×10⁷个单位的效力，所述肉毒杆菌神经毒素在每毫克肉毒杆菌神经毒素中包含1纳克或少于1纳克的残余核酸，并且步骤(i)至(iii)在一周或短于一周内完成；和

(b)混配所述肉毒杆菌神经毒素与至少一种适合赋形剂，由此制备基本上APF药物组合物，借以局部施用所述基本上APF药物组合物治疗所述病状。

局部施用治疗有效量的包含通过本文中公开的IAPF工艺/系统/方法提供的生物活性肉毒杆菌神经毒素的药物组合物可以例如约2个月至约6个月的时间间隔或以约2个月至约3个月的时间间隔重复。局部施用至患者的治疗有效量的根据本发明制备的基本上APF药物组合物的示例性适用剂量可具有约0.01个单位与约10,000个单位之间的肉毒杆菌神经毒素单位量。在特定情况下，肉毒杆菌神经毒素以约0.01个单位与约3000个单位之间的量施用。在具体实施例中，作为药物组合物中的活性药物成分的生物活性肉毒杆菌神经毒素是例如A型或B型肉毒杆菌神经毒素。

本发明包括用于获得生物活性肉毒杆菌神经毒素的利用色谱的基本上APF方法。所述方法可按序包括以下步骤：提供基本上APF发酵培养基，接着在所述发酵培养基中发酵肉毒梭菌细菌，和使用阴离子交换色谱介质并接着使用阳离子交换色谱介质从所述发酵培养基回收生物活性肉毒杆菌神经毒素，由此由所述基本上APF色谱方法获得生物活性肉毒杆菌神经毒素。回收步骤还可在使用阳离子交换色谱介质后包括使用疏水相互作用介质。所获得的生物活性肉毒杆菌神经毒素可以是肉毒杆菌神经毒素复合物或由其分离的具有约150kDa分子量且不含肉毒杆菌毒素复合物的复合蛋白质的肉毒杆菌毒素神经毒性组分。可使用APF方法(利用2个管柱(IAPF)，例如相继进行阴离子与阳离子色谱；或3个管柱(FAPF)，例如相继进行阴离子和阳离子和疏水相互作用色谱)获得生物活性肉毒杆菌神经毒素，如A、B、C₁、D、E、F和G型肉毒杆菌神经毒素。所获得的肉毒杆菌神经毒素优选为A型肉毒杆菌神经毒素复合物。

在本发明的一个方面，所用发酵培养基的量可包括约2L至约75L基本上APF发酵培养基，优选约2L至约30L基本上APF发酵培养基。举例来说，由所述方法获得约100mg至约5克，优选约100mg至约3克，更优选约100mg至约1克生物活性肉毒杆菌神经毒素。举例来说，每升所用发酵培养基可获得约20mg至约100mg或约20mg至约80mg生物活性神经毒素。发酵培养基可包含例如植物来源的蛋白质产物、酵母提取物和葡萄糖。举例来说，发酵培养基包含约5％w/v或更少的植物来源的蛋白质产物。在另一实施例中，发酵培养基包含约2％w/v或更少的酵母提取物。在另一实施方案中，发酵培养基包含约2％w/v或更少的葡萄糖。在一个具体实施例中，发酵培养基包含约5％w/v或更少的植物来源的蛋白质产物、约2％w/v或更少的酵母提取物和约2％w/v或更少的葡萄糖，所述植物来源的蛋白质产物、酵母提取物和葡萄糖根据所引述的w/v百分比量呈任何比率。在一些实施方案中，发酵步骤进行约60小时至约80小时之间的时间。

在一个实施方案中，提供用于获得生物活性肉毒杆菌神经毒素的利用色谱的基本上APF方法，所述方法按序包括以下步骤，其中在基本上APF培养基中培养肉毒梭菌细菌；接着在约2L至约75L基本上APF发酵培养基中，更优选在约2L至约30L基本上APF发酵培养基中发酵来自所述培养基的肉毒梭菌细菌，其中所述基本上APF培养基和基本上APF发酵培养基中的至少一者包含植物蛋白；随后通过移除发酵培养基中存在的细胞碎片收集发酵培养基并通过过滤浓缩所收集的发酵培养基，并且通过添加缓冲液稀释经过浓缩的发酵培养基。缓冲后，进行第一接触步骤，其中使经过稀释的所收集发酵培养基与阴离子交换介质接触，以便使生物活性肉毒杆菌神经毒素与阴离子交换介质结合，接着从阴离子交换介质洗提所捕捉的肉毒杆菌神经毒素由此获得第一洗提液，接着进行第二接触步骤，其中使第一洗提液与阳离子交换介质接触以从第一洗提液移除杂质，由此获得第二洗提液；接着通过UF和/或DF对其进行处理；并且接着过滤经过处理的第二洗提液，由此使用利用色谱的基本上APF方法获得生物活性肉毒杆菌神经毒素。

举例来说，从培养细菌到获得生物活性肉毒杆菌神经毒素完成所述方法的时间例如可在约50小时至约150小时之间，更优选为约80小时至约120小时。在具体实施方案中，培养基包含不超过约4％w/v植物来源的蛋白质产物，在另一实施方案中，培养基包含不超过约2％w/v酵母提取物，并且在另一实施方案中，培养基包含不超过约2％w/v葡萄糖。培养基可包含根据所引述的w/v百分比量任何比率的植物来源的蛋白质产物、酵母提取物和葡萄糖。在一个具体实施例中，培养基的pH值水平在培养步骤开始时可为约pH6.5至约pH8.0，优选为约pH6.8至约pH7.6，更优选为pH7.3。培养步骤可在厌氧培养室中在约33℃至约37℃的温度下，优选在约34.5℃下进行约8小时与约14小时之间、约10小时至12小时，优选约11小时的时间。在一个具体实施例中，厌氧培养室可在其进行培养的工作空间中含有整合高效微粒过滤器。发酵步骤可在约33℃至约37℃的温度下，优选在35℃下进行约60小时与约80小时之间，优选约72小时的时间。根据本发明的一个方面，收集步骤可移除发酵培养基中所含的RNA和DNA的至少约80％，且阴离子交换介质可移除所收集的发酵培养基中所有可测量出来的剩余DNA和RNA(低于检测极限)。在另一方面，收集步骤可进行约1小时与约3小时之间，优选约2.5小时的时间。在具体实施例中，可进行收集步骤直至原始发酵培养基体积的75％已被收集。在一实施方案的一个方面，浓缩步骤可进行约30分钟与约2小时之间，优选约0.75小时的时间。在另一方面，稀释步骤将所收集的发酵培养基再稀释到收集步骤开始时发酵培养基的初始重量。第一接触步骤可进行例如约4小时与约5小时之间的时间。在一个实施例中，在分光光度计读数达到约150mAU或更大时从阴离子交换树脂收集第一洗提液，直至280nm下的分光光度计读数从峰顶降回至约150mAU。第二接触步骤可进行约1小时与约3小时之间，优选约2小时的时间。可在分光光度计读数为约100mAU或更大时从阳离子交换树脂收集此第二洗提液，直至例如分光光度计读数从峰顶降回至约100mAU。通过浓缩和渗滤处理此第二洗提液的步骤可进行约1小时与约2小时之间，优选约1.5小时的时间。在一个具体实施方案中，过滤步骤包括通过使第二洗提液通过生物负载降低过滤器使生物负载量降低。生物负载降低过滤器可具有约0.1μm至约0.3μm，优选0.2μm的孔径。在具体实施方案中，所述方法可在第二接触步骤后进一步包括第三接触步骤，其中使第二洗提液与疏水相互作用介质接触以便进一步从第二洗提液移除杂质并由此获得第三洗提液。此第三接触步骤可进行约1小时与约3小时之间，优选约2小时的时间。可在分光光度计读数为约50mAU或更大时从疏水相互作用介质收集第三洗提液，直至例如分光光度计读数从峰顶降回至约50mAU。在存在第三接触步骤的情况下，对第三洗提液应用浓缩和渗滤处理步骤并且进行约2小时与约4小时之间的时间。可相应地通过使经过浓缩和渗滤的洗提液(来自所利用的2个管柱或3个管柱方法)通过生物负载降低过滤使生物负载量降低。在具体实施方案中，所述方法进一步包括冷冻所获得的生物活性肉毒杆菌神经毒素的步骤。

在具体实施方案中，基本上APF培养基包括约100mL与约500mL之间的体积。特定培养步骤通过将约100μL与约500μL之间的含肉毒梭菌的APF工作细胞库培养基引入基本上APF培养基中来起始。培养步骤接着可在厌氧培养室中例如在约34.5℃±1℃的温度下进行至少约8小时，优选约11小时。在一个实施例中，工作细胞库培养基可具有每毫升工作细胞库培养基至少约1×10⁴个菌落形成单位，例如每毫升工作细胞库培养基约1×10⁵至约5×10⁷个菌落形成单位的活细胞计数测定值，并且工作细胞库中的肉毒梭菌细菌已进行选择以便具有基本上均一的形态。

在一个实施方案中，工作细胞库培养基包含例如约20体积％甘油，如无菌甘油。工作细胞库培养基可通过以下步骤来制备：(a)使肉毒梭菌细菌在含有约2％w/v大豆蛋白胨、约1％w/v酵母提取物和约1％w/v葡萄糖的APF培养基中在厌氧培养室中在约34.5℃±1℃的温度下生长，直至在约540nm的波长下所测得培养基等份试样的光学密度为约2.5±1.0AU；和添加甘油以获得培养基中约20％的甘油浓度，由此获得工作细胞库。可通过例如在低于约-135℃下冷冻工作细胞库来制备工作细胞库的储存形式。用于本发明的示例性方法中的工作细胞库的储存形式可在环境温度下解冻并用于引发培养步骤。

培养步骤可在厌氧培养室中，如优选在工作空间中具有整合高效微粒空气(HEPA)过滤器的厌氧培养室/培养橱中，在约33℃至约37℃的温度下，优选在约34.5℃下进行约8小时与约14小时之间，优选约11小时的时间。发酵步骤可在约33℃至约37℃的温度下，优选在35℃下进行约20小时与约80小时之间，优选约60小时至约80小时，更优选约72小时的时间。所述方法可例如且在培养步骤前进一步包括通过使基本上APF培养基暴露于厌氧培养室的氛围使所述培养基发生氧化还原的步骤。所述方法还可在发酵步骤前包括通过也使基本上APF发酵培养基暴露于厌氧培养室的氛围使所述发酵培养基发生氧化还原的步骤。举例来说，使基本上APF培养基发生氧化还原的步骤可在厌氧培养室中进行约10小时与约14小时之间的时间。类似地，使基本上APF发酵培养基在发酵罐中发生氧化还原的步骤可在发酵步骤开始之前进行约10小时与约14小时之间的时间。

在一个实施方案中，公开用于获得生物活性肉毒杆菌神经毒素的包括色谱的APF方法，其按序包括以下步骤：将来自APF工作细胞库的肉毒梭菌细菌添加至APF培养基中；在所述培养基中培养所述肉毒梭菌细菌；在APF发酵培养基中发酵来自培养步骤的肉毒梭菌细菌直至发生肉毒梭菌细胞溶解；收集APF发酵培养基以提供收集的发酵培养基；通过过滤对所收集的发酵培养基进行浓缩；通过添加缓冲液稀释经过过滤的发酵培养基以获得经过稀释的发酵培养基；第一接触步骤，其中使经过稀释的发酵培养基与捕获色谱介质接触，其中所述捕获色谱介质是阴离子交换介质；第二接触步骤，其中使来自第一接触的步骤的洗提液与精制色谱介质接触，其中所述精制色谱介质是阳离子交换介质，和过滤来自第二接触步骤的洗提液，由此通过改良的APF方法获得生物活性肉毒杆菌神经毒素。在具体实施方案中，所述方法可进一步包括在第二接触步骤之后且在过滤步骤之前进行第三接触步骤的步骤，其中使来自第二接触步骤的洗提液与疏水相互作用介质接触。肉毒梭菌溶解期可在发酵步骤开始后例如在约35小时与约70小时之间出现。发酵培养基可具有例如约2L与约75L之间，约2L与约30L之间，或约2L与20L之间的体积的发酵培养基。所述方法整体可进行约50小时至约150小时之间，更优选约80小时至约120小时的时间。利用所述方法如此获得的生物活性肉毒杆菌神经毒素具有例如每毫克生物活性肉毒杆菌神经毒素约2.4×10⁷至约5.9×10⁷个单位的效力。

根据一个方面，在发酵结束时，每升发酵培养基可获得约40mg至约85mg肉毒杆菌神经毒素。在处理(过滤/色谱/过滤操作)的各种阶段之后，每升发酵培养基可获得约30mg至约60mg肉毒杆菌神经毒素；每升发酵培养基可获得约5mg至约25mg肉毒杆菌神经毒素；每升发酵培养基可获得约6mg至约20mg肉毒杆菌神经毒素。

作为一个实施方案，在发酵步骤开始时，可将发酵培养基的pH值调整至约pH6.0与约pH8之间，优选约pH6.8与约pH7.6之间，更优选约pH7.3。作为另一实施例，还提供用于获得生物活性肉毒杆菌神经毒素的基本上APF色谱方法，所述方法包括以下步骤：获得含有肉毒杆菌神经毒素的基本上APF发酵培养基；使所述培养基与阴离子交换色谱树脂接触以提供经过纯化的含有肉毒杆菌神经毒素的洗提液；使所述洗提液与阳离子交换色谱树脂接触由此获得经过进一步纯化的洗提液，和过滤所述经过进一步纯化的洗提液由此获得从基本上APF色谱方法纯化的生物活性肉毒杆菌神经毒素。在特定配置中，可利用含有约600mL至约800mL阴离子交换色谱树脂的阴离子色谱管柱。阴离子色谱管柱可具有例如约8cm至约10cm的直径和管柱内约9cm至约16cm的阴离子交换色谱树脂床高度。发酵培养基流过阴离子交换色谱树脂的流动速率可为例如每小时约140cm至每小时约250cm，或每小时约150cm至每小时约160cm。在另一方面，所述方法中可利用色谱管柱内约150mL至约300mL的阳离子交换色谱树脂，其中所述阳离子色谱管柱例如具有约5cm至约8cm的直径和约5cm至约11cm的阳离子交换色谱树脂床高度。所述方法可包括渗滤步骤和/或生物负载降低步骤中的至少一者。生物负载降低步骤可利用胶囊式过滤器。经过纯化的洗提液的渗滤优选在生物负载降低步骤之前进行。在一个实施例中，在对经过进一步纯化的洗提液进行渗滤步骤之前或之后调整经过渗滤的经过进一步纯化的洗提液的浓度，并使浓度经过调整的经过渗滤的经过进一步纯化的洗提液通过生物负载降低过滤器。所述方法可提供如利用小鼠LD50生物测定法所测定，效力为每毫克肉毒杆菌毒素至少约2.0×10⁷个单位，如每毫克肉毒杆菌神经毒素约2.4×10⁷至约6.0×10⁷个单位的所得肉毒杆菌神经毒素。所述方法结束时每升发酵培养基可回收例如约4mg至约25mg肉毒杆菌毒素的示例性回收率。

在另一个实施方案中，用于纯化生物活性肉毒杆菌神经毒素的基本上APF方法可包括以下步骤：获得约2L至约30L包含肉毒杆菌神经毒素的APF发酵培养基；收集APF发酵培养基步骤以提供收集的APF发酵培养基；收集APF发酵培养基后进行阴离子交换色谱由此提供第一洗提液；使来自阴离子交换色谱的洗提液与阳离子交换色谱介质接触以进行阳离子交换色谱由此提供第二洗提液；和过滤来自阳离子交换色谱介质的第二洗提液，由此获得经过纯化的肉毒杆菌神经毒素，其中所获得的经过纯化的肉毒杆菌神经毒素具有每毫克肉毒杆菌神经毒素约2.4×10⁷至约5.9×10⁷个单位的效力且获得量可在每升所用APF发酵培养基约4mg至约25mg之间。

本发明还包括用于制备活性成分是生物活性肉毒杆菌神经毒素的基本上APF药物组合物的混配方法，其包括以下步骤：通过以下方式获得生物活性肉毒杆菌神经毒素：(i)提供基本上不含动物产物的发酵培养基；(ii)在发酵培养基中发酵肉毒梭菌细菌，和(iii)使用阴离子交换色谱介质接着使用阳离子交换色谱介质从所述发酵培养基回收生物活性肉毒杆菌神经毒素；和接着混配所述肉毒杆菌神经毒素与至少一种适合赋形剂，由此制备基本上APF药物组合物。在一个实施例中，所述方法包括通过冷冻干燥或冻干或真空干燥对所混配的肉毒杆菌神经毒素与至少一种适合赋形剂进行干燥以获得适用于运输或储存的形式的步骤，其中活性成分是生物活性肉毒杆菌神经毒素，其中发酵培养基包含从植物获得蛋白质产物。可用来获得蛋白质产物的植物可为大豆、玉米或麦芽、洋羽扇豆(Lupinuscampestris)的去苦味种子或其水解产物。所获得肉毒杆菌神经毒素可具有每毫克肉毒杆菌神经毒素约2.0×10⁷个单位至每毫克肉毒杆菌神经毒素约6.0×10⁷个单位之间的效力。肉毒杆菌神经毒素选自由A、B、C₁、D、E、F和G型肉毒杆菌神经毒素组成的群组，优选是A型肉毒杆菌神经毒素。在特定情况下，肉毒杆菌神经毒素是以分子量为约150kDa且不含肉毒杆菌毒素复合物的复合蛋白质的肉毒杆菌毒素神经毒性组分形式获得。在具体实施方案中，适合赋形剂选自由以下组成的群组：白蛋白、人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、明胶、蔗糖、海藻糖、羟乙基淀粉、胶原蛋白、乳糖、蔗糖、氨基酸、氯化钠、氯化钾、多糖、辛酸盐、聚乙烯吡咯烷酮和柠檬酸钾。获得生物活性肉毒杆菌神经毒素可进一步包括使用疏水相互作用介质接着使用阳离子交换介质的步骤。在具体实施例中，在约20℃至约25℃的温度下进行真空干燥。在一些实施方案中，在例如约70mmHg至约90mmHg的压力下进行真空干燥。真空干燥的时间可为例如约4小时至约5小时。

本发明的具体方面涉及提供可包含例如生物活性肉毒杆菌神经毒素复合物的药物组合物，且赋形剂选自由白蛋白、人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、明胶、蔗糖、海藻糖、羟乙基淀粉、胶原蛋白、乳糖和蔗糖组成的群组，其中所述药物组合物基本上不含核酸。

在具体实施例中，提供包含生物活性肉毒杆菌神经毒素和至少一种赋形剂的药物组合物，其中所获得的肉毒杆菌神经毒素具有每毫克生物活性肉毒杆菌神经毒素约2.0×10⁷至约6.0x10⁷个单位之间的效力，其中所述组合物在每毫克肉毒杆菌神经毒素复合物中包含少于约12ppm核酸，优选少于1ppm核酸。

在一个具体实施方案中，用于获得生物活性肉毒杆菌神经毒素的基本上APF色谱方法按序包括以下步骤：在基本上APF培养基中培养肉毒梭菌细菌持续约10小时与约12小时之间的时间，或直至培养基的生物量测量值达到在约540纳米(nm)波长下的光学密度在约0.8AU与约4.5AU之间；在基本上APF发酵培养基中发酵来自所述培养基的肉毒梭菌细菌持续约65小时至约75小时之间的时间或直至在发酵结束时通过在约890nm的波长下使用在线生物量探测器测量发酵培养基的光学密度获得的生物量测量值在约0.05AU与约0.7AU之间；收集所述发酵培养基持续约2.5小时，其中移除发酵培养基中的细胞碎片并且使发酵培养基的重量减至发酵步骤开始时其起始重量的约四分之三；通过切线流过滤将所收集的发酵培养基浓缩至收集步骤开始时其起始体积的约四分之一；通过添加缓冲液稀释经过浓缩的发酵培养基，其中所述浓缩和稀释步骤进行约0.5小时至约2小时之间的时间，其中在浓缩期间使发酵培养基缩减至收集步骤开始时其起始重量的约四分之一，且接着通过添加缓冲液再稀释至收集步骤开始时的其最初起始重量；使经过稀释的发酵培养基与用于捕捉生物活性肉毒杆菌神经毒素的捕获色谱介质接触约4至约5小时的时期；使来自所述捕获色谱介质的洗提液与用于进行第一次精制操作以从其中移除杂质的第一精制色谱介质接触约1.5小时至约2.5小时的时期；通过使来自所述精制色谱介质的洗提液流过疏水相互作用介质持续约1.5小时至约2.5小时的时期进行第二次精制操作；通过渗滤处理来自所述疏水相互作用介质的洗提液持续约1小时至约4小时的时期；和利用生物负载降低过滤器过滤所述经过处理的洗提液持续约0.5小时，由此获得生物活性肉毒杆菌神经毒素。

在另一方面，公开用于获得生物活性肉毒杆菌神经毒素的基本上APF色谱系统，所述系统包括：用于培养肉毒梭菌细菌的第一装置，所述第一装置能够容纳基本上APF培养基；用于发酵已在第一装置中培养的肉毒梭菌细菌的第二装置，所述第二装置能够容纳基本上APF发酵培养基；用于收集发酵培养基的第三装置；用于对来自第三装置的所收集培养基进行浓缩和稀释的第四装置；所述第四装置包括切线流过滤(TFF)；用于对来自经过浓缩和稀释的培养基进行第一次纯化的第五装置，所述第五装置包括阴离子交换色谱介质，由此获得经过第一次纯化的肉毒杆菌神经毒素；和用于对经过第一次纯化的肉毒杆菌神经毒素进行第二次纯化的第六装置，所述第六装置包括阳离子交换色谱介质，并且由此获得经过第二次纯化的肉毒杆菌神经毒素。

在一个具体实施方案中，所述系统可进一步包括用于通过对从第六装置获得的经过第二次纯化的肉毒杆菌神经毒素进行纯化而进行进一步纯化的第七装置，其中所述第七装置包括疏水相互作用介质，由此获得经过第三次纯化的肉毒杆菌神经毒素。所述系统还可进一步包括具有过滤膜用于过滤来自第六或第七装置的洗提液的第八装置。

在另一个实施方案中，直径在约8cm与约15cm之间的色谱管柱含有阴离子交换色谱介质并且所述阴离子交换色谱介质例如在管柱中可具有约8cm与约15cm之间的床高度。在另一实施例中，所述系统的第四装置包括在每小时约125cm与每小时约200cm之间的流动速率下操作的色谱管柱，并且所述管柱可具有约500mL与约1L之间的管柱体积。在一个方面，第五装置可具有例如约50mL与约500mL的管柱体积和约8cm与约15cm的床高度。在一些实施例中，第五装置的色谱管柱具有例如约2cm与约10cm的管柱直径。第五装置的色谱管柱可具有每小时约100cm与约200cm之间的示例性流动速率。所述系统的第七装置可包括过滤膜。

在另一个实施方案中，所述系统可进一步包括第九装置，所述第九装置包括用于提供厌氧氛围的厌氧培养室，其中用于培养肉毒梭菌细菌的第一装置容纳于所述厌氧培养室中。此第九装置优选包括定位于其培养室/工作区内的整合高效微粒空气(HEPA)过滤器。所述系统的第二装置(用于发酵)可包括至少一个用于探测氧化-还原电位或pH值或光学密度的探测器。在一个具体实施例中，至少一个一次性探测器选自由还原-氧化探测器、pH值探测器和浊度探测器组成的群组。所述系统的第八装置可包括用于浓缩和缓冲液交换的切线流过滤装置。在另一实施方案中，所述系统可包括第十装置，所述第十装置包括用于降低生物负载量的生物负载降低装置。在一个实施例中，生物负载降低装置包括孔径大致在约0.1μm与0.3μm之间，优选为0.2μm的过滤器。所述系统还可包括用于在获得经过第二次纯化的肉毒杆菌神经毒素后用于储存所述经过纯化的肉毒杆菌神经毒素的第十一装置。在一个实施例中，此储存装置提供约-25℃至约-80℃之间的储存温度。

在另一方面，通过具有以下步骤的APF方法提供生物活性肉毒杆菌毒素：提供基本上APF发酵培养基；在所述发酵培养基中发酵肉毒梭菌细菌；使用阴离子交换色谱介质接着使用阳离子交换色谱介质从所述发酵培养基回收生物活性肉毒杆菌神经毒素，其中所获得的生物活性肉毒杆菌毒素具有每毫克肉毒杆菌神经毒素约2.0×10⁷个单位至每毫克肉毒杆菌神经毒素约6.0×10⁷个单位之间的效力。在一个实施方案中，所述方法进一步包括通过使用疏水相互作用介质接着使用阳离子交换介质进一步纯化所述肉毒杆菌神经毒素的步骤。

根据另一方面，提供利用包含根据本文中公开的方法获得的肉毒杆菌神经毒素的药物组合物治疗患者的病状的方法。病状可包括疾病、失调、疾患或美容畸形或外貌。在一个实施例中，治疗患者的病状的方法包括向所述患者施用治疗有效量的包含肉毒杆菌神经毒素和至少一种适合赋形剂的药物组合物的步骤，其中所述肉毒杆菌毒素具有约1个单位≥约0.02皮克的效力，由此治疗所述的患者的病状。

在一个具体实施例中，用于治疗所述病状的肉毒杆菌神经毒素可通过以下方法获得：在基本上APF培养基中培养肉毒梭菌细菌；获得含有肉毒杆菌神经毒素的基本上APF发酵培养基；使所述培养基与阴离子交换色谱介质接触以提供含有肉毒杆菌神经毒素的经过纯化的洗提液；使所述洗提液与阳离子交换色谱介质接触由此获得经过进一步纯化的洗提液，和过滤所述经过进一步纯化的洗提液由此获得从基本上APF色谱方法纯化的生物活性肉毒杆菌神经毒素。

在一个实施方案中，包括用于获得生物活性肉毒杆菌神经毒素的基本上APF色谱系统，所述系统包括用于厌氧培养肉毒梭菌细菌的第一装置，所述第一装置能够容纳约200mL至约1L基本上APF培养基；用于厌氧发酵已在第一装置中培养的肉毒梭菌细菌的第二装置，所述第二装置能够容纳约5L至约75L，或约2L至约75L，或约2L至约30L基本上APF发酵培养基并且包括至少一个选自由还原-氧化探测器、pH值探测器和浊度探测器组成的群组的一次性探测器；用于提供厌氧氛围并且能够容纳第一装置的第九装置，所述第九装置包括在培养室内具有整合高效微粒空气过滤器的厌氧培养室，其中所述培养室可容纳用于厌氧培养肉毒梭菌细菌的第一装置；用于收集发酵培养基的第三装置；用于进行所收集培养基的浓缩和稀释的第四装置，用于对从第四装置获得的肉毒杆菌神经毒素进行第一次纯化的第五装置，所述第五装置包括阴离子交换色谱介质，由此获得经过第一次纯化的肉毒杆菌神经毒素；用于对经过第一次纯化的肉毒杆菌神经毒素进行第二次纯化的第六装置，所述第六装置包括阳离子交换色谱介质，由此获得经过第二次纯化的肉毒杆菌神经毒素；用于对经过第二次纯化的肉毒杆菌神经毒素进行第三次纯化的第七装置，所述第七装置包括疏水相互作用介质，由此获得经过第三次纯化的肉毒杆菌神经毒素；和用于对经过第三次纯化的肉毒杆菌神经毒素进行浓缩和缓冲液交换的第八装置，所述第八装置包括TFF膜。

在具体实施例中，发酵培养基包含不超过约5％w/v植物来源的蛋白质产物、不超过约2％w/v酵母提取物和不超过约2％w/v葡萄糖，并且其中在约72小时发酵步骤开始时发酵培养基的pH值水平例如为约pH6.8至约pH7.6，优选为约pH7.3。在一个实施方案中，所述方法可进一步包括使经过进一步纯化的洗提液与疏水相互作用介质接触以获得含有肉毒杆菌神经毒素的经过甚至更进一步纯化的洗提液的步骤。在一个具体实施例中，治疗病状的方法可使用作为分子量为约150kDa且不含肉毒杆菌毒素复合物的复合蛋白质的肉毒杆菌毒素神经毒性组分获得的肉毒杆菌神经毒素。示例性施用步骤可选自由以下组成的施用途径群组：肌肉内、皮内、皮下、腺内、鞘内、直肠、口服和透皮施用，并且肉毒杆菌神经毒素选自由A、B、C₁、D、E、F或G型肉毒杆菌毒素组成的群组。肉毒杆菌神经毒素优选是A型肉毒杆菌神经毒素。

在一些实施例中，所述系统可促进可借以获得生物活性肉毒杆菌神经毒素的方法，所述生物活性肉毒杆菌神经毒素可用作每毫克肉毒杆菌神经毒素复合物包含少于约12ng核酸、优选每毫克肉毒杆菌神经毒素复合物包含低于约1ng核酸、更优选具有不可测量出来的核酸(例如低于检测极限)的药物组合物的一部分。

附图

图1A是展示实施例1NAPF方法中的主要步骤的流程图。图1B是展示实施例2IAPF方法中的主要步骤的流程图，其中捕捉和精制色谱步骤可利用2个管柱(阴离子交换接着为阳离子交换)或3个管柱(FAPF)(阴离子交换接着为阳离子交换接着为疏水相互作用管柱)。

描述

本发明是基于可通过使用简单、快速并且经济的APF色谱系统和方法获得高效力、高纯度的生物活性梭菌神经毒素(如肉毒杆菌神经毒素)的发现。重要的是，使用我们的系统和方法可产生每1mg所获得的经过纯化的肉毒杆菌神经毒素包含1ng(或少于1ng)核酸(RNA和DNA)杂质，甚至没有动物来源的酶(如RNA酶和DNA酶)的经过纯化的肉毒杆菌神经毒素。举例来说，使用我们的系统和方法可产生每毫克所获得的经过纯化的肉毒杆菌神经毒素包含少于约0.6ng核酸(RNA和DNA)杂质的经过纯化的肉毒杆菌神经毒素。所获得的肉毒杆菌神经毒素可以是A型肉毒杆菌毒素复合物，如300kDa、500kDa或900kDa(近似分子量)复合物或其混合物。所获得的肉毒杆菌神经毒素还可以是分子量为约150kDa的肉毒杆菌毒素型神经毒性组分(即，没有复合蛋白质)。肉毒杆菌神经毒素可以是血清型A、B、C、D、E、F或G中的任一者或其混合物。另外，所述改良的系统和方法可与重组、杂交、嵌合或经过修饰的肉毒杆菌毒素(轻链、重链或两条链一起)结合实施。

本发明的一个重要方面是使用阴离子交换(捕捉)介质色谱，接着使用阳离子交换(精制)介质色谱从已在其中发酵了肉毒梭菌细菌的APF发酵培养基纯化肉毒杆菌神经毒素。我们发现使用阴离子交换接着使用阳离子交换色谱介质提供用于获得高纯度、高产率肉毒杆菌神经毒素的有效且快速的方法。在先前认为使用阴离子交换色谱会对肉毒杆菌神经毒素的凝胶显带型态具有不利影响，因此在肉毒杆菌神经毒素的纯化中不主张使用阴离子交换色谱。参见例如美国专利7,452,697第55栏第53-57行。

本发明的另一重要方面在于如上所述其产生高纯度肉毒杆菌神经毒素(即，每毫克所获得的肉毒杆菌神经毒素含≤1ng核酸)。本发明的另一重要方面在于，尽管已知的尚茨法需要若干周(即，通常为约18天至约22天)来培养、发酵和纯化肉毒杆菌神经毒素，但本发明范围内的系统和方法允许所有培养、发酵和纯化步骤在一周或短于一周内完成。在本发明的一优选实施方案中，所有培养、发酵和纯化步骤可在六天或短于六天内完成。在本发明的一更优选实施方案中，所有培养、发酵和纯化步骤可在约四天或短于四天内(例如约80小时至约144小时内或其间的时间/范围内)完成。我们通过发展一种八步骤或九步骤方法(和用于实现所述方法的系统)并且发现在一个具体实施方案中这八个或九个步骤各自可在下文所述的时期内完成而发明了本发明的这种更优选的快速实施方案：

约8小时至约14小时进行培养；

约60小时至约80小时进行发酵；

约2.5小时进行收集；

约2小时至约4小时进行浓缩和稀释；

约4小时至约6小时进行阴离子交换色谱(其包括用于洗提所捕捉的肉毒杆菌神经毒素的时间)；

约2小时进行阳离子交换色谱；

约2小时进行可选的第三次色谱步骤(即，疏水相互作用色谱)；

约2小时至约4小时进行浓缩和渗滤；和

约1/2小时进行进一步过滤。因此，完成本发明的8步骤或9步骤更优选快速实施方案所需要的总时间为约75小时至约150小时。

本发明更有效并且节省时间。在一个方面，我们的新方法利用预先选择和确认的细胞系，并且因此去掉先前技术尚茨法中涂铺和生长细胞、选择和收集菌落以及对所收集的菌落进行逐步细胞系扩增(在细胞培养和发酵步骤之前)的步骤，所述扩增步骤需要培养和接着接种发酵培养基。在一个方面，本发明直接以培养预先选择用于接种APF培养基的细胞开始，因此节省时间的方法步骤。

通过实验，我们发展出两个色谱管柱(“IAPF”)和三管柱(“FAPF”/“FIAPF”)色谱系统和方法用于纯化发酵培养基中所存在的肉毒杆菌神经毒素，所述发酵培养基由肉毒梭菌细菌的APF发酵产生。重要的是，尽管APF发酵方法可以减少或消除来自用于培养和发酵梭菌细菌的培养基中作为养分的动物来源的产物(如酪蛋白和肉汤)，但已知的APF发酵方法之后通常进行一个或多个纯化步骤，所述纯化步骤会利用动物来源的产物，如酶DNA酶和RNA酶。我们用于纯化APF发酵培养基中所存在的肉毒杆菌神经毒素的系统和方法不使用动物来源的酶。

本发明可涵盖将所收集的发酵培养基(例如通过过滤进行澄清)加载到阴离子交换管柱(如来自AppliedBiosystems的50HQ阴离子交换色谱树脂)上。在一个方面，可使用具有聚苯乙烯/二乙烯基苯基础基质和约50μm粒子直径和约60-70的动态容量(BSAmg/ml)的强阴离子交换介质。阴离子交换管柱捕捉梭菌神经毒素(如肉毒杆菌毒素复合物)并且降低杂质含量。发现阴离子交换管柱从所收集的发酵培养基有效捕捉肉毒杆菌毒素复合物并且保留肉毒杆菌毒素复合物的生物活性，同时还分离与肉毒杆菌毒素一起存在于发酵培养基中的许多杂质。使用适合缓冲液从阴离子交换管柱洗提所捕捉(结合)的梭菌神经毒素。

在本发明的一个两管柱实施方案中，将来自阴离子交换管柱的洗提液(含有肉毒杆菌神经毒素)加载至阳离子交换管柱上以从杂质进一步纯化肉毒杆菌神经毒素。阳离子交换管柱可以是来自AppliedBiosystems的20HS阳离子交换树脂。在一个方面，可使用具有聚苯乙烯/二乙烯基苯基础基质和约20μm粒子直径和约＞75的动态结合容量(溶菌酶mg/ml)的强阳离子交换介质。在本发明的一个三管柱实施方案(FAPF)中，将来自阳离子交换管柱的洗提液加载至疏水相互作用管柱(如来自GEHealthcare的PhenylSepharoseHP树脂)上以进一步纯化肉毒杆菌神经毒素。在一个方面，可使用粒度为约34μm的高度交联琼脂糖珠粒基质，其已经用苯基进行衍生化并且具有约45的动态结合容量(胰凝乳蛋白酶原mg/ml)。

在两管柱或三管柱方法后，可进一步处理来自最后所用管柱的洗提液以获得经过高度纯化的主体肉毒杆菌毒素复合物。色谱后处理步骤可包括通过超滤和渗滤进行浓缩和缓冲液交换、无菌过滤和制备经过纯化的肉毒杆菌毒素复合物的溶液而不是悬浮液(先前技术)，所述溶液优选是在柠檬酸钾中，并且在一个实施例中，柠檬酸钾的浓度是10mM并且pH值为约6.5。

在某些优选实施方案中，用于生长(厌氧培养和厌氧发酵)肉毒梭菌和制备肉毒杆菌毒素的培养基可包含基于大豆的产物来置换动物来源的产物，以便所用培养基基本上或完全不含动物来源的产物。培养步骤增加用于后续发酵的微生物的量。培养允许先前冷冻的休眠细菌重新恢复为活跃生长的培养物。另外，用于接种发酵培养基的活微生物的体积和量对于从活跃生长的培养物获得比从所储存的非繁殖肉毒梭菌细胞库获得来说可以得到更精确的控制。因此，将APF培养基中的工作细胞库的样品解冻并且置于所选APF培养基中。获得适合水平的细菌生长后，将培养基用于接种发酵培养基。作为一个实施例，使用来自生长期的约1％至约5％或其间的量的具有肉毒梭菌的培养基接种发酵培养基。在大规模厌氧环境中进行发酵以产生最大量的微生物细胞(Ljungdahl等人，Manualofindustrialmicrobiologyandbiotechnology(1986)，由Demain等人编著，AmericanSocietyforMicrobiology，Washington，D.C.第84页)。或者，可通过将工作细胞库的样品直接添加至发酵培养基中在发酵培养基中进行肉毒梭菌的生长。

在先前技术中，肉毒梭菌在培养基中的生长通常以两个阶段进行，第一阶段是细胞涂铺、细胞群落生长、选择和生长，接着的第二阶段为接种培养基(通常是两阶段逐步扩增培养物)和接种发酵培养基和肉毒杆菌毒素制备。优选培养基中任何阶段的生长都不在用培养基中的最终生长物接种发酵培养基之前导致细胞溶解。因此，在本发明之前，在开始发酵步骤前采用约四天来培养肉毒梭菌细菌。根据本发明，我们能够在仅8至14小时内就完成所有培养，这是因为无需先前利用的涂铺细胞的步骤、后续等待菌落在血液琼脂板上生长的时间、从板选择用于以小体积培养物(例如8-9mL)生长的菌落，所述培养物接着提供用于培养基的接种物。根据本发明的一个方面，预先选择的细胞直接用于接种培养基，所述培养基用于接种借以最终纯化肉毒杆菌毒素的全规模发酵培养基，因此去除了涂铺、菌落形成、选择和逐步扩增步骤，这些步骤先前用来生长用于接种培养基的细胞，所述培养基本身接着用于接种发酵培养基。

基于动物(非APF或“NAPF”)的培养基通常包括脑心浸液培养基(BHI)、细菌蛋白胨、NaCl和葡萄糖。本发明范围内的培养基是APF培养基。例如，可使用基于大豆的产物替代培养基和发酵培养基中的BHI和细菌蛋白胨。优选基于大豆的产物可溶于水并且包含水解大豆，不过肉毒梭菌可在含有不溶性大豆的培养基中生长。根据本发明可使用基于大豆的产物的任何来源。优选大豆是水解大豆并且水解是使用非动物酶进行的。水解大豆或可溶性大豆的来源包括Hy-Soy(QuestInternational)、Soypeptone(Gibco)Bac-soytone(Difco)、AMISOY(Quest)NZsoy(Quest)、NZsoyBL4、NZsoyBL7、SE50M(DMVInternationalNutritionals)和SE50MK(DMV)。

实施例

以下实施例说明本发明的具体实施方案并且不欲限制本发明的范围。除非在实施例中另外说明，否则“毒素”或“肉毒杆菌毒素”意谓分子量为约900kDa的A型肉毒杆菌毒素复合物。本文中公开用于纯化分子量为约900kDa的A型肉毒杆菌毒素复合物的系统和方法完全适用于纯化约150kDa、约300kDa、约500kDa以及其它分子量毒素、复合物、肉毒杆菌毒素血清型和肉毒杆菌毒素神经毒性组分。

实施例1

用于获得肉毒杆菌毒素的非APF(尚茨)法

本实施例阐述用于获得肉毒杆菌神经毒素的先前技术尚茨法。所述方法为使用动物来源的培养基和试剂(即，牛血液琼脂板用于培养、酪蛋白用于发酵培养基中和使用RNA酶和DNA酶进行肉毒杆菌神经毒素纯化)的非APF方法。图1A是展示尚茨法的主要步骤的流程图。尚茨法具有约16至20个主要步骤，对于生产规模工作来说使用115L发酵罐并且完成需要耗时约3周。尚茨法开始于将非APF肉毒梭菌母细胞库(MCB)小瓶解冻至室温，随后进行四个培养步骤。首先选择具有适合形态的菌落，将来自解冻MCB小瓶的等份试样在预先还原的哥伦比亚血液琼脂(CBA)板上划线并在34℃±1℃下厌氧孵育30-48小时。其次，将所选菌落接种至含有酪蛋白生长培养基的9mL试管中在34℃保持6-12小时。具有最快速生长和最高密度的9mL试管的内含物(生长选择步骤)接着通过两次逐步扩增厌氧孵育(第三和第四培养步骤)进一步培养，所述两次逐步扩增厌氧孵育为在34℃下在600mL中孵育12-30小时至1L菌种培养瓶，接着在35℃下在含有酪蛋白生长培养基的15L至25L菌种发酵罐中培养6-16小时。这两个逐步扩增培养在于水中含有2％酪蛋白水解产物(酪蛋白[奶蛋白质]消化产物、1％酵母提取物和1％葡萄糖(右旋糖)的营养培养基中在pH7.3下进行。

逐步扩增培养之后在商业规模(即115L)生产发酵罐中在含酪蛋白培养基中在受控厌氧氛围下在35℃下进一步孵育60-96小时。细菌的生长通常在24至36小时之后完成，并且在发酵步骤进行的约65至约72小时期间大部分细胞发生溶解并释放肉毒杆菌神经毒素。相信毒素因细胞溶解而释放并且由培养基中存在的蛋白酶活化。可使用单层深度过滤器制备培养基的滤液以移除总杂质(即完整和破裂的细胞)，由此获得清澈溶液，称为经过澄清的培养物。由经过澄清的培养物收集肉毒杆菌神经毒素通过在20℃下用3M硫酸使经过澄清的培养物的pH值降至pH3.5以使原始毒素沉淀(酸化沉淀)来完成。接着通过超微过滤(微过滤)(称为MF或UF)随后进行渗滤(DF)浓缩原始肉毒杆菌神经毒素(以达成体积减小)。微过滤步骤使用0.1μm过滤器。

所收集的粗毒素或原始毒素接着转移至消化容器中并且通过添加蛋白酶抑制剂苯甲脒盐酸盐使其稳定。添加DNA酶和RNA酶来消化(水解)核酸。经过水解的核酸和低分子量杂质接着通过进一步UF和DF步骤加以移除。接着用pH6.0磷酸盐缓冲液提取毒素，并且通过澄清移除细胞碎片。接下来按序进行三个沉淀步骤(冷乙醇、盐酸和硫酸铵沉淀)。经过纯化的肉毒杆菌神经毒素复合物(毒素批料)以磷酸钠/硫酸铵缓冲液中的悬浮液形式在2℃至8℃下储存。

本实施例1尚茨(非APF)方法(包括收集和纯化步骤)的完成耗时约两周至三周。所得肉毒杆菌神经毒素批料是由肉毒梭菌HallA菌株制得的900kDaA型肉毒杆菌毒素复合物的高品质悬浮液，其比效力为2×10⁷U/mg，A₂₆₀/A₂₇₈小于0.6且在凝胶电泳时具有独特显带型态，并且适用于混配肉毒杆菌毒素药物组合物。

肉毒杆菌神经毒素还可由美国专利7,452,697的实施例7中所述的APF非色谱方法获得，所述完整APF非色谱方法(从培养开始至所有纯化和处理步骤结束)的完成耗时约两周至三周。获得，肉毒杆菌神经毒素还可由美国专利7,452,697的实施例16中所述的APF色谱方法获得，所述APF色谱方法(从培养开始至所有纯化和处理步骤结束)的完成耗时一周或更长的时间。

实施例2

用于获得肉毒杆菌神经毒素的APF两管柱和三管柱色谱系统和方法

我们开发了用于获得高产率高纯度肉毒杆菌神经毒素的基于阴离子-阳离子色谱的快速APF系统和方法。本实施例2的方法仅具有8-10个主要步骤，出于生产目的(即，获得克量的最终肉毒杆菌神经毒素)使用20L发酵容器，并且完成所述方法的所有步骤(从起始培养至完成最终纯化和毒素储存)仅耗时4-7天，优选约4至约6天。本文公开的系统中所用的装置在下文论述。开发了两种色谱介质方法和三种色谱介质方法并且在本文中阐述。两种介质方法相继使用阴离子交换色谱和阳离子交换色谱。三种介质方法相继使用阴离子交换色谱和阳离子交换色谱和疏水相互作用色谱(HIC)。HIC移除其它杂质，如49kDa杂质(它证明是宿主细胞磷酸葡萄糖异构酶，如下文所论述)。

制备工作细胞库

我们开发了一种新型的肉毒梭菌细胞库(用于起始培养步骤)，其不使用哥伦比亚血液琼脂板并且去除在培养前进行菌落选择的需要，并且还消除了进行尚茨法逐步扩增试管培养和多次接种(培养)步骤的需要。

出于此目的，使用先前已建立的尚茨母细胞库(MCB)来产生APF研究细胞库(RCB)，从所述APF研究细胞库产生新型APF母细胞库(MCB)和后续工作细胞库(WCB)。研究细胞库(RCB)是从来自尚茨(NAPF)MCB的菌落制备。为从MCB小瓶去除动物来源的蛋白质，将细胞在含有2％w/vSPTII(II型大豆蛋白胨)、1％w/v酵母提取物和1％w/v葡萄糖的APF培养基中洗涤两次。将细胞在严格厌氧条件下使用模块化氛围控制系统(MACS)厌氧培养室涂铺在APF培养基上。进一步扩增分离的菌落并且在含有约20％甘油的APF培养基中在-135℃下储存。

通过在无氧APF培养基(200mL，在厌氧培养室中还原最少12小时)中扩增RCB在GMP条件下制备APF-MCB，并且在MACS厌氧培养室中在34.5℃±1℃下(在60rpm下搅拌)培养直至培养物的OD₅₄₀达到2.5±1.0AU。添加无菌甘油至所得培养物中至约20％的最终浓度，其后将混合物以每小瓶1毫升转移至冷冻小瓶中(APF-MCB小瓶)。小瓶在液氮中速冻，并接着在低于-135℃下储存。通过如上所述进行扩增在GMP条件下制备APF-WCB。表征所得APF细胞库的特性、纯度、活力和遗传稳定性。

上游步骤(培养和发酵)

本实施例2方法具有两个大致阶段：上游阶段和下游阶段。上游阶段包括扩增起始细胞系(肉毒梭菌细菌在基本上APF培养基中生长和繁殖)、发酵、收集(移除细胞碎片)以提供经过澄清的所收集的培养物，接着对其进行浓缩和稀释。因此，在本实施例中，我们的两管柱方法的九个步骤是培养、发酵、收集过滤、浓缩、捕捉(阴离子)色谱、精制(阳离子)色谱、缓冲液交换、生物负载降低和小瓶填充。

上游阶段包括在1L瓶中使用含有400mL经过还原(在厌氧培养室中)的菌种APF培养基(2％w/vSPTII、1％w/v酵母提取物(高压灭菌前用1N氢氧化钠和/或1N盐酸调整至pH7.3)、1％w/v无菌葡萄糖(在对培养基进行高压灭菌后添加))的培养基。培养基(菌种培养基)用400μL解冻的肉毒梭菌WCB接种。孵育/培养在34.5℃±1.0℃下在150rpm搅拌下在厌氧培养室中进行。

当培养基在540nm下的光学密度达到1.8±1.0AU时，将1L瓶的整个内容物(约400mL)转移至含有以1N氢氧化钠和/或1N盐酸在蒸汽灭菌后调整至pH7.3的APF发酵培养基的20L生产发酵罐中，发酵培养基由3.25％w/vSPTII、1.2％w/v酵母提取物、1.5％w/v无菌葡萄糖(灭菌后添加，例如在约122℃下灭菌0.5小时)构成。温度和搅拌分别控制为35℃±1℃和70rpm。氮气层设定为12slpm并且顶空压力设定为5psig以维持用于细胞生长的厌氧环境。发酵pH值和细胞密度分别利用pH值和在线浊度探测器监测。生产发酵的三个期包括指数生长期、静止期和自溶期。据观察，将活性BoNT/A复合物释放至培养基中细胞自溶总是在35小时与发酵结束之间的时间发生。在发酵结束时，将培养物冷却至25℃以便进行收集。

一旦将发酵培养基冷却到25℃，就通过深度过滤使细胞碎片与A型肉毒杆菌神经毒素复合物分离，首先过滤通过5-0.9μm标称滞留分级梯度预过滤器以移除细胞碎片，并且接着过滤通过带正电荷的0.8-0.2μm标称滞留分级梯度以移除DNA(移除多达约80％)。两个过滤器在使用前都用20L注射用水(WFI)一起冲洗。进一步处理需要至少15L滤液，并且在处理中取样完成后去除任何过量材料。如果不立即利用超滤进行处理，那么滤液在4℃下储存。

在生物安全柜(BSC)内，使用来自GEHealthcare的中空纤维切线流过滤(TFF)膜将来自收集步骤的滤液从15L浓缩至5±0.5L。经过超滤的材料接着用10mM磷酸钠(pH6.5)缓冲液稀释至20L的最终体积。此材料通过使用两个管柱(阴离子接着阳离子)或三个色谱管柱(阴离子、阳离子并且接着疏水相互作用)进行纯化。如果不立即进行纯化处理，那么经过稀释并且经过超滤的收集材料在4℃下储存。

在尚茨法中，基于培养物生长的时间和可见观察结果结束培养步骤和开始发酵步骤。相比之下，在本实施例2方法中，培养步骤结束时间的确定是基于对培养物流体光学密度的分析，此确保培养物在发酵步骤开始时是处于对数生长期，并且允许将培养步骤的持续时间减至约8小时至约14小时。我们根据OD参数终止培养步骤使得所培养细胞的健康程度达到最强并且促进由发酵步骤产生稳固并且丰富的肉毒杆菌毒素。培养基在培养结束时的平均光学密度(在540nm下)为1.8AU。发酵步骤的平均持续时间为72小时，并且发酵培养基在发酵步骤结束时的平均最终浊度(A₈₉₀)为0.15AU。发酵步骤结束时20L发酵培养基(全肉汤)中所存在的A型肉毒杆菌毒素复合物的平均量(如利用ELISA所确定)为每毫升发酵培养基约64μgA型肉毒杆菌毒素复合物。

收集步骤使用深度过滤以移除细胞碎片和核酸，接着进行超滤和稀释来制备用于所述方法中的下一步骤的发酵培养基。此收集/细胞碎片清除在根本上不同于尚茨收集方法，所述尚茨收集方法使用酸化沉淀，接着进行微过滤和渗滤以浓缩和交换制剂中的缓冲液以供进行进一步处理。

下游步骤(纯化)

下游步骤包括将肉毒杆菌神经毒素捕捉于阴离子交换管柱上，从所述管柱洗提和通过在阳离子交换管柱上精制进一步与杂质分离，并且优选(在三管柱方法中)使含有所要肉毒杆菌神经毒素的洗提液通过第三管柱(优选疏水相互作用管柱，例如色谱)，接着使用切线流过滤(TFF)进行浓缩和缓冲液交换，和进行生物负载降低(例如通过使用0.2μm过滤器进一步过滤)制成针对冷储存(优选冷冻)优化的最终A型肉毒杆菌神经毒素复合物，和最终混配成A型肉毒杆菌神经毒素复合物药物组合物。色谱和过滤阶段的顺序意欲移除与产物和方法有关的杂质、移除潜在外源因子和控制最终A型肉毒杆菌神经毒素的A型肉毒杆菌神经毒素复合物浓度和缓冲基质以便提供更稳定的药品。

所进行的三管柱下游处理的更详细实施方案如下。使经过澄清(稀释)的超滤材料(20L，如上文所公开)通过50HQ阴离子交换色谱树脂，从阴离子交换管柱洗提所捕捉的肉毒杆菌神经毒素并接着流经20HS阳离子交换色谱树脂，使来自所述阳离子交换色谱树脂的洗提液流经PhenylSepharoseHP色谱树脂。来自HIC管柱的洗提液进行100kDa切线流过滤，接着进行0.2μm过滤。将所得A型肉毒杆菌神经毒素复合物冷冻以供储存。

在本实施例中，我们在下游处理的第一色谱步骤中使用填充至内径为约8cm且管柱高度为约15cm的管柱中的50HQ阴离子交换色谱树脂。整个50HQ管柱操作在环境温度下完成，并且流动是按向下方向。使用pH值步进变化从阴离子管柱洗提A型肉毒杆菌神经毒素复合物，其中带较多负电荷的组分(如核酸，例如DNA和RNA)和其它宿主细胞蛋白质保持结合于阴离子交换管柱。

阴离子交换步骤的详情为：使用50HQ管柱，使用0.1N氢氧化钠持续30分钟的最短接触时间(至少约3个管柱体积，每小时230cm)。管柱接着用50mM磷酸钠(pH6.5)缓冲液(至少5个管柱体积)平衡。接下来将经过澄清的经过超滤和稀释的材料(即，经过处理的溶解产物APF发酵材料)以每小时230cm加载至50HQ阴离子交换管柱上，随后以至少约20管柱体积的50mM磷酸钠(pH6.5)以每小时230cm洗涤直至管柱洗提液在280nm下的吸光度降至0.10AU，接着以50mM乙酸钠(pH4.8)以每小时230cm洗提。当280nm下的吸光度(A₂₈₀)升至至少约0.15AU并且通过峰最大值直至在拖尾边缘上等于或小于约0.2AU时，将产物池收集到含有1个管柱体积的50mM乙酸钠(pH4.8)的容器中。此洗提池在约2℃至约8℃下储存至多48小时。

本实施例2的下游处理中的第二色谱步骤使用填充至内径为8cm且管柱高度为5cm的管柱中的20HS阳离子交换色谱树脂。整个20HS管柱操作在环境温度下完成，并且流动是按向下方向。A型肉毒杆菌神经毒素复合物与20HS管柱树脂结合。接着使用盐步进变化从所述管柱洗提A型肉毒杆菌神经毒素复合物。与产物相关的杂质用洗涤缓冲液和去污溶液洗提。

阳离子交换步骤的详情为：使用20HS管柱，使用0.1N氢氧化钠溶液持续30分钟的最短接触时间(至少约3个管柱体积，每小时230cm)。管柱接着用50mM乙酸钠(pH4.8)缓冲液(至少约5个管柱体积)平衡。接下来将50HQ产物池(如上所述收集，新鲜或经过冷藏)加载至20HS管柱上。管柱接着用50mM乙酸钠(pH4.8)缓冲液(至少约3个管柱体积)洗涤并接着用50mM乙酸钠、150mM氯化钠(pH4.8)缓冲液再次洗涤。用50mM乙酸钠、250mM氯化钠(pH4.8)缓冲液以200mL/min从20HS管柱洗提A型肉毒杆菌神经毒素复合物，当A₂₈₀升至约≥0.1AU通过峰最大值直至洗提峰拖尾边缘的A₂₈₀降至拖尾边缘值≤0.1AU时，将洗提液转移至生物处理收集袋(含有1个管柱体积的50mMNaH₃C₂O₂，pH4.8)中。20HS产物池在环境温度下在收集袋中储存至多约6小时。

在本实施例2的三管柱色谱介质方法中，使来自第二(阳离子交换)管柱的洗提液通过HIC管柱。所用HIC管柱为填充至内径为约8cm且管柱高度为约5cm的管柱中的PhenylSepharoseHP疏水相互作用色谱树脂。整个PhenylSepharoseHP管柱操作在环境温度下完成，并且流动是按向下方向。接着使用递减盐步进变化从所述管柱洗提A型肉毒杆菌神经毒素复合物。杂质在加载期间用洗涤缓冲液和去污溶液洗提。

疏水相互作用色谱步骤的详情为：

PhenylSepharoseHP管柱最初用0.1N氢氧化钠溶液净化30分钟的最短接触时间(用至少约3个管柱体积的0.1N氢氧化钠溶液，以每小时200cm)。管柱接着用至少约5个管柱体积的50mM乙酸钠、0.4M硫酸铵(pH4.8)缓冲液平衡。接下来将20HS(阳离子交换管柱)产物池(如上所述)按1∶1与50mM乙酸钠、0.8M硫酸铵(pH4.8)缓冲液合并并且加载至PhenylSepharoseHP管柱上。管柱首先用至少约3个管柱体积的50mM乙酸钠、0.4M硫酸铵(pH4.8)缓冲液洗涤，并接着用50mM磷酸钠、0.4M硫酸铵(pH6.5)缓冲液洗涤。用10mM磷酸钠、0.14M硫酸铵(pH6.5)缓冲液从所述管柱洗提A型肉毒杆菌神经毒素复合物。当A₂₈₀升至≥0.05AU时，将洗提液转移至生物处理收集袋中。收集洗提液直至洗提峰拖尾边缘的A₂₈₀降至值≤0.05AU。PhenylSepharoseHP产物池在环境温度下在收集袋中储存至多约6小时。

使用切线流过滤系统将PhenylSepharoseHP色谱步骤产物池浓缩并渗滤至药品制剂缓冲液中。浓缩和渗滤步骤使用具有100kDa分子量截止膜的FiltronMinimate卡匣。经过配制的材料接着通过PallMini0.2μm过滤器以降低潜在生物负载量。如先前所述，UF/DF步骤将PhenylSepharoseHP产物池(HIC管柱的洗提液)浓缩至0.7g/L的BoNT/A复合物浓度并用10mM柠檬酸钾(pH6.5)缓冲液渗滤经过浓缩的材料。

所用超滤/渗滤方法的详情如下。UF/DF单元和Pall100kDa聚醚砜膜最初用至少5L注射用水(WFI)冲洗以移除填充溶液并且用至少200mL1N氢氧化钠溶液在再循环条件下净化至少10分钟，优选至少30分钟，以净化UF/DF单元。接下来将膜和UF/DF系统用足够体积的10mM柠檬酸钾(pH6.5)配制缓冲液平衡直至渗透物和滞留物pH值为pH6.5。其后将PhenylSepharoseHP产物池加载至切线流过滤卡匣上并将HIC洗提液浓缩至0.7g/L。浓缩步骤后，滞留物池以至少5个渗滤体积的药品配制缓冲液(10mM柠檬酸钾，pH6.5)在7.5psig(磅/平方英寸表压)的跨膜压力下渗滤。接着封闭渗透物出口且UF/DF系统运行至少2分钟，并且系统用50mL的10mM柠檬酸钾(pH6.5)配制缓冲液冲洗。冲洗后，通过测量离线A₂₇₈并且基于A₂₇₈读数测定滞留物池中BoNT/A复合物的浓度，用10mM柠檬酸钾(pH6.5)缓冲液将滞留物池的浓度调整至0.5g/L。浓度经过调整的滞留物池接着过滤通过PallMiniKleenpak0.2μm过滤器以降低潜在生物负载量。经过过滤的浓度经过调整的滞留物池在2℃-8℃下在收集袋中储存至多2天。

最终所获得的经过纯化的A型肉毒杆菌神经毒素复合物按每个小瓶700μL填充至1mL冷冻小瓶中并冷冻储存。填充操作在100级生物安全柜中在环境温度下进行。

下游处理(包括使用2个或3个色谱管柱)仅在1至3天内完成且所获得的A型肉毒杆菌神经毒素复合物在柠檬酸钾(pH6.5)缓冲液中以0.5g/L的浓度作为溶液冷冻储存。相比之下，先前技术尚茨下游(毒素纯化)处理使用多个过滤、沉淀、提取和离心步骤来纯化A型肉毒杆菌神经毒素复合物并且需要1-2周来完成仅下游步骤，而且所得药品(回收的肉毒杆菌神经毒素)作为硫酸铵悬浮液以约2.7g/L的浓度冷冻储存。使用色谱替代沉淀和处理时间减少得到显著改良的一致下游处理，如本文所公开。

根据一个方面，基于植物的产物(如基于大豆的产物)的浓度可以是培养基和发酵培养基中的II型大豆蛋白胨或SE50MK(一种犹太人食用的大豆蛋白胨)。菌种培养基中的可在10-200g/L之间的范围内。菌种培养基中的浓度优选在15-150g/L之间的范围内。菌种培养基中的浓度最优选大致在约20-30g/L之间或为其间的量。菌种培养基中葡萄糖的浓度可在0.1g/L与20g/L之间的范围内。葡萄糖的浓度优选在0.5-15g/L之间的范围内。培养基中葡萄糖的浓度最优选为约10g/L。酵母提取物的量可为约5-20g/L，更优选为约10-15g/L或其间的量。举例来说，肉毒梭菌生长前培养基的pH值可为约pH7.0-7.5，或其间的值，优选为pH7.3。

举例来说，生产发酵培养基中的量可在10-200g/L之间的范围内。发酵培养基中的浓度优选在15-150g/L之间的范围内。发酵培养基中的浓度最优选大致在约20-40g/L之间或为其间的量。发酵培养基中葡萄糖的浓度可在0.1g/L与20g/L之间的范围内。葡萄糖的浓度优选在0.5-15g/L之间的范围内或为其间的量。并非必然但如上所述，葡萄糖可连同发酵培养基的其它组分一起进行高压灭菌。生长前发酵培养基的pH值水平可为pH7.0-7.8，优选为约7.0-7.5或其间的值，更优选为pH7.3。

如图1的右手侧所示，本实施例2中用于获得生物活性肉毒杆菌神经毒素的两管柱APF方法包括以下步骤：(a)在菌种/培养瓶中培养细菌，如来自APFWCB小瓶的肉毒梭菌细菌，(b)接着在具有APF发酵培养基的发酵罐(毒素生产发酵罐)中发酵肉毒梭菌细菌以扩增细胞系，进行发酵和肉毒杆菌毒素生产直至达到所要细胞溶解期。接着，(c)收集(例如通过过滤进行澄清)APF发酵培养基以获得收集的发酵培养基，(d)进行浓缩和稀释获得经过稀释的所收集的发酵培养基，使其(e)流经捕捉管柱以移除杂质，(f)使来自捕捉管柱的洗提液与精制管柱接触以进一步移除杂质，且任选与第二精制管柱接触，(g)对精制管柱洗提液进行浓缩和缓冲液交换，(h)接着进行生物负载降低过滤和(i)填充小瓶。

在一个实施例中，发酵体积是20L，所有步骤的总处理时间仅为4至6天，且获得高肉毒杆菌神经毒素产率。

以下提供本发明范围内的具体实施方案的更多细节。发酵步骤是在APF培养基中使用30L不锈钢发酵罐进行。

在以下本实施例中，使用少得多的发酵培养基体积，而仍以高产率获得高效力A型肉毒杆菌神经毒素复合物。通过使用以下方案，仅需要例如20L或更少的APF发酵培养基，而非先前对于获得肉毒杆菌神经毒素来说产生商业上适用量所需要的通常较大体积(例如115L)的发酵培养基。

具有气闸的MACS厌氧工作区(DonWhitley)提供用于操作厌氧生物体的缺氧环境。通过包括内门和外门的舷窗系统进入和退出培养室。单元受到温度控制以在培养室内维持使用者的设置。恒湿控制冷凝板确保有效移除培养室内的过量水分。培养室被照亮以便操作者使用和警示：低气压、连续气流和缺少电力条件。培养室配备有HEPA过滤器以降低厌氧培养室中的有生命和无生命颗粒水平。厌氧条件利用“Anotox”和钯去氧“D”催化剂氛围洗涤系统维持。收集来自冷凝板的冷凝水并用管道输送到外部储集器，在外部储集器中将其移除。

如上文所公开，制备APFWCB使用APF方法，其中细胞库小瓶在低于-135℃下储存。在培养基接种前APFWCB细胞库小瓶在室温下解冻约15分钟，随后如上文所公开进行单一培养步骤以建立“菌种”培养物。此举在模块化氛围控制系统中始终利用无菌技术进行以便使生物负载量最低。模块化氛围控制系统在用APFWCB小瓶内容物接种完成的菌种培养物之间加以清洁。使用1N盐酸和1N氢氧化钠(用于调整pH值)、无水D(+)葡萄糖(MallinckrodtBaker，目录号7730，4.00g)、II型大豆蛋白胨(SPTII)(Marcor，目录号1130，8.00g)、400.0mL注射用水(WFI)和酵母提取物(YE)(BD目录号212730，4.00g)制备培养基。用500mL量筒测出300mLWFI制备II型大豆蛋白胨和酵母提取物溶液并且倾入菌种培养瓶中。菌种培养瓶置于搅拌器上并启动搅拌器。添加8.00gSPTII和4.00g酵母提取物至菌种培养瓶中并进行混合直至溶解。如果混合后溶解未完全，那么在较低温度设置下加热混合物。测量pH值并调整至约7.30±0.05。用WFI将培养基溶液体积调整至约360mL。菌种培养瓶充分通气以使蒸汽和气体转移。用100mL量筒测出约30mLWFI来制备10％葡萄糖溶液(w/v)并置于预先组装好的葡萄糖添加瓶中，将所述添加瓶置于搅拌器上并启动搅拌器。添加约4.00g葡萄糖至葡萄糖添加瓶中并进行混合直至溶解(必要时使用低温加热以便溶解)并且用WFI将葡萄糖溶液补足(quantitysufficient；qs)至40mL。接着用通气盖松散地盖上所述葡萄糖添加瓶。葡萄糖和菌种培养瓶均在123℃高压灭菌30分钟以便灭菌。灭菌后，两个物品均从高压釜移出并放置在生物安全柜中进行冷却。无菌冷却后，将葡萄糖溶液的10％转移至含有酵母提取物和大豆蛋白胨II溶液的菌种培养瓶中并进行混合，由此提供完成的菌种培养瓶。

将此完成的菌种培养瓶放置于预先清洁的MACS中(其中放置准备好的厌氧指示器)。松开完成的菌种培养瓶的盖子。接着将完成的菌种培养瓶置于MACS内的搅拌板上(搅拌板启动至约150rpm)并且完成的菌种培养瓶中的培养基在约34.5℃+/-1℃下在MACS内还原至少12小时，其后取出1mL培养基空白作为样品用于光学密度测量(用于在540nm下测定生物量)。然后，接种MACS(厌氧)中的完成的菌种培养瓶。APFWCB培养小瓶是从冷冻细胞库获得并带进MACS中。小瓶解冻约10-15分钟，随后将约400μL小瓶内容物直接置于完成的菌种培养瓶中的培养基中。完全松开完成菌种培养瓶上的盖子并将所述盖子搁置在所述瓶子的顶部且将搅拌速度设置为150rpm。在MACS孵育至少约11小时之后，如下文所述进行发酵生产。

检查和校准发酵罐(如30L不锈钢发酵罐)的探测器(例如氧化还原探测器、pH值探测器、浊度探测器，例如来自BroadleyJames和Optek)，并插入其相应发酵罐端口并适当紧固。例如，发酵罐可以是由30L容积发酵罐容器、搅拌器驱动系统、用于设施连接的管道总成(CIP、清洁蒸汽、CDA、氮气、氧气、处理冷却水、生物废料和厂蒸汽)、仪器(pH值、温度、压力、氧化还原、光学密度和质量流量)和四个蠕动泵组成的ABEC30L(VT)发酵罐系统。可使用Allen-Bradley可变频率驱动器(VFD)控制底部安装的搅拌器的速度。系统的半自动和自动控制由Allen-BradleyControlLogixPLC根据编程操作。系统设计成在发酵操作期间提供培养物温度、压力、pH值和氧化还原作用的闭环PID(比例-积分-微分)控制。利用Allen-Bradley(开放式装置级网络)进行控制和在滑轨上与装置和感应器通讯。

对于无菌保持、平衡、运行和收集模式，利用以下设定点操作搅拌、温度、压力和氮气层。

对于无菌保持和平衡模式：

控制参数	设定点和范围
		搅拌	100rpm±10
氮气层	12SLPM±2
		发酵罐压力	5psig±1
发酵罐温度	35±1℃
		氧化还原	-390至-150mV

对于运行模式：

控制参数	设定点和范围
		搅拌	70rpm±5

氮气层	12SLPM±2
		发酵罐压力	5psig±1
发酵罐温度	35±1℃

对于收集模式：

控制参数	设定点和范围
		搅拌	150rpm±10
氮气层	10SLPM±2
		初始发酵罐压力	0psig
发酵罐温度	25±1℃

为制备发酵培养基，需要的材料包括无水D(+)葡萄糖(MallinckrodtBaker，目录号7730，300.0g)、II型大豆蛋白胨(SPTII)(Marcor，目录号1130，650.0g)、注射用水(WFI，13L)和酵母提取物(YE)(BD目录号212730，240.0g)以及标准天平、大玻璃瓶(例如20L)、玻璃瓶(5L)、量筒、搅拌棒和搅拌器。将约10LWFI连同搅拌棒添加至大玻璃瓶中。将大玻璃瓶置于搅拌器上并启动搅拌器，其后添加约650.0gII型大豆蛋白胨以及约240.00gYE。用WFI将发酵培养基补足(quantitysufficient；q.s)至13L并盖上大玻璃瓶。接着通过添加约2LWFI至5L玻璃瓶(其中具有搅拌棒)中来制备10％葡萄糖溶液(w/v)。放置在搅拌器上并让棒旋转，将约300.00g葡萄糖添加至瓶中，并进行混合直至溶解。用WFI将葡萄糖溶液补足至3L并盖上瓶子，由此提供10％葡萄糖溶液。

将大玻璃瓶中的发酵培养基添加至发酵罐中并记录蒸汽灭菌前的发酵罐体积，并将操作顺序推进至发酵。在SIP(蒸汽灭菌(steaminplace))(122℃，+/-1℃)结束时，记下SIP后的发酵罐体积。将包括有管伸出的容器与串联0.2μm过滤器(PALLCorp.)和蠕动泵的葡萄糖添加总成连接至发酵罐并对管线进行SIP并让其冷却。打开添加阀端口并添加约3L葡萄糖(过滤灭菌)，且向葡萄糖添加瓶中添加适量WFI(过滤灭菌)以将总发酵罐体积补足至20L且通过相同葡萄糖过滤器管线泵入发酵罐中。关闭添加阀端口。其后用无菌1N氢氧化钠或1N盐酸将生产发酵培养基的pH值调整至约pH7.3+/-0.05，需要时对添加管线进行SIP。此后，设定用于无菌保持的参数并保持约12小时，随后进行接种。使用代谢物分析仪测量培养基的起始葡萄糖浓度并记录葡萄糖浓度。

如上所述，在菌种培养物孵育结束时(约11±1小时)，取1mL样品用于进行光学密度(OD)测量。OD使用分光光度计在540nm下离线测量，并且如果记录到OD值在适当范围内，那么就将培养物用于发酵。相应地将发酵罐浊度探测器归零。将菌种接种物瓶从厌氧培养室带至发酵罐和菌种培养物转移总成(一种其中具有APF培养基的菌种容器，所述容器具有培养物接种物转移管线以及可从PALLCorp.或Millipore获得的无菌Kleenpak^TM连接器总成替代发酵罐的阀门)，并且固定连接至泵1的管道。使发酵罐压力降至2psig并将菌种接种物瓶的整个体积泵至发酵罐中。在接种结束时，记录来自发酵罐的在线吸光度单位(AU)，将发酵罐参数设定为运行模式并记录时间。

接着进行发酵(发酵操作可进行约60小时至约80小时，优选约68小时至约76小时，最优选约72小时)，同时在例如24小时和48小时从发酵罐取样，同时维持无菌条件。对至少一个在发酵期间取得的样品进行的测试可包括(但不限于)例如离线光学密度测量、葡萄糖测量、ELISA、SDS-PAGE、蛋白质印迹。发酵结束时(结束时发酵肉汤体积为例如约18-19L)，可获取样品(用于进行测试，例如离线光学密度测量、葡萄糖测量、ELISA、SDS-PAGE、蛋白质印迹和DNA/RNA定量)。

在发酵结束时，记录在线光学密度、EFT(所消耗的发酵时间)和发酵结束时间，以及搅拌(rpm)、温度(℃)、压力(psig)和氮气层(slpm)和氧化还原(mV)。接着，对生产发酵肉汤进行收集，即，生产发酵肉汤通过过滤进行澄清，由此例如收集到约15L滤液。发酵参数设定为收集并准备用于澄清的过滤器总成(CUNO，3M过滤)，所述总成包括预过滤器、深度过滤器和至少一个压力表。预过滤器和深度过滤器用约20L注射用水冲洗。冲洗后，将过滤总成连接至发酵罐的收集/排液端口。使发酵罐温度降至约25℃，随后开始发酵肉汤的澄清(记录澄清起始时间、初始在线OD、初始pH值、初始温度和初始发酵罐体积)。发酵罐中的压力在过滤期间以约每10分钟约1psi(磅/平方英寸)的速率升高，直至达到约6psi的压力，此时保持压力直至收集结束。此过滤器移除APF发酵培养基中约80％的RNA/DNA(其余基本上在稍后的色谱步骤期间移除，如下文所论述)，因此不再像从前依赖/使用RNA酶和/或DNA酶来从发酵肉汤移除移除所述组分。每收集2L滤液时监测处理参数(如预过滤器入口压力、深度过滤器入口压力、发酵罐压力、搅拌和滤液体积)，结束时记录澄清结束时间和所收集滤液的体积。完成收集步骤后，对系统进行去污和清洁。

滤液大玻璃瓶带至BSC进行取样，从其中取得约≤10mL滤液样品用于进行离线OD测量和其它分析(例如ELISA、SDS-PAGE、DNA/RNA和蛋白质印迹)。

滤液接着进行超滤/稀释。组装切线流过滤器(TFF)单元总成。TFF单元用WFI以每分钟约2L的优选速率冲洗约90分钟，且接着TFF单元通过以0.1N氢氧化钠(再循环)流过约60分钟进行净化，此后以1L10mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)流过，接着以WFI冲洗约30分钟。接着使来自收集步骤的滤液(约15L)通过TFF(此举在生物安全柜中进行)，从而使滤液浓缩至约5L+/-0.5L(浓缩步骤以每分钟约2L且在约5psig的跨膜压力下进行)。可获取渗透物的样品并进行例如ELISA、dsDNA、SDS-PAGE和蛋白质印迹测试。浓缩至约5L+/-0.5L后，接着即用约15L经过TFF以每分钟约2L的速率无菌过滤的10mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)将滞留物池稀释至约20L。接着可再次获取样品并进行例如ELISA、DNA/RNA、SDS-PAGE和蛋白质印迹测试。超滤/稀释材料(滞留物)在4℃下储存。

使用后，所有系统均使用1N氢氧化钠或灭菌(蒸汽)温度进行去污并进行清洁。

使用以下材料、装备和程序制备下文阐述用于示例性方法的溶液、缓冲液等，即用于纯化从实施例2方法获得的发酵培养基以便获得经过纯化的A型肉毒杆菌神经毒素复合物。所用示例性缓冲液(经过0.2微米真空过滤器过滤并且其导电性以mS/cm测量用于记录储存)包括：10mM磷酸钠，pH6.5；50mM磷酸钠，pH6.5；50mM乙酸钠，pH4.8；50mM乙酸钠、170mM氯化钠，pH4.8；50mM乙酸钠、250mM氯化钠，pH4.8；50mM乙酸钠、1M氯化钠，pH4.8；50mM乙酸钠，pH4.0；和10mM柠檬酸盐，pH6.5。

以下为用于从实施例2方法纯化和获得A型肉毒杆菌神经毒素的操作的实施例。所有产物接触部分设计和构造成确保其不具反应性和不具吸收性。另外，所有装备设计成允许利用单次使用一次性系统或设计和构造成便于按证明有效的方法进行净化、清洁和去污。系统和滑轨设计成不与产物接触，而流径设计成为单次使用一次性的，包括色谱管柱和所有相关管道。色谱组件从AlphaBio获得并且UF/DF组件从ScilogInc.获得。所用色谱设置包括用于以可变速度驱动递送溶液的蠕动泵、具有5个入口的入口阀歧管、具有一组3个自动阀的管柱阀歧管、具有3个出口的出口阀歧管、管柱流出物监测(包括pH值、导电性和UV)、基于UV吸光度的峰收集和完成纯化操作所需要的仪器和控制。控制系统具有设计用于控制纯化过程的软件和硬件。指令和数据通过HMI(人机界面)终端输入。操作者通过在HMI输入指令起始所有自动处理功能并且监测和调整处理参数(如进料流速率、压力、导电性、pH值、UV吸光度和个别阀门位置)。

UF/DF系统包括一个再循环泵、渗滤泵、2个天平和一个切线流过滤器(TFF)支架。再循环泵与3个一次性压力感应器和一个天平(定位于渗透物储集器下方)接合以控制流动速率以便基于渗透物储集器重量维持规定跨膜压力和停止。渗滤泵与第二天平(定位于滞留物储集器下方)接合以便基于维持滞留物储集器的恒定重量来起始和停止。

浓缩和稀释来自收集步骤(收集不含动物蛋白质的发酵培养基)的滞留物材料后，将所述材料加载至阴离子交换管柱上。以下为用于填充和测试适用于实施例2两管柱方法中的阴离子交换管柱的程序。

所有三个色谱步骤使用预填充管柱。首先，使进料材料(已进行超滤/稀释的所收集的APF培养基)通过阴离子交换管柱(来自ABI的Poros50HQ，如上所述)。利用至少5个管柱体积(CV)的50mM磷酸钠(pH6.5)来平衡阴离子交换管柱(在本实施例中为捕捉管柱)。

平衡后，进行加载步骤，其中将进料材料(收集步骤后收集的发酵肉汤，例如约20L)以例如约200cm/hr的速率加载至阴离子交换管柱上。0.5管柱体积的所加载材料已通过阴离子交换管柱后，将流过(FT)池收集至容器(如聚醚砜容器)中，同时使毒素复合物结合于阴离子交换管柱材料。此步骤后接着为洗涤步骤，其中使至少约15个管柱体积的洗涤缓冲液(例如pH值为6.5的50mM磷酸钠)通过阴离子交换管柱。当在管柱出口处实时测得的UV降至低于或等于约80mAU时停止洗涤步骤。记录洗涤缓冲液体积和流过/洗涤池体积，且取1mL的流过/洗涤池样品并测试例如毒素浓度、核酸含量、全细胞蛋白质、SDS-PAGE、qPCR、2DLC和ELISA。

下一步骤为洗提步骤，其中将洗提缓冲液(例如50mM乙酸钠，pH4.8)泵至阴离子交换管柱上。当管柱出口处的实时UV读数升至约150mAU或更高时，开始将洗提液收集至预填充有1CV洗提缓冲液(50mM乙酸钠，pH4.8)的容器中。当UV读数降至小于或等于200mAU时(此时所收集的体积在约1至约2CV之间)，停止洗提液池的收集。接着使用1N氢氧化钠对色谱系统进行去污和清洁。

来自阴离子交换管柱的洗提液池接着准备用于添加至阳离子交换管柱上。记录阴离子交换洗提液体积、pH值、导电性和进料温度并用1CV的50mM乙酸钠(pH4.8)稀释来自阴离子交换管柱的洗提液池。

流过阴离子交换管柱后，进行阳离子交换色谱操作。阳离子交换管柱(例如20HS)用至少5CV的平衡缓冲液(50mM乙酸钠，pH4.8)平衡。平衡后，将经过稀释的来自阴离子交换管柱的洗提液池加载至阳离子交换管柱上并记录总加载体积。在0.5管柱体积的所加载稀释洗提液池已通过阳离子交换管柱后，收集流过(FT)池。进行阳离子交换管柱的第一次洗涤，其中使约3-5CV的50mM乙酸钠(pH4.8)通过阳离子交换管柱(记录所用第一洗涤缓冲液的体积)。进行第二次洗涤，其中抽吸约3CV的170mM氯化钠、50mM乙酸钠(pH4.8)通过管柱，将此洗提液收集至标记“洗涤2峰”的新容器中。当UV读数升至大于或等于50mAU时开始收集。收集1CV并记录所用第二洗涤缓冲液体积。

利用洗提缓冲液(例如含250mM氯化钠的50mM乙酸钠(pH4.8))从阳离子交换管柱洗提毒素复合物批料，所述缓冲液泵至阳离子交换管柱上。当洗提的UV读数达到至少约100mAU时，开始将洗提液收集至预填充有稀释缓冲液(40mL的100mM磷酸钾(pH6.8)和60mL的10mM柠檬酸钾(pH6.5))的容器中。继续从阳离子交换管柱收集洗提液直至UV读数降至约100mAU或更低。记录稀释后洗提液的总体积。接着对阳离子交换色谱系统进行去污和清洁。

从阳离子交换管柱洗提后，洗提液进行过滤。利用使用三个100KMWCO膜(SartoriusAG，Goettingen，Germany)彼此上下堆叠的切线流过滤(TFF)系统。记录阳离子交换洗提液池初始体积，在渗滤/平衡和净化溶液描述中也进行同样的记录。例如，渗滤溶液可为10mM柠檬酸钾(pH6.5)并且净化溶液可为0.1N氢氧化钠。给系统设置连接上来自含有来自阳离子管柱(IAPF)或管柱(FAPF)的洗提液的储集器的一个管，所述洗提液含有肉毒杆菌毒素，通过超滤泵头部进入切线流过滤膜的入口。来自切线流过滤膜的渗透物出口的第二管连接至超滤(UF)渗透物容器。来自切线流过滤膜的滞留物出口的管紧固于滞留物储集器，并且来自渗滤(DF)缓冲液通过渗滤泵头部并且进入滞留物储集器的第四管也加以紧固。通过用至少约720mL注射用水(WFI)冲洗膜对系统的储存缓冲液进行冲洗，同样对膜进行冲洗，其中滞留物作为废料导出，其后膜用至少约4200mL注射用水进一步冲洗，其中滞留物再循环至储集器。此后，通过用至少约200mL的1N氢氧化钠冲洗膜来进行膜净化(如果必要的话)，其中滞留物作为废料导出，接着用至少约200mL的1NNaOH冲洗膜，其中滞留物再循环至储集器，持续至少30分钟。接着通过用平衡缓冲液(pH值为6.5的10mM柠檬酸钾)冲洗膜进行平衡，其中滞留物作为废料导出，直至滞留物和渗透物pH值在平衡缓冲液pH值的+/-0.2个单位以内(例如在pH6.5的+/-0.2个单位以内)。

测定材料(来自阳离子交换管柱的洗提液(产物池))的浓度，以了解稀释度或浓度(示例性加工)是否适当(示例性目标浓度可为约0.7mg/mL)。利用10mM柠檬酸钾(pH6.5)完成稀释。确定0.7mg/mL产物浓度的目标体积(目标体积＝(起始浓度/起始体积)/0.7mg/mL)。

将产物池(来自阳离子交换管柱的洗提液(经过相应处理或未处理))加载至膜上并使系统(TFF系统)在无背压下再循环(其中渗透物出口封闭)至少2分钟，其后缓慢打开渗透物阀，同时将滞留物背压阀调整至约7psig的目标跨膜压力。对于稀释，添加10mM柠檬酸钾(pH6.5)至目标体积，并移动至渗滤上而不进行超滤；浓缩时，开始超滤。对于渗滤：将渗透物收集至新容器中(目标渗滤体积为5×渗滤体积)并用至少5倍渗滤体积的10mM柠檬酸钾(pH6.5)进行渗滤。以至少10分钟的时间间隔收集渗滤处理数据(渗透物重量g/体积mL、入口压力(psig)、滞留物压力(psig)、渗透物压力(psig)和跨膜压力(psig))。对于再循环/和冲洗：在渗透物出口过滤器关闭下，系统在无背压下再循环/操作至少2分钟，并且系统用至少20mL的10mM柠檬酸钾(pH6.5)冲洗。产物池包括滞留物和冲洗液。可从产物池获得样品并进行验证分析，包括例如278nm下的UV、SDS-Page、LcHPLC。SE-HPLC、qPCR、RP-HPLC、Native-Page、AUC、鲎变形细胞溶解产物、蛋白质印迹和ELISA测试。对于使用后清洁，将系统用1N氢氧化钠冲洗，再循环至少10分钟，此后系统用0.1N氢氧化钠冲洗并在其中储存0.1N氢氧化钠。

接着进行无菌过滤和填充以便储存和等分神经毒素批料。使用10mM柠檬酸钾(pH6.5)进行浓度调整以根据冲洗后样品将毒素浓度调整至约0.5mg/mL。如果毒素浓度低于约0.5mg/mL，那么无需进行浓度调整。

使用无菌移液管，于各无菌15mL/1.5mL样品管中制备10mL/0.75mL等份试样。产物容器用手轻缓搅拌并将所需量的溶液(含有药品批料，即肉毒杆菌毒素批料)转移至各小瓶中。样品在2℃-8℃冰箱中储存最多5天或者将0.75mL滤液产物池转移至冷冻小瓶中。冷冻小瓶在-70℃+/-5℃下储存。

实施例3

混配方法

适于施用于患者的药物组合物可通过将从实施例2方法获得的肉毒杆菌神经毒素与一种或多种赋形剂混配来制备。赋形剂可用于使肉毒杆菌神经毒素在混配过程中和在使用前的后续储存时期中稳定。赋形剂还可充当增积剂和/或用于向药物组合物提供特定张力。混配需要从实施例2方法获得的肉毒杆菌神经毒素的多倍稀释，与一种或多种赋形剂(如白蛋白[如人血清白蛋白或重组人白蛋白]和氯化钠)混合由此形成毒素组合物，和制备毒素组合物的储存和运输稳定形式，如通过冻干、冷冻干燥或真空干燥组合物来制备。因此，将约1.5至1.9ng实施例2获得的A型肉毒杆菌毒素复合物与0.5毫克重组人白蛋白(DeltaBiotechnologies)和约0.9毫克氯化钠通过将这三种成分混合到一起随后进行真空干燥来加以混配。真空干燥可在约20℃至约25℃下、在约80mmHg的压力下进行约5小时，此时将用于进行此等组分的真空干燥的小瓶在真空下密封并加盖，由此获得具有约100个单位的A型肉毒杆菌神经毒素复合物的小瓶。所得固体(粉状)真空干燥产物在使用时用生理盐水(0.9％)复原并用于治疗具有各种适应症(如颈部张力障碍和多汗症)的患者。冻干、真空和冷冻干燥制备所混配肉毒杆菌神经毒素的储存和运输稳定形式。

在另一个实施例中，将约1.5-1.9ng的A型肉毒杆菌毒素批料与约0.5毫克人血清白蛋白(Baxter/Immuno、Octapharma和Pharmacia&Upjohn)和约0.9毫克氯化钠通过将这三种成分混合在一起随后进行真空干燥加以混配。示例性真空干燥可在约20℃至约25℃下、在约80μmHg的压力下进行约5小时，此时将用于进行此等组分的真空干燥的小瓶在真空下密封并加盖，由此获得具有约100个单位的肉毒杆菌毒素的小瓶。所得固体(粉状)真空干燥产物在使用时用生理盐水(0.9％)复原并用于治疗具有各种适应症(如颈部张力障碍和多汗症)的患者。另外，肉毒杆菌毒素药物组合物可含有例如人血清白蛋白和/或乳糖。在一个实施例中，可将约1.5-1.9ng的A型肉毒杆菌毒素批料与约125微克人血清白蛋白和2.5毫克乳糖混配并进行真空干燥、冻干或冷冻干燥以获得例如储存稳定性。在另一实施例中，可将约1.5-1.9ng通过本文公开的方法获得的肉毒杆菌神经毒素与约10mg海藻糖和约0.5mg血清白蛋白(如天然或重组人血清白蛋白)和任选约1毫克甲硫氨酸组合以提供约100个单位的肉毒杆菌毒素干燥产物。此组合物可进行冻干并在稍后在使用前用例如约1mL蒸馏水或无菌无防腐剂盐水(0.9％注射用氯化钠)复原。在具体实施例中，肉毒杆菌毒素药物组合物可包括蔗糖，如在示例性制剂中具有约1.5-1.9ng通过本文公开的方法获得的肉毒杆菌神经毒素与20％人血清白蛋白和蔗糖组合，所述组合物也可冻干以提供约100个单位的A型肉毒杆菌毒素，并且稍后用无防腐剂盐水(体积为例如0.5mL至约8.0mL)复原。在一个具体实施例中，可将200个单位的肉毒杆菌神经毒素与每毫升约10mg蔗糖和2mg人血清白蛋白组合，并且将所得组合物置于小瓶中并冷冻干燥，稍后在使用前用生理盐水复原。

另外，混配还可利用可通过本文公开的IAPF方法获得的A型肉毒杆菌毒素复合物的神经毒性组分(即，A型肉毒杆菌毒素复合物的约150kDa组分，不含复合蛋白质)。在从相关非毒性蛋白质(例如HA、NTNH)纯化约150kDa神经毒性组分的一种方法中，通过Tse等(1982)(Goodnough，M.C.，1994，Thesis，UW，Wis.)的方法的修改形式从复合物的相关非毒性蛋白质纯化A型神经毒素。通过我们的IAPF方法(其利用2管柱阴离子-阳离子或3管柱阴离子-阳离子-HIC步骤，如上文所论述)获得肉毒杆菌神经毒素复合物从DEAE-SephadexA50(SigmaChemicalCo.，St.Louis，Mo.)pH5.5管柱回收并通过每100mL添加39g固体硫酸铵使其沉淀。沉淀的毒素复合物通过离心进行收集，以25mM磷酸钠(pH7.9)进行透析，并施加至用相同缓冲液平衡的DEAE-SephadexA50管柱上。使神经毒性组分与复合物的非毒性蛋白质分离，并用线性0-0.5M氯化钠梯度从管柱洗提。经过部分纯化的神经毒素组分在pH7.9下从DEAE-SephadexA50管柱回收，并以25mM磷酸钠(pH7.0)透析。经过透析的毒素于25mM磷酸钠(pH7.0)中施加至SP-SephadexC50(SigmaChemicalCo.)上。污染材料在所述条件下不与管柱结合。纯神经毒素(约150kDa组分)用线性0-0.25M氯化钠梯度洗提。约150-kDa纯神经毒素可通过金属亲和色谱、凝胶过滤或蛋白质色谱的其它方法进行进一步纯化。如上所述，此纯神经毒素(肉毒杆菌毒素复合物的约150kDa神经毒性组分)可与上文所论述的各种赋形剂(例如血清白蛋白、蔗糖、乳糖、氯化钠、海藻糖等)一起冻干、真空或冷冻干燥。

通过我们的IAPF方法获得的肉毒杆菌神经毒素复合物批料可以众多方式混配。公开各种肉毒杆菌毒素制剂的示例性专利，如美国专利No.6,087,327(公开用明胶配制的A型和B型肉毒杆菌毒素的组合物)；美国专利No.5,512,547(Johnson等)的名称为″PharmaceuticalCompositionofBotulinumNeurotoxinandMethodofPreparation″于1996年4月30日颁予，并且要求包含白蛋白和海藻糖并且在37℃储存稳定的纯A型肉毒杆菌制剂；美国专利No.5,756,468(Johnson等)在1998年5月26日颁予(″PharmaceuticalCompositionsofBotulinumToxinorBotulinumNeurotoxinandMethodofPreparation″)，并且要求包含硫烷基、白蛋白和海藻糖并且可以在25℃与42℃之间储存稳定的冻干肉毒杆菌毒素制剂；美国专利No.5,696,077(Johnson等)的名称为″PharmaceuticalCompositionContainingBotulinumBComplex″于1997年12月9日颁予，并且要求包含B型复合物与蛋白质赋形剂的冷冻干燥无氯化钠B型肉毒杆菌复合物制剂；和美国专利申请公布第20030118598号(Hunt)公开使用各种赋形剂(如重组白蛋白、胶原蛋白或淀粉)来稳定肉毒杆菌毒素(所有所述公布的美国专利申请或美国专利的全文以引用的方式并入本文)，均提供可用于混配由我们的IAPF方法提供的肉毒杆菌神经毒素批料的各种适用制剂/赋形剂的实施例并且提供药物组合物。

所获得的肉毒杆菌毒素复合物可在pH7-8缓冲液中以使非毒素复合物蛋白质与肉毒杆菌毒素分子解离从离子交换管柱洗提，由此提供(取决于所发酵的肉毒梭菌细菌的类型)具有约150kDa分子量和1-2×10⁸LD₅₀U/mg或更高比效力的A型肉毒杆菌毒素神经毒性组分；或具有约156kDa分子量和1-2×10⁸LD₅₀U/mg或更高比效力的经过纯化的B型肉毒杆菌毒素；或具有约155kDa分子量和1-2×10⁷LD₅₀U/mg或更高比效力的经过纯化的F型肉毒杆菌毒素。

本发明提供许多益处。首先，实施例2的两管柱和三管柱方法不再使用动物来源试剂和介质(例如酪蛋白水解产物和哥伦比亚血液琼脂板)，因此显著降低患者暴露于朊病毒样病原体或其它感染原的理论风险。其次，实施例2的两管柱和三管柱色谱方法(和相关系统和装置)高度可再现，如由极佳批料间一致性所证明。此改良在需要用含肉毒杆菌毒素的市售化合物重复治疗若干年的患者中转变成更一致的临床特征。对来自本文公开的IAPF方法(2管柱或3管柱)的药品(肉毒杆菌神经毒素)进行的分析研究揭示较低的蛋白质和核酸杂质负载量。此较低蛋白质杂质负载量转变成较低免疫原性(抗体产生)风险。另外，IPAF方法的纯度提高转变成通常与生物药物有关的非特异性症状(例如鼻咽炎、上呼吸道症状、肌肉骨骼症状、头痛等)的发生率较低。此外，此方法的规模缩小方面的改良降低实验室和制造设施员工的BoNT/A暴露风险。

本发明的示例性优势包括例如：

1.因为方法中没有使用从动物来源(例如人或动物)获得的组分或物质，消除了DNA酶和RNA酶、哥伦比亚血液琼脂板、酪蛋白的使用(例如在澄清/收集步骤期间替换为带电过滤和现代色谱技术；直接用来自工作细胞库的细胞接种培养基，即预先选择细胞并在APF培养基中繁殖/维持；和培养瓶和发酵培养基替换为II型大豆蛋白胨作为蛋白胨源。)，因此安全性得到提高。

2.每10L发酵培养基可获得约50mg至约200mg之间的高品质A型肉毒杆菌毒素。

3.经过纯化的毒素批料是从稳固、一致、可缩放、可验证并且符合cGMP的方法获得。稳固意谓所述方法即使在一个或多个处理参数变化约±10％时也能够再现。可再现意谓所述方法可再现地提供经过纯化的毒素的一致产率。符合cGMP意谓所述方法可容易地转化成符合FDA所要求的当前良好操作规范的制造方法。

4.最终纯化的肉毒杆菌毒素复合物的效力满足或超过从尚茨法或经过修改的尚茨法获得的经过纯化的肉毒杆菌毒素复合物的效力(例如通过MLD50测定所测得)。

5.用色谱步骤替换任何沉淀步骤来纯化肉毒杆菌毒素复合物批料，此举改良纯化方法的特异性。

6.经过改良的新方法有利于减小规模，从而导致改良的操纵和达成大于95％的操作成功率(例如从利用110L-120L发酵培养基的典型体积缩减至约10L至约50L，甚至缩减至约2L至约30L发酵培养基或其间的量)。药品批料的典型当前生产规模是115L非APF发酵培养基，并且作为本发明的一个方面已缩减至20L发酵培养基。此规模缩减是因BoNT/A复合物的合成和细胞释放以及整个纯化步骤的总体产率得到优化而成为可能，从而获得与需要例如5×或甚至更多发酵体积(例如115L)的先前方法所获得类似量的最终肉毒杆菌毒素批料(药品)。此缩减的规模有利于更容易地管理发酵工作体积并因此使操作者暴露于BoNT/A复合物的潜在风险降至最低，此为一个重要的操作和安全性优势。

7.由于BoNT/A复合物的潜在致死性质，因此在本文所公开的整个制造过程中实施封闭系统。不同于先前技术方法，根据本发明的方面生产的药品材料在单元操作之间转移期间不会暴露于环境；所有操作都完全封闭。

8.本文公开的肉毒杆菌毒素批料制造方法的所有步骤都得到简化而没有牺牲制造期间药品的特性、品质、纯度或效力。非APF方法中所用的多个步骤在经过重新设计的IAPF方法中被去除，由此将生产时间从例如21天缩减至6天或更短的时间。

9.呈冷冻溶液形式的肉毒杆菌毒素的储存条件极大地提高药品稳定性。

各种出版物、专利和/或参考文献已在本文中引用，所述文献内容的全文以引用的方式并入本文。本文公开的本发明的各组替代要素或实施方案不应解释为具限制性。各组成员可个别地提及和主张，或与所述组的其它成员或本文中发现的其它要素组合提及和主张。预期一个组的一个或多个成员可出于便利性和/或专利性的原因而包括于一个组中或从一个组中删除。此外，除非本文另外说明或上下文另外明显冲突，否则本发明涵盖上述要素的所有可能变化的任何组合。

尽管本发明已关于某些优选方法进行了详细描述，但本发明范围内的其它实施方案、型式和修改是可能的。因此，上文权利要求书的精神和范围应不限于上文所述实施方案的具体描述。

Claims

1.一种用于获得A型生物活性肉毒杆菌神经毒素复合物的不含动物产物的色谱方法，所述方法包括以下连续步骤：

(a)在不含动物产物的培养基中培养肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)细菌；

(b)在2L至75L不含动物产物的发酵培养基中发酵来自所述培养基的肉毒梭菌细菌，其中所述培养基和所述发酵培养基中的至少一种包含植物蛋白；

(c)通过移除所述发酵培养基中存在的细胞碎片收集所述发酵培养基；

(d)通过过滤浓缩所收集的发酵培养基；

(e)通过添加缓冲液稀释经过浓缩的发酵培养基；

(f)第一接触步骤，其中使经过稀释的所收集的发酵培养基与阴离子交换介质接触，以使所述生物活性肉毒杆菌神经毒素被所述阴离子交换介质捕捉；

(g)使用pH值步进变化从所述阴离子交换介质洗提被捕捉的肉毒杆菌神经毒素，由此获得第一洗提液；

(h)第二接触步骤，其中使所述第一洗提液与阳离子交换介质接触以从所述第一洗提液移除杂质，使用盐步进变化从所述阳离子交换介质洗提A型肉毒杆菌神经毒素复合物，由此获得第二洗提液；

(i)通过渗滤处理所述第二洗提液；和

(j)过滤经过处理的第二洗提液，由此使用不含动物产物的色谱方法获得A型生物活性肉毒杆菌神经毒素复合物，其中所获得的所述A型肉毒杆菌神经毒素复合物具有每毫克A型肉毒杆菌神经毒素复合物2.0×10⁷至6.0×10⁷个单位的效力。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵培养基包含不超过5％w/v植物来源的蛋白质产物、不超过2％w/v酵母提取物和不超过2％w/v葡萄糖，并且其中在发酵步骤开始时所述发酵培养基的pH值水平为pH6.5至pH8.0。

3.根据权利要求1所述的方法，其中进行培养步骤直至所述培养基在540nm下的光学密度在0.8AU与4.5AU之间。

4.根据权利要求1所述的方法，其中发酵步骤进行60小时至80小时并且直至所述发酵培养基在890nm下的光学密度降至0.05AU至0.7AU之间。

5.根据权利要求1所述的方法，其中通过将肉毒梭菌不含动物产物的工作细胞库内含物引入所述培养基中引发培养步骤，其中所述工作细胞库包含每毫升所述工作细胞库1×10⁴至5×10⁷个菌落形成单位的肉毒梭菌，并且其中所述工作细胞库中的所述肉毒梭菌细菌具有均一的形态。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所获得的所述肉毒杆菌神经毒素在每毫克所获得的所述肉毒杆菌神经毒素中包含1纳克或少于1纳克残余核酸。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法在一周或短于一周内完成。

8.一种用于获得生物活性肉毒杆菌神经毒素的不含动物产物的色谱方法，其包括以下连续步骤：

(a)将来自不含动物产物的工作细胞库的肉毒梭菌细菌添加至不含动物产物的培养基中；

(b)在所述培养基中培养所述肉毒梭菌细菌；

(c)在不含动物产物的发酵培养基中发酵来自步骤(b)的所述肉毒梭菌细菌直至发生肉毒梭菌细胞溶解；

(d)收集所述发酵培养基以提供经过收集的发酵培养基；

(e)通过过滤对所收集的发酵培养基进行浓缩；

(f)通过添加缓冲液稀释经过过滤的发酵培养基以获得经过稀释的发酵培养基；

(g)第一接触步骤，其中使经过稀释的发酵培养基与捕获色谱接触，其中捕获色谱介质是阴离子交换介质，使用pH值步进变化从阴离子交换色谱介质洗提A型肉毒杆菌神经毒素复合物；

(h)第二接触步骤，其中使来自所述第一接触步骤的洗提液与精制色谱介质接触，其中所述精制色谱介质是阳离子交换介质，使用盐步进变化从阳离子交换色谱介质洗提A型肉毒杆菌神经毒素复合物；和

(i)过滤来自所述第二接触步骤的洗提液，由此通过改良的不含动物产物的方法获得生物活性肉毒杆菌神经毒素，其中所获得的所述肉毒杆菌神经毒素在每毫克所获得的所述肉毒杆菌神经毒素中包含1纳克或少于1纳克残余核酸，并且所述方法在一周或短于一周内完成。

9.一种用于获得生物活性肉毒杆菌神经毒素的利用色谱的不含动物产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供不含动物产物的发酵培养基；(b)在所述发酵培养基中发酵肉毒梭菌细菌；和(c)通过使所述发酵培养基与阴离子交换色谱介质接触，使用pH值步进变化从阴离子交换色谱介质洗提A型肉毒杆菌神经毒素复合物，接着使来自所述阴离子交换色谱介质的洗提液与阳离子交换色谱接触，使用盐步进变化从阳离子交换色谱介质洗提A型肉毒杆菌神经毒素复合物，从所述发酵培养基回收所述生物活性肉毒杆菌神经毒素，由此从不含动物产物的色谱方法获得所述生物活性肉毒杆菌神经毒素。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所获得的所述肉毒杆菌神经毒素在每一百万份所获得的所述肉毒杆菌神经毒素中包含一份或少于一份残余核酸。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述方法在一周或短于一周内完成。