PT2454275T - Processo e sistema de obtenção de neurotoxina botulinum - Google Patents

Processo e sistema de obtenção de neurotoxina botulinum Download PDF

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Description

DESCRI πϋΟ 'PROCESSO E SISTEIW DE OBTENnuO DE NEUROTOXINA BOTULINUM.
ANTECEDENTES A presente inven'2o refere-se a sistemas e processos para a obten'2o de urra neurotoxina cl ost r i di ana. Em part i cul ar, a presente inven'2o refere-se a um processo e si sterna cromat ogrdf i co r dpi do e livre de prote°na animal para obter uma neurotoxina botul°nica biologicamente activa de alta pot5ncia, alta pureza e alta produtividade.
Uma conposi'2o farma^utica adequada para adrri ni st r a'2 o a um humano ou animal para uma finalidade terapsutica, de diagn/Btico, de pesquisa ou cosrrlfltica conpreende um i ngredi ente activo e um ou mai s exci pi entes, tanpPes, transportadores, estabilizadores, ajustadores de tonicidade, conservantes e/ou agentes de volume. O ingrediente ativo em uma corrposi'2o farma^utica pode ser bi ol /Igi co, como uma neurotoxina botul°nica. Qs rrlfltodos conhecidos (tais como o nrtUtodo de Schantz) para a obten'2o de uma neurotoxina botul°nica Bteis como ingredientes activos numa corrposi'2o farma^utica s2o processos de cultura, fermenta'2o e purifica'2o de v(§rias semanas que ut i I i zam pr ot e° nas derivadas de animais, tais corro o caldo de carne e case°na utilizados em cultura e meios de fermenta'2o e enzi mas de purifica'2o derivadas de animais. A admnistra'2o a umpaciente de uma corrposi '2o farma^utica feita atravUs da ut i I i z a'2 o de produtos derivados de animais pode implicar o risco de adrrinistra'2o de agent es pat ogUni cos ou de um agente infeccioso, tal corro umpri2o. AI Hm di sso, os rrlfltodos conhecidos de prote°na animal livre para obter uma t oxi na bot ul 0 ni ca t arrbUms2 o processos que consomemt errpo (ou seja, leva mai s de uma semana para completar) comvStios passos a rrontante (cultura e fermenta'2o) e a jusante ( pu r i f i c a '2 o), e ainda assim resultam na obten'2o de uma neurotoxina botul°nica com i nrpurezas det ect®/ei s.
Toxi na bot ul0 ni ca O género Clostr°dio tem mai s de cent o e vinte e sete espUcies, agrupadas por morfologia e fun'2o. A bactUria anaer/Ebi ca, grampositiva Cl ost r i di um bot ul i num produz uma neurotoxina pol i pept0 di ca potente, toxina botul°nica (si noni mament e "toxina"), que causa uma doen'a neuroparal °t i ca em humanos e animais conhecidos corro botulism). Os sintomas de intoxica'2 o por toxina bot ul0 nica podem progredi r de di f i cul da de em andar, engol ir e falar com paralisia dos rrBscuI os respi rat/Eri os e rrorte.
Uma unidade de toxina botulinica H definida corro a DL50 ap/ls a inje'2o i nt raperi toneal em camundongos Svu ss V\èbster su°'os que pesam cerca de 18-20 gramas cada. Uma unidade de toxina bot ul0 nica H a quantidade de toxina botul°nica que mata 50% de um grupo de camundongos Svu ss V\êbster su°'os. Sete neurotoxinas de botulinum i nunol ogi cament e distintas, geral mente t, m sido caract eri zados, sendo estes neurotoxina botul°nica, respect i vament e, serotipos A, B, Ci, D, E, F e G, cada um dos quais se distingue por neut ral i za'2 o com anticorpos espec°ficos do tipo. Os diferentes sorotipos de toxina botul°nica variam nas espllcies animais que afectam e na gravidade e dura'2o da paralisia que eles evocam As toxinas botul°nicas aparentemente se ligam com alta afinidade aos neur/Bii os motores col i nllrgi cos e transi ocamse ao neur/Bii o e bloquei ama I i be r t a '2 o pr H- s i ndpt i ca da acet i I col i na.
As toxinas botul0 nicas foram utilizadas em contextos cl°nicos para o tratamento de, por exerrpl o, distBrbios neurorruscul ares caract eri zados por rrfiscul os esqueléticos hiperativos. A toxina botul0 nica tipo A foi aprovada pela US Food and Drug Adrri ni st r at i on (FDA) para o tratamento de bl ef a roes pasmo essencial, estrabismo e espasmo hemifacial em pacientes com ma i s de doze anos, distonia cervical, rugas de linha glabellar (facial) e tratamento de hi peri drose. A FDA t arrbUm aprovou uma t oxi na bot ul 0 ni ca ti po B para o tratamento da distonia cervical.
Apesar de todos os serotipos de toxinas botul°nicas aparentemente inibirem a I i be r t a '2 o do neurot ransrri ssor acetil colina na jun'2o neurorruscul ar, eles fazemisso afectando as prote°nas neurosecret oras diferentes e/ou cl i vagemdest as prot e° nas emdi f erent es I ocai s. A t oxi na botul0 nica do ti po A 1 uma endopept i dase de zinco que pode hidrolisar es peei f i cament e uma liga'2o pept°dica da prote°na associada intracelular, associada - ves°cula (VAIVP, tarrbUm chamada de synapt obrevi n) 25 k i I o Da I ton ( kDa) (SNAP-25). 0 t i po botul°nico E tarrbUm corta o SNAP-25, rras alveja diferentes sequ5 nci as de am no®ci dos dentro desta prote°na, em conpara '2 o com a t oxi na bot ul 0 ni ca t i po A. Os t i pos B, D, F e G da toxina botul°nica atuam sobre o VAIVP com cada serotipo que divide a prote°na em um local diferente. Final mente, a toxina botul°nica tipo Ci foi mostrado para cortar a sintaxe e o SNAP-25. Estas diferen'as no mecanismo de ac'2o podemafectar a potsncia relativa e/ou a dura'2o da ac'2o dos v®ri os serotipos de toxina de botulinum O peso molecular da rrol Hcul a activa da prote°na da toxina botul°nica (t arrbUm conheci do corro "toxina pura" ou corro o "corrponente neur ot Axi co") de um corrpl exo de toxina botul°nica, para os sete dos serotipos conhecidos de toxina botul°nica H de cerca de 150 kDa. Curiosamente, as toxinas botul°nicas s2o libertadas pela bacteria Clostridial corro corrpl exos que corrpPem o corrponente neurot/Ed co de 150 kDa j unt ament e com uma ou mai s prot e° nas η2 o t oxi nas assoei a das. Assi rq o corrpl exo de toxina botul°nica tipo A pode ser produzido por bacteria Clostridial corro formas de 900 kDa, 500 kDa e 300 kDa (pesos moleculares aproximados). Toxina botul°nica tipos B e Ci s2o aparentemente produzidos corro apenas um corrpl exo de 500 kDa. A toxina botul°nica do tipo D H produzi da corro corrpl exos de 300 kDa e 500 kDa. Final mente, os tipos de toxina bot ul 0 nica E e F s2o produzidos corro apenas corrpl exos de aproxi madament e 300 kDa.
Os conpl exos (ou sej a, peso molecular superior a cerca de 150 kDa) cont 5 m pr ot e° nas herragl ut i ni nas (HA) e urra prote°na n2 o- toxina η2 o herragl ut i ni na (l\[TNH). Assi rp um conpl exo de toxina botul°nica pode conpreender urra rrol Hcul a de toxina bot ul 0 ni ca ( o component e neur ot /Bei co) e urra ou rrai s pr ot e° nas HA e/ou prote°na NTTNH. Estes doi s tipos de prote°nas η2 o t oxi nas ( que j unt o com a rral Hcul a de t oxi na bot ul 0 ni ca podem conpreender o conpl exo de neurotoxina relevante) podematuar para proporei onar estabi I i dade ~ desnatura'2o da mol Hcul a de toxina botul°nica e prote'2o contra ®ci dos digestivos quando a toxi na H i ngeri da. AI Hmdi sso, H poss°vel que os conpl exos de toxina botul°nica rrai ores (superiores a cerca de 150 kDa) possam resul t ar em urra taxa de difus2o rrai s lenta da toxina botul°nica longe de um I ocal de inje'2o i nt ranxiscul ar de um conpl exo de t oxi na bot ul 0 ni ca. O sucesso da t oxi na bot ul 0 ni ca tipo A para tratar urra variedade de condi ' Pes c I 0 ni cas levou ao i nt eresse emout ros ser/S i pos de t oxi na bot ul°nica. Assi rp pel o menos os t i pos de t oxi nas bot ul°nicas, A, B, E e F foram utilizados clinicamente em seres humanos. AI Um disso, urra forrrula'2o do conponente neurot/Ed co (ou sej a, sem as prote°nas η2 o toxinas associadas) H vendi da na Europa sob o nome comercial XECM N (IVferz Pharmaceuticals, Frankfurt, Al erranha). A t oxi na bot ul 0 ni ca do t i po A H conheci da por ser sol Bvel emsolu'Pes aquosas dilu°das a pH 4-6,8. A um pH aci rra de cerca de 7, as prot e° nas est abi I i zadoras η2 o t oxi nas dissociamse da neurotoxina, resultando emurra perda gradual de toxicidade, part i cul ar ment e corro o aumento do pH e da t errper at ur a (Schantz EJ , et al . Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment ( em part i cul ar as pdgi nas 44-45), sendo o cap°tulo 3 de J ankovi c, J., et al., Therapy vu t h Bot ul i num Toxi n, IVbrcel Dekker, Inc, 1994).
Tal corro acontece com as enzimas em geral, as atividades biolAgicas das toxinas bot ul 0 nicas (que s2o peptidases intracelulares) s2o dependentes, pelo menos em parte, da sua conforrra'2o tridimensional. A di I ui '2 o da toxina das quantidades de rri li gramas para uma solu'2o contendo nanogramas por nil i litro apresenta dificuldades significativas, como, por exerrpl o, a tendida de a toxina aderir ”s superf°cies e assimreduzir a quantidade de toxina dispon°vel. Uma vez que a toxina pode ser utilizada meses ou anos apAs a forrrula'2o da conposi'2o farrra^utica contendo toxina, a toxina H estabilizada com um agente estabilizador tal corro al burn na, sacarose, trealose e/ou gelatina.
Uma conposi'2o farmac5utica contendo toxina botul°nica comerei al ment e dispon°vel H vendida sob a marca registada BOTOX* (conplexo de neurotoxina purificada de toxina botul°nica tipo A) dispon°vel comerei al ment e de Allergan, Inc., de Irvine, CalifArnia. Cada frasco de 100 unidades de BOTOX* consiste em cerca de 5 ng de conplexo purificado de toxina botul°nica tipo A, 0, 5 rrg de al burn na de soro humano e 0, 9 rrg de cloreto de s/ffli o, forma seca ao v®cuo e dest inado a reconstitui '2 o comsol u'2o sal i na normal esterilizada sem conservante (0,9% inje'2o de cloreto de s/ffli ο). Outras conposi'Pes f ar mac5 ut i cas contendo toxina botul°nica comerei al ment e dispon°veis incluem Dysport-^ ( Cl ost r i di um bot ul i num conpl exo de hemagl ut i ni na de toxina t i po A com al burn na de soro humano e I actose na corrposi '2o f ar mac, ut i ca da toxina botul°nica), dispon°vel na Ipsen Lirrited, Berkshire, Reino Unido como um p/E a ser r econst i t u° do com cloreto de s/Hi o a 0,9% antes da ut i I i za '2 o) e IVtyoBI oc u (uma sol u'2 o i nj et ®/el corrpr eendendo toxina botul°nica tipo B, al burn na de soro humano, succinato de s/ffli o e cloreto de s/Hi o a cerca de pH 5,6, dispon°vel a partir de Solstice Neurosciences of San Diego, Calif/Ernia. O conponente neurot/Ed co (a rml Hcul a de toxina de 150 kDa) e os conpl exos de toxina bot ul 0 ni ca (300 kDa a 900 kDa) podem ser obtidos, por exenpl o, List Biological Laboratories, Inc., Canpbel I , Cal i f Ar ni a; o Centro de M crobi ol ogi a Aplicada e Pesquisa, Port on Down, Reino Unido; V\6ko (Osaka, Jap2o), bem corro da Sigma Cherricals de St Louis, Mssouri.
Os niUtodos de produ'2o de prote°na animal e/ou cromat ogr®f i ca para a obten'2o de uma neurotoxina botul°nica s2o revelados nas patentes US 7,445,914 ; 7,452,697 ; 7,354,740 ; 7. 160. 699 ; 7,148,041, e; 7,189,541. TantHm s2o de interesse os pedidos de patente dos EUA 11/609. 449 intitulado "IVhdia for Cl ost r i di um Bact er i urrV, arquivado em 12 de dezerrbro de 2006; 12/098. 896, intitulado "Animal Product Free IVfedi a and Processes for Obtaining a Botulinum Toxin", arquivado em 7 de abril de 2008; 11/932. 689 intitulado "Chromatographic IVfet hod and Systemfor Purifying a Botulinum Toxin", arquivado em 31 de outubro de 2007; 11/932. 789 intitulado "Chromatographic IVfet hod and System for Purifying a Bot ul i num Toxi n", arquivado em31 de outubro de 2007, e; 12/234. 537, intitulado "Animal Product Free IVfedi a And Processes For Obtaining A Botulinum Toxin", arquivado em 19 de setembro de 2008. A toxina botul°nica para o uso numa composi'2o farrrac, utica pode ser obtida por fermenta'2o anaer/fbi a de Clostridium botulinum utilizando o processo Schantz bem conhecida (ver por exenrplo, Schantz EJ, et al.. Properties
and use of bot ul i num t oxi n and other rricrobial neurotoxins in medicine, Mcrobial Rev 1992 IVbr; 56 ( 1): 80-99; Schantz EJ , et al., Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment, cap°tulo 3 emj ankovi c J, ed. Neurological Disease and Therapy. Terapia com toxina bot ul 0 ni ca ( 1994), Nova York, IVfereel Dekker; 1994, p<Sgi nas 41-49, e; Schantz EJ , et al., Use of crystalline type A bot ul i num t oxi n in medical research, em Lewis GE Jr, ed. Biomedical Aspects of Botulism (1981) New York, Academic Press, pCSgi nas 143- 50). O processo de Schant z para a obt en'2 o de uma toxina botul°nica utiliza produtos animais, por exenplo, corro reagentes e corro parte da cultura e dos meios de f er ment a '2 o. S2 o necessárias v®rias etapas para criar uma composi ' 2 o farmaci ut i ca de toxi na Cl ostri di al adequada para adrni ni st r a '2 o a um ser humano ou animal para fins t er ap, ut i cos, de diagn/Btico, de pesquisa ou c os rr1||t i c a. Estas etapas podem incluir a obten'2o de uma toxina
Clostridial purificada e depois a conposi '2o da toxina Cl ost r i di a I pur i f i cada. Um pr i mei r o passo pode ser a f or ma '2 ο e cultivo de col/Enias de bactHrias Clostridial, tipicamente em placas de agar sangue, em um arrbiente prop°cio ao crescimento bacteriano anaer/Bai co, corro em uma atrrosfera anaer/Bai a quente. Este passo pernite col/Biias Cl ostri diais com morfologia desej ®/el e outras caract er° st i cas a serem obtidas. Numa segunda etapa, as col/Baias de Clostridial sei ecci onadas podem ser fermentadas num primeiro meio adequado e, se desejado adi ci onal ment e, num segundo meio de fermenta'2o. Ap/B umcerto per°odo de fermenta'2o, a bactéria Clostridial tipicamente lisa e libera a toxina Clostridial no meio. Em terceiro lugar, o mei o pode ser purificado de rrodo a obter uma toxina em massa. Tipicamente, a pur i f i c a '2 o de meio para obter toxina em massa H realizada utilizando, entre outros reagentes, enzimas derivadas de animais, tais corro DNase e RNase, que s2o utilizadas para degradar e facilitar a rerro'2o de ®ci dos nucl ei cos. A toxina a granel resultante pode ser uma toxina altamente purificada com uma deterrrinada atividade espec°fica. Ap/B a estabi I i za'2o num tanp2o adequado, a toxina emmassa pode ser corrtai nada comum ou mai s exci pi entes para formar uma conposi '2o farmacs ut i ca de toxina Clostridial adequada para adrri ni st r a'2 o a um humano. A corrposi '2o farmac5 ut i ca da toxi na cl ostri di ai pode conpreender uma toxina clostridial corro um ingrediente farmacsutico ativo (API). A conposi '2o farmacsutica tarrtaUm pode incluir um ou mai s exci pi entes, tanpPes, ve°culos, estabilizadores, conservantes e/ou agentes de volume. 0 passo de f er ment a '2 o da t oxi na Cl ost r i di um pode resultar em urna solu'2o de meio de fermenta'2o que contam bactérias completas de Clostridium bactérias I i sadas, nutrientes de meio ambiente de cultura e subprodutos de f er ment a '2 o. Afiltra'2o dest a sol u'2 o de cultura de rrodo a remover elementos brutos, corro bactérias inteiras e I i sadas, fornece um meio col hi do/cl ari f i cado. O meio clarificado conpreende uma toxina Clostridial e v®rias i npurezas e H processado para obter uma toxina Clostridial concentrada, que se denorri na toxina em massa. S2 o conhecidos os processos de fermenta'2o e purifica'2o para obter uma toxina clostridial em massa utilizando um ou mai s produtos derivados de animais (tais corro o case digest casein, DNase e RNase). Um exerrpl o de um processo conhecido de produto η2 o animal η2 o conhecido ("NAPF") para obter um corrpl exo de toxina botul°nica H o processo Schantz e suas rrodi f i ca' Pes. O processo de Schantz (desde o revestimento inicial, a cultura celular atU a fermenta'2o e a purifica'2o da toxina) faz uso de uma s^rie de produtos derivados de fontes animais tais corro, por exerrpl o, meio de carne cozida Bacto derivado de animal no frasco de cultura, placas Col u rrbi a Blood Agar para crescimento e sele'2o de col/Eiias e case°na no meio de fermenta'2o. AlUmdisso, o processo de pu r i f i c a '2 o da toxina em massa de Schantz faz uso de DNase e RNase de fontes bovinas para hidrolisar (St i dos nucl ei cos presentes no meio de f er ment a'2 o cont endo t oxi na. Foram expressas preocupa'Pes quanto ao potencial de uma encef ai opat i a espongi forme virai e transrriss°vel (EET), corro a encef al opat i a espongiforme bovina (BSE), a contarrina'2o quando os produtos animais s2o utilizados em um processo de obten'2o de uma API e/ou em um processo de fabrica'2o (conposi'2o) uma corrposi'2o farmac5utica usando tal API. § conhecido um processo de fermenta'2o para a obten'2o de um tox/Ede tet°nico que utiliza quantidades reduzidas de produtos derivados de animais (designados processos de f er ment a '2 ο I i vres de produt os ani mai s ou " APF", o APF engloba prote°na livre de animais), ver, por exenpl o, a patente US 6,558,926. Um processo de fermentado de APF para a obten'2o de uma toxina Clostridial tema vantagem potencial de reduzir a possibilidade (j® muito baixa) de contani na'2o da toxina emmassa resultante comv°rus, pri Pes ou outros elementos i ndesej ®/ei s que podem ent2o acompanhar o ingrediente farma^utico ativo, toxina clostridial, uma vez que H conposto numa composi'20 farma^utica para adrrí ni stra'2o a seres humanos. A cromatograf i a, tal corro a cromatograf i a em coluna, por exemplo, pode ser utilizada para separar uma prote°na particular (tal corro uma neurotoxina botul°nica) de uma mistura de prote°nas, (St i dos nucl ei cos, detritos celulares, etc. num processo conhecido corro f r acci onament o ou purifica'2o. A rristura de prote°nas normal mente passa através de uma coluna de vidro ou pl (Estico contendo, por exemplo, um mei o s/H i do, muitas vezes poroso (muitas vezes referido corro contas ou resina). Diferentes prote°nas e outros conpostos passam pel a matriz a diferentes taxas com base emsuas caract er° st i cas qu° nicas espec°ficas e a maneira corro essas car act er° st i cas fazemcomque el as interajamcom o mei o cromat ogr®f i co particular utilizado. A escolha do mei o determ na o t i po de caract er° st i ca qu°rrica pel a qual o f racci onament o das prote°nas se baseia. Existem quatro tipos b®si cos de cromat ograf i a em col una; permita i/Biica, f i 11 r a '2 o em gel , afinidade e intera'2o hi drof/Bai ca. A c r omat ogr af i a de permita de i hes realiza o f racci onament o com base na carga ei et r ost ®t i ca de superf°cie usando uma coluna errbal ada com pequenas contas que carregamuma carga positiva ou negativa. Na cromat ograf i a de f i 11 r a '2 o em gel, as prote°nas s2o f racci onadas com base no seu tamanho. Na c r omat ogr af i a de afinidade, as prote°nas s2o separadas com base na sua capacidade de se ligar a grupos qu°nicos espec°ficos (ligando) anexados a pUrolas na matriz da coluna. Os I i gandos podemser biologicamente espec°ficos para uma prote°na alvo. A c r omat ogr af i a de intera'2o hi drof/Bai ca realiza o f racci onament o com base na hi drof obi ci dade superficial. A c r omat ogr af i a em coluna para purificar (f racci onar) uma toxina clostridial H bem conheci da. Veja, por exenpl o, as seguintes publica'hes: 1. Ozutsurri K. , et al , Rapid, rrliltodo si rrpl i ficado para a produ'2o e purifica'2o da toxina tet°nica, App &amp; Environ Mero, abril de 1985, p 939- 943, vol 49, no. 4. ( 1985) descreve a ut i I i za '2 o de f i 11 r a '2 o em gel de crornatografi a I 0 qui da de alta press2o ( HPLC) para purificar a t oxi na do t Ut ano. 2. Schrridt JJ, et al., Purifica'2o de neurotoxina botul°nica de tipo E por cromatograf i a de permita i/Bii ca de alto deserrpenho, Anal Biochem 1986 J ul ; 156 (1): 213-219 descreve o uso de cronratograf i a de exclus2o de tamanho ou cronrat ograf i a de permita i/Biica para purificar a toxina botul°nica tipo E . TarrbUm H divulgado o uso de sulfato de protanina em vez de ribonuclease (RNase). 3. Si npson LL, et ai., Isolation and characterization of the bot ul i num neur ot oxi ns Si rrpson LL; Schrridt JJ; M ddl ebrook J L, In: Harsnran S, ed. IVfet hods in Enzyrrology. Vol . 165, M crobi al Toxins: Tools in Enzyrrol ogy San Diego, CA: Academe Press; vol 165: p(Sgi nas 76-85 ( 1988) descreve a purifica'2o de neurotoxinas botul°nicas usando crornat ogr af i a de fluxo gr avi t aci onal, HPLC, etapas de captura usando urra resina de afinidade, cr onrat ogr af i a de exclus2o de tamanho e cr omat ogr af i a de permita i /frii ca (ani2o e cati2o), incluindo a ut i I i z a'2 o de duas colunas de permita i/6iica diferentes. S2 o divulgadas diversas se'Pes Sephadex, Sephacel, Trisacryl, S e Q. 4. Zhou L., et al., Expression and purification of t he I i ght chai n of bot ul i num neur ot oxi n A: A si ngl e mit at i on abolishes its cleavage of SNAP-25 and neurotoxicity after reconstitution v\i t h the heavy chain, Biochemistry 1995; 34 (46): 15175- 81 ( 1995) descreve o uso de urna coluna de afinidade de am I ose para purificar prote°nas de fus2o de cadeia leve de neurotoxina botul°nica. 5. Kannan K. , et ai., IVfet hods development for the biocherrical assessment of Neurobloc (toxina botul°nica t i po B), IVbv Disorder 2000; 15 (Suplemento 2): 20 ( 2000) descreve o uso de cromat ograf i a de exclus2o de tamanho para ensaiar uma toxina botul°nica de t i po B . 6. V\6ng Yc, The preparation and quality of bot ul i num t oxi n type A for i nj ect i on ( BTXA) and its cl i ni cal use, Dermatol Las Faci Cosm Surg 2002; 58 (2002) descreve cromat ograf i a de permita i/Eriica para purificar uma toxina botul°nica tipo A. Essa refer4ncia revela uma corrbina'2o de técnicas de precipita'2o e cr ornat ogr af i a. 7. Johnson SK, et ai., Scale-up of the fermentation and purification of the r ecorrbi nat i on heavy chain fragment C of botulinum neurotoxin serotype F, expressed in Pi chi a pastoris, Protein Expr and Purif 2003; 32: 1-9 (2003) descreve o uso de permita i /Erii ca e colunas de intera'2o hidrof/Ebica para purificar umfragmento de cadeia pesada recorrbi nante de urra toxina botul°nica tipo F. 8. O pedi do de patente de i nven'2o norte-ameri cana 2003 0008367 A1 ( Oguma) descreve a ut i I i z a '2 o de colunas de permita i/Biica e lactose para purificar uma toxina bot ul 0 ni ca.
Os niUtodos de purifica'2o resurrido acirra referem se pur i f i c a '2 o em pequena escala do conponente neurot/B<i co de um conpl exo de toxina botul°nica (isto H, a 150 kDa rral Hcul a de aproxi rradament e neur ot /Be i co), ou um conponente espec°fico do conponente neur ot /Be i co, em oposi '2o a purifica'2o de todo o conpl exo de toxina 900 kDa botul°nica. AI Hm disso, os processos existentes, incluindo processos em escala comercial, para obter urra toxina botul°nica adequada para conposi'2o em urra corrposi'2o f ar rracs ut i ca de t oxi na bot ul°nica ti pi carne nte incluemurra sUrie de etapas de precipita'2o para separar o conpl exo de toxina de i npurezas que aconpanham a toxina botul°nica do processo de fermenta'2o. Notavelmente, as tUcnicas de precipita'2o s2o anplamente utilizadas na indBstria bi of ar rracs ut i ca para purificar urra toxina botul°nica. Por exenpl o, o fracionamento com® cool frio (rrlUtodo de Cohn) ou preci pi ta'2o H usado para remover as prote°nas pl asn® i cas. I nf el i z ment e, as técnicas de precipita'2o previas para a purifica'2o de urra toxina botul°nica apresentam as desvantagens de baixa resolu'2o, baixa produtividade, dificuldade de opera'2o, dificuldade de controlo e/ou valida'2o e/ou dificuldade de aumentar ou diminuir a escala. Ant er i or ment e publicado Pedido de Patente US como nBmero de sUrie 11/452. 570, publicado em 12 de outubro de 2006, desc r eve etapas tais corro centrif uga '2 o, preci pi ta'2o <St i da, precipita'2o com etanol, passos de acidifica'2o e precipita'2o de sulfato de am<ni o, utilizados em v®rios processos NAPF livres de prote°na ani mal e para urra discuss2o detalhada, veja o documento de patente de inven'2o norte-americana n. é 2006/0228780). Existem algumas distin'Pes entre um processo livre de prote°na η2 o animal e processos livres de prote°na animal para a obten'2o de uma neurotoxina bot ul 0 ni ca. O que H necessdrio, portanto, s2o sistemas e processos r (gpi dos, de escala relativamente ainda menor para a obten'2o de elevada pureza, altamente potente neurotoxina botul°nica, que pode ser usada para efeitos de investiga'2o e/ou para fazer uma corrposi'2o farmBC,utica de alto r endi ment o.
S UIVE RI O O presente invento satisfaz esta necessidade e proporciona neurotoxinas botul°nicas altamente potentes, de elevada pureza, obtidas por sistemas e processos crorrat ogrdf i cos r®pi dos, de menor rendimento, comer ci al ment e Bteis, de alto rendimento, semprote°nas animais, de grande pureza. A neurotoxina botul°nica resultante H βΐ i I para a prepara'2o de uma conposi'2o f ar mac, ut i ca. A toxina Clostridial obtida pela prdtica da nossa inven'2o H de prefer, nci a um conpl exo de tipo A de neurotoxina botul°nica de cerca de 900 kDa. A nossa inven'2o η2 o requer reagentes NAPF, tais corro DNase e RNase.
Def i ni ' Pes
As segui ntes pal avras e termos aqui ut i I i zados t5 m as seguintes defini 'bes. "Cerca" significa que o i t e rrj par°metro ou termo de modo qualificado engloba uma gama de mai s ou menos dez por cento acima e abaixo dovalor do itemindicado, par° met ro ou termo. " Adrri ni st ra'2 o" ou "adrrinistrar" significa o passo de dar (ou seja, adrrinistrar) uma conposi '2 o farmac5utica ou ingrediente ativo para um sujeito. As conposi 'bes f ar macs ut i cas aqui descritas s2o "local mente adrri ni st radas" por exenpl o, por via i nt ranuscul ar (IIV), i nt radllr rri ca, adrri ni st r a'2 o subcut°nea, adrri ni st r a'2 o intratecal, i nt raperi t oneal (i p), t/ípi ca (t r ansdUr rri ca) e o inplante (isto H, de um di s pos i t i vo de liberta'2o lenta tal corro um inplante ou uma borrba polirrlUrica rri ni os mffi i cas) vias de adrri ni st ra '2 o. "Livre de produto animal" ou "subst anci al ment e livre de produtos animais" engloba, respect i vament e, "livre de prote°na animal" ou "subst anci al ment e livre de prote°na animal" e significa a aus5 nci a ou aus5 nci a substancial de derivados sangu°neos, agrupados em sangue e outros produtos ou conpostos derivados de animais. "Animal" significa um marrtfero (tal corro um humano), pdSsaro, rUptil, peixe, insecto, aranha ou de outras espUcies animais. "Animal" exclui rri croorgani srros, tais corro bactérias. Assi rp um mei o ou processo APF ou um mei o ou processo substanci al merite APF dent ro do ° rrbi t o da present e i nven'2 o pode i ncl ui r urna t oxi na botul°nica ou uma Clostridial botulinum bactUria. Por exenpl o, um processo APF ou um processo subst anci al ment e APF significa um processo que H subst anci al ment e livre ou essenci al ment e livre ou total mente livre de prote°nas de ri va das de animais, tais corro i rrunogl obul i nas, di gest2 o de carne, carne por produtos e leite ou produtos IStteos ou di geri das. "Toxina botul°nica" ou "neurotoxina botul°nica: significa uma neurotoxina produzida pelo Clostridium botulinum bem corro toxinas botul°nicas modificadas, recorrbi nant es, h° bridas e qui rrfflr i cas. Uma toxina botul°nica recorrbi nant e pode ter a cadeia leve e/ou a sua cadeia pesada feita de f or ma recorrbi nant e por uma es pile i e η2 o cl ost r i di al . "Toxina botul°nica", tal corro aqui utilizado, engloba os ser/Sipos de toxina botul°nica A, B, C, D, E, F e G. "A t oxi na bot ul 0 ni ca ", tal corro aqui ut i I i zado, abrange t arrbUm um corrpl exo de toxina bot ul 0 nica (isto il, os corrpl exos de 300, 600 e 900 kDa), bem corro a toxina bot ul 0 nica pura (ou seja, a rrol Hcul a neurot/E<ica de 150 kDa), todas as quais s2o βΐ ei s na prCStica da presente inven'2o. "Toxina botul°nica purificada" significa uma toxina botul°nica pura ou um corrpl exo de toxina botul°nica que i isolado ou subst anci al ment e isolado de outras prote°nas e i rrpurezas que podem acorrpanhar a toxina botul°nica tal corro H obtida a partir de uma cultura ou processo de fermenta'2o. Assim uma toxina botul°nica purificada pode ter pelo menos 90% de preferencia rnai s de 95°/q e rnai s pref erenci al ment e rnai s de 99% das prote°nas de toxina η2 o botul0 nicas e impurezas removidas. A botul 0 ni ca C2 e C3 citotoxinas, n2 0 sendo neur ot oxi nas, s2o exclu°das do 0 rrbi t 0 da presente inven'2o. " Cl ost r° di 0 neurot oxi na" si gni f i ca urna neur ot oxi na produzida a partir de, ou para nativa, uma bactéria de Clostr°dio, tais corro 0 Clostr°dio botul inurp Clostr°dio butyricumou Clostr°dio beratti, bemcorro uma neurotoxina de Clostr°dio feita recorrbi nant ement e por uma espHcie que n2 0 de cI ost r i di 0. "Tot al ment e livre" (" consi st i ndo de" t er ni nol ogi a) significa que, dentro da faixa de detec'2o do instrumento ou processo que est® sendo usado, a subst°ncia n2 0 pode ser detectada ou sua presen'a n2 0 pode ser confirmada. " Essenci al ment e livre" (ou "consistindo essenci al ment e errf) significa que apenas quantidades vestigiais de a subst°ncia podemser detectadas. "Toxina botul 0 ni ca modificada" significa uma t oxi na bot ul°nica que teve pelo menos um dos seus arri no®ci dos eliminados, modificado, subst i t u° do ou, quando comparada com uma t oxi na bot ul i ni ca nat i va. Al Hm di sso, a t oxi na bot ul 0 ni ca pode ser modificada uma neurotoxina produzida de forma recorrbi nante, ou umderivado ou fragmento de uma neurot oxi na de forma reconbinante feita. At oxi na bot ul 0 ni ca modi f i cada retHm pelo menos uma actividade biol/Igica da toxina botulinica nativa, tais corro, a capacidade para se ligar a um recept or de t oxi na bot ul 0 ni ca, ou a capaci da de para i ni bi r a I i be r t a '2 o de neurot ransrri ssores a partir de um neur/frii o. Um exenpl o de urna toxina botul°nica modificada H uma toxina botul°nica que tem uma cadeia leve de uma toxina botul°nica do serotipo (tal corro o ser/Sipo A), e uma cadeia pesada de uma toxina botul°nica do serotipo diferente (tal corro serotipo B). Outro exenpl o de uma toxina botul°nica modificada H uma toxina botul°nica acoplada a um neurot ransrri ssor, tais corro a subst°ncia P. "Conposi'2ofarmac5utica" significa uma f or mil a '2 o emque um i ngr edi ent e activo pode ser uma toxina botul°nica. A palavra "f or rail a'2 o" significa que existe pelo menos um ingrediente adicional (tal corro, por exenpl o, e η2 ο I irritado a, uma al burn na [tal corro uma al burn na de soro humano ou uma al burn na humana recorrbi nant e] e/ou cloreto de s/ffli o) na conposi'2o farmac5utica al Hm de um ingrediente ativo de neurotoxina botul°nica. Uma corrposi'2o farma^utica H, portanto, uma forroila'2o que H adequada para adrri ni st r a'2 o diagn/Btica, terapsutica ou cosrrlUtica (por exenpl o, por inje'2o i nt rarroscul ar ou subcut°nea ou por inser'2o de um dep/Bito ou inplante) para um sujeito, corro um paciente humano. A corrposi'2o farrra^utica pode ser: num estado liofilizado ou seco por v<Stuo, uma solu'2o formada ap/B r econst i t ui '2 o da conposi'2o farmac5utica liofilizada ou secada ao v®cuo comsol u'2o sal i na ou (Egua, por exenpl o, ou; corro uma solu'2o que n2o requer reconstitui '2o. Oingrediente ativo pode ser um dos ser/Sipos de toxina bot ul 0 nica A, B, C 1, D, E, F ou G ou uma toxina botul°nica, todos os quais podem ser criados nativamente por bactérias cl ost ri di anas. Corro afi rrrado, uma conposi '2o farmac5 ut i ca pode ser I °qui da ou s/H i da, por exenpl o, seca sob v®cuo. IVffltodos exenpl ares para a forrmla'2o de uma conposi '2o farmacsutica de ingrediente activo de toxina botul°nica s2o divulgados em publica'Pes Publica'2o de patente US 200301 18598, arquivada em 5 de noverrbro de 2002 . O terrro "subst anci al ment e livre" significa presente a um n°vel de menos do que um por cento em peso de um meio de cultura, meio de fermenta'2o, a conposi '2o farmacsutica ou outro material no qual a percent agem em peso de uma subst°ncia (tal corro, uma prote°na animal ou produto animal produto derivado de animais ou prote°na). "Forrmla'2o terap5utica" significa uma fornxila'2o pode ser utilizada para tratar e, assip atenuar umdistBrbio ou uma doen'a e/ou sintomas associados mesma, tal corro um distBrbio ou uma doen'a caract er i zada por hi per act i vi dade (por exenpl o, es past i ci dade) de um rrôscul o periférico ou gl°ndula (por exenpl o, gl°ndula sudor°para). " Quant i dade t era peut i ca ment e ef i caz" si gni f i ca que o n°vel, a quantidade ou concentra'2o de um agente (por exenpl o, tal corro uma toxina botul°nica ou a conposi '2o farmac5utica que conpreende toxina botul°nica) necess®ria para o tratamento de uma doen'a, distBrbio ou condi '2o sem provocar efeitos colaterais negativos ou adversos si gni f i cat i vos. "Tratar", "tratar", ou "tratamento" significa um al°vio ou redu'2o (que inclui alguma redu'2o, redu'2o significativa, redu'2o quase total e redu'2o total), resolu'2o ou preven'2o (tenpor®ria ou permanentemente) de uma doen'a, desordem ou condi '2o, corm a deform dade das n®degas, de rrodo a obter um resultado terap5utico ou cosrrlUtico desejado, corro por cicatriza'2o de tecido danificado ou danificado, ou alterando, alterando, apri rrorando, melhorando, apri norando e/ou errbel ezando um fato existente ou percebido doen'a, desordemou condi '2o. Um efeito de tratamento, corro um efeito de al°vio da adrri ni st r a'2 o de uma neurotoxina botul°nica, pode η2 o aparecer clinicamente durante entre 1 a 7 dias apAs a adrri ni st r a '2 o da neur ot oxi na bot ul°nica a umpaciente por exenplo e pode ter uma dura'2o de efeito de cerca de 1 ιη s a cerca de 1 ano ou qualquer intervalo de terrpo entre eles, por exenpl o, dependendo da condi '2o e do caso particular a ser tratado.
As percentagens s2o baseadas no peso por volume, salvo indica'2o emcontr®rio. APF significa produto ani mal / prot e° na livre CV significa volume da coluna DF significa diafiltra'2o ELISA significa ensaio de i nunoabsor '2 o enzi rriSt i ca. IAPF, corro no "sistema IAPF" ou "processo IAPF", significa sistema ou processo de "prote°na animal melhorada". Umsi sterna ou processo IAPF inclui o uso de dois meios de cr omat ogr af i a ou tr,s meios de cr omat ogr af i a para purificar uma toxina botul°nica ou corrponente de neurotoxina, corro especi f i camente detalhado aqui. O mei o de cr omat ogr af i a inclui resinas de cr omat ogr af i a, corro H conhecido na tUcnica. Os lotes de neurotoxina botul°nica obtidos por utiliza'2o de dois meios de cr omat ogr af i a s2o aqui desi gnados corro IAPF. FAPF, corro no "sistema FAPF" ou "processo FAPF", significa sistema ou processo "ainda melhorado semprote°na animal". Conseqaeentemente, FAPF H um processo IAPF, e um sistema ou processo FAPF significa que trss meios de cr omat ogr af i a s2o usados para purificar uma toxina botul°nica ou corrponente de neurotoxina. Os lotes de neurotoxina botul°nica obtidos por utiliza'2o de tr,s meios de cr omat ogr af i a s2o aqui designados corro FAPF. NAPF significa prote°na sem animais livre SDS-PAGE significa eletroforese em gel de pol i acri I arri da de dodeci I sul f at o de s/Hi o SEC-HPLC significa c r omat ogr af i a I 0 qui da de alta resolu'2o de exclus2o de tamanho UF significa ultrafi ltra'2o
Um aspecto da inven'2o H um processo para a produ'2 o de uma neurot oxi na bot ul i ni ca bi ol ogi camente activo do t i po A corrpl exa conpr eendendo os passos sequenciais de: (a) cultura de bactérias de Cl ost r i di um bot ul i num num meio de cultura que H total mente isento de produtos derivados de animais ou cont Hm pr odut os derivados de animais em quant idade inferior a 1 % ( p/ v) ; ( b) fermentar a bactéria Cl ost r i di um bot ul i num do meio de cultura em 1,8 a 82,5 L de um mei o de fermenta'2o que H total mente isento de produtos derivados de animais ou contHm produtos derivados de animais numa quantidade i nf er i or a 1 % ( p/v); (c) colher o meio de fermenta'2o removendo det ri t os cel ul ares; (d) concentrar o mei o de fermenta'2o colhido por f i I t r a '2 o; ( e) di I ui '2 o do meio de fermenta'2o concentrada por adi '2o de umtanp2o ao mesmo; (f) realizar um pri mei ro passo de contacto em que o meio de fermenta'2o colhido dilu°do H posto em contacto com um meio de c r orrat ogr af i a de perrruta ani/Biica de modo que a neurotoxina botul°nica biologicamente activa no meio H capturada pelo meio de permita ani/Bnica; (g) el ui ndo a neurotoxina botul°nica capturada do meio de permita ani/Biica para obter um primeiro eluato; ( h) realizar um segundo passo de contacto em que o primeiro eluato H posto em contacto com um meio de c r orrat ogr af i a de permita de catibes para remover i rrpurezas do primeiro elu°do, obtendo assi m um segundo eluato; (i) realizar umterceiro passo de contacto em que o segundo eluato H contactado com um mei o de crorrat ograf i a de interac'2o hi dr of/Boi ca e elu°do para obter umterceiro el uat o; (j) processamento do terceiro eluato por di af i 11 ra '2 o; e (k) filtrar o terceiro eluato processado para obter um produto contendo um conpl exo de tipo A neurotoxina bot ul 0 ni co bot ul°nico bi ologi carne nte activo comurra pot 5 nci a de 1, 8 B 10 7 a 6, 6 x 10 7 unidades/ng; em que pelo menos um do meio de cultura e o mei o de f er ment a '2 o i nc I uem urra pr ot e° na veget al, enenhurraenzirra derivada de ani rral H utilizada para purificar a neurotoxina bot ul 0 ni ca; e em que o processo i realizado em urna semana ou menos.
Emexenplos particulares neurotoxina botul°nica de tipo A possuindo um conpl exo de potsncia entre cerca de 2,4 x 10 7 unidades/rrg a cerca de 5,9 x 10 7 uni dades/rrg, por exenpl o, pode ser obtido.
Numa forma de realiza'2o particular, o processo utiliza meio de fermenta'2o conpr eendendo η2 o mai s de cerca de 5% p/v de um produto de prote°na derivado de vegetais, η2 o mai s de cerca de 2% p/v de umextracto de levedura e η2 o mai s de cerca de 2% p/v glucose e em que o n°vel de pH do meio de fermenta'2o i de cerca de 6,5 a cerca de pH 8,0, mai s preferenci al mente de cerca de pH 6, 8 a cerca de pH 7, 6, no in°cio do passo de fermenta'2o. Numa forma de realiza'2o particular, o passo de cultura i realizado ati a densidade /Eptica do meio de cultura a cerca de 540 nan/Bmetros ( nrr) estar entre cerca de 0,8 unidades de absorv5 nci a (AU) e cerca de 4, 5 UA. O passo de cul t ura i de pref ers nci a i ni ci a do pel a introdu'2o de umconteBdo do banco de c ill u I as de trabalho de APF Clostridium botulinum para o meio de cultura, onde o conteBdo do banco de c ill ul as de trabalho conpreende pelo menos aproxi madament e 1 x 10 4 unidades formadoras de col/Biias, de prefersncia de cerca de 1 x 10 4 a cerca de 5 x 10 7 uni dades formadoras de col/Biias de Clostridium bot ul i num por nil i litro do banco de c ill ul as de trabalho, e onde o Clostridium botulinum A bactiria no banco de c ill ul as de trabalho possui uma morfologia s ubst anci al ment e uniforme.
Ainda noutra forma de realiza'2o, o passo de fermenta'2o H realizado durante cerca de 60 a 80 horas e atU uma densidade /fptica do meio de fermenta'2o a cerca de 890 nm di rri nui r para entre cerca de 0,05 UA a cerca de 0,7 UA. Num aspecto, a neurotoxina botul°nica obtida por um processo de cromat ograf i a subst anci al ment e APF compreende menos de 1 ppm de $Ci do nucl ei co residual e o processo H realizado em uma semana ou menos.
Outro aspecto da inven'2o H um sistema para a pr odu'2 o de uma neur ot oxi na bot ul i ni ca bi ol ogi cament e act i vo compreendendo: um pri mei ro aparelho para a cultura anaer/fbi ca da bactUria Clostridium botulinurp sendo o primeiro aparelho capaz de conter de 180 rrt a 1, 1 L de um mei o de cultura que H total mente isento de produtos derivados de animais ou contUm produtos derivados de animais em uma quantidade i nf er i or a 1 % ( Wv); umsegundo aparelho para a fermenta'2o anaer/Ibi ca da bactUria Clostridium botulinum que foi cultivada no primeiro aparelho, sendo o segundo aparelho capaz de conter de 1,8 a 82,5 L de um mei o de fermentado que H total mente isento de produtos derivados de animais ou cont Hm pr odut os derivados de animais numa quantidade inferior a 1 % ( p/ v) e o segundo aparei ho i ncl ui ndo pel o menos uma sonda descart®/el sei ecci onada de uma sonda de r edu'2 o- oxi da '2 o, urna sonda de pH e uma sonda de turva'2 o; um terceiro aparelho para colher o meio de f er ment a '2 o; um quarto aparelho para concentrar o meio de fermenta'2o colhido por f i I t r a'2 o e dilui '2o do meio de f er ment a '2 o f i I t r a do; um quinto aparelho para realizar uma primeira purifica'2o de neurotoxina botul°nica obtida a partir do mei o de fermenta'2o col hi do, o qui nt o aparei ho conpreendendo um meio de c r omat ogr af i a de permita ani/Biica capaz de capturar neurotoxina botul°nica; um sexto aparelho para realizar uma segunda purifica'2o de neurotoxina botul°nica elu°da a partir do meio de c r omat ogr af i a de permita ani/Eiica, o sexto aparelho conpr eendendo um mei o de c r omat ogr af i a de permita cati/Biica; um sétimo aparelho para realizar uma terceira purifica'2o de neurotoxina botul°nica elu°da a partir do meio de cromatografia de per mit a cat i /Eli ca, o sUti rro aparei ho conpr eendendo um meio de cromatografia de intera'2o hi drof/Bai ca; e um oitavo aparelho para filtrar a neurotoxina botul°nica purificada do sUtirro aparelho, em que o oitavo aparelho conpreende uma merrbrana de f i I t r a'2 o, e em que o produto contendo toxina botul°nica obtido tem uma potsncia de 1, 8 B 10 7 a 6, 6 x 10 7 uni dades/rrg, o produto corrpreende 1, 1 ng ou menos de (Sti do nucl ei co resi dual por rrg do produto, e o processo pode ser realizado em urra serrana ou menos; emque o si sterna H capaz de puri f i car a neurotoxi na botul°nica semo uso de urra enzi rra derivada de ani rrai s.
De acordo com processos e sisterras aqui descritos, obtUmse assim a neurotoxi na botul°nica biologicamente activa. Emforrras de realiza'2o particulares, a neurotoxi na botul°nica biologicamente activa obtida pelo processo e sisterras aqui descritos tem um peso molecular de cerca de 900 kDa.
Um corrposi 'Pes f ar rraci ut i cas APF pode ser feita através de corrposi'2 o da neurotoxi na botul°nica biologicamente activo obtido pelo processo e sistema aqui di vul gado. A corrposi '2o f ar rrac, ut i ca emque o ingrediente activo H urra neurotoxi na botul°nica biologicamente activa obtida pelo processo APF (isto li, o processo IAPF e FAPF) aqui divulgado pode ser usado para tratar urra condi '2o emum paciente. Exenrpl os de condi 'Pes a serem tratadas s2o selecionados do grupo que consiste em dor de cabe'a, dor de cabe'a de enxaqueca, dor de cabe'a de tens2o, dor de cabe'a sinusal, cef al ei a cervi cog, ni ca, t r anst or no de t r ans pi r a'2 o, hi peri drose axi I ar, hi peri drose pal rrar, hi peri drose pi antar, s°ndrome de Frey, pele hi per ci n^t i ca linha, rugas faciais, I i nhas gl abel ares, pUs de gal i nha, I i nhas de mari onete, dobra nasolabial, distSrbios da pel e, acal asi a, estrabismo, fissura anal crxnica, bl ef arospasrro, dor mjscul oesquel Ht i ca, fibrorrialgia, pancreatite, taquicardia, aumento prostdtico, prostatite, reten'2o urin®ria, i ncont i ns nci a urindria, bexiga hiperativa, espasmo herrifacial, tremores, rrioclonia, distBrbios gastrointestinais, diabetes, sialorrHia, desi ncroni za'2 o do det rusor-esf0 net er, espast i ci dade p/ls-derrame, cicatriza'2o de feridas, paralisia cerebral juvenil, espasmo rruscul ar liso, reestenose, distonia focal, epilepsia, distonia cervical, distBrbios da tir/Bde, hi percal cerri a, transtorno obsessi vo-corrpul si vo, dor artr°tica, s°ndrome de Raynaud, estria e distensae, ades2o peritoneal, vasoespasmo, rinorrUia, contratura rruscul ar, rrôseul o lesionado, distonia lar°ngea, c2ibra do escritor e s°ndrome do tBnel de carpel, por exerrpl o. A adrrinistra'2o local de quantidades t er apeut i cament e eficazes de uma corrposi'2o f arrrac, ut i ca corrpr eendendo uma neurotoxina botul°nica biologicamente activa fornecida pelo pr ocesso/si st ema IAPF aqui divulgado, pode ser repetida a intervalos de cerca de 2 meses a cerca de 6 meses ou a intervalos de cerca de 2 meses a cerca de 3 meses, por exerrpl o. Exenrpl os de dosagens Bteis administradas local mente ao paciente de uma quantidade t er apeut i cament e eficaz de uma corrposi'2o farma^utica subst anci al ment e APF feita de acordo com a presente divulga'2o, podem ter quantidades unitdrias de neurotoxi na botul°nicas entre cerca de 0,01 unidade e cerca de 10 000 unidades. Em casos particulares, a neurotoxina botul°nica H admnistrada nurra quantidade entre cerca de 0,01 unidade e cerca de 3000 unidades. Emexerrplos particulares, a neurotoxina botul°nica biologicamente activa que H o ingrediente farrrac,utico act i vo na conposi '2ofarrrac,utica Ha neur ot oxi na bot ul 0 ni ca t i po A ou t i po B, por exenpl o. A nossa inven'2o inclui um processo subst and al rrent e APF, utilizando crorratografi a, para a obten'2o de uma neurotoxina botul°nica biologicamente activa. O processo conpreende as etapas sequenciais de pr opor ci onar um mei o de f er rrent a '2 o de APF subst and al ment e, seguido de fermenta'2o de Bactérias Cl ost r i di um Bot ul i num no meio de fermentado e recupera'2o da neurotoxina botul°nica biologicamente activa a partir do meio de fermenta'2o utilizando um mei o de cr omat ogr af i a de permita ani/Biica seguido da ut i I i z a '2 o de um mei o de cr omat ogr af i a de permita cati/Biica. O passo de recupera'2o t arrbHm i ncl ui a ut i I i z a'2 o de um meio de interac'2o hi drof/tbi co ap/B a ut i I i z a '2 o do meio de crorrat ograf i a de permita cati/Ehica. A neurotoxina bot ul 0 nica obtido H urra neurotoxina botul i ni ca do t i po A conpl exa.
Numaspecto da nossa i nven'2o, a quanti dade de mei o de fermenta'2o utilizada pode conpreender de cerca de 2 L a cerca de 75 L de mei o de fermenta'2o de APF substanci al mente, de prefer, nci a de cerca de 2 L a cerca de 30 L de meio de fermenta'2o de APF subst anci al ment e. Corra exenpl o, de cerca de 100 rrg a cerca de 5 gramas, de prefer, nci a de cerca de 100 rrg a cerca de 3 gramas, mai s pref erenci al mente de cerca de 100 rrg a cerca de 1 grama da neurotoxina botul°nica biologicamente activa H obtida a partir do processo. Corro exerrpl o, podem ser obtidos cerca de 20 rrg a cerca de 100 rrg ou cerca de 20 rrg a cerca de 80 rrg da neurotoxina biologicamente activa por litro do meio de fermenta'2o utilizado. O mei o de fermenta'2o pode compreender produto proteico derivado de vegetais, extracto de levedura e glicose, por exerrpl o. Corro exerrpl o, o meio de fermenta'2o conpreende cerca de 5%p/v ou menos de umproduto de prote°na derivado de vegetais. Ainda noutro exerrpl o, o meio de fermenta'2o compreende cerca de 2% p/v ou menos de um extracto de levedura. Numa outra forma de realiza'2o, o mei o de fermenta'2 o conpreende cerca de 2% p/v ou menos de glucose. Num exenplo particular, o meio de fermenta'2o compreende cerca de 5% p/v ou menos de umproduto de prote°na derivado de vegetais, cerca de 2% p/v ou menos de umextracto de levedura e cerca de 2% p/v ou menos de glicose, o vegetal O produto de prote°na derivado, o extrato de levedura e a glicose est2o em qualquer propor'2o de acordo com as quantidades percentuais especificadas em w/v. Em algumas formas de realiza'2o, o passo de fermenta'2o prossegue entre cerca de 60 horas a cerca de 80 horas.
Numa forma de realiza'2o, um processo subst anci al ment e APF utilizando cr omat ogr af i a para a obten'2o de uma neurotoxina botulinica biologicamente activa, conpr eendendo o processo os seguintes passos
sequenciais, H proporcionada onde a cultura de bactérias Clostridium botulinum num meio de cultura APF subst anci ai ment e, ent2o fermentar Clostridium botulinum bactérias do meio de cultura em cerca de 2 L a cerca de 75 L de um meio de fermenta'2o subst anci ai ment e APF, mai s pref erenci ai ment e emcerca de 2 L a cerca de 30 L de um mei o de fermenta'2o subst anci ai ment e APF, onde pelo menos um do meio de cultura s ubst anci ai ment e APF e subst anci ai ment e APF 0 mei o de fermenta'2o inclui uma prote°na vegetal, seguido pela colheita do meio de fermenta'2o removendo detritos celulares presentes no meio de fermenta'2o e concentrando o meio de fermenta'2o colhido por f i 11 r a'2 o e di I uyendo o meio de fermenta'2o concentrada por adi '2o de umtarrp2o. Uma vez armazenado, H executado um pri mei ro passo de contacto, em que o mei o de fermenta'2o col hi da di I u°do H posto emcontacto com um mei o de permita ani/Biica de modo que a neurotoxina botul°nica biologicamente activa esteja associada como meio de per mit a ani /Erii ca, depoi s el ui ndo a neur ot oxi na bot ul 0 ni ca capturada do meio de permita ani/Biica procede para assim obter um pri mei ro elu°do, seguido de um segundo passo de contacto em que o primeiro eluato H posto em contato comum meio de permita cati/friica para remover impurezas, obtendo assi m um segundo eluato que H submetido a c r omat ogr af i a de 1 nt er a '2 o hi d r of/Boi ca e depoi s processado por DF e f i I t r a do, obtendo assim neurotoxina botul°nica biologicamente ativa usando um processo subst anci ai ment e APF que utiliza c r omat ogr af i a.
Como exenpl o, o tenpo para a concl us2o do processo, desde a cultura das bactérias atU a obten'2o da neurotoxina botul°nica biologicamente activa pode ser entre cerca de 50 horas e cerca de 150 horas, rrai s pref erenci al ment e cerca de 80 horas a cerca de 120 horas, por exenpl o. Em formas de realiza'2o particulares, o meio de cultura conpreende η2 o rnai s do que cerca de 4% p/v de um produt o de prot e° na deri vado de vegetais, emoutro, o meio de cultura conpreende η2 o rnai s de cerca de 2% p/v de umextracto de levedura e ainda em outro, o mei o de cultura conpreende η2 o rnai s do que cerca de 2% p/v de glicose. O mei o de cultura pode conpreender o produto de prote°na derivado de vegetais, o extracto de levedura e a glicose em qual quer propor'2o de acordo comas quantidades percentuais indicadas em w/v. Num exerrpl o espec°fico, o n°vel de pH do meio de cultura pode ser de cerca de pH 6, 5 a cerca de pH 8,0, de prefer, nci a cerca de pH 6,8 a cerca de pH 7,6, rnai s pref erenci al ment e 7,3 no in°cio do passo de cultura. O passo de cultura pode ser realizado durante cerca de 8 horas e cerca de 14 horas, cerca de 10 horas a 12 horas, de prefer, nci a cerca de 11 horas, a uma tenperatura de cerca de 33 é C a cerca de 37 é C, de prefer, nci a a cerca de 34,5 é C, emuma c°mara anaer/Bai a. Em um exenpl o particular, a c°mara anaer/Bai a pode conter um filtro particular integral de alta ef i c i, nci a dentro do seu espa'o de trabalho, onde a cultura H conduzida. O passo de fermenta'2o pode ser realizado durante cerca de 60 horas e cerca de 80 horas, de prefer, nci a cerca de 72 horas a uma tenperatura de cerca de 33 é C a cerca de 37 é C, de prefer, nci a a 35 é C. De acordo com um aspecto da nossa inven'2o, o passo de colheita pode remover pelo menos cerca de 80% de ARN e ADN cont i dos no mei o de f er ment a '2 o e o mei o de permita ani/Bnica pode remover todo o ADN e ARN restante mensur®/el (abaixo do I i rri t e de detec'2o) na colheita meio de fermenta'2o. Noutro aspecto, o passo de colheita pode ser realizado durante cerca de 1 hora e cerca de 3 horas, de prefersncia cerca de 2,5 horas. Em exenpl os particulares, o passo de colheita pode ser realizado atU 75% do volume do meio de fermenta'2o original ter sido coletado. Num aspecto de uma forma de realiza'2o, o passo de concentra'2o pode ser realizado durante cerca de 30 ninutos e cerca de 2 horas, de prefersncia cerca de 0,75 horas. Noutro aspecto, o passo de d i I ui '2 o dilui o mei o de fermenta'2o colhido de volta ao peso inicial do meio de fermenta'2o no in°cio do passo de colheita. Um pri mei ro passo de contacto pode ser realizado durante cerca de 4 horas e cerca de 5 horas, por exenpl o. Numexenplo, o primeiro eluato da resina de permita ani/Eiica H recolhido a leituras de es pect r of ot /fmet r o de cerca de 150 rrAU ou superior, atU que as leituras do espect rof ot xmet ro a 280 nm di rri nuam do (Spice rríSki rro de volta para cerca de 150 rrAU. A segunda etapa de contacto pode ser realizada durante 1 hora e cerca de 3 horas, de prefersncia durante cerca de 2 horas. Este segundo eluato pode ser recolhido a partir da resina de permita cati/friica emleituras de espect rof ot xrnet r o de cerca de 100 rrAU ou superior, atU que as leituras do es pect r of ot xmet r o dirrinuamde (Spice rríSki rro para cerca de 100 rrAU, por exemplo. O processo compreende ainda um terceiro passo de contacto ap/δ o segundo passo de contacto, contactando o segundo eluato com um meio de interac'2o hi drof/Ebi co para remover ainda mai s i rrpurezas do segundo eluato e para assimobter umterceiro eluato. Este terceiro passo de contacto pode ser realizado durante cerca de 1 hora e 3 horas, de prefer, nci a durante cerca de 2 horas. O terceiro elu°do pode ser recolhido a partir do meio de interac'2o hi drof/fbi co a leituras de espect rof ot/fmet ro de cerca de 50 rrAU ou superior, ati que as leituras do espect rof ot/tmet ro di rri nuam do (Spice do pico de volta para cerca de 50 nAU, por exerrpl o. O passo de processamento por concentrado e di afi I tra'2o H aplicado ao terceiro elu°do e H realizado durante cerca de 2 horas e cerca de 4 horas. A redu'2o de carboidratos atravis da passagem do eluato que i concentrado e diafiltrada atravis de umfiltro de redu'2o de bi ocorrbust0 vel pode, consequentemente, ser realizada. Em formas de realiza'2o particulares, o processo corrpreende ainda um passo de congela'20 da neurotoxina botul°nica biologicamente activa obtida.
Em formas de real i za'2o particulares, o meio de cultura subst anci al ment e APF corrpreende um vol ume de entre cerca de 100 rrt e cerca de 500 rrt. Os passos de cultura particulares s2o iniciados pela introdu'2o entre cerca de 100 =1 e cerca de 500 =L de um mei o de banco de cill uI as de trabalho APF contendo Clostridium botulinum no meio de cul t ura subst anci al ment e APF. O passo de cul t ura pode ent2 o ter lugar numa c°mara anaer/Ebi a durante pelo menos cerca de 8 horas, de prefer, nci a cerca de 11 horas, por exerrpl o, a uma t errperat ur a de cerca de 34, 5 é C é 1 é C. Em um exerrpl o, o mei o do banco de c ill u I as de trabalho pode ter umteste de contagem de células vi dVel de pelo menos cerca de 1 x 104 unidades de forma'2o de col/Biias/rrL de meios de banco de c ill ui as de trabalho, por exerrpl o cerca de 1 x 105 a cerca de 5 x 107 formando col/Biias unidades/rrL de meios de banco de c ill ui as de trabalho, e a bactiria Cl ost r i di um bot ui i num no banco de c ill ul as de trabalho pode ter sido sei ecci onada para ter uma morfologia subst anci ai ment e uniforme.
Numa forma de realiza'2o, o meio de banco de c ill ul as de trabalho inclui cerca de 20% em volume de gl i cerol , tal como gl i cerol estiri I , por exerrpl o. A rrfdi a do banco de c ill ul as de trabalho pode ser feita por (a) cresci ment o Cl ost ri di um bot ulinum bactiria emummeio APF contendo cerca de 2%p/v de peptona de soja, cerca de 1%p/v de extracto de levedura e cerca de 1% p/v de glicose numa c°mara anaerAbi ca, a uma terrperatura de cerca de 34,5 é C é 1 é C ati uma densi dade Apt i ca de uma ai °quota do mei o medi do com um corrpri ment o de onda de cerca de 540 nm i de cerca de 2,5 é 1,0 AU, e; adicionando gl i cerol para obter uma concentra'2o de gl i cerol no meio de cerca de 20% obtendo assim um banco de c ill ul as de trabalho. Uma forma de armazenamento do banco de c ill ul as de trabalho pode ser preparada congelando o banco de c ill ul as de trabalho em apr oxi madament e abaixo de -135 é C, por exerrpl o. A forma de armazenamento do banco de cill ul as de trabalho, para ut i I i z a'2 o num processo exerrpl ar de acordo coma presente descri '2o, pode ser descongelada "" temperatura ambiente e utilizada para iniciar o passo de cultura. O passo de cul tura pode ser real i zado durante cerca de 8 horas e cerca de 14 horas, de prefer, ncia cerca de 11 horas a urra terrperatura de cerca de 33 é C a cerca de 37 é C, de prefer, nci a a cerca de 34,5 é C, numa c°rrara anaer/fbi ca, tal como, por exerrpl o, una c°nara/arn€ri o anaer/fbico comumfiltro de ar particulado de alta ef i c i, nc i a integrado (HEPA), de prefer, nci a dentro do seu espa'o de trabalho. O passo de fermenta'2o pode ser realizado durante cerca de 20 horas e cerca de 80 horas, de prefer, nci a de cerca de 60 horas a cerca de 80 horas, nais preferencial mente durante cerca de 72 horas a una terrperatura de cerca de 33 é C a cerca de 37 é C, de prefer, nci a a 35 é C. O processo pode ainda corrpr eender, por exerrpl o e antes do passo de cultura, um passo de perrritir a redu'2o oxidativa do meio de cultura subst anci al ment e APF expondo o mei o atmosfera de urra c°rrara anaer/Boi a. O processo t arrbUm pode incluir antes do passo de fermenta'2o, um passo de perrritir a redu'2o oxidativa do meio de fermenta'2o de APF subst anci al ment e, expondo tarrbUm o meio de fermentado ~ atmosfera de urra c°rrara anaer/Boi a. Corro um exerrpl o, o passo de perrritir a redu'2o oxidativa do meio de cultura subst anci al ment e APF pode ser realizado durante cerca de 10 horas e cerca de 14 horas na c° rrar a a na er/Boi a. Do mes rro rrodo, o passo de per rri t i r a redu'2o oxidativa do meio de fermenta'2o de APF subst anci al ment e no fermentador pode ser realizado durante cerca de 10 horas e cerca de 14 horas antes do in°cio do passo de fermenta'2c>. 0 Clostridium botulinum a fase de I i se pode ocorrer entre cerca de 35 horas e cerca de 70 horas apAs o in°cio do passo de fermenta'2o, por exenpl o. O meio de fermenta'2o pode ter umvolume entre cerca de 2 L e cerca de 75 L, entre cerca de 2 L e cerca de 30 L, ou entre cerca de 2 L e 20 L de mei o de fermenta'2o, por exenpl o. A total i dade deste processo pode ser realizada durante cerca de 50 horas a cerca de 150 horas, rnai s pref erenci al ment e de cerca de 80 horas a cerca de 120 horas. A neurotoxina botul°nica biologicamente activa assim obtida por este processo pode ter urna potsncia de cerca de 2, 4 x 107 a cerca de 5, 9 x 107 uni dades/ rrg de neurot oxi na bot ul°nica bi ologi carne nte activa, por exenpl o.
De acordo com um as pect o, no final da fermenta'2o, podem ser obtidos cerca de 40 rrg a cerca de 85 ng de neurotoxina botul°nica por litro de meio de fermenta'2o. Subsequentemente a v®rias fases de processamento ( f i 11 ra '2 o/crornat ograf i a/f i 11 ra '2 o), de cerca de 30 ng a cerca de 60 ng de neurotoxina botul°nica por litro de meio de fermenta'2o; de cerca de 5 ng a cerca de 25 ng de neurotoxina botul°nica por litro de meio de fermenta'2o; De cerca de 6 ng a cerca de 20 ng de neurotoxina botul°nica por litro de meio de fermenta'2o podemser obtidos.
Coito uma forma de realiza'2o, o pH do meio de fermenta'2o pode ser ajustado entre cerca de pH 6, 0 e cerca de pH 8, de prefersncia entre cerca de pH 6, 8 e cerca de pH 7, 6 no i n°ci o do passo de fermenta'2o, rnai s preferenci al mente cerca de pH 7,3. Em configurares particulares, pode ser utilizada urna coluna de crornat ograf i a ani/Eiica que contUmde cerca de 600 rrt a cerca de 800 rrt de resina de crornat ograf i a de permita ani/Enica. A coluna de crornat ograf i a de ani bes pode ter umdi°metro de cerca de 8 cm a cerca de 10 eme, por exerrpl o, uma altura de cama de resina de crornat ograf i a de troca ani/Eiica na coluna de cerca de 9 cm a cerca de 16 cm Uma taxa de fluxo de meio de fermenta'2o através da resi na de crornat ograf i a de per mit a ani /Bii ca pode ser de cerca de 140 cmíhora a cerca de 250 cmíhora, ou de cerca de 150 cmíhora a cerca de 160 cmíhora, por exenpl o. Noutro aspecto, pode ser utilizada no processo cerca de 150 rrL a cerca de 300 rrt de resina de c r omat ogr af i a de permita cati/Brica numa coluna de crornat ograf i a, emque a coluna de cr omat ogr af i a de catibes t em um di ° met r o de cerca de 5 cm a cerca de 8 cm e uma resina de cr omat ogr af i a de permita cati/Brica altura do leito de cerca de 5 cm a cerca de 11 crp por exerrpl o. O processo pode i nel ui r pel o menos um de um passo de diafiltra'2o e/ou um passo de redu'2o de bi omassa. O passo de redu'2o de bi omassa pode utilizar um filtro de cSpsul a. A di afi I tra'2o de eluato purificado H de prefer, nci a realizada antes de um passo de redu'2o de bi omassa. Em um exerrpl o, o passo de di af i 11 r ar o el uato puri f i ca do adi ci onado H precedido ou seguido pelo ajuste da concentra'2o do eluato purificado adi ci onal ment e di afi I trado e passando o eluato purificado adi ci onal ment e purificado com di afi I trado ajustado na concentra'2o através de umfiltro de redu'2o de bi omassa. O processo pode proporcionar uma neurotoxina botul°nica obtido tendo uma pot5ncia, tal corro deterninado por umbi oensai o emratos DL50, da parti r de pel o menos cerca de 2,0 x 10 7 unidades/rrg de toxina botul°nica, tal corro cerca de 2,4 x 10 7 a cerca de 6,0 x 10 7 unidades/rrg de neurotoxina botul°nica. A recupera'2o exerrpl i f i cat i va no fi nal do processo de cerca de 4 rrg a cerca de 25 rrg de toxi na botul°nica pode ser recuperada por litro de meio de fermenta'2o, por exerrpl o. A neurotoxina botul°nica pode ser composta com pelo menos um excipiente adequado para produzir uma composi '2o farmac, ut i ca substanci al mente APF. Emumexerrpl o, 0 rrlfltodo inclui o passo de secar a neurotoxina botul°nica composta e pelo menos um excipiente adequado para obter uma forma es t CBVe I para embarque ou armazenamento, por 1 i of i I i za '2 o ou I i of i I i za'2 o ou secagem a vdtuo, em que o ingrediente ativo H o botul°nico biologicamente ativo neurotoxina, em que o meio de fermenta'2o compreende um produto proteico obtido a partir de umvegetal. O vegetal a partir do qual o produto proteico pode ser obtido pode ser uma soja, rri I ho ou malte, semente desordenada de Lupi nus carrpestris, ou produtos hi drol i sados deles. Em formas de
realiza'2o particulares, o excipiente adequado H sei ecci onado do grupo que consiste em alburn na, a I burn na de soro humano, albumina de soro humano recombi nant e, gelatina, sacarose, trealose, hi droxi et i I a rri d2 o, col agllni o, lactose, sacarose, arri no®ci dos, cloreto de s/ffli o, cloreto de pot®ssio, pol i ssacar0 deo, caprilato, pol i vi ni I pi r r ol i dona e citrato de potdSsio. Em exerrpl os particulares, a secagem em v(Stuo ocorre a uma temperatura de cerca de 20 é C a cerca de 25 é C. Emalgumas formas de realiza'2o, a secagemsob v(§tuo ocorre a uma press2o de cerca de 70 mrrHg a cerca de 90 mrrHg, por exemplo. O tenrpo de secagema v(Stuo pode ser de cerca de 4 horas a cerca de 5 horas, por exerrpl o.
Num exemplo particular, uma corrposi'2o farmac,utica compreende uma neurotoxina botulinica biologicamente activa, em que a neurotoxina botul°nica tem uma pot,ncia entre cerca de 2, 0 x 10 7 a cerca de 6,0 x 10 7 uni dades/ rrg de neur ot oxi na bot ul 0 ni ca bi ol ogi cament e act i vo, e, pel o menos, uma exci pi ente, emque a conrposi '2o corrpreende menos de cerca de 12 ppm de ®Ci do nucl ei co, de prefer, nci a menos de 1 ppm de (Sti do nucl ei co por ng de corrpl exo de neurot oxi na bot ul0 ni ca.
Numa forma de realiza'2o particular, um APF subst anci al ment e processo cromat ogr®f i co para a obten'2o de uma neurotoxina botulinica biologicamente activa corrpreende os seguintes passos sequenciais de: cultivar bactUrias Clostridium botulinum num meio de cultura APF subst anci al ment e para entre cerca de 10 horas e cerca de 12 horas, ou atU que umA medi '2o de bi ornassa do meio de cultura temuma densi dade /φΐ i ca, comumconpri mento de onda de cerca de 540 nanxmetros (nrr), de entre aproxi madament e 0,8 UA e cerca de 4, 5 UA; f er ment ando a bact Ur i a Cl ost r i di um bot ul i num do meio de cultura emummeio de fermenta'2o substancialmente APF durante cerca de 65 horas atU cerca de 75 horas ou atU que seja tomada uma medi'2o de bi ornassa no final da fermenta'2o medi ndo a densi dade /fpt ica do meio de fermenta'2o usando urra sonda de bi omassa online um conpr i ment o de onda de cerca de 890 nmest® entre cerca de 0,05 UA e cerca de 0,7 UA; colhendo o meio de fermenta'2o durante aproxi madament e 2,5 horas, pelo que os restos celulares no meio de fermenta'2o s2o removidos e o peso do meio de fermenta'2o H reduzido para cerca de tr5s quartos do seu peso inicial no in°cio do passo de colheita; concentrando o meio de fermenta'2o colhi do por f i I t r a '2 o de fluxo t angenci ai para cerca de um quarto do seu volume inicial no in°cio do passo de colheita; d i I ui '2 o do meio de fermenta'2o concentrada por adi '2o de um tarrp2o, em que as etapas de concentra'2o e d i I ui '2 o ocorrem entre cerca de 0,5 horas a cerca de 2 horas, pelo que durante a concentra'2o o mei o de fermenta'2o H reduzido para cerca de um quarto do seu peso inicial no in°cio da colheita passo, e depois H dilu°do, pel a adi '2 o do t anp2 o, de volta ao seu peso inicial inicial no in°cio do passo de colheita; contactar o meio de fermenta'2o dilu°do com um mei o de c r omat ogr af i a de permita ani/Biica, para capturar a neurotoxina botul°nica biologicamente activa, durante umper°odo de tenpo de cerca de 4 horas a cerca de 5 horas; entrar em contacto com o elu°do do meio de c r omat ogr af i a de permita ani/Biica comum meio de c r omat ogr af i a de troca de catibes para conduzir uma primeira opera'2o de polimento para remover i rrpurezas do mesmo durante umper°odo de tenpo de cerca de 1,5 horas a cerca de 2,5 horas; conduzindo uma segunda corrida de pol i mento fazendo passar o el uente dos mei os de cromatografi a de polimento através de um meio de intera'2o hi drof/fbi co durante umper°odo de tenpo de cerca de 1,5 horas a cerca de 2,5 horas; processamento de elu°do do meio de interac'2o hi drof/Bai co por di afi I tra'2 o, durante umper°odo de tenpo de cerca de 1 hora a cerca de 4 horas; e f i 11 r a'2 o do eluato processado através de um filtro de redu'2o de bio-carga, durante cerca de 0,5 horas, obtendo assim neurotoxina botul°nica biologicamente ativa.
Numa forma de realiza'2o do sistema da inven'2o, uma coluna de crornat ograf i a com um di ° met ro entre cerca de 8 cm e cerca de 15 cm contam o meio de c r omat ogr af i a de permita ani/Biica e o meio de c r omat ogr af i a de permita ani/Biica pode ter uma altura de cama na coluna de cerca de 8 eme cerca de 15 crp por exenpl o. Ainda em outro exenpl o, o quinto aparelho do sistema conpreende uma coluna de c r omat ogr af i a que H operada a uma taxa de fluxo entre cerca de 125 cmíhora e cerca de 200 cmíhora, e a coluna pode ter umvolume de coluna entre cerca de 500 rrt e cerca de 1L. Num aspecto, o quinto aparelho pode ter umvolume de coluna de cerca de 50 rrt e cerca de 500 rrt, e uma altura de cama de cerca de 8 cm e cerca de 15 crp por exenpl o. Em alguns exenpl os, a coluna de c r omat ogr af i a do quinto aparelho tem umdi°metro de coluna de cerca de 2 eme cerca de 10 crp por exenpl o. A coluna de c r omat ogr af i a do quinto aparelho pode ter uma taxa de fluxo exerrpl ar entre cerca de 100 eme cerca de 200 cmíhora. O oi tavo aparei ho do si sterna conpreende uma merrbrana de f i I t r a '2 o.
Em outra forma de realiza'2o, o sistema pode conpreender ainda um nono aparelho, o nono dispositivo que corrpreende urra c°rrara anaer/fbi ca para proporcionar urra atmosfera anaer/fbi a, onde o primeiro aparelho para a cultura de Cl ost r i di um bot ul i num A bact Ur i a est ® cont i da. Est e nono aparelho inclui, de prefer, nci a, umfiltro de ar parti culado de alta ef i ci, nci a i nt egr ado ( HE PA) I ocal i zado dent r o da sua c° rrara/est a'2 o de trabalho. O segundo aparelho do si sterna (para fermenta'2o) pode incluir pelo menos urra sonda para detectar potencial de oxi da'2 o-r edu'2 o ou pH ou densidade /fptica. Em um exerrpl o particular, urra pelo menos urra sonda descart®/el H selecionada do grupo que consiste emurra sonda de redu'2o-oxi da'2o, urra sonda de pH e urra sonda de turva'2o. O oi t avo aparei ho do si sterna pode corrpreender um aparei ho de filtra'2o de fluxo tangencial para concentra'2o e troca de tarrp2o. Nurra outra forrra de realiza'2o, o sisterra pode corrpreender um dUci rro aparei ho que i ncl ui um aparei ho de redu'2o de bi orrassa para reduzir a bi orrassa. Num exerrpl o, o aparelho de redu'2o de bi orrassa corrpreende um ajustador com umtarranho de poro de cerca de cerca de 0, 1 =m e 0, 3 =rp de prefer, nci a 0, 2 =m O si sterna tarrbUmpode incluir um dUci rro primeiro aparelho para uso ap/fs a obten'2o da segunda neurotoxina botul°nica purificada, para armazenar a neurotoxina botul°nica purificada. Num exerrpl o, este aparelho de armazenamento proporciona uma terrperatura de armazenamento entre cerca de -25 é C a cerca de -80 é C.
UmniUtodo para tratar urra condi '2o num doente pode utilizar uma corrposi'2o farrrac, utica corrpr eendendo a neurotoxina bot ul 0 nica obtida de acordo cornos rrlfltodos aqui descritos. Urra condi '2o pode incluir uma doen'a, doen'a, doen'a ou deform dade ou aparência cosrrfltica. Emumexenplo, o rrlTltodo de tratamento de uma condi '2o em um paciente corrpreende o passo de administrar ao paciente uma quantidade t er apeut i cament e eficaz de uma composi'2o farmacj utica compreendendo uma neurotoxina botul°nica e pel o menos um excipiente adequado, em que a toxina botul°nica possui uma po^ncia de cerca de 1 unidade h cerca de . 02 pi cogramas para assimtratar a condi '2 o do paci ent e.
Em uma forma de realiza'2o de um APF substand al mente sistema crorratogr®f i co para a obten'2o de uma neurotoxina botulinica biologicamente activo est® inclu°do, o sistema compreendendo um primeiro aparelho para anaer/fbi o da cultura de bactUrias Cl ost r i di um bot ul i num) o primeiro aparelho capaz de conter a partir de cerca de 200 rrt para cerca de 1 L de um subst anci al ment e meio de cultura APF; um segundo aparelho para a fermenta'2o anaer/Ibi ca de bactérias Clostridium botulinum que foi cultivada no primeiro aparelho, o segundo aparelho capaz de conter de cerca de 5 L a cerca de 75 L, ou de cerca de 2 L a cerca de 75 L, ou de cerca de 2 L a cerca de 30 L de um mei o de fermenta'2o subst anci al ment e APF e incluindo pelo menos uma sonda descart®/el sei ecci onada do grupo constitu°do por uma sonda de redu'2 o-oxi da'2 o, uma sonda de pH e uma sonda de turva'2o; um nono aparelho para proporcionar uma atmosfera anaer/0DÍ ca e capaz de conter o primeiro aparelho, o nono aparelho compreendendo uma c°mara anaer/Ebi ca possuindo um filtro de ar part i cul a do de alta ef i ci 5 nci a i nt eg r a do dent r o da c°mara, em que a referida c°mara pode conter o primeiro aparelho para cultivo anaer/Bai co de bactérias Clostridium botulinum ; um terceiro aparelho para colher o meio de fermenta'2o; umquarto aparelho para realizar a concentra'2o e a d i I ui '2 o do meio colhido, um quinto aparelho para realizar uma primeira purifica'2o de neurotoxina botul°nica obtida a partir do quarto aparelho, sendo o quinto aparelho um mei o de c r omat ogr af i a de permita ani/Biica, obtendo assim uma primeira neurotoxina botul°nica purificada; um sexto aparelho para realizar uma segunda pu r i f i c a '2 o da primeira neurotoxina botul°nica purificada, o sexto aparelho conpreendendo um mei o de c r omat ogr af i a de permita cati/Biica, obt endo as si m uma segunda neurot oxi na bot ui 0 ni ca puri f i cada; urnsUtirro aparelho que realiza uma terceira purifica'2o da segunda neurot oxi na bot ui 0 ni ca pur i f i cada, o sUt i rro aparei ho conpr eendendo mei os de i ntera'2o hi drof/Bai cos, obtendo assi m uma terceira neurotoxina botul°nica purificada; e um oitavo aparelho para concentra'2o e troca de tanp2o da terceira neurotoxina botul°nica purificada, o oitavo aparelho que conpreende uma merrbrana TFF.
Em exenpl os particulares, o meio de fermenta'2o conpreende η2 o mai s de cerca de 5% p/v de um produto de prote°na derivado de vegetais, η2 o mai s de cerca de 2% p/v de umextracto de levedura e η2 o mai s de cerca de 2% p/v de glicose, e onde o n°vel de pH do meio de fermenta'2o H de cerca de pH 6, 8 a cerca de 7,6, de prefersncia cerca de pH 7,3 no in°cio de um passo de fermenta'2o de cerca de 72 horas, por exenpl o. O rrlUtodo de tratamento das condi 'bes pode enpregar uma neurotoxina botul°nica que H obtida corro um conponente de neurotoxina de toxina botul°nica com um peso molecular de cerca de 150 kDa, livre das prote°nas conpl exant es de um conpl exo de toxina botul°nica. As etapas de adrri ni st r a'2 o exenpl i f i cat i vas podem ser selecionadas a partir do grupo de rotas de adrri ni st r a'2 o consistindo em adrri ni st r a'2 o i nt rarruscul ar, i nt r adUr rri ca, subcut°nea, i nt ragl andul ar, intratecal, rectal, oral e t ransdUr rri ca, e a neur ot oxi na bot ul°nica H selecionada do grupo que consiste em toxina bot ul 0 nica t i po A, B, C 1, D, E, F ou G. De prefersncia, a neurotoxina botul°nica H neurotoxina bot ul 0 ni ca de t i po A.
Em alguns exenpl os, o sistema pode facilitar um processo pelo qual um conpl exo de neurotoxina botul°nica biologicamente activo pode ser obtida para utiliza'2o corro parte de uma conposi '2o farmac5utica que conpreende menos do que cerca de 12 ng de (Sti do nucl ei co por rrg de conpl exo de neurotoxina botul°nica, de prefersncia abaixo de 1 ng de (St i do nucl ei co por rrg de conpl exo de neurotoxi na botul 0 ni ca, mai s pref erenci al ment e η2 o tendo um (St i do nucl ei co mensur®/el (por exenpl o abaixo de um I irrite de detec'2o).
Desenho A Figura 1A H um fluxograma que nostra etapas irrportantes no processo NAPF do Exenpl o 1. A Figura 1B H um diagrama de fluxo que rrost ra os passos pri nci pai s no processo IAPF do Exerrpl o 2, em que os passos de c r omat ogr af i a de captura e polimento podem ut i I i zar uma coluna de 2 colunas (troca de aniles seguida de troca de catives) ou 3 colunas ( FAPF) (troca de ani Pes seguida de troca de catiPes seguida por urra coluna de intera'2o hi dr of /Bdí ca).
Peser i '2 o A nossa inven'2o baseia-se na descoberta de que urra neurotoxina Clostridial de alta potsncia, de alta pureza e biologicamente ativa, corra urra neurotoxina botul°nica, pode ser obtida por meio de um si sterna e processo de crorrat ograf i a APF si npl es, rdpi do e econxrri co.
Significativamente, o uso de nosso sisterra e processo pode resultar em urra neurotoxina botul°nica purificada conpreendendo 1 ng (ou menos de 1 ng) de i npurezas de (Sti do nucl ei co (ARN e DNA) por 1 rrg da neurotoxina botul°nica purificada obtida, mesrra que nenhurra enzi rra derivada de ani rrai s, tais corra RNase e DNase, s2o utilizados para purificar a neurotoxina botul°nica fermentada. Por exenpl o, o uso de nosso sisterra e processo pode resultar em urra neurotoxina botul°nica purificada conpreendendo menos de cerca de 0,6 ng de i npurezas de ®ci do nucl ei co (ARN e DNA) por niligrarra de neurotoxina botul°nica purificada, obtida. A neurot oxi na bot ul 0 ni ca obt i da pode ser um conpl exo de t i po A de t oxi na bot ul 0 ni ca, corra um corrpl exo de 300 kDa, 500 kDa ou 900 kDa (peso molecular aproximado) ou suas rristuras. A neurotoxina botul°nica obtida t arrbUm pode ser um component e neurot/Ed co do tipo toxina botul°nica (isto H, sem as prote°nas corrpl exas) com um peso molecular de cerca de 150 kDa. A neurotoxina botul°nica pode ser qualquer um dos serotiposA, B, C, D, E, F ou G ou suas rri st ur as. AI Hm disso, os sistemas e processos melhorados podem ser praticados em conjunto com uma toxina botul°nica r ecorrbi nant e, h°brida, quirrlUrica ou modificada (cadeia leve, cadeia pesada ou ambas as cadeias em conjunto).
Umaspecto i nportante da nossa i nven'2o H o uso de uma permita ani/Eiica (de captura) meios de cr omat ogr af i a seguido por ut i I i z a'2 o de permita cati/Biica (polimento) meios de c r omat ogr af i a para purificar neurotoxina botul°nica a parti r de um mei o de fermenta'2o no qual APF em que a bactéria Cl ost r i di um bot ul i num f oi fermentada. Descobrimos que o uso da troca de ani Pes seguida pelo uso de meios de cromat ograf i a de troca de catiPes fornece um nifltodo eficaz e r dpi do para a obten'2o de neurotoxina botul°nica de alta pureza e alto rendimento. Anteri or mente, pensava-se que o uso de cromat ograf i a de permita ani/Ehica tinha um efeito prejudicial nos padrPes de bandas de gel da neurotoxina botul°nica, desencorajando assim a ut i I i z a'2 o da cr omat ogr af i a de troca de ani Pes para a purifica'2o de neurotoxina bot ul 0 nica. Veja, por exemplo, Patente US 7 452 697 na coluna 55, linhas 53-57.
Outro aspecto importante da nossa inven'2o H que resulta em neurotoxi na botul°nica de alta pureza (ou seja, tT 1 ng de dei do nucleico/ng de neurotoxina bot ul0 nica obtida), conforme estabelecido acima. Um outro aspecto irrportante da nossa inven'2o H que enquanto o processo conhecido de Schantz requer vdrias semanas (ou seja, tipicamente cerca de 18 a cerca de 22 dias) para cultivar, fermentar e purificar a neurotoxina botul°nica, umsistema e processo dentro do escopo da nossa inven'2o pernite toda a cultura, etapas de fermenta'2o e purifica'2o a serem conpletadas emuma semana ou menos. Numa forma de realiza'2o preferida da nossa inven'2o, todas as etapas de cultura, fermenta'2o e purifica'2o podemser conpletadas emseis dias ou menos. Numa forma de realiza'2o mai s preferida da nossa inven'2o, todas as etapas de cultura, fermenta'2o e purifica'2o podemser conpletadas emcerca de quatro dias ou menos (por exenpl o, dentro de cerca de 80 a cerca de 144 horas ou dentro de um interval o de tenpo entre elas). N/ts inventamos esta forma de realiza'2o r®pi da, mai s preferida da presente inven'2o através do desenvolvimento de um processo de nove passos (e o sistema para realizar o processo) e ao concluir que cada um dos nove passos pode ser conpletada dentro dos per°odos de tenpo def i ni dos abai xo: cerca de 8 horas a cerca de 14 horas para a c u I t u r a; cerca de 60 horas a cerca de 80 horas para f er ment a '2 o; cerca de 2,5 horas para a colheita; cerca de 2 horas a cerca de 4 horas para se concent rar e di I ui r; cerca de 4 horas a cerca de 6 horas para a crornatografi a de permita ani/Biica (isto inclui tenpo para el ui r a toxina botul°nica capturada) cerca de 2 horas para c r ornat ogr af i a de permita cat i /Bii ca; cerca de 2 horas para um terceiro passo de c r ornat ogr af i a (ou seja, c r ornat ogr af i a de intera'2o hi drof/fbi ca; cerca de 2 horas a cerca de 4 horas para concentra'2o e di afi I tra'2 o, e; cerca de meia hora para f i I t r a '2 o adicional.
Assi rp o tenpo total requerido para conpletar a nossa forma de realiza'2o r®pi da e preferida de 9 passos da nossa inven'2o H de apr oxi madament e 75 horas a cerca de 150 horas. A nossa inven'2o H mai s eficiente e econorriza terrpo. Em um aspecto, o nosso novo processo utiliza linhas celulares pri-sei eci onadas e verificadas e, portanto, destr/H as etapas do processo de Shantz da tUcnica anterior de plaqueamento e crescimento de c ill u I as, selecionando e colhendo col/Biias e anpl i ando a expans2o da linha celular das col/Eiias colhidas (antes dos passos de cultura celular e fermenta'2o) que foram necess®ri os para cultura e depois i nocul ar o mei o de fermenta'2o. Numaspecto, a nossa i nven'2o come'a imediatamente a cultivar c ill u I as pri- sel ecci onadas para i nocul a'2o de um mei o de cultura de APF, econorrizando assimterrpo e etapas do processo.
Atravis da experi ment a'2 o foi desenvolvido um de tr,s colunas (" FAPF"/" FI APF") sistema de cr omat ogr af i a e processo para purificar a neurotoxina botul°nica presente no mei o de fermenta'2o, o mei o de fermenta'2o resultante de uma fermenta'2o APF de bacteria Clostridium botulinum Significativamente, enquanto um processo de fermenta'2o de APF pode reduzir ou eliminar produtos derivados de animais (corro case°na e caldo de carne) corro nutrientes dos meios utilizados para cultivar e fermentar bactérias cl ost ri di anas, os processos conhecidos de fermenta'2o de APF s2o tipicamente seguidos por uma ou mai s etapas de pu r i f i c a '2 o que fazem uso de produtos derivados de animais, corro as enzimas DNase e RNase. Nossos sistemas e processos para purificar a neurotoxina botul°nica presentes emummeio de fermenta'2o de APF η2 o usamenzimas derivadas de animais. A nossa inven'2o pode abranger o carregamento de um mei o de f er ment a '2 o col hi do ( por exerrpl o, cl ar i f i ca do por f i 11 r a'2 o) numa coluna de permita ani/Biica tal corro uma resina de c r omat ogr af i a de permita ani/Biica POROS* 50HQ da Applied Biosysterrc. Em um aspecto, pode usar-se um mei o de troca de ani Pes forte, possuindo uma matriz base de pol i est i r eno/ di vi ni I benze no e di 0 met ro de part°cula de cerca de 50 =m e capacidade din°rrica ( BSA rrg/ rri) de cerca de 60-70. A coluna de troca de ani Pes captura a neurotoxina Clostridial (corro um conpl exo de toxina bot ul° nica) e reduz os n°veis de i npurezas. Verificou-se que unra coluna de permita de ani Pes proporcionou unra captura eficiente de um conpl exo de t oxi na bot ul°nica a partir de meiodefermenta'2o colhida com reten'2o da atividade biolAgica do corrpl exo de toxina botul°nica, al Hm de separar rruitas i rrpurezas presentes coma toxina botul°nica no meio de fermenta'2o. Um tanp2o adequado H usado para el ui r a neurotoxina Clostridial capturada (encadernada) da coluna de permita ani/Biica. O elu°do (contendo a neurotoxina bot ul 0 nica) da col una de permita ani /Bii ca H carregado nunra col una de perrmta cati/Biica para purificar ainda nrai s a neurotoxina botul°nica a parti r de i rrpurezas. A col una de troca de cati Pes pode ser unra resina de permita cati/Eli ca POROS* 20HS da Applied BiosystemE. Em um aspecto, pode usar-se um mei o de troca de catiPes forte, possuindo unra nratriz base de pol i est i reno/di vi ni I benzeno e di°metro de part°culas de cerca de 20 =m e capacidade de I i ga'2 o din°nica (lisosime rrg/rri) de cerca de> 75. Na fornra de realiza'2o de tr5s colunas (FAPF) da nossa inven'2o, o eluato da coluna de permita de catiPes H carregado nurrra coluna de interac'2o hi drof/fbi ca tal corro a resina Phenyl Sepharose HP da GE Healthcare para purificar ainda nrai s a neurotoxina botul°nica. Num aspecto, pode ser utilizada unra nratriz de esferas de agarose altamente reticuladas com um t arranho de part°cula de cerca de 34 =rp que foram deri vadas com grupos fenilo e t5 m uma capacidade de I i ga'2 o din°nica ( qui mot r i psi nogHni o rrg/ ni) de cerca de 45.
Oeluente da β| ti ma coluna usada H post er i or ment e processado para obter um conpl exo de toxina botul°nica em massa altamente purificado. As etapas de processamento p/6-crornatografi a incluema diafiltra'2o e t arrioHm podem i ncl ui r f i I t r a '2 o estéril e prepara'2o de urna solu'2o de conpl exo de toxina botul°nica purificada em vez de urna suspens2o (arte anterior), de prefersncia em citrato de potdSsio e, num exenpl o, a urna concentra'2o de citrato de potdSsio 10 rrM a urn pH de cerca de 6, 5.
Em certas formas de realiza'2o preferidas, os meios para o crescimento (cultura anaer/Boi ca e fermenta'2o anaer/Boi ca) de Cl ost ri di um bot ul i num e a produ'2 o de t oxi na botul°nica pode conpreender produtos - base de soj a para subst i t ui r produt os deri vados de ani mai s de rrodo que os mei os utilizados sejam substancial ou total mente isentos de produt os deri vados de animais. 0 passo de cultura aumenta a quantidade de rri croorgani srms para subsequente fermenta'2o. Culturagem pernite que bactérias latentes e previ amente congeladas se rejuvenescem em culturas que crescem ativamente. AI Hm disso, o volume e a quantidade de rri croorgani smos vi ®/ei s utilizados para inocular o mei o de fermenta'2o podem ser controlados de forma mai s precisa a partir de uma cultura que cres'a ativamente do que o que pode ser aparti r de um ar mazenament ο, η2 o propaga'2o do banco celular de Cl ost r i di um bot ul i num Assi rp uma amostra de um banco de c ill ul as de trabalho em mei o APF H descongelada e colocada no mei o de cultura APF selecionado. Ao obter um n°vel adequado de crescimento bacteriano, o mei o de cultura H utilizado para inocular o mei o de fermenta'2o. Como um exenpl o, de cerca de 1% a cerca de 5% ou uma quantidade entre eles, do meio de cultura tendo Cl ost r i di um bot ul i num a partir da fase de crescimento H utilizada para inocular o meio de ferment a'2 o. A ferment a'2o H realizada para produzi r a quantidade nrfgki ma de c ill ul as microbianas em um arrbi ent e anaer/Ibi co em larga escala (Ljungdahl et a I . # IVbnual of industrial microbiology and biotechnology ( 1986), edited by Derrai n et a I , Ameri can Soci ety for M crobi ol ogy, V\èshington, D. C. page. 84). Alternativamente, o crescimento de
Cl ost r i di um bot ulinumno meio de fermenta'2o pode prossegui r adicionando a armstra do banco de c ill u I as de trabalho diretamente ao meio de fermenta'2o.
No est a do da t ieni ca, o cresci me nt o de Cl ost ri di um botulinum no meio de cultura geral mente ocorre em dois estCSgios, um primeiro estdgio de revestimento celular, crescimento, sele'2o e crescimento de col/Biias celulares, segui do de urna segunda et apa de i noeul a '2 o do mei o de cultura (tipicamente urna cultura step-up em dois estdgios) e i noeul a'2o do meio de fermenta'2o e produ'2o de toxina bot ul0 ni ca. De pref er, nci a, o cresci me nt o no mei o de cul t ura em qualquer estdgio η2 o resulta em I i se celular antes da i noeul a'2o dos meios de fermenta'2o como crescimento final no meio de cultura. Assi rp antes da nossa inven'2o levou cerca de quatro dias para a cultura de bactérias Clostridium bot ul i num ant es do in°cio da etapa de fermenta'2o. De acordo com a nossa inven'2o, sorros capazes de corrpletar toda a cultura em apenas 8 a 14 horas porque n2o h® necessi dade de etapas previ amente utilizadas de células de revestimento, tenpo de espera subsequente para o crescimento de col/Bii as emplacas de agar de sangue, sele'2o de col/Biias das placas para cresci me nt o em pequenos vol umes de cultura (por exerrpl o, 8-9 nt) que fornecement2o umi n/fcul o para o meio de cultura. De acordo com um aspecto da nossa inven'2o, as cill ul as pri-sel ecci onadas s2o utilizadas directamente para inocular o meio de cultura que i ent2o utilizado para inocular o meio de fermenta'2o em grande escala a partir do qual a toxina botul°nica i event uai ment e purificada, el i rri nando assi m o revestimento, a forrra'2o de col/Biias, a selec'2o e passagem para as etapas previamente utilizadas para cultivar c ill ul as que i nocul am um mei o de cultura que i ent2o utilizado para inocular o mei o de fermenta'2o.
Qs meios de cultura baseados em ani mai s (n2o-APF ou "NAPF") geral mente i ncl uem mei os de infus2o de cora'2o cerebral (BHI), bact o-pept ona, NaCI e glicose. Qs meios culturais dentro do °rrbito da nossa inven'2o s2o meios de cultura APF. Por exerrpl o, um produto - base de soja pode ser usado em vez de BHI e bact o-pept ona na cultura e meios de fermenta'2o. De prefer5ncia, o produto ~ base de soja i sol βνβΙ em (Egua e corrpreende soja hidrolisada, errbora a Cl ost r i di um bot ul i num possa crescer emrrtdias contendo soja i nsol Bvel . Qualquer fonte de produtos - base de soja pode ser utilizada de acordo com a presente inven'2o. De prefer, nci a, a soj a H soj a hi drol i sada e a hidroliza'2o foi realizada utilizando enzimas n2o-animais. As fontes de soja hi drol i sada ou sol Bvel i ncl uem Hy- Soy ( Quest I nt er nat i onal ), Pept one de soj a ( Gi bco) Bac-soyt one ( Di f co), AM SOY ( Quest), NZ soja (Quest), NZ soy BL4, NZ soy BL7, SE50M ( DIW International Nutricionais) e SE50IVK (DIW).
EXEIVPLOS
Os exenpl os seguintes apresentam formas de realiza'2o particulares da nossa inven'2o e η2 o se destinam a lirritar o ° rrbi t o da nossa inven'2o. Salvo disposi'2o em contrario nos exenpl os "toxina" ou "toxina botul°nica" significa um corrpl exo de toxina botul°nica tipo A comum peso molecular de cerca de 900 kDa. Os sistemas e o rrlfltodo aqui divulgados para purificar um corrpl exo de tipo A de toxina botul°nica com um peso molecular de cerca de 900 kDa ^muma aplicabilidade pronta para a purifica'2o de cerca de 150 kDa, cerca de 300 kDa, cerca de 500 kDa, bem como outras toxinas, complexos, ser/Sipos de toxina botul°nica e componente neurot/Bd co de toxina botul°nica.
Exemplo 1 (comparativo)
Processo n2o-APF (Schantz) para obter uma toxina bot ui 0 ni ca
Este exemplo apresenta o processo Schantz da técnica anterior para a obten'2o de neurotoxina botul°nica. 0 processo H um processo n2o-APF que utiliza meios e reagentes derivados de animais (por exenpl o, placas de agar de sangue bovi no para cultura, case0 na no mei o de f er ment a '2 o e uso de enzimas RNase e DNase para purifica'2o de neurotoxina botul°nica). A Figura 1A H umfluxograma que mostra os principais passos do processo Schantz. O processo Schantz tem cerca de 16 a 20 etapas principais, pois o trabalho em escal a de produ'2o usa um f er ment ador de 115 L e leva cerca de 3 semanas para ser conclu°do. O processo de Schantz H iniciado pela descongel a'2 o de um frasco n2o-APF de banco de cHI ui as mestre de Cl ost r i di um bot ul i num ( MSB) tenperatura arrbiente seguido de quatro etapas de cultivo. Primeiro para selecionar col /Bii as com uma morfologia adequada, as al°quotas do frasco de MZB descongelado foram listadas emplacas de agar de sangue Columbia Columbia ( CBA) pre-reduzi das e incubadas anaer obi cament e por 30-48 horas em 34 é C é 1 é C.
Emsegundo lugar, as col/Biias sei ecci onadas foram i nocul adas em tubos de ensaio de 9 rrt contendo um mei o de crescimento de case°na durante 6-12 horas a 34 é C. Qs conteSdos do tubo de 9 rrt como crescimento mai s r dpi do e a maior densidade (etapa de sele'2o de crescimento) forament2o cultivados por meio de duas incuba'Pes anaer/fbi cas step-up (o terceiro e quart o passos de cul t i vo), sendo uma i ncuba '2 o de 12-30 horas a 34 é C emumfrasco de cultivo de semente de 600 rrt a 1 L, seguido de um cultivo em um f er ment ador de semente de 15 L a 25 L contendo um mei o de crescimento de case0 na durante 6-16 horas a 35 é C. Estes dois cultivos step-up foram realizados em um mei o nutritivo contendo 2% de hidrolisado de case°na (umconposto de case°na [prote°na de leite]), 1% de extracto de levedura e 1% de glicose (dextrose) em (Egua a pH 7, 3.
Os cultivos step-up foram seguidos por urna incuba'2o adicional durante 60- 96 horas a 35 é C num fermentador de produ'2o comercial (isto H, 115 L) emummeio contendo case°na sob uma atmosfera anaer/Boi a controlada. O crescimento da bactUria H geral mente conpleto ap/ts 24 a 36 horas e durante o passo de fermenta'2o realizado durante cerca de 65 a cerca de 72 horas, onde a maioria das cHI ui as sofre I i se e liberta neurotoxina botul°nica. Acredita-se que a toxina H liberada pela I i se celular e ativada pelas proteases presentes no meio. Umfil trado do meio de cultura pode ser preparado usando umf i 11 ro de prof undi da de de camada Bni ca para remover as i rrpurezas brutas (isto H, cHl ui as inteiras e rompidas), obtendo assim uma solu'2o clara referida como uma cultura esclarecida. A coleta de neurotoxina botul°nica da cultura esclarecida foi realizada reduzi ndo o pH da cul t ura cl ari f i cada para pH 3, 5 com (Sti do sulfBrico 3M para precipitar a toxina em bruto a 20 é C ( pr eci pi t a'2 o de aci di f i ca'2 o). A neurotoxina botul°nica em bruto foi ent2o concentrada (para obter uma redu'2o de volume) por ul trarri crofi I tra'2o (rricrofi ltra'2o) (referida corro IVF ou UF), segui da de di afi I tra'2o ( DF). Ut i I i z ou- s e um filtro de 0,1 =m para o passo de rri crof i 11 ra '2 o. A col hi da em bruto ou toxi na em bruto foi ent2o transferida para um vaso de digest2o e estabilizada por adi '2 o do cl or i dr at o de benzarri di na i ni bi dor de pr ot ease. A DNase e a RNase f oram adi ci onadas para digerir (hidrolisar) os (St i dos nucl ei cos. Os (St i dos nucl ei cos hidrolisados e as i rrpurezas de baixo peso molecular foram ent2o removidos por outras etapas de UF e DF. A toxina foi ent2o extra°da com tanp2o de fosfato de pH 6, 0 e res°duos de cHI ul as removidos por cl ari fi ca'2o. Foram realizadas as tr,s etapas de precipita'2o sequencial ( pr eci pi t a'2 o de etanol frio, (Sti do clor°drico e precipitates de sulfato de anrnia). O corrpl exo de neurotoxina botul°nica purificada (toxina em massa) foi armazenado como uma suspens2o num tarrp2o de fosfato de s/ffli o/sul f ato de amffiii o a 2 é C a 8 é C, A conclus2o deste exerrpl o 1 processo de Schantz (n2o-APF), incluindo os passos de colheita e purifica'2o, leva cerca de duas a tr5s semanas. A neurotoxina botul°nica a granel resultante possui uma suspens2o de alta qualidade de um corrpl exo de t oxi na bot ul 0 ni ca t i po A de 900 kDa f ei t o a part i r da est i r pe Hal I A de Cl ost r i di um bot ul i num com uma pot5ncia espec°fica de h2 X 107U/ng, a A260/A278 ou inferior a 0, 6 e umpadr2o distinto de bandagem na eletroforese emgel e adequado para a conposi '2o de uma conrposi '2o farma^utica de t oxi na bot ul 0 ni ca. A neurotoxina bot ul 0 nica pode tarrbUmser obtida a partir de um processo APF, n2 0-cromat ogr®f i ca, corro estabelecido no Exerrpl 0 7 da patente US 7452697, a corrpl et a APF, processo n2 0 cromat ogr®f i ca (desde 0 in°cio da cultura ao f i m de t odas as et apas de pur i f i ca '2 0 e de process ament 0) levando cerca de duas a tr5s serranas para conpletar. Alternativamente, a neurotoxina botul°nica t arrbUm pode ser obtida a partir de um processo de cr orrat ogr af i a de APF, conforme estabelecido no Exerrpl o 16 de Patente US 7,452,697, o APF, processo cr orrat ogr ®f i co (desde o in°cio do cultivo atU o final de todas as etapas de purifica'2o e processamento) demorando uma serrana ou mai s para completar.
Exerrpl o 2 APF, sistemas e processos cr orrat ogr ®f i c os de duas e trss colunas para obter urra neurotoxina botul°nica
Desenvolvemos si stems r dpi dos e processos de crorratografia de catiPes ani/Eriicos para processos de obten'2o de alto rendimento, elevada pureza neurotoxina botul°nica. O processo deste Exerrpl o 2 tinha apenas 8-10 passos principais, para fins de produ'2o (isto H, obter quantidades gram da neurotoxina botul°nica final) usou um vaso de fermenta'2o de 20 L e leva apenas 4-7 dias, de prefer5ncia cerca de 4 a cerca de 6 dias, para conpletar todo o passo do processo desde o in°cio do cultivo atU a conclus2o da purifica'2o final e armazenamento de toxinas. Os aparelhos utilizados nos si stems aqui descritos s2o discutidos abaixo. Tanto um processo de dois mios c r orrat ogr ®f i cos (processo de refersncia) quanto um processo de tr5s mios cromt ogrdf i cos foram desenvolvidos e s2o apresentados aqui. O processo de dois mios usou a cromtografia de permita ani/Eiica seguida por cromtografia de troca de catives. O processo de trss meios usou a cr orrat ogr af i a de permita ani/Biica seguida por cromatograf i a de troca de catives seguida por cr orrat ogr af i a de intera'2o hi drof/Ebi ca ( HI C). O HI C removeu i rrpurezas adicionais, como uma i rrpureza de 49 kDa (o que acaba por ser uma isomerase de fosfato de glicose da c ill ul a hospedeira, conforme discutido abai xo).
Prepara'2o do banco de c ill ul as de trabalho
Foi desenvolvido um novo banco de cill ul as de Cl ost r i di um bot ul i num ( par a ut i I i z a'2 o para iniciar o passo de cultura), sem ut i I i za '2 o de placas de agar de sangue de Col urrbi a, e que removeu a necessidade para a selec'2o de col/Eiias antes da cultura e t arrbim el i rri nou a necessidade de realizar o processo de Shantz de intensificar o cultivo de tubos e v®rias etapas de semente (cultivo).
Para isso, foi ut i I i zado um banco de c ill ul as mest re Schantz previ amente estabelecido (IVCB) para criar um banco de c ill u I as de pesquisa ( RCB) da APF a partir do qual foram gerados um novo banco de c ill ul as mestre APF (IVCB) e um banco de cill uI as de t rabal ho subsequent e ( V\CB). Um banco de cill ul as de pesquisa (RCB) foi feito de urra col/Bnia do IVCB Schantz ( NAPF). Para remover a prot e° na deri vada de ani rrai s do f rasco de IVCB, as c ill ul as foram lavadas duas vezes em mei o de APF cont endo 2% p/v SPTII ( Pept ona de soj a t i po II), ext ract o de levedura a 1% p/v e glicose a 1% p/v. As c ill ul as foram pl aqueadas em mei o APF sob condi 'Pes anaer/Boi cas rigorosas usando uma c°rrara anaer/Boi ca do Sistema de Controlo AtmosfUrico IS/bdul ar (M^CS). Uma col/Biia isolada foi ainda expandida e armazenada em mei o APF contendo cerca de 20% de gl i cerol abaixo de -135 é C. A APF- MSB foi feita sob condi 'Pes GIVP por mei o da expans2o do RCB em forma APF isento de oxigénio ( 200 rrt, reduzida para umrrtnimo de 12 horas numa c°mara anaer/Ibi a) e cultivaramse em uma c°mara anaer/fbi ca NACS a 34, 5 é C é 1 é C (agitada a 60 rpn) ati a OD540 da cultura atingiu 2,5 é 1,0 AU. Adicionou-se gl i cerol esterilizado - cultura resultante ati uma concentra'2o final de cerca de 20% ap/B 0 que a rristura foi transferida para crioviais a 1 rrL/frasco (frascos APF-MSB). Os frascos foram congelados instantaneamente ermi t r ogUni 0 l°quido e depois armazenados abaixo de -135 é C. Uma APF-WIB foi feita sob condi 'Pes GIVP, expandi ndo- se conforme acima. Os bancos de c ill u I as APF resultantes foram caract eri zados por identidade, pureza, vi abi I i dade e estabi I i dade genUti ca.
Etapas a montante (cultura e fermenta'2o) O nosso processo do Exemplo 2 teve dois estdgios gerais; um estdgio a montante e um estdgio a jusante. O est(Hgio a montante inclui a expans2o de uma linha celular inicial (crescimento e reprodu'2o de bactUrias Clostridium botulinum em um meio de cultura subst anci al ment e APF), fermenta'2o, colheita (rerm'2o de detritos celulares) para fornecer uma cultura colhida clarificada que H ent2o concentrada e dilu°da. Assi rp neste exenpl o, as nove etapas do nosso processo de duas colunas s2o a cultura, a fermenta'2o, a f i 11 r a '2 o de colheita, a concent ra'2 o, a crornatografi a de captura (ani2o), a crornatografi a de polimento ( c a t i 2 o), a troca de tarrp2o, a redu'2o de bi omassa e o preenchimento do frasco. O estdgi o a montante i ncl ui u o uso de um mei o de cultura em uma garrafa de 1 L contendo 400 rrt de meio de cultura de APF de serre nt e reduzi do (emuma camada a na er/Boi ca) (2%p/v SPTII, extrato de levedura a 1% p/v, (ajustado para pH 7, 3 com hi dr/Ed do de s/BJi o 1 N e/ou ®ci do cl or°dri co 1 N antes da autoclave)) 1% p/v de adi'2o de autoclave esterilizada de meios de cultura). O meio de cultura (semente) foi inoculado com 400 =1 de um descongel ado de
Clostridium botulinum V\CB. A i ncuba '2 o/cul t ura ocorreu a 34,5 é C é 1,0 é C comagita'2o de 150 rpm em uma c°mara anaer/Boi a.
Quando a densidade /Iptica do meio de cultura a 540 nm foi de 1,8 é 1,0 AU, todo o conteBdo da garrafa de 1 L ( aproxi madament e 400 rrt) foi transferido para um f er ment ador de produ'2o de 20 L contendo o meio de fermenta'2o de APF aj ust ado com hi dr/B<i do de s/ffli o 1 N e/ou esteri I i za'2o p/B-vapor de (St i do clor°drico 1 N a pH 7, 3, meio de fermenta'2o conposto de SPTII a 3, 25%p/p, extract o de levedura a 1,2% p/v, 1,5% p/v de glicose estUril ( p/B esteri I i za'2o p/B-esteri I i za'2o, eg a cerca de 122 é C durante 0,5 hora). A tenperatura e a agita'2o foram cont rol adas a 35 é C é 1 é C e 70 rpro respect i vamente. A sobreposi '2o de nitrogHnio foi ajustada em12 slpme a press2o do espa'o de cabe'a ajustada em 5 psig para manter um arrbiente anaer/fbi o para o crescimento celular. 0 pH e a densidade celular da fermenta'2o foram rroni torados por pH e sondas de turva'2o online, respect i vament e. As trss fases para a produ'2o de fermenta'2o i ncl uem cresci ment o exponencial, est aci ondr i o e fases de aut/H i se. A aut/H i se cel ul ar, que I i bera o corrpl exo BoNT/A ativo no mei o de cultura, foi observada de forma consistente entre 35 horas e o fimda fermenta'2o. No final da fermenta'2o, a cultura foi arrefecida a 25 é C para a col hei t a.
Urra vez que o mei o de fermenta'2o foi arrefecido a 25é C, os restos celulares foram separados do corrpl exo de t oxi na bot ul°nica dotipoAcont endo lisa do por f i 11 r a '2 o em prof undi da de, pri mei ro at ravUs de um pr il- f i 11 ro de gr adi ente de reten'2o norri nal de 5 a 0, 9 =m para remover detritos celulares e, emseguida, atravUs de umgradiente de reten'2o norri nal de 0, 8 a 0, 2 =m de carga positiva para remover o DNA (remo'2o de atU cerca de 809Q . Anrbos os filtros foram enxaguados juntamente com 20 L de dgua para inje'2o (V\FI) antes da utilizado. Um nri ni mo de 15 L do filtrado foi necessdrio para posterior processamento e qualquer excesso de material foi descont am nado ap/B a amostragemno processo estar completa. O filtrado foi armazenado a 4 é C se η2 o processado imediatamente por ultrafi ltra'2o.
Dentro de um gabinete de bi osseguran'a (BSC), ο filtrado do passo de colheita foi concentrado de 15 L a 5 é 0, 5 L usando urra merrbrana de fibra oca, filtrante de fluxo tangencial (TFF) da GE Healthcare. O material ul t r af i I t r ado foi ent2o dilu°do comtanp2o de fosfato de s/ffli o pH 6,5 10 rrMatU umvolume final de 20 L. Este material foi purificado por meio de 2 colunas (ani2o e cati2o) ou tr5s colunas de c r orrat ogr af i a (ani2o, cati2o e, em seguida, interac'2o hi drof /fbi ca). O material de colheita ul t raf i 11 rado dilu°do foi armazenado a 4 é C se η2 o processado imediatamente por pur i f i ca '2 o.
No processo de Schantz, o passo de cultura H term nado e o passo de fermenta'2o i ni ci ado com base no tenpo e na observa'2o visual do crescimento da cultura. Em contraste, na nossa deterrrina'2o dos processos do Exenpl o 2 de quando terrrinar o passo de cultivo baseia-se na anOise da densidade /fptica do fluido de cultura, o que garante que a cultura esteja na fase de crescimento logar°tnico no moment o do in°cio do passo de fermenta'2o e pernita a redu'2o da dura'2o do passo de cultivo para cerca de 8 horas a cerca de 14 horas. Nosso passo de cultura term nado pelo par°metro OD rraxirrizou a saBde das c ill u I as cultivadas e encorajou a toxina botul°nica robusta e abundante resultante do passo de fermenta'2o. A densidade /fptica rrildi a (a 540 nnj do meio de cultura em concl us2o de cultivo foi de 1,8 AU. A dura'2o rrildi a do passo de fermenta'2o 72 horas e a turva'2o final rrildi a (As9o) do meio de fermenta'2o em concl us2o do passo de fermenta'2o foi de 0,15 AU. A quantidade rrlUdi a de conpl exo de t oxi na bot ul°nica tipo A (conforme det er rri nado por ELI SA) no meio de fermenta'2o de 20 L (caldo inteiro) no final do passo de fermenta'2o foi de cerca de 64 =g de meio de fermenta'2o conplexo/rrt de toxina botul°nica tipo A. O passo de col hei t a usou f i I t r a '2 o em pr of undi da de para remover detritos celulares e ®ci dos nucl ei cos, seguido de ultrafi ltra'2o e dilui '2o para preparar o meio de fermenta'2o para o pr/Bci rro passo no processo. Este corte de detritos de col hei t a/cHI ul a H f undament al ment e diferente do processo de colheita de Schantz, que usa precipita'2o por acidifica'2o seguida de rri c r of i I t r a '2 o e diafiltra'2o para concentrar e trocar buffers emprepara'2o para processamento post er i or.
Passos a jusante (Purificado)
As etapas a jusante inclu°ram a captura da neurotoxina botul°nica em uma coluna de permita ani xni ca, a e I ui '2 o da coluna e a separa'2o adicional de i npurezas por polimento em uma coluna de permita cati/Eiica e (no processo de tr5s colunas), passagem de neurotoxina botul°nica desejada de eluizatina através de uma terceira coluna, que H uma coluna de intera'2o hi drof/Bai ca (por exerrpl o, crornat ograf i a), seguida de concentra'2o e troca de tanp2o usando filtra'2odefluxot angenci al (TFF) e redu'2o de carga biolAgica (por exenpl o, por filtra'2o adicional usando um filtro de 0, 2 =rr) para um conpl exo final de neurotoxina de tipo A otinizado para armazenamento frio, de prefersncia congelamento e eventual conposi '2o em uma conposi '2o farmac, utica conpl exa de t i po A de neurotoxina botul°nica. A sequ5 nci a dos estdgios de cromat ograf i a e filtra'2o foi destinada a remover as i npurezas relacionadas ao produto e ao processo, para remover potenciais agentes advent°cios e para controlar a concentra'2o do conpl exo de t i po A da neurotoxina botul°nica e a matriz tanp2o da neurotoxina botul°nica final do t i po A, a fim de proporcionar mai s subst°ncia f ar rnacol /tgi ca est®/el. lima forma de realiza'2o mai s detalhada do processo a jusante de t r 5 s colunas executado H a segui nt e. Omaterial ui t r af i I t r ado clarificado ( di I u° do) (20 L, corro descrito acima) foi passado através de uma resina de cromat ograf i a de permita ani/Eiica POROSA 50HQ, a neurotoxina botul°nica
capturada foi elu°da da coluna de permita ani/Biica e depois atravessou uma resina de c r omat ogr af i a de troca de catiPes POROSA 20HS, o eluato a partir do qual foi executado através de uma resina de cromat ograf i a de Phenyl Sepharose HP. O eluente da coluna HI C foi submetido a f i I t r a'2 o de fluxo tangencial de 100 kDa, seguido de f i I t r a'2 o de 0,2 =m O conpl exo de t oxi na bot ul°nica ti po A resultante foi congel a do para armazenamento.
Neste Exenpl o, utilizamos no primeiro passo de c r omat ogr af i a do processo a jusante uma resina de c r omat ogr af i a de troca de ani Pes POROSA 50HQ errbal ada emuma coluna com um di ° met r o interno de cerca de 8 eme uma altura de coluna de cerca de 15 cm Toda a opera'2o da coluna POROS-^ 50HQ foi conclu°da - tenperatura arrbiente, e o fluxo estava na di re'2o descendente. O conpl exo de t i po A de neurotoxi na botul°nica foi elu°do da coluna de ani2o utilizando urra midan'a de passo de pH em que os conponentes com carga negativa, tais corro ®ci dos nucl ei cos (por exenpl o, ADNs e ARNs) e outras prote°nas de c ill u I as hospedeiras, per rraneceram I i gados - coluna de permita ani/Eli ca.
Qs detalhes do passo de permita de ani Pes foram uso da col una POROSA 50HQ usando hi dr/Ed do de s/ffli o 0, 1 N para umtenpo de contato rrf ni no de 30 ninutos (pelo menos cerca de 3 volumes de coluna, a 230 cmíhora). A coluna foi ent2o equilibrada comumtanp2o fosfato de s/Hi o 50 rrf4 pH 6,5 (pelo menos 5 volumes de coluna). Emseguida, o material ul t r af i I t r ado e dilu°do clarificado (isto H, material de fermenta'2o APF de I i sado processado) foi carregado a 230 cmíhora na coluna de permita ani/Eli ca POROSA 50HQ, seguido por I avagem com pel o menos cerca de 20 volumes de coluna de fosfato de s/ffli o 50 rrtV) pH 6, 5 a 230 cmíhora atU a absorv5 nci a a 280 nmdo ef I uente da col una di rri nui r para 0, 10 AU, segui do por el ui '2o comacetato de s/Efi o 50 ni/) pH 4, 8 a 230 cmíhora. O grupo de produtos foi recolhido, quando a absorv°ncia a 280 nm (A280) aumenta para pelo menos cerca de 0,15 AU e através do pico rrtlki rro igual ou inferior a cerca de 0,2 UA no bordo de fuga, numvaso contendo 1 volume de coluna de 50 rrM de acetato de s/Efi 0, pH 4, 8. Este grupo de el ui '2o foi armazenado a cerca de 2 é C a cerca de 8 é C atU 48 horas. 0 segundo passo de crorratografia no processo a jusante deste Exenplo 2 usou urna resina de c r orrat ogr af i a de troca de catives POROSA 20HS errbal ada em uma coluna comum di°metro interno de 8 eme uma altura de coluna de 5 cm Toda a opera'2o da coluna POROSA 20HS foi conclu°da tenperatura arrbiente, e o fluxo estava na dire'2o descendent e. O conpl exo bot ul 0 ni co de neurot oxi na do t i po A associa-se - resina de coluna POROSA 20HS. O conpl exo de t i po A de neur ot oxi na bot ul 0 ni ca f oi ent2 o el u° do da col una usando uma rrudan'a de passo de sal . As i npurezas rei aci onadas ao produto foramelu°das como tanp2o de lavageme a solu'2o de descont arri na '2 o.
Os detalhes do passo de troca de catiPes foram uso da coluna POROSA 20HS usando solu'2o de hi d r /Be i do de s/ffli o 0,1 N para umtenpo nT ni rro de contato de 30 rrinutos (pelo menos cerca de 3 volumes de coluna, a 230 cmíhora). A col una foi ent2o equi I i brada com um tanp2o de acetato de s/ffli o 50 rrM pH 4, 8 ( pel o menos cerca de 5 vol umes de col una). Em segui da, o grupo de produtos POROSA 50HQ (coletado corro descrito acima, fresco ou refrigerado) foi carregado na coluna POROSA 20HS. A coluna foi ent2o lavada comumtanp2o de acetato de s/ffli o 50 rrM pH 4, 8 (pelo menos cerca de 3 volumes de coluna) e depois lavada novamente comumtarrp2o de acetato de s/ffli o 50 rrM tanp2o de cloreto de s/ffli o 150 rrM pH 4, 8. O conpl exo de t i po A de neur ot oxi na bot ul 0 ni ca foi elu°do da coluna POROSA 20HS comumtanp2o de acetato de s/Edi o 50 rrM 250 rrM de c I or et o de s/ffli o, pH 4, 8 a 200 rrt/ rri n, o elu°do foi desviado para uma bolsa de recolha de bi oprocessos ( contendo 1 vol ume de col una de a 50 rrM NaH 3 C 2 ο 2, pH 4, 8) em que os a 280 aumenta para cerca de 0, 1 UA Ti através de pico n€ki rro atl] a A280 do bordo de fuga do pico de elui'2o di rri nui para um vai or bordo de fuga de 1=T 0, 1 UA. O grupo de produtos POROSA 20HS foi armazenado no saco de recolha - terrperatura arrbiente por atU cerca de 6 horas.
No processo de meios de cr omat ogr af i a em tr,s colunas deste Exerrpl 0 2, 0 eluato da segunda coluna (troca cati/Biica) foi passado através de uma coluna HI C. A coluna HI C usada foi uma resina de cr omat ogr af i a de intera'2o hi d r of /Hdí ca Phenyl Sepharose HP errbal ada em uma coluna com umdi°metro interno de cerca de 8 eme uma altura de coluna de cerca de 5 cm Toda a opera'2o da coluna Phenyl Sepharose HP foi completada " terrperatura ambiente, e 0 fluxo estava na di re'2o descendente. O conpl exo de ti po A de neurotoxi na botul°nica foi elu°do da coluna usando uma mudan'a de passo de sal decrescente. As impurezas foram elu°das durante a carga e como tarrp2o de I avageme sol u'2o de descontami na'2o.
Qs pormenores do passo de cr omat ogr af i a de intera'2o hi dr of /Hdí c a foram uma coluna de Phenyl Sepharose HP foi inicial mente hi gi eni zada com uma sol u'2 0 de hi dr/Bci do de s/Hi 0 0, 1 N para um tempo de contato rri1 ni mo de 30 minutos (com pelo menos cerca de 3 volumes de coluna de uma solu'2o de hi dr/Bci do de s/Hi o 0, 1 N a 200 cmfhora). A coluna foi ent2o equilibrada com pel o menos cerca de 5 volumes de coluna de acetato de s/ffli ο 50 rrtV) sulfato de amffrii ο 0, 4 M tarrp2o de pH 4,8. Em seguida, o grupo de produtos POROSA 20HS (coluna de permita de catiPes) (de cirna) foi combinado 1: 1 com um acetato de s/ffli o 50 rrtV) sulfato de am<ni o 0,8 M tarrp2o pH 4,8 e carregado na coluna Phenyl Sepharose HP. A coluna foi primeiro lavada com pel o menos cerca de 3 volumes de coluna de umacetato de s/ffli o 50 rrtV) sulfato de amffiii o 0,4 M tarrp2o de pH 4, 8 e depoi s lavado com um f os f at o de s/Bdi o 50 rnM um tanp2o de sulfato de amffiii o 0, 4 M umtarrp2o de pH 6,5. O conpl exo de tipo A de neurotoxina botul°nica foi elu°do da coluna com um fosfato de s/Edi o 10 rrM sulfato de amffiii o a 0,14 IV) tanp2o de pH 6,5. O elu°do foi desviado para uma bolsa de coleta de bi oprocessos quando o A 28o aumentou para Ti 0, 05 AU. O el uato foi col etado at D o A 28o da borda de fuga do pi co de el ui '2 o di rri nui do para um vai or de 1=t 0, 05 AU. O grupo de produtos Phenyl Sepharose HP foi armazenado no saco coletor a terrperatura ambiente por atU 6 horas.
Um sistema de f i 11 r a'2 o de fluxo tangencial foi ut i I i zado para concent rar e di af i 11 rar o conj unto de produtos de passo de cromatograf i a de Phenyl Sepharose HP no tarrp2o de formula'2o de subst°ncia de fdrmaco. As cassetes Pa I I -ϊ-Filtron Mnimate com uma membrana de corte de peso molecular de 100 kDa foram uti I i zadas para as etapas de concentra'2o e di af i 11 r a'2 o. O material formulado foi ent2o passado at ravUs de umf i 11 ro Pall M ni Kl eenpak + 0, 2 =m para reduzi r a potencial carga bi ol/^i ca. Conforme indicado anteri ormente, o passo UF/DF concentrou o grupo de produtos Phenyl Sepharose HP (elu°do da coluna HI C) para uma concentra'2o de conpl exo BoNT / A de 0,7 g/L e diafiltrou o material concentrado comumcitrato de pot®ssio 10 rrM tanp2o pH 6, 5.
Os detalhes do processo de ultrafi Itra'2 o/ di afi I tra'2o utilizados foram os seguintes. A uni dade UF/DF e a merrbrana Pal I 100 kDa de pol i Uter sul f ona f oram i ni ci al ment e lavadas comumrrtnimD de 5 L de (Egua para inje'2o (NAFI) para remover a solu'2o de errbal agem e higienizada com um rrf ni mo de 200 rrt de uma solu'2o de hi dr/Ed do de s/ffli o 1 N sob condi 'Pes de reci rcul a'2o durante pel o menos 10 rrinutos, de prefersncia pel o menos 30 rrinutos, para desinfetar a unidade UF/DF. Em segui da, a merrbrana e o sistema UF/DF f oram equi I i brados com volumes suficientes do citrato de potdSsio 10 rrf/) tanp2o de forrrula'2o de pH 6,5 atH o pH do permeado e do retentado ser de pH 6,5. Depois disso, o grupo de produtos Phenyl Sepharose HP foi carregado na cassete de f i I t r a'2 o de fluxo tangencial Mnimate-^ e o elu°do HI C concent rou- se para 0,7 g/L. Ap/ts o passo de concent r a'2 o, o grupo retentado foi diafiltrado contra um rrf ni rro de 5 volumes de diafiltra'2o do tanp2o de fornxila'2o de subst°ncia de f ®r maco (citrato de pot (SSsi o 10 rrf/) pH 6, 5) a uma press2o t ransmerrbranar de 7, 5 psi g ( I i bras por pol egada quadrada). A sa°da do permeado foi ent2o fechada e o sistema UF/DF funcionou durante pelo menos 2 rrinutos e o sistema foi enxaguado com 50 rrt de citrato de potdSsio 10 rrf/) tanp2o de forrrula'2o de pH 6,5. Ap/B o enxagBe, a concentra'2o do conpl exo BoNTT/A no grupo retentado foi deterrrinada medindo o A 278 offline e com base na A 278 leitura, a concentra'2o do grupo retentado foi ajustada para 0,5 g/L comcitrato de pot®ssio 10 rrM tanp2o de pH 6,5. O grupo de retentado ajustado em concent ra'2 o foi ent2o filtrado através de um filtro Pall M ni Kl eenpak de 0,2 =mpara reduzir a potencial carga biol/lgica. O grupo de retentado ajustado em concent r a '2 o filtrada f oi ar maze na do em uma boi sa de r ecol ha a 2 é C a 8 é C por atU 2 dias. O conpl exo purificado de neurotoxina de tipo A purulento botul°nico obtido foi preenchido em 1 ni de crioviais Nunc* a 700 =L por frasco e armazenado congelado. A opera'2o de enchimento foi realizada em um gabinete de bi osseguran'a classe 100 - temperatura ambiente.
O processo a jusante (incluindo o uso de 2 ou 3 colunas de cr omat ogr af i a) foi conclu°do emapenas 1 a 3 di as e o conpl exo de t i po A de neurot oxi na bot ul0 ni ca obt ido foi armazenado congelado emumcitrato de potG&amp;sio, tamp2o de pH 6,5 a uma concentra'2o de 0,5 g/L como solu'2o. Em conpara'2o, o processo de Schantz a jusante (processo de puri f i ca'2 o de t oxi na) da tUcni ca anteri or uti I i za etapas de f i I t r a '2 o, pr eci pi t a'2 o, extra'2o e cent r i f uga'2 o rrBItiplas para purificar o compl exo de neurot oxi na de ti po A bot ul 0 ni co e requer 1-2 semanas para completar apenas as etapas a jusante e a subst°ncia f ar macol /Igi ca resultante (neurotoxina botul°nica recuperada) H armazenada refrigerada como uma suspens2o de sulfato de anmni o a uma concentrado de aproxi madament e 2,7 g/L. O uso de cr omat ogr af i a em vez de precipita'2o e o tempo de processamento reduzido resultaram em um processo a jusante significativamente melhorado e consistente, conforme aqui descrito.
De acordo com um aspecto, as concent r a ' Pes de produtos - base de vegetais, corro os produtos - base de soja, podem ser Peptone Type II Hy-Soy-^ ou SE50IVK (uma peptone de cebola Kosher) em cultura e meio de fermenta'2o. O Hy-Soy-^ no meio de cultura de semente pode variar entre 10-200 g/L. De prefer5ncia, a concentra'2o de Hy-Soy-^ no meio de semente varia entre 15-150 g/L. IVhi s pref erenci al ment e, a concentra'2o de Hy-Soy-^ no meio de semente H aproxi madamente entre cerca de 20-30 g/L ou uma quantidade entre eles. A concentra'2o de glicose no meio de semente pode variar entre 0,1 g/L e 20 g/L. De prefer5ncia, a concentra'2o de glicose varia entre 0,5-15 g/L. IVhi s pref erenci al ment e, a concentra'2o de glicose no meio de cultura H de a pr oxi madament e 10 g/ L. As quant i dades de ext rato de fermento podem ser de cerca de 5-20 g/L, mai s pref erenci al ment e de cerca de 10-15 g/L ou uma quantidade entre eles. Por exenpl o, o pH do mei o de cul t ura ant es do cresci ment o de Cl ost ri di um bot ul i num pode ser aproxi madament e de pH 7,0-7,5, ou entre el es, de pref ers nci a pH 7, 3.
Corro exerrpl o, as quantidades de Hy-Soy-^ no meio de fermenta'2o da produ'2o podem variar entre 10- 200 g/L. De pr ef er 5 nci a, a concent r a '2 o de Hy- Soy-^ no mei o de fermenta'2o varia entre 15-150 g/L. IVhi s pref erenci al ment e, a concentra'2o de Hy-Soy-^ no meio de fermentado H aproxi madament e entre cerca de 20-40 g/L ou uma quantidade ent r e el es. A concent ra'2o de glicose emmeio de fermenta'2o pode variar entre 0,1 g/L e 20 g/L. De prefer, nci a, a concentra'2o de glicose varia entre 0,5-15 g/L ou una quantidade entre eles. N2 o necessariamente, mas como acima, a glicose pode ser esterilizada por aut ocl avagem em conj unt o comos outros componentes do meio de fermenta'2o. O n°vel de pH do meio de fermenta'2o antes do crescimento pode ser de pH 7,0-7,8, de prefer, nci a cerca de 7,0-7,5 ou entre eles, rnai s pref erenci al ment e pH 7, 3.
Corro mostrado pelo lado direito da FIG. 1, o processo de APF de refer, nci a de duas col unas ut i I i zado neste Exenplo 2 para a obten'2o de um complexo de neurotoxina botul°nica biologicamente ativo compreende os seguintes passos: (a) cultura de bactérias, tais corro bactérias de Cl ostri di um botul i num de um frasco de V\CA de APF, em uma garrafa de serrent e/cul t ur a, ( b) depois fermentando bactérias Clostridium botul i num em um fermentador (fermentador de produ'2o de toxina) com meio de fermenta'2o de APF para expandir a linha celular, procedendo com fermenta'2o e produ'2o de toxina botul0 ni ca atU atingir a fase de I i se celular desejada. Em segui da, (c) colheita (por exemplo, esclarecendo por f i 11 r a '2 o), o meio de fermenta'2o de APF para obter um mei o de fermenta'2o colhido, (d) procedendo com concentra'2o e di I ui '2 o resultando em um meio de fermenta'2o colhida dilu°da que H (e) passada por coluna de captura ani *ni ca para rerrover impurezas, (f) entrar em contato comelu°do da coluna de captura com uma coluna de polimento cati/Biica para rerrover ainda rnai s as impurezas, (g) concentra'2o e troca de tanp2o do eluente da coluna de polimento, ( h) seguida de f i 11 r a '2 o de redu'2o de bi orrassa e (i ) enchi me nt o de f rase os. O processo APF de t r5 s col unas da inven'2o compreendeu um passo de cromat ograf i a de interac'2o hidrof/Baica apAs o passo de cromat ograf i a cat i /Bii ca.
Num exerrpl ο, o volume de fermenta'2o H de 20 L, o tenpo de processo total para todas as etapas foi de apenas 4 a 6 di as e obt eve- se o rendi ment o de neurot oxi na bot ul 0 ni co el evado. O seguinte fornece mai s detalhes de uma forma de realiza'2o particular dentro do escopo da nossa inven'2o. 0 passo de ferment a'2o foi realizado emmeio APF ut i I i zando um fermentador de a'o i noxi d®/el de 30 L.
Neste exemplo abaixo, utilizou-se um vol ume muito reduzido de meio de fermenta'2o enquanto ainda proporcionava um alto rendimento de complexo de neurotoxina botul°nica de tipo A de alta pot5ncia. Ao usar o seguinte protocolo, era necessário apenas 20 L ou menos, de meio de fermenta'2o de APF, emvez dos volumes anteriores, geral mente maiores, (por exenrpl o, 115 L) de meio de fermenta'2o necessdri os para a produ'2o de quantidades comer ci al ment e Steis para a obten'2o de uma neurotoxina bot ul0 nica. A esta'2o de trabalho anaer/fbi ca M\CS (Don Wii 11 ey) comc°mara de ar forneceu umambiente deficiente em oxi gi ni o para manipular organismos anaer/fbi cos. O acesso e a sa°da da c°mara eram através de um sistema de vigia, conpostos por portas interiores e exteriores. Atenperatura da unidade foi controlada para manter uma configura'2o de utilizador dentro da c°mara. Uma placa de condensa'2o cont rol a da por estado de hum da de assegurou a r erro'2 o ef et i va do excesso de uni dade na c°mara. A c°mara foi i I uni nada para uso do operador e alarme para: baixa press2o do g®s, fluxo de g®5 cont°nuo e perda de condi 'Pes de energia. A c°mara foi equipada com um filtro HEPA para reduzir os n°veis de part°culas vi ®/ei s e η2 o vi (ÊVei s na c°mara anaer/Bai a. As condi ' Pes a na er/Boi cas f or am mant i das ut i I i zando o si st ema de depura'2o atmosférica "Anotox" e Palladium Deoxo "D" Catalyst. A <§gua condensada da placa de condensa'2o foi coletada e canalizada para um reservat/Eri o externo onde ela f oi removi da.
Conforme descrito acima, foi utilizado umprocesso de APF para a prepara'2o de um V\CB de APF, tendo os frascos de bancos de células armazenados abaixo de -135 é C. Um frasco do banco de células da APF V\CB foi descongelado tenperatura ambiente por cerca de 15 rri n antes da inocula'2o do meio de cultura, seguido por um Bni co passo de cultivo conforme descrito acima para estabelecer uma cultura de "semente". Isso foi realizado em um sistema controlado atmosférico modular, utilizando técnicas assépticas, rrinirrizando a bi omassa. O sistema controlado atmosférico modular foi I i npo antes da inocula'2o do frasco de cultura de semente conclu°do como conteBdo do frasco de APF V\CB. O meio de cultura foi preparado usando (SC i do clor°drico 1 N e hi dr/B<i do de s/Edi o 1 N (para ajuste do pH), D (+) Glucose,
Ani dro (IVàI I i nckrodt Baker, Cat # 7730, 4, 00 g), Peptona de
Soja Tipo II (SPTII) (IVbrcor, Gato # 1 130, 8,00 g), Egua
para Inje'2o (V\FI) 400,0 rrt e Extracto de Levedura (YE) ( BD Cat # 212730, 4, 00 g). A sol u'2o de ext ract o de I evedura de tipo II de peptona de soja e solu'2o de extrato de levedura foi feita medindo 300 rrt de V\FI com um ci I i ndro graduado de 500 rrt e vertida em um frasco de cultura de semente. A garrafa de cultura de semente foi colocada sobre umagitador e o agitador ativado. Foram adi ci onadas 8,00 g de SPTII e 4,00 g de extracto de levedura - garrafa de cultura de semente e rristuradas atU - dissolu'2o. Se a dissolu'2o η2 o fosse corrpleta ap/Is a rristura, a nristura seria aquecida em bai xa conf i gur a '2 o. O pH f oi medi do e aj ust a do para cerca de 7,30 é 0,05. A solu'2o rrlfldi a foi levada atU cerca de 360 rrL comV\FI. O frasco de cultura de semente foi adequadamente ventilado para permitir transferida de vapor e gds. Foi preparada uma solu'2o de 10% de glicose ( p/v) medindo cerca de 30 rrL de V\FI comumci I i ndro graduado de 100 rrL e col ocada na garrafa de adi '2o de glucose pr H-rront ada, que foi colocada sobre umagitador e o agitador ativado. Cerca de 4,00 g de glicose foram adi ci onados - garrafa de adi'2o de glicose e misturados atU ~ dissolu'2o (calor baixo foi utilizado, se necessário, para uma dissolu'2o) e qs (quantidade suficiente) de solu'2o de glicose para 40 nt com V\FI. A adi'2o de glicose foi ent2o tampada vagamente com tampa de ventila'2o. Ambos os frascos de glicose e cultura de semente s2o autoclavados a 123 é C durante 30 minutos para esteri I i za'2o. Ap/B a esteri I i za'2o, arrbos os itens foram removidos da autoclave e deixados esfriar em um gabinete de bi o-seguran'a. Depois de arrefecer assept i cament e, 10% da solu'2o de glicose foi transferida para o frasco de cultura de semente contendo o extrato de levedura e a solu'2o de peptona de soja II e rristurado, proporcionando desse modo um frasco de cultura de semente conpleto.
Este frasco de cultura de semente conpletado foi col ocado no IVACS prU-1 i npo ( em que foi col ocado um i ndi cador anaer/Boi co preparado). A tanpa da garrafa de cultura de semente conpleta foi afrouxada. O frasco de cultura de semente conpletado foi ent2o colocado sobre uma placa de agita'2o dentro do IVACS (placa de agita'2o ativada a cerca de 150 rprr) e o mei o no frasco de cultura de semente conpleto foi reduzido durante pelo menos 12 horas a cerca de 34,5 é C +/- 1 é C dentro do IVACS, ap/B o que uma amostra rrflldi a de 1 rrt foi amostrada para medi'2o de densidade Aptica (para deternina'2o de bi omassa a 540 nrr). Post er i or ment e, o frasco de cultura de semente conpletado, no IVACS (anaer/Boi co) foi inoculado. Um frasco de cultura V\CB da APF foi obtido do banco de c ill u I as congeladas e introduzido no IVACS. O frasco foi descongelado durante cerca de 10-15 rrinutos, ap/B o que cerca de 400 =L do conteBdo do frasco foram colocados di r et ament e no mei o no f rasco de cultura de se ment e conpl et o. A tanpa na garrafa de cultura de semente conpleta foi afrouxada corrpl et ament e e a tanpa foi apoiada no topo da garrafa e o ritmo de agita'2o foi ajustado para 150 rpm Ap/B pelo menos cerca de 11 horas de incuba'2o no IVACS, a produ'2o de fermenta'2o foi realizada, conforme descrito abai xo.
As sondas (por exenpl o, sonda redox, sonda de pH, sonda de turva'2o, por exenpl o, por Broadl ey James e Optek) e a configura'2o de sequ, nci a do fermentador, corro um fermentador de a'o i noxi ddVeI de 30 L, foram veri fi cadas e cal i bradas e i nser i das nas res pect i vas port as de f er ment a dor e apertadas e colocadas no lugar. Por exenpl o, umf er ment ador pode ser umsi sterna de fermenta'2o ABEC 30 L (VT), conposto por um vaso fermentador de volume de 30 L, um sistema de acionamento do agitador, conjunto de tubula'2o para conexPes de utilidade ( Cl P, vapor I i npo, CDA, ni t r ogllni o, Qxi gs ni o, Egua Processada Chilled, bio-res°duos e vapor de plantas), i nst r ument a '2 o ( pH, tenperatura, press2o, ReDox, densidade /fptica e fluxo de massa) e quatro bombas peri st(H t i cas. A velocidade do agitador montado na parte inferior foi controlada usando uma unidade de freq^ncia vari®/el AI I en-Bradl ey (VFD). O controlo autorrt&amp;ico serri - aut orrtgt i co e aut orrt&amp; ico do sistema H gerenciado por um PLC AI I en- Br a dl ey Control Logix com programa'2 o. O sistema foi projetado para fornecer controlo PI D ( proporei onal - i nt egral - der i vado) em circuito fechado de terrperatura de cultura, press2o, pH e redox durante opera'Pes de ferrrenta'2o. Um AI I en-Br adi ey DeviceNet-^ (uma rede de n°vel de dispositivo aberto) H utilizado para controlo e corrunica'2o com dispositivos e sensores na plataforma deslizante.
Para modos estHril de espera, equil°brio, corrida e colheita, agita'2o, terrperat ura, press2o e sobreposi'2o denitrog^lnio s2o operados cornos seguintes pontos de ajuste. ___Para modo estUril de espera e equi I 0 bri o
Para o modo RUN:
Para o modo de colheita:
Para preparar o meio de fermenta'2o, o material necess®ri o i ncI ui D ( +) Gl ucose, Ani dro ( IVàl I i nckrodt Baker, Cat # 7730, 300,0 g), Peptona de Soja Tipo II (SPTII) (IVbrcor, Cat # 1 130, 650,0 g), Egua para Inje'2o (VSFI, 13 L) e extracto de levedura (YE) (BD Cat # 212730, 240. 0 g), juntamente com bal an'as padr2o, um carburador (20 L, por exenplo), gar r af a de vi dro ( 5 L), ci I i ndros graduados, barras de agita'2o e agitadores. Cerca de 10 L de VNFI foram adicionados ao carburador juntamente com uma barra de agita'2o. O carburador foi colocado sobre um agitador e o agitador foi ativado, ap/ts o que f or am adi ci onados cerca de 650.0 g de peptona de soja tipo II, juntamente com cerca de 240.00 g de YE. O mei o de fermenta'2o foi qs (quantidade suficiente) para 13 L comV\FI, e o carburador foi tarrpado. Uma solu'2o de glucose a 10% ( p/ v) foi ent2o preparada por adi '2o de cerca de 2 L se V\FI numa garrafa de vidro de 5 L (com barra de agita'2o no mesmo). Colocado em um agitador e coma rota'2o da barra, cerca de 300,00 g de glicose foram adicionados " garrafa e rristurados atU dissolver. A solu'2o de glicose foi de qs a 3 L com V\FI e o tanp2o engarrafado, proporcionando assim urna solu'2o de glicose a 10% O mei o de fermenta'2o no carburador foi adi ci onado ao fermentador e o volume de fermentador prU-vapor no local foi registado e a sequ, nci a de fermenta'2o da opera'2o foi avan'ada. No final do SI P (vapor no local) (122 é C, +/- 1 é C), observou-se o volume do fermentador p/Es-SIP. Um conjunto de adi'2o de glicose, que corrpreende um vaso com tubo do mesmo come filtro de 0,2 =m (PALL Corp.) e borrba perist®ti ca em I i nha, foi ligado ao fermentador e a linha foi submetida a SI P e deixada arrefecer. Foi aberta uma porta de v® vul a de adi'2o e f or am adi ci onados cerca de 3 L de glicose (esterilizado por filtro) e a quantidade apropriada de V\FI (esterilizado por f i I t r a'2 o) a qs o volume total de fermentador a 20 L foi adicionado ao frasco de adi '2o de glucose e borrbeado para o fermentador atravUs da mesma linha de filtro de glicose. A porta da v® vul a de adi'2o foi fechada. O mei o de fermenta'2o de produ'2o teve seu pH ajustado post er i or ment e, atU cerca de pH 7,3 +/- 0,05, com hi dr/Bei do de s/ffli ο 1N estUril ou ®ci do clor°drico 1 N, utilizando SI P de linhas de adi'2o, conforme necess®rio. Post er i or ment e, os par°metros para reten'2o estUril foram ajustados e mantidos por cerca de 12 horas antes da inocula'2o. A concentra'2o de glicose inicial do meio foi medida usando um anal i sador de metabolitos e a concentrado de gl i cose regi stada.
Conforme indicado acima, no final da incuba'2o da cultura de semente (cerca de 11 é 1 horas), foram ext ra° dos 1 rrt de arrost ra para medi '2 o de densi dade Apt i ca ( OD). O OD foi medido offline a 540nm usando um es pect r of ot orret r o e, se dent ro da f ai xa apropri a da, o vai or do OD f oi regi st a do e a cultura foi usada para fermenta'2o. A sonda de turva'2o do fermentador foi, consequentemente, anulada. O frasco de i n/fcul o de sementes, da c°rrara anaer/Ebi a, foi levado ao fermentador e a um conjunto de t ransf er, nci a de i n/Biul o de semente (um vaso de semente com mei o de cultura de APF no mesmo, o vaso tendo uma I i nha de t ransf er, nci a de i nocul a'2 o de cultura com um conj unt o de conector Kl eenpak u estllril dispon°vel da PALL Corp. ou Μ I I i pore substituiu a v® vul a do fermentador e a tubula'2o - borrba 1 foi fixada. A press2o do fermentador foi reduzida para 2 psig e todo o volume do frasco de i n/£ul o de sementes foi bombeado para o fermentador. No fi nal da i nocul a'2 o, as uni dades de absor'2 o on-line (AU) do fermentador foram regi st adas, os par°metros do fermentador foram aj ustados para o modo RUN e o tempo foi regi stado. A fermenta'2o prosseguiu (as corridas de fermenta'2o podem ser de cerca de 60 horas a cerca de 80 horas, de prefer, nci a de cerca de 68 horas a cerca de 76 horas, mai s pref erenci al mente durante cerca de 72 horas), enquanto as amostras f oram ret i radas do fermentador, s 24 e 48 horas, por exemplo, mantendo condi 'Pes assllpticas. Qs testes que f or am execut ados em pel o menos uma amostra tomada durante a fermenta'2o podem i ncl ui r, rras η2 o est2 ο I i rri t ados a, medi 'Pes de densidade Aptica fora da linha, medi 'Pes de glicose, ELISA, SDS-PAGE, Vtest er n bl ot, por exenpl o. No final da fermenta'2o (o final do volume do caldo de fermenta'2o H de cerca de 18-19 L, por exenpl o), pode ser torrada urra arrastra (para teste, por exenpl o, medi 'Pes de densidade Apt i ca f or a da I i nha, medi Pes de gl i cose, ELI SA, SDS - PAGE, v\estern blot e DNA/ RNA quant i f i ca'2 o.
No f i nal da f er menta'2o, f oi regi stada a densi dade Aptica on-line, o EFT (terrpo de fermenta'2o decorrido) e o tenpo de fim de fermenta'2o, bem como a velocidade de agita'2o, a temperatura em é C, a press2o psig e a sobreposi'2o de nitrogHnio si pm e redox rrV. Em segui da, o caldo de fermenta'2o de produ'2o foi submetido a colheita, ou sej a, o caldo de fermenta'2o de produ'2o H clarificado através de f i I t r a '2 o, pel o que, por exenpl o, cerca de 15 L de filtrado s2o recolhidos. Os par°metros de fermenta'2o foram aj ust ados para HARVEST e o conjunto do filtro para o esc I ar eci ment o f oi pr epar ado ( CUNO, f i I t r a '2 o 3IV) que inclui um prU filtro, filtro de profundidade e pelo menos um rranxmetro. O filtro de prU-filtro e profundidade foi lavado com cerca de 20 L de (Egua para inje'2o. ApAs a descarga, o conjunto de f i 11 r a'2 o foi preso ao orif°cio de col hei ta/drenagem do fermentador. A tenperatura do fermentador di rri nui u para cerca de 25 é C, apAs o que come'a a clarificado do caldo de fermenta'2o (tenpo de in°cio do esclarecimento do registo, DO inicial inicial, pH inicial, tenperatura inicial e volume inicial do fermentador). A press2o no fermentador foi aumentada a urra taxa de cerca de 1 psi (libra por polegada quadrada) cerca de cada 10 rrinutos durante a filtra'2o, atU se atingir uma press2o de cerca de 6 psi, na qual a press2o foi mantida atU o fimda colheita. Este filtro remove aproxi ma da me nt e 80% do RNA/ DNA no mei o de fermenta'2o de APF (o restante essenci al ment e removido durante etapas de cromat ograf i a posteriores, conforme di scut i do abai xo), ei i rri nando as si m a depend5 nci a/ uso prUvi o de RNase e/ou DNase para remover tais conponentes do caldo de fermenta'2o. Os par°metros do processo, corro a press2o de entrada do prll-filtro, a press2o de entrada do filtro de pr of undi da de, a pr ess2 o do f er ment a dor, a agi ta'2o e o vol ume do filtrado foram monitorizados a cada 2 L de filtrado coletado, no final do qual o tenpo de fimde clarifica'2o e o volume do filtrado coletado foram registados. ApAs a conclus2o do passo da colheita, os sistemas foram descont arri nados e I i rrpos. O garraf2o filtrado foi trazido para o BSC para armstragerp a partir do qual cerca de 1=t10 nt de filtrado foi amostrado para medi 'Pes fora de I i nha de densi dade Apt i ca e outra an(SJ i se (por exenpl o, ELISA, SDS-PAGE, ADN/ARN e v\est er n bl ot).
O filtrado foi ent2o submetido a ultrafi Itra'2 o/ d i I ui '2 o. Foi rront a do um conj unt o de uni dade de filtro de fluxo tangencial (TFF). A unidade TFF foi enxaguada durante cerca de 90 rrinutos com V\FI a uma taxa preferida de cerca de 2 L por rrinuto e depois a unidade TFF foi desinfectada através da adrri ni st r a'2 o de hi dr/B<i do de s/ffli o 0,1 N ( re-ci rcul ado) por cerca de 60 rrinutos, ap/B o que 1 L de tanp2o de fosfato de s/ffli o 10 rrMfoi adicionado, pH 6,5, seguido de um enxagBe com V\FI durante cerca de 30 rrinutos. Ofiltrado da etapa de colheita (cerca de 15 L) foi ent2o passado através do TFF (isto H realizado emumgabi net e de bi o-seguran'a), concentrando o filtrado atU cerca de 5 L +/- 0,5 L (o passo de concentra'2o passa aproxi madament e 2 L por rrinuto e a urna press2o t rans-merrbrana de cerca de 5 psig). Uma amostra do permeado pode ser tomada e submetida a testes ELISA, dsDNA, SDS-PAGE e v\estern blot, por exenpl o. Uma vez concentrado a cerca de 5 L +/- 0, 5 L, o grupo retentado foi ent2o dilu°do atU cerca de 20 L com cerca de 15 L de tanp2o de fosfato de s/ffli o 10 rrM esteri I i zado, pH 6,5, através do TFF, a cerca de uma taxa de 2 L por rrinuto. Uma amostra pode ent2o ser novamente tomada e submetida a testes ELISA, DNA/ RNA, SDS-PAGE e v\estern blot, por exenpl o. O material de ultrafi ltra'2o/di I ui '2o (retentado) foi armazenado a 4 é C.
Ap/B a utiliza'2o, todos os sistemas foram descont arri nados utilizando tenperaturas de hi dr/Ed do de s/Edi o 1 Nou de esteri I i za'2o (vapor) e li npas.
Os seguintes materiais, equipamentos e procedimentos foram utilizados para tornar as solu'Pes, tanpPes, etc., apresentados a seguir para utiliza'2o em um processo exenpl ar, isto H, na purifica'2o do meio de fermenta'2o obtido a partir dos processos do Exenpl o 2 de rrodo a obter urra solu'2o botul°nica purificada corrpl exa de tipo A de neurotoxina. Os tarrphes exerrpl ares utilizados (filtrados atravUs de umfiltro de v(Stuo de 0,2 nricron e a sua condut i vi dade medida em nS/crp para rranuten'2o de registos) incluem fosfato de s/Hi o 10 rrM pH 6,5; Fosfato de s/Hi o 50 rrM pH 6,5; acetato de s/Hi o 50 rrM pH 4,8; acetato de s/Hi o 50 rrM cloreto de s/Hi o 170 rrtfl pH 4,8; Acetato de s/Hi o 50 rrM cloreto de s/Hi o 250 rrM pH 4,8; acetato de s/Hi o 50 rrM cl oreto de s/Hi o 1 M pH 4, 8; acetato de s/Hi o 50 rrM pH 4, 0 e ci t r at o 10 rrM pH 6, 5. O seguinte H um exerrpl o de operates para purifica'2o e obten'2o de neurotoxina botul°nica tipo A a partir dos processos do Exerrpl o 2. Todas as pe'as de contato com produtos foram projetadas e constru°das para garantir que elas η2 o sej am reat i vas e η2 o absorventes. AI Hm di sso, todo o equipamento foi projetado para pernitir a ut i I i z a'2 o de sistemas descart (ÊVei s de uso βη i co ou foi projetado e constru°do para facilitar a hi gi eni za'2 ο, I i rrpez a e descont arri na'2 o de acordo com rrlUtodos documentados e validados. Os sistemas ou skids foram proj et ados para η2 o entrar em contato com o produto, enquanto os carrinhos de fluxo foram proj et ados para serem descart Ovei s de uso βηι co, incluindo as colunas de crorrat ograf i a e todas as tubula'bes associadas. Qs conponentes de crorrat ograf i a foram obtidos a partir de conponentes AI phaBi o e UF/DF foram obtidos da Sci I og I nc. Qs aj ust es de cr orrat ogr af i a ut i I i zados i nc I u° ram urra borrba peri st(SI ti ca para entrega de solu'2o comvariador de velocidade, colector de v® vul a de adniss2o com 5 entradas, colector de ν®1 vul a de coluna com urna matriz de 3 v®l vul as automatizadas, colector de v®l vul a de sa°da com 3 sa°das, rroni t orament o de efluentes de coluna, incluindo pH, condut i vi dade e UV, coleta de picos com base na absorv°ncia de UV e i nst r ument a'2 o e control os necess®ri os para conpl etar as opera'bes de purifica'2o. O sistema de controlo tinha o softv\are e o hardv\are projetados para controlar o processo de purifica'2o. Comandos e dados foram i nseri dos através de umterrri nal HIVI (Human IVbchine Interface). Ooperador iniciou todas as fun'bes de processo automatizadas por comandos na HIVI e par°metros de processo monitorados e ajustados, tais corro taxas de fluxo de alimenta'2o, press2o, condut i vi dade, pH, absorv5 nci a de UV e posi 'bes de v(SJ vul as i ndi vi duai s. O sistema UF/DF inclu°do de uma bomba de reci rcul a'2 o, borrba de di af i I t r a'2 o, 2 balan'as e umsuporte de filtro de f I uxo t angenci al (TFF). A borrba de reci rcul a'2o foi conectada com 3 sensores de press2o descart®/ei s e um dos bal an'os (localizado sob o reservat/fri o de permeado) para control ar o caudal para manter uma press2o t ransmerrbrana definida e parar, com base no peso do reservat/fri o de permeado. A borrba de diafiltra'2o interagiu como segundo equi I 0 br i o (localizado sob o reservat/fri o de reten'2o) para iniciar e parar, com base na manuten'2o de um peso constante do reservat/fri o de retentado.
ApAs a concentra'2o e a d i I ui '2 o do material retentado do passo de colheita (colhendo o meio de fermenta'2o livre de prote°na animal), o material foi carregado numa coluna de per rrut a ani /Eri ca. O segui nt e Ho procedi me nt o ut i I i zado para errbal ar e testar a col una de troca de ani bes Kt i I no processo de duas col unas do Exenpl o 2.
Foram utilizadas colunas pr H- errbal adas para os tr5s passos cromatogrdf i cos. Primeiro, o material de alimenta'2o (material APF colhido que tinha sido submetido a ultrafi ltra'2o/di I ui '2o) foi passado at ravlls da col una de permita ani/Eri ca (Poros 50HQ de ABI corro descrito acima). Foram ut i I i zados pelo menos 5 volumes de coluna (CVs) de fosfato de s/EJi o 50 rrtV) pH 6, 5, para equi I i brar a col una de permita ani/Eli ca (neste exenpl o, uma coluna de captura).
Ap/B o equi I 0 br i o, realizou-se o passo de carregamento, onde o material de alimenta'2o (p/B colheita de caldo de fermenta'2o colhido, de cerca de 20 L, por exenpl o)) foi carregado na coluna de permita ani/Erica a uma taxa de cerca de 200 crrfh por exenpl o. Ap/B o volume de coluna de 0,5 do material carregado ter passado através da coluna de permita ani/Eli ca, o agrupamento de fluxo atravHs de (FT) foi recol hi do num r ecept (Stul o tal corro um reci pi ente de pol i et ersul f ona, enquanto que o corpl exo de toxina H ligado ao material da coluna de pernota ani/Erica. Seguiu-se um passo de I avagep em que pelo menos cerca de 15 volumes de col una do t arp2 o de I avagem( por exerpl o, f osf at o de s/Edi o 50 rrM a um pH de 6,5) foram passados atravHs da coluna de permita ani/Eri ca. O passo de I avagemf oi i nterrorpi do quando o UV, medido na sa°da da coluna, emterpo real, di rri nui u para menos ou igual a cerca de 80 rrAU. O vol ume do tanp2o de lavagem e o volume do fl uxo/vol ume da lavagem foram registados e uma amostra de 1 rrt do grupo de f I uxo/1 avagem foi tomada e testada, por exenpl o, para a concentra'2o de toxina, o teor de (St i do nucl ei co, prote°nas de cHI ui as inteiras, SDS-PAGE qPCR, LC 2D e ELISA. O passo seguinte foi o passo de elui'2o, onde o
tanp2o de e I ui '2 o (por exenpl o, acetato de s/ffli o 50 rrM pH 4,8) foi bombeado para a coluna de permita ani/Eli ca. Quando a leitura UV na sa°da da coluna, emtenpo real, aumentou para cerca de 150 rrAU ou mai s, i ni ci ou-se a col et a de ei u°do em um reci pi ent e prU- chei o com 1 CV de t anp2 o de el ui '2 o (acetato de s/ffli o 50 rrtv] pH 4,8). A coleta do grupo de e I ui '2 o foi interronpida quando a leitura UV di rri nui u para menos ou igual a cerca de 200 rrAU (o volume coletado neste ponto est® entre cerca de 1 a cerca de 2 CV). O sistema de c r omat ogr af i a foi ent2o descont arri nado e I i rrpo com hi dr/Ed do de s/Edi o 1 N. O grupo de e I ui '2 o da coluna de permita ani/Eiica foi ent2o preparado para adi'2o na coluna de permita cati/Eiica. O vol ume de elu°do de troca de ani Pes, o pH, a condut i vi dade e a temperatura de alimenta'2o foram recodi f i cados e o grupo de e I ui '2 o da coluna de permita ani/Eli ca foi dilu°do com 1 CV de acetato de s/Edi o 50 rrA/J pH 4, 8.
Ap/B a passagemda coluna de permita ani/Eiica, foi realizada opera'2o de crorratografi a de troca cati/Eiica. A coluna de permita cati/Eiica (por exenpl o, Porosa 20HS) foi equilibrada com um ιτί ni mo de 5 CVs de tanp2o de equi I 0 br i o ( acet at o de s/Efi o 50 ni/) pH 4, 8). Ap/B oequil°brio, o grupo de el uat o di I u° do da col una de per rrut aani/Eiicafoi carr egado na coluna de permita cati/Eiica e o volume total carregado foi gravado. Depois de o volume de coluna de 0,5 volumes de massa de eluato dilu°do carregado ter passado atravUs da coluna de permita de catiPes, o grupo de fluxo através (FT) foi recolhido. Foi realizada uma primeira I avagem da coluna de permita cati/Eiica onde cerca de 3-5 CV de acetato de s/EJi o 50 rrM pH 4,8, passaram através da coluna de permita cati/Eiica (o volume do primeiro tanp2o de lavagemutilizado foi regi stado) . Real i zou-se uma segunda I avagem emque cerca de 3 CV de cloreto de s/EJi o 170 rrM acetato de s/Efi o 50 rrM pH 4, 8, f oram borrbeados atravUs da col una, este el uente sendo recolhido num novo recipiente coma etiqueta "\AASH 2 Peak". A coleta foi iniciada quando as leituras UV aumentam para igual ou superior a 50 rrAU. 1 CV foi coletado e o segundo volume do tarrp2o de lavagemutilizado foi registado. A el ui '2o do conpl exo de toxi na em massa a parti r da coluna de permita de catiPes foi realizada utilizando t anp2 o de ei ui '2 o (por exenpl o, cl or et o de s/EJi o 250 rrM em acetato de s/Efi o 50 rrM pH 4,8) que foi borrbeado para a col una de per mit a cat i /Eli ca. Quando a leitura UV da elui'2o atingiu pelo menos cerca de 100 rrAU, a coleta de elui'2o come'ou em reci pi entes prU-chei os com tanpPes de di I ui '2o (40 rrt de fosfato de potdSsio 100 rrM pH 6, 8 e 60 rrt de citrato de potdSsio 10 rrM pH 6,5). A coleta de eluato da coluna de troca de catives continuou atU que as leituras UV dininu°rampara cerca de 100 rrAU ou menos. Ovolumetotal de elu°do, apAs a d i I ui '2 o, foi registado. O sistema de c r omat ogr af i a de troca de catives foi ent2o descont arri nado e I i npo.
Ap/ts a e I ui '2 o da coluna de permita cati/Biica, o eluato foi submetido a f i I t r a '2 o. Foi utilizado umsistema de f i I t ra'2 o de f I uxo t angenci al (TFF), usandotr5s merrbranas MAÇO de 100 K ( Sart or i us AG, Goet t i ngen, Al ema n ha) enpi I ha das uma sobre a outra. Observou-se o volume inicial do grupo de e I ui '2 o de troca de catives, assi m corro as describes da solu'2o de di af i I t r a'2 o/equi I 0 br i o e saneamento. Por exenpl o, a solu'2o de diafiltra'2o pode ser 10 rrM de citrato de pot®5si o, pH 6, 5 e a solu'2o de saneamento pode ser 0,1 Nde hidr/Ecido de s/Hi o. Aconfigura'2o do sistema prosseguiu coma conex2o de umtubo do reservat/fri o contendo elu°do da coluna de catiPes (IAPF) ou coluna HI C ( FAPF), o eluato contendo toxina botul°nica, através da cabe'a da borrba de ultrafi ltra'2o na entrada da merrbrana de f i I t r a '2 o de fluxo tangencial. Umsegundo tubo da sa°da de permeado da merrbrana de f i 11 r a '2 o de fluxo t angenci al foi conectadoaorecipiente de permea'2o de ultrafi ltra'2o (UF). Umtubo da sa°da de retentado da merrbrana de filtra'2o de fluxo tangencial para o reservat/fri o de reten'2o foi seguro e um quarto tubo do tanp2o de diafiltra'2o (DF) através da cabe'a da borrba de diafiltra'2o e no reservat/frio de reten'2o t arrbUmf oi seguro.
Otanrp2o de ar mazenament o do sistema foi lavado, assim corro a merrbrana, I avando a merrbrana com pel o menos cerca de 720 rrL de dgua para i nj e'2o (VNFI) com o retentado di red onado ao desperd°cio, ap/6 o que a merrbrana foi lavada com pel o menos apr oxi madament e 4200 rrL de (Sgua para inje'2o como retentado reci rcul ando para o reservat/Eri o. Depoi s di sso, o saneamento da membrana (se necessdrio) foi realizado lavando a membrana com pel o menos cerca de 200 rrL de hi dr/E<i do de s/Hi o 1 N com o retentado direcionado ao lixo, seguido de uma descarga da merrbrana com pel o menos cerca de 200 rrL de 1 N NaOH com o retentado reci rcul ando no reservat/Eri o por umrrtnirro de 30 minutos. O equi 10 br i o f oi ent2 o real i zado, I avando a membra na comtanp2o de equil°brio (citrato de potdSsio 10 rrM a um pH de 6,5), com retentado direcionado ao desperd°cio atU o pH do retentado e do permeado estar dentro de +/- 0,2 unidades do pH do tanp2o de equi Io brio (por exemplo, dentro de +/-0, 2 uni dades de pH 6, 5). A concentra'2o do material (eluato (grupo de produtos) a partir da coluna de permuta de catibes) foi determinada, para ver se a di I ui '2 o ou concentra'2o (processamento exemplar) era apropriada (um exemplo de concent ra '2 o alvo pode ser de cerca de 0, 7 mg/ rrL). A di I ui '2 o foi real i zada ut i I i zando ci trato de potdâssi o 10 nM pH 6, 5. Det er rri nou-se um volume alvo, por exemplo, para uma concentra'2o de produto de 0,7 ng/rrL (alvo vol ( concent ra'2 o i ni ci al / pont o de partida)/0,7 ng/rrL). 0 grupo de produtos (elu°do ( em conf or rri dade ou n2 o) da coluna de troca de catives) foi carregado na merrbrana e a recircula'2o (comsa°da de permeado fechada) do sistema (sistema TFF) foi executada durante pelo menos 2 rrinutos sem cont rapress2 o, ap/B o que o a v(SJ vul a de permea'2o foi lentamente aberta enquanto ajustava a v(SJ vul a de contra'2o de reten'2o de press2o para um alvo t ransmerrbranar de aproxi madament e 7 psig. Para dilui'2o, adiciona-se citrato de pot ®5 s i o 10 rrM pH 6, 5 ao volume alvo, e rmve-se para a diafiltra'2o sem ultrafi ltra'2o; para a concent r a'2 o, a ultrafi ltra'2o H iniciada. Para di afi I tra'2 o: o desperd°cio de permeado foi coletado em um novo recipiente (o volume de diafiltra'2o alvo H o volume de diafiltra'2o 5X) e diafiltrado com pelo menos 5 volumes de diafiltra'2o de citrato de potdSsio 10 rrM pH 6,5. Os dados do processo de diafiltra'2o foram coletados em intervalos nf ni rros de 10 rrinutos (peso de permeado g/vol rrt, press2o de entrada (psig), press2o de reten'2o (psig), press2o de permeado (psig) e press2o t ransmerrbranar (psig)). Para r eci r cul a '2 o/ enxaguament o: como filtro de sa°da de permeado fechado, o sistema foi reci rcul ado/execut ado durante pelo menos 2 rrinutos s em cont r apr ess2 o e o sistema foi enxaguado com pel o menos 20 rrt de citrato de potdSsio 10 rrt/) pH 6,5. O grupo de produtos inclui o retentado e o enxagBe. Uma a most ra pode ser r et i rada do conj unt o de produt os e subnet i da a anOise de verifica'2 o, inclui ndo, por exenpl o, UV a 278 nrq SDS- Page, LcHPLC. SE-HPLC, qPCR, RP-HPLC, Nat i ve- Page, AUC, Lirrisus lisbocyte lysate, V\èstern Blot e testes ELISA. Para a I i rrpez a p/B-uso, o sistema foi lavado com hi d r /5c i do de s/ffli ο 1 N, reci rcul ado durante pel o menos 10 rrinutos, apAs o que o sistema foi lavado e armazenado com hi dr /Be i do de s/ffli o 0, 1 N no mes rm. A f i I t r a '2 o e o enchimento estHril foram ent2o conduzidos para armazenar e dividir a neurotoxina em massa. O ajuste de concentra'2o foi realizado para ajustar a concentra'2o de toxina, usando citrato de pot®ssio 10 pH 6,5, para cerca de 0,5 rrg/rrt coma amostra de enx(Egue. Se a concentra'2o de toxina for inferior a cerca de 0,5 rrg/rrt, ent2o η2 o H necess®rio ajustar a concent r a'2 o.
Usando uma pipeta estUril, foramfeitas al°quotas de 10 rrt/0, 75 rrt emeada um dos tubos de amostra estareis de 15 rrt/1, 5 rrt. O reci pi ente do produto foi suavemente agi tado manual mente e transferida a quantidade necess®ria de solu'2o ( cont endo subst°ncia farmacol/lgica a grane I, ou seja, toxina botul°nica em massa) em cada frasco para i nj ect®/ei s. As amostras foram ar mazenadas no rriEXi rro 5 dias a 2 é C - 8 é C de geladeira ou 0,75 rrt do produto filtrado foi transferido para crioviais. Os crioviais s2o armazenados a -70 é C +/-5 é C.
Exerrpl o 3 jVffltodo de Corrposi '2o
Uma corrposi '2o farmacsutica adequada para adrri ni st r a'2 o a um paciente pode ser feita por corrt>ina'2o de urra neurotoxina botul°nica obtida a partir de um processo do Exenpl o 2 com um ou rrai s exci pi entes. Um exci pi ente pode at uar para est abi I i zar a t oxi na bot ul°nica durante o processo de conposi '2o e durante umper°odo de armazenamento posteri or antes da ut i I i z a '2 o. Um exci pi ente tarrbUm pode funcionar corro um agente de volume e/ou para proporcionar urra certa tonicidade - conposi '2o f ar rracs ut i ca. Conposto requer urra d i I ui '2 o de dobras rrôltiplas da neurotoxina botul°nica obtida a partir de um processo do Exenpl o 2, rristurando com um ou rrai s exci pi entes (tais corro a I burn na [tal corro urra al burn na de soro hurrano ou urra al burn na hurrana recorrbi nante] e cl oreto de s/ffli o) para assi m former urra conposi '2o de toxina e a prepara'2o de urra forrra est@r/el e armazenada de conposi '2 o da t oxi na, corro por I i of i I i za '2 ο, I i of i I i za '2 o ou secagem a v®cuo da conposi '2o. Assi rp cerca de 1,5 a 1,9 ng do Exenpl o 2 o corrpl exo de toxina bot ul 0 nica t i po A obtido H conposto com cerca de 0,5 niligrarras de a I burn na hurrana recorrbi nant e (Delta Biotechnologies) e cerca de 0,9 niligrarras de cloreto de s/ffli o, rristurando estes tras ingredientes em conjunto seguidos por secagem sob vdtuo. A secagem por v®cuo pode ter lugar de cerca de 20 é C a cerca de 25 é C, a urra press2o de cerca de 80 mm Hg, durante cerca de 5 horas, momento em que os frascos em que estes componentes s2o secos ao v®cuo s2o selados sob vdtuo e tarrpado, obtendo assi m um f rasco com cerca de 100 unidades de corrpl exo botul°nico de neurotoxina t i po A. O produto solido seco resultante (em p/Ç H, ap/ls o uso, r econst i t u° do com solu'2o salina normal (0, 9°Λ) e usado para tratar pacientes comvdrias indicates, corro distonia cervical e hiperidrose. A I i of i I i za'2 o, o v®cuo ou a I i of i I i za '2 o prepara uma forma est®/el e ar mazen®/el de conpress2o da neurotoxina botul°nica.
Em outro exenpl o, cerca de 1,5-1,9 ng da toxina botul°nica em massa tipo A H composto com cerca de 0,5 rri I i gramas de al bum na de soro humano ( Baxt er/1 nmino, Octapharma e Pharmacia &amp; Upjohn) e cerca de 0,9 rri I i gramas de cloreto de s/ffli o por rristura destes tras ingredientes juntos seguidos por secagem a v®cuo. A secagem exenpl ar por v®cuo pode ter lugar de cerca de 20 é C a cerca de 25 é C, a uma press2o de cerca de 80 =m de Hg, durante cerca de 5 horas, momento em que os frascos em que estes conponentes s2o secos sob v®cuo s2o sei ados sob v®cuo e tanpados, obtendo assi m um f rasco para i nj ect ®/ei s com cerca de 100 unidades de toxina botul°nica. O produto s/H i do seco (em p/Ç resultante H, ap/ls o uso, r econst i t u° do com sol u'2o salina normal (0, 9°Λ) e usado para tratar pacientes com v®rias indicates, corro distonia cervical e hiperidrose. Adi ci onal ment e, uma conposi'2o farmac5utica de toxina botul°nica pode conter al burn na de soro humano e/ou lactose, por exenpl o. Em um exenpl o, cerca de 1,5-1,9 ng da toxina botul°nica em massa tipo A podemser conpostos comcerca de 125 nicrogramas de a I burn na de soro humano e 2, 5 miligramas de lactose e secas sob v<Stuo, liofilizadas ou liofilizadas para estabilidade de armazenamento, por exenplo. Ainda em outro exenplo, cerca de 1,5-1,9 ng de neurotoxina botul°nica obtida pelos processos aqui descritos podemser combinados comcerca de 10 mg de trealose e cerca de 0, 5 ng de albumina de soro (tal corro a I burn na de soro humano, nativa ou recorrbi nant e) e, opci onal ment e, cerca de 1 rri li grama de metionina para fornecer cerca de 100 unidades de produto seco de toxina botul°nica. Esta conposi'2o pode ser liofilizada e reconst i t u° da post er i or ment e corn antes do uso, cerca de 1 nl de (Egua estéril destilada ou solu'2o salina η2 o conservada estUril ( 0, 9% de cloreto de s/Edi o para inje'2o), por exenpl o. Em exemplos particulares, as conposi ' hes farma^uticas detoxina botul°nica podem i ncl ui r sacarose, tal corro numa forrrola'2o exenpl ar com cerca de 1,5-1,9 ng de neurotoxina botul°nica obtida pelos processos aqui descritos corrbi nados comalbBrrina de soro humano 20% e sacarose, que tambUmpode ser liofilizado para proporcionar cerca de 100 unidades de toxina botul°nica t i po A e depois reconstitu°das comsolu'2osalina n2o conservada ( num vol ume de cerca de 0,5 nl a cerca de 8,0 rrt, por exemplo). Num exenplo particular, 200 unidades de neurotoxina botul°nica podem ser corrbi nadas com cerca de 10 rrg de sacarose e 2 ng de a I burn na de soro humano por ml, e a compos i '2 o resultante colocada em frascos e liofilizada, para depois ser r econst i t u° da antes do uso comsol u'2o salina f i si ol Agi ca.
Adi ci onal ment e, a compos i '2 o t ambUrn pode utilizar o componente neurot/tkico (ou seja, o componente de cerca de 150 kDa do corrpl exo do t i po A da t oxi na bot ul0 ni ca, livre de prote°nas corrpl exant es) do corrpl exo da toxina bot ul 0 nica do tipo A que pode ser obtido pelos processos IAPF aqui descritos. Num rrllltodo de purifica'2o do componente neurotAxico de cerca de 150 kDa das prote°nas n2o tAkicas associadas (por exerrpl o HAs, NTNH), a neurotoxina do t i po A H purificada a partir das prote°nas η2 o t/Bcicas associadas do corrpl exo por urra rradifica'2o do nlUtodo de Tse et al . ( 1982) (Goodnough, M C. , 1994, Thesis, UW Ws,), O corrpl exo de neurotoxina botul°nica obtido por nosso processo IAPF (que utiliza os passos de anion-cati2o de anion-cati2o ou 3-col unas de HI C de 3 colunas, corra discutido acirra) H recuperado a part i r de um DEAE- Sephadex A 50 ( Si grra Cherri cal Co., St. Louis, IVb.), pH 5,5, coluna e H precipitada por adi '2 o de 39 g de sul f at o de amffiii o s/H i do/ 100 rrt. O corrpl exo de toxina precipitado H recolhido por cent r i f uga '2 o, di al i sado contra fosfato de s/ffli o 25 rrf/J pH 7, 9 e aplicado a urra coluna DEAE-Sephadex A50 equilibrada com o mesmo tarrp2o. O corrponente neurot/B<ico H separado das prote°nas η2 o t /Bei cas do corrpl exo e elu°do da coluna com um gr adi ent e de cloreto de s/ffli o 0-0,5 M linear. O corrponente de neurotoxina parcial mente purificado H recuperado da coluna DEAE-Sephadex A50 a pH 7, 9 e di al i sado contra fosfato de s/Hi o 25 rrM pH 7,0. A toxina di al i sada H aplicada a SP-Sephadex C50 (Sigma Chemical Co.) emfosfato de s/ffli o 25 rnM pH 7,0. O material contam nante η2 o se liga ~ coluna sob estas condi 'Pes. A neurotoxina pura (o componente de cerca de 150 kDa) H elu°da com um gr adi ent e linear de cloreto de s/ffli o 0-0,25 Μ A neurotoxina pura de cerca de 150 kDa pode ser adi ci onal ment e purificada por cr orrat ogr af i a de afinidade de met al , filtra'2oemgel ou out r os rr1||t odos de cr orrat ogr af i a de prote°nas. Corra aci ma, esta neurotoxi na pura (o componente neurot/Bd co de 150 kDa de um corrpl exo de toxina botul°nica) pode ser liofilizada, v<Stuo ou liofilizada cornos vdfios exci pi entes (por exerrpl o, al bum na de soro, sacarose, lactose, cl or et o de s/ffli o, trealose, etc.) di scut i dos aci ma. O corrpl exo de neurotoxina botul°nico em massa obtido pelo nosso processo IAPF pode ser combinado de vdrias maneiras. Patentes exerrpl ares que revel am vdr i as forrrula'Pes de toxinas botul0 nicas, como Patente USA No. 6,087,327 (descreve uma conposi'2o de toxina botul 0 ni ca tipos A e B formilada com gel at i na); Patente USA No. 5,512,547 (Johnson et al ) intitulado "Pharmaceutical Conposition of Botulinum Ne u rot ox i n and IVfet hod of Pr e par at i on", e ni t i do em30 de abr i I de 1996 e reivindica uma fornxila'2o pura de tipo A de botul i na corrpr eendendo a I burn na e trealose, estdà/el em armazenamento a 37 é C; Patente USA N é 5,756,468 (Johnson et al.) concedido em 26 de maio de 1998 ("Pharmaceutical Corrposi t i ons of Bot ul i num Toxi n or Bot ul i num Neur ot oxi n and IVbt hod of Pr epar at i on") e r ei vi ndi ca uma f or rail a '2 o de t oxi na bot ul 0 ni ca I i of i I i zada corrpr eendendo umt i oal qui I o, al burri na e trealose que podem ser armazenados entre 25 é C e 42 é C; Patente USA No. 5,696,077 (Johnson et al.) Intitulado "Pharmaceutical Composition Containing BotulinumB Corrpl ex" emitido em 9 de dezembro de 1997 e reivindica uma forma'2o de corrpl exo de bot ul i num do t i po B sem cl or et o de s/Hi o, que cont Hm um corrpl exo de t i po B e um exci pi ente de prote°na; e o nBmero de publica'2o do pedido de patente US 2003 01 18598 (Hunt) descreve as utiliza'Pes de vCSTios exci pi entes tais corro uma al burri na recorrbi nant e, col agUni o ou umarrido para estabilizar uma toxina botul 0 ni ca, todos f or necem exerrpl os de v®rias forrrul a'Pes/exci pi entes βΐ ei s que podem ser utilizados para agravar o volume botul°nico neurotoxina fornecida pelo nosso processo IAPF e fornecer urna composi '2o f ar macs ut i ca. O complexo de toxina botul°nica obtido pode ser elu°da a partir de uma coluna de permita i/Eiica, numtanp2o de pH 7-8 para dissociar os conpl exos de prote°nas η2 o toxinas a partir da rrol Hcul a da toxina botul°nica, fornecendo, assi rp (dependendo do tipo de bactéria Cl ost r i di um bot ul i num f er ment ado) botul°nica toxina tipo a conponente neurot/Ed co com um peso de aproxi madament e 150 kDa molecular, e uma potência especifica de 1-2 X 10 8 LD 50 U/rrg ou superior; ou purificado de toxina botulica do tipo B com um peso de aproxi madament e 156 kDa molecular e uma pot 5 nci a es peei f i ca de 1-2 X 10 8 LD 50 U/ rrg ou super i or, ou t oxi na bot ul°nica do tipo F purificada comum peso rrol eeul ar de aproxi madament e 155 kDa e uma potsncia espec°fica de 1-2 x 10 7 LD 50 U/ rrg ou superior.
Nossa inven'2o oferece miitos benef°cios. Em primeiro lugar, 0 processo de tr5s colunas do Exenpl 0 2 e I i rri na 0 uso de reagentes e meios de origem animal (por exenpl 0, hidrolisado de case°na e placas de agar sangue de Columbia), diminuindo acent uadament e os riscos te/fricos de exposi'2o do paciente a agentes semelhantes a pri hes ou outros agentes infecciosos. Em segundo lugar, 0 processo de c r omat ogr af i a emtr5s colunas (e 0 sistema associado) do exenplo 2 H altamente r epr odut0 vel , corro evidenciado por excel ente consi st5 nci a do I ot e com ο I ote. Essa mel hori a traduz-se emum perfil cl°nico irais consistente em pacientes que necessitam de tratamentos repetidos com corrpostos contendo toxina botul°nica comer ci al ment e dispon°veis ao longo de vdrios anos. Estudos anal°ticos de subst°ncia medicamentosa (neurotoxina botul°nica) dos processos IAPF aqui descritos (coluna 2 e 3) revel aram uma menor carga de prote°nas e i rrpurezas de (SCi dos nucl ei cos. Esta menor carga de i rrpurezas de prote°nas traduz-se em um menor risco de i rrunogeni ci dade (produ'2o de anticorpos). Al Hm disso, a pureza melhorada do processo IPAF traduz-se em uma menor incidida de sintomas η2 o espec°ficos corrumente associados a drogas bi ol /Igi cas ( p. ex., nasof ar i ngi t e, sintomas do tracto respi rat/fri o superior, sintomas rruscul oesquel Ht i cos, dor de cabe'a, etc.). Al Hm disso, a melhoria na escala reduzida deste processo di rri nui o risco de exposi'2o de BoNTT/A emlaborat/frio e equipe de instai a'Pes de f abri ca'2 o.
Exenpl os de vantagens do presente i nvento i ncl uerrj por exenpl o: 1. A seguran'a H melhorada, uma vez que nenhum conponente ou subst°ncia derivada de fonte animal (por exenpl o, humano ou animal) H usado no processo, uso de DNase e RNase, placas de agar de sangue de Columbia, a case0 na H el i rri nada ( subst i t u° da, por exenplo, por: f i I t ra '2 o carregada durante a etapa de escl areei ment o/col hei t a e tHcnicas de cromat ograf i a modernas, semeando meios de cultura diretamente com c Hl ul as de um banco de c HI u I as de trabalho, ou seja, c HI u I as previ amente selecionadas e propagadas/rrant i das em mei o de APF, e frascos de cultura e meios de fermenta'2o substitu°dos comPeptona de Soja Tipo II (SPTII) corm uma fonte de peptona). 2. Entre aproxi madament e 50 rrg e cerca de 200 rrg de t oxi na bot ui 0 ni ca de alta qual i da de t i po A conpl exo pode ser obtido por 10 L de mei o de fermenta'2o. 3. A t oxi na em massa pur i f i cada H obt i da a part i r de um processo robusto, consistente, escal ®/el , vai i d®/el e conpat°vel com cGIVP. Robusto significa que o processo H reprodut°vel mesmo com uma rrudan'a de cerca de é 10% em um ou mai s dos par°metros do processo. Vai i d(&amp;/el significa que o processo reproduz°vel fornece rendimentos consistentes de toxina purificada. A conform dade do cGIVP significa que o processo pode ser facilmente convertido em um processo de fabrica'2o que cunpra as Boas Prdticas de Fabrica'2o de boas prdticas atuais da FDA. 4. A pots nci a do conpl exo final de toxina botul°nica purificada atende ou excede a potsncia (por exenpl o, corro deterrrinado pelo ensaio M.D50) do conpl exo purificado de toxina botul°nica obtido a partir de um processo Schantz ou Schantz modificado. 5. Substitui '2o de quaisquer passos de precipita'2o com passos cromat ogrdf i cos para purificar um conpl exo de toxina botul°nica em massa, o que melhora a especificidade do processo de purifica'2o. 6. O novo processo mel hora do facilita a redu'2 o da escala, resultando em mel hor manipula'2o e realiza'2o de uma taxa de sucesso operaci onal > 95% ( por exenpl o, reduzida de volumes t°picos utilizando 110 L -120 L de meio de fermenta'2o atU cerca de 10 L a cerca de 50 L, mesmo atU cerca de 2 L atU cerca de 30 L de mei o de fermenta'2o ou uma quantidade entre eles. A escala de produ'2o atual t°pica para subst°ncia f ar macol Agi ca em massa H 115 L de meio de fermenta'2o η2 o APF e, corro um aspecto da nossa inven'2o, foi reduzida para 20 L de mei o de fermenta'2o. Essa redu'2o de escala H poss°vel através da otirriza'2o da s°ntese e I i bera '2 o celular do conplexo BoNTT/A, bem corro do rendi ment o geral em todas as etapas de pu r i f i c a'2 o, resultando em quantidade si rri I ar de toxina botul°nica final (subst°ncia f ar macol Agi ca), corro obtida em processos anteriores que exigem por exenpl ο 5X ou mesrro mai s volumes de fermenta'2o (por exenpl o, 115 L). Essa escala reduzida facilita o gerenci ament o do vol ume de trabal ho de f er ment a '2 o e rri ni rriza o risco potencial de exposi'2o do operador ao conpl exo
BoNTT/A, uma vant agem operaci onal e de seguran'a irrportante. 7. Devido - natureza pot enci al ment e letal do complexo BoNT / A, os sistemas fechados foram i rrpl ernent ados ao longo do processo de fabrica'2o conforme aqui divulgado. Ao contr®rio dos rrlUtodos da tUcnica anterior, nenhum mat er i al de subst°ncia de f®rmaco produzido de acordo comaspectos da presente inven'2o H exposto ao arriai ente durante a transferencia entre as operates da unidade; todas as operates est2o total mente contidas. 8. O processo de fabrica'2o de toxina botul°nica em grande aqui divulgado H si rrpl i ficado em todas as etapas sem sacri f i car a identidade, qualidade, pureza ou pot5ncia da subst°ncia de f®rrraco durante o fabrico. Uma sUrie de etapas utilizadas emum processo n2o-APF foram ei i rri nadas no processo IAPF redesenhado, reduzindo assim o tenpo de produ'2o, por exenplo, de 21 di as a 6 dias ou menos. 9. A condi '2o de armazenamento da toxina botul°nica em massa corro uma solu'2o congelada melhora consideravelmente a estabilidade da subst°ncia de fcgrmaco.
Os agrupamentos de elementos alternativos ou formas de realiza'2o da inven'2o aqui divulgados η2 o devem ser i nterpretados corro I i rrita'Pes. Cada merrbro do grupo pode ser referido e reivindicado i ndi vi dual ment e ou em qual quer combi na'2o com outros membros do grupo ou outros elementos aqui encontrados. Prev4-se que umou mai s membros de umgrupo possam ser inclu°dos ou exclu°dos de umgrupo por razPes de conven^ncia e/ou pat ent eabi I i dade. AI Hm disso, qualquer combi na'2o dos elementos acima descritos em todas as suas poss°veis varia'Pes H abrangida pela inven'2o, a menos que seja indicado de outra forma aqui ou de outra forma claramente contrariado pelo contexto.
Errbora a presente inven'2o tenha sido descrita em pormenor no que diz respeito a deterrri nados rrlUtodos preferidos, outras formas de realiza'2o, vershes e rmdifica'hes dentro do ° rrbi t o das r ei vi ndi ca ' hes s2o poss0vei s.

Claims (8)

  1. REI VI NDICAauES
    1. Processo para a produ'2o de um conpl exo de neurotoxina botul°nico de tipo A biologicamente activo que conpreende os passos sequenciais de: (a) cultura de bactérias de Cl ost r i di um bot ul i num num meio de cultura que H total mente isento de produtos derivados de animais ou cont Hm pr odut os derivados de animais em quant idade inferior a 1 % ( p/ v) ; ( b) fermentar a bactéria Cl ost r i di um bot ul i num do meio de cultura em 1,8 a 82,5 L de um mei o de fermenta'2o que H total mente isento de produtos derivados de animais ou contHm produtos derivados de animais numa quantidade i nf er i or a 1 % ( p/v); (c) colher o meio de fermenta'2o removendo det ri t os cel ul ares; (d) concentrar o mei o de fermenta'2o colhido por f i I t r a '2 o; ( e) di I ui '2 o do meio de fermenta'2o concentrada por adi '2o de umtanp2o ao mesmo; (f) realizar um pri mei ro passo de contacto em que o meio de fermenta'2o colhido dilu°do H posto em contacto com um meio de c r orrat ogr af i a de perrruta ani/Biica de modo que a neurotoxina botul°nica biologicamente activa no meio H capturada pelo meio de permita ani/Bnica; (g) el ui ndo a neurotoxina botul°nica capturada do meio de permita ani/Biica para obter um primeiro eluato; ( h) realizar um segundo passo de contacto em que o primeiro eluato H posto em contacto com um meio de c r orrat ogr af i a de permita de catibes para remover i rrpurezas do primeiro elu°do, obtendo assi m um segundo eluato; (i) realizar umterceiro passo de contacto em que o segundo eluato H contactado com um mei o de crorrat ograf i a de interac'2o hi dr of/Boi ca e elu°do para obter umterceiro el uat o; (j) processamento do terceiro eluato por di af i 11 ra '2 o; e (k) filtrar o terceiro eluato processado para obter um produto contendo um conpl exo de tipo neurotoxina bot ul 0 ni co bot ul°nico bi ologi carne nte activo comurra pot 5 nci a de 1,8 B 107 a 6, 6 x 107 unidades/ng; em que pelo menos um do meio de cultura e o mei o de f er ment a '2 o i nc I uem urra pr ot e° na veget al, enenhurraenzirra derivada de ani rral H utilizada para purificar a neurotoxina bot ul 0 ni ca; e em que o processo H realizado em urna semana ou menos.
  2. 2. Processo de acordo coma r ei vi ndi ca'2 o 1, em que o mei o de fermenta'2o η2 o conpreende mai s de 5, 5% ( p/v) de um produto de prote°na derivado de vegetais, η2 o mai s de 2, 2% ( p/v) de umextracto de levedura e η2 o mai s de 2,2% (p/v) de glucose, e em que o pH do meio de fermenta'2o H de 5,85 a 8, 8 no in°cio do passo de fermenta'2o.
  3. 3. Processo de acordo coma r ei vi ndi ca'2 o 1, em que o passo de cultura i realizado ati a densidade /fptica do meio de cultura a 540 nm estar entre 0,72 UA e 4,95 UA.
  4. 4. Processo de acordo coma rei vi ndi ca'2 o 1, em que o passo de fermenta'2o i realizado durante 54 a 88 horas atU a densidade /Eptica do meio de fermenta'2o a 890 nm di rri nui r para ent re 0, 045 UA e 0, 77 UA.
  5. 5. O processo de acordo coma r ei vi ndi ca'2 o 1, em que o passo de cultura H iniciada pela introdu'2o de uma quantidade de um Cl ost r i di um bot ui i num I i vr e produto animal trabalhando banco de c ill ui as para o mei o de cultura, o banco de c ill ul as de trabalho, conpr eendendo 0, 9 x 104 a 5, 5 x 107 unidades formadoras de col/Biias de Cl ost r i di um bot ul i num por nil i litro do banco de c ill u I as de trabalho e a bactiria Clostridium botulinum no banco de c ill u I as de trabalho possuindo uma morfologia subst anci al ment e uniforme.
  6. 6. Processo de acordo coma rei vi ndi ca '2 o 1, em que o produto do passo (k) η2 o conpreende mai s de 1 ng de (Sti do nucl ei co residual por rrg do produto.
  7. 7. Um sistema para produzir uma neurotoxina botul°nica biologicamente activa conpr eendendo: um pri mei ro aparelho para a cultura anaer/fbi ca da bactilria Clostridium botulinurp sendo o primeiro aparelho capaz de conter de 180 rrL a 1,1 L de um mei o de cultura que i total mente isento de produtos derivados de animais ou contim produtos derivados de animais em uma quantidade i nf er i or a 1 % ( w/v); umsegundo aparelho para a fermenta'2o anaer/Bai ca da bactiria Clostridium botulinum que foi cultivada no primeiro aparelho, sendo o segundo aparelho capaz de conter de 1,8 a 82,5 L de um mei o de fermenta'2o que H total mente isento de produtos derivados de animais ou cont Hm pr odut os derivados de animais em quantidade inferior a 1%(p/v), e o segundo aparelho incluindo pelo menos urna sonda descart®/el sei ecci onada de uma sonda de redu'2 o-oxi da'2 o, uma sonda de pH e uma sonda de turva'2o; um terceiro aparelho para colher o meio de f er ment a '2 o; um quarto aparelho para concentrar o meio de fermenta'2o colhido por f i I t r a'2 o e dilui '2o do meio de f er ment a '2 o f i I t r a do; um quinto aparelho para realizar uma primeira pu r i f i c a '2 o de neurotoxina botul°nica obtida a partir do mei o de fermenta'2o col hi do, o qui nt o aparei ho conpr eendendo um meio de c r ornat ogr af i a de permita ani/Biica capaz de capturar neurotoxina botul°nica; um sexto aparelho para realizar uma segunda purifica'2o de neurotoxina botul°nica elu°da a partir do meio de c r ornat ogr af i a de permita ani/Eli ca, o sexto aparelho conpr eendendo um mei o de c r ornat ogr af i a de permita cati/Eiica; um sUtirro aparelho para realizar uma terceira pu r i f i c a '2 o de neurotoxina botul°nica elu°da a partir do meio de cromatografia de per mit a cat i /Eli ca, o sUti mo aparei ho conpr eendendo um meio de cromatografia de intera'2o hi drof/Bai ca; e um oitavo aparelho para filtrar a neurotoxina botul°nica purificada do sUtirro aparelho, em que o oitavo aparelho conpreende urra merrbrana de f i 11 r a'2 o, e em que o produto contendo toxina botul°nica obtido tem urra pot4ncia de 1,8 B 107 a 6, 6 x 107 uni dades/rrg, o produto conpreende 1, 1 ng ou menos de ®ci do nucl ei co resi dual por rrg do produto, e o processo pode ser realizado em urra serrana ou menos; emque o si sterna H capaz de puri f i car a neurotoxi na botul°nica semo uso de urra enzi rra derivada de ani rrai s.
  8. 8. Si sterna de acordo coma rei vi ndi ca'2 o 7, que conpreende ainda um aparelho modular modificado por atmosfera, que conpreende urra c°rrara anaer/fbi ca que H capaz de conter o primeiro aparelho, emque a c°rrara anaer/fbi a conpreende umfiltro de ar particulado de alta efici5ncia i nt egrado.
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WO (1) WO2011008713A1 (pt)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8632785B2 (en) * 2000-02-08 2014-01-21 Allergan, Inc. Clostridial toxin pharmaceutical composition containing a gelatin fragment
JP5006803B2 (ja) 2005-03-03 2012-08-22 アラーガン、インコーポレイテッド クロストリジウム・バクテリアの培地およびクロストリジウム毒素を得るための方法
US8168206B1 (en) 2005-10-06 2012-05-01 Allergan, Inc. Animal protein-free pharmaceutical compositions
US8129139B2 (en) * 2009-07-13 2012-03-06 Allergan, Inc. Process for obtaining botulinum neurotoxin
CA2773396C (en) 2009-10-21 2020-12-15 Revance Therapeutics, Inc. Methods and systems for purifying non-complexed botulinum neurotoxin
KR20110046178A (ko) * 2009-10-28 2011-05-04 엘지전자 주식회사 이동 단말기
KR101134146B1 (ko) 2010-05-31 2012-04-19 메덱스젠 주식회사 국소 근마비 효과를 갖는 비확산형 보툴리눔 독소와 그의 정제방법
US9605887B2 (en) 2011-07-29 2017-03-28 Hdt Expeditionary Systems, Inc. Transportable packaged ice supply system for high temperature environments
GB201113544D0 (en) * 2011-08-05 2011-09-21 Fujifilm Diosynth Biotechnologies Uk Ltd Purification process
WO2014197837A1 (en) * 2013-06-06 2014-12-11 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for producing a biological toxin
WO2015014487A1 (en) * 2013-07-30 2015-02-05 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa Process for preparing a highly pure neurotoxic component of a botulinum toxin and uses thereof
KR101339349B1 (ko) * 2013-08-02 2013-12-09 주식회사 대웅 보툴리눔 독소의 제조방법
US20160287693A1 (en) * 2013-11-15 2016-10-06 Novartis Ag Removal of residual cell culture impurities
US9480731B2 (en) * 2013-12-12 2016-11-01 Medy-Tox, Inc. Long lasting effect of new botulinum toxin formulations
GB201407525D0 (en) * 2014-04-29 2014-06-11 Syntaxin Ltd Manufacture of recombinant clostridium botulinum neurotoxins
KR101729251B1 (ko) * 2015-04-28 2017-04-21 주식회사 대웅 보툴리눔 독소의 제조를 위한 배지 조성물
KR101775682B1 (ko) * 2015-11-30 2017-09-06 주식회사 대웅 보툴리눔 독소의 제조방법
WO2017161345A1 (en) 2016-03-18 2017-09-21 Biomadison, Inc. Improved cell based assay
RU2019110875A (ru) 2016-09-13 2020-10-15 Аллерган, Инк. Небелковые композиции клостридиального токсина
KR102463881B1 (ko) * 2016-10-04 2022-11-07 (주)메디톡스 보툴리눔 독소 함유 용액으로부터 보툴리눔 독소를 분리하는 방법
KR20190126894A (ko) * 2017-03-22 2019-11-12 본티, 인크. 치료법에서 사용하기 위한 보툴리눔 신경독소
EP3615669A4 (en) * 2017-04-28 2021-05-12 Bonti, Inc. BOTULINIC NEUROTOXINS PRODUCTION PROCESSES
EP3644971A4 (en) * 2017-06-26 2021-03-31 Bonti, Inc. CLOSTRIDIAL NEUROTOXIN FORMULATIONS AND USE
KR102140531B1 (ko) * 2018-08-07 2020-08-04 (주)휴온스 Gly-Tβ4의 제조방법
CN113056478A (zh) 2018-12-21 2021-06-29 一般财团法人阪大微生物病研究会 肉毒毒素的制造方法
KR102209159B1 (ko) * 2019-03-29 2021-01-29 (주)제테마 독소의 제조방법
KR102485146B1 (ko) * 2019-04-15 2023-01-06 (주)제테마 보툴리눔 독소의 제조방법
KR102447441B1 (ko) * 2019-04-15 2022-09-27 (주)제테마 보툴리눔 독소의 정제방법
US10851363B1 (en) * 2019-05-22 2020-12-01 Boke Zhang Multilayer nano-cell containing biomolecules
KR102287437B1 (ko) * 2019-08-14 2021-08-09 주식회사 프로톡스 보툴리눔 독소의 제조방법
TW202136518A (zh) * 2019-12-20 2021-10-01 瑞士商葛德瑪控股公司 生產肉毒桿菌毒素的方法
TW202136286A (zh) * 2019-12-20 2021-10-01 瑞士商葛德瑪控股公司 純化肉毒桿菌毒素的方法
KR20230009178A (ko) * 2021-07-08 2023-01-17 주식회사 파마리서치바이오 비-독소 단백질이 제거된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 단백질의 정제방법
KR102427362B1 (ko) * 2021-11-11 2022-08-01 (주)이니바이오 보툴리눔 독소 제제의 건조 공정
KR20240015446A (ko) * 2022-07-27 2024-02-05 (주)이니바이오 감압건조장치 및 이를 이용한 감압건조방법
WO2024102345A1 (en) 2022-11-07 2024-05-16 Allergan, Inc. Prevention of post-operative atrial fibrillation with a botulinum toxin

Family Cites Families (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4401683A (en) 1981-07-06 1983-08-30 Fmc Corporation Carbohydrate food products resistant to Clostridium botulinum and the formation of enterotoxin
AU4646393A (en) 1992-06-23 1994-01-24 Interactive Biologics Associates Pharmaceutical composition containing botulinum b complex
TW257792B (pt) * 1992-10-01 1995-09-21 Lilly Co Eli
NZ257215A (en) 1992-10-13 1996-12-20 Univ Duke Diagnosis or prognosis of alzheimers using the presence of apolipoprotein e type 4 as an indicator and apolipoprotein e isoform specific antibodies
US5314822A (en) 1992-10-15 1994-05-24 Merck & Co., Inc. Method of clonal growth of Streptococcus pneumoniae
GB9411138D0 (en) 1994-06-03 1994-07-27 Microbiological Res Authority Toxin assay
US5962637A (en) 1994-06-03 1999-10-05 Microbiological Research Authority Toxin assay
WO1996005222A1 (en) 1994-08-08 1996-02-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Purification and pharmaceutical compositions containing type g botulinum neurotoxin
US5512547A (en) 1994-10-13 1996-04-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Pharmaceutical composition of botulinum neurotoxin and method of preparation
US5756468A (en) 1994-10-13 1998-05-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Pharmaceutical compositions of botulinum toxin or botulinum neurotoxin and methods of preparation
ATE239491T1 (de) 1995-06-06 2003-05-15 L Bruce Pearce Verbesserte zusammensetzungen und verfahren zur chemodenervation mit neurotoxinen
US6444209B1 (en) 1996-10-28 2002-09-03 Wisconsin Alumni Research Foundation Hybrid botulinal neurotoxins
PT983342E (pt) 1997-05-28 2007-12-13 Novartis Vaccines & Diagnostic Meio de cultura com extracto de grãos de soja comofonte de amiinoácido e não complexos proteicos de fonteanimal
JP4055248B2 (ja) 1998-05-25 2008-03-05 味の素株式会社 精製ヒトアクチビン及びその製造方法
GB9902000D0 (en) * 1999-01-30 1999-03-17 Delta Biotechnology Ltd Process
DE19925739A1 (de) 1999-06-07 2000-12-21 Biotecon Ges Fuer Biotechnologische Entwicklung & Consulting Mbh Therapeutikum mit einem Botulinum-Neurotoxin
US6558926B1 (en) 1999-07-16 2003-05-06 Massachusetts Institute Of Technology Method for production of tetanus toxin using media substantially free of animal products
AU1571801A (en) 1999-11-12 2001-05-30 Eli Lilly And Company Improved fermentation process
AU1486801A (en) 1999-11-15 2001-05-30 Curagen Corporation Novel growth factor polypeptides and nucleic acids encoding same
DE10004024A1 (de) 2000-01-31 2001-08-02 Guenther Bebenroth Schaltungsanordnung zum Betreiben von Leuchtdioden
US8632785B2 (en) 2000-02-08 2014-01-21 Allergan, Inc. Clostridial toxin pharmaceutical composition containing a gelatin fragment
US20060269575A1 (en) * 2000-02-08 2006-11-30 Allergan, Inc. Botulinum toxin pharmaceutical compositions formulated with recombinant albumin
US20030118598A1 (en) 2000-02-08 2003-06-26 Allergan, Inc. Clostridial toxin pharmaceutical compositions
EP1398038B2 (en) 2000-02-08 2011-01-26 Allergan, Inc. Botulinum toxin pharmaceutical compositions
US6811067B2 (en) 2000-02-10 2004-11-02 Magna International Inc. Vehicle tailgate with storage capacity
JP2003009897A (ja) 2001-07-03 2003-01-14 Keiji Oguma ボツリヌス毒素の分離・精製法
AU2002321012B2 (en) 2001-08-14 2008-07-24 Statens Serum Institut A purification process for large scale production of Gc-globulin, product obtained thereby and their use in medicine
US7332567B2 (en) 2001-08-28 2008-02-19 Allergan, Inc. Fret protease assays for clostridial toxins
US7208285B2 (en) 2001-08-28 2007-04-24 Allergan, Inc. Fret protease assays for botulinum serotype A/E toxins
US8022172B2 (en) 2001-08-28 2011-09-20 Allergan, Inc. Luminescence resonance energy transfer (LRET) assays for clostridial toxin activity
KR20030060150A (ko) 2002-01-07 2003-07-16 (주)메디톡스 클로스트리디움 보툴리눔 ａ형 독소를 정제하는 방법
RU2230325C2 (ru) * 2002-08-15 2004-06-10 Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны Российской Федерации Способ приготовления очищенного препарата ботулинического токсина типа а
US7183066B2 (en) 2002-09-27 2007-02-27 Allergan, Inc. Cell-based fluorescence resonance energy transfer (FRET) assays for clostridial toxins
US20040235139A1 (en) 2002-12-23 2004-11-25 Demain Arnold L. Clostridium difficile culture and toxin production methods
CA2472611C (en) * 2003-07-02 2009-09-15 Filtertek Inc. Multiple retainer bridge
US7160699B2 (en) 2003-09-25 2007-01-09 Allergan, Inc. Media for clostridium bacterium and processes for obtaining a clostridial toxin
US7148041B2 (en) 2003-09-25 2006-12-12 Allergan, Inc. Animal product free media and processes for obtaining a botulinum toxin
US7452697B2 (en) 2003-09-25 2008-11-18 Allergan, Inc. Chromatographic method and system for purifying a botulinum toxin
WO2005072433A2 (en) 2004-01-26 2005-08-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Toxin induced sympathectomy
DK1718756T3 (da) 2004-02-24 2012-02-27 Allergan Inc Botulinumtoksinscreeningassays
EP2266600B1 (en) 2004-07-26 2014-09-10 Merz Pharma GmbH & Co. KGaA Therapeutic composition with a botulinum neurotoxin
US20060069562A1 (en) 2004-09-10 2006-03-30 Adams Marilyn J Word categories
US7399607B2 (en) 2004-09-22 2008-07-15 Allergan, Inc. Fluorescence polarization assays for determining clostridial toxin activity
US20070258992A1 (en) 2004-10-06 2007-11-08 Atassi M Zouhair Determining and Reducing Immunoresistance to Botulinum Toxin Therapy Using Botulinum Toxin a Peptides
US20070277577A1 (en) 2004-10-29 2007-12-06 Allen Clyde G Sheet metal brake and hinge mechanism therefor
WO2006067230A1 (en) 2004-12-23 2006-06-29 Novo Nordisk Health Care Ag Reduction of the content of protein contaminants in compositions comprising a vitamin k-dependent protein of interest
JP5006803B2 (ja) 2005-03-03 2012-08-22 アラーガン、インコーポレイテッド クロストリジウム・バクテリアの培地およびクロストリジウム毒素を得るための方法
CA2604039C (en) 2005-04-05 2014-09-16 Allergan, Inc. Lipophilic dye-based fret assays for clostridial toxin activity
US8323666B2 (en) 2005-08-01 2012-12-04 Allergan, Inc. Botulinum toxin compositions
US7744904B1 (en) 2005-09-26 2010-06-29 B.B. Scientific L.L.C. Stabilization of Clostridium botulinum neurotoxin complex
NZ568216A (en) 2005-11-17 2012-09-28 Revance Therapeutics Inc Compositions and methods of topical application and transdermal delivery of botulinum toxins with reduced non-toxin proteins
EP3556770A1 (en) 2008-03-14 2019-10-23 Allergan, Inc. Immuno-based botulinum toxin serotype a activity assays
AU2010223912B2 (en) 2009-03-13 2015-09-24 Allergan, Inc. Immuno-based retargeted endopeptidase activity assays
US8129139B2 (en) * 2009-07-13 2012-03-06 Allergan, Inc. Process for obtaining botulinum neurotoxin
CA2773396C (en) 2009-10-21 2020-12-15 Revance Therapeutics, Inc. Methods and systems for purifying non-complexed botulinum neurotoxin
NL2010545C2 (en) 2013-03-28 2014-09-30 Ihc Holland Ie Bv Skidding system for an offshore installation or vessel.
US9889608B2 (en) 2014-11-10 2018-02-13 International Business Machines Corporation Matching the scale of independent objects or intelligently scaling objects when 3D printing

Also Published As

Publication number Publication date
EP3252070A1 (en) 2017-12-06
AU2010273601A1 (en) 2012-02-02
CA2767760C (en) 2018-12-04
US20210292727A1 (en) 2021-09-23
KR20180122039A (ko) 2018-11-09
CN102482332B (zh) 2016-08-03
MX2020009978A (es) 2020-10-12
ES2643554T3 (es) 2017-11-23
IN2012DN00456A (pt) 2015-05-15
SI2454275T1 (sl) 2017-12-29
JP5887268B2 (ja) 2016-03-16
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EP4299070A2 (en) 2024-01-03
SI3252070T1 (sl) 2020-03-31
CY1122567T1 (el) 2021-01-27
EP4299070A3 (en) 2024-03-27
US20120156756A1 (en) 2012-06-21
US20230029327A1 (en) 2023-01-26
US9719076B2 (en) 2017-08-01
US11203748B2 (en) 2021-12-21
MX2012000615A (es) 2012-03-26
JP6704329B2 (ja) 2020-06-03
CA2767760A1 (en) 2011-01-20
US20220298496A1 (en) 2022-09-22
CY1119519T1 (el) 2018-03-07
JP2020078306A (ja) 2020-05-28
DK3252070T3 (da) 2020-01-20
EP3640259A1 (en) 2020-04-22
KR101667174B1 (ko) 2016-10-17
US20220228136A1 (en) 2022-07-21
US20220145279A1 (en) 2022-05-12
CN102482332A (zh) 2012-05-30
US11326155B2 (en) 2022-05-10
US8927229B2 (en) 2015-01-06
PL2454275T3 (pl) 2017-12-29
ES2770031T3 (es) 2020-06-30
DK2454275T3 (en) 2017-10-23
EP3252070B1 (en) 2019-10-02
US11124786B2 (en) 2021-09-21
US8357541B2 (en) 2013-01-22
US20220033796A1 (en) 2022-02-03
HK1247629A1 (zh) 2018-09-28
US20230021648A1 (en) 2023-01-26
KR102344985B1 (ko) 2021-12-31
US20230123158A1 (en) 2023-04-20
US20200071686A1 (en) 2020-03-05
KR20150085140A (ko) 2015-07-22
US20120123095A1 (en) 2012-05-17
EP2454275B1 (en) 2017-07-12
US10465178B2 (en) 2019-11-05
US20220204958A1 (en) 2022-06-30
US11518986B2 (en) 2022-12-06
CN106117325A (zh) 2016-11-16
US20170327811A1 (en) 2017-11-16
US8932827B2 (en) 2015-01-13
US8324349B2 (en) 2012-12-04
KR101916139B1 (ko) 2018-11-08
PL3252070T3 (pl) 2020-04-30
US20110008843A1 (en) 2011-01-13
JP2017070291A (ja) 2017-04-13
US20220251532A1 (en) 2022-08-11
RU2561459C2 (ru) 2015-08-27
HUE047362T2 (hu) 2020-04-28
US20150184141A1 (en) 2015-07-02
US9206409B2 (en) 2015-12-08
EP4141024A1 (en) 2023-03-01
JP2021193103A (ja) 2021-12-23
JP2016028601A (ja) 2016-03-03
KR20120105417A (ko) 2012-09-25
KR20190111161A (ko) 2019-10-01
US8129139B2 (en) 2012-03-06
KR101784532B1 (ko) 2017-10-11
US20160097045A1 (en) 2016-04-07
RU2012104778A (ru) 2013-08-20
JP2012532932A (ja) 2012-12-20
US11530400B2 (en) 2022-12-20
US11525130B2 (en) 2022-12-13
US20120245324A1 (en) 2012-09-27
MX340718B (es) 2016-07-22
WO2011008713A1 (en) 2011-01-20
PT3252070T (pt) 2020-01-14
HUE033888T2 (en) 2018-01-29
US20120108792A1 (en) 2012-05-03
JP6356651B2 (ja) 2018-07-11
BR112012000784A2 (pt) 2020-08-11
EP2454275A1 (en) 2012-05-23
KR20170019489A (ko) 2017-02-21

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