CN106008682A - 抑制产气荚膜梭菌感染的重组ε蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抑制产气荚膜梭菌感染的重组ε蛋白及其制备方法与应用。该重组ε蛋白为a)或b)或c)：a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由SEQ ID No.2第51‑370位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。该重组ε蛋白免疫动物后可使动物产生较高的血清抗体水平，并且可抵抗产气荚膜梭菌的攻击。该重组ε蛋白可溶性好，纯化简易，可作为诊断抗原、制备成单克隆抗体或进一步对蛋白功能与构象关系进行研究。

Description

抑制产气荚膜梭菌感染的重组ε蛋白及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中抑制产气荚膜梭菌感染的重组ε蛋白及其制备方法与应用。
背景技术
产气荚膜梭菌(Clostridium Perfringens)也称魏氏梭菌，是一种重要的人畜共患病，该病原是创伤性气性坏疽和人类食物中毒以及羊快疫、羔羊痢疾、牛羊坏死性肠炎、牛羊肠毒血症的主要病原之一，对畜牧业造成了巨大的经济损失。产气荚膜梭菌主要的致病因素是其分泌的外毒素，种类多达13种，其中α、β和ε是最主要的外毒素，根据产生外毒素的种类不同，可将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E这五个血清型。ε毒素仅见于B型和D型产气荚膜梭菌中，是牛羊产气荚膜梭菌疾病的主要致病因子。产气荚膜梭菌的ε毒素导致动物传染病的防控是当前困扰动物疫病防控工作着的主要难题之一。传统疫苗在治疗和预防动物产气荚膜梭菌疾病方面虽然取得了一定的效果。但是，这些疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷，例如传统疫苗免疫易引起动物局部炎症以及毒性反应等。研发能表达ε外毒素抗原蛋白，并且不破坏ε外毒素抗原蛋白的免疫原性，对产气荚膜梭菌ε外毒素引起的疫病起到防控作用的基因工程疫苗是急需解决的技术难题。
现有技术中对产气荚膜梭菌主要外毒素蛋白的表达与纯化方法相对复杂，表达产物通常以不溶性的包涵体形式存在，可溶性蛋白表达的报道在国内外非常少。因为包涵体中的表达产物不具有生物学活性，因而需要进行变性与复性处理。蛋白的变性与复性是一个极其复杂的过程，不同蛋白的复性条件各异，复性率往往很难提高。这是限制其应用的主要制约因素。采用可溶性表达方式可很好的克服这一问题。如何构建可溶性表达载体并且优化可溶性蛋白的高效表达方法，是本领域长期以来一直研究的热点课题。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是如何获得抑制产气荚膜梭菌感染的可溶性蛋白质疫苗。
为解决上述技术问题，本发明提供了制备重组ε蛋白的方法。
本发明所提供的制备重组ε蛋白的方法，包括使重组ε蛋白的编码基因在生物中进行表达得到所述重组ε蛋白的步骤；所述生物为微生物、植物或非人动物；
所述重组ε蛋白为a)或b)或c)或d)：
a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)由SEQ ID No.2第51-370位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；
d)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的可溶性蛋白质。
上述方法中，a)的蛋白质名称为ε-his，b)的蛋白质名称为ε-Y。SEQ ID No.2由353个氨基酸残基组成。
上述方法中，蛋白标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化等。
上述方法中，所述使重组ε蛋白的编码基因在生物中进行表达包括所述重组ε蛋白的编码基因导入受体微生物，得到表达所述重组ε蛋白的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述重组ε蛋白。
上述方法中，所述受体微生物可为C1)-C4)中的任一种:
C1)原核微生物；
C2)革兰氏阴性细菌；
C3)埃希氏菌属细菌；
C4)大肠杆菌BL21(DE3)。
上述方法中，所述蛋白质的编码基因为如下1)或2)或3)或4)所示的基因：
1)编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；
2)编码序列是SEQ ID No.1的第151-1113位所示的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述重组ε蛋白。
其中，SEQ ID No.1由1068个核苷酸组成，其名称为ε-hisY基因，编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质ε-his。SEQ ID No.1的第151-1113位所示的DNA分子是ε-Y基因，编码由SEQ ID No.2第51-370位所示的氨基酸序列组成的蛋白质ε-Y。
上述方法中，所述重组微生物为将pET30a-ε-Y导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的重组ε蛋白的重组微生物，所述重组微生物命名为BL21(DE3)/pET30a-ε-Y，所述pET30a-ε-Y为将载体pET30a(+)的BamHI和XhoI位点之间的序列替换为SEQ ID No.1第151-1113位所示的DNA片段得到的重组载体。
上述方法中，所述表达为诱导表达，所述诱导表达是用0.75mM的IPTG在16℃诱导13-16小时或13-24小时或13小时或16小时。
下述任一种产品也属于本发明的保护范围：
P1)重组ε蛋白，所述重组ε蛋白为a)或b)或c)或d)：
a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)由SEQ ID No.2第51-370位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；
d)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的可溶性蛋白质；
P2)与所述重组ε蛋白相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B16)中的任一种：
B1)编码所述重组ε蛋白的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
P3)预防动物产气荚膜梭菌感染的疫苗，其含有所述重组ε蛋白或所述生物材料。
上述产品中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述产品中，所述重组ε蛋白按照上述任一种方法制备；
所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；
2)编码序列是SEQ ID No.1的第151-1113位所示的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；
所述重组载体为所述pET30a-ε-Y；
所述重组微生物为E1)或E2)：
E1)所述重组微生物为将所述重组ε蛋白的编码基因导入受体微生物，得到表达所述重组ε蛋白的重组微生物，所述受体微生物为C1)-C4)中的任一种:
C1)原核微生物；
C2)革兰氏阴性细菌；
C3)埃希氏菌属细菌；
C4)大肠杆菌BL21(DE3)；
所述重组微生物为所述BL21(DE3)/pET30a-ε-Y；
所述预防动物产气荚膜梭菌感染的疫苗的活性成分为所述重组ε蛋白或所述生物材料。
下述任一种应用也属于本发明的保护范围：
Y1)所述重组ε蛋白在制备抗产气荚膜梭菌疫苗中的应用；
Y2)所述生物材料在制备抗产气荚膜梭菌疫苗中的应用；
Y3)所述方法在制备抗产气荚膜梭菌疫苗中的应用；
Y4)所述重组ε蛋白在制备产气荚膜梭菌病诊断抗原中的应用；
Y5)所述重组ε蛋白在制备单克隆抗体中的应用。
本发明中，所述产气荚膜梭菌可为A、B、C、D和E这5种型产气荚膜梭菌中的任5种、任4种、任3种、任2种或任1种。
本发明中，所述抗产气荚膜梭菌疫苗具体可为上述预防动物产气荚膜梭菌感染的疫苗。
在实际应用中，可以将本发明的重组ε蛋白或其相关生物材料作为药物直接给予病人、或者与适宜的载体或赋形剂混合后给予病人，以达到治疗产气荚膜梭菌感染的目的。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。上述给药途径优选的是注射给药。
本发明将SEQ ID No.1的第151-1113位所示的DNA分子插入pET30a(+)的BamHI和XhoI位点，得到表达SEQ ID No.2的重组蛋白ε-his的重组表达载体pET30a-ε-Y。将重组表达载体pET30a-ε-Y导入大肠杆菌BL21(DE3)获得了可溶性的目的蛋白ε-his。本发明优化了ε-hisε-his的表达条件，进一步提高了ε-his的表达量，用0.75mM的IPTG在16℃诱导13-24小时，ε-his的含量达到菌体总蛋白的91％，表达的目的ε-his 99.4％可溶。ε-his免疫动物后可使动物产生较高的血清抗体水平，并且可抵抗产气荚膜梭菌的攻击。ε-his在抵抗A型产气荚膜梭菌攻击时的免疫保护率为90％(18只存活，2只死亡)，PBS对照组小鼠全部死亡；ε-his在抵抗B型产气荚膜梭菌攻击时的免疫保护率为95％(19只存活，1只死亡)，PBS对照组小鼠全部死亡；ε-his在抵抗C型产气荚膜梭菌攻击时的免疫保护率为80％(16只存活，4只死亡)，PBS对照组小鼠全部死亡；ε-his在抵抗D型产气荚膜梭菌攻击时的免疫保护率为95％(19只存活，1只死亡)，PBS对照组小鼠全部死亡。第三次免疫ε-his后7-14天抗体效价达到峰值，最高抗体效价达1：128000。ε-his可溶性好，纯化简易，可作为诊断抗原、制备成单克隆抗体或进一步对蛋白功能与构象关系进行研究。
附图说明
图1为各菌株表达蛋白的SDS-PAGE电泳图谱。
图中，M为Marker，从上到下分别为从上到下分别为130kD、95kD、70kD、62kD、51kD、40kD、29kD，1、诱导表达的受体菌全菌蛋白液体，2、未诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-Y全菌蛋白液体，3、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-Y全菌蛋白液体，4、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-Y含蛋白上清液，5、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-Y含蛋白沉淀，6、未诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-W全菌蛋白液体，7、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-W全菌蛋白液体，8、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-W含蛋白上清液，9、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-W含蛋白沉淀，10、未诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-pmε-W全菌蛋白液体，11、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-pmε-W全菌蛋白液体，12、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-pmε-W含蛋白上清液，13、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-pmε-W含蛋白沉淀。
图2为Western-blot图谱。
图中M是Marker，1、诱导表达的受体菌全菌蛋白液体，2、未诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-Y全菌蛋白液体，3、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-Y全菌蛋白液体，4、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-Y含蛋白上清液，5、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-Y含蛋白沉淀，6、未诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-W全菌蛋白液体，7、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-W全菌蛋白液体，8、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-W含蛋白上清液，9、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-W含蛋白沉淀，10、未诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-pmε-W全菌蛋白液体，11、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-pmε-W全菌蛋白液体，12、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-pmε-W含蛋白上清液，13、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-pmε-W含蛋白沉淀。
图3为重组蛋白ε-his的AKTA纯化鉴定。箭头所指的为纯化的目的蛋白峰。
图4为重组蛋白ε-his的分子筛纯化鉴定。箭头所指的为纯化的目的蛋白峰。
图5为纯化的目的蛋白的SDS-PAGE电泳图谱。箭头示目的条带。
其中M是Marker，从上到下分别为从上到下分别为130kD、95kD、70kD、62kD、51kD、40kD、29kD；1是诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-Y全菌蛋白液体；2是诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-Y含蛋白上清液；3是分子筛纯化的ε-his蛋白；4是诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-Y含蛋白沉淀；5是是未诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-α-Y全菌蛋白液体。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
pET30a(+)为Novagen公司产品。pET28a(+)为Novagen公司产品。
A型产气荚膜梭菌强毒株C57-10、B型产气荚膜梭菌强毒株C58-5、C型产气荚膜梭菌强毒株C59-4、D型产气荚膜梭菌强毒株C60-11均为中国兽医药品监察所产品。
实施例1、可溶性表达ε-hisY
1、合成基因
本申请设计了3种重组ε基因，分别为SEQ ID No.1所示的ε-hisY基因、SEQ IDNo.3所示的ε-hisW基因、SEQ ID No.4所示的pmε-hisW基因。
ε-hisY基因和ε-hisW基因均编码SEQ ID No.2所示的蛋白质ε-his。pmε-hisW基因编码SEQ ID No.5所示的蛋白质pmε-hisW。ε-his是将pmε-hisW的第52-59位氨基酸残基缺失得到的蛋白质。
用化学合成的方法合成出SEQ ID No.1的第151-1113位所示的ε-Y基因(编码SEQ ID No.2的第51-370位氨基酸残基所示的蛋白质)，SEQ ID No.3的第151-1113位所示的ε-W基因(编码SEQ ID No.2的第51-370位氨基酸残基所示的蛋白质)，SEQ ID No.4的第151-1137位所示pmε-W基因(编码SEQ ID No.5的第51-378位氨基酸残基所示的蛋白质pmε-W)。
2、重组表达载体和重组菌的构建
以ε-Y基因作为模板，利用上游引物F1(序列为’-ggatccatggcgattgcgagcgcggttattag-3’)和下游引物R1(序列为5’-CTCGAGTCATTTGATGCCCGGTGCTTTGA-3’)进行PCR扩增，在ε-Y基因的两端加上BamHI位点(带下划线的序列)和XhoI识别位点(带下划线的序列)，得到SEQ ID No.1的第145-1119位所示的ε-Y基因PCR产物。
以ε-W基因作为模板，利用上游引物F1和下游引物R2(序列为5’-CTCGAGTCATTTGATACCCGGCGCTTTGA-3’)进行PCR扩增，在ε-W基因的两端加上BamHI和XhoI识别位点，得到SEQ ID No.3的第145-1119位所示的ε-W基因PCR产物。
以pmε-W基因作为模板，利用上游引物F3(序列为5’-ggatccatgaaaaagaacctggtcaaaagcct-3’)和下游引物R2进行PCR扩增，在pmε-W基因的两端加上BamHI和XhoI识别位点，得到SEQ ID No.4的第145-1143位所示的pmε-W基因PCR产物。
将上述ε-Y基因PCR产物用BamHI和XhoI酶切，回收目的片段(ε-Y基因)；同时用BamHI和XhoI酶切载体pET30a(+)，回收载体大片段；将回收的目的片段与回收的载体大片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。将其均匀涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒用BamHI和XhoI进行双酶切鉴定，将酶切验证正确的质粒进行测序，将测序结果表明是用SEQ ID No.1的第151-1113位所示的ε-Y基因替换pET30a(+)的BamHI和XhoI识别位点间的片段，保持pET30(+)的其它序列不变得到的重组表达载体，命名为pET30a-ε-Y。pET30a-ε-Y含有带His标签的ε-hisY基因，ε-hisY基因的核苷酸序列是SEQ ID No.1，编码SEQ ID No.2所示的蛋白质ε-his。将含有pET30a-ε-Y的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET30a-ε-Y。
将上述ε-W基因PCR产物用BamHI和XhoI酶切，回收目的片段(ε-W基因)；同时用BamHI和XhoI酶切载体pET30a(+)，回收载体大片段；将回收的目的片段与回收的载体大片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。将其均匀涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒用BamHI和XhoI进行双酶切鉴定，将酶切验证正确的质粒进行测序，将测序结果表明是用SEQ ID No.3的第151-1113位所示的ε-W基因替换pET30a(+)的BamHI和XhoI识别位点间的片段，保持pET30(+)的其它序列不变得到的重组表达载体，命名为pET30a-ε-W。pET30a-ε-W含有His标签融合蛋白ε-hisW基因，ε-hisW基因的核苷酸序列是SEQ ID No.3，编码SEQ ID No.2所示的蛋白质ε-his。将含有pET30a-ε-W的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET30a-ε-W。
将上述pmε-W基因PCR产物用BamHI和XhoI酶切，回收目的片段(pmε-W基因)；同时用BamHI和XhoI酶切载体pET30a(+)，回收载体大片段；将回收的目的片段与回收的载体大片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。将其均匀涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒用BamHI和XhoI进行双酶切鉴定，将酶切验证正确的质粒进行测序，将测序结果表明是用SEQ ID No.4的第151-1137位所示的pmε-W基因替换pET30a(+)的BamHI和XhoI识别位点间的片段，保持pET30(+)的其它序列不变得到的重组表达载体，命名为pET30a-pmε-W。pET30a-pmε-W含有带His标签的pmε-hisW基因，pmε-hisW基因的核苷酸序列是SEQ ID No.4，编码SEQ ID No.5所示的蛋白质pmε-hisW。将含有pET30a-pmε-W的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET30a-pmε-W。
3、蛋白表达形式的分析与鉴定
将BL21(DE3)/pET30a-ε-Y、BL21(DE3)/pET30a-ε-W、BL21(DE3)/pET30a-pmε-W和大肠杆菌BL21(DE3)(简称受体菌)这四个菌株分别单独接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基(在LB液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基)中，37℃，采用Thermo MaxQ6000型全温振荡器200rpm振荡培养至0D600值(以含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基为空白对照)达到0.6时，取出1mL菌液作为未诱导表达的菌液(对照)，其余液体中加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。上述四株菌的诱导表达均是用0.75mM的IPTG在16℃诱导13小时。
取诱导表达的菌液和未诱导表达的菌液用于蛋白表达形式分析。具体步骤为，取1mL菌液置于1.5mL离心管中，做好标记，4℃条件下8000rpm/min离心30min，弃掉上清液，收集菌体沉淀。加入1mL PBS重悬沉淀，8000rpm/min离心5min，弃掉上清液。向洗涤好的菌体沉淀中加入200μL PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液体。将全菌蛋白液体于4℃离心机中16000rpm/min离心30min，分别收集上清液(命名为含蛋白上清液)和沉淀(命名为含蛋白沉淀)，向含蛋白沉淀中加入50μL PBS重悬洗涤沉淀。向全菌蛋白液体、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中加入10μL 5×SDS-PAGE loading Buffer，充分混匀后，置沸水浴中煮沸5min，待样品冷却后，用掌式离心机瞬离。取6μL用于SDS-PAGE电泳分析，并且结合蛋白灰度分析软件初步分析蛋白含量。将电泳后的凝胶转印于NC膜，以抗His标签的羊抗鼠抗体为结合抗体DAB显色，进行Western-blot鉴定。将上述全菌蛋白液体和含蛋白上清液用0.22μm滤膜过滤后上样至预先用溶液1(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl，溶剂是水，pH8.0的溶液)平衡好的镍柱。将镍柱接入AKTA机器上，分别用10个柱体积的溶液1与10个柱体积的溶液2(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、50mM咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)清洗镍柱中的杂质蛋白，并在AKTA机器上监测蛋白峰。用溶液3(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)冲洗镍柱挂在镍柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出现目的蛋白峰的洗脱样品，将该样品称为镍柱纯化目的蛋白样品。
将镍柱纯化的目的蛋白样品用GE公司生产的Superdex200凝胶柱通过分子筛进一步纯化。流动相使用溶液1。通过分子筛纯化后可以除去样品中的含有的大量咪唑，收集洗脱峰，得到分子筛纯化的目的蛋白样品，使用NanoDrop2000超微量分光光度计(ND2000)对得到的分子筛纯化的目的蛋白样品中蛋白(即可溶性目的蛋白)的含量进行定量分析。并用NanoDrop2000超微量分光光度计(ND2000)测定全菌蛋白液体中的蛋白质含量，得到菌体总蛋白含量。将含蛋白沉淀用尿素溶解后，用NanoDrop2000超微量分光光度计(ND2000)测定含蛋白沉淀中的蛋白质的含量。结果表明诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-Y的全菌蛋白液体、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中均含有大小为41kD的目的蛋白ε-his，未诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-Y的全菌蛋白液体中不含有大小为41kD的目的蛋白ε-his；诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-Y的全菌蛋白液体中目的蛋白ε-his占菌体总蛋白(全菌总蛋白)的91％，诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-Y的含蛋白上清液中的目的蛋白ε-his占诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-Y的全菌蛋白液体中目的蛋白ε-his的99.4％，该99.4％的目的蛋白ε-his为可溶性蛋白；诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-Y的含蛋白沉淀中的目的蛋白ε-his占诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-Y的全菌蛋白液体中目的蛋白ε-his的0.6％，该0.6％的目的蛋白ε-his为不溶性包涵体蛋白；说明诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-Y的目的蛋白ε-his占菌体总蛋白的91％，BL21(DE3)/pET30a-ε-Y表达的目的蛋白ε-his中99.4％为可溶性蛋白，0.6％的目的蛋白ε-his为不溶性包涵体蛋白。诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-W的全菌蛋白液体、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中均含有大小为41kD的目的蛋白ε-his，未诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-W的全菌蛋白液体不含有大小为41kD的目的蛋白ε-his；诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-W的全菌蛋白液体中目的蛋白ε-his占菌体总蛋白的91％，诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-W的含蛋白上清液中的目的蛋白ε-his占诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-W的全菌蛋白液体中目的蛋白ε-his的0.5％，该0.5％的目的蛋白ε-his为可溶性蛋白；诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-W的含蛋白沉淀中的目的蛋白ε-his占诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-W的全菌蛋白液体中目的蛋白ε-his的99.5％，该99.5％的目的蛋白ε-his为不溶性包涵体蛋白；说明诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-W的目的蛋白ε-his占菌体总蛋白的91％，BL21(DE3)/pET30a-ε-W表达的目的蛋白ε-his中0.5％为可溶性蛋白，99.5％为不溶性包涵体蛋白。未诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-pmε-W的全菌蛋白液体、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-pmε-W的全菌蛋白液体、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中均不含有大小为43kD的目的蛋白pmε-his；说明BL21(DE3)/pET30a-pmε-W没有表达目的蛋白pmε-his。诱导表达的大肠杆菌BL21(DE3)的全菌蛋白液体不含有大小为41kD的目的蛋白ε-his；说明大肠杆菌BL21(DE3)没有表达目的蛋白ε-his。菌落形成单位(CFU)数量相同的诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-Y和诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-ε-W表达的菌体总蛋白质量相同(图1和图2)。
4、ε-his的纯化
将BL21(DE3)/pET30a-ε-Y接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基(在LB液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基)中，37℃，采用Thermo MaxQ6000型全温振荡器200rpm振荡培养至0D600值(以含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基为空白对照)达到0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。该诱导表达是用0.75mM的IPTG在16℃诱导13小时。
取IPTG诱导表达13h后的菌液收集菌体沉淀。加入PBS重悬沉淀，8000rpm/min离心5min，弃掉上清液。向洗涤好的菌体沉淀中加入PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，于4℃离心机中16000rpm/min离心30min，收集上清液(命名为含蛋白上清液)，弃沉淀。将含蛋白上清液用0.22μm滤膜过滤后上样至预先用溶液1(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl，溶剂是水，pH8.0的溶液)平衡好的镍柱。将镍柱接入AKTA机器上，分别用10个柱体积的溶液1与10个柱体积的溶液2(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、50mM咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)清洗镍柱中的杂质蛋白，并在AKTA机器上监测蛋白峰。用溶液3(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)冲洗镍柱挂在镍柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出现目的蛋白峰的洗脱样品，将该样品称为镍柱纯化的ε-his(图3)。
将镍柱纯化的ε-his用GE公司生产的Superdex200凝胶柱通过分子筛进一步纯化。流动相使用溶液1。通过分子筛纯化后可以除去样品中的含有的大量咪唑，收集洗脱峰，得到分子筛纯化的ε-his蛋白(分子筛纯化目的蛋白样品)(图5)，使用NanoDrop2000超微量分光光度计(ND2000)对得到的蛋白的纯度进行定量分析。
将纯化的ε-his进行质谱分析其氨基酸序列，结果表明ε-his的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
将BL21(DE3)/pET30a-ε-Y、BL21(DE3)/pET30a-pmε-W和大肠杆菌BL21(DE3)(简称受体菌)这三个菌株分别单独接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基(在LB液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基)中，37℃，采用Thermo MaxQ6000型全温振荡器200rpm振荡培养至0D600值(以含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基为空白对照)达到0.6时，取出1mL菌液作为未诱导表达的菌液(对照)，其余液体中加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。上述三株菌的诱导表达均是用0.75mM的IPTG在16℃诱导13小时。
取诱导表达的菌液和未诱导表达的菌液用于蛋白表达形式分析。具体步骤为，取1mL菌液置于1.5mL离心管中，做好标记，4℃条件下8000rpm/min离心30min，弃掉上清液，收集菌体沉淀。加入1mL PBS重悬沉淀，8000rpm/min离心5min，弃掉上清液。向洗涤好的菌体沉淀中加入200μL PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液体。将全菌蛋白液体于4℃离心机中16000rpm/min离心30min，分别收集上清液(命名为含蛋白上清液)和沉淀(命名为含蛋白沉淀)，向含蛋白沉淀中加入50μL PBS重悬洗涤沉淀。向全菌蛋白液体、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中加入10μL 5×SDS-PAGE loading Buffer，充分混匀后，置沸水浴中煮沸5min，待样品冷却后，用掌式离心机瞬离。取6μL用于SDS-PAGE电泳分析。结果表明BL21(DE3)/pET30a-ε-Y表达的目的蛋白ε-his以可溶性的形式存在于细菌破碎菌体的上清液中，可溶性蛋白目的条带表达明显，上清液中杂质较少。通过对AKTA机器纯化洗脱条件的优化，可以得到纯度更好的可溶性目的蛋白条带。进一步通过分子筛的纯化后，可以除去蛋白样品中的含有的大量咪唑(图4)。通过分子筛的纯化后的可溶性蛋白可以作为诊断抗原、制备成单克隆抗体或进一步对蛋白功能与构象关系进行研究。
另外，按照上述方法，将pET28a(+)的限制性内切酶NheI和NotI位点之间的序列替换为SEQ ID No.1第151-1113位所示的ε-Y基因，保持pET28a(+)的其它序列不变，得到含有ε-Y基因的重组表达载体，将该重组表达载体命名为pET28a-ε-Y。将pET28a-ε-Y转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将得到的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET28a-ε-Y。将BL21(DE3)/pET28apET28a-ε-Y接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基(在LB液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基)中，37℃，采用Thermo MaxQ6000型全温振荡器200rpm振荡培养至0D600值(以含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基为空白对照)达到0.6时，取出1mL菌液作为未诱导表达的菌液(对照)，其余液体中加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。该诱导表达是用0.75mM的IPTG在16℃诱导13小时。取诱导表达的菌液和未诱导表达的菌液按照上述方法进行蛋白表达形式分析。结果表明，未诱导表达的BL21(DE3)/pET28a-ε-Y全菌蛋白液体、诱导表达的BL21(DE3)/pET28a-ε-Y全菌蛋白液体、诱导表达的BL21(DE3)/pET28a-ε-Y含蛋白上清液和诱导表达的BL21(DE3)/pET28a-ε-Y含蛋白沉淀中均没有目的蛋白的表达。可见，虽然采用同一种外源目的基因(ε-Y基因)，在不同的BL21(DE3)表达载体-pET28a(+)和pET30a(+)中，外源目的基因的表达情况相差很大，将ε-Y基因通过pET30a(+)导入大肠杆菌BL21(DE3)可获得ε-Y基因的高效可溶性表达，将ε-Y基因通过pET28a(+)导入大肠杆菌BL21(DE3)中，ε-Y基因却没有表达。
实施例2、ε-his的动物免疫保护性试验
1、抗产气荚膜梭菌疫苗的制备
将实施例1中分子筛纯化的ε-his蛋白用无菌PBS溶解，得到ε-his浓度为1000μg/mL的ε-his溶液，用于免疫。将ε-his溶液与弗氏佐剂按1:1等体积混合，乳化制备油乳剂疫苗，将其命名为首免疫苗。将ε-his溶液与不完全弗氏佐剂按1:1等体积混合，乳化制备油乳剂疫苗，将其命名为二免疫苗。
取出从中国兽医药品监察所购买到的B型产气荚膜梭菌强毒株C58-5和D型产气荚膜梭菌强毒株C60-11。在超净工作台中，用75％酒精棉球仔细擦拭保存菌种的安瓿瓶外壁，然后用砂轮在安瓶的上三分之一处做一划痕，再用干燥的无菌纱布包裹安瓶将其掰开。吸取400μL厌氧肉肝汤液体培养基反复吹打安瓶中的菌种，使冻干菌种溶解菌悬液。按照1：100的比例将菌悬液接种到含有牛肉膏的厌氧肉肝汤的试管中，并在试管上层加盖1-2cm的液体石蜡隔绝空气。将接好菌的试管放入厌氧培养箱，置37℃恒温培养箱中，培养16-24h后，观察细菌的生长情况。复苏后的菌种经过涂片、染色、镜检，确认无误后传1-2代后使用，并将一部分菌种用30％的甘油盐水-80℃冰箱保存。
2、B型产气荚膜梭菌攻毒试验
按照如下方法测试ε-his对B型产气荚膜梭菌强毒株C58-5的抗性试验：
将30只体重在18-22g的雌性昆明小鼠，随机分成2组(攻毒剂量组20只，并设10只小鼠的PBS对照组)。攻毒剂量组，首次免疫、第二次免疫与第三次免疫均采用皮下注射的方法进行免疫，首次免疫用首免疫苗，第二次免疫与第三次免疫用二免疫苗，每次免疫剂量均为0.2mL/只(ε-his免疫剂量为100μg/只)；PBS对照组中的每只小鼠首次免疫、第二次免疫与第三次免疫，皮下注射0.2mL PBS。首次免疫之前，先对小鼠进行一次割尾采血，分离血清，用作阴性对照血清。首次免疫后，间隔14d进行第二次免疫，二免后14d进行第三次免疫。第三次免疫两周后每只攻毒剂量组小鼠和每只PBS对照组小鼠腹腔注射2×109cfu的B型产气荚膜梭菌强毒株C58-5进行攻毒试验。自一免后开始，每组小鼠每周采血一次，每组采5只，分离血清，于-80℃冰箱保存，用于检测抗体。采用间接ELISA检测免疫动物抗体水平，具体方法如下：
1)包被：将实施例1中分子筛纯化的ε-his用0.05mol/L pH 9.0的碳酸盐包被缓冲液进行稀释，然后按100μL/孔逐一加入ELISA板中，将加好的ELISA板置4℃冰箱中过夜；
2)洗涤：从4℃冰箱中取出ELISA板，弃去板孔内的液体，并在滤纸上拍干，向每孔加入200μL PBST置于洗板机中进行洗版，重复4次。
3)封闭：向ELISA板的每个孔中加入100μL含有5％脱脂乳的PBST溶液，放入37℃温箱孵育1h；
4)洗涤：向每孔加入200μL PBST置于洗板机中进行洗版，重复4次；
5)加待检血清：将待检血清按比例用灭菌PBS进行稀释，每孔加100μL，同时设阴性对照、阳性对照和空白对照孔，放入37℃温箱孵育1h；
6)洗涤：向每孔加入200μL PBST置于洗板机中进行洗版，重复4次；
7)酶标二抗结合：将HRP标记的羊抗鼠二抗用含有5％脱脂乳的PBS封闭缓冲液按1：20 000-1:40000浓度稀释后，分别向每孔加入100μL，放入37℃温箱孵育1h；
8)洗涤：向每孔加入200μL PBST置于洗板机中进行洗板，重复4次；
9)显色反应：将新鲜配制的TMB显色液按100μL/孔加入到ELISA板的各个孔中，放入37℃温箱避光显色15min；
10)终止反应：向按照50μL/孔加入2mol/L的浓H2SO4终止液，放入37℃温箱反应5min，终止显色；
11)读数：将终止显色的ELISA板放酶标仪中检测OD450的值。
12)判定检测结果：用确定好的阴阳性临界值来判定检测结果。阳性临界值＝阴性样本的OD450平均值+3S(S为标准方差)。待检血清的效价为待检血清的OD值≥阳性临界值时所对应的血清稀释度。
3、D型产气荚膜梭菌攻毒试验
除了将B型产气荚膜梭菌强毒株C58-5替换为D型产气荚膜梭菌强毒株C60-11，攻毒剂量调整为1.8×109cfu外，其它操作完全相同。
攻毒剂量组和PBS对照组实验小鼠在三免二周后，分别使用各型产气荚膜梭菌1MLD 100的剂量对小鼠进行攻毒，并于一周内观察和记录小鼠发病死亡情况。攻毒结果表明，攻毒剂量组(免疫ε-his)对各型产气荚膜梭菌的攻击均具有一定的免疫保护效果。ε-his在抵抗A型产气荚膜梭菌攻击时的免疫保护率为90％(18只存活，2只死亡)，PBS对照组小鼠全部死亡；ε-his在抵抗B型产气荚膜梭菌攻击时的免疫保护率为95％(19只存活，1只死亡)，PBS对照组小鼠全部死亡；ε-his在抵抗C型产气荚膜梭菌攻击时的免疫保护率为80％(16只存活，4只死亡)，PBS对照组小鼠全部死亡；ε-his在抵抗D型产气荚膜梭菌攻击时的免疫保护率为95％(19只存活，1只死亡)，PBS对照组小鼠全部死亡。将纯化后的ε-his作为诊断抗原包被酶标板检测检测小鼠免疫抗原或者攻毒后的血清抗体，发现ε-his作为诊断抗原建立的检测方法均具有非常好的灵敏性与特异性。分别检测各实验组中小鼠初免后0-6周的血清中抗体效价水平，结果表明ε-his融合毒素蛋白免疫组抗体效价有明显升高，在二免后抗体效价快速上升，三免后7-14天抗体效价达到峰值，最高抗体效价达1：128000。
实施例3、ε-his诱导表达条件的优化
1、诱导温度和时间的优化
将BL21(DE3)/pET30a-ε-Y接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基(在LB液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基)中，37℃，采用Thermo MaxQ6000型全温振荡器200rpm振荡培养至0D600值(以含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基为空白对照)达到0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)分别进行下述6种诱导表达。第一种诱导表达是用0.75mM的IPTG在37℃诱导1小时。第二种诱导表达是用0.75mM的IPTG在37℃诱导2小时。第三种诱导表达是用0.75mM的IPTG在37℃诱导4小时。第四种诱导表达是用0.75mM的IPTG在37℃诱导5小时。第五种诱导表达是用0.75mM的IPTG在16℃诱导13小时。第六种诱导表达是用0.75mM的IPTG在16℃诱导24小时。
取1mL诱导后的重组菌液置于1.5mL离心管中，做好标记，4℃条件下8000rpm/min离心30min，弃掉上清液，收集菌体沉淀。加入1mL PBS重悬沉淀，8000rpm/min离心5min，弃掉上清液。向洗涤好的菌体沉淀中加入200μL PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液体。向全菌蛋白液体中加入10μL 5×SDS-PAGE loading Buffer，充分混匀后，置沸水浴中煮沸5min，待样品冷却后，用掌式离心机瞬离。取6μL用于SDS-PAGE电泳分析。结果表明BL21(DE3)/pET30a-ε-Y在诱导温度为37℃，诱导时间在1-4h的条件下，ε-his蛋白表达量随时间延长逐渐上升，5h诱导条件下蛋白表达量有所下降。但是随着诱导温度的降低，ε-his表达量也有所增加,当诱导温度降低至16℃，时间为诱导13h时,ε-his表达量达到最高,目的蛋白ε-his占全菌总蛋白的91％。继续培养至24h,ε-his的表达量略有下降,因此,通过实验验证BL21(DE3)/pET30a-ε-Y的最佳诱导温度为16℃，诱导时间为13-24h。
2、IPTG浓度的优化
将BL21(DE3)/pET30a-ε-Y接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基(在LB液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基)中，37℃，采用Thermo MaxQ6000型全温振荡器200rpm振荡培养至0D600值(以含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基为空白对照)达到0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)分别进行下述6种诱导表达。第一种诱导表达是用0.1mM的IPTG在16℃诱导13小时。第二种诱导表达是用0.3mM的IPTG在16℃诱导13小时。第三种诱导表达是用0.5mM的IPTG在16℃诱导13小时。第四种诱导表达是用0.75mM的IPTG在16℃诱导13小时。第五种诱导表达是用1mM的IPTG在16℃诱导13小时。第六种诱导表达是用0mM的IPTG在16℃诱导13小时。
取1mL诱导后的重组菌液置于1.5mL离心管中，做好标记，4℃条件下8000rpm/min离心30min，弃掉上清液，收集菌体沉淀。加入1mL PBS重悬沉淀，8000rpm/min离心5min，弃掉上清液。向洗涤好的菌体沉淀中加入200μL PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液体。将全菌蛋白液体于4℃离心机中16000rpm/min离心30min，收集上清液(命名为含蛋白上清液)，向含蛋白上清液中加入10μL 5×SDS-PAGE loading Buffer，充分混匀后，置沸水浴中煮沸5min，待样品冷却后，用掌式离心机瞬离。取6μL用于SDS-PAGE电泳分析。结果表明ε-his在不同浓度的IPTG诱导下，表达量也有所不同。ε-his表达量与加入IPTG浓度在0.1-0.75mM之间呈递增关系。当IPTG诱导浓度为1mM时，蛋白表达量有所减少，这可能与IPTG本身的毒性有关。因此选择IPTG浓度0.75mM为最佳诱导浓度。
3、诱导时间的优化
将BL21(DE3)/pET30a-ε-Y接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基(在LB液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基)中，37℃，采用Thermo MaxQ6000型全温振荡器200rpm振荡培养至0D600值(以含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基为空白对照)达到0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)分别进行下述2种诱导表达。第一种诱导表达是用0.75mM的IPTG在16℃诱导13小时。第二种诱导表达是用0.75mM的IPTG在16℃诱导16小时。
取1mL诱导后的重组菌液置于1.5mL离心管中，做好标记，4℃条件下8000rpm/min离心30min，弃掉上清液，收集菌体沉淀。加入1mL PBS重悬沉淀，8000rpm/min离心5min，弃掉上清液。向洗涤好的菌体沉淀中加入200μL PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液体。
向全菌蛋白液体中加入10μL 5×SDS-PAGE loading Buffer，充分混匀后，置沸水浴中煮沸5min，待样品冷却后，用掌式离心机瞬离。取6μL用于SDS-PAGE电泳分析。
结果表明BL21(DE3)/pET30a-ε-Y在诱导温度为16℃，诱导时间在13h与16h的条件下，目的蛋白ε-his表达量变化不大，此时表达的蛋白几乎均为可溶性蛋白，沉淀中的不溶性包涵体蛋白几乎没有表达。当诱导温度为16℃，诱导时间在13h与16h的条件下表达的可溶性目的蛋白纯度较高，表达量接近。因此,通过实验验证，进一步确定了重组菌的最佳诱导温度为16℃，诱导时间为13-16h。

Claims (10)

1.制备重组ε蛋白的方法，包括使重组ε蛋白的编码基因在生物中进行表达得到所述重组ε蛋白的步骤；所述生物为微生物、植物或非人动物；
所述重组ε蛋白为a)或b)或c)或d)：
a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)由SEQ ID No.2第51-370位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；
d)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的可溶性蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述使重组ε蛋白的编码基因在生物中进行表达包括将所述重组ε蛋白的编码基因导入受体微生物，得到表达所述重组ε蛋白的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述重组ε蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述受体微生物为C1)-C4)中的任一种:
C1)原核微生物；
C2)革兰氏阴性细菌；
C3)埃希氏菌属细菌；
C4)大肠杆菌BL21(DE3)。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因为如下1)或2)或3)或4)所示的基因：
1)编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；
2)编码序列是SEQ ID No.1的第151-1113位所示的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述重组ε蛋白。
5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：所述重组微生物为将pET30a-ε-Y导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的重组ε蛋白的重组微生物，所述重组微生物命名为BL21(DE3)/pET30a-ε-Y，所述pET30a-ε-Y为将载体pET30a(+)的BamHI和XhoI位点之间的序列替换为SEQ ID No.1第151-1113位所示的DNA片段得到的重组载体。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述表达为诱导表达。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述诱导表达是用0.75mM的IPTG在16℃诱导13-16小时或13-24小时或13小时或16小时。
8.下述任一种产品：
P1)重组ε蛋白，所述重组ε蛋白为a)或b)或c)或d)：
a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)由SEQ ID No.2第51-370位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；
d)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的可溶性蛋白质；
P2)与所述重组ε蛋白相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B16)中的任一种：
B1)编码所述重组ε蛋白的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
P3)预防动物产气荚膜梭菌感染的疫苗，其含有所述重组ε蛋白或所述生物材料。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于：所述重组ε蛋白按照权利要求1-7中任一所述的方法制备；
所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；
2)编码序列是SEQ ID No.1的第151-1113位所示的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
所述重组载体为权利要求5中所述pET30a-ε-Y；
所述重组微生物为E1)或E2)：
E1)所述重组微生物为将所述重组ε蛋白的编码基因导入受体微生物，得到表达所述重组ε蛋白的重组微生物，所述受体微生物为C1)-C4)中的任一种:
C1)原核微生物；
C2)革兰氏阴性细菌；
C3)埃希氏菌属细菌；
C4)大肠杆菌BL21(DE3)；
所述重组微生物为将权利要求5中所述BL21(DE3)/pET30a-ε-Y；
所述预防动物产气荚膜梭菌感染的疫苗的活性成分为所述重组ε蛋白或所述生物材料。
10.下述任一种应用：
Y1)权利要求8或9中所述重组ε蛋白在制备抗产气荚膜梭菌疫苗中的应用；
Y2)权利要求8或9中所述生物材料在制备抗产气荚膜梭菌疫苗中的应用；
Y3)权利要求1-7中任一所述的方法在制备抗产气荚膜梭菌疫苗中的应用；
Y4)权利要求8或9中所述重组ε蛋白在制备产气荚膜梭菌病诊断抗原中的应用；
Y5)权利要求8或9中所述重组ε蛋白在制备单克隆抗体中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENBANK: "epsilon-toxin precursor, partial [Clostridium perfringens D]", 《GENBANK》 *
孙金良 等: "D型产气荚膜梭菌ε毒素重组蛋白的表达与纯化", 《河北师范大学学报（自然科学版）》 *

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