CN116813718B - 一种重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体及其表达体系和应用 - Google Patents
一种重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体及其表达体系和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116813718B CN116813718B CN202311099459.7A CN202311099459A CN116813718B CN 116813718 B CN116813718 B CN 116813718B CN 202311099459 A CN202311099459 A CN 202311099459A CN 116813718 B CN116813718 B CN 116813718B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- recombinant
- porcine circovirus
- cap protein
- vector
- protein trimer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000013639 protein trimer Substances 0.000 title claims abstract description 50
- 241001673669 Porcine circovirus 2 Species 0.000 title claims abstract description 28
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 27
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 40
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 abstract description 19
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 14
- 241000202347 Porcine circovirus Species 0.000 abstract description 8
- 241000282887 Suidae Species 0.000 abstract description 8
- 101100382437 Porcine circovirus 2 Cap gene Proteins 0.000 abstract description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 6
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 abstract description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001018 virulence Effects 0.000 abstract description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 abstract description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 30
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 28
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 24
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 24
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 17
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 17
- IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=CC=C1OCCO IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 229920004929 Triton X-114 Polymers 0.000 description 16
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 13
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 10
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 7
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 7
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 6
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 5
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 5
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 4
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 4
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 241001533399 Circoviridae Species 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 235000021052 average daily weight gain Nutrition 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000000937 inactivator Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 239000011265 semifinished product Substances 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 description 1
- 206010033546 Pallor Diseases 0.000 description 1
- 208000005342 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000702619 Porcine parvovirus Species 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 210000001099 axilla Anatomy 0.000 description 1
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001217 buttock Anatomy 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012297 crystallization seed Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 235000021051 daily weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 208000010643 digestive system disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011013 endotoxin removal Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000013115 immunohistochemical detection Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000007923 nasal drop Substances 0.000 description 1
- 229940100662 nasal drops Drugs 0.000 description 1
- 230000002956 necrotizing effect Effects 0.000 description 1
- 201000008383 nephritis Diseases 0.000 description 1
- 238000011369 optimal treatment Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000011197 physicochemical method Methods 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明提供了一种重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体及其表达体系和应用，属于猪圆环病毒防治技术领域。本发明提供了一种氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体，克服了现有技术中猪圆环病毒的疫苗免疫原性差、应用有风险等问题。本发明提供的蛋白三聚体免疫原性好，能够有效保护猪免受野毒的攻击，在制备动物疫苗中具有良好前景。采用大肠杆菌表达系统生产，得到的重组蛋白用于制备疫苗不含病原感染性物质，能够避免活病毒疫苗毒力返强、灭活疫苗灭活不完全等的潜在风险。特定的表达系统可高效规模化生产Cap蛋白三聚体疫苗，具备成本低、产量高的优势。
Description
技术领域
本发明涉及猪圆环病毒防治技术领域，尤其涉及一种重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体及其表达体系和应用。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine Circovirus，PCV)是圆环病毒科(Circoviridae)、动物圆环病毒属的成员。该病毒是已知能自行复制的最小的哺乳动物病毒。PCV可以分为PCV1和PCV2两种血清型，PCV2是断奶后仔猪多系统衰弱综合征的主要病因，临床上主要表现为皮肤苍白、发热、进行性消瘦，伴随呼吸与消化系统失调。感染猪群中发病率约60％以上，死淘率达80％。此外，猪皮炎与肾炎综合征、增生性坏死性肺炎、猪呼吸道综合征、繁殖障碍、先日性颤抖、胎儿心肌炎及肠炎等疾病也与PCV2感染有关。PCV2感染可导致机体免疫系统功能严重受损，形成免疫抑制，增强对其它多种病原体的易感性，引起在正常情况下具有较低致病性的病原体感染发病，使猪群发生难以控制的复发性疾病和多重感染。现有研究已证明，PCV2和猪繁殖与呼吸综合症、猪瘟、猪细小病毒等混合感染对猪群危害极大。
疫苗免疫是防制该病的有效手段，主要有嵌合活病毒疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗（杆状病毒表达系统、大肠杆菌表达系统）等类型。例如现有技术公开了多种嵌合活病毒疫苗：中国专利CN106834242A公开的嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1-233株及其构建方法；再如CN109195623A公开了一种嵌合型猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗。但是现有的嵌合活病毒疫苗存在疫苗毒力返强的风险，且致弱毒株毒力评价较为困难，生产过程复杂、成本高。
PCV2灭活疫苗是将病毒通过细胞培养扩增后，再通过理化方法处理使其丧失感染性，加入适宜的佐剂制备而成。灭活疫苗存在病毒难培养、培养周期长、生产成本高、研发周期长等缺陷。
亚单位疫苗不含病原感染性物质，其能够避免活病毒疫苗毒力返强、灭活疫苗灭活不完全等的潜在风险。目前商品化的猪圆环病毒亚单位疫苗大多由杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达，但该表达系统生产效率低、成本高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体，能够解决现有技术中猪圆环病毒的疫苗存在免疫原性差、应用有风险等问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体，所述重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了编码上述重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种表达重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体的重组载体，所述重组载体包括初始载体和上述编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体的基因。
优选的，所述初始载体为pGEX载体、pET系列载体或pMAL载体。
优选的，所述初始载体为pET30a载体。
本发明还提供了一种表达重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体的重组载体，所述重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种包含上述重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体的编码基因的重组菌株。
优选的，所述重组菌株通过IPTG进行诱导表达。
优选的，所述IPTG的浓度为0.3~0.9mmol/L；
所述诱导表达的温度为35~38℃；
所述诱导表达的时间为4~6h。
本发明还提供了上述重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体、重组载体、重组菌株在制备动物疫苗中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体，该蛋白三聚体免疫原性好，能够有效保护猪免受野毒的攻击，在制备动物疫苗中具有良好前景。
本发明所述的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体采用大肠杆菌表达系统生产，用于制备疫苗不含病原感染性物质，能够避免活病毒疫苗毒力返强、灭活疫苗灭活不完全等的潜在风险。特定的表达系统可高效规模化生产Cap蛋白三聚体疫苗，具备成本低、产量高的优势。
附图说明
图1为菌液PCR鉴定结果图，其中1-10：菌液PCR的样品编号，M：为Marker，从下向上对应的条带大小分别为：300、500、800、1000、1500、2000、3000、5000bp。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将Cap蛋白核苷酸+GS Linker核苷酸+T4 Foldon核苷酸组成一条序列并进行密码子优化，优化后序列如SEQ ID NO.2所示：ATGACCTATCCGCGTCGCCGTTTTCGTCGTCGTCGTCACCGTCCTCGTAGCCAGCTGGGTCAGATTCTGCGTCGTCGTCCGTGGCTGGTTCATCCGCGTCATCGTTATCGTTGGCGTCGTAAAAATGGTATTTTCAATGCACGTCTGAGCCGTACCTTTGGTTATACCGTTAAAGCAACCACCGTGAGCACACCGAGCTGGAGCGTTGATATGCTGCGTTTTAACCTGGATGATTTTGTGCCGCCTGGTGGCGGTACAAATAAAATCTCAATCCCGTTTGAATATTATCGTATTCGCAAAGTGAAAGTTGAATTTTGGCCGTGTAGCCCGATTACCCAGGGTGATCGTGGTGTTGGTAGCAGTGCAATTATTCTGGACGATAATTTTGTTATGAAAGTTCCGGCACAGACCTATGATCCGTATGTGAACTATAGCAGTCGTCATACCATCCCGCAACCGTTTAGCTATCATAGCCGTTATTTTACCCCGAAACCGGTTCTGGATAGCACCATTGATTACTTCCAGCCGAATAACAAACGTAATCAGCTGTGGATGCGTCTGCAGACCAGCCGAAATGTTGATCATGTTGGTCTGGGCACCGCATTTGAAAATAGCAAGTATGATCAGGATTATAATATTCGTGTTACCATGTATGTTCAGTTTCGTGAATTTAATCTGAAAGATCCTCCGCTGAAACCGGGTAGTGGTAGCGGCAGCGGTGGTTATATTCCGGAAGCCCCTCGCGATGGTCAGGCATATGTTCGTAAAGATGGTGAATGGGTTCTGCTGAGCACCTTTCTGTAA，在上述编码基因前后引入BamHI酶切位点，发送基因合成公司合成。
将合成后的序列（目标序列）和pET30a载体分别通过BamHI酶切，将酶切后产物进行电泳、切胶回收，将上述回收产物进行连接，连接体系如下：
5×T4 DNA Ligase Buffe：2μL；
T4 DNA Ligase：0.5μL；
pET30a载体：0.5μL（约100ng）；
目标序列：400ng；
总体积：10μL；
连接后的重组载体序列为：tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaattaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggggccgccatgccggcgataatggcctgcttctcgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggcacctgtcctacgagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatgtccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatcgatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatcgGATCCATGACCTATCCGCGTCGCCGTTTTCGTCGTCGTCGTCACCGTCCTCGTAGCCAGCTGGGTCAGATTCTGCGTCGTCGTCCGTGGCTGGTTCATCCGCGTCATCGTTATCGTTGGCGTCGTAAAAATGGTATTTTCAATGCACGTCTGAGCCGTACCTTTGGTTATACCGTTAAAGCAACCACCGTGAGCACACCGAGCTGGAGCGTTGATATGCTGCGTTTTAACCTGGATGATTTTGTGCCGCCTGGTGGCGGTACAAATAAAATCTCAATCCCGTTTGAATATTATCGTATTCGCAAAGTGAAAGTTGAATTTTGGCCGTGTAGCCCGATTACCCAGGGTGATCGTGGTGTTGGTAGCAGTGCAATTATTCTGGACGATAATTTTGTTATGAAAGTTCCGGCACAGACCTATGATCCGTATGTGAACTATAGCAGTCGTCATACCATCCCGCAACCGTTTAGCTATCATAGCCGTTATTTTACCCCGAAACCGGTTCTGGATAGCACCATTGATTACTTCCAGCCGAATAACAAACGTAATCAGCTGTGGATGCGTCTGCAGACCAGCCGAAATGTTGATCATGTTGGTCTGGGCACCGCATTTGAAAATAGCAAGTATGATCAGGATTATAATATTCGTGTTACCATGTATGTTCAGTTTCGTGAATTTAATCTGAAAGATCCTCCGCTGAAACCGGGTAGTGGTAGCGGCAGCGGTGGTTATATTCCGGAAGCCCCTCGCGATGGTCAGGCATATGTTCGTAAAGATGGTGAATGGGTTCTGCTGAGCACCTTTCTGTAAGgatccgaattcgagctccgtcgacaagcttgcggccgcactcgagcaccaccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggat，如SEQ ID NO.3所示。
从-80℃冰箱取出冻存的E.coli.BL21（购自北京索莱宝科技有限公司）感受态细胞，置冰上融化（5min）；取出EP管，每管加入50µL感受态细胞，再加入连接产物5µL，轻弹使之混匀。于冰水浴中静置30 min（同时将液体LB培养基放于37 ℃，打开水浴42℃）；42 ℃热激45 s（TransT1热激30s）；迅速冰浴2 min；每管加入500 µL预热的LB培养基，混匀，37 ℃（200 rpm）摇菌45min（同时将LB平板放于37 ℃培养箱中）；3500 rpm离心3 min，吸掉上清400µL，留取下部液体100µL；将此液体涂布在含有0.1%卡那霉素的LB平板上，37 ℃放置1h至液体被吸收，然后倒置平板；37℃培养14h。
取若干个灭菌EP管，每管加入600µL 含有0.1%卡那霉素的LB培养基，用小白枪头挑取单个菌落，将枪头在培养基中吹吸几次，打入EP管中，37℃，300rpm，摇菌4-6h(直到培养基变得不透亮)，进行菌液PCR鉴定，结果如图1所示。由图1可知，成功扩增出目的条带（大小为661bp），说明成功构建了重组大肠杆菌，菌液鉴定PCR体系如下：
ddH2O：3 μL
Primer-F(20μM/μL)：0.5μL
Primer-R(20μM/μL)：0.5 μL
菌液模板：1μL
2xPCR TaqMix：5 μL
总体积：10 μL
其中，Primer-F的序列为：GTTATCGTTGGCGTCGTA，如SEQ ID NO.4所示；
Primer-R序列为：CGAACATATGCCTGACCAT，如SEQ ID NO.5所示。
将重组大肠杆菌接种于含有0.1%卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，加入冻干保护剂后冻干，作为种子批。
将菌种接种于含有0.1%卡那霉素的LB液体培养基中，36.5℃培养，当OD600达到0.6~0.8时，加入IPTG溶液使其终浓度达到0.6mmol/L，诱导表达5h，收获离心收集菌体。
按每克菌体湿重加10mL灭菌生理盐水进行菌体重悬，高压均质机破菌（破菌时温度控制在15℃以下）。在显微镜下检查破菌液，待99%以上菌体破碎后停止破菌。破碎后的菌液8000r/min离心18min，收集上清液。
向上清液中加入终浓度为1%的Triton X-114，充分混匀。将蛋白液于4℃冷库中放置7h，每隔2.5h摇匀一次，30℃水浴放置40min，12000r/min离心30min，收集水相，再次加入TritonX-114，以同样方法重复操作3次，得到去除内毒素的蛋白溶液，加入硫酸铵至50%的饱和度，充分混匀后，2~8℃静置15h，以12000r/min离心20min后，收集沉淀，称重后按每克沉淀加20mL灭菌生理盐水进行重悬，向重悬液中加入硫酸铵至20%饱和度，充分混匀后4℃静置4h，以12000r/min 离心20min，收集上清。向上清液中加入硫酸铵至50%饱和度，充分混匀后，4℃静置15h，以12000r/min 离心20min后，收集沉淀，称重后按每克沉淀加10mL灭菌生理盐水进行复溶，得到复溶液，按体积加入终浓度0.1%甲醛溶液，4℃灭活72h，即获得纯化后的Cap蛋白三聚体，所述Cap蛋白三聚体的氨基酸序列为：
MTYPRRRFRRRRHRPRSQLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNARLSRTFGYTVKATTVSTPSWSVDMLRFNLDDFVPPGGGTNKISIPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSSAIILDDNFVMKVPAQTYDPYVNYSSRHTIPQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWMRLQTSRNVDHVGLGTAFENSKYDQDYNIRVTMYVQFREFNLKDPPLKPGSGSGSGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL，如SEQ ID NO.1所示。
实施例2
获得纯化后的Cap蛋白三聚体经以下步骤制备为成品疫苗：
1）半成品配制：用灭菌生理盐水补足体积，然后按照抗原与201佐剂1:1添加201佐剂，将201佐剂缓慢加入乳化罐中预热至30℃，将预热的混合抗原液缓慢加入到乳化罐中，设置温度30℃，150r/min，继续搅拌1h，冷却至室温静置2h；
2）半成品检验：检测内毒素、Cap蛋白三聚体琼扩效价、蛋白浓度测定、无菌检验等；
3）分装、轧盖、贴标签、包装、入库；
4）成品检验：检测内毒素、Cap蛋白三聚体琼扩效价、蛋白浓度测定、无菌检测等，检测合格获得Cap蛋白三聚体疫苗。
实验例1 不同诱导温度对Cap蛋白三聚体表达的影响
取胰蛋白胨10g（购自北京索莱宝科技有限公司）、酵母浸粉5g（购自北京索莱宝科技有限公司）、氯化钠10g（购自北京索莱宝科技有限公司），溶解于900mL无离子水中，定容至1000mL，115℃高压灭菌20min，待温度降至50℃左右加入终浓度为0.1%卡那霉素（购自北京索莱宝科技有限公司），2～8℃保存备用。将二级生产种子按照4%的比例接种于2瓶LB液体培养基中，37℃ 150rpm培养至菌体浓度OD600值为0.6~0.8。加入终浓度为0.6mmol/L的IPTG（购自北京索莱宝科技有限公司），分别以16℃诱导过夜和37℃诱导4h。将收获的菌体破碎离心取上清，检测Cap蛋白三聚体琼扩效价，结果如表1所示：
表1 不同诱导温度对Cap蛋白三聚体表达的影响
结果显示，37℃诱导表达的Cap蛋白三聚体琼扩效价高于16℃，因此选择37℃为最适诱导温度。
实验例2 不同诱导剂浓度对Cap蛋白三聚体表达的影响
将二级生产种子按照4%的比例接种于4瓶LB液体培养基中，37℃ 150rpm培养至菌体浓度OD600值为0.6~0.8。分别以终浓度为0.1、0.3、0.6和1.2mmol/L的IPTG（购自北京索莱宝科技有限公司），37℃诱导4h。并将取得的菌体破碎离心取上清，检测Cap蛋白三聚体琼扩效价，结果如表2所示：
表2 不同诱导剂浓度对Cap蛋白三聚体表达的影响
结果表明，当诱导剂IPTG的浓度为0.6mmol/L时，Cap蛋白三聚体的表达量最高，因此选用IPTG诱导终浓度为0.6mmol/L。
实验例3 不同诱导时间对Cap蛋白三聚体表达的影响
将二级生产种子按照4%的比例接种于1 LB液体培养基中，37℃ 150rpm培养至菌体浓度OD600值为0.6~0.8。加入终浓度为0.6mmol/L的IPTG，加入诱导剂后2、4、6、8h分别取菌液20mL，将取得的菌体破碎离心取上清，检测Cap蛋白三聚体琼扩效价，结果如表3所示：
表3 不同诱导时间对Cap蛋白三聚体表达的影响
结果表明，当诱导时间为4h和6h，Cap蛋白三聚体的表达量达到最高，因此选择诱导4~6h，确保蛋白的高效表达。
实验例4 不同破菌方式对蛋白液制备的影响
采用两种方式进行菌体破裂，分别为超声破碎和高压均质机破碎。称取同一批次的菌泥采，用10倍（W/V）体积的灭菌生理盐水重悬，采用两种方式进行破菌。收集上清液，琼扩试验检测蛋白效价。
通过琼扩试验检测两种不同破菌方式下制备的Cap蛋白三聚体效价，结果如表4所示：
表4 不同破菌方式对蛋白液制备的影响
研究表明两种方式制备的蛋白效价无明显差别，均在1:64之上。
实验例5 不同硫酸铵浓度的影响
下述不同饱和度的硫酸铵，均是根据硫酸铵饱和度计算表（25℃），添加硫酸铵粉末（购自北京索莱宝科技有限公司）以达到要求的饱和度。
去除内毒素后的蛋白质沉淀，称重后按每克沉淀加20mL灭菌生理盐水进行重悬，将重悬液分为3组，加入硫酸铵调整溶解浓度分别为10%、20%、30%饱和度。充分混匀后4℃静置4h，以12000r/min 离心20min，收集上清。向上清液中加入硫酸铵至不同的沉淀浓度（沉淀浓度分别见表5、表6和表7），充分混匀后，4℃静置15h，以12000r/min 离心20min后，收集沉淀，称重后按每克沉淀加10mL灭菌生理盐水进行复溶，得到复溶液，测定复溶液中目的蛋白的琼扩效价和蛋白质浓度，以评估纯化效果。
10%硫酸铵饱和度试验组蛋白纯化
设置溶解浓度为10%硫酸铵饱和度，然后分为5组，根据硫酸铵饱和度计算表（25℃）分别调整沉淀浓度为30%、40%、50%、60%、70%硫酸铵饱和度。检测复溶液中目的蛋白的琼扩效价和蛋白质浓度，结果如下表5所示，其中3~5号样品蛋白浓度明显高于1和2号，琼扩效价3~5号均为1:64，2号效价为1:16，1号效价为1:8。因此综合分析3号样品纯化效果较好，琼扩效价高，蛋白质浓度较低。
表5 10%硫酸铵饱和度试验组蛋白纯化结果
20%硫酸铵饱和度试验组蛋白纯化
设置溶解浓度为20%硫酸铵饱和度，然后分为4组，根据硫酸铵饱和度计算表（25℃）分别调整沉淀浓度为40%、50%、60%、70%硫酸铵饱和度。检测复溶液中目的蛋白的琼扩效价和蛋白质浓度，结果如下表6所示，其中8~9号样品蛋白浓度明显高于6和7号，琼扩效价7~9号均为1:64，6号效价为1:32。因此综合分析7号样品纯化效果较好，琼扩效价高，蛋白质浓度较低。
表6 20%硫酸铵饱和度试验组蛋白纯化结果
30%硫酸铵饱和度试验组蛋白纯化结果
设置溶解浓度为30%硫酸铵饱和度，然后分为3组，根据硫酸铵饱和度计算表（25℃）分别调整沉淀浓度为50%、60%、70%硫酸铵饱和度。检测复溶液中目的蛋白的琼扩效价和蛋白质浓，结果如下表7所示，其中11~12号样品蛋白浓度高于10号，但琼扩效价均为1:48。因此10号样品纯化效果较好，蛋白质浓度较低。
表7 30%硫酸铵饱和度试验组蛋白纯化结果
综上所述，7号是最佳选择，溶解浓度为20%，沉淀浓度为50%，获得的目的蛋白琼扩效价高，蛋白质浓度较低。
实验例6 不同Triton X-114浓度的影响
试验分组将蛋白液分成三份，Triton X-114（购自北京索莱宝科技有限公司）工作浓度设置为0.5%、1%、2%三种浓度，进行试验，2~8℃放置6h，间隔2个h振摇一次，然后30℃水浴40min，12000rpm离心30min，收集上层水相。将每次离心后得到的水相取样，样品参照《中国药典》第3部（2010版）细菌内毒素检测法进行内毒素含量的检测，去除内毒素以后蛋白液使用琼扩方法检测Cap蛋白三聚体的琼扩效价，确定最适浓度。
通过使用不同浓度的Triton X-114处理，内毒素下降最高的为2%试验组，其次为1%试验组，下降程度最低的为0.5%试验组。处理完成后蛋白效价基本保持不变，结果如表8所示：
表8 Triton X-114液相萃取前后各项指标
结果显示，1%和2%浓度Triton X-114第一次处理效果明显高于0.5%浓度的TritonX-114。因此初步确定采用1%~2%终浓度作为Triton X-114的工作浓度。
实验例7 不同Triton X-114处理次数的影响
按照最适Triton X-114浓度加入待处理蛋白样中（1%和2%），2~8℃放置6h，间隔2个h振摇一次，然后30℃水浴40min，12000rpm离心30min，收集上层水相，所得水相再次加入Triton X-114，重复操作3次。将每次离心后得到的水相取样，样品参照《中国药典》第3部（2010版）细菌内毒素检测法进行内毒素含量的检测，去除内毒素以后蛋白液使用琼扩方法检测Cap蛋白三聚体的琼扩效价，确定最适处理次数。分别采用1%和2%的Triton X-114作为工作浓度连续处理三次，进行内毒素和蛋白效价测定，结果如表9所示：
表9 Triton X-114处理不同次数结果
结果显示，通过二次和三次处理，1%和2%试验组处理内毒素的效果差距逐渐减小，最终第三次处理后的蛋白液内毒素检测均在0.5~1万之间。因此为了减小Triton X-114用量，节约成本，减少环境污染，最终选择1%作为Triton X-114的工作浓度，处理次数确定为三次。
实验例8 不同灭活温度对蛋白抗原液灭活效果
取灭菌水配制的0.2M BEA（购自武汉华翔科洁有限公司）和0.4N的NaOH（购自北京化工厂）等体积混合，置37℃水浴，每隔10min振摇1次，1h后终止环化，制备成终浓度为0.1mol/L的BEI（二乙烯亚胺）。
取Cap蛋白三聚体抗原液150mL，分三管，每管50mL，分别加入终浓度为2%的0.1mol/L BEI溶液，分别放置37℃、25℃和4℃环境中静置，每隔12h观察一次，连续观察72h。记录抗原液性状变化，确定最适灭活温度。抗原加入终浓度2% BEI溶液，放置不同的温度下进行灭活，结果如表10所示：
表10 不同灭活温度对蛋白抗原液灭活效果
注：+代表灭活检验阳性灭活不完全，-代表灭活完全灭活检验合格。
研究表明，37℃试验组灭活所需时间最短，因此选择37℃作为最适灭活温度。
实验例9 不同灭活剂浓度对蛋白抗原液灭活效果
将灭活剂终浓度浓度设置为0.1%、0.5%、1%、2%分别加入50mL Cap蛋白三聚体抗原液中，混合均匀，选择最适灭活温度（37℃）放置72h，每隔12h取样进行灭活检验，确定最适灭活剂浓度。
将灭活剂终浓度浓度设置为0.1%、0.5%、1%、2%加入蛋白液中，37℃放置72h，每隔12h取样进行灭活检验，结果1%和2%终浓度灭活组均能在12h内完全灭活，结果如表11所示：
表11 不同灭活剂浓度对蛋白抗原液灭活效果
注：+代表灭活检验阳性灭活不完全，-代表灭活完全灭活检验合格。
实验例10 疫苗效力检验猪圆环病毒2型攻毒保护试验
猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体抗原，与佐剂（201佐剂，购自法国赛比克公司）配制成疫苗，抗原含量为1:2（琼扩效价），抗原与佐剂比分别为3:1、2:1、1:1、1:2。14~21日龄健康仔猪30头，经ELISA（试剂盒购自INgezim）检测猪圆环病毒2型抗体阴性。每个试验组5头试验猪，首免后14日进行二免，二免后14日攻毒，每头猪经颈部肌肉注射PCV2 RYZ株毒4mL、滴鼻3mL（含毒量106.0TCID50/mL），空白对照猪不攻毒隔离饲养。攻毒后第4、7日，分别对所有猪（空白对照组除外）用弗氏不完全佐剂（购自上海碧云天生物技术有限公司）乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，1mg/mL）在每头猪的两侧腋下及两侧臀部共接种4个点，每个点接种1mL。攻毒前和攻毒后28日称重，计算相对增重率，攻毒后28日，扑杀所有试验猪，取腹股沟淋巴结，免疫组化检测法检测。
相对增重率计算方法如下。攻毒试验组（免疫攻毒组、攻毒对照组）仔猪与空白对照组（非免疫非攻毒组）仔猪相比，如相对增重率≥5.0%，则判为该仔猪生长发育不良。计算公式为：
攻毒相对增重率=（空白对照组平均日增重-攻毒试验猪平均日增重）/空白对照组平均日增重×100%；
攻毒试验仔猪平均日增重=（攻毒后28日该仔猪体重-攻毒前该仔猪体重）/28日；
空白对照组仔猪平均日增重=（攻毒后28日空白对照组仔猪体重之和-攻毒前空白对照组仔猪体重之和）/（28日×5头）；
结果如下表12所示：3:1攻毒保护率为4/5，2:1、1:1、1:2攻毒保护率为5/5。
表12 疫苗效力检验猪圆环病毒2型攻毒保护试验
由以上实施例可知，本发明提供了重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体及其表达系统和在动物疫苗制备中的应用，可高效规模化生产，具备成本低、产量高等优势。通过重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体制备得到的动物疫苗免疫原性好，能够有效保护猪免受野毒的攻击。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种表达重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括初始载体和权利要求1所述的编码重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体的基因。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述初始载体为pGEX载体、pET系列载体或pMAL载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述初始载体为pET30a载体。
5.一种表达重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体的重组载体，其特征在于，所述重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
6.一种包含权利要求1所述的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体的编码基因的重组菌株。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株通过IPTG进行诱导表达。
8.根据权利要求7所述的重组菌株，其特征在于，所述IPTG的浓度为0.3~0.9mmol/L；
所述诱导表达的温度为35~38℃；
所述诱导表达的时间为4~6h。
9.权利要求2~5任一项所述的重组载体、权利要求6~8任一项所述的重组菌株在制备动物疫苗中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311099459.7A CN116813718B (zh) | 2023-08-30 | 2023-08-30 | 一种重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体及其表达体系和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311099459.7A CN116813718B (zh) | 2023-08-30 | 2023-08-30 | 一种重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体及其表达体系和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116813718A CN116813718A (zh) | 2023-09-29 |
| CN116813718B true CN116813718B (zh) | 2023-10-27 |
Family
ID=88117012
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311099459.7A Active CN116813718B (zh) | 2023-08-30 | 2023-08-30 | 一种重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体及其表达体系和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116813718B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117330764A (zh) * | 2023-12-01 | 2024-01-02 | 北京瑞阳瑞泰生物科技有限公司 | 兽用疫苗效力检验方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110387355A (zh) * | 2018-04-18 | 2019-10-29 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 表达猪圆环病毒Cap蛋白基因的重组猪伪狂犬病病毒株、疫苗及其制备方法和应用 |
| CN115960250A (zh) * | 2022-08-06 | 2023-04-14 | 武汉科前生物股份有限公司 | 一种重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白及其制备方法与应用 |
| CN116334139A (zh) * | 2023-04-28 | 2023-06-27 | 龙湖现代免疫实验室 | 基于猪圆环病毒2型病毒样颗粒的通用型模块化纳米抗原展示载体及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2488407C2 (ru) * | 2005-12-29 | 2013-07-27 | Берингер Ингельхайм Ветмедика, Инк. | Поливалентные иммуногенные композиции pcv2 и способы получения таких композиций |
| TWI508974B (zh) * | 2010-12-22 | 2015-11-21 | Sbc Virbac Ltd | 豬第二型環狀病毒(Porcine Circovirus Type 2)、含彼之免疫組合物、檢測套組及其應用 |
-
2023
- 2023-08-30 CN CN202311099459.7A patent/CN116813718B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110387355A (zh) * | 2018-04-18 | 2019-10-29 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 表达猪圆环病毒Cap蛋白基因的重组猪伪狂犬病病毒株、疫苗及其制备方法和应用 |
| CN115960250A (zh) * | 2022-08-06 | 2023-04-14 | 武汉科前生物股份有限公司 | 一种重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白及其制备方法与应用 |
| CN116334139A (zh) * | 2023-04-28 | 2023-06-27 | 龙湖现代免疫实验室 | 基于猪圆环病毒2型病毒样颗粒的通用型模块化纳米抗原展示载体及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 猪圆环病毒2型Cap蛋白在毕赤酵母中的分泌表达;郑光来;卢晓冉;张静远;陈腾;王东方;严妍;张守峰;扈荣良;;中国生物制品学杂志(07);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116813718A (zh) | 2023-09-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108558995B (zh) | 一种防治新型鹅星状病毒的卵黄抗体及其制备方法 | |
| CN116813718B (zh) | 一种重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体及其表达体系和应用 | |
| CN107267466A (zh) | 一种大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法 | |
| CN107177001A (zh) | 一种防治猪流行性腹泻病的卵黄抗体及其制备方法 | |
| CN106928373A (zh) | 一种猪支原体肺炎多表位黏膜疫苗 | |
| CN108704128B (zh) | 一种犬瘟热细小病毒二联亚单位疫苗 | |
| CN105087501B (zh) | 猪圆环病毒2型毒株及由其制备的灭活疫苗和应用 | |
| CN111808826B (zh) | 猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株及其应用 | |
| CN104411330B (zh) | 用犬呼吸道冠状病毒进行疫苗接种以针对支气管炎博德特菌感染进行保护 | |
| CN108517318A (zh) | 一种猪流行性腹泻病毒的变异毒株及其应用 | |
| CN105802921B (zh) | 表达猪瘟病毒e2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株及其构建方法和应用 | |
| CN104388396B (zh) | 猪伪狂犬病毒毒株及由其制备的灭活疫苗和应用 | |
| CN105754905A (zh) | 一种水貂绿脓杆菌及其应用 | |
| CN106039304B (zh) | 一种猪细小病毒、猪流行性腹泻、大肠埃希氏菌三联疫苗 | |
| CN102847168B (zh) | 一种预防奶牛乳腺炎的核酸疫苗PV-Fn的设计及其构建 | |
| CN115554396A (zh) | 一种猫嵌杯病毒和猫疱疹病毒二联疫苗及其制备方法与应用 | |
| CN112891525B (zh) | 山羊支原体山羊肺炎亚种Mccp1801在制备山羊传染性胸膜肺炎疫苗中的应用 | |
| CN105833263B (zh) | 一种禽偏肺病毒和h9亚型禽流感病毒二联疫苗 | |
| CN110974951B (zh) | 一种二联灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN109134619A (zh) | 猪圆环病毒2型抗原、其制备的免疫原性组合物、制备方法和应用 | |
| CN107129527A (zh) | 一种马链球菌兽疫亚种保护性抗原hp0623及其制备方法 | |
| CN106563125A (zh) | 鸭甲肝病毒ⅲ型复合物活疫苗及其制备方法 | |
| CN104338128B (zh) | 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
| CN111000995A (zh) | 猪用三联灭活疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN105879023B (zh) | 一种猪细小病毒和猪流行性腹泻二联灭活疫苗 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |