JP6356651B2 - ボツリヌス神経毒素を得るためのプロセスおよびシステム - Google Patents
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Description
本出願は、2009年7月13日出願の米国特許出願第12/502,181号の利益を主張し、その開示全体は、このように具体的に参照することにより、本明細書に組み込まれる。
クロストリジウム属は、形態および機能によって分類された127を超える種を有する。嫌気性グラム陽性菌であるクロストリジウム・ボツリナムは、ボツリヌス中毒として知られるヒトおよび動物における神経麻痺疾患の原因となる強力なポリペプチド神経毒であるボツリヌス毒素(「毒素」と同意語)を産生する。ボツリヌス毒素中毒の症状は、歩行困難、嚥下困難、および発話困難から、呼吸筋の麻痺および死亡まで進行し得る。
1.Ozutsumi K., et al,Rapid,simplified method for production and purificationof tetanus toxin,App&Environ Micro,Apr.1985,p939−943,vol49,no.4.(1985)は、破傷風毒素を精製するためのゲル濾過高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)の使用を開示している。
2.Schmidt J.J.,et al.,purificationof type E botulinum neurotoxin by high−performance ion exchange chromatography,Anal Biochem 1986 Jul;156(1):213−219は、E型ボツリヌス毒素を精製するためのサイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーの使用を開示している。また、リボヌクレアーゼ(RNase)の代わりの硫酸プロタミンの使用も開示されている。
3.Simpson L.L.,et al.,Isolation and characterization of thebotulinum neurotoxin s Simpson LL;Schmidt JJ;Middlebrook JL,In:Harsman S,ed.Methods in Enzymology.Vol. 165,Microbial Toxins:Tools in Enzymology San Diego,CA:Academic Press;vol165:pages76−85(1988)は、重力流によるクロマトグラフィー、HPLC、親和性樹脂を用いた初期精製ステップ、サイズ排除クロマトグラフィー、および2つの異なるイオン交換カラムの使用を含むイオン(陰イオンおよび陽イオン)交換クロマトグラフィーを用いたボツリヌス神経毒の精製を開示している。種々のSephadex、Sephacel、Trisacryl、SおよびQカラムが開示されている。
4.Zhou L., et al.,Expression and purification of the light chain of botulinum neurotoxin A:A single mutation abolishes its cleavage of SNAP−25 and neurotoxicity after reconstitution with the heavy chain,Biochemistry 1995;34(46):15175−81 (1995)は、ボツリヌス神経毒素の軽鎖融合タンパク質を精製するためのアミロースアフィニティーカラムの使用を開示している。
5.Kannan K., et al.,Methods development for the biochemical assessment of Neurobloc(botulinum toxin type B),Mov Disord 2000;15(Suppl 2):20(2000)は、B型ボツリヌス毒素をアッセイするためのサイズ排除クロマトグラフィーの使用を開示している。
6.Wang Y−c,The preparation and quality of botulinum toxin type A for injection (BTXA) and its clinical use, Dermatol Las Faci Cosm Surg 2002;58(2002)は、A型ボツリヌス毒素を精製するためのイオン交換クロマトグラフィーを開示している。この参考文献は、沈殿およびクロマトグラフィー技術の組み合せを開示している。
7.Johnson S.K.,et al.,Scale−up of the fermentation and purificationof the recombination heavy chain fragment C of botulinum neurotoxin serotype F, expressed in Pichia pastoris,Protein Expr and Purif 2003;32:1−9(2003)は、F型ボツリヌス毒素の組換え重鎖断片を精製するためのイオン交換および疎水性相互作用カラムの使用を開示している。
8.公開米国特許出願第2003 0008367 A1号(Oguma)は、ボツリヌス毒素を精製するためのイオン交換およびラクトースカラムの使用を開示している。
定義
本明細書で使用される以下の単語および用語は、以下の定義を有する。
パーセンテージは、別途記載のない限り体積当たりの重量に基づく。
APFは、動物性成分/タンパク質を含まないことを意味する。
CVは、カラム体積を意味する。
DFは、ダイアフィルトレーションを意味する。
ELISAは、酵素結合免疫吸着検定法を意味する。
「IAPFシステム」または「IAPFプロセス」におけるIAPFとは、「改良された、動物性タンパク質を含まない」システムまたはプロセスを意味する。IAPFシステムまたはプロセスは、本明細書に具体的に詳述するように、ボツリヌス毒素または神経毒成分を精製するための2つのクロマトグラフィー媒体または3つのクロマトグラフィー媒体のいずれかの使用を含む。クロマトグラフィー媒体は、当該技術分野において既知であるように、クロマトグラフィー樹脂を含む。2つのクロマトグラフィー媒体の使用によって得られたボツリヌス神経毒素のバッチは、本明細書においてIAPFと表す。
「FAPFシステム」または「FAPFプロセス」におけるFAPFとは、「さらに改良された、動物性タンパク質を含まない」システムまたはプロセスを意味する。したがって、FAPFはIAPFプロセスであり、FAPFシステムまたはプロセスは、ボツリヌス毒素または神経毒構成要素を精製するために3つのクロマトグラフィー媒体が使用されることを意味する。3つのクロマトグラフィー媒体の使用によって得られたボツリヌス神経毒素のバッチは、本明細書においてFAPFと表す。
NAPFは、動物性タンパク質を含むことを意味する。
SDS−PAGEは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を意味する。
SEC−HPLCは、高性能サイズ排除クロマトグラフィーを意味する。
UFは、限外濾過を意味する。
培養に約8時間〜約14時間、
発酵に約60時間〜約80時間、
採取に約2.5時間、
濃縮および希釈に約2時間〜約4時間、
陰イオン交換クロマトグラフィーに約4時間〜約6時間(これには捕捉されたボツリヌス毒素を溶出するための時間も含まれる)、
陽イオン交換クロマトグラフィーに約2時間、
任意の第3のクロマトグラフィーステップ(すなわち、疎水性相互作用クロマトグラフィー)に約2時間、
濃縮およびダイアフィルトレーションに約2時間〜約4時間、
さらなる濾過に約1/2時間。したがって、我々の発明の我々の8つまたは9つのステップの、迅速な、より好ましい実施形態を完了するために必要な合計時間は、約75時間〜約150時間である。
ボツリヌス毒素を得るための非APF(Schantz)プロセス
この実施例では、ボツリヌス神経毒素を得るための従来技術であるSchantz法について記載する。このプロセスは、動物由来培地および試薬を使用する非APFプロセスである(すなわち、培養のためのウシ血液寒天プレート、発酵培地中のカゼイン、ボツリヌス神経毒素の精製のためのRNaseおよびDNase酵素の使用)。図1Aは、Schantz法の主なステップを示すフロー図である。Schantz法は、約16〜20の主なステップを有し、生産規模の作業には115L発酵槽を使用し、完了するまで約3週間かかる。Schantz法は、非APFであるクロストリジウム・ボツリナムのマスターセルバンク(MCB)バイアルを室温まで解凍し、続いて4つの培養ステップを行うことによって開始される。最初に、好適な形態のコロニーを選択するために、予め還元したコロンビア血液寒天(CBA)プレート上に、解凍したMCBバイアルからのアリコートを画線塗抹し、34℃±1℃で30〜48時間嫌気的にインキュベートした。2番目に、選択したコロニーを、カゼイン増殖培地を含有する9mL試験管に34℃で6〜12時間接種した。次いで、最も急激な増殖および最高密度(増殖選択ステップ)を有する9mL管の内容物を、2段階漸増した嫌気性インキュベーション(第3および第4の培養ステップ)によりさらに培養した:600mL〜1Lの種培養瓶内にて、34℃で12〜30時間のインキュベーション、その後、カゼイン増殖培地を含有する15L〜25Lの種発酵槽中、35℃で6〜16時間の培養。これらの2段階漸増による培養は、pH7.3の水中、2%カゼイン加水分解物(カゼイン[乳タンパク質]消化物)、1%酵母エキスおよび1%グルコース(デキストロース)を含有する栄養培地中で行った。
ボツリヌス神経毒素を得るためのAPF、2カラムおよび3カラムクロマトグラフィーシステムおよびプロセス
我々は、高収率、高純度のボツリヌス神経毒素を得るための、迅速な、APF陰イオン‐陽イオンクロマトグラフィーに基づくシステムおよびプロセスを開発した。この実施例2のプロセスは、わずか8〜10個の主なステップを有し、生産のために(つまり、最終的なボツリヌス神経毒素のグラム量を得るために)20Lの発酵容器を使用し、培養の開始から最終的な精製および毒素の保存まで、プロセスの全ステップを完了するためにわずか4〜7日、好ましくは約4〜約6日かかる。本明細書に開示されるシステムにおいて用いられる装置について以下に考察する。2カラムクロマトグラフィー媒体プロセスおよび3カラムクロマトグラフィー媒体プロセスの両方が開発され、本明細書に記載される。2媒体プロセスは、陰イオン交換クロマトグラフィーの後に陽イオン交換クロマトグラフィーを使用した。3媒体プロセスは、陰イオン交換クロマトグラフィーの後に陽イオン交換クロマトグラフィー、その後に疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)を使用した。HICにより、49kDaの不純物等の不純物をさらに除去した(後に考察されるように、それは宿主細胞のグルコースリン酸イソメラーゼであった)。
我々は、コロンビア血液寒天プレートを使用しない、新しいクロストリジウム・ボツリナムのセルバンク(培養ステップを開始するために使用するため)を開発し、それによって培養前のコロニー選択の必要性を排除し、またShantz法の漸増的な試験管培養および複数の播種(培養)ステップを行う必要性をも排除した。
我々の実施例2のプロセスは、概して上流段階および下流段階の2段階を有していた。上流段階は、清澄化した、採取済みの培養物(次いで濃縮および希釈される)を提供するための、出発細胞株の増殖(実質的にAPFである培養培地中でのクロストリジウム・ボツリナム菌の増殖および再生産)、発酵、採取(細胞残屑の除去)を含む。したがって、この例において、我々の2カラムプロセスにおける9つのステップは、培養、発酵、採取濾過、濃縮、初期精製(陰イオン)クロマトグラフィー、最終精製(陽イオン)クロマトグラフィー、緩衝液の交換、バイオバーデンの減少、およびバイアルの充填である。
(BSC)内で、採取ステップからの濾液を中空ファイバ、GE Healthcare社製接線流濾過(TFF)膜を使用して15Lから5±0.5Lに濃縮した。次いで、限外濾過した材料を10mMリン酸ナトリウムのpH6.5緩衝液で最終体積20Lまで希釈した。この材料を2カラム(陰イオン、次いで陽イオン)または3カラムクロマトグラフィーカラム(陰イオン、陽イオン、次いで疎水性相互作用)のいずれかを使用して精製した。希釈した、限外濾過した採取材料をすぐに精製によって処理しない場合は4℃で保存した。
下流ステップは、陰イオン交換カラム上でのボツリヌス神経毒素の捕捉;陽イオン交換カラム上での最終精製による、カラムからの溶出および不純物のさらなる分離;そして好ましくは(3カラムプロセスにおいて)、所望のボツリヌス神経毒素を含有する溶離液の第3カラム、好ましくは疎水性相互作用カラムの通過(例えばクロマトグラフィー);その後の接線流濾過(TFF)を用いた濃縮および緩衝液の交換;冷却保存、好ましくは冷凍のために最適化された最終的なA型ボツリヌス神経毒素複合体になるまでのバイオバーデンの減少(例えば、0.2μmフィルタを使用したさらなる濾過による);ならびにA型ボツリヌス神経毒素複合体医薬組成物への最終的な配合を含んでいた。クロマトグラフィーおよび濾過の段階の手順は、より安定した原体を提供するために、生成物およびプロセスに関連する不純物を除去すること、潜在的な外来性物質を除去すること、ならびにA型ボツリヌス神経毒素複合体の濃度および最終的なA型ボツリヌス神経毒素の緩衝液マトリックスを制御することを目的とするものであった。
最初に、Phenyl Sepharose HPカラムを0.1N水酸化ナトリウム溶液で最短接触時間の30分間(少なくとも約3カラム体積の0.1N水酸化ナトリウム溶液を用いて200cm/時で)殺菌した。次いで、少なくとも約5カラム体積の50mM酢酸ナトリウム、0.4M硫酸アンモニウム、pH4.8緩衝液でカラムを平衡化した。次に、POROS(登録商標)20HS(陽イオン交換カラム)生成物プール(上記の)を1:1で50mM酢酸ナトリウム、0.8M硫酸アンモニウム、pH4.8緩衝液と合わせ、Phenyl Sepharose HPカラムに投入した。最初にカラムを少なくとも約3カラム体積の50mM酢酸ナトリウム、0.4M硫酸アンモニウム、pH4.8緩衝液で洗浄し、次いで50mMリン酸ナトリウム、0.4M硫酸アンモニウム、pH6.5緩衝液で洗浄した。A型ボツリヌス神経毒素複合体を10mMリン酸ナトリウム、0.14M硫酸アンモニウム、pH6.5緩衝液でカラムから溶出した。A280が>0.05AUまで増加したときに、溶出液をバイオプロセス収集袋に誘導した。溶出ピークの立ち下がり区間のA280が<0.05AUの値に減少するまで溶出液を収集した。Phenyl Sepharose HP生成物プールを、周囲温度で最長約6時間、収集袋内に保存した。
滅菌ピペットを使用して、15mL/1.5mL滅菌サンプル管の各々に10mL/0.75mLを含まれるアリコートを作製した。生成物の入った容器を手で穏やかに撹拌し、必要量の溶液(バルク原体、すなわち、バルクのボツリヌス毒素を含有する)を各バイアルに移した。サンプルは、最長5日間、2℃〜8℃の冷蔵庫に保存するか、または0.75mLの濾液生成物プールをクライオバイアルに移した。クライオバイアルを−70℃+/−5℃で保存した。
配合方法
患者への投与に好適な医薬組成物は、実施例2のプロセスから得られたボツリヌス神経毒素を1つ以上の賦形剤と配合することによって作製することができる。賦形剤は、配合プロセスおよびその後の使用前の保存期間の間にボツリヌス毒素を安定化する役割を果たすことができる。賦形剤はまた、増量剤として、および/または医薬組成物にある程度の浸透圧を与えるために作用することもできる。配合は、実施例2のプロセスから得られたボツリヌス神経毒素を何倍にも希釈すること、1つ以上の賦形剤(アルブミン[ヒト血清アルブミンまたは組換えヒトアルブミン等]および塩化ナトリウム等)と混合し、それによって毒素組成物を形成すること、該組成物を凍結乾燥、フリーズドライ、または真空乾燥することにより、毒素組成物の保存および輸送用の安定した形態を調製することを必要とする。したがって、約1.5〜1.9ngの実施例2で得られたA型ボツリヌス毒素複合体は、約0.5ミリグラムの組換えヒトアルブミン(Delta Biotechnologies)および約0.9ミリグラムの塩化ナトリウムと(これらの3つの成分を一緒に混合し、その後真空乾燥することによって)配合される。真空乾燥は、約20℃〜約25℃で、約80mmHgの圧力で約5時間行われてもよく、その時点で、その中にこれらの成分が真空乾燥されたバイアルが真空下で密封されて蓋をされ、それによって約100単位のA型ボツリヌス神経毒素複合体を含むバイアルが得られる。得られた固体(粉末状)の真空乾燥生成物は、使用時に標準的な(0.9%)生理食塩水で再構成され、頸部ジストニアおよび多汗症等の種々の適応症に罹患する患者を治療するために使用される。凍結乾燥、真空乾燥またはフリーズドライにより、配合されたボツリヌス神経毒素の保存および輸送用の安定した形態を調製する。
1.プロセスにおいて動物源(例えば、ヒトまたは動物)に由来する成分または物質が使用されず、DNaseおよびRNase、コロンビア血液寒天プレート、カゼインの使用が排除されるため、安全性が向上する(例えば、清澄化/採取ステップの間の帯電濾過および最新のクロマトグラフィー技術によって、ワーキングセルバンクからの細胞(つまり、以前に選択され、APF培地中で増殖/維持された細胞)を直接含む播種培養培地によって置き換えられ、ペプトン源として、培養瓶および発酵培地がSoy Peptone Type II (SPTII)によって置き換えられる)。
2.発酵培地10L当たり約50mg〜約200mgの高品質なA型ボツリヌス毒素複合体を得ることができる。
3.頑健な、一貫性のある、拡張可能、検証可能、およびcGMPに適合するプロセスから精製されたバルク毒素が得られる。頑健であるとは、プロセスが、プロセスパラメータのうちの1つ以上におけるたとえ約±10%の変化でも再現可能であることを意味する。検証可能であるとは、プロセスが、一貫した収率の精製毒素を再現可能に提供することを意味する。cGMP適合とは、プロセスが、FDAが要求する医薬品適正製造基準に準拠する製造プロセスに容易に変換され得ることを意味する。
4.最終的な精製ボツリヌス毒素複合体の効力は、Schantz法または改良されたSchantz法によって得られる精製ボツリヌス毒素複合体の効力(例えば、MLD50アッセイによって判定される)を満たすかまたはそれを超える。
5.精製プロセスの特異性を向上させる、バルクのボツリヌス毒素複合体を精製するためのクロマトグラフィーステップによる、任意の沈殿ステップの置き換え。
6.新しい改良プロセスは、規模の縮小を促進し、その結果、取扱いの改良および>95%の操作成功率の達成がもたらされる(例えば、典型的に用いられる発酵培地の体積が110L〜120Lの約10L〜約50Lまで、さらには約2L〜約30Lの発酵培地まで、またはその間の量まで減少された。原薬の典型的な現在の生産規模は、115Lの非APF発酵培地であるが、我々の発明の一態様として、20Lの発酵培地まで減少された。この規模の縮小は、BoNT/A複合体の合成および細胞放出、ならびに精製ステップを通じて全収率を最適化することによって可能となり、その結果、例えば、5×またはさらに多い発酵体積(例えば115L)を必要とする従来プロセスにおいて得られるのと同様の量の最終バルクボツリヌス毒素(原体)がもたらされる。この規模の縮小は、発酵作業体積の管理をより容易にし、したがって、作業者がBoNT/A複合体に曝露される潜在的リスクを最小限に留める:これは重要な操作および安全上の利点である。
7.潜在的に致死性であるBoNT/A複合体の性質のために、本明細書に開示される製造ステップを通してクローズドシステムが実装されてきた。従来技術の方法とは異なり、本発明の態様にしたがって生成される原体物質は、単位操作間の移動の間、環境に曝露されない:全ての作業者は完全に封じ込められる。
8.本明細書に開示されるバルクボツリヌス毒素の製造プロセスは、製造中の原体の同一性、品質、純度、または効力を犠牲にすることなく、全てのステップにおいて簡素化される。再設計されたIAPFプロセスでは、非APFプロセスにおいて用いられるステップ数が削減されるため、生産期間が、例えば21日から6日以内に短縮される。
9.冷凍液としてのバルクボツリヌス毒素の保存条件が、原体の安定性を大幅に向上させる。
Claims (4)
- ボツリヌス神経毒素を得るための動物性成分を含まない(APF)プロセスであって、以下のステップ:
(a)APF発酵培地を提供するステップ;
(b)前記発酵培地中でクロストリジウム・ボツリナム菌を発酵させるステップであって、クロストリジウム・ボツリナム菌はボツリヌス神経毒素を産生する、ステップ;
(c)ボツリヌス神経毒素を含有する前記発酵培地を陰イオン交換クロマトグラフィー媒体と接触させる第1の接触工程を行うステップ;
(d)前記陰イオン交換媒体から、捕捉されたボツリヌス神経毒素を溶出して第1の溶離液を得るステップ;
(e)前記第1の溶離液を陽イオン交換クロマトグラフィー媒体と接触させる第2の接触工程を行い、前記陽イオン交換クロマトグラフィー媒体から、捕捉されたボツリヌス神経毒素を溶出して第2の溶離液を得るステップ;
(f)前記第2の溶離液を疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体と接触させるステップ;および
(g)前記疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体から、捕捉されたボツリヌス神経毒素を溶出して第3の溶離液を得るステップ
を含み、それによってボツリヌス神経毒素を得、ボツリヌス神経毒素がA型神経毒素である、プロセス。 - 得られたボツリヌス神経毒素が、得られたボツリヌス神経毒素1mg当たり、1ngまたは1ng未満の残留核酸を含む、請求項1に記載のプロセス。
- 1週間以内に行われる、請求項1に記載のプロセス。
- 得られたボツリヌス神経毒素が、約2.0×107〜約6.0×107単位/mgボツリヌス神経毒素の効力を有する、請求項1に記載のプロセス。
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