KR101784532B1 - 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 공정 및 시스템 - Google Patents

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Abstract

연구, 치료 및 미용 용도를 위하여 고역가, 고수율 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 신속하고 동물 단백질이 없는 크로마토그래피 공정 및 시스템.

Description

보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 공정 및 시스템 {PROCESS AND SYSTEM FOR OBTAINING BOTULINUM NEUROTOXIN}
교차 참조
이 출원은 2009년 7월 13일자 미국 특허 출원번호 제12/502,181호의 이익을 청구하며, 상기 특허의 전체 개시는 본 명세서에 구체적인 참조로 포함된다.
배경
본 발명은 클로스트리디움 신경독소를 수득하기 위한 시스템 및 공정, 클로스트리디움 신경독소로부터 약제학적 조성물을 제조하는 방법 및 이렇게 제조된 약제학적 조성물의 치료 및 미용 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 고역가(high potency), 고순도, 및 고수율의 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한, 신속하고 동물 단백질이 없는 크로마토그래피 공정 및 시스템에 관한 것이다.
치료, 진단, 연구 또는 미용 목적을 위하여 인간 또는 동물에게 투여하기 적절한 약제학적 조성물은 활성 성분 및 한 가지 이상의 부형제, 완충제, 담체, 안정화제, 삼투성 조정제, 보존제 및/또는 증량제를 포함한다. 약제학적 조성물 중의 활성 성분은 보툴리눔 신경독소와 같이 생물학적일 수 있다. 약제학적 조성물 중의 활성 성분으로서 유용한 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 공지 방법(예컨대 Schantz 방법)은 배양 및 발효 배지에서 사용되는 고기 육즙(meat broth) 및 카제인과 같은 동물-유래 단백질, 및 동물 유래의 정제 효소를 사용하는 수주일의 배양, 발효 및 정제 공정이다. 동물 유래 산물의 사용을 통하여 제조된 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 것은 프리온과 같은 감염원 또는 병원체를 투여할 위험을 수반할 수 있다. 추가적으로, 보툴리눔 독소를 수득하기 위한 동물 단백질이 없는 공지된 방법은 또한 많은 상류 (배양 및 발효) 및 하류 (정제) 단계를 가지는 시간-소모적 공정(즉 완료를 위하여 일주일 이상이 걸림)이며, 여전히 검출 가능한 불순물을 가지는 보툴리눔 신경독소 수득을 초래한다.
보툴리눔 독소
클로스트리디움 속에는 형태 및 기능에 의하여 분류되는 127 종 이상이 속한다. 혐기성, 그람 양성 박테리아 클로스트리디움 보툴리눔( Clostridium botulinum )은 강력한 폴리펩타이드 신경독소인 보툴리눔 독소(동의어로 "독소")를 생성하는데, 이는 인간 및 동물에게 보툴리눔증(botulism)으로 알려진 신경마비성 병을 일으킨다. 보툴리눔 독소 중독의 증상은 보행장애, 연하장애 및 언어장애로부터 호흡기 근육의 마비 및 사망으로 진행할 수 있다.
보툴리눔 독소의 1 유닛(unit)은 각각 약 18-20 그램으로 계량되는 암컷 스위스 웹스터 마우스에게 복강내 주사 시의 LD50으로 정의된다. 보툴리눔 독소의 1 유닛은 암컷 스위스 웹스터 마우스 그룹의 50%를 죽이는 보툴리눔 독소의 양이다. 일반적으로 면역학적으로 구별되는 일곱 가지의 보툴리눔 신경독소가 특징분석되었고, 이들은 각각 보툴리눔 신경독소 혈청형(serotype) A, B, C1, D, E, F 및 G이며, 이들 각각은 유형-특이성 항체로 중화하여 구별된다. 보툴리눔 독소의 상이한 혈청형들은 이들이 영향을 미치는 동물 종 및 이들이 일으키는 마비의 중증도 및 지속기간에 차이가 있다. 보툴리눔 독소는 높은 친화성을 가지고 콜린작동성 모터 뉴런에 명백하게 결합하고, 뉴런으로 위치를 옮기며, 아세틸콜린의 시냅스전 방출을 차단한다.
보툴리눔 독소는, 예를 들어 활동항진성 골격근을 특징으로 하는 신경근육 장애의 치료를 위한 임상적 상황에서 사용되어 왔다. 보툴리눔 독소 A 형은 미국 식품의약국(FDA)에 의하여 12 세 이상 환자의 본태성 안검경련, 사시 및 반측안면 경련에 대하여 승인되었고, 경부 근긴장이상증, 미간 (안면) 주름의 치료 및 다한증 치료에 대하여 승인되었다. FDA는 또한 경부 근긴장이상증의 치료에 대하여 보툴리눔 독소 B 형을 승인했다.
비록 모든 보툴리눔 독소 혈청형들이 신경근육 접합부에서 신경전달물질 아세틸콜린의 방출을 명백하게 억제하기는 하지만, 보툴리눔 독소 혈청형들은 여러 상이한 신경분비 단백질에 작용하고 및/또는 이러한 단백질들을 여러 상이한 부위에서 분해하여 이를 수행한다. 보툴리눔 독소 A 형은 세포내, 소포-결합 단백질(vesicle-associated protein, VAMP, 또한 시냅토브레빈(synaptobrevin)으로 지칭됨) 25 킬로달톤 (kDa) 시냅토솜 결합 단백질(SNAP-25)의 펩타이드 결합을 특이적으로 가수분해할 수 있는 아연 엔도펩티데이즈이다. 보툴리눔 E 형 또한 SNAP-25를 절단하지만, 보툴리눔 독소 A 형과 비교하여 이 단백질 내의 상이한 아미노산 서열을 표적으로 한다. 보툴리눔 독소 B, D, F 및 G 형은 VAMP에 작용하며, 각각의 혈청형은 상이한 부위에서 단백질을 절단한다. 마지막으로, 보툴리눔 독소 C1 형은 신택신 및 SNAP-25 모두를 절단하는 것으로 나타났다. 이러한 작용 메커니즘의 상이함은 다양한 보툴리눔 독소 혈청형 작용의 상대적 효력 및/또는 작용기간에 영향을 미칠 수 있다.
일곱 가지의 모든 공지 보툴리눔 독소 혈청형에 대하여, 보툴리눔 독소 복합체의 활성 보툴리눔 독소 단백질 분자("순수 독소" 또는 "신경독성 성분"으로도 공지임)의 분자량은 약 150 kDa이다. 흥미롭게도, 보툴리눔 독소는 하나 이상의 결합된 비-독소 단백질과 함께150 kDa 신경독성 성분을 포함하는 복합체로서 클로스트리디움 박테리아에 의하여 방출된다. 따라서, 보툴리눔 독소 A 형 복합체는 900 kDa, 500 kDa 및 300 kDa 형태(대략의 분자량)로서 클로스트리디움 박테리아에 의하여 생성될 수 있다. 보툴리눔 독소 B 및 C1 형은 명백하게 500 kDa 복합체로서만 생성된다. 보툴리눔 독소 D 형은 300 kDa 및 500 kDa 복합체 두 가지로서 생성된다. 마지막으로, 보툴리눔 독소 E 및 F 형은 대략 300 kDa 복합체로서만 생성된다. 복합체(즉, 분자량이 약 150 kDa보다 큰 것)는 헤마글루티닌(HA) 단백질 및 비-독소 비-헤마글루티닌(NTNH) 단백질을 포함한다. 따라서, 보툴리눔 독소 복합체가 보툴리눔 독소 분자(신경독성 성분) 및 하나 이상의 HA 단백질 및/또는 NTNH 단백질을 포함할 수 있다. (보툴리눔 독소 분자와 함께 관련 신경독소 복합체를 이룰 수 있는) 이러한 두 가지 유형의 비-독소 단백질은 보툴리눔 독소 분자의 변성에 대한 안정성 및 독소가 섭취될 때 소화성 산에 대한 보호를 제공하는 작용을 할 수 있다. 추가적으로, 더 큰 (분자량이 약 150 kDa보다 큰) 보툴리눔 독소 복합체가 보툴리눔 독소 복합체의 근육내 주사 부위로부터 더 느린 보툴리눔 독소 확산 속도를 유발할 수 있다. 다양한 임상 상태를 치료하는 보툴리눔 독소 A 형의 성공은 다른 보툴리눔 독소 혈청형에 대한 관심을 유발시켰다. 따라서, 적어도 보툴리눔 독소 A, B, E 및 F 형이 인간에게 임상적으로 사용되었다. 추가적으로, 신경독성 성분의 제제(즉 결합된 비-독소 단백질이 없음)가 상표명 XEOMIN(독일, 프랑크푸르트 소재의 Merz Pharmaceuticals)으로 유럽에서 판매된다.
보툴리눔 독소 A 형은 pH 4-6.8의 묽은 수용액에 용해성인 것으로 공지이다. 약 7 이상의 pH에서 안정화 비-독소 단백질이 신경독소로부터 분리되어, 그 결과 독성이 점진적으로 손실되는데, 특히 pH 및 온도가 상승함에 따라 그러하다 (Schantz E.J., et al Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment (특히 44-45 쪽), Jankovic, J., et al, Therapy with Botulinum Toxin, Marcel Dekker, Inc, 1994의 3장).
효소가 일반적으로 그렇듯이, 보툴리눔 독소(이는 세포내 펩티데이즈임)의 생물학적 활성은 이의 삼차원 형상에 최소한 부분적으로 의존적이다. 독소를 밀리그램 양으로부터 밀리리터당 수나노그램을 함유하는 용액으로 희석하는 것은, 예를 들어 독소가 표면에 부착되어 따라서 가용 독소의 양을 감소시키는 경향과 같은 상당한 어려움을 나타낸다. 독소는 독소 함유 약제학적 조성물이 제제화된 지 수개월 또는 수년 후에 사용될 수 있으므로, 알부민, 수크로오스, 트레할로오스 및/또는 젤라틴와 같은 안정화제로써 안정화된다.
상용화되어 입수 가능한 보툴리눔 독소 함유 약제학적 조성물은 캘리포니아, 어바인 소재의 Allergan, Inc.로부터 상용화되어 입수 가능한 상표명 BOTOX®(보툴리눔 독소 A 형 정제된 신경독소 복합체)로 판매된다. 각각의 BOTOX®의 100 유닛 바이알은 약 5 ng의 정제된 보툴리눔 독소 A 형 복합체, 0.5 mg 인간 혈청 알부민, 및 0.9 mg 염화나트륨으로 구성되고 진공-건조 형태이며, 보존제 없이(0.9% 염화나트륨 주입) 멸균 생리식염수로써 복원되도록 의도된다. 다른 상용화되어 입수 가능한 보툴리눔 독소-함유 약제학적 조성물에는 Dysport®(보툴리눔 독소 약제학적 조성물 중에 락토오스 및 인간 혈청 알부민을 가지는 클로스트리디움 보툴리눔 A 형 독소 헤마글루티닌 복합체, 영국, 버크셔 소재의 Ipsen Limited로부터 상용화되어 입수 가능, 사용 전에 0.9% 염화나트륨로써 복원될 분말), 및 MyoBlocTM(보툴리눔 독소 B 형, 인간 혈청 알부민, 숙신산나트륨, 및 염화나트륨을 포함하는 약 pH 5.6 주사 용액, 캘리포니아, 샌 디에고 소재의 Solstice Neurosciences로부터 상용화되어 입수 가능)이 포함된다. 신경독성 성분(150 kDa 독소 분자) 및 보툴리눔 독소 복합체(300 kDa 내지 900 kDa)는, 예를 들어 캘리포니아, 캠벨 소재의 List Biological Laboratories, Inc.; 영국, 포턴 다운 소재의 the Centre for Applied Microbiology and Research; Wako (일본, 오사카), 또한 미주리, 세인트 루이스 소재의 Sigma Chemicals로부터 입수될 수 있다.
보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 동물 단백질이 없는 및/또는 크로마토그래피 방법이 미국 특허 제7,445,914호; 제7,452,697호; 제7,354,740호; 제7,160,699호; 제7,148,041호 및; 제7,189,541호에 개시된다. 발명의 명칭이 "Media for Clostridium Bacterium"인 2006년 12월 12일자 미국 특허 출원 제11/609,449호; 발명의 명칭이 "Animal Product Free Media and Processes for Obtaining a Botulinum Toxin"인 2008년 4월 7일자 제12/098,896호; 발명의 명칭이 "Chromatographic Method and System for Purifying a Botulinum Toxin"인 2007년 10월 31일자 제11/932,689호; 발명의 명칭이 "Chromatographic Method and System for Purifying a Botulinum Toxin"인 2007년 10월 31일자 2007 제11/932,789호 및; 발명의 명칭이 "Animal Product Free Media And Processes For Obtaining A Botulinum Toxin"인 2008년 9월 19일 제12/234,537호가 또한 관심사이다.
약제학적 조성물에서 사용하기 위한 보툴리눔 독소는 공지된 Schantz 공정을 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔의 혐기성 발효에 의하여 수득될 수 있다 (예를 들어 Schantz E.J., et al., Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine , Microbiol Rev 1992 Mar;56(1):80-99; Schantz E.J., et al., Preparation and characterization of botulinum toxin A type for human treatment, chapter 3 in Jankovic J, ed. Neurological Disease and Therapy. Therapy with botulinum toxin (1994), New York, Marcel Dekker;1994, pages 41-49, and; Schantz E.J., et al., Use of crystalline type A botulinum toxin in medical research , in: Lewis GE Jr, ed. Biomedical Aspects of Botulism (1981) New York, Academic Press, pages 143-50 참조). 보툴리눔 독소를 수득하기 위한 Schantz 공정은 동물 산물을 예를 들어 시약 및 배양 및 발효 배지의 일부로서 사용한다.
다수의 단계가 치료, 진단, 연구 또는 미용 목적을 위하여 인간 또는 동물에게 투여하기 적절한 클로스트리디움 독소 약제학적 조성물 제조에 필요하다. 이러한 단계들은 정제된 클로스트리디움 독소를 수득하는 단계 그리고 이후 정제된 클로스트리디움 독소를 조합(compounding)하는 단계를 포함할 수 있다. 첫 번째 단계는 온난한 혐기성 대기와 같은 혐기성 박테리아 성장에 도움이 되는 환경에서, 전형적으로 혈액 한천 플레이트에 클로스트리디움 박테리아의 콜로니를 도말하고 성장시키는 것일 수 있다. 이 단계는 원하는 형태 및 다른 특징을 가지는 클로스트리디움 콜로니가 수득되도록 한다. 두 번째 단계에서, 선택된 클로스트리디움 콜로니가 적절한 제1 배지에서 발효될 수 있고, 추가적으로 필요한 경우, 제2 발효 배지에 보내진다. 일정 기간의 발효 후, 클로스트리디움 박테리아가 일반적으로 용해되고 클로스트리디움 독소를 배지에 방출한다. 세 번째로, 배지가 벌크(bulk) 독소를 수득하도록 정제될 수 있다. 전형적으로 벌크 독소를 수득하기 위한 배지 정제가 시약 중에서 특히 DNase 및 RNase와 같은 동물-유래의 효소를 사용하여 수행되는데, 상기 효소는 핵산의 분해 및 제거 촉진에 사용된다. 생성된 벌크 독소는 특정한 특이적 활성을 가지는 고도로 정제된 독소일 수 있다. 적절한 완충제에서 안정화시킨 후, 인간에게 투여하기 적절한 클로스트리디움 독소 약제학적 조성물을 제조하기 위하여 벌크 독소가 한 가지 이상의 부형제와 조합될 수 있다. 클로스트리디움 독소 약제학적 조성물은 활성 약제학적 성분(API)으로서 클로스트리디움 독소를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 한 가지 이상의 부형제, 완충제, 담체, 안정화제, 보존제 및/또는 증량제를 포함할 수 있다.
클로스트리디움 독소 발효 단계는 완전(whole) 클로스트리디움 박테리아, 용해된 박테리아, 배양 배지 영양물 및 발효 부산물을 포함하는 발효 배지 용액을 생성할 수 있다. 완전 및 용해된 박테리아와 같은 큰 성분을 제거하도록 이 배양 용액을 여과하여 수확/정화(harvest/clarified) 배지를 제공한다. 정화 배지는 클로스트리디움 독소 및 다양한 불순물을 포함하고, 벌크 독소로 지칭되는 농축된 클로스트리디움 독소를 수득하도록 가공된다.
한 가지 이상의 동물 유래 산물(예컨대 젖 소화 카제인, DNase 및 RNase)을 사용하여 벌크 클로스트리디움 독소를 수득하기 위한 발효 및 정제 공정이 공지이다. 보툴리눔 독소 복합체를 수득하기 위한 이러한 공지의 비-동물 산물이 없는 (non-animal product free, "NAPF") 공정의 예는 Schantz 공정 및 이의 변형이다. Schantz 공정(초기의 도말, 세포 배양으로부터 발효 및 독소 정제까지)은 예를 들어 배양 바이알 중의 동물 유래의 박토 조리 고기 배지(Bacto Cooked Meat medium), 콜로니 성장 및 선택을 위한 콜롬비아 혈액 한천 플레이트, 및 발효 배지 중의 카제인과 같은 다수의 동물 공급원 유래 산물을 사용한다. 추가적으로, Schantz 벌크 독소 정제 공정은 독소 함유 발효 배지에 존재하는 핵산을 가수분해하기 위하여 소 원천의 DNase 및 RNase를 사용한다. API를 수득하기 위한 공정에서 및/또는 이러한 API를 사용하여 약제학적 조성물을 제조(조합)하기 위한 공정에서 동물 산물이 사용될 경우 바이러스성 및 전염성 해면형 뇌증(transmissible spongiform encephalopathy, TSE), 예컨대 소 해면형 뇌증(bovine spongiform encephalopathy, BSE) 오염에 대한 잠재성에 관하여 우려가 나타났다.
감소된 양의 동물-유래 산물을 사용하는, 파상풍 유독소를 수득하기 위한 발효 공정(동물 산물이 없는 또는 "APF" 발효 공정으로 지칭됨; APF는 동물 단백질 없는을 포괄함)이 공지이고, 예를 들어 미국 특허 제6,558,926호를 참조하라. 클로스트리디움 독소를 수득하기 위한 APF 발효 공정은, 얻어진 벌크 독소가 바이러스, 프리온 또는 다른 원하지 않는 성분으로써 오염되고, 벌크 독소가 인간에게 투여하기 위한 약제학적 조성물에 조합됨에 따라 바이러스, 프리온 또는 다른 원하지 않는 성분이 이후 활성 약제학적 성분인 클로스트리디움 독소에 동반할 수 있는 가능성을 낮추는 (이미 매우 낮음) 잠재적인 장점을 가진다.
예를 들어 컬럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피가 단백질, 핵산, 세포 파편 등의 혼합물로부터 특정 단백질(예컨대 보툴리눔 신경독소)을 분리하기 위하여 분획화(fractionation) 또는 정제로 공지인 공정에서 사용될 수 있다. 단백질 혼합물은 전형적으로, 예를 들어 흔히 다공성인 고체 매질(흔히 비드 또는 수지로 지칭됨)을 포함하는 유리 또는 플라스틱 컬럼을 통과한다. 상이한 단백질들 및 다른 화합물들은, 이들의 특이적인 화학적 특징 및 이러한 특징들이 이용되는 특정 크로마토그래피 매질과 상호작용하도록 야기하는 방식에 따라, 상이한 속도로 매트릭스를 통과한다.
매질의 선택은 단백질의 분획화가 기초하는 화학적 특징의 유형을 결정한다. 네 가지 기본적 유형의 컬럼 크로마토그래피가 있다; 이온-교환, 겔 여과, 친화성 및 소수성 상호작용. 이온-교환 크로마토그래피는 양전하 또는 음전하를 보유하는 소형 비드로 패킹(packing)된 컬럼을 사용하여 표면 정전기적 전하에 기초한 분획화를 수행한다. 겔 여과 크로마토그래피에서, 단백질은 크기에 기초하여 분획화된다. 친화성 크로마토그래피에서, 단백질은 컬럼 매트릭스의 비드에 부착된 특이적 화학 그룹(리간드)에 결합하는 능력에 기초하여 분리된다. 리간드는 표적 단백질에 대하여 생물학적으로 특이적일 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피는 표면 소수성에 기초하여 분획화를 수행한다.
클로스트리디움 독소를 정제(분획화)하기 위한 컬럼 크로마토그래피가 공지이다. 예를 들어 다음 간행물을 참조하라:
1. Ozutsumi K., et al, Rapid , simplified method for production and purification of tetanus toxin, App & Environ Micro, Apr. 1985, p 939-943, vol 49, no. 4.(1985)는 파상풍 독소를 정제하기 위한 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 겔 여과의 사용을 개시한다.
2. Schmidt J.J., et al., Purification of type E botulinum neurotoxin by high-performance ion exchange chromatography , Anal Biochem 1986 Jul;156(1):213-219는 보툴리눔 독소 E형을 정제하기 위한 크기 배제 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피의 사용을 개시한다. 리보뉴클리에이즈(RNase) 대신 황산프로타민의 사용이 또한 개시된다.
3. Simpson L.L., et al., Isolation and characterization of the botulinum neurotoxins Simpson LL ; Schmidt JJ ; Middlebrook JL , In: Harsman S, ed. Method in Enzymology. Vol. 165, Microbial Toxins: Tools in Enzymology San Diego, CA: Academic Press;vol 165:pages 76-85 (1988)은 중력 흐름 크로마토그래피를 사용한 보툴리눔 신경독소의 정제, HPLC, 친화성 수지를 사용한 포획 단계, 크기 배제 크로마토그래피, 및 두 가지의 상이한 이온 교환 컬럼의 사용을 포함하는 이온 (음이온 및 양이온) 교환 크로마토그래피를 개시한다. 다양한 Sephadex, Sephacel, Trisacryl, S 및 Q 컬럼이 개시된다.
4. Zhou L., et al., Expression and purification of the light chain of botulinum neurotoxin A: A single mutation abolishes its cleavage of SNAP -25 and neurotoxicity after reconstitution with the heavy chain , Biochemistry 1995;34(46):15175-81 (1995)는 보툴리눔 신경독소 경사슬 융합 단백질을 정제하기 위한 아밀로오스 친화성 컬럼의 사용을 개시한다.
5. Kannan K., et al., Methods development for the biochemical assessment of Neurobloc ( botulinum toxin type B), Mov Disord 2000;15(Suppl 2):20 (2000)는 보툴리눔 독소 B 형을 검사하기 위한 크기 배제 크로마토그래피의 사용을 개시한다.
6. Wang Y-c, The preparation and quality of botulinum toxin type A for injection ( BTXA ) and its clinical use , Dermatol Las Faci Cosm Surg 2002;58 (2002)는 보툴리눔 독소 A 형을 정제하기 위한 이온 교환 크로마토그래피를 개시한다. 이 참조문헌은 침전과 크로마토그래피 기법의 조합을 개시한다.
7. Johnson S.K., et al., Scale - up of the fermentation and purification of the recombination heavy chain fragment C of botulinum neurotoxin serotype F, expressed in Pichia pastoris , Protein Expr and Purif 2003;32:1-9 (2003)은 보툴리눔 독소 F 형의 재조합 중사슬 단편을 정제하기 위한 이온 교환 및 소수성 상호작용 컬럼의 사용을 개시한다.
8. 공개된 미국 특허 출원 제2003 0008367 A1호(Oguma)는 보툴리눔 독소를 정제하기 위한 이온 교환 및 락토오스 컬럼의 사용을 개시한다.
상기 요약된 정제 방법은 전체 900 kDa 보툴리눔 독소 복합체의 정제와는 대조적인, 복합체의 보툴리눔 독소의 신경독성 성분(즉, 대략 150 kDa 신경독성 분자), 또는 신경독성 성분의 특정 성분의 소규모 정제에 관한 것이다.
더욱이, 보툴리눔 독소 약제학적 조성물에 조합하기에 적절한 보툴리눔 독소를 수득하기 위한 상업적 규모 공정을 포함하는 현존 공정은, 발효 공정의 보툴리눔 독소에 동반하는 불순물로부터 독소 복합체를 분리하기 위한 일련의 침전 단계를 전형적으로 포함한다. 특히, 침전 기법은 보툴리눔 독소를 정제하기 위하여 생물약제학적 산업에서 널리 사용된다. 예를 들어, 냉각 알코올 분획화 (Cohn 방법) 또는 침전이 혈장 단백질 제거에 사용된다. 불행하게도, 보툴리눔 독소를 정제하기 위한 이전의 침전 기법은 낮은 분해능, 낮은 생산성, 조업의 어려움, 제어 및/또는 허가의 어려움 및/또는 규모 확대 또는 규모 축소의 어려움의 단점을 가진다. 이전에 공개된 공개일 2006년 10월 12일의 미국 특허 출원번호 제11/452,570호는 다양한 동물-단백질이 없는 및 NAPF 공정에서 이용되는 원심분리, 산 침전, 에탄올 침전, 산성화 단계, 및 황산암모늄 침전과 같은 단계를 개시한다 (상세한 논의에 대하여, 미국 특허 공개공보 제2006/0228780호 참조, 전체가 본 명세서에 참조로 포함됨). 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 동물 단백질이 없는 공정과 비-동물 단백질이 없는 공정 사이의 몇 가지 차이점이 상기 문헌에 나타난다.
그러므로 연구 목적을 위하여 및/또는 약제학적 조성물을 제조하기 위하여 사용될 수 있는 고순도의 매우 강력한 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한, 신속하고 상대적으로 더 작은 규모이지만 고수율인 시스템 및 공정이 요구된다.
요약
본 발명은 이러한 요구를 충족시키며, 신속하고, 더 작은 규모이고, 상업적으로 유용하고, 고수율이며, 동물 단백질이 없는 크로마토그래피 시스템 및 공정에 의하여 수득 가능한 고순도의 매우 강력한 보툴리눔 신경독소를 제공한다. 생성된 보툴리눔 신경독소는 약제학적 조성물 제조에 유용하다. 본 발명의 실시에 의하여 수득된 클로스트리디움 독소는 바람직하게는 보툴리눔 신경독소이고 가장 바람직하게는 약 900 kDa의 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체 또는 이의 150 kDa 신경독성 성분이다. 본 발명은 DNase 및 RNase와 같은 NAPF 시약을 필요로 하지 않는다.
정의
본 명세서에서 사용된 다음 단어 및 용어는 다음 정의를 가진다.
"약"은 한정된 항목, 파라미터 또는 용어가 명시된 항목, 파라미터 또는 용어의 값 위 및 아래의 플러스 또는 마이너스 십 퍼센트 범위를 포괄함을 의미한다.
"투여" 또는 "투여하다"는 약제학적 조성물 또는 활성 성분을 대상에게 제공(즉 투여)하는 단계를 의미한다. 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 예를 들어 근육내 (i.m.), 진피내, 피하 투여, 경막내 투여, 두개내, 복강내 (i.p.) 투여, 국소 (경피) 및 이식 (즉 고분자 임플란트 또는 소형삼투압 펌프와 같은 서방 장치의 이식) 투여 경로에 의하여 "국지적으로 투여된다".
"동물 산물이 없는" 또는 "실질적으로 동물 산물이 없는"은 각각 "동물 단백질이 없는" 또는 "실질적으로 동물 단백질이 없는"을 포괄하고, 혈액 유래, 혈액 풀드(blood pooled) 및 다른 동물 유래 산물 또는 화합물의 부재 또는 실질적인 부재를 의미한다. "동물"은 포유류 (예컨대 인간), 조류, 파충류, 어류, 곤충, 거미 또는 다른 동물 종을 의미한다. "동물"은 박테리아와 같은 미생물을 배제한다. 따라서, 본 발명의 범위 내의APF 배지 또는 공정 또는 실질적으로 APF 배지 또는 공정은 보툴리눔 독소 또는 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 포함할 수 있다. 예를 들어, APF 공정 또는 실질적으로 APF 공정은 면역글로불린, 고기 소화물(digest), 고기 부산물 및 젖 또는 유제품 또는 소화물과 같은 동물-유래 단백질이 실질적으로 없거나 본질적으로 없거나 완전히 없는 공정을 의미한다.
"보툴리눔 독소" 또는 "보툴리눔 신경독소는 클로스트리디움 보툴리눔에 의하여 생성된 신경독소 뿐만 아니라 변형, 재조합, 하이브리드 및 키메라 보툴리눔 독소를 의미한다. 재조합 보툴리눔 독소는 비-클로스트리디움 종에 의하여 재조합으로 제조된 경사슬 및/또는 중사슬을 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "보툴리눔 독소"는 보툴리눔 독소 혈청형 A, B, C, D, E, F 및 G를 포괄한다. 본 명세서에서 사용된 "보툴리눔 독소"는 또한 보툴리눔 독소 복합체(즉 300, 600 및 900 kDa 복합체) 뿐만 아니라 순수 보툴리눔 독소(즉 약 150 kDa 신경독성 분자) 두 가지 모두를 포괄하고, 이들 모두 본 발명의 실시에서 유용하다. "정제된 보툴리눔 독소"는 보툴리눔 독소가 배양 또는 발효 공정으로부터 수득될 때 보툴리눔 독소에 동반할 수 있는 다른 단백질 및 불순물로부터 분리되거나 실질적으로 분리된 순수 보툴리눔 독소 또는 보툴리눔 독소 복합체를 의미한다. 따라서, 정제된 보툴리눔 독소는 최소한 90%, 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 비-보툴리눔 독소 단백질을 가질 수 있고 불순물이 제거된다. 신경독소가 아닌 보툴리눔 C2 및 C3 세포독소는 본 발명의 범위로부터 배제된다.
"클로스트리디움 신경독소"는 클로스트리디움 보툴리눔, 클로스트리디움 부티리쿰 또는 클로스트리디움 베라티와 같은 클로스트리디움 박테리아 원산이거나 이로부터 생성된 신경 독소 뿐만 아니라 비-클로스트리디움 종에 의하여 재조합으로 제조된 클로스트리디움 신경독소를 의미한다.
"완전히 없는"(용어 "구성되는")은 사용되는 장비 또는 공정의 검출 범위 내에서, 물질이 검출될 수 없거나 물질의 존재가 확인될 수 없음을 의미한다.
"본질적으로 없는"(또는 "본질적으로 구성되는"')은 단지 미량의 물질만이 검출될 수 있음을 의미한다.
"변형된 보툴리눔 독소"는 천연 보툴리눔 독소와 비교하여 아미노산 중 최소한 하나가 결손되거나, 변형되거나, 치환된 보툴리눔 독소를 의미한다. 또한, 변형된 보툴리눔 독소는 재조합으로 생성된 신경독소, 또는 재조합으로 제조된 신경독소의 유도체 또는 단편일 수 있다. 변형된 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 수용체에 결합하는 능력, 또는 뉴런으로부터 방출된 신경전달물질을 억제하는 능력과 같은 천연 보툴리눔 독소의 생물학적 활성 중 최소한 한 가지를 보유한다. 변형된 보툴리눔 독소의 한 예는 한 보툴리눔 독소 혈청형(예컨대 혈청형 A)의 경사슬, 및 다른 상이한 보툴리눔 독소 혈청형(예컨대 혈청형 B)의 중사슬을 가지는 보툴리눔 독소이다. 변형된 보툴리눔 독소의 또 다른 예는 물질 P(substance P)와 같은 신경전달물질에 결합된 보툴리눔 독소이다.
"약제학적 조성물"은 활성 성분이 보툴리눔 독소일 수 있는 제제를 의미한다. 단어 "제제(formulation)"는 약제학적 조성물에 보툴리눔 신경독소 활성 성분 이외에 최소한 한 가지의 추가적인 성분(예컨대, 알부민 [예컨대 인간 혈청 알부민 또는 재조합 인간 알부민] 및/또는 염화나트륨, 예를 든 것이고 이에 제한되지 않음)이 존재함을 의미한다. 그러므로 약제학적 조성물은 인간 환자와 같은 대상에게 진단, 치료 또는 미용을 위하여 (예를 들어 근육내 또는 피하 주사에 의하여 또는 데포(depot) 또는 임플란트의 삽입에 의하여) 투여하기 적절한 제제이다. 약제학적 조성물은 예를 들어 동결건조되거나 진공건조된 상태, 동결건조되거나 진공건조된 약제학적 조성물을 식염수 또는 물로써 복원한 후 형성된 용액 또는; 복원을 필요로 하지 않는 용액일 수 있다. 활성 성분은 보툴리눔 독소 혈청형 A, B, C1, D, E, F 또는 G 중 하나 또는 클로스트리디움 박테리아에 의하여 천연으로 제조될 수 있는 모든 보툴리눔 독소일 수 있다. 언급된 바와 같이, 약제학적 조성물은 액체 또는 고체일 수 있고, 예를 들어 진공-건조될 수 있다. 보툴리눔 독소 활성 성분 약제학적 조성물을 제제화하기 위한 대표적인 방법은 2002년 11월 5일에 공개된 미국 특허 공개공보 제20030118598호에 개시되고, 이는 본 명세서에 전체가 참조로 포함된다.
"실질적으로 없는"은 물질(예컨대 동물 산물, 동물 단백질 또는 동물 유래 산물 또는 단백질)의 중량 퍼센트가 평가되는 배양 배지, 발효 배지, 약제학적 조성물 또는 다른 원료의 1 중량 퍼센트 미만의 수준으로 존재함을 의미한다.
"치료 제제"는 제제가 장애 또는 질환 및/또는 이에 관련된 증상, 예컨대 말초 근육 또는 샘(예를 들어 땀샘)의 과활동(예를 들어 강직)을 특징으로 하는 장애 또는 질환을 치료하고 이에 의하여 경감시키기 위하여 사용될 수 있음을 의미한다.
"치료적 유효량"은 현저한 부정적 또는 역의 부작용을 야기하지 않고 질환, 장애 또는 용태를 치료하기 위하여 필요한 (예를 들어 보툴리눔 독소 또는 보툴리눔 독소 포함 약제학적 조성물과 같은) 약제의 수준, 양 또는 농도를 의미한다.
"치료하다", "치료하는", 또는 "치료"는 예컨대 상처입거나 손상된 조직의 회복에 의하여, 또는 현존하거나 인지된 질환, 장애 또는 용태의 변경, 변화, 향상, 개선, 호전 및/또는 미화에 의하여, 원하는 치료적 또는 미용적 결과를 성취하도록 하는, 둔부 변형과 같은 질환, 장애 또는 용태의 경감 또는 감소(이는 약간의 감소, 상당한 감소, 거의 완전한 감소, 및 완전한 감소를 포함함), 소산 또는 예방(일시적 또는 영구적)을 의미한다. 보툴리눔 신경독소의 투여의 경감 효과와 같은 치료 효과가 예를 들어 환자에게 보툴리눔 신경독소를 투여한 후 1 내지 7 일 사이에 임상적으로 나타나지 않을 수 있고, 예를 들어 치료되는 용태 또는 특정 사례에 따라 약 1 개월 내지 약 1 년 또는 그 사이의 임의의 시간 범위의 유효 기간을 가질 수 있다.
퍼센티지는 달리 명시되지 않으면 부피당 중량 기준이다.
APF는 동물 산물/단백질이 없는(animal product/protein free)을 의미하고
CV는 컬럼 부피(column volume)를 의미하고
DF는 정용여과(diafiltration)를 의미하고
ELISA는 효소-결합 면역흡수 검사(enzyme-linked immunosorbent assay)를 의미한다.
"IAPF 시스템" 또는 "IAPF 공정"에서와 같은 IAPF는 "개선된 동물 단백질이 없는(improved animal protein free)" 시스템 또는 공정을 의미한다. IAPF 시스템 또는 공정은 본 명세서에 구체적으로 기재된 바와 같이 보툴리눔 독소 또는 신경독소 성분을 정제하기 위한 두 가지의 크로마토그래피 매질 또는 세 가지의 크로마토그래피 매질의 사용을 포함한다. 크로마토그래피 매질은 당해 분야에 공지된 크로마토그래피 수지를 포함한다. 두 가지의 크로마토그래피 매질의 사용에 의하여 수득된 보툴리눔 신경독소 배치(batch)는 본 명세서에서 IAPF로 명시된다.
"FAPF 시스템" 또는 "FAPF 공정"에서와 같은 FAPF는 "더욱 개선된 동물 단백질이 없는(further improved animal protein free)" 시스템 또는 공정을 의미한다. 따라서, FAPF는 IAPF 공정이며, FAPF 시스템 또는 공정은 보툴리눔 독소 또는 신경독소 성분을 정제하기 위하여 세 가지의 크로마토그래피 매질이 사용됨을 의미한다. 세 가지의 크로마토그래피 매질의 사용에 의하여 수득된 보툴리눔 신경독소의 배치는 본 명세서에서 FAPF로 명시된다.
NAPF는 비-동물 단백질이 없는(non-animal protein free)을 의미하고
SDS-PAGE는 소듐 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis)을 의미하고
SEC-HPLC는 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(size exclusion high performance liquid chromatography)를 의미하고
UF는 한외여과(ultrafiltration)를 의미한다.
본 발명의 한 구체예에서, 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 실질적으로 APF 크로마토그래피 공정이 제공되고, 상기 공정은 다음의 (a) 실질적으로 APF 발효 배지를 제공하는 단계; (b) 발효 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 발효시키는 단계, 및; (c) 발효 배지를 음이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키고 이어서 음이온 교환 크로마토그래피 매질에서 나온 용리액을 양이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시켜 발효 배지로부터 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 회수하는 단계를 포함하고, 이에 의하여 실질적으로 APF 크로마토그래피 공정으로부터 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득한다. 특정 구체예에서, 공정은 수득된 보툴리눔 신경독소의 각 밀리그램에 대하여 1 나노그램 이하의 잔류 핵산인, 1 백만분율 (ppm) 미만의 잔류 핵산을 포함하는 보툴리눔 신경독소를 제공할 수 있다. 또 다른 양태에서, 공정은 1 주일 이내에 수행된다.
한 예에서, 3:1:1의 비율을 가지는 배지는 3% HySoy, 1% HyYeast, 및 1% 글루코오스를 포함하는 보툴리눔 독소 배양/발효 배지를 의미한다. HySoy(Quest 제품번호 5X59022)는 대두의 효소적 가수분해에 의하여 제조된 펩타이드 공급원이다. HyYeast(HyYest, Quest 제품번호 5Z10102 또는 5Z10313)는 제빵 효모 추출물이다. 또 다른 예에서, 5:1:1의 비율을 가지는 배지는 5% HySoy, 1% HyYeast, 및 1% 글루코오스를 포함하는 보툴리눔 독소 배양/발효 배지를 의미한다.
또 다른 구체예가 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체를 수득하기 위한 실질적으로 APF 크로마토그래피 공정을 제공하고, 상기 공정은 다음의 순차적인 실질적으로 APF 배양 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 배양하는 단계; 약 2 L 내지 약 75 L의 실질적으로 APF 발효 배지에서, 더욱 바람직하게는 약 2 L 내지 약 50 L의 실질적으로 APF 발효 배지에서, 더욱더 바람직하게는 약 2 L 내지 약 30 L의 실질적으로 APF 발효 배지에서 배양 배지로부터의 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 발효시키는 단계 (특정 구체예가 식물 단백질 및/또는 식물 단백질 유도체, 예를 들어 가수분해된 식물 단백질을 포함하는 배양 배지 및 발효 배지 중 최소한 하나를 가짐); 여과 또는 원심분리를 이용하여 발효 배지에 존재하는 세포 파편을 제거하여 발효 배지를 수확하는 단계; 예를 들어 한외여과(UF)와 같은 여과에 의하여 수확 발효 배지를 농축하는 단계; 완충제를 첨가하여 농축된 발효 배지를 희석하는 단계를 포함한다. 완충제로 희석한 후, 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소가 음이온 교환 매질에 의하여 포획되도록, 희석된 수확 발효 배지가 음이온 교환 매질과 접촉되는 제1 접촉 단계가 착수되고; 이어서 포획된 보툴리눔 신경독소를 음이온 교환 매질로부터 용리하여 이에 의하여 보툴리눔 독소를 포함하는 제1 용리액을 수득하고; 제1 용리액으로부터 불순물을 제거하기 위하여, 제1 용리액이 양이온 교환 매질과 접촉되는 제2 접촉 단계를 수행하고, 이에 의하여 보툴리눔 독소를 포함하는 제2 용리액을 수득하고; 이어서 정용여과(DF)에 의하여 제2 용리액을 가공하고; 가공된 제2 용리액을 여과하여, 이에 의하여 실질적으로 APF 크로마토그래피 공정을 이용하여 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체를 수득한다. 수득된 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체는 약 2.0 x 107 유닛/mg 내지 약 6.0 x 107 유닛/mg의 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체 역가를 가질 수 있다. 특정 예에서, 예를 들어 약 2.4 x 107 유닛/mg 내지 약 5.9 x 107 유닛/mg의 역가를 가지는 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체가 수득될 수 있다.
특정 구체예에서, 상기 공정은 약 5% w/v 이하의 식물-유래 단백질 산물, 약 2% w/v 이하의 효모 추출물 및 약 2% 이하의 w/v 글루코오스를 포함하는 발효 배지를 이용하고, 여기서 발효 배지의 pH 수준은 발효 단계 시작 시 약 6.5 내지 약 pH 8.0, 더욱 바람직하게는 약 pH 6.8 내지 약 pH 7.6이다. 특정 구체예에서, 배양 단계는 약 540 나노미터(nm)에서 배양 배지의 광학 밀도가 약 0.8 흡광 단위 (AU) 내지 약 4.5 AU일 때까지 수행된다. 배양 단계는 바람직하게는 클로스트리디움 보툴리눔 APF 제조용 세포 은행(working cell bank) 내용물을 배양 배지에 도입하여 개시되고, 여기서 제조용 세포 은행 내용물은 제조용 세포 은행 밀리리터당 최소한 약 1 x 104 콜로니형성수(colony-forming unit), 바람직하게는 약 1 x 104 내지 약 5 x 107 콜로니형성수의 클로스트리디움 보툴리눔을 포함하고, 제조용 세포 은행 중의 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아는 실질적으로 균일한 형태를 가진다. 또 다른 구체예에서, 발효 단계는 약 890 nm에서 발효 배지의 광학 밀도가 약 0.05 AU 내지 약 0.7 AU로 감소될 때까지, 약 60 내지 80 시간 동안 수행된다. 한 양태에서, 실질적으로 APF 크로마토그래피 공정에 의하여 수득된 보툴리눔 신경독소는 1 ppm 미만의 잔류 핵산을 포함하고, 공정은 1 주일 이내에 수행된다.
또 다른 구체예에서, 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위하여 크로마토그래피를 이용하는 APF 공정이 제공되고, 상기 공정은 다음의 순차적인: (a) APF 제조용 세포 은행으로부터의 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 APF 배양 배지에 첨가하는 단계; (b) 배양 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 배양하는 단계; (c) 클로스트리디움 보툴리눔 세포 용해가 일어날 때까지 APF 발효 배지에서 단계 (b)로부터의 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 발효시키는 단계; (d) 발효 배양물을 수확하여 수확 발효 배지를 제공하는 단계; (e) 수확 발효 배지가 여과에 의한 농축을 거치는 단계; (f) 완충제를 첨가하여 여과된 발효 배지를 희석하여 희석된 발효 배지를 수득하는 단계; (g) 희석된 발효 배지가 포획 크로마토그래피 매질과 접촉되는 제1 접촉 단계, 여기서 포획 크로마토그래피 매질은 음이온 교환 매질임; (h) 제1 접촉 단계의 용리액이 폴리싱(polishing) 크로마토그래피 매질과 접촉되는 제2 접촉 단계, 여기서 폴리싱 크로마토그래피 매질은 양이온 교환 매질임, 및 (i) 제2 접촉 단계의 용리액을 여과하는 단계를 포함하고, 이에 의하여 개선된 APF 공정에 의하여 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득하고, 여기서 수득된 보툴리눔 신경독소는 1 ppm의 잔류 핵산 또는 1 ppm 미만의 잔류 핵산을 포함하고, 공정은 1 주일 이내에 수행된다.
한 양태에서, 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 실질적으로 동물 산물이 없는(APF) 크로마토그래피 시스템이 제공되고, 이는 실질적으로 APF 발효 배지, 발효 배지에서 발효시키기 위한 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아, 발효 배지로부터 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 회수하기 위한 음이온 교환 크로마토그래피 매질, 및 음이온 교환 크로마토그래피 매질에서 나온 용리액으로부터 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 추가로 회수하기 위한 양이온 교환 크로마토그래피 매질을 포함하고, 이에 의하여 실질적으로 APF 크로마토그래피 공정으로부터 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득한다. 특정 구성에서, 시스템은 실질적으로 APF 배양 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 혐기성으로 배양하기 위한 제1 장치를 추가로 포함할 수 있고, 실질적으로 APF 발효 배지에서 제1 장치로부터 수득된 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 혐기성으로 발효시키기 위한 제2 장치로 추가로 이루어질 수 있다. 정화를 위하여, 시스템은 제2 장치로부터 수득된 발효 배지로부터 세포 파편을 제거하여, 이에 의하여 수확 발효 배지를 제공하는 수확 장치를 포함할 수 있다. 수확 발효 배지는 수확 발효 배지를 농축시킨 다음 희석시키는 농축 및 희석 장치를 통과할 수 있다. 특정 예에서, 시스템은 또한 양이온 교환 크로마토그래피 매질에서 나온 용리액으로부터 추가로 정제된 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 회수하기 위한 소수성 상호작용 매질을 포함할 수 있다. 추가적으로, 수득된 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소 중 생물부하(bioburden)를 감소시키기 위한 여과 장치가 또한 2 또는 3 크로마토그래피 매질을 이용하여 수득된 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소의 생물부하를 감소시키기 위한 시스템을 이룰 수 있다. 특정 예에서, 실질적으로 APF 배양 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 배양하기 위한, 작업 공간 내에 집적된 고효율 미립자 공기 필터를 가지는 혐기성 챔버가 사용될 수 있다. 대표적인 시스템은 최소한 약 2.0 x 107 유닛/mg의 보툴리눔 신경독소 역가를 가지는 보툴리눔 신경독소를 제공할 수 있고, 수득된 보툴리눔 신경독소는 수득된 보툴리눔 신경독소의 각 mg에 대하여 1 ng 또는 1 ng 미만의 잔류 핵산을 포함한다. 특정 구체예에서, 실질적으로 APF 발효 배지가 약 2 L 내지 약 75 L의 양으로 제공되고; 약 200 mL 내지 약 1 L의 실질적으로 APF 배양 배지가 이용된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위하여 크로마토그래피를 이용하는 실질적으로 APF 시스템이 제공되고, 시스템은 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 배양하기 위한 제1 장치(제1 장치는 실질적으로 APF 배양 배지를 포함할 수 있음); 제1 장치에서 배양된 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 발효시키기 위한 제2 장치(제2 장치는 실질적으로 APF 발효 배지를 포함할 수 있음); 발효 배지를 수확하기 위한 제3 장치; 수확 발효 배지를 농축하고 여과된 발효 배지를 희석하기 위한 제4 장치; 수확된 배지로부터 보툴리눔 신경독소의 제1 정제를 수행하여, 이에 의하여 제1 정제된 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 제5 장치(여기서 제5 장치는 음이온 교환 크로마토그래피 매질을 포함함); 및 보툴리눔 신경독소의 제2 정제를 수행하여, 이에 의하여 제2 정제된 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 제6 장치(여기서 제6 장치는 양이온 교환 크로마토그래피 매질을 포함함)을 포함하고, 여기서 수득된 보툴리눔 신경독소는 최소한 약 2.0 x 107 유닛/mg의 보툴리눔 신경독소 내지 약 5.9 x 107 유닛/mg의 보툴리눔 신경독소 역가를 가지고, 수득된 보툴리눔 신경독소는 수득된 보툴리눔 신경독소 각 mg에 대하여 1 ng 또는 1 ng 미만의 잔류 핵산을 포함하고, 공정은 1 주일 이내에 수행된다. 특정 구체예에서, 수득된 보툴리눔 신경독소는 최소한 4.4 x 107 유닛/mg의 보툴리눔 신경독소 역가를 가질 수 있다. 시스템의 특정 구체예에서, 시스템은 제6 장치로부터 수득된 보툴리눔 신경독소의 추가의 정제를 수행하여, 이에 의하여 제3 정제된 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 제7 장치를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 제7 장치는 소수성 상호작용 매질을 포함한다. 추가적인 구체예에서, 시스템은 제7 장치에서 나온 용리액을 여과하기 위한 막을 포함하는 제8 장치를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 실질적으로 APF 크로마토그래피 시스템을 포함하고, 상기 시스템은 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 혐기성 배양하기 위한 제1 장치(제1 장치는 약 200 mL 내지 약 1 L의 실질적으로 APF 배양 배지를 포함할 수 있음); 제1 장치를 수용할 수 있는 챔버 내에 집적된 고효율 미립자 공기 필터를 가지는 혐기성 챔버를 포함하는 제2 장치; 제1 장치에서 배양된 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아의 혐기성 발효를 위한 제3 장치(제3 장치는 약 2 L 내지 약 75 L의 실질적으로 APF 발효 배지, 바람직하게는 약 2 L 내지 약 30 L의 실질적으로 APF 발효 배지를 포함할 수 있고, 환원-산화 탐침, pH 탐침 및 탁도 탐침으로 이루어진 군에서 선택되는 최소한 하나의 일회용 탐침을 포함할 수 있음); 발효 배지를 수확하기 위한 제4 장치; 수확 발효 배지를 농축하고 여과된 발효 배지를 희석하기 위한 제5 장치; 수확 발효 배지로부터 수득된 보툴리눔 신경독소의 제1 정제를 수행하여, 이에 의하여 제1 정제된 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 제6 장치(제6 장치는 음이온 교환 크로마토그래피 매질을 포함함); 보툴리눔 신경독소의 제2 정제를 수행하여, 이에 의하여 제2 정제된 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 제7 장치(제7 장치는 양이온 교환 크로마토그래피 매질을 포함함); 제2 정제된 보툴리눔 신경독소의 제3 정제를 수행하여 제3 정제된 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 제8 장치(제8 장치는 소수성 상호작용 매질을 포함함); 및 제3 정제된 보툴리눔 신경독소를 여과하기 위한 제9 장치(제9 장치는 여과막을 포함함)를 포함하고, 여기서 수득된 보툴리눔 신경독소는 약 2.4 x 107 유닛/mg의 보툴리눔 신경독소 내지 약 5.9 x 107 유닛/mg의 보툴리눔 신경독소 역가를 가지고, 수득된 보툴리눔 신경독소는 수득된 보툴리눔 신경독소의 각 mg에 대하여 1 ng 또는 1 ng 미만의 잔류 핵산을 포함하고, 공정은 1 주일 이내에 수행된다. 이러한 공정에 따르면, 이에 의하여 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소가 수득되고, 특정 예에서, 수득된 보툴리눔 신경독소는 최소한 약 4.4 x 107 유닛/mg의 보툴리눔 신경독소의 역가를 가진다.
본 명세서에 개시된 공정 및 시스템에 따르면, 이에 의하여 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소가 수득된다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 개시된 공정 및 시스템에 의하여 수득된 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소는 약 900 kDa의 분자량을 가진다.
본 발명은 실질적으로 APF 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 추가로 포함하며, 여기서 활성 성분은 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소이고, 상기 방법은 다음의: (a) (i) 실질적으로 동물 산물이 없는 발효 배지를 제공하고; (ii) 발효 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 발효시키고; (iii) 음이온 교환 크로마토그래피 매질을 사용하고 이어서 양이온 교환 크로마토그래피 매질을 사용하여 발효 배지로부터 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 회수하여, 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득하는 단계, 여기서 회수된 보툴리눔 신경독소는 최소한 약 2.0 x 107 유닛/mg의 보툴리눔 신경독소, 바람직하게는 약 2.4 x 107 유닛/mg의 보툴리눔 신경독소 내지 약 5.9 x 107 유닛/mg의 보툴리눔 신경독소, 일부 구체예에서 최소한 약 4.4 x 107 유닛/mg의 보툴리눔 신경독소 역가를 가지고, 보툴리눔 신경독소는 보툴리눔 신경독소의 각 mg에 대하여 1 ng 또는 1 ng 미만의 잔류 핵산을 포함하고, 단계 (i) 내지 (iii)는 1 주일 이내에 완료됨; (b) 보툴리눔 신경독소를 최소한 한 가지의 적절한 부형제와 조합하는 단계를 포함하고, 이에 의하여 실질적으로 APF 약제학적 조성물을 제조한다. 특정 구체예에서, 조합 단계는 냉동건조(freeze drying), 동결건조(lyophilization) 및 진공건조(vacuum drying)로 이루어진 공정의 군에서 선택된 공정에 의하여 보툴리눔 신경독소를 건조하는 단계를 포함하고, 여기서 적절한 부형제가 알부민, 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 혈청 알부민, 젤라틴, 수크로오스, 트레할로오스, 하이드록시에틸 녹말, 콜라겐, 락토오스, 수크로오스 염화나트륨, 폴리사카라이드, 카프릴레이트, 폴리비닐피롤리돈 및 나트륨으로 이루어진 군에서 선택된다. 따라서, 한 양태에서 본 발명은 본 명세서에 개시된 공정 및 시스템에 의하여 수득된 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 조합하여 제조된 실질적으로 APF 약제학적 조성물을 또한 제공한다.
추가적으로, 본 발명은 환자의 용태를 치료하기 위한 방법을 또한 포함하고, 상기 방법은 활성 성분이 본 명세서에 개시된 APF 공정(즉 IAPF 및 FAPF 공정)에 의하여 수득된 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소인 실질적으로 APF 약제학적 조성물을 제조하기 위한 방법에 의하여 제조된 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 치료될 용태의 예는 예를 들어 두통, 편두통, 긴장성 두통, 부비동 두퉁, 경추성 두통, 발한 장애, 겨드랑이 다한증, 손 다한증, 발 다한증, 프레이 증후군, 과운동성 피부 주름(hyperkinetic skin line), 안면 주름, 미간 주름, 눈가 주름, 입가 주름, 코입술 주름, 피부 장애, 이완불능증, 사시, 만성 치열, 안검경련, 근골격 통증, 섬유근통, 췌장염, 빈맥, 전립선 비대, 전립선염, 요폐, 요실금, 과민성 방광, 반측안면 경련, 떨림, 근경련, 위장관 장애, 당뇨병, 타액과다증, 배뇨근-조임근 협동장애, 뇌졸중 후 강직, 상처 회복, 소아 뇌성마비, 평활근 경련, 재협착, 국소 근긴장이상, 간질, 경부 근긴장이상증, 갑상선 장애, 고칼슘혈증, 강박 장애, 관절염 통증, 레이노 증후군, 튼살, 복막 유착, 혈관경련, 콧물, 근육 경축, 부상 근유, 후두 근긴장이상, 필기 경련 및 수근관 증후군으로 이루어진 군에서 선택된다.
한 구체예에서, 환자의 용태를 치료하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 다음 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조된 유효량의 실질적으로 APF 약제학적 조성물을 환자에게 국지적으로 투여하는 단계를 포함한다: (a) (i) 동물 산물이 실질적으로 없는 발효 배지를 제공하고; (ii) 발효 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 발효시키고; (iii) 음이온 교환 크로마토그래피 매질을 사용하고 이어서 양이온 교환 크로마토그래피 매질을 사용하여 발효 배지로부터 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 회수하여, 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득하는 단계, 여기서 회수된 보툴리눔 신경독소는 최소한 약 2.0 x 107 유닛/mg의 보툴리눔 신경독소 역가를 가지고, 보툴리눔 신경독소는 보툴리눔 신경독소 각 mg에 대하여 1 ng 또는 1 ng 미만의 잔류 핵산을 포함하고, 단계 (i) 내지 (iii)는 1 주일 이내에 완료됨; (b) 보툴리눔 신경독소를 최소한 한 가지의 적절한 부형제와 조합하는 단계, 이에 의하여 실질적으로 APF 약제학적 조성물을 제조하고, 상기 방법에 의하여 실질적으로 APF 약제학적 조성물의 국지 투여가 용태를 치료한다.
본 명세서에 개시된 IAPF 공정/시스템/방법에 의하여 제공된 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 포함하는 치료적 유효량의 약제학적 조성물의 국지 투여가, 예를 들어 약 2 개월 내지 약 6 개월의 간격 또는 약 2 개월 내지 약 3 개월의 간격으로 반복될 수 있다. 본 개시에 따라 제조된 치료적 유효량의 실질적으로 APF 약제학적 조성물의 환자에게 국지적으로 투여되는 대표적인 유용한 투약량은 약 0.01 유닛 내지 약 10,000 유닛의 보툴리눔 신경독소 유닛 양을 가질 수 있다. 특정 예에서, 보툴리눔 신경독소가 약 0.01 유닛 내지 약 3000 유닛의 양으로 투여된다. 특정 예에서, 약제학적 조성물 중의 활성 약제학적 성분인 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소는 예를 들어 보툴리눔 신경독소 A 형 또는 B 형이다.
본 발명은 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위하여 크로마토그래피를 이용하는 실질적으로 APF 공정을 포함한다. 공정은 실질적으로 APF 발효 배지를 제공하는 단계, 이어서 발효 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 발효시키는 단계 및 음이온 교환 크로마토그래피 매질의 사용에 이어서 양이온 교환 크로마토그래피 매질을 사용하여 발효 배지로부터 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 회수하는 단계의 순차적인 단계를 포함할 수 있고, 이에 의하여 실질적으로 APF 크로마토그래피 공정으로부터 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득한다. 회수 단계는 또한 양이온 교환 크로마토그래피 매질의 사용 후 소수성 상호작용 매질의 사용을 포함할 수 있다. 수득된 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소는 보툴리눔 신경독소 복합체 또는 이로부터 분리된 약 150 kDa의 분자량을 가지고 보툴리눔 독소 복합체의 조합 단백질이 없는 보툴리눔 독소 신경독성 성분일 수 있다. APF 공정(2-컬럼 사용 (IAPF), 예를 들어 음이온 크로마토그래피에 이어 양이온 크로마토그래피; 또는 3-컬럼 사용 (FAPF), 예를 들어 음이온 크로마토그래피에 이어 양이온 크로마토그래피에 이어 소수성 상호작용 크로마토그래피)이 보툴리눔 신경독소 A, B, C1, D, E, F 및 G 형과 같은 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위하여 이용될 수 있다. 수득된 보툴리눔 신경독소는 바람직하게는 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체이다.
본 발명의 한 양태에서, 사용된 발효 배지의 양은 약 2 L 내지 약 75 L의 실질적으로 APF 발효 배지, 바람직하게는 약 2 L 내지 약 30 L의 실질적으로 APF 발효 배지를 포함할 수 있다. 예로서, 약 100 mg 내지 약 5 그램, 바람직하게는 약 100 mg 내지 약 3 그램, 더욱 바람직하게는 약 100 mg 내지 약 1 그램의 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소가 공정으로부터 수득된다. 예로서, 사용된 발효 배지 리터당 약 20 mg 내지 약 100 mg 또는 약 20 mg 내지 약 80 mg의 생물학적으로 활성인 신경독소가 수득될 수 있다. 발효 배지는 예를 들어 식물 유래 단백질 산물, 효모 추출물 및 글루코오스를 포함할 수 있다. 예로서, 발효 배지는 약 5% w/v 이하의 식물 유래 단백질 산물을 포함한다. 또 다른 예에서, 발효 배지는 약 2% w/v 이하의 효모 추출물을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 발효 배지는 약 2% w/v 이하의 글루코오스를 포함한다. 특정 예에서, 발효 배지는 약 5% w/v 이하의 식물-유래 단백질 산물, 약 2% w/v 이하의 효모 추출물 및 약 2% w/v 이하의 글루코오스를 포함하고, 식물-유래 단백질 산물, 효모 추출물 및 글루코오스는 언급된 w/v 퍼센티지 양에 따른 임의의 비율이다. 일부 구체예에서, 발효 단계는 약 60 시간 내지 약 80 시간 동안 진행된다.
한 구체예에서, 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위하여 크로마토그래피를 이용하는 실질적으로 APF 공정이 제공되고, 다음의 순차적인 실질적으로 APF 배양 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 배양하는 단계, 이후 약 2 L 내지 약 75 L의 실질적으로 APF 발효 배지에서, 더욱 바람직하게는 약 2 L 내지 약 30 L의 실질적으로 APF 발효 배지에서 배양 배지로부터의 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 발효시키는 단계, (여기서 실질적으로 APF 배양 배지 및 실질적으로 APF 발효 배지 중 최소한 하나는 식물 단백질을 포함함), 이어서 발효 배지에 존재하는 세포 파편을 제거하여 발효 배지를 수확하는 단계 및 여과에 의하여 수확 발효 배지를 농축하고 완충제를 첨가하여 농축된 발효 배지를 희석하는 단계를 포함한다. 일단 완충되면, 제1 접촉 단계가 실행되고, 여기서 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소가 이온 교환 매질과 결합되도록, 희석된 수확 발효 배지가 음이온 교환 매질과 접촉되고, 이후 음이온 교환 매질로부터의 포획된 보툴리눔 신경독소 용리가 진행되어, 이에 의하여 제1 용리액을 수득하고, 이어서 제2 접촉 단계가 실행되고, 여기서 제1 용리액으로부터 불순물을 제거하기 위하여 제1 용리액이 양이온 교환 매질과 접촉되고, 이에 의하여 제2 용리액을 수득하고; 이후 제2 용리액은 예컨대 UF 및/또는 DF에 의하여 가공되고; 이후 가공된 제2 용리액을 여과하고, 이에 의하여 크로마토그래피를 이용하는 실질적으로 APF 공정을 이용하여 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득한다.
예로서, 박테리아를 배양하는 것으로부터 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득하기까지의 공정을 완료하기 위한 시간은 예를 들어 약 50 시간 내지 약 150 시간, 더욱 바람직하게는 약 80 시간 내지 약 120 시간일 수 있다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 약 4% w/v 이하의 식물-유래 단백질 산물을 포함하고, 또 다른 예에서, 배양 배지는 약 2% w/v 이하의 효모 추출물을 포함하고, 또 다른 예에서 배양 배지는 약 2% w/v 이하의 글루코오스를 포함한다. 배양 배지는 언급된 w/v 퍼센티지 양에 따른 임의의 비율로 식물-유래 단백질 산물, 효모 추출물 및 글루코오스를 포함할 수 있다. 특정 예에서, 배양 배지의 pH 수준은 배양 단계의 시작 시 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.0, 바람직하게는 약 pH 6.8 내지 약 pH 7.6, 더욱 바람직하게는 7.3일 수 있다. 배양 단계는 혐기성 챔버에서 약 8 시간 내지 약 14 시간, 약 10 시간 내지 12 시간, 바람직하게는 약 11 시간 동안, 약 33 ℃ 내지 약 37 ℃, 바람직하게는 약 34.5 ℃의 온도에서 수행될 수 있다. 특정 예에서, 혐기성 챔버는 작업 공간 내에 집적된 고효율 미립자 필터를 포함할 수 있고, 여기서 배양이 수행된다. 발효 단계는 약 60 시간 내지 약 80 시간, 바람직하게는 약 72 시간 동안 약 33 ℃ 내지 약 37 ℃, 바람직하게는 35 ℃의 온도에서 수행될 수 있다. 본 발명의 한 양태에 따르면, 수확 단계는 발효 배지에 포함된 최소한 약 80%의 RNA 및 DNA를 제거할 수 있고, 음이온 교환 매질은 수확 발효 배지 중의 모든 측정 가능한 잔여 DNA 및 RNA(검출 한계 아래)를 제거할 수 있다. 또 다른 양태에서, 수확 단계는 약 1 시간 내지 약 3 시간, 바람직하게는 약 2.5 시간 동안 수행될 수 있다. 특정 예에서, 수확 단계는 원래 발효 배지 부피의75%가 수집될 때까지 수행될 수 있다. 구체예의 한 양태에서, 농축 단계는 약 30 분 내지 약 2 시간, 바람직하게는 약 0.75 시간 동안 수행될 수 있다. 또 다른 양태에서, 희석 단계는 수확 발효 배지를 수확 단계의 시작 시 발효 배지의 초기 중량까지 희석한다. 제1 접촉 단계는 예를 들어 약 4 시간 내지 약 5 시간 동안 수행될 수 있다. 한 예에서, 음이온 교환 수지로부터의 제1 용리액은 280 nm에서의 분광광도계 눈금이 정점으로부터 약 150 mAU로 감소할 때까지, 약 150 mAU 이상의 분광광도계 눈금에서 수집된다. 제2 접촉 단계는 1 시간 내지 약 3 시간, 바람직하게는 약 2 시간 동안 수행될 수 있다. 이 제2 용리액은 분광광도계 눈금이 정점으로부터 예를 들어 약 100 mAU로 감소할 때까지, 약 100 mAU 이상의 분광광도계 눈금에서 양이온 교환 수지로부터 수집될 수 있다. 농축 및 정용여과에 의한 이 제2 용리액 가공 단계는 약 1 시간 내지 약 2 시간, 바람직하게는 약 1.5 시간 동안 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 여과 단계는 제2 용리액을 생물부하 감소 필터를 통과시키는 것에 의한 생물부하 감소를 포함한다. 생물부하 감소 필터는 약 0.1 ㎛ 내지 약 0.3 ㎛, 바람직하게는 0.2 ㎛의 공극 크기를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, 공정은 제2 용리액으로부터 불순물을 추가로 제거하기 위하여 제2 용리액을 소수성 상호작용 매질에 접촉시키는 것에 의한 제2 접촉 단계 후의 제3 접촉 단계를 추가로 포함할 수 있고, 이에 의하여 제3 용리액을 수득한다. 이러한 제3 접촉 단계는 약 1 시간 내지 3 시간, 바람직하게는 약 2 시간 동안 수행될 수 있다. 제3 용리액은 분광광도계 눈금이 정점으로부터 예를 들어 약 50 mAU로 감소할 때까지, 약 50 mAU 이상의 분광광도계 눈금에서 소수성 상호작용 매질로부터 수집될 수 있다. 제3 접촉 단계가 존재하는 경우, 농축 및 정용여과에 의한 가공 단계가 제3 용리액에 적용되고 약 2 시간 내지 약 4 시간 동안 수행된다. 따라서 (이용된 2 또는 3-컬럼 공정으로부터) 농축되고 정용여과된 용리액을 생물부하 감소 필터에 통과시켜 생물부하 감소가 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 공정은 수득된 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 냉동하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 실질적으로 APF 배양 배지는 약 100 mL 내지 약 500 mL의 부피를 포함한다. 특정 배양 단계가 약 100 ㎕ 내지 약 500 ㎕의 클로스트리디움 보툴리눔-포함 APF 제조용 세포 은행 배지를 실질적으로 APF 배양 배지에 도입하여 개시된다. 이후 배양 단계가 혐기성 챔버에서 예를 들어 최소한 약 8 시간, 바람직하게는 약 11 시간 동안, 약 34.5 ℃ ± 1 ℃의 온도에서 일어날 수 있다. 한 예에서, 제조용 세포 은행 배지는 최소한 약 1 x 104 콜로니형성수/mL의 제조용 세포 은행 배지, 예를 들어 약 1 x 105 내지 약 5 x 107 콜로니형성수/mL의 제조용 세포 은행 배지의 생존 세포 계수 검사치를 가질 수 있고, 제조용 세포 은행 중의 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아는 실질적으로 균일한 형태를 가지도록 선택될 수 있다.
한 구체예에서, 제조용 세포 은행 배지는 예를 들어 약 20부피% 글리세롤, 예컨대 멸균 글리세롤을 포함한다. 제조용 세포 은행 배지는 (a) 약 540 nm의 파장에서 측정된 배지 분취물의 광학 밀도가 약 2.5 ± 1.0 AU가 될 때까지, 혐기성 챔버에서 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 약 2% w/v 대두 펩톤, 약 1% w/v 효모 추출물, 및 약 1% w/v 글루코오스를 포함하는 APF 배지에서 약 34.5 ℃ ± 1 ℃의 온도에서 성장시키고; 글리세롤을 첨가하여 약 20%의 배지 중 글리세롤 농도를 달성하여 제조될 수 있고, 이에 의하여 제조용 세포 은행을 수득한다. 제조용 세포 은행의 보관 형태는 예를 들어 약 -135 ℃ 아래에서 제조용 세포 은행을 냉동하여 제조될 수 있다. 본 개시에 따른 대표적인 공정에서 사용하기 위한 제조용 세포 은행의 보관 형태는 주위 온도에서 해동되어 배양 단계를 개시하기 위하여 사용될 수 있다.
배양 단계는 약 8 시간 내지 약 14 시간, 바람직하게는 약 11 시간 동안 약 33 ℃ 내지 약 37 ℃, 바람직하게는 약 34.5 ℃의 온도에서, 혐기성 챔버에서, 예를 들어 바람직하게는 작업 공간 내에 집적된 고효율 미립자 공기 (high efficiency particulate air, HEPA) 필터를 가지는 혐기성 챔버/캐비닛에서 수행될 수 있다. 발효 단계는 약 20 시간 내지 약 80 시간, 바람직하게는 약 60 시간 내지 약 80 시간, 더욱 바람직하게는 약 72 시간 동안 약 33 ℃ 내지 약 37 ℃, 바람직하게는 35 ℃의 온도에서 수행될 수 있다. 공정은, 예를 들어 배양 단계 전에, 혐기성 챔버의 대기에 배지를 노출시켜 실질적으로 APF 배양 배지의 산화적 환원(oxidative reduction)을 허용하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 공정은 발효 단계 전에, 혐기성 챔버의 대기에 역시 발효 배지를 노출시켜 실질적으로 APF 발효 배지의 산화적 환원을 허용하는 단계를 또한 포함할 수 있다. 한 예로서, 실질적으로 APF 배양 배지의 산화적 환원을 허용하는 단계는 혐기성 챔버에서 약 10 시간 내지 약 14 시간 동안 수행될 수 있다. 유사하게, 발효기에서 실질적으로 APF 발효 배지의 산화적 환원을 허용하는 단계는 발효 단계의 시작 전에 약 10 시간 내지 약 14 시간 동안 수행될 수 있다.
한 구체예에서, 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 크로마토그래피를 포함하는 APF 공정이 개시되고, 다음의 순차적인, APF 제조용 세포 은행으로부터의 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 APF 배양 배지에 첨가하는 단계; 배양 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 배양하는 단계; 클로스트리디움 보툴리눔 세포 용해가 일어날 때까지 APF 발효 배지에서 배양 단계로부터의 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 발효시키는 단계; APF 발효 배양물을 수확하여 수확 발효 배지를 제공하는 단계; 수확 발효 배지가 여과에 의한 농축을 거치는 단계; 완충제를 첨가하여 여과된 발효 배지를 희석하여 희석된 발효 배지를 수득하는 단계; 희석된 발효 배지가 포획 크로마토그래피 매질과 접촉되는 제1 접촉 단계, 여기서 포획 크로마토그래피 매질은 음이온 교환 매질임; 제1 접촉 단계으로부터의 용리액이 폴리싱 크로마토그래피 매질과 접촉되는 제2 접촉 단계, 여기서 폴리싱 크로마토그래피 매질은 양이온 교환 매질임, 및 제2 접촉 단계로부터의 용리액을 여과하는 단계를 포함하고, 이에 의하여 개선된 APF 공정에 의하여 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득한다. 특정 구체예에서, 공정은 제2 접촉 단계 후 및 여과 단계 전에, 제2 접촉 단계에서 나온 용리액을 소수성 상호작용 매질과 접촉시켜 제3 접촉 단계를 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 클로스트리디움 보툴리눔 용해 단계는 예를 들어 발효 단계의 시작 후 약 35 시간 내지 약 70 시간에 일어날 수 있다. 발효 배지는 예를 들어 약 2 L 내지 약 75 L, 약 2 L 내지 약 30 L, 또는 약 2 L 내지 20 L의 발효 배지의 부피를 가질 수 있다. 이 공정 전체는 약 50 시간 내지 약 150 시간, 더욱 바람직하게는 약 80 시간 내지 약 120 시간 동안 수행될 수 있다. 이 공정에 의하여 이렇게 수득된 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소는 예를 들어 약 2.4 x 107 내지 약 5.9 x 107 유닛/mg의 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소 역가를 가질 수 있다.
한 양태에 따르면, 발효 종결 시, 발효 배지 리터당 약 40 mg 내지 약 85 mg의 보툴리눔 신경독소가 수득될 수 있다. 다양한 가공(여과/크로마토그래피/여과 런) 단계 다음에, 발효 배지 리터당 약 30 mg 내지 약 60 mg의 보툴리눔 신경독소; 발효 배지 리터당 약 5 mg 내지 약 25 mg의 보툴리눔 신경독소; 발효 배지 리터당 약 6 mg 내지 약 20 mg의 보툴리눔 신경독소가 수득될 수 있다.
한 구체예로서, 발효 배지의 pH는 발효 단계 시작 시 약 pH 6.0 내지 약 pH 8, 바람직하게는 약 pH 6.8 내지 약 pH 7.6, 더욱 바람직하게는 약 pH 7.3으로 조정될 수 있다. 또 다른 예로서, 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 실질적으로 APF 크로마토그래피 공정이 또한 제공되고, 상기 공정은 보툴리눔 신경독소를 포함하는 실질적으로 APF 발효 배지를 수득하는 단계; 배지를 음이온 교환 크로마토그래피 수지와 접촉시켜 보툴리눔 신경독소를 포함하는 정제된 용리액을 제공하는 단계; 용리액을 양이온 교환 크로마토그래피 수지와 접촉시켜 이에 의하여 추가로 정제된 용리액을 수득하는 단계, 및 정제된 용리액을 추가로 여과하는 단계를 포함하고, 이에 의하여 실질적으로 APF 크로마토그래피 공정으로부터 정제된 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득한다. 특정 구성에서, 약 600 mL 내지 약 800 mL의 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 포함하는 음이온 크로마토그래피 컬럼이 사용될 수 있다. 음이온 크로마토그래피 컬럼은 예를 들어 약 8 cm 내지 약 10 cm의 지름 및 약 9 cm 내지 약 16 cm의 컬럼 내 음이온 교환 크로마토그래피 수지층 높이를 가질 수 있다. 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 통한 발효 배지의 유속은 예를 들어 약 140 cm/시간 내지 약 250 cm/시간, 또는 약 150 cm/시간 내지 약 160 cm/시간일 수 있다. 또 다른 양태에서, 크로마토그래피 컬럼 중의 약 150 mL 내지 약 300 mL의 양이온 교환 크로마토그래피 수지가 공정에서 이용될 수 있고, 여기서 양이온 크로마토그래피 컬럼은 예를 들어 약 5 cm 내지 약 8 cm의 지름 및 약 5 cm 내지 약 11 cm의 양이온 교환 크로마토그래피 수지층 높이를 가진다. 공정은 정용여과 단계 및/또는 생물부하 감소 단계 중 최소한 하나를 포함할 수 있다. 생물부하 감소 단계는 캡슐 필터를 이용할 수 있다. 정제된 용리액의 정용여과는 바람직하게는 생물부하 감소 단계 전에 수행된다. 한 예에서, 추가로 정제된 용리액의 정용여과 단계는 정용여과된 추가로 정제된 용리액의 농도 조정, 및 농도-조정된 정용여과된 더욱-정제된 용리액의 생물부하 감소 필터 통과에 선행하거나 후행한다. 공정은 마우스 LD50 생물검사에 의하여 결정된 최소한 약 2.0 x107 유닛/mg의 보툴리눔 독소, 예컨대 약 2.4 x 107 내지 약 6.0 x 107 유닛/mg의 보툴리눔 신경독소 역가를 가지는 수득된 보툴리눔 신경독소를 제공할 수 있다. 예를 들어, 발효 배지 리터당 약 4 mg 내지 약 25 mg의 보툴리눔 독소의 예시적인 공정 종결 시 회수물이 회수될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 정제하기 위한 본질적으로 APF 공정은 보툴리눔 신경독소를 포함하는 약 2 L 내지 약 30 L APF 발효 배지를 수득하는 단계; APF 발효 배지 단계를 수확하여 수확된 APF 발효 배지를 제공하는 단계; 수확된 APF 발효 배지에 대하여 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여, 이에 의하여 제1 용리액을 제공하는 단계; 음이온 교환 크로마토그래피에서 나온 용리액을 양이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시켜 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하고, 이에 의하여 제2 용리액을 제공하는 단계; 및 양이온 교환 크로마토그래피 매질에서 나온 제2 용리액을 여과하여, 이에 의하여 정제된 보툴리눔 신경독소를 수득하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 수득된 정제된 보툴리눔 신경독소는 약 2.4 x 107 내지 약 5.9 x 107 유닛/mg의 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소 역가를 가지고, 사용된 APF 발효 배지 리터당 약 4 mg 내지 약 25 mg의 양으로 수득될 수 있다.
본 발명은 또한 활성 성분이 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소인 실질적으로 APF 약제학적 조성물을 제조하는 조합 방법을 포함하고, 상기 방법은 (i) 실질적으로 동물 산물이 없는 발효 배지를 제공하고; (ii) 발효 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 발효시키고, (iii) 음이온 교환 크로마토그래피 매질를 사용하고 이어서 양이온 교환 크로마토그래피 매질을 사용하여 발효 배지로부터 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 회수하여 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득하는 단계; 이후 보툴리눔 신경독소를 최소한 한 가지의 적절한 부형제와 조합하는 단계를 포함하고, 이에 의하여 실질적으로 APF 약제학적 조성물을 제조한다. 한 예에서, 상기 방법은 냉동건조 또는 동결건조 또는 진공건조에 의하여 조합된 보툴리눔 신경독소 및 최소한 한 가지의 적절한 부형제를 건조하여 출하 또는 보관에 안정한 형태를 수득하는 단계를 포함하고, 여기서 활성 성분은 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소이고, 발효 배지는 식물로부터 수득된 단백질 산물을 포함한다. 단백질 산물을 수득할 수 있는 식물은 대두, 옥수수 또는 맥아, 쓴 맛이 제거된(debittered) 루피누스 캄페스트리스의 종자, 또는 이들의 가수분해된 산물일 수 있다. 수득된 보툴리눔 신경독소는 약 2.0 x 107 유닛/mg의 보툴리눔 신경독소 내지 약 6.0 x 107 유닛/mg의 보툴리눔 신경독소 역가를 가질 수 있다. 보툴리눔 신경독소는 보툴리눔 신경독소 A, B, C1, D, E, F 및 G 형으로 이루어진 군에서 선택되고, 바람직하게는 보툴리눔 신경독소 A 형이다. 특정 예에서 보툴리눔 신경독소는 약 150 kDa의 분자량을 가지고 보툴리눔 독소 복합체의 복합 단백질이 없는 보툴리눔 독소 신경독성 성분으로서 수득된다. 특정 구체예에서, 적절한 부형제는 알부민, 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 혈청 알부민, 젤라틴, 수크로오스, 트레할로오스, 하이드록시에틸 녹말, 콜라겐, 락토오스, 수크로오스, 아미노산, 염화나트륨, 염화칼륨, 폴리사카라이드, 카프릴레이트, 폴리비닐피롤리돈 및 시트르산칼륨으로 이루어진 군에서 선택된다. 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소 수득은 양이온 교환 매질의 사용 후 소수성 상호작용 매질을 사용하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 예에서, 진공건조는 약 20 ℃ 내지 약 25 ℃의 온도에서 일어난다. 일부 구체예에서, 진공건조는 예를 들어 약 70 mmHg 내지 약 90 mmHg의 압력에서 일어난다. 진공건조를 위한 시간은 예를 들어 약 4 시간 내지 약 5 시간일 수 있다.
본 개시의 특정 양태는 예를 들어 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소 복합체를 포함할 수 있는 약제학적 조성물을 제공하는 것에 관한 것이고, 부형제는 알부민, 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 혈청 알부민, 젤라틴, 수크로오스, 트레할로오스, 하이드록시에틸 녹말, 콜라겐, 락토오스 및 수크로오스로 이루어진 군에서 선택되며, 여기서 약제학적 조성물에 본질적으로 핵산이 없다.
특정 예에서, 수득된 보툴리눔 신경독소가 약 2.0x 107 내지 약 6.0 x 107 유닛/mg의 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소 역가를 가지는 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소 및 최소한 한 가지의 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공되고, 조성물은 보툴리눔 신경독소 복합체 mg당 약 12 ppm 미만의 핵산, 바람직하게는 1 ppm 미만의 핵산을 포함한다.
특정 구체예에서, 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 실질적으로 APF 크로마토그래피 공정은 다음의 순차적인: 약 10 시간 내지 약 12 시간 동안 또는 배양 배지의 바이오매스 측정치가 약 540 나노미터(nm)의 파장에서 약 0.8 AU 내지 약 4.5 AU의 광학 밀도를 가질 때까지, 실질적으로 APF 배양 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 배양하는 단계; 약 65 시간 내지 약 75 시간 동안 또는 약 890 nm의 파장에서 온라인 바이오매스 탐침을 사용하여 발효 배지를 광학 밀도 측정하여 발효 종료 시 구한 바이오매스 측정치가 약 0.05 AU 내지 약 0.7 AU일 때까지, 배양 배지로부터의 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 실질적으로 APF 발효 배지에서 발효시키는 단계; 발효 배지를 약 2.5 시간 동안 수확하는 단계, 이에 의하여 발효 배지의 세포 파편이 제거되고 발효 배지의 중량이 수확 단계의 시작 시 출발 중량의 약 4분의 3으로 감소됨; 수확 발효 배지를 접선 흐름 여과에 의하여 수확 단계의 시작 시 출발 부피의 약 4분의 1로 농축하는 단계; 완충제를 첨가하여 농축된 발효 배지를 희석하는 단계, 여기서 농축 및 희석 단계는 약 0.5 시간 내지 약 2 시간 동안 일어나고, 이에 의하여 농축 동안 발효 배지가 수확 단계 시작 시 출발 중량의 약 4분의 1로 감소되고, 이후 완충제를 첨가하여 희석되어, 수확 단계의 시작 시 원래의 출발 중량으로 되돌아감; 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 포획하기 위하여 희석된 발효 배지를 포획 크로마토그래피 매질과 약 4 시간 내지 약 5 시간 동안 접촉시키는 단계; 약 1.5 시간 내지 약 2.5 시간 동안 포획 크로마토그래피 매질에서 나온 용리액을 제1 폴리싱 크로마토그래피 매질과 접촉시켜 제1 폴리싱 런을 수행하여 불순물을 제거하는 단계; 약 1.5 시간 내지 약 2.5 시간 동안 폴리싱 크로마토그래피 매질에서 나온 용리액을 소수성 상호작용 매질에 통과시켜 제2 폴리싱 런을 수행하는 단계; 약 1 시간 내지 약 4 시간 동안 정용여과에 의하여 소수성 상호작용 매질에서 나온 용리액을 가공하는 단계; 및 약 0.5 시간 동안 가공된 용리액을 생물부하 감소 필터를 통하여 여과시키는 단계를 포함하고, 이에 의하여 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득한다.
또 다른 양태에서, 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 실질적으로 APF 크로마토그래피 시스템이 개시되고, 상기 시스템은: 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 배양하기 위한 제1 장치(제1 장치는 실질적으로 APF 배양 배지를 포함할 수 있음); 제1 장치에서 배양된 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 발효시키기 위한 제2 장치(제2 장치는 실질적으로 APF 발효 배지를 포함할 수 있음); 발효 배지를 수확하기 위한 제3 장치; 제3 장치로부터 수확된 배지 농축 및 희석을 수행하기 위한 제4 장치(제4 장치는 접선 흐름 여과 (tangential flow filtration, TFF)를 포함함); 농축 및 희석된 배지로부터의 보툴리눔 신경독소의 제1 정제를 수행하여, 이에 의하여 제1 정제된 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 제5 장치(제5 장치는 음이온 교환 크로마토그래피 매질을 포함함); 및 제1 정제된 보툴리눔 신경독소의 제2 정제를 수행하여, 이에 의하여 제2 정제된 보툴리눔 신경독소를 수행하기 위한 제6 장치(제6 장치는 양이온 교환 크로마토그래피 매질을 포함함)를 포함한다.
특정 구체예에서, 시스템은 제6 장치로부터 수득된 제2 정제된 보툴리눔 신경독소를 정제하여 추가의 정제를 수행하여, 이에 의하여 제3 정제된 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 제7 장치를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 제7 장치는 소수성 상호작용 매질을 포함한다. 시스템은 또한 제6 또는 제7 장치에서 나온 용리액을 여과하기 위한 여과막을 가지는 제8 장치로 추가로 이루어질 수 있다.
또 다른 구체예에서, 예를 들어 약 8 cm 내지 약 15 cm의 지름을 가지는 크로마토그래피 컬럼은 음이온 교환 크로마토그래피 매질을 포함하고, 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 약 8 cm 내지 약 15 cm의 컬럼 내 층 높이를 가질 수 있다. 또 다른 예에서, 시스템의 제4 장치는 약 125 cm/시간 내지 약 200 cm/시간의 유속으로 작동되는 크로마토그래피 컬럼을 포함하고, 컬럼은 약 500 mL 내지 약 1 L의 컬럼 부피를 가질 수 있다. 한 양태에서, 예를 들어 제5 장치는 약 50 mL 내지 약 500 mL의 컬럼 부피, 약 8 cm 내지 약 15 cm의 층 높이를 가질 수 있다. 일부 예에서, 예를 들어 제5 장치의 크로마토그래피 컬럼은 약 2 cm 내지 약 10 cm의 컬럼 지름을 가진다. 제5 장치의 크로마토그래피 컬럼은 약 100 cm 내지 약 200 cm/시간의 예시적인 유속을 가질 수 있다. 시스템의 제7 장치는 여과막을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 시스템은 제9 장치를 추가로 포함할 수 있고, 제9 장치는 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 배양하기 위한 제1 장치가 포함되는 혐기성 대기를 제공하기 위한 혐기성 챔버를 포함한다. 이러한 제9 장치는 바람직하게는 챔버/작업장소에 위치되는 집적된 고효율 미립자 공기 (HEPA) 필터를 포함한다. (발효를 위한) 시스템의 제2 장치는 산화-환원 전위 또는 pH 또는 광학 밀도를 검출하기 위한 최소한 하나의 탐침을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 최소한 하나의 일회용 탐침이 환원-산화 탐침, pH 탐침 및 탁도 탐침으로 이루어진 군에서 선택된다. 시스템의 제8 장치는 농축 및 완충제 교환을 위하여 접선 흐름 여과 장치를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 시스템은 생물부하 감소를 위한 생물부하 감소 장치를 포함하는 제10 장치를 포함할 수 있다. 한 예에서, 생물부하 감소 장치는 약 0.1 ㎛ 내지 0.3 ㎛, 바람직하게는 0.2 ㎛의 공극 크기를 가지는 필터를 포함한다. 시스템은 또한 제2 정제된 보툴리눔 신경독소를 수득한 후, 정제된 보툴리눔 신경독소 보관에 사용하기 위한 제11 장치를 포함할 수 있다. 한 예에서, 이러한 보관 장치는 약 -25 ℃ 내지 약 -80 ℃의 보관 온도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소가 다음 단계를 가지는 APF 공정에 의하여 제공된다: 실질적으로 APF 발효 배지를 제공하는 단계; 발효 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 발효시키는 단계; 음이온 교환 크로마토그래피 매질의 사용에 이어서 양이온 교환 크로마토그래피 매질을 사용하여 발효 배지로부터 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 회수하는 단계, 수득된 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소는 약 2.0 x 107 유닛/mg의 보툴리눔 신경독소 내지 약 6.0 x 107 유닛/mg의 보툴리눔 신경독소 역가를 가진다. 한 구체예에서, 공정은 소수성 상호작용 매질의 사용에 이어서 양이온 교환 매질을 사용하여 보툴리눔 신경독소를 추가로 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 명세서에 개시된 방법에 따라 수득된 보툴리눔 신경독소를 포함하는 약제학적 조성물을 이용하여 환자의 용태를 치료하는 방법이 제공된다.용태는 질환, 불쾌, 병, 또는 미용적 변형 또는 외관을 포함할 수 있다. 한 예에서, 환자의 용태를 치료하는 방법은 보툴리눔 신경독소 및 최소한 한 가지의 적절한 부형제를 포함하는 치료적 유효량의 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의하여 환자의 용태를 치료하고, 여기서 보툴리눔 독소는 약 1 유닛 = 약 .02 피코그램의 역가를 가진다.
특정 예에서, 이러한 용태를 치료하기 위한 보툴리눔 신경독소는 실질적으로 APF 배양 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 배양하고; 보툴리눔 신경독소를 포함하는 실질적으로 APF 발효 배지를 수득하고; 배지를 음이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시켜 보툴리눔 신경독소를 포함하는 정제된 용리액을 제공하고; 용리액을 양이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시켜 이에 의하여 추가로 정제된 용리액을 수득하고, 추가로 정제된 용리액을 여과하는 공정에 의하여 수득될 수 있고, 이에 의하여 실질적으로 APF 크로마토그래피 공정으로부터 정제된 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득한다.
한 구체예에서 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 실질적으로 APF 크로마토그래피 시스템이 포함되고, 상기 시스템은 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 혐기성 배양하기 위한 제1 장치(제1 장치는 약 200 mL 내지 약 1 L의 실질적으로 APF 배양 배지를 포함할 수 있음); 제1 장치에서 배양된 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아의 혐기성 발효를 위한 제2 장치(제2 장치는 약 5 L 내지 약 75 L, 또는 약 2 L 내지 약 75 L, 또는 약 2 L 내지 약 30 L의 실질적으로 APF 발효 배지를 포함할 수 있고 환원-산화 탐침, pH 탐침 및 탁도 탐침으로 이루어진 군에서 선택되는 최소한 하나의 일회용 탐침을 포함할 수 있음); 혐기성 대기를 제공하고 제1 장치를 수용할 수 있는 제9 장치(제9 장치는 챔버 내에 집적된 고효율 미립자 공기 필터를 가지는 혐기성 챔버를 포함하고, 상기 챔버는 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 혐기성 배양하기 위한 제1 장치를 수용할 수 있음); 발효 배지를 수확하기 위한 제3 장치; 수확된 배지의 농축 및 희석을 수행하기 위한 제4 장치; 제4 장치로부터 수득된 보툴리눔 신경독소의 제1 정제를 수행하여, 이에 의하여 제1 정제된 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 제5 장치(제5 장치는 음이온 교환 크로마토그래피 매질을 포함함); 제1 정제된 보툴리눔 신경독소의 제2 정제를 수행하여, 이에 의하여 제2 정제된 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 제6 장치(제6 장치는 양이온 교환 크로마토그래피 매질을 포함함); 제2 정제된 보툴리눔 신경독소의 제3 정제를 수행하여, 이에 의하여 제3 정제된 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 제7 장치(제7 장치는 소수성 상호작용 매질을 포함함); 및 제3 정제된 보툴리눔 신경독소의 농축 및 완충제 교환을 위한 제8 장치(제8 장치는 TFF 막을 포함함)를 포함한다.
특정 예에서, 예를 들어 발효 배지는 약 5% w/v 이하의 식물-유래 단백질 산물, 약 2% w/v 이하의 효모 추출물 및 약 2% w/v 이하의 글루코오스를 포함하고, 여기서 발효 배지의 pH 수준은 약 72 시간 발효 단계의 시작 시 약 pH 6.8 내지 약 7.6, 바람직하게는 약 pH 7.3이다. 한 구체예에서, 상기 방법은 추가로 정제된 용리액을 소수성 상호작용 매질과 접촉시켜 보툴리눔 신경독소를 포함하는 추가로 더욱 정제된 용리액을 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 예에서, 용태를 치료하는 방법은 약 150 kDa의 분자량을 가지고 보툴리눔 독소 복합체의 복합 단백질이 없는 보툴리눔 독소 신경독성 성분으로서 수득되는 보툴리눔 신경독소 사용에 의할 수 있다. 예시적인 투여 단계는 근육내, 진피내, 피하, 선내, 경막내, 직장, 경구 및 경피 투여로 이루어진 투여 경로의 군에서 선택될 수 있고, 보툴리눔 신경독소는 보툴리눔 독소 A, B, C1, D, E, F 또는 G 형으로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직하게는, 보툴리눔 신경독소는 보툴리눔 신경독소 A 형이다.
일부 예에서, 시스템은 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소 복합체가 약제학적 조성물의 일부로서 사용하기 위하여 수득될 수 있는 공정을 용이하게 할 수 있고, 상기 약제학적 조성물은 보툴리눔 신경독소 복합체 mg당 약 12 ng 미만의 핵산, 바람직하게는 보툴리눔 신경독소 복합체 mg당 1 ng 아래의 핵산을 포함하고, 더욱 바람직하게는 측정 가능한 핵산을 가지지 않는다 (예를 들어 검출 한계 아래).
도면
도 1A는 실시예 1 NAPF 공정의 주요 단계를 나타내는 흐름도이다. 도 1B는 실시예 2 IAPF 공정의 주요 단계를 나타내는 흐름도이고, 여기서 포획 및 폴리싱 크로마토그래피 단계가 2-컬럼(음이온 교환에 이어 양이온 교환) 또는 3-컬럼(FAPF)(음이온 교환에 이어 양이온 교환에 이어 소수성 상호작용 컬럼)을 이용할 수 있다.
상세한 설명
본 발명은 고역가, 고순도의 생물학적으로 활성인 클로스트리디움 신경독소, 예컨대 보툴리눔 신경독소가 단순하고 빠르며 경제적인 APF 크로마토그래피 시스템 및 공정의 이용에 의하여 수득될 수 있다는 발견에 기초한다. 중요하게도, 본 시스템 및 공정의 이용은, 발효된 보툴리눔 신경독소를 정제하기 위하여 RNase 및 DNase와 같은 동물 유래의 효소가 사용되지 않음에도 불구하고, 수득된 정제된 보툴리눔 신경독소 1 mg당 1 ng (또는 1 ng 미만)의 핵산 (RNA 및 DNA) 불순물을 포함하는 정제된 보툴리눔 신경독소를 생성할 수 있다. 예를 들어, 본 시스템 및 공정의 이용은 수득된 정제된 보툴리눔 신경독소 밀리그램당 약 0.6 ng 미만의 핵산 (RNA 및 DNA) 불순물을 포함하는 정제된 보툴리눔 신경독소를 생성할 수 있다. 수득된 보툴리눔 신경독소는 보툴리눔 독소 A 형 복합체, 예컨대 300 kDa, 500 kDa 또는 900 kDa (대략의 분자량) 복합체 또는 이들의 혼합일 수 있다. 수득된 보툴리눔 신경독소는 또한 약 150 kDa의 분자량을 가지는 보툴리눔 독소 유형 신경독성 성분(즉 복합 단백질이 없음)일 수 있다. 보툴리눔 신경독소는 혈청형 A, B, C, D, E, F 또는 G 또는 이들의 혼합 중 임의의 하나일 수 있다. 추가적으로, 개선된 시스템 및 공정이 재조합, 하이브리드, 키메라 또는 변형된 보툴리눔 독소(경사슬, 중사슬, 또는 두 사슬 함께)로써 실시될 수 있다.
본 발명의 중요한 양태는 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아가 발효된 APF 발효 배지로부터 보툴리눔 신경독소를 정제하기 위하여 음이온 교환 (포획) 매질 크로마토그래피의 이용에 이어서 양이온 교환 (폴리싱) 매질 크로마토그래피를 이용하는 것이다. 본 발명자들은 음이온 교환의 사용에 이어 양이온 교환 크로마토그래피 매질을 사용하는 것이 고순도, 고수율의 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 효과적이고 신속한 방법을 제공함을 발견했다. 종전에는, 음이온 교환 크로마토그래피의 사용은 보툴리눔 신경독소의 겔 밴딩 패턴에 유해한 영향을 미치는 것으로 생각되었고, 이에 따라 보툴리눔 신경독소 정제를 위한 음이온 교환 크로마토그래피 사용이 단념되었다. 예를 들어 미국 특허 제7,452,697호의 컬럼 55, 라인 53-57을 참조하라.
본 발명의 또 다른 중요한 양태는 앞에서 제시한 바와 같이 고순도 보툴리눔 신경독소(즉 ≤ 1 ng 핵산/mg 수득된 보툴리눔 신경독소)를 생성하는 것이다. 본 발명의 또 다른 중요한 양태는 공지의 Schantz 공정이 보툴리눔 신경독소를 배양, 발효 및 정제하기 위하여 수주일(즉 전형적으로 약 18 내지 약 22 일)를 필요로 하는 것과 대조적으로, 본 발명의 범위 내의 시스템 및 공정은 모든 배양, 발효 및 정제 단계가 1 주일 이내에 완료되도록 하는 것이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서 모든 배양, 발효 및 정제 단계는 6일 이내에 완료될 수 있다. 본 발명의 더욱 바람직한 구체예에서 모든 배양, 발효 및 정제 단계는 약 4일 이내(예를 들어 약 80 내지 약 144 시간 이내 또는 그 사이의 시간/범위 이내)에 완료될 수 있다. 본 발명자들은 8 또는 9 단계 공정(및 공정을 수행하기 위한 시스템)을 개발하고 특정 구체예에서 8 또는 9 단계 각각이 아래에 제시된 시간 이내에 완료될 수 있음을 발견하여 이러한 본 발명의 신속하고 더욱 바람직한 구체예를 발명했다:
배양을 위하여 약 8 시간 내지 약 14 시간;
발효를 위하여 약 60 시간 내지 약 80 시간;
수확을 위하여 약 2.5 시간;
농축 및 희석을 위하여 약 2 시간 내지 약 4 시간;
음이온 교환 크로마토그래피를 위하여 약 4 시간 내지 약 6 시간 (이는 포획된 보툴리눔 독소 용리를 위한 시간을 포함한다)
양이온 교환 크로마토그래피를 위하여 약 2 시간;
선택적인 제3 크로마토그래피 단계(즉 소수성 상호작용 크로마토그래피)를 위하여 약 2 시간;
농축 및 정용여과를 위하여 약 2 시간 내지 약 4 시간, 및;
추가의 여과를 위하여 약 1/2 시간. 따라서, 본 발명의 8 또는 9 단계의 신속하고 더욱 바람직한 구체예를 완료하기 위하여 필요한 총 시간은 약 75 시간 내지 약 150 시간이다.
본 발명은 더욱 효율적이고 시간 절약적이다. 한 양태에서, 본 발명의 새로운 공정은 사전-선택되고 검증된 세포주를 사용하고, 따라서 (세포 배양 및 발효 단계 전에) 배양한 다음 발효 배지에 접종하기 위하여 필요한, 세포 도말 및 성장, 콜로니 선택 및 수확, 및 수확된 콜로니의 단계적 세포주 확대의 종래기술 Schantz 공정 단계를 폐기한다. 한 양태에서, 본 발명은 APF 배양 배지의 접종을 위한 사전-선택된 세포 배양 없이 바로 시작하고, 따라서 시간 및 공정 단계를 단축한다.
실험을 통하여 본 발명자들은 발효 배지에 존재하는 보툴리눔 신경독소를 정제하기 위한 2크로마토그래피 컬럼 ("IAPF") 및 3 컬럼 ("FAPF" / "FIAPF") 크로마토그래피 시스템 및 공정을 개발했고, 발효 배지는 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아의 APF 발효로부터 유래했다. 중요하게도, APF 발효 공정이 클로스트리디움 박테리아를 배양하고 발효시키기 위하여 사용된 영양물로서 동물 유래 산물(예컨대 카제인 및 고기 육즙)을 배지로부터 줄이거나 제거할 수 있기는 하지만, 공지된 APF 발효 공정에는 전형적으로 동물 유래 산물, 예컨대 효소 DNase 및 RNase를 사용하는 하나 이상의 정제 단계가 이어진다. 본 발명의 APF 발효 배지에 존재하는 보툴리눔 신경독소를 정제하기 위한 시스템 및 공정은 동물 유래의 효소를 사용하지 않는다.
본 발명은 수확 발효 배지(예를 들어 여과에 의하여 투명해짐)를 Applied Biosystems의 POROS® 50HQ 음이온 교환 크로마토그래피 수지와 같은 음이온 교환 컬럼에 로딩(loading)하는 것을 포함할 수 있다. 한 양태에서, 폴리스타이렌/디비닐벤젠의 베이스 매트릭스 및 약 50 ㎛의 입자 지름 및 약 60-70의 동적 능력(BSA mg/ml)을 가지는 강한 음이온 교환 매질이 사용될 수 있다. 음이온 교환 컬럼은 클로스트리디움 신경독소(예컨대 보툴리눔 독소 복합체)를 포획하고 불순물 수준을 감소시킨다. 음이온 교환 컬럼이 발효 배지에 보툴리눔 독소와 함께 존재하는 많은 불순물을 또한 분리하면서 보툴리눔 독소 복합체의 생물학적 활성을 보존하며 수확 발효 배지로부터의 보툴리눔 독소 복합체의 효과적인 포획을 제공함이 발견되었다. 음이온 교환 컬럼으로부터 포획된 (결합된) 클로스트리디움 신경독소를 용리시키기 위하여 적절한 완충제가 사용된다.
본 발명의 2-컬럼 구체예에서, 음이온 교환 컬럼에서 나온 용리액(보툴리눔 신경독소 포함)이 양이온 교환 컬럼에 로딩되어 불순물로부터 보툴리눔 신경독소를 추가로 정제한다. 양이온 교환 컬럼은 Applied Biosystems의 POROS® 20HS 양이온 교환 수지일 수 있다. 한 양태에서, 폴리스타이렌/디비닐벤젠의 베이스 매트릭스 및 약 20 ㎛의 입자 크기 및 약 75 초과(>75)의 동적 결합 능력(라이소자임 mg/ml)을 가지는 강한 양이온 교환 매질이 사용될 수 있다. 본 발명의 3-컬럼 구체예(FAPF)에서, 양이온 교환 컬럼에서 나온 용리액이 GE Healthcare의 Phenyl Sepharose HP 수지와 같은 소수성 상호작용 컬럼에 로딩되어 보툴리눔 신경독소를 추가로 정제한다. 한 양태에서, 페닐기로써 유도체화되고 약 45의 동적 결합 능력(키모트립시노겐 mg/ml)을 가지는, 고도로 가교된 약 34 ㎛의 입자 크기를 가지는 아가로오스 비드의 매트릭스가 사용될 수 있다.
2컬럼 또는 3 컬럼 공정 후, 최종 사용된 컬럼에서 나온 용리액이 더욱 가공되어 고도로 정제된 벌크 보툴리눔 독소 복합체를 수득할 수 있다. 크로마토그래피 후 가공 단계는 한외여과 및 정용여과에 의한 농축 및 완충제 교환, 멸균 여과, 현탁액(종래기술) 대신 정제된 보툴리눔 독소 복합체의 용액 제조를 포함할 수 있고, 용액은 바람직하게는 시트르산칼륨에 섞인 용액이고, 한 예에서 약 6.5의 pH에서 10mM 시트르산칼륨의 농도이다.
특정한 바람직한 구체예에서, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장(혐기성 배양 및 혐기성 발효)을 위한 배지 및 보툴리눔 독소의 생성은 사용된 매질에 실질적으로 또는 완전히 동물-유래 산물이 없도록 동물 유래 산물을 대체하는 대두 기초 산물을 포함할 수 있다. 배양 단계는 추후의 발효를 위하여 미생물의 양을 증가시킨다. 배양은 이전에 냉동된 휴면 중인 박테리아를 활발하게 성장하는 배양물로 회복시킨다. 또한, 발효 배지에 접종하기 위하여 사용된 생존 가능한 미생물의 부피 및 양은, 보관된 비-증식 클로스트리디움 보툴리눔 세포 은행보다는 활발하게 성장하는 배양물로부터 더욱 정확하게 제어될 수 있다. 따라서, APF 배지에서 제조용 세포 은행의 샘플이 해동되고 선택된 APF 배양 배지에 넣어진다. 적절한 박테리아 성장 수준을 달성하면, 배양 배지가 발효 배지에 접종시키기 위하여 사용된다. 한 예로서, 성장기의 클로스트리디움 보툴리눔을 가지는 약 1% 내지 약 5%, 또는 그 사이의 양의 배양 배지가 발효 배지에 접종시키기 위하여 사용된다. 발효는 대규모 혐기성 환경에서 최대량의 미생물 세포 생산을 위하여 수행된다 (Ljungdahl et al., Manual of industrial microbiology and biotechnology (1986), edited by Demain et al, American Society for Microbiology, Washington, D.C. page. 84). 대안으로, 발효 배지에서의 클로스트리디움 보툴리눔 성장이 제조용 세포 은행의 샘플을 발효 배지에 직접 첨가하여 진행될 수 있다.
종래 기술에서, 배양 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔의 성장은 전형적으로, 세포 도말, 세포 콜로니 성장, 선택 및 성장의 제1 단계에 이어서 배양 배지의 접종 (전형적으로 두 단계 증대(step-up) 배양) 및 발효 배지의 접종 및 보툴리눔 독소 생성의 제2 단계의 두 단계로 진행한다. 바람직하게는, 어떤 단계의 배양 배지 중의 성장물도 배양 배지 중의 최종 성장물로 발효 배지를 접종하기 전에 세포 용해를 야기하지 않는다. 따라서, 본 발명 이전에는 발효 단계가 시작되기 전에 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 배양하기 위하여 약 4 일이 걸렸다. 본 발명에 따르면, 종전에 이용된 세포 도말 단계, 혈액 한천 플레이트 상의 콜로니 성장을 위한 추후의 대기 시간, 배양 배지를 위한 접종물을 제공하는 작은 부피의 배양물(예를 들어 8-9 mL) 성장을 위한 플레이트로부터의 콜로니 선택이 필요하지 않으므로, 본 발명자들은 모든 배양을 단지 8 내지 14 시간 내에 완료할 수 있다. 본 발명의 한 양태에 따르면, 사전-선택된 세포가 배양 배지 접종에 직접 이용되고, 이후 배양 배지는 완전-규모 발효 배지를 접종하기 위하여 이용되며, 완전-규모 발효 배지로부터 보툴리눔 독소가 결국 정제되므로, 이후 그 자체가 발효 배지를 접종하기 위하여 이용되는 배양 배지를 접종할 세포 성장을 위하여 종전에 이용된 도말, 콜로니 형성, 선택 및 증대 단계를 생략한다.
동물-기초의 (비-APF 또는 "NAPF") 배양 배지는 일반적으로 뇌 심장 침출 배지 (BHI), 박토-펩톤, NaCl, 및 글루코오스를 포함한다. 본 발명의 범위 내의 배양 배지는 APF 배양 배지이다. 예를 들어, 대두-기초 산물이 배양 및 발효 배지에서 BHI 및 박토-펩톤 대신에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 비록 클로스트리디움 보툴리눔이 불용성 대두를 포함하는 배지에서 성장할 수 있기는 하지만, 대두-기초 산물은 물에 용해성이고 가수분해된 대두를 포함한다. 대두-기초 산물의 어떠한 원천이라도 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 바람직하게는, 대두는 가수분해된 대두이고 가수분해는 비-동물 효소를 사용하여 수행되었다. 가수분해되거나 용해성인 대두의 원천은 Hy-Soy (Quest International), Soy peptone (Gibco) Bac-soytone (Difco), AMISOY (Quest), NZ soy (Quest), NZ soy BL4, NZ soy BL7, SE50M (DMV International Nutritionals), 및 SE50MK (DMV)를 포함한다.
실시예
다음 실시예는 본 발명의 특정 구체예를 제시하고, 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다. 실시예에서 달리 제시되지 않으면 "독소" 또는 "보툴리눔 독소"는 약 900 kDa의 분자량을 가지는 보툴리눔 독소 A 형 복합체를 의미한다. 약 900 kDa의 분자량을 가지는 보툴리눔 독소 A 형 복합체를 정제하기 위한 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법은 약 150 kDa, 약 300 kDa, 약 500 kDa 뿐만 아니라 다른 분자량의 독소, 복합체, 보툴리눔 독소 혈청형 및 보툴리눔 독소 신경독성 성분의 정제에 준비된 적용성을 가진다.
실시예 1
보툴리눔 독소를 수득하기 위한 비- APF ( Schantz ) 공정
이 실시예는 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 종래 기술의 Schantz 공정을 제시한다. 상기 공정은 동물 유래의 배지 및 시약을 사용하는 비-APF 공정이다 (즉 배양을 위한 소 혈액 한천 플레이트, 발효 배지 중의 카제인 및 보툴리눔 신경독소 정제를 위한 RNase 및 DNase 효소 사용). 도 1A는 Schantz 공정의 주요 단계를 나타내는 흐름도이다. Schantz 공정은 약 16 내지 20 개의 주요 단계를 가지고, 생산 규모를 위하여 115 L 발효기를 사용하며 완료에 약 3 주가 걸린다. Schantz 공정은 비-APF 클로스트리디움 보툴리눔 마스터 세포 은행(master cell bank, MCB) 바이알을 실온으로 해동하는 것으로 시작되고 넷의 배양 단계가 이어진다. 첫 번째로, 적절한 형태를 가지는 콜로니를 선택하기 위하여, 해동된 MCB 바이알의 분취물이 사전-환원된 콜롬비아 혈액 한천(Columbia blood agar, CBA) 플레이트에 획선도말되었고 30-48 시간 동안 34 ℃ ± 1 ℃에서 혐기성으로 인큐베이션(incubation)되었다. 두 번째로, 선택된 콜로니가 6-12 시간 동안 34 ℃에서 카제인 성장 배지를 포함하는 9 mL 테스트 튜브에 접종되었다. 가장 빠른 성장 및 가장 높은 밀도(성장 선택 단계)를 가지는 9 mL 튜브 내용물이 두 증대 혐기성 인큐베이션(제3 및 제4 배양 단계)을 통하여 추가로 배양되었는데, 상기 인큐베이션은 600 mL 내지 1 L 종균 배양 병에서 34 ℃의 12-30 시간 인큐베이션에 이어서 카제인 성장 배지를 포함하는 15 L 내지 25 L 종균 발효기에서 6-16 시간 동안 35 ℃의 배양이다. 이러한 두 증대 배양이 물에 2% 카제인 가수분해물(카제인 [우유 단백질] 소화물), 1% 효모 추출물 및 1% 글루코오스(덱스트로오스)를 포함하는 pH 7.3의 영양 배지에서 수행되었다.
증대 배양에 이어서, 제어된 혐기성 대기하에 카제인 포함 배지에서 상업적 규모(즉 115 L) 생산 발효기에서 60-96 시간 동안 35 ℃에서 추가로 인큐베이션되었다. 박테리아의 성장은 보통 24 내지 36 시간 후 완료되고, 발효 단계 동안 약 65 내지 약 72 시간 동안 수행되며 여기서 대부분의 세포가 용해 및 보툴리눔 신경독소 방출을 겪는다. 독소가 세포 용해에 의하여 유리되고 매질에 존재하는 프로테이즈에 의하여 활성화되는 것으로 생각된다. 배양 배지의 여과액이 단일층 심층 필터를 사용하여 제조되어, 큰 불순물(즉 전체 및 파쇄된 세포)이 제거되고, 이에 의하여 정화 배양물로 지칭되는 투명한 용액을 수득할 수 있다. 정화 배양물로부터의 보툴리눔 신경독소 수집은 정화 배양물의 pH를 3M 황산으로써 pH 3.5로 낮추고 20 ℃에서 생(raw) 독소를 침전시켜 이루어졌다 (산성화 침전). 이후 생 보툴리눔 신경독소가 (부피 감소를 달성하기 위하여) 초미세여과(미세여과)(MF 또는 UF로 지칭됨)에 이어 정용여과(DF)에 의하여 농축되었다. 0.1 ㎛ 필터가 미세여과 단계에 사용되었다.
이후 수확된 미정제 또는 생 독소가 소화 용기에 옮겨지고 프로테이즈 억제제 벤즈아미딘 하이드로클로라이드의 첨가에 의하여 안정화되었다. DNase 및 RNase가 핵산 소화(가수분해)를 위하여 첨가되었다. 이후 가수분해된 핵산 및 저분자량 불순물이 추가의 UF 및 DF 단계에 의하여 제거되었다. 이후 독소가 pH 6.0 포스페이트 완충제로써 추출되었고 정화에 의하여 세포 파편이 제거되었다. 그 다음 셋의 연속 침전 단계(차가운 에탄올, 염산 및 황산암모늄 침전)가 수행되었다. 정제된 보툴리눔 신경독소 복합체(벌크 독소)가 인산나트륨/황산암모늄 완충제 중의 현탁액으로서 2 ℃ 내지 8 ℃에서 보관되었다.
수확 및 정제 단계를 포함하는 이러한 실시예 1 Schantz (비-APF) 공정의 완료에는 약 2 내지 3 주가 걸린다. 생성된 벌크 보툴리눔 신경독소는 2 X 107 U/mg 이상(≥ 2 X 107 U/mg)의 특이역가, 0.6 미만의 A260/A278 및 겔 전기영동에서의 뚜렷한 밴딩 패턴을 가지는 클로스트리디움 보툴리눔의 Hall A 균주로부터 제조된 900 kDa 보툴리눔 독소 A 형 복합체의 고품질 현탁액이었고, 보툴리눔 독소 약제학적 조성물 조합에 사용하기에 적절했다.
보툴리눔 신경독소는 또한 미국 특허 제7,452,697호의 실시예 7에 제시된 바와 같이 APF, 비-크로마토그래피 공정으로부터 수득될 수 있고, 완전한 APF, 비-크로마토그래피 공정(배양의 시작으로부터 모든 정제 및 가공 단계의 종료까지)은 완료에 약 2 내지 3주가 걸린다. 대안으로, 보툴리눔 신경독소가 또한 미국 특허 제7,452,697호의 실시예 16에 제시된 바와 같이 APF, 크로마토그래피 공정으로부터 수득될 수 있고, APF, 크로마토그래피 공정(배양의 시작으로부터 모든 정제 및 가공 단계의 종료까지)은 완료에 1주 이상이 걸린다.
실시예 2
보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 APF , 2 및 3 컬럼 크로마토그래피 시스템 및 공정
본 발명자들은 고수율, 고순도의 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한 신속한 APF, 음이온-양이온 크로마토그래피 기초의 시스템 및 공정을 개발했다. 이 실시예 2의 공정은 (그램 양의 최종 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위한) 생산 목적으로 단지 8-10 개의 주요 단계를 가졌고, 20 L 발효 용기를 사용했으며, 배양의 개시로부터 최종 정제 및 독소 보관의 완료에 이르는 공정의 모든 단계 완료에 단지 4-7 일, 바람직하게는 약 4 내지 약 6 일이 걸린다. 본 명세서에 개시된 시스템에서 사용된 장치는 아래에 논의된다. 2 크로마토그래피 매질 공정 및 3 크로마토그래피 매질 공정 두 가지가 개발되었고 본 명세서에 제시된다. 2 매질 공정은 음이온 교환 크로마토그래피에 이어 양이온 교환 크로마토그래피를 사용했다. 3 매질 공정은 음이온 교환 크로마토그래피에 이어 양이온 교환 크로마토그래피에 이어 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 사용했다. HIC는 49 kDa 불순물(이는 아래에 논의되는 바와 같이 숙주 세포 글루코오스 포스페이트 아이소머레이즈로 밝혀졌다)과 같은 추가의 불순물을 제거했다.
제조용 세포 은행의 준비
본 발명자들은 (배양 단계 개시에 사용하기 위한) 콜롬비아 혈액 한천 플레이트를 사용하지 않는 새로운 클로스트리디움 보툴리눔 세포 은행을 개발했고, 이는 배양 전에 콜로니를 선택해야 할 필요성을 제거하고 또한 Schantz 공정 증대 튜브 배양 및 다중 종균 (배양) 단계를 수행할 필요성을 없앴다.
이 목적을 위하여, 종전에 확립된 Schantz 마스터 세포 은행(MCB)이 APF 연구용 세포 은행(research cell bank, RCB) 생성에 사용되었고, 이로부터 새로운 APF 마스터 세포 은행(MCB) 및 다음의 제조용 세포 은행(WCB)이 발생되었다. 연구용 세포 은행(RCB)이 Schantz(NAPF) MCB의 콜로니로부터 제조되었다. MCB 바이알로부터 동물-유래 단백질을 제거하기 위하여, 세포가 2% w/v SPTII(대두 펩톤 타입 II), 1% w/v 효모 추출물, 및 1% w/v 글루코오스를 포함하는 APF 배지에서 두 번 세척되었다. 세포는 모듈식 대기 제어 시스템(Modular Atmosphere Controlled System, MACS) 혐기성 챔버를 사용하여 엄격한 혐기성 조건하에 APF 배지에 도말되었다. 단리된 콜로니는 더욱 팽창되었고 -135 ℃ 아래에서 약 20% 글리세롤을 포함하는 APF 배지에 보관되었다.
APF-MCB는 RCB를 무산소 APF 배지(200 mL, 혐기성 챔버에서 최소 12 시간 동안 환원됨)에 팽창시켜 GMP 조건하에 제조되었고, 배양물의 OD540가 2.5 ± 1.0 AU에 도달할 때까지 34.5 ℃ ± 1 ℃ MACS 혐기성 챔버(60 rpm에서 교반됨)에서 배양되었다. 생성된 배양물에 멸균 글리세롤이 약 20%의 최종 농도로 첨가되었고, 그 후 혼합물이 1 mL/바이알로 냉동바이알(APF-MCB 바이알)에 옮겨졌다. 바이알이 액체 질소에서 급속 냉동된 다음, -135 ℃ 아래에서 보관되었다. APF-WCB는 상기와 같이 팽창시켜 GMP 조건하에 제조되었다. 생성된 APF 세포 은행은 동일성, 순도, 생존력 및 유전적 안정성에 대하여 특징분석되었다.
상류 단계 (배양 및 발효)
본 발명의 실시예 2 공정은 일반적인 두 단계; 상류 단계 및 하류 단계를 가졌다. 상류 단계는 출발 세포주의 팽창(실질적으로 APF 배양 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아의 성장 및 재생), 발효, 수확(세포 파편의 제거)을 포함하여, 정화된 수확 배양물을 제공하고 이는 이후 농축되고 희석된다. 따라서, 이 실시예에서 본 발명의 2 컬럼 공정의 9 단계는 배양, 발효, 수확 여과, 농축, 포획 (음이온) 크로마토그래피, 폴리싱 (양이온) 크로마토그래피, 완충제 교환, 생물부하 감소 및 바이알 충전이다.
상류 단계는 400 mL의 (혐기성 챔버에서) 환원된 종균 APF 배양 배지(2% w/v SPTII, 1% w/v 효모 추출물, (오토클레이빙(autoclaving) 전에) 1 N 수산화나트륨 및/또는 1 N 염산으로써 pH 7.3으로 조정된) 배양 배지의 오토클레이빙 후 첨가된 1% w/v 멸균 글루코오스)를 수용하는 1 L 병에서 배양 배지의 사용을 포함했다. 배양 (종균) 배지가 400 ㎕의 해동된 클로스트리디움 보툴리눔 WCB로 접종되었다. 인큐베이션/배양이 혐기성 챔버에서 150 rpm 교반되며 34.5 ℃ ± 1.0 ℃에서 일어났다.
540 nm에서 배양 배지의 광학 밀도가 1.8 ± 1.0 AU였을 때, 1 L 병의 전체 내용물(대략 400 mL)이 증기 멸균 후 1 N 수산화나트륨 및/또는 1 N 염산으로써 pH 7.3으로 조정된 APF 발효 배지를 포함하는 20 L 생산 발효기에 옮겨졌고, 발효 배지는 3.25% w/v SPTII, 1.2% w/v 효모 추출물, 1.5% w/v 멸균 글루코오스(멸균 후 첨가됨; 멸균, 예를 들어 약 122 ℃에서 0.5 시간 동안)로 구성되었다. 온도 및 교반은 각각 35 ℃ ± 1 ℃ 및 70 rpm으로 제어되었다. 세포 성장을 위한 혐기성 환경을 유지하기 위하여 질소 오버레이(overlay)가 12 slpm으로 설정되었고 헤드스페이스 압력이 5 psig로 설정되었다. 발효 pH 및 세포 밀도가 pH 탐침 및 온라인 탁도 탐침 각각에 의하여 모니터링되었다. 생산 발효를 위한 세 단계는 지수성장기, 정체기, 및 자가용해기를 포함한다. 활성 BoNT/A 복합체를 배양 배지에 방출하는 세포 자가용해가 35 시간 및 발효의 종료 사이에 일정하게 일어나는 것으로 관찰되었다. 발효의 종료 시, 배양물이 수확을 위하여 25 ℃로 냉각되었다.
발효 배지가 25 ℃로 냉각되면, 세포 파편이 심층 여과에 의하여 용해물을 함유하는 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체로부터 분리되는데, 먼저 5 - 0.9 ㎛ 명목 체류율 구배(nominal retention rating gradient) 사전-필터를 통과하여 세포 파편이 제거된 다음, 양으로 하전된 0.8 - 0.2 ㎛ 명목 체류율 구배를 통과하여 DNA가 제거된다 (최대 약 80% 제거). 두 필터는 사용 전에 20 L의 주사용수(water for injuction, WFI)로 함께 헹구어졌다. 최소 15 L의 여과액이 추가의 가공을 위하여 필요했고, 공정 중 샘플채취(in-process sampling)가 완료된 후 임의의 과잉 물질이 오염제거되었다. 여과액은 한외여과에 의하여 즉시 가공되지 않을 경우 4 ℃에서 보관되었다.
생물안전 캐비닛(biosafety cabinet, BSC) 내에서 수확 단계에서 나온 여과액이 GE Healthcare의 중공 섬유, 접선 흐름 여과(TFF) 막을 사용하여 15 L로부터 5 ± 0.5 L로 농축되었다. 이후 한외여과된 물질이 10 mM 인산나트륨 pH 6.5 완충제로써 20 L의 최종 부피로 희석되었다. 이 물질은 2 컬럼(음이온 이후 양이온) 또는 3크로마토그래피 컬럼(음이온, 양이온, 이후 소수성 상호작용)의 사용에 의하여 정제되었다. 희석되고 한외여과된 수확 물질이 정제에 의하여 즉시 가공되지 않을 경우 4 ℃에서 보관되었다.
Schantz 공정에서 시간 및 배양물 성장의 시각적 관찰에 기초하여 배양 단계가 종료되고 발효 단계가 시작된다. 반면에, 본 발명의 실시예 2 공정에서 배양 단계를 언제 종료시킬지의 결정이 배양물 유체 광학 밀도의 분석에 기초하는데, 이는 배양물이 발효 단계의 시작 시간에 대수증식기에 있음을 보증하고, 배양 단계 기간을 약 8 시간 내지 약 14 시간으로 단축시킨다. 본 발명의 OD 파라미터 배양된 세포의 건강이 최대화된 배양 단계를 끝내고, 발효 단계에서 생성된 확고하고 풍부한 보툴리눔 독소를 고무시켰다. 배양 종결 시 (540 nm에서) 배양 배지의 평균 광학 밀도는 1.8 AU였다. 발효 단계의 평균 기간은 72 시간이었고, 발효 단계의 종결 시 발효 배지의 평균 최종 탁도(A890)는 0.15 AU였다. 발효 단계의 종결 시 20 L 발효 배지(전체 육즙)에 존재하는 보툴리눔 독소 A 형 복합체의 평균 양(ELISA에 의하여 결정됨)은 약 64 ㎍ 보툴리눔 독소 A 형 복합체/mL 발효 배지였다.
수확 단계는 세포 파편 및 핵산을 제거하기 위하여 심층 여과를 이용했고, 이어서 공정의 다음 단계를 위한 발효 배지를 제조하기 위하여 한외여과 및 희석을 이용했다. 이 수확/세포 파편 세정은 Schantz 수확 공정과 근본적으로 상이한데, Schantz 수확 공정은 산성화에 의한 침전에 이어서 미세여과 및 정용여과를 이용하여 추가의 가공을 위한 제조에서 농축하고 완충제를 교환한다.
하류 단계 (정제)
하류 단계는 음이온 교환 컬럼 상의 보툴리눔 신경독소 포획, 컬럼으로부터의 용리 및 양이온 교환 컬럼 상의 폴리싱에 의한 불순물로부터의 추가 분리, 및 바람직하게는 (3 컬럼 공정에서), 원하는 보툴리눔 신경독소를 함유하는 용리액의 제3 컬럼, 바람직하게는 소수성 상호작용 컬럼 통과 (예를 들어 크로마토그래피), 이어서 접선 흐름 여과(TFF)를 이용한 농축 및 완충제 교환, 및 냉장 보관, 바람직하게는 냉동에 최적화된 최종 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체로의 생물부하 감소 (예를 들어 0.2 ㎛ 필터를 사용한 추가의 여과에 의하여), 및 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체 약제학적 조성물로의 궁극적인 조합을 포함했다. 크로마토그래피 및 여과 단계의 순서는 더욱 안정한 약물 물질을 제공하기 위하여, 생성물 및 공정-관련 불순물을 제거하고, 잠재적인 부수 물질을 제거하고, 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체 농도 및 최종 보툴리눔 신경독소 A 형의 완충제 매트릭스를 제어하도록 의도되었다.
수행된 3 컬럼 하류 공정의 더욱 상세한 구체예는 다음과 같다. 정화된(희석된) 한외여과된 물질(앞에서 개시된 바와 같이 20 L)이 POROS® 50HQ 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 통과했고, 포획된 보툴리눔 신경독소가 음이온 교환 컬럼으로부터 용리된 다음 POROS® 20HS 양이온 교환 크로마토그래피 수지를 빠져나가며, 이로부터의 용리액이 Phenyl Sepharose HP 크로마토그래피 수지를 빠져나갔다. HIC 컬럼에서 나온 용리액이 100 kDa 접선 흐름 여과에 이어 0.2 ㎛ 여과를 거쳤다. 생성된 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체는 보관을 위하여 냉동되었다.
이 실시예에서, 본 발명자들은 하류 공정의 제1 크로마토그래피 단계에서 약 8 cm의 내부 지름 및 약 15 cm의 컬럼 높이를 가지는 컬럼에 패킹된 POROS® 50HQ 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 사용했다. 완전한 POROS® 50HQ 컬럼 조업은 주위 온도에서 완료되었고, 흐름은 하향 방향이었다. 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체가 pH 단계 변화를 이용하여 음이온 컬럼으로부터 용리되었고, 여기서 핵산(예를 들어 DNA 및 RNA)과 같은 더욱 음으로 하전된 성분 및 다른 숙주 세포 단백질이 음이온 교환 컬럼에 결합된 채로 있었다.
음이온 교환 단계의 상세사항은 다음과 같았다: 30 분의 최소 접촉 시간 동안 0.1 N 수산화나트륨을 사용하는 POROS® 50HQ 컬럼의 사용 (최소한 약 3 컬럼 부피, 230 cm/시간). 이후 컬럼이 50 mM 인산나트륨, pH 6.5 완충제(최소한 5 컬럼 부피)로써 평형화되었다. 그 다음 정화되고 한외여과되고 희석된 물질(즉 가공된 용해물 APF 발효 물질)이 230 cm/시간으로 POROS® 50HQ 음이온 교환 컬럼에 로딩되었고, 이어서 컬럼 유출액의 280 nm에서의 흡광도가 0.10 AU로 감소될 때까지 최소한 약 20 컬럼 부피의 50 mM 인산나트륨, pH 6.5로써 230 cm/시간으로 세척하고, 이어서 50 mM 아세트산나트륨, pH 4.8으로써 230 cm/시간으로 용리했다. 280 nm에서의 흡광도(A280)가 피크 최대치를 통하여 최소한 약 0.15 AU로 증가하고, 트레일링 에지(trailing edge)에서 약 0.2 AU 이하일 때, 생성물 풀(pool)이 1 컬럼 부피의 50 mM 아세트산나트륨, pH 4.8을 수용하는 용기에 수집되었다. 이 용리 풀은 약 2 ℃ 내지 약 8 ℃에서 최대 48 시간 동안 보관되었다.
이 실시예 2의 하류 공정에서 제2 크로마토그래피 단계는 8 cm의 내부 지름 및 5 cm의 컬럼 높이를 가지는 컬럼에 패킹된 POROS® 20HS 양이온 교환 크로마토그래피 수지를 사용했다. 전체 POROS® 20HS 컬럼 조업은 주위 온도에서 완료되었고, 흐름은 하향 방향이었다. 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체는 POROS® 20HS 컬럼 수지와 결합한다. 이후 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체가 염 단계 변화를 이용하여 컬럼으로부터 용리되었다. 생성물-관련 불순물이 세척 완충제 및 오염제거 용액으로써 용리되었다.
양이온 교환 단계의 상세사항은 다음과 같았다: 30 분의 최소 접촉 시간 동안 0.1 N 수산화나트륨 용액을 사용하는 POROS® 20HS 컬럼의 사용 (최소한 약 3 컬럼 부피, 230 cm/시간). 이후 컬럼이 50 mM 아세트산나트륨, pH 4.8 완충제(최소한 약 5 컬럼 부피)로써 평형화되었다. 그 다음 POROS® 50HQ 생성물 풀(앞에서 기재된 바와 같이 수집됨, 새롭거나 냉장상태로부터)이 POROS® 20HS 컬럼에 로딩되었다. 이후 컬럼이 50 mM 아세트산나트륨, pH 4.8 완충제(최소한 약 3 컬럼 부피)로 세척된 다음 50 mM 아세트산나트륨, 150 mM 염화나트륨, pH 4.8 완충제로 다시 세척되었다. 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체가 POROS® 20HS 컬럼으로부터 50 mM 아세트산나트륨, 250 mM 염화나트륨, pH 4.8 완충제로써 200 mL/min으로 용리되었고, A280이 피크 최대치를 통하여 약 0.1 AU 이상(≥ 0.1 AU)으로 증가될 때, 용리 피크의 트레일링 에지의 A280이 0.1 AU 이하(≤ 0.1 AU)의 트레일링 에지 값으로 감소될 때까지, 용리액이 생물공정 수집 백(1 컬럼 부피의 50 mM NaH3C2O2, pH 4.8 수용)으로 우회되었다. POROS® 20HS 생성물 풀이 수집 백에 주위 온도에서 최대 약 6 시간 동안 보관되었다.
이 실시예 2의 3-컬럼 크로마토그래피 매질 공정에서, 제2(양이온 교환) 컬럼에서 나온 용리액이 HIC 컬럼을 통과했다. 사용된 HIC 컬럼은 Phenyl Sepharose HP 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지가 패킹된, 약 8 cm의 내부 지름 및 약 5 cm의 컬럼 높이를 가지는 컬럼이었다. 전체 Phenyl Sepharose HP 컬럼 조업은 주위 온도에서 완료되었고, 흐름은 하향 방향이었다. 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체가 감소되는 염 단계 변화를 이용하여 컬럼으로부터 용리되었다. 불순물이 로딩 동안 세척 완충제 및 오염제거 용액으로써 용리되었다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 단계의 상세사항은 다음과 같았다: Phenyl Sepharose HP 컬럼이 30 분의 최소 접촉 시간 동안 0.1 N 수산화나트륨 용액으로써 초기에 위생처리되었다 (최소한 약 3 컬럼 부피의 0.1 N 수산화나트륨 용액으로써 200 cm/시간으로). 이후 컬럼이 최소한 약 5 컬럼 부피의 50 mM 아세트산나트륨, 0.4 M 황산암모늄, pH 4.8 완충제로써 평형화되었다. 그 다음 POROS® 20HS (양이온 교환 컬럼) 생성물 풀(상기)이 50 mM 아세트산나트륨, 0.8 M 황산암모늄, pH 4.8 완충제와 1:1로 조합되고 Phenyl Sepharose HP 컬럼에 로딩되었다. 컬럼은 먼저 최소한 약 3 컬럼 부피의 50 mM 아세트산나트륨, 0.4 M 황산암모늄, pH 4.8 완충제로 세척된 다음, 50 mM 인산나트륨, 0.4 M 황산암모늄, pH 6.5 완충제로 세척되었다. 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체는 10 mM 인산나트륨, 0.14 M 황산암모늄, pH 6.5 완충제로써 컬럼으로부터 용리되었다. A280이 0.05 AU 이상(≥ 0.05 AU)으로 증가했을 때, 용리액이 생물공정 수집 백으로 우회되었다. 용리 피크의 트레일링 에지의 A280이 0.05 AU 이하(≤ 0.05 AU)의 값으로 감소할 때까지 용리액이 수집되었다. Phenyl Sepharose HP 생성물 풀이 수집 백에 주위 온도에서 최대 6 시간 동안 보관되었다.
Phenyl Sepharose HP 크로마토그래피 단계 생성물 풀을 약물 물질 제제화 완충제로써 농축하고 정용여과하기 위하여 접선 흐름 여과 시스템이 사용되었다. 100 kDa 분자량 차단 막을 가지는 Pall® Filtron Minimate 카세트가 농축 및 정용여과 단계를 위하여 사용되었다. 이후 제제화된 물질이 Pall Mini Kleenpak ® 0.2 ㎛ 필터를 통과하여 잠재적인 생물부하를 감소시켰다. 앞에서 언급된 바와 같이, UF/DF 단계는 Phenyl Sepharose HP 생성물 풀(HIC 컬럼의 용리액)을 0.7 g/L의 BoNT/A 복합체 농도까지 농축했고 10 mM 시트르산칼륨, pH 6.5 완충제로써 농축된 물질을 정용여과했다.
사용된 한외여과/정용여과 공정의 상세사항은 다음과 같았다. UF/DF 유닛 및 Pall 100 kDa 폴리에테르 설폰 막이 패킹 용액 제거를 위한 최소 5 L의 주사용수(WFI)로 처음에 플러싱되었고, 최소 10 분, 바람직하게는 최소한 30 분 동안의 재순환 조건하에 최소 200 mL의 1 N 수산화나트륨 용액으로써 위생처리(sanitization)되어 UF/DF 유닛을 위생처리했다. 그 다음 투과액 및 체류액 pH가 pH 6.5일 때까지 막 및 UF/DF 시스템이 충분한 부피의 10 mM 시트르산칼륨, pH 6.5 제제화 완충제로써 평형화되었다. 그 후 Phenyl Sepharose HP 생성물 풀이 Minimate® 접선 흐름 여과 카세트에 로딩되었고, HIC 용리액이 0.7 g/L로 농축되었다. 농축 단계 이후에, 체류액 풀이 7.5 psig(제곱인치당 파운드 게이지)의 막간차압(transmembrane pressure)으로 최소 5 정용여과 부피의 약물 물질 제제화 완충제(10 mM 시트르산칼륨, pH 6.5)에 대하여 정용여과되었다. 이후 투과액 유출구가 폐쇄되었고, UF/DF 시스템이 최소한 2 분 동안 가동되었으며, 시스템이 50 mL의 10 mM 시트르산칼륨, pH 6.5 제제화 완충제로써 헹구어졌다. 헹굼 후, 체류액 풀 중의 BoNT/A 복합체의 농도가 오프라인 A278를 측정하고 A278 눈금에 기초하여 결정되었고, 체류액 풀의 농도가 10 mM 시트르산칼륨, pH 6.5 완충제로써 0.5 g/L로 조정되었다. 이후 농도-조정된 체류액 풀이 Pall Mini Kleenpak 0.2 ㎛ 필터를 통하여 여과되어 잠재적인 생물부하가 감소되었다. 여과된 농도-조정된 체류액 풀은 수집 백에 2 ℃ - 8 ℃에서 최대 2 일 동안 보관되었다.
수득된 최종 정제된 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체가 바이알당 700 ㎕로 1 mL Nunc® 냉동바이알에 채워지고 냉동 보관되었다. 충전 조업이 주위 온도의 클래스 100 생물안전 캐비닛에서 수행되었다.
하류 공정(2 또는 3 크로마토그래피 컬럼의 사용을 포함함)은 단지 1 내지 3 일 후 완료되었고, 수득된 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체는 시트르산칼륨, pH 6.5 완충제 중의 0.5 g/L의 농도의 용액으로서 냉동 보관되었다. 비교하면, 종래기술의 Schantz 하류 (독소 정제) 공정은 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체를 정제하기 위하여 다중 여과, 침전, 추출 및 원심분리 단계를 사용하고, 단지 하류 단계를 완료하기 위하여 1-2 주를 필요로 하며, 결과적인 약물 물질(회수된 보툴리눔 신경독소)이 대략 2.7 g/L 농도의 황산암모늄 현탁액으로서 냉장 보관된다. 침전 대신 크로마토그래피의 사용 및 단축된 가공 시간은 본 명세서에 개시된 것과 같은 현저하게 개선되고 일관된 하류 공정을 야기했다.
한 양태에 따르면, 식물-기초 산물, 예컨대 대두-기초 산물의 농축물은 배양 및 발효 배지에서 대두 펩톤 타입 II Hy-Soy® 또는 SE50MK(Kosher 대두 펩톤)일 수 있다. 종균 배양 배지에서 Hy-Soy®는 10-200 g/L 범위일 수 있다. 바람직하게는, 종균 배지에서 Hy-Soy®의 농도는 15-150 g/L 범위이다. 가장 바람직하게는, 종균 배지에서 Hy-Soy®의 농도는 대략 약 20-30 g/L 또는 그 사이의 양이다. 종균 배지에서 글루코오스의 농도는 0.1 g/L 내지 20 g/L 범위일 수 있다. 바람직하게는, 글루코오스의 농도는 0.5-15 g/L 범위이다. 가장 바람직하게는, 배양 배지에서 글루코오스의 농도는 대략 10 g/L이다. 효모 추출물 양은 약 5-20 g/L, 더욱 바람직하게는 약 10-15 g/L 또는 그 사이의 양일 수 있다. 예를 들어, 클로스트리디움 보툴리눔 성장 전의 배양 배지의 pH는 대략 pH 7.0-7.5, 또는 그 사이, 바람직하게는 pH 7.3일 수 있다.
예로서, 생산 발효 배지 중의 Hy-Soy® 양은 10-200 g/L 범위일 수 있다. 바람직하게는, 발효 배지 중의 Hy-Soy® 농도는 15-150 g/L 범위이다. 가장 바람직하게는, 발효 배지 중의 Hy-Soy® 농도는 대략 약 20-40 g/L 또는 그 사이의 양이다. 발효 배지 중의 글루코오스 농도는 0.1 g/L 내지 20 g/L 범위일 수 있다. 바람직하게는, 글루코오스 농도는 0.5-15 g/L 또는 그 사이의 양 범위이다. 필수적이지는 않지만, 상기와 같이, 글루코오스는 발효 배지의 다른 성분과 함께 오토클레이빙하여 멸균될 수 있다. 성장 전 발효 배지의 pH 수준은 pH 7.0-7.8, 바람직하게는 약 7.0-7.5 또는 그 사이, 더욱 바람직하게는 pH 7.3일 수 있다.
도 1의 우측에 나타나는 바와 같이, 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소 복합체를 수득하기 위하여 이 실시예 2에서 사용된 2 컬럼 APF 공정은 다음 단계로 이루어졌다: (a) 종균/배양 병에서 APF WCB 바이알로부터의 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아와 같은 박테리아를 배양하는 단계, (b) 이후 APF 발효 배지를 가지는 발효기(독소 생산 발효기)에서 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 발효시켜 세포주를 팽창시키고, 원하는 세포 용해 상에 도달할 때까지 발효 및 보툴리눔 독소 생산을 진행하는 단계. 그 다음, (c) APF 발효 배지를 수확(예를 들어 여과에 의한 정화)하여 수확 발효 배지를 수득하는 단계, (d) 농축 및 희석을 진행하여 희석된 수확 발효 배지를 생성하는 단계, 희석된 수확 발효 배지는 (e) 포획 컬럼을 통과하여 불순물이 제거됨, (f) 포획 컬럼에서 나온 용리액을 폴리싱 컬럼과 접촉시켜 불순물을 추가로 제거하고, 선택적으로 제2 폴리싱 컬럼과 접촉시키는 단계 (g) 폴리싱 컬럼 용리액의 농축 및 완충제 교환 단계, (h) 이어서 생물부하 감소 여과 단계 및 (i) 바이알의 충전 단계.
한 예에서, 발효 부피는 20 L이고, 모든 단계에 대한 총 공정 시간이 단지 4 내지 6 일이었으며, 높은 보툴리눔 신경독소 수율이 달성되었다.
다음은 본 발명의 범위 내의 특정 구체예의 더욱 상세한 설명을 제공한다. 발효 단계가 30 L 스테인리스 스틸 발효기를 사용하여 APF 배지에서 수행되었다.
하기 이 실시예에서, 여전히 고수율의 고역가 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체를 제공하면서 훨씬 감소된 부피의 발효 배지가 사용되었다. 다음의 프로토콜을 사용하여, 예를 들어 보툴리눔 신경독소를 수득하기 위하여 상업적으로 유용한 양 생산에 필요한 전형적으로 더 큰 종전 부피(예를 들어 115 L)의 발효 배지 대신 단지 20 L 이하의 APF 발효 배지가 필요했다.
기밀실(airlock)을 가지는MACS 혐기성 워크스테이션(Don Whitley)이 혐기성 생물을 처리하기 위한 산소-결핍 환경을 제공했다. 챔버로의 접근 및 챔버로부터의 퇴거는 내부 및 외부 문으로 구성된 포트홀(porthole) 시스템을 통했다. 유닛이 온도 제어되어 챔버 내의 사용자 설정을 유지했다. 습도조절장치-제어된 응축 플레이트가 챔버 내 과잉 수분의 효과적인 제거를 보장했다. 챔버는 작업자 사용을 위하여 조사되었고, 낮은 기체 압력, 연속적인 기체 흐름, 및 전력 조절(power condition) 손실에 대하여 경보했다. 챔버는 혐기성 챔버 내의 생육성 및 비생육성 미립자 수준을 감소시키기 위한 HEPA 필터를 구비했다. 혐기성 조건은 "Anotox" 및 Palladium Deoxo "D" Catalyst 대기 스크러빙(scrubbing) 시스템을 이용하여 유지되었다. 응축 플레이트로부터의 응축물 물이 수집되고, 물이 제거되는 외부 저장고에 파이프로 물이 운반되었다.
앞에서 개시한 바와 같이, -135 ℃ 아래에서 보관된 세포 은행 바이알을 가지고서 APF 공정이 APF WCB의 제조에 이용되었다. APF WCB 세포 은행 바이알이 배양 배지 접종 전에 실온에서 약 15 min 동안 해동되었고, "종균" 배양을 확립하기 위하여 앞에서 개시한 바와 같은 단일 배양 단계가 이어졌다. 이는 전반에 걸쳐 무균 기법을 이용하는 모듈식 대기 제어 시스템에서 수행되어 생물부하를 최소화했다. 모듈식 대기 제어 시스템은 완료된 종균 배양 바이알에 WCB 바이알 내용물로써 접종을 착수하기 전에 APF 세정되었다. 배양 배지가 (pH 조정을 위한) 1 N 염산 및 1 N 수산화나트륨, D(+) 글루코오스, Anhydrous (Mallinckrodt Baker, Cat# 7730, 4.00 g), 대두 펩톤 타입 II(Soy Peptone Type II, SPTII)(Marcor, Cat #1130, 8.00 g), 주사용수(WFI) 400.0 mL 및 효모 추출물(YE)(BD Cat #212730, 4.00 g)을 사용하여 제조되었다. 대두 펩톤 타입 II 및 효모 추출물 용액이 500 mL 메스실린더로 300 mL의 WFI를 측정하여 제조되고 종균 배양 병에 부어졌다. 종균 배양 병을 교반기에 넣었고 교반기가 가동되었다. 8.00 g의 SPTII 및 4.00 g의 효모 추출물이 종균 배양 병에 첨가되고 용해될 때까지 혼합되었다. 혼합 후에 용해가 완료되지 않았을 경우, 혼합물이 저온 설정에서 가열될 것이다. pH가 측정되고 약 7.30 ± 0.05로 조정되었다. 배지 용액이 WFI로써 약 360 mL가 되었다. 종균 배양 병이 증기 및 기체 이동을 허용하도록 적절히 통기되었다. 10% 글루코오스 용액(w/v)이 100 mL 메스실린더로 약 30 mL의 WFI를 측정하여 제조되고 사전-조립된 글루코오스 첨가 병에 넣어졌고, 상기 병을 교반기에 넣었고 교반기가 가동되었다. 약 4.00 g의 글루코오스가 글루코오스 첨가 병에 첨가되고, 용해될 때까지 혼합되었고 (용해를 위하여 필요할 경우 저온 열이 이용되었음), WFI를 충분한 양(qs, quantity sufficient)으로 첨가하여 글루코오스 용액이 40 mL가 되었다. 이후 글루코오스 첨가 병이 통기 캡으로 느슨하게 닫혔다. 글루코오스 및 종균 배양 병이 모두 멸균을 위하여 123 ℃에서 30 분 동안 오토클레이빙된다. 멸균 후, 두 물품이 오토클레이브로부터 수거되고 생물-안전 캐비닛에서 냉각되도록 방치되었다. 무균 냉각 후, 10%의 글루코오스 용액이 효모 추출물 및 대두 펩톤 II 용액을 수용하는 종균 배양 병에 옮겨지고 혼합되어, 이에 의하여 완료된 종균 배양 병을 제공했다.
이 완료된 종균 배양 병은 사전-세정된 MACS(여기에 준비된 혐기성 지시약이 넣어짐ㄴ)에 넣어졌다. 완료된 종균 배양 병의 캡이 느슨해졌다. 이후 완료된 종균 배양 병이 MACS 내의 교반 플레이트에 놓였고 (교반 플레이트는 약 150 rpm으로 가동되었다) 완료된 종균 배양 병 안의 배지가 MACS 내에서 최소 12 시간 동안 약 34.5 ℃ +/- 1 ℃에서 환원되었으며, 그 후 1 mL 배지 블랭크(blank)가 (540 nm에서의 바이오매스 결정을 위한) 광학 밀도 측정을 위하여 채취되었다. 그 후, MACS (혐기성) 안의 완료된 종균 배양 병이 접종되었다. APF WCB 배양 바이알이 냉동 세포 은행으로부터 수득되었고 MACS에 가져와졌다. 바이알은 약 10-15 분 동안 해동되었고, 그 후 약 400 ㎕의 바이알 내용물이 완료된 종균 배양 병 안의 배지에 직접 넣어졌다. 완료된 종균 배양 병 위의 캡이 완전히 느슨해지고, 캡은 병의 위에 놓였으며, 교반 플레이트는 150 rpm으로 설정되었다. MACS에서 최소한 약 11 시간의 인큐베이션 후, 아래 기재되는 바와 같이 발효 생산이 착수되었다.
30 L 스테인리스 스틸 발효기와 같은 발효기의 탐침(예를 들어 산화환원 탐침, pH 탐침, 탁도 탐침, 예를 들어 Broadley James and Optek에 의하여) 및 시퀀스 구성이 체크되고 보정되었고, 각각의 발효기 포트에 삽입되고 적소에서 죄어졌다. 예를 들어, 발효기는 30 L 부피 발효기 용기, 교반기 구동 시스템, 유틸리티 연결을 위한 파이핑 어셈블리(CIP, 세정 증기, CDA, 질소, 산소, 공정 냉각수, 생물-폐기물, 및 플랜트 증기), 계측장비 (pH, 온도, 압력, 산화환원, 광학 밀도, 및 질량 유량), 및 네 개의 연동 펌프로 구성된 ABEC 30 L (VT) 발효기 시스템일 수 있다. 바닥 탑재된 교반기 속도가 Allen-Bradley 변환 주파수 드라이브(variable frequency drive, VFD)를 사용하여 제어되었다. 시스템의 반-자동 및 자동 제어가 프로그래밍으로써 Allen-Bradley ControlLogix PLC에 의하여 취급된다. 시스템은 발효 조업 동안 배양 온도, 압력, pH, 및 산화환원의 폐루프 PID(비례-적분-미분(proportional-integral-derivative)) 제어를 제공하도록 설계되었다. Allen-Bradley DeviceNet®(오픈 디바이스 레벨 네트워크)가 스키드 상의 디바이스 및 센서와의 소통 및 제어를 위하여 이용된다.
멸균 유지, 평형, 런 및 수확 모드에 대하여, 교반, 온도, 압력 및 질소 오버레이가 다음 설정점으로써 조업되었다.
멸균 유지 및 평형 모드에 대하여:
제어된 파라미터 설정점 및 범위
교반 100 rpm ± 10
질소 오버레이 12 SLPM ± 2
발효기 압력 5 psig ± 1
발효기 온도 35 ± 1℃
산화환원 -390 내지 - 150 mV
런 모드에 대하여:
제어된 파라미터 설정점 및 범위
교반 70 rpm ± 5
질소 오버레이 12 SLPM ± 2
발효기 압력 5 psig ± 1
발효기 온도 35 ± 1℃
수확 모드에 대하여:
제어된 파라미터 설정점 및 범위
교반 150 rpm ± 10
질소 오버레이 10 SLPM ± 2
초기 발효기 압력 0 psig
발효기 온도 25 ± 1℃
발효 배지를 제조하기 위하여, 필요한 용구는, 표준 저울(standard balance), 카보이(20 L, 예를 들어), 유리 병(5 L), 메스실린더, 교반 막대 및 교반기와 함께, D(+) 글루코오스, Anhydrous(Mallinckrodt Baker, Cat# 7730, 300.0 g), 대두 펩톤 타입 II(SPTII)(Marcor, Cat #1130, 650.0 g), 주사용수(WFI, 13 L) 및 효모 추출물(YE)(BD Cat #212730 , 240.0 g)을 포함한다. 약 10 L의 WFI가 교반 막대와 함께 카보이에 첨가되었다. 카보이가 교반기에 놓였고, 교반기가 작동되었으며, 그 후 약 650.0 g의 대두 펩톤 타입 II가 약 240.00 g의 YE와 함께 첨가되었다. 발효 배지는 WFI를 q.s.로 13 L까지 첨가했고, 카보이가 막아졌다. 이후, WFI가 유리 5 L 병(그 안에 교반 막대를 포함)에 넣어질 경우 약 2 L를 첨가하여 10% 글루코오스 용액(w/v)이 제조되었다. 교반기에 놓이고 막대가 회전하면서, 약 300.00 g의 글루코오스가 병에 첨가되었고, 용해될 때까지 혼합되었다. 글루코오스 용액은 WFI를 q.s.로 3 L까지 첨가했고, 병에 넣어지고 막아졌으며, 10% 글루코오스 용액을 제공했다.
카보이 안의 발효 배지가 발효기에 첨가되고, 정치증기멸균(steam in place) 전 발효기 부피가 기록되고, 조업의 발효 시퀀스가 진전되었다. SIP(steam in place)(122 ℃, +/- 1 ℃)의 종료 시, SIP 후 발효기 부피가 기록되었다. 튜브 및 인-라인(in-line) 0.2 ㎛ 필터(PALL Corp.)를 가지는 용기 및 연동 펌프를 포함하는 글루코오스 첨가 어셈블리가 발효기에 연결되었고, 라인은 SIP를 거치고 냉각되었다. 첨가 밸브 포트가 개방되고, 약 3 L의 (필터 멸균된) 글루코오스가 첨가되고, 적절한 양의 (필터 멸균된) WFI가 20 L의 총 발효기 부피까지 q.s.로 글루코오스 첨가 병에 첨가되고, 동일한 글루코오스 필터 라인을 통하여 발효기에 펌핑되었다. 첨가 밸브 포트가 폐쇄되었다. 생산 발효 배지는 그 후, 필요한 대로 첨가 라인의 SIP를 이용하여 멸균 1 N 수산화나트륨 또는 1 N 염산으로써 약 pH 7.3 +/- 0.05로 pH 조정되었다. 이후, 멸균 유지를 위한 파라미터가 설정되고 접종 전에 약 12 시간 동안 유지되었다. 배지의 출발 글루코오스 농도가 대사산물 분석기 및 기록된 글루코오스 농도를 사용하여 측정되었다.
앞에서 명시된 바와 같이, 종균 배양 인큐베이션의 종료 시 (약 11 ± 1 시간), 1 mL의 샘플이 광학 밀도 (OD) 측정을 위해 취해졌다. OD는 적절한 범위 내에서 OD 값이 기록되고 배양이 발효를 위하여 이용되었을 경우 분광광도계를 사용하여 540nm에서 오프라인 측정되었다. 따라서 발효기 탁도 탐침이 영으로 맞춰졌다. 혐기성 챔버로부터의 종균 접종물 병이 발효기에 가져와졌고 및 종균 접종 이송 어셈블리(그 안의 APF 배양 배지를 포함하는 종균 용기, 용기는 PALL Corp. 또는 Millipore로부터 입수 가능한 멸균 Kleenpak™ Connector 어셈블리를 포함하는 배양 접종 이송 라인을 가짐)가 발효기의 밸브를 대체했고, 펌프 1로의 배관이 고정되었다. 발효기 압력은 2 psig로 낮춰졌고, 종균 접종물 병의 전체 부피가 발효기에 펌핑되었다. 접종의 종료 시, 발효기의 온라인 흡광 단위(AU)가 기록되고, 발효기 파라미터가 런 모드로 설정되고 시간이 기록되었다.
이후 24 및 48 시간에 샘플이 발효기로부터 취해지면서, 예를 들어, 무균 상태를 유지하면서 발효가 진행되었다 (발효 런은 약 60 시간 내지 약 80 시간, 바람직하게는 약 68 시간 내지 약 76 시간, 가장 바람직하게는 약 72 시간 동안일 수 있다). 발효 동안 취한 최소한 하나의 샘플에 대한 런인 테스트는, 예를 들어 오프-라인 광학 밀도 측정, 글루코오스 측정, ELISA, SDS-PAGE, 웨스턴 블롯을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 발효의 종료 시 (예를 들어 발효의 종료 시 육즙 부피는 약 18-19 L임), 샘플이 (예를 들어, 오프-라인 광학 밀도 측정, 글루코오스 측정, ELISA, SDS-PAGE, 웨스턴 블롯 및 DNA/RNA 정량화에 의하여) 테스트를 위하여 취해질 수 있다.
발효의 종료 시, 온라인 광학 밀도, EFT (경과된 발효 시간), 및 발효 종료 시간 뿐만 아니라 교반 rpm, ℃로 나타낸 온도, 압력 psig 및 질소 오버레이 slpm 그리고 산화환원 mV가 기록되었다. 그 다음, 생산 발효 육즙이 수확을 거쳤다. 즉 생산 발효 육즙이 여과를 통하여 정화되었고, 이에 의하여, 예를 들어, 약 15 L의 여과액이 수집된다. 발효 파라미터는 수확을 위하여 설정되었고, 사전-필터, 심층 필터 및 최소한 하나의 압력 게이지를 포함하는 정화를 위한 필터 어셈블리가 준비되었다 (CUNO, 3M 여과). 사전-필터 및 심층 필터가 약 20 L의 주사용수로써 플러싱되었다. 플러싱 후, 여과 어셈블리가 발효기의 수확/배출 포트에 부착되었다. 발효기 온도가 약 25 ℃로 감소되었고, 그 후 발효 육즙의 정화가 시작되었다 (정화 시작 시간, 초기 온라인 OD, 초기 pH, 초기 온도 및 발효기의 초기 부피를 기록하라). 발효기 내 압력은 약 6 psi의 압력에 도달할 때까지 여과 동안 10 분 마다 약 1 psi(제곱인치당 파운드)의 속도로 증가되었고, 수확 종료까지 압력이 유지되었다. 이 필터는 APF 발효 배지 중의 대략 80%의 RNA/DNA를 제거하고 (나머지는 아래 논의되는 바와 같이 이후의 크로마토그래피 단계 동안 본질적으로 제거되었다), 따라서 발효 육즙으로부터 이러한 성분을 제거하기 위한 종래의 RNase 및/또는 DNase의 의존/사용을 폐지한다. 사전-필터 유입구 압력, 심층 필터 유입구 압력, 발효기 압력, 교반 및 여과액 부피와 같은 공정 파라미터가 수집된 2 L의 여과액마다 모니터링되었고, 이의 종료 시 정화 종료 시간 및 수집된 여과액의 부피가 기록되었다. 수확 단계의 완료 이후, 시스템은 오염제거되고 세정되었다.
여과액 카보이가 샘플링을 위하여 BSC에 가져와졌고, 이로부터 약 10 mL 이하(=10 mL)의 여과액이 오프라인 OD 측정 및 다른 분석(예를 들어 ELISA, SDS-PAGE, DNA/RNA 및 웨스턴 블롯)을 위하여 샘플링되었다.
이후 여과액은 한외여과/희석을 거쳤다. 접선 흐름 필터 (TFF) 유닛 어셈블리가 조립되었다. TFF 유닛은 분당 약 2 L의 바람직한 속도로 WFI로써 약 90 분 동안 헹구어진 다음 TFF 유닛에 이를 통하여 (재순환된) 0.1 N 수산화나트륨이 약 60 분 동안 지나가 위생처리되었고, 그 후 1 L의 10 mM 인산나트륨 완충제, pH 6.5가 이를 통하여 지나갔고, 이어서 WFI로써 약 30 분 동안 헹구어졌다. 이후 수확 단계(약 15 L)에서 나온 여과액이 TFF를 통과하여(이는 생물-안전 캐비닛에서 수행된다), 여과액이 약 5 L +/- 0.5 L으로 농축된다 (농축 단계는 분당 약 2 L 및 약 5 psig의 막간차압으로 진행한다). 투과액의 샘플이 취해지고 예를 들어 ELISA, dsDNA, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 테스트를 거칠 수 있다. 약 5 L +/- 0.5 L로 농축되면, 이후 체류액 풀이 약 15 L의 멸균 여과된 10 mM 인산나트륨 완충제, pH 6.5로써 TFF를 통하여 분당 약 2 L의 속도로 약 20 L까지 희석되었다. 이후 샘플이 다시 취해지고 예를 들어 ELISA, DNA/RNA, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 테스트를 거칠 수 있다. 한외여과/희석 물질(체류액)이 4 ℃에서 보관되었다.
사용 이후 모든 시스템은 1N 수산화나트륨 또는 멸균 (증기) 온도를 이용하여 오염제거되고 세정되었다.
정제된 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체를 수득하도록 실시예 2 공정으로부터 수득된 발효 배지의 정제 중의 예시적인 공정에서 사용하기 위한 아래에 제시된 용액, 완충제 등을 제조하기 위하여, 다음 물질, 기구 및 절차가 사용되었다. 이용된 예시적인 완충제(0.2-마이크론 진공 필터를 통하여 여과되고 이의 전도도가 기록보존을 위하여 mS/cm로 측정됨)10 mM 인산나트륨, pH 6.5; 50 mM 인산나트륨, pH 6.5; 50 mM 아세트산나트륨, pH 4.8; 50 mM 아세트산나트륨, 170 mM 염화나트륨, pH 4.8; 50 mM 아세트산나트륨, 250 mM 염화나트륨, pH 4.8; 50 mM 아세트산나트륨, 1 M 염화나트륨, pH 4.8; 50 mM 아세트산나트륨, pH 4.0 및 10 mM 시트르산염, pH 6.5를 포함한다.
다음은 실시예 2 공정으로부터 보툴리눔 신경독소 A 형을 수득하고 정제하기 위한 조업의 예이다. 모든 생성물-접촉 부품은 비-반응성이고 비-흡수성임을 보장하도록 설계되고 구성되었다. 추가적으로, 모든 기구가 단일 사용 일회용 시스템의 이용을 허용하도록 설계되거나, 문서화된 입증 방법에 따라 위생처리, 세정 및 오염제거를 용이하게 하도록 설계되고 구성되었다. 크로마토그래피 컬럼 및 모든 관련 배관을 포함하는 시스템 또는 스키드는 흐름 경로가 단일 사용 일회용으로 설계되는 한, 생성물에 접촉하지 않도록 설계되었다. 크로마토그래피 컴포넌트는 AlphaBio로부터 입수되고 UF/DF 컴포넌트는 Scilog Inc로부터 입수되었다. 사용된 크로마토그래피 셋업은 변환 속도 드라이브(variable speed drive)를 가지는 용액 수송용 연동 펌프, 5 유입구를 가지는 유입구 밸브 매니폴드, 3 자동화 밸브의 배열을 가지는 컬럼 밸브 매니폴드, 3 유출구를 가지는 유출구 밸브 매니폴드, pH, 전도도, 및 UV, UV 흡광도에 기초한 피크 수집을 포함하는 컬럼 유출액 모니터링, 및 정제 조업을 완료하기 위하여 필요한 계측장비 및 제어부를 포함했다. 제어 시스템은 정제 공정을 제거하도록 설계된 소프트웨어 및 하드웨어를 가졌다. 명령 및 데이터가 HMI (인간 기계 인터페이스(Human Machine Interface)) 터미널을 통하여 입력되었다. 작업자는 HMI에서의 명령에 의하여 모든 자동화 공정 기능을 개시하고, 공급 유량, 압력, 전도도, pH, UV 흡광도 및 개별적인 밸브 위치와 같은공정 파라미터를 모니터링하고 조정했다.
UF/DF 시스템은 재순환 펌프, 정용여과 펌프, 2 저울 및 접선 흐름 필터(TFF) 홀더를 포함했다. 재순환 펌프는 투과액 저장고의 중량에 기초하여 유량을 제어하여 한정된 막간차압을 유지하고 정지하기 위하여 3 개의 일회용 압력 센서 및 (투과액 저장고 아래에 위치된) 저울 중 하나와 접속했다. 정용여과 펌프는 체류액 저장고의 일정한 중량 유지에 기초하여 시작 및 정지하기 위하여 (체류액 저장고 아래에 위치된) 두 번째 저울과 접속했다.
수확 단계(동물 단백질이 없는 발효 배지 수확)에서 나온 체류액 물질의 농축 및 희석 후, 물질이 음이온 교환 컬럼에 로딩되었다. 다음은 실시예 2의 2컬럼 공정에서 유용한 음이온 교환 컬럼 패킹 및 테스트를 위하여 이용된 절차이다.
사전-패킹된 컬럼이 셋의 모든 크로마토그래피 단계를 위하여 사용되었다. 첫 번째로, 공급 물질(한외여과/희석을 거친 수확된 APF 배지)이 음이온 교환 컬럼(상기한 바와 같이 ABI의 Poros 50HQ)을 통과했다. 최소한 5 컬럼 부피(CV)의 50mM 인산나트륨, pH 6.5가 음이온 교환 컬럼(이 예에서, 포획 컬럼)을 평형시키기 위하여 이용되었다.
평형 후, 로딩 단계가 수행되었고, 여기서 공급 물질(예를 들어 약 20 L의 수확 단계 후 수확 발효 육즙)이 예를 들어 약 200 cm/hr의 속도로 음이온 교환 컬럼에 로딩되었다. 0.5 컬럼 부피의 로딩된 물질이 음이온 교환 컬럼을 통과한 후, 독소 복합체가 음이온 교환 컬럼 물질에 결합되는 동안, 흐름 통과(flow through, FT) 풀이 폴리에테르설폰 용기와 같은 저장소에 수집되었다. 이에 세척 단계가 이어졌고, 여기서 최소한 약 15 컬럼 부피의 세척 완충제(예를 들어 pH 6.5의 50 mM 인산나트륨)가 음이온 교환 컬럼을 통과했다. 컬럼 유출구에서 실시간으로 측정된 UV가 약 80 mAU 이하로 감소했을 때 세척 단계가 정지되었다. 세척 완충제 부피 및 흐름 통과/세척 풀 부피가 기록되었고, 1 mL 샘플의 흐름 통과/세척 풀이, 예를 들어 독소 농도, 핵산 함량, 전체 세포 단백질, SDS-PAGE, qPCR, 2D LC 및 ELISA를 위하여 취해지고 테스트되었다.
다음 단계는 용리 단계였고, 여기서 용리 완충제(예를 들어 50 mM 아세트산나트륨, pH 4.8)가 음이온 교환 컬럼에 펌핑되었다. 컬럼 유출구에서의 UV 눈금이 실시간으로 약 150 mAU 이상까지 증가했을 때, 1 CV의 용리 완충제(50 mM 아세트산나트륨, pH 4.8)로 사전-충전된 용기에서 용리액의 수집이 시작되었다. UV 눈금이 약 200 mAU 이하로 감소되었을 때 용리액 풀의 수집이 정지되었다 (이 시점에서 수집된 부피는 약 1 내지 약 2 CV임). 이후 크로마토그래피 시스템이 1 N 수산화나트륨을 사용하여 오염제거되고 세정되었다.
이후 음이온 교환 컬럼에서 나온 용리액 풀이 양이온 교환 컬럼에 첨가하기 위하여 준비되었다. 음이온 교환 용리액 부피, pH, 전도도 및 공급 온도가 기록되었고, 음이온 교환 컬럼에서 나온 용리액 풀이 1 CV의 50 mM 아세트산나트륨, pH 4.8로써 희석되었다.
음이온 교환 컬럼의 런-스루(run-through) 이후, 양이온 교환 크로마토그래피 조업이 착수되었다. 양이온 교환 컬럼(예를 들어 Poros® 20HS)이 최소 5 CV의 평형 완충제(50 mM 아세트산나트륨, pH 4.8)로써 평형화되었다. 평형 후, 음이온 교환 컬럼에서 나온 희석된 용리액 풀이 양이온 교환 컬럼에 로딩되고 로딩된 총 부피가 기록되었다. 0.5 컬럼 부피의 로딩된 희석된 용리액 풀이 양이온 교환 컬럼을 통과한 후, 흐름 통과(FT) 풀이 수집되었다. 양이온 교환 컬럼의 제1 세척이 수행되었고 여기서 약 3-5 CV의 50mM 아세트산나트륨, pH 4.8이 양이온 교환 컬럼을 통과했다 (이용된 제1 세척 완충제의 부피가 기록되었다). 제2 세척이 수행되었고, 여기서 약 3 CV의 170 mM 염화나트륨, 50 mM 아세트산나트륨, pH 4.8이 컬럼을 통하여 펌핑되었고, 이 용리액은 "WASH 2 Peak"로 표지된 새로운 용기에 수집되었다. UV 눈금이 50 mAU 이상까지 증가했을 때 수집이 시작되었다. 1 CV가 수집되고 이용된 제2 세척 완충제 부피가 기록되었다.
양이온 교환 컬럼으로부터의 벌크 독소 복합체 용리가 양이온 교환 컬럼에 펌핑된 용리 완충제(예를 들어 50 mM 아세트산나트륨 중의 250 mM 염화나트륨, pH 4.8)를 이용하여 수행되었다. 용리의 UV 눈금이 최소한 약 100 mAU에 도달했을 때, 희석 완충제(40 mL의 100 mM 인산칼륨, pH 6.8 및 60 mL의 10 mM 시트르산칼륨, pH 6.5)로 사전-충전된 용기에 용리액 수집이 시작되었다. 양이온 교환 컬럼으로부터의 용리액 수집은 UV 눈금이 약 100 mAU 이하로 감소할 때까지 계속되었다. 희석 후 용리액의 총 부피가 기록되었다. 이후 양이온 교환 크로마토그래피 시스템이 오염제거되고 세정되었다.
양이온 교환 컬럼으로부터의 용리 이후, 용리액은 여과를 거쳤다. 서로 적층된 3 개의 100K MWCO 막(Sartorius AG, Goettingen, Germany)을 사용하는 접선 흐름 여과(TFF) 시스템이 이용되었다. 정용여과/평형 및 위생처리 용액 기재가 그러하듯이, 양이온 교환 용리액 풀 초기 부피가 기록되었다. 예를 들어, 정용여과 용액은 10 mM 시트르산칼륨, pH 6.5일 수 있고, 위생처리 용액은 0.1 N 수산화나트륨일 수 있다. 시스템 셋업이 양이온 컬럼(IAPF) 또는 HIC 컬럼(FAPF)에서 나온 보툴리눔 독소 함유 용리액을 수용하는 저장고로부터의 한 튜브를, 접선 흐름 여과막의 유입구로의 한외여과 펌프 헤드를 통하여 연결하여 진행되었다. 접선 흐름 여과막의 투과액 유출구로부터의 제2 튜브는 한외여과 (UF) 투과액 컨테이너에 연결되었다. 체류액 저장고를 향한 접선 흐름 여과막의 체류액 유출구로부터의 튜브가 잠그어졌고, 정용여과 펌프 헤드를 통하고 체류액 저장고를 향한 정용여과(DF) 완충제로부터의 제4 튜브 또한 잠그어졌다. 막이 그러하듯이 시스템의 보관 완충제가 폐기물을 향한 체류액을 포함하는 최소한 약 720 mL의 주사용수(WFI)로써 막을 플러싱하여 플러싱되었고, 그 후 막이 저장고로 재순환되는 체류액을 포함하는 최소한 약 4200 mL의 주사용수로써 추가로 플러싱되었다. 이후, (필요한 경우) 막 위생처리가 폐기물을 향한 체류액을 포함하는 최소한 약 200 mL의 1N 수산화나트륨으로써 막을 플러싱하고, 이어서 저장고로 재순환되는 체류액을 포함하는 최소한 약 200 mL의 1N NaOH로써 막을 플러싱하여 최소 30 분 동안 수행되었다. 이후 체류액 및 투과액 pH가 평형 완충제 pH의 +/- 0.2 유닛 이내(예를 들어, pH 6.5의 +/- 0.2 유닛 이내)일 때까지 폐기물을 향한 체류액을 포함하는 평형 완충제(pH 6.5의 10 mM 시트르산칼륨)로써 막을 플러싱하여 평형화가 수행되었다.
희석 또는 농축(예시적 가공)이 적절했는지를 알아보기 위하여 물질(양이온 교환 컬럼에서 나온 용리액(생성물 풀))의 농도가 결정되었다 (예시적 표적 농도는 약 0.7 mg/mL일 수 있다). 희석이 10 mM 시트르산칼륨, pH 6.5를 이용하여 수행되었다. 표적 부피가 예를 들어 0.7 mg/mL 생성물 농도에 대하여 결정되었다 (표적 부피 = (출발 농도/출발 부피)/0.7 mg/mL).
생성물 풀((따라서 가공되거나 가공되지 않은) 양이온 교환 컬럼에서 나온 용리액)이 막에 로딩되고, (폐쇄된 투과액 유출구로써) 시스템(TFF 시스템)의 재순환이 배압(backpressure) 없이 최소한 2 분 동안 가동되었고, 그 후 투과액 밸브가 체류액 배압 밸브를 표적의 약 7 psig 막간차압으로 조정하면서 천천히 개방되었다. 희석을 위하여, 10 mM 시트르산칼륨, pH 6.5가 표적 부피에 첨가되고, 한외여과 없이 정용여과를 착수하고; 농축을 위하여, 한외여과가 시작된다. 정용여과를 위하여: 투과액 폐기물이 새로운 컨테이너에 수집되고 (표적 정용여과 부피는 5X 정용여과 부피이다) 최소한 5 정용여과 부피의 10 mM 시트르산칼륨, pH 6.5로써 정용여과되었다. 정용여과 공정 데이터가 최소 10-분 간격으로 수집되었다 (투과액 중량 g/부피 mL, 유입구 압력 (psig), 체류액 압력 (psig), 투과액 압력 (psig) 및 막간차압 (psig)). 재순환/및 헹굼을 위하여: 투과액 유출구 필터가 폐쇄되어, 시스템이 배압 없이 최소한 2 분 동안 재순환/가동되고, 시스템이 최소한 20 mL의 10 mM 시트르산칼륨, pH 6.5로 헹구어졌다. 생성물 풀은 체류액 및 헹굼액을 포함한다. 샘플이 생성물 풀로부터 취해지고, 예를 들어, 278nm에서의 UV, SDS-Page, LcHPLC. SE-HPLC, qPCR, RP-HPLC, Native-Page, AUC, Limulus amebocyte lysate, 웨스턴 블롯 및 ELISA 테스트를 포함하는 확인 분석을 거칠 수 있다. 사용 후 세정을 위하여, 시스템이 최소한 10 분 동안 재순환된 1N 수산화나트륨으로 플러싱되고, 그 후 시스템이 그 안의 0.1 N 수산화나트륨으로 플러싱되고 보관되었다.
이후 벌크 신경독소 보관 및 분할을 위하여 멸균 여과 및 충전이 수행되었다. 농도 조정은 헹굼 후 샘플로써 10 mM 시트르산칼륨, pH 6.5를 사용하여 독소 농도를 약 0.5 mg/mL로 조정하도록 수행되었다. 독소 농도가 약 0.5 mg/mL 미만일 경우, 농도 조정이 필요하지 않다.
멸균 피펫을 사용하여, 멸균 mL/1.5mL 샘플 튜브 각각으로의 10mL/0.75mL 분취물이 제조되었다. 생성물 컨테이너는 손으로 부드럽게 교반되고 원하는 양의 용액(벌크 약물 물질, 즉 벌크 보툴리눔 독소 함유)을 각 바이알에 옮겼다. 샘플이 최대 5 일 동안 2 ℃ - 8 ℃ 냉장고에서 보관되거나 0.75 mL의 여과액 생성물 풀이 냉동바이알로 옮겨졌다. 냉동바이알은 -70 ℃ +/- 5 ℃에서 보관된다.
실시예 3
조합 방법
환자에게 투여하기에 적절한 약제학적 조성물이 실시예 2 공정으로부터 수득된 보툴리눔 신경독소를 한 가지 이상의 부형제와 조합하여 제조될 수 있다. 부형제는 조합 공정 동안 및 추후의 사용 전 보관 기간 동안 보툴리눔 독소를 안정시키는 작용을 할 수 있다. 부형제는 또한 증량제로서 기능을 하거나 및/또는 약제학적 조성물에 얼마간의 장성(tonicity)을 제공하는 기능을 할 수 있다. 조합은 한 가지 이상의 부형제(예컨대 알부민 [예컨대 인간 혈청 알부민 또는 재조합 인간 알부민] 및 염화나트륨)와 혼합하여 실시예 2 공정으로부터 수득된 보툴리눔 신경독소를 수배로 희석하는 것을 필요로 하고, 이에 의하여 독소 조성물을 형성하고, 조성물을 동결건조, 냉동건조 또는 진공건조하여 독소 조성물의 보관 및 출하 안정 형태를 제조한다. 따라서, 약 1.5 내지 1.9 ng의 실시예 2 수득된 보툴리눔 독소 A 형 복합체가 약 0.5 밀리그램의 재조합 인간 알부민 (Delta Biotechnologies) 및 약 0.9 밀리그램의 염화나트륨과 함께, 이들 세 가지 성분을 함께 혼합하고 이어서 진공건조하여 조합된다. 진공건조는 약 20 ℃ 내지 약 25 ℃, 약 80 mm Hg의 압력에서, 약 5 시간 동안 일어날 수 있고, 이때 상기 성분들이 있는 바이알이 진공건조되고 진공하에 밀폐되고 막아져, 이에 의하여 약 100 유닛의 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체를 포함하는 바이알을 수득한다. 생성된 고체 (분말화) 진공건조 생성물은 사용 시 일반 (0.9%) 식염수로써 복원되고 경부 근긴장이상증 및 다한증과 같은 다양한 적응증을 가지는 환자 치료에 사용된다. 동결건조, 진공 또는 냉동건조는 보관 및 출하 안정 형태의 복합된 보툴리눔 신경독소를 제조한다.
또 다른 예에서, 약 1.5-1.9 ng의 벌크 보툴리눔 독소 A 형이 약 0.5 밀리그램의 인간 혈청 알부민(Baxter/Immuno, Octapharma, and Pharmacia & Upjohn) 및 약 0.9 밀리그램의 염화나트륨과 함께, 이들 세 가지 성분을 함께 혼합하고 이어서 진공건조하여 조합된다. 예시적인 진공건조가 약 20 ℃ 내지 약 25 ℃, 약 80 ㎛ Hg의 압력에서 약 5 시간 동안 일어날 수 있고, 이때 상기 성분들이 있는 바이알이 진공건조되고 진공하에 밀폐되고 막아져, 이에 의하여 약 100 유닛의 보툴리눔 독소를 포함하는 바이알을 수득한다. 생성된 고체 (분말화) 진공건조된 생성물은 사용 시, 일반 (0.9%) 식염수로써 복원되고 경부 근긴장이상증 및 다한증과 같은 다양한 적응증을 가지는 환자 치료에 사용된다. 추가적으로, 약제학적 보툴리눔 독소 조성물이 예를 들어 인간 혈청 알부민 및/또는 락토오스를 함유할 수 있다. 한 예에서, 예를 들어 약 1.5-1.9 ng의 벌크 보툴리눔 독소 A 형이 약 125 마이크로그램의 인간 혈청 알부민, 및 2.5 밀리그램의 락토오스와 조합되되고 보관 안정성을 위하여 진공 전고, 동결건조 또는 냉동건조될 수 있다. 또 다른 예에서, 본 명세서에 개시된 공정에 의하여 수득된 약 1.5-1.9 ng의 보툴리눔 신경독소가 약 10 mg의 트레할로오스 및 약 0.5 mg의 혈청 알부민(예컨대 인간 혈청 알부민, 천연 또는 재조합), 그리고 선택적으로 약 1 밀리그램의 메티오닌과 조합되어 약 100 유닛의 보툴리눔 독소 건조 생성물을 제공할 수 있다. 이 조성물은 예를 들어 동결건조되고 사용 전에 약 1 mL의 증류 멸균수 또는 멸균 무보존(unpreserved) 식염수(주사용 0.9% 염화나트륨)로써 복원될 수 있다. 특정 예에서, 약제학적 보툴리눔 독소 조성물은 인간 혈청 알부민 20% 및 수크로오스와 조합된, 본 명세서에 개시된 공정에 의하여 수득된 약 1.5-1.9 ng의 보툴리눔 신경독소를 가지는 예시적 제제에서와 같이 수크로오스를 포함할 수 있고, 상기 제제는 또한 동결건조되어 약 100 유닛의 보툴리눔 독소 A 형을 제공하고, 무보존 식염수(예를 들어 약 0.5 mL 내지 약 8.0 mL 부피)로 나중에 복원될 수 있다. 특정 예에서, 200 유닛의 보툴리눔 신경독소가 mL당 약 10 mg의 수크로오스 및 2 mg의 인간 혈청 알부민과 조합될 수 있고, 나중에 사용 전에 생리 식염수로써 복원될 생성된 조성물이 바이알에 넣어지고 냉동건조되었다.
추가적으로, 조합이 또한 본 명세서에 개시된 IAPF 공정에 의하여 수득 가능한 보툴리눔 독소 A 형 복합체의 신경독성 성분(즉 복합 단백질이 없는 보툴리눔 독소 A 형 복합체의 약 150 kDa 성분)을 이용할 수 있다. 결합된 비-독성 단백질(예를 들어 HAs, NTNH)로부터 약 150 kDa 신경독성 성분을 정제하는 한 방법에서, A 형 신경독소가 Tse et al. (1982)(Goodnough, M. C., 1994, Thesis, UW, Wis.)의 방법의 변형에 의하여 복합체의 결합된 비-독성 단백질로부터 정제된다. (앞에서 논의한 바와 같이 2-컬럼 음이온-양이온 또는 3-컬럼 음이온-양이온-HIC 단계를 이용하는) 본 발명의 IAPF 공정에 의하여 수득되는 보툴리눔 신경독소 복합체가 DEAE-Sephadex A 50 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), pH 5.5, 컬럼으로부터 회수되고, 39 g의 고체 황산암모늄/100 mL 첨가에 의하여 침전된다. 침전된 독소 복합체가 원심분리에 의하여 수집되고, 25 mM 인산나트륨, pH 7.9에 대하여 투석되고, 동일한 완충제로써 평형화된 DEAE-Sephadex A50 컬럼에 가해진다. 신경독성 성분이 복합체의 비-독성 단백질로부터 분리되고, 선형 0-0.5 M 염화나트륨 구배로 컬럼으로부터 용리된다. 부분적으로 정제된 신경독소 성분은 pH 7.9에서 DEAE-Sephadex A50 컬럼으로부터 회수되고, 25 mM 인산나트륨, pH 7.0에 대하여 투석된다. 투석된 독소는 25 mM 인산나트륨, pH 7.0 중에서 SP-Sephadex C50 (Sigma Chemical Co.)에 가해진다. 오염 물질은 이러한 조건하에 컬럼에 결합하지 않는다. 순수 신경독소(약 150 kDa 성분)가 선형 0-0.25 M 염화나트륨 구배로 용리된다. 약 150-kDa 순수 신경독소는 금속 친화성 크로마토그래피, 겔 여과 또는 다른 단백질 크로마토그래피 방법에 의하여 추가로 정제될 수 있다. 상기와 같이, 이러한 순수 신경독소(보툴리눔 독소 복합체의 약 150 kDa 신경독성 성분)가 앞에서 논의된 다양한 부형제(예를 들어 혈청 알부민, 수크로오스, 락토오스, 염화나트륨, 트레할로오스 등)와 함께 동결건조, 진공 또는 냉동-건조될 수 있다.
본 발명의 IAPF 공정에 의하여 수득된 벌크 보툴리눔 신경독소 복합체는, 다양한 방식으로 조합될 수 있다. 보툴리눔 독소의 다양한 제제를 개시하는 대표적인 특허, 예컨대 미국 특허 제6,087,327호 (젤라틴과 함께 제제화된 보툴리눔 독소 A 및 B 형의 조성물을 개시함); 1996년 4월 30일 등록되고 발명의 명칭이 "Pharmaceutical Composition of Botulinum Neurotoxin and Method of Preparation"이며 37 ℃에서 보관 안정성인 알부민 및 트레할로오스 포함 순수 보툴리눔 A 형 제제를 청구하는 미국 특허 제5,512,547호 (Johnson et al); 1998년 5월 26일에 등록되고 25 ℃ 내지 42 ℃에서 보관될 수 있는 티오알킬, 알부민 및 트레할로오스 포함동결건조된 보툴리눔 독소 제제를 청구하는 미국 특허 제5,756,468호 (Johnson et al) ("Pharmaceutical Compositions of Botulinum Toxin or Botulinum Neurotoxin and Method of Preparation"); 1997년 12월 9일에 등록되고 발명의 명칭이 "Pharmaceutical Composition Containing Botulinum B Complex"이며 B 형 복합체 및 단백질 부형제를 포함하는 냉동건조된, 염화나트륨이 없는 보툴리눔 B 형 복합체 제제를 청구하는 미국 특허 제5,696,077호 (Johnson et al); 및 보툴리눔 독소를 안정시키기 위한 재조합 알부민, 콜라겐 또는 녹말과 같은 다양한 부형제의 사용을 개시하는 미국 특허 공개공보 제2003 0118598호 (Hunt) (이러한 공개된 미국 특허 출원 또는 미국 특허 모두가 전체가 참조문헌으로 포함된다), 모두 본 발명의 IAPF 공정에 의하여 제공된 벌크 보툴리눔 신경독소 복합 및 약제학적 조성물 제공에 사용될 수 있는 다양한 유용한 제제/부형제의 예를 제공한다.
수득된 보툴리눔 독소 복합체는 pH 7-8 완충제에서 이온 교환 컬럼으로부터 용리되어 보툴리눔 독소 분자로부터 비독소 복합체 단백질을 해리시킬 수 있고, 이에 의하여 (발효된 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아의 유형에 따라) 대략 150 kDa 분자량, 및 1-2 X 108 LD50 U/mg 이상의 특이역가를 가지는 보툴리눔 독소 A 형 신경독성 성분; 또는 대략 156 kDa 분자량 및 1-2 X 108 LD50 U/mg 이상의 특이역가를 가지는 정제된 보툴리눔 독소 B 형, 또는 대략 155 kDa 분자량 및 1-2 X 107 LD50 U/mg 이상의 특이역가를 가지는 정제된 보툴리눔 독소 F 형을 제공한다.
본 발명은 많은 이점을 제공한다. 첫 번째로, 실시예 2의 2 및 3 컬럼 공정은 동물 원천 시약 및 배지(예를 들어 카제인 가수분해물 및 콜롬비아 혈액 한천 플레이트)의 사용을 제거하고, 따라서 프리온과 같은 작용원 또는 다른 감염원에 환자가 노출될 이론적 위험을 현저하게 감소시킨다. 실시예 2의 두 번째로, 2 및 3 컬럼 크로마토그래피 공정 (및 관련 시스템과 장치)은 우수한 배치마다의 일관성에의하여 증명되는 바와 같이 매우 재현성이다. 이러한 개선은 상용화되어 입수 가능한 화합물 포함 보툴리눔 독소로써 수년에 걸쳐 반복된 치료를 필요로 하는 환자에서 더욱 일관된 임상 프로파일로 전환된다. 본 명세서에 개시된 IAPF 공정(2 및 3 컬럼)의 약물 물질(보툴리눔 신경독소) 분석 연구는 더 낮은 부하의 단백질 및 핵산 불순물을 나타냈다. 이러한 더 낮은 부하의 단백질 불순물은 더 낮은 면역원성 (항체 생산) 위험으로 전환된다. 더욱이, IPAF 공정의 개선된 순도는 생물학적 약물과 통상적으로 관련된 비-특이적 증상(예를 들어, 비인두염, 상기도 증상, 근골격 증상, 두통 등)의 더 낮은 발생으로 전환된다. 더욱이, 이 공정의 개선된 축소 규모는 연구실 및 제조 설비 직원에 대한 BoNT/A 노출 위험을 감소시킨다.
본 발명의 대표적인 장점은, 예를 들어 다음을 포함한다:
1. 동물 원천(예를 들어 인간 또는 동물)으로부터 유래된 성분 또는 물질이 공정에서 사용되지 않고, DNase 및 RNase, 콜롬비아 혈액 한천 플레이트, 카제인의 사용이 제거되므로 (예를 들어, 정화/수확 단계 및 현대의 크로마토그래피 기법 동안의 하전 여과에 의하여; 제조용 세포 은행으로부터의 세포, 즉 사전에 선택되고 APF 배지에서 증식/유지된 세포로서 배양 배지에 직접 종균하는 것에의하여 대체되고; 배양 병 및 발효 매질이 펩톤원으로서 대두 펩톤 타입 II(SPTII)로 대체됨) 안정성이 개선된다.
2. 10 L의 발효 배지당 약 50 mg 내지 약 200 mg의 고품질 보툴리눔 독소 A 형 복합체가 수득될 수 있다.
3. 정제된 벌크 독소가 확고성(robust), 일관성(consistent), 규모변화성(scalable), 입증성(validatable), 및 cGMP 순응성(compliant)인 공정으로부터 수득된다. 확고성은 공정 파라미터 중 한 가지 이상의 약 ± 10% 변화 시에도 공정이 재현성임을 의미한다. 입증성은 공정이 재현적으로 일관된 정제된 독소 수율을 제공함을 의미한다. cGMP 순응성은 공정이 FDA 요구의 현행 우수 제조 관리기준(current Good Manufacturing Practices)에 순응하는 제조 공정으로 쉽게 전환될 수 있음을 의미한다.
4. 최종 정제된 보툴리눔 독소 복합체의 역가가 Schantz 또는 변형된 Schantz 공정으로부터 수득된 정제된 보툴리눔 독소 복합체의 역가(예를 들어 MLD50 검사에 의하여 결정됨)를 충족시키거나 이를 초과한다.
5. 임의의 침전 단계를 벌크 보툴리눔 독소 복합체를 정제하기 위하여 크로마토그래피 단계로 대체하고, 이는 정제 공정의 특이성(specificity)을 개선한다.
6. 새로운 개선된 공정은 개선된 취급 및 95% 초과(>95%)의 조업 성공률 달성을 야기하는 규모 축소를 용이하게 한다 (예를 들어, 110 L -120 L의 발효 배지를 이용하는 전형적인 부피로부터 약 10 L 내지 약 50 L로 축소시키고, 심지어 약 2 L 내지 약 30 L의 발효 배지 또는 그 사이의 양으로 축소시킴). 전형적인 현행 벌크 약물 물질 제조 규모는 115 L의 비-APF 발효 배지이고, 본 발명의 한 양태와 같이 20 L의 발효 배지로 축소되었다. 이러한 규모 축소는 BoNT/A 복합체의 합성 및 세포 방출 뿐만 아니라 정제 단계에 걸친 전체 수율을 최적화하여 가능하게 되고, 예를 들어 5X 이상의 발효 부피(예를 들어 115 L)를 필요로 하는 종래 공정에서 수득된 것과 같은 유사한 양의 최종 벌크 보툴리눔 독소(약물 물질)를 야기한다. 이러한 축소된 규모는 발효 작업 부피의 관리를 더 쉽게 만들고, 따라서 조업자가 BoNT/A 복합체에 노출될 잠재적 위험을 최소화하며, 이는 중요한 조업적, 안전성 장점이다.
7. BoNT/A 복합체의 잠재적 치사 성질로 인하여, 본 명세서에 개시된 제조 공정 전반에 걸쳐 폐쇄 시스템이 이행되었다. 종래기술 방법과는 달리, 본 발명의 양태에 따라 생성된 약물 물질이 유닛 조업 사이의 이송 동안 환경에 노출되지 않고; 모든 조업이 완전히 포함된다.
8. 본 명세서에 개시된 벌크 보툴리눔 독소 제조 공정이 제조 동안 약물 물질의 동일성, 품질, 순도 또는 역가를 희생시키지 않고 모든 단계에서 단순화된다. 비-APF 공정에서 이용된 다수의 단계가 재설계된 IAPF 공정에서 제거되었고, 이에 의하여 생산 시간을 예를 들어, 21 일로부터 6 일 이하로 단축시킨다.
9. 냉동 용액으로서 벌크 보툴리눔 독소를 보관하는 조건은 약물 물질 안정성을 크게 개선한다.
다양한 간행물, 특허 및/또는 참조문헌이 본 명세서에 언급되었고, 이들의 내용은 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다. 본 명세서에 개시된 본 발명의 대안의 요소 또는 구체예의 분류가 제한으로 간주되지 않아야 한다. 각 군 일원이 개별적으로 또는 그룹의 다른 일원 또는 본 명세서에서 발견되는 다른 요소와 임의의 조합으로 지칭되고 청구될 수 있다. 군의 하나 이상의 일원이 편의성 및/또는 특허성의 이유로 군에 포함되거나 군으로부터 제거될 수 있음이 예상된다. 더욱이, 모든 가능한 변형에서 상기 요소의 임의의 조합이, 본 명세서에 달리 지시되지 않고 문맥에 의하여 명백히 부정되지 않으면, 본 발명에 포함된다.
비록 본 발명이 특정한 바람직한 방법에 관하여 상세하게 기재되기는 했지만, 본 발명의 범위 내의 다른 구체예, 버전, 및 변형이 가능하다. 따라서, 다음 청구항의 사상 및 범위가 앞에서 제시된 구체예의 특정 설명으로 제한되지 않아야 한다.

Claims (30)

  1. 다음의 단계를 포함하는, 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체를 생성하기 위한 공정:
    (a) 동물 단백질이 없는(animal protein free) 발효 배지를 제공하는 단계;
    (b) 발효 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 발효시키는 단계, 여기서 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아가 보툴리눔 신경독소를 생성함;
    (c) 세포 파편을 제거하여 발효 배지를 수확하는 단계;
    (d) 여과에 의하여 수확 발효 배지를 농축하는 단계;
    (e) 완충제를 첨가하여 농축된 발효 배지를 희석하는 단계;
    (f) 희석된 수확 발효 배지를 음이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 제1 접촉 단계를 수행하여 배지 내 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소를 음이온 교환 매질로써 포획하는 단계;
    (g) 음이온 교환 매질로부터 포획된 보툴리눔 신경독소를 용리하여 제1 용리액을 수득하는 단계;
    (h) 제1 용리액을 양이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 제2 접촉 단계를 수행하여 제1 용리액으로부터 불순물을 제거하고, 이에 의하여 제2 용리액을 수득하는 단계;
    (i) 제2 용리액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 매질과 접촉시키고 용리하여 제3 용리액을 수득하는 제3 접촉 단계를 수행하는 단계;
    (j) 정용여과에 의하여 제3 용리액을 가공하는 단계; 및
    (k) 가공된 제3 용리액을 여과하여 2.0 x 107 내지 6.0 x 107 유닛/mg의 역가를 갖는 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소 A 형 복합체-함유 생성물을 수득하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 수득된 생물학적으로 활성인 보툴리눔 신경독소 A 형은, 수득된 보툴리눔 신경독소 A 형의 각 mg에 대하여 1 ng 또는 1 ng 미만의 잔류 핵산을 포함하는 것인 공정.
  3. 제1항에 있어서, 1주일 이내에 수행되는 공정.
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