CN105658662B - 制备高纯度的肉毒杆菌毒素神经毒性组分的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过在允许产生肉毒杆菌毒素的条件下培养肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、并从所述肉毒杆菌毒素分离神经毒性组分来制备高纯度的肉毒杆菌毒素神经毒性组分的方法。另外，本发明涉及可通过本发明的方法获得的高纯度的肉毒杆菌毒素神经毒性组分及其应用。

Description

制备高纯度的肉毒杆菌毒素神经毒性组分的方法及其应用
技术领域
本发明涉及通过在允许产生肉毒杆菌毒素的条件下培养肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)、并从所述肉毒杆菌毒素分离神经毒性组分来制备高纯度的肉毒杆菌毒素神经毒性组分的方法。另外，本发明涉及可通过本发明的方法获得的高纯度的肉毒杆菌毒素神经毒性组分及其应用。
背景技术
肉毒杆菌毒素是针对人类的最强有力的蛋白质毒素。它们通过阻断神经肌肉接头处的乙酰胆碱释放起作用，导致肌肉去神经支配。肉毒杆菌毒素在其他周围性胆碱能神经末梢处也具有活性并引起，例如，减少唾液分泌或出汗以及减轻面部的纹路和皱纹。由于它们作用方式的特殊性，肉毒杆菌毒素的临床应用范围在持续增长，并且肉毒杆菌毒素如今被广泛用作药学美容品。
肉毒杆菌毒素由特定梭菌菌属合成和释放，其形式为包含肉毒杆菌毒素分子(“神经毒性组分”)和相关的非毒性细菌蛋白质(也称为“复合蛋白质”)的大复合体。所述复合蛋白质包括不同的非毒性血凝素(HA)蛋白质和非毒性的非血凝素(NTNH)蛋白质。所述毒素复合体的分子量在七种不同的肉毒杆菌毒素血清型(A，B，C，D，E，F和G)之中为从约300kDa至约900kDa不等。所述复合蛋白质给所述神经毒性组分提供了稳定性。与所述毒素复合体不同，所述神经毒性组分在它的分离和纯粹形式、即没有任何复合梭状芽胞杆菌蛋白质下，是酸不稳定性的并且不耐受胃肠道中的侵蚀性环境。
对于全部七种已知的肉毒杆菌毒素血清型来说，所述神经毒性组分是以分子量约150kDa的无活性单链前体(未裂解的多肽)合成的。这种单链前体通过蛋白质水解性裂解被活化，产生二硫键连接的双链蛋白质。50kDa的轻链含有催化结构域，而100kDa的重链含有内部易位结构域和受体结合结构域。所述100kDa的重链介导了与突触前胆碱能神经末梢的结合和毒素进入细胞的内化。所述50kDa的轻链负责毒性效应，充当锌-内肽酶和裂解负责膜融合的特殊蛋白质(SNARE复合体的蛋白质)。通过破坏神经细胞内的膜融合过程，肉毒杆菌毒素阻止乙酰胆碱释放到突触间隙中。
1989年，A血清型肉毒杆菌毒素复合体(BoNT/A-复合体)在美国首次被批准为人类所用，用于治疗斜视、眼睑痉挛和其他失调。如今，“A”形式的肉毒杆菌毒素复合体可从若干来源商购，例如以商品名
Figure BDA0000918567160000021
得自Allergan、以商品名
Figure BDA0000918567160000022
得自Ipsen、和以商品名
Figure BDA0000918567160000023
得自Galderma。
然而，在相当一部分情况下，患者响应反复的BoNT/A-复合体注射产生中和抗体。据认为，这种效应与BoNT/A-复合体的复合蛋白质有关。受到影响的患者变成所谓的“继发性非应答者(secondary non-responders)”，并且用BoNT/A-复合体治疗不再有效。发现这种抗体引起的治疗失败的风险影响了不少于10％至20％的治疗对象。与使用肉毒杆菌毒素复合体有关的另一个缺点是它在注射到靶肌肉中之后的区域性或全身性扩散。例如，利用单纤维肌电图(SF-EMG)的研究显示在远离注射部位的肌肉中抖动增加。
在施用纯神经毒性组分时，观察不到这些缺点。特别是，施用纯神经毒性组分降低了不响应或响应降低的风险，这对于进行长期治疗的患者特别重要。与纯神经毒性组分有关的其他利益包括快速发病效应和优良的温度稳定性，所述温度稳定性甚至消除了对冷藏链和在冰箱中储存的需要。只含有A型神经毒性组分而没有任何复合蛋白质的制剂可从Merz以商品名
Figure BDA0000918567160000024
和
Figure BDA0000918567160000025
商购。
所述神经毒性组分可通过培养产生肉毒杆菌毒素的梭状芽胞杆菌菌株并通过一系列沉淀和色谱步骤从所产生的肉毒杆菌毒素复合体分离所述神经毒性组分而制备。如果使用天然存在的梭状芽胞杆菌菌株，则肉毒杆菌毒素以其活性的急性毒性形式由梭状芽胞杆菌产生和释放。因此，必须采取专门的措施来避免对生产肉毒杆菌毒素和/或从所述毒素复合体提纯神经毒性组分所涉及的人员的不利健康后果。为了减少暴露于毒性气溶胶的风险，WO 2006/133818 A1提议，例如，在以低于周围生产室压力的较低压力下运行的隔离器中进行肉毒杆菌毒素的生产，以避免操作者与任何毒性物质的接触。
虽然WO 2006/133818 A1中描述的制造过程确保了足够的操作安全性，但它在所产生的神经毒性组分的纯度方面仍然留有改进的余地。在制药工业中，高化学和微生物纯度是至关重要的。因此，药物开发者的最终目标是达到尽可能高的药物纯度以建立期望的安全性和功效。
因此，本发明的目的是提供以安全的方式制备高纯度的肉毒杆菌毒素神经毒性组分的改进方法。
发明内容
在第一方面，本发明提供了制备高纯度的肉毒杆菌毒素神经毒性组分的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)在允许产生肉毒杆菌毒素的条件下培养肉毒杆菌，和
(b)从所述肉毒杆菌毒素分离神经毒性组分，
其中培养步骤(a)和分离步骤(b)在压力梯度装置中进行，所述装置包含第一隔离器单元，其含有培养肉毒杆菌的发酵罐，和任选的第二或另一个隔离器单元，以及安全工作台，所述工作台是II级BSC(生物安全柜)，配备了允许将材料无菌传送进出所述BSC的传送系统。
所述第一和第二或另一个隔离器单元位于生产室，所述生产室通过气锁与环境通连，其中所述第一和第二或另一个隔离器单元中的压力低于生产室中的压力，生产室中的压力低于环境压力，气锁中的压力高于环境压力。所述安全工作台也位于生产室中。
在另一个方面，本发明提供了高纯度的肉毒杆菌毒素神经毒性组分，其单链含量小于2.00wt％。
在又一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含如本文中所述的高纯度的肉毒杆菌毒素神经毒性组分和一种或多种可药用载体。
在再一个方面，本发明提供了如本文中所述的高纯度的肉毒杆菌毒素神经毒性组分用作药物。
在又一个方面，本发明提供了如本文中所述的高纯度的肉毒杆菌毒素神经毒性组分用于治疗与肌肉或外分泌腺的胆碱能神经支配活动亢进有关的疾病的治疗。
本发明的优选实施方式在所附的从属权利要求中阐述。
具体实施方式
意外地发现，有迄今尚未考虑过但可对肉毒杆菌毒素神经毒性组分的质量、特别是对纯度发挥深刻影响的关键生产参数。此外，本发明的生产方法符合与安全、健康和环境有关的法律要求，并奠定了安全和不危险的工作环境。换句话说，本发明是基于意外发现存在另外的制造过程操作模式，其不仅对于环境和人体健康问题安全，而且提供了优质的肉毒杆菌毒素神经毒性组分，特别是优质。
在第一方面，本发明涉及制备高纯度的肉毒杆菌毒素神经毒性组分的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)在允许产生肉毒杆菌毒素的条件下培养肉毒杆菌，和
(b)从所述肉毒杆菌毒素分离神经毒性组分。
在本文中使用时，术语“肉毒杆菌毒素”或“肉毒杆菌毒素复合体”是可互换的并且是指包含大约150kDa的神经毒性组分以及梭状芽孢杆菌菌属的非毒性蛋白质、包括血凝素和非血凝素蛋白质的高分子量复合体。此外，术语“肉毒杆菌毒素”和“肉毒杆菌毒素复合体”意欲涵盖全部七种毒素血清型(即A、B、C、D、E、F和G血清型)及其亚型(例如，A1，A2，C1，C2，等等)。
术语“神经毒性组分”，在本文中使用时，是指肉毒杆菌毒素复合体中包含的肉毒杆菌毒素蛋白质分子(也称为“纯毒素”或“纯神经毒素”)。换句话说，本发明含义内的“神经毒性组分”没有缔合并且缺乏任何相关的肉毒杆菌非毒素蛋白质、包括血凝素和非血凝素蛋白质。优选地，它也没有可能与所述神经毒性组分缔合的RNA。
还指出本发明含义内的“神经毒性组分”包括大约150kDa的单链前体蛋白质和蛋白水解加工的双链形式的神经毒性组分，后者包含大约50kDa的轻链(LC)和大约100kDa的重链(HC)，它们通常由一个或多个二硫键连接。本领域技术人员将领会，只有在蛋白水解活化之后才能达到完全的生物活性，即使可以设想到未加工的前体能够发挥一些生物功能。“生物功能”可以是指(a)受体结合，(b)内化，(c)跨内体膜易位到细胞溶质中，和/或(d)参与突触小泡膜融合的蛋白质的内切蛋白酶解。
优选地，所述神经毒性组分源自于天然存在的A、B、C、D、E、F或G血清型的肉毒杆菌毒素复合体。在本发明的情形内，特别优选的神经毒性组分源自于A血清型肉毒杆菌毒素，特别是源自于由Hall菌株(ATCC 3502)产生的A型肉毒杆菌毒素。然而，在本发明的情形内，神经毒性组分也可以是重组产生的组分，包括嵌合的(融合的)神经毒性组分。还包括含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或最多20个氨基酸突变的被遗传修饰的神经毒性组分。突变可以是取代、插入或缺失。另外，含有化学修饰的氨基酸、例如一个或多个被糖基化、乙酰化、脂化或以其它方式修饰的氨基酸的神经毒性组分，也包含在术语“神经毒性组分”内。
术语“高纯度神经毒性组分”在本发明的含义内是指纯化的神经毒性组分、或其组合物、制品或制剂，其基本不包含其他固体成分，并且其可以通过本文中详细描述的方法制备。此外，术语“高纯度”，在本文中使用时，是指不含复合蛋白质(产物相关的杂质)、其他梭状芽胞杆菌蛋白质(非产物相关的杂质)和非梭状芽胞杆菌蛋白质的肉毒杆菌毒素神经毒性组分、或其制剂、制品或组合物。优选地，术语“高纯度”是指总纯度至少99.90wt％，更优选至少99.95wt％，和最优选至少99.99wt％。“总纯度”是指基于本发明的高纯度神经毒性组分样品的总重量，单链和双链形式的神经毒性组分的重量百分比。根据本发明，所述纯度通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来评价。
在步骤(a)中，肉毒杆菌在合适的发酵培养基中培养(或发酵)，所述发酵培养基例如含有2％月示蛋白胨、1％酵母提取物、1％葡萄糖和0.05％硫代乙酸钠的培养基，以便产生肉毒杆菌毒素。在本文中使用时，术语“培养”与术语“发酵”可互换地使用。术语“肉毒杆菌”意图包括A、B、C、D、E、F或G型肉毒杆菌。在本发明的情形内，优选使用产生A型肉毒杆菌毒素的肉毒杆菌，即A型肉毒杆菌。在此特别优选使用的是A型肉毒杆菌Hall菌株(ATCC3502)(在下面称为“Hall菌株”)。培养肉毒杆菌以产生所述毒素复合体的方法是本领域中已知的(参见，例如，Schantz E.和Kautter D.，J.Assoc.Off.Anal.Chem.61：96-99，1978)。
本发明方法的步骤(a)中的发酵(培养)温度取决于所使用的具体的肉毒杆菌菌株和发酵条件。优选地，所述温度恒定保持在预先规定的窄温度范围内。例如，为了产生A型肉毒杆菌毒素，特别是Hall菌株，发酵温度优选设置和保持在33.5℃±1.0℃，更优选33.5℃±0.5℃，和最优选33.5℃±0.2℃。
本发明人发现，约33.5℃的恒温是肉毒杆菌毒素产生的最适温度。温度过高、过低和/或太多变将导致肉毒杆菌产生不合需要的化合物。令人惊讶地，发现如果发酵温度没有控制在上文指出的温度范围之内，则不想要的无活性单链形式的所述神经毒性组分的量明显增加。要强调的是，在本发明的情形内，所述单链形式的神经毒性组分被认为是不合需要的“杂质”，因为它没有被蛋白水解加工并且基本无活性。
根据本发明，所述发酵温度优选设置在并利用加热夹套保持在所指出的温度范围下。在本文中使用时，“加热夹套”是包围发酵罐的大表面积、通常是整个侧壁并可加热的材料。例如，加热夹套可以纳入不同的层来提供发酵所需要的温度稳定性，例如热电基底层用于加热、绝缘层用于避免温度损失和防水外层用于保护加热夹套免受发酵环境的危害。与通过加热棒提高和保持温度相反，使用加热夹套基本避免了培养基的不同位置之中的加热差异，即使培养基没有被搅拌，像本发明方法通常的情况那样，从而确保均匀的温度分布。
在发酵期间梭状芽胞杆菌培养物的生长(即细胞密度)优选通过培养物的浊度评价，所述浊度可以适当地通过联机光学探头监测。术语“浊度”，在本文中使用时，是指导致光散射和吸收而不是以直线透过样品的光学性质。浊度可通过可商购的浊度计测量。这些浊度计通常测量被存在于流体样品中的粒子以与入射光束成直角散射的光的量。在本情况下，浊度计用于测量被存在于培养基中的细菌细胞以相对于入射光束90°的角度散射的光。为了测量细胞密度，细胞密度在本文中定义为每单位体积培养物的肉毒杆菌细胞数量，所述浊度计用可商购的认证福尔马肼浊度标准品(即规定的粒子悬液)进行校准。测量的浊度值在本文中以福尔马肼浊度单位(FTU)表示。
在本发明的情形下，发酵通常持续到培养物的细胞密度在它已经由于细菌生长而增加后，由于细胞溶解而降低为止。对于A型肉毒杆菌，特别是对于Hall菌株，培养24小时后的细胞密度优选约1.3±0.3FTU。24小时后的pH优选约5.7±0.2。在A型肉毒杆菌、特别是Hall菌株发酵结束时，细胞密度优选低于0.8FTU。发酵结束时的pH通常约5.5±0.3。
再次对于A型肉毒杆菌和特别是对于Hall菌株，发酵时间通常在65至80小时的范围内，并优选约72小时，例如72小时±4小时，72小时±2小时，72小时±1小时或72小时±0.5小时。培养物体积没有特别的限制，但通常在约10至40升的范围内，优选约20升。使用A型肉毒杆菌菌株、特别是Hall菌株发酵后，基于发酵结束时的1ml发酵培养基，肉毒杆菌毒素复合体的产量通常在3.5±2.0μg范围内，特别是3.5±1.0μg。
浊度测量，与本领域常规用于测定发酵肉汤中的细胞密度的透射光测量不同，不是装置特异性的并且产生更准确的而且特别是可再现性和可比较性好得多的测量结果。出乎意料地，发现通过浊度测量评价细胞密度不仅高度准确和可重复，而且允许人们控制过程以便限制单链形式的神经毒性组分形成。因此，利用浊度测定监测细胞生长并特别是确定发酵终点，使得有可能在最终产物中减少不想要的单链形式的量。这是重大的方法改进，因为当前的提纯方法不能够将无活性(未裂解)的单链形式与活性的(裂解)双链形式分开。
根据本发明，步骤(a)的肉毒杆菌培养物优选如下得到：(i)提供细胞密度为530至850FTU、特别是600至800FTU、更特别是650至750FTU的初始肉毒杆菌培养物，和(ii)向培养基添加预定量的所述初始培养物。优选地，所述初始培养物以5.0％至10.0％v/v的量、优选以7.7％至8.2％v/v的量添加到所述发酵培养基。还优选所述初始培养物的厌氧活菌计数为至少5.0x105cfu/ml(集落形成单位/ml)，特别是至少2.0x106cfu/ml，更特别是多于1.0x107cfu/ml，并最特别是1.0x107cfu/ml至1.0x108cfu/ml。在本发明内，如下确定需氧或厌氧活菌计数：将初始样品的稀释系列在血琼脂板上铺板，将所述板在需氧或厌氧条件下在给定温度(例如37℃)下温育给定时间(例如40小时至72小时)，和计数长出的集落，特别是根据欧洲药典(Pharm.Eur.)2.6.12和USP<61>。
所述初始培养物可以，例如，通过首先制备预培养物而得到，制备预培养物包括用肉毒杆菌接种种子培养基并在合适的生长温度(例如37℃)下生长所述细菌。然后用所得到的预培养物的等份接种培养基，随后在合适的生长温度下生长所述细菌。接下来，使用所得到的预-初始培养物的等份在合适的生长温度下接种培养基，直到达到期望的细胞密度。然后，用所得到的初始培养物的等份接种本发明方法的步骤(A)中的发酵培养基。
本发明内使用的肉毒杆菌菌株(例如Hall菌株)的来源可以方便地以工作细胞库(WCB)的冷冻等份的形式提供。WCB是根据本领域已知的技术从相应菌株的主细胞库(MCB)建立的。WCB的冷冻等份可以，例如，以含有800μl的所述WCB和200μl的作为冷冻保护剂的无菌甘油的冷冻小瓶形式提供。通常，肉毒杆菌、特别是Hall菌株的冷冻等份的厌氧活菌计数是至少5.0x105cfu/ml，优选多于1.0x107cfu/ml。所述冷冻等份(例如冷冻小瓶)可以储存在冷冻器中-80℃下，或者优选在液氮的蒸气相中约-130℃下。
在本发明方法的步骤(b)中，从所产生的肉毒杆菌毒素(复合体)分离所述神经毒性组分。从肉毒杆菌产生的毒素复合体提纯所述神经毒性组分的方法是本领域已知的(参见，例如，DasGupta B.R.和Sathyamoorthy，V.，Toxicon.22：415-424，1984；和WO 00/74703)。提纯结束时，基于1ml所述纯化的神经毒性组分的最终溶液，所述纯化的神经毒性组分的浓度通常在100μg/ml至500μg/ml范围内。
本发明内供使用的合适的分离方法，特别是用于分离A型肉毒杆菌毒素、包括Hall菌株的神经毒性组分的分离方法，包括在发酵结束时酸沉淀所述肉毒杆菌毒素的步骤(例如，通过添加3N硫酸；最终pH约3.5)。离心后，提取沉淀物(例如，用0.2M磷酸钠缓冲剂，pH6.0)，以将所述毒素复合体释放到溶液中。所述提取液然后经受硫酸鱼精蛋白沉淀(例如，2％硫酸鱼精蛋白)以从上清液中沉淀核酸，和利用硫酸铵(例如，通过每100g上清液添加38g硫酸铵)从上清液沉淀所述毒素复合体。
用磷酸盐缓冲剂(例如，50mM磷酸钠，pH 6.0)增溶后，所述毒素通过三个离子交换色谱步骤按以下顺序进一步提纯：DEAE琼脂糖快流速，Q琼脂糖快流速和SP琼脂糖快流速。添加甘油之后，最终的洗脱液通过无菌过滤器、例如0.22μm过滤器过滤，以得到最终产物。提纯后的这种最终产物然后可进一步加工，例如补充稳定化助剂(例如，人血清白蛋白(HSA)或蔗糖)和/或冻干。
根据本发明，本发明方法的培养步骤(a)和分离步骤(b)在压力梯度装置中进行。这种装置包含第一隔离器单元和任选的第二或另一个隔离器单元，以及安全工作台。所述安全工作台用于用材料、特别是不能压热灭菌的热敏感材料(例如工作细胞库)无菌装载所述第一隔离器单元和/或第二或另一个隔离器单元。为此，所述材料可以利用专门的传送系统(例如α/β-端口系统，可得自Getinge Group)从安全工作台传送到所述隔离器，如下文进一步描述。这是本发明的重要方面，因为发现产生较少的污染(微生物和特殊的杂质)和更高纯度的肉毒杆菌毒素神经毒性组分。
在本发明内，所述安全工作台是II级BSC，其配备了允许将材料无菌传送进出所述BSC的传送系统。在本发明的含义内的“生物安全柜”或“BSC”是封闭式的通风实验工作区，用于保护实验室工作者和周围环境抵御危险因子例如细菌、病毒或者任何其他毒性或致病因子的风险，和用于保持工作区内部材料的无菌性。换句话说，BSC提供了保护试验抵御周围环境，和保护周围环境抵御试验。在本发明的情形内，这也包括在没有灭菌步骤下将热敏感材料传送到隔离器1或隔离器2中，例如细胞库。
优选地，用于所述安全工作台的BSC是II级BSC，更优选II级A1型或A2型BSC，最优选II级A2型BSC，根据美国疾病控制和预防中心(U.S.Centers for Disease Control andPrevention)(CDC)的分级(参见美国卫生与人类服务公共卫生服务部；疾病控制和预防中心；国立卫生研究院(U.S.Department of Health and Human Services，Public HealthService；Centers for Disease Control and Prevention；National Institutes ofHealth).微生物学和生物医学实验室的生物安全.附件A–生物危害的初级防护：生物安全柜的选择、安装和使用(Biosafety in Microbiological and BiomedicalLaboratories.Appendix A–Primary Containment for Biohazards：Selection，Installation and Use of Biological Safety Cabinets).第五版，HHS出版号(CDC)21-1112，2009年12月修订)和NSF/ANSI标准49-2007的规定(参见NSF International(NSF)；美国国家标准学会(American National Standards Institute)(ANSI).NSF/ANSI标准49-2007.II级(层流)生物安全柜(Class II(laminar flow)biosafety cabinetry).AnnArbor(MI)；2004)。所述安全工作台通常在与所述生产室相同的压力下运行。
BSC包含工作舱、用于供应空气以形成从所述工作舱的上部行进到下部的单向气流的空气供应机构、和用于排放所述单向气流的空气的空气排放机构。生物安全柜通过在处理中的产物上方拉上无菌空气幕而发挥作用。然后在工作面(例如，桌或台)的下面抽取所述空气，回到顶部。一部分空气被排出，而另一部分再次被引入所述工作区以拉上无菌空气幕。在所述系统的一些点处，所述空气通过一个或多个过滤器，通常是HEPA(高效粒子空气级别)过滤器，以便所述排出空气和再循环空气二者是无菌和无粒子的。所述排出的空气由被吸入柜前面的空气补充，所述被吸入的空气然后在所述工作面的下面与在所述工作面之下内侧处从所述柜抽取的再循环空气合并。在典型的II级A1型BSC的情况下，约30％的空气通过排出型HEPA过滤器和约70％通过供应型HEPA过滤器再循环回所述柜的工作区内。II级A2型BSC与A1型相似，但最低流入速度通常是约100ft/min或更高。
应该理解在本发明的含义内的“BSC”不是“净化台”。“净化台”，在本文中使用时，是指水平层流“净化台”或垂直流“净化台”，其通常只为需要无粒子环境的工序提供100级别的工作区域。补充空气被过滤，而排出的空气不被过滤。相反，在BSC的情况下，所述补充和排出的空气二者都被过滤，例如被HEPA过滤。因此，净化台只提供产物保护但不防止工作者暴露于在净化台上操作的材料。通常，净化台不适合用于任何潜在生物危险性材料，包括毒性、致突变或致癌物质、生物毒素、传染原(例如，细菌、病毒、寄生虫等等)，并且如果工作需要无菌条件的话通常是不可用的。
所述安全工作台的传送系统优选包含彼此可拆卸连接的第一传送单元和第二传送单元，其中所述第一传送单元是安装在BSC表面上的可密封部件，通常固定在所述BSC的壁上，而所述第二传送单元是可密封的容器。所述可密封的容器可以由各种材料例如不锈钢、聚乙烯等制成。它可以是刚性的或柔性的，例如袋子的形式，并且可以是一次性使用或可再使用的容器。优选地，所述传送系统是
Figure BDA0000918567160000111
传送系统(Getinge)包含两个独立的单元，即α和β部分，其各自装有门、锁和密封功能并且容许在不破坏包含在所述α或β组件内的无菌或毒性环境的完整性下连续传送材料。
本发明的压力梯度装置还包含第一隔离器单元和任选的第二或另一个隔离器单元。所述第一隔离器单元和所述第二或另一个隔离器单元是II级BSC，其配备了允许将材料无菌传送进出所述BSC的传送系统。通常，前面附有手套以防止与所述神经毒素接触。所述传送系统可以是，例如，与所述安全工作台相连接的上述DPTE系统。所述第一隔离器单元包含发酵罐，在其中进行培养肉毒杆菌的步骤。所述第一和第二或另一个隔离器单元二者位于通过气锁与环境连接的生产室内，其中在所述隔离器单元、生产室和气锁之间形成压力梯度。
具体而言，所述第一和第二或另一个隔离器单元中的压力低于所述生产室，例如比所述生产室低10至100Pa、优选20至80Pa、更优选至50至70Pa、最优选60Pa。此外，虽然生产室中的压力高于所述第一和第二或另一个隔离器单元，它仍然低于环境压力，例如比环境压力低5至50Pa、优选10至30Pa、更优选12至18Pa、和最优选约15Pa。
所述气锁中的压力高于环境压力，例如比环境压力高10至100Pa、优选20至80Pa、更优选25至35Pa、和最优选30Pa。换句话说，所述气锁和生产室之间通常有约15至150Pa的压差，优选约30至110Pa，更优选约37Pa至53Pa，和最优选约45Pa。术语“环境压力”是指周围大气的压力并且通常是约1个大气压，但是依据地理位置或气象条件可以变化。
所述第二或另一个隔离器单元可以是如同上文关于第一隔离器单元所描述的BSC。它可以在与所述第一隔离器单元相同或不同的压力下运行。此外，所述第一隔离器单元可以不与或可以与所述第二或另一个隔离器单元通过例如一个或多个可锁定的气锁、双阱容器或端口相连接。根据本发明，所述培养步骤(a)和分离步骤(b)可以在第一隔离器单元中进行。然而，优选地，所述培养步骤以及所述提纯步骤的至少一个阶段在所述第一隔离器单元中进行，而其余的提纯阶段在所述第二或另一个隔离器单元中进行。所述第一隔离器单元可以在较高的温度下、例如约15℃至50℃或20℃至40℃下运行，而所述第二或另一个隔离器单元可以在较低的温度、例如在约-5℃至+25℃范围内运行。术语“约”，在本发明的情形下使用时，是指“大致”或“接近”。在数值的情形下，不承担严格数值定义的责任，所述术语可以解释为估算所指示的值或范围的+/-10％的值。
本发明的生产室是可在负压下运行的密封和气密的室。它可通过一个或多个气锁接通外部。所述生产室包含所述安全工作台以及所述第一隔离器和任选的所述第二或另一个隔离器。供应空气进出所述生产室优选通过过滤器、特别是HEPA过滤器发生。在所述生产室内部，有受控的温度，例如19℃至26℃，和受控的相对湿度，例如40％至60％，特别是55％。某些操作或活动，包括生产肉毒杆菌毒素所必需或相关的测量或测试，可以在隔离器单元外部执行，特别是如果它们与气溶胶形成无关或者如果所述生物活性材料以对从事肉毒杆菌毒素生产的人员不造成任何危害的形式存在的话。
在另一个方面，本发明涉及高纯度的肉毒杆菌毒素神经毒性组分，其单链含量小于2.00wt％。优选地，所述单链含量小于1.90wt％，1.80wt％，1.70wt％，1.60wt％，1.50wt％，1.40wt％，1.30wt％，1.20wt％，1.10wt％，1.00wt％，0.90wt％或小于0.80wt％。此外，本发明的高纯度神经毒性组分优选具有至少99.90wt％的总纯度，更优选至少99.95wt％，和最优选99.99wt％，其中术语“总纯度”具有上文定义的含义。另外，本发明的高纯度的肉毒杆菌毒素神经毒性组分可以在具有每ml提纯后的最终产物等于或小于5.0IU的内毒素含量、特别是等于或小于1.0IU/ml，即通常1ml溶液含有所述高纯度肉毒杆菌毒素神经毒性组分的浓度为100μg/ml至500μg/ml。
此外，基于含有浓度为100μg/ml至500μg/ml的高纯度肉毒杆菌毒素神经毒性组分的1ml溶液，本发明的高纯度的肉毒杆菌毒素神经毒性组分优选具有小于1cfu/ml的总需氧活细胞计数，优选小于0.5cfu/ml，更优选0cfu/ml。
此外，本发明的高纯度肉毒杆菌神经毒性组分在LD50测定中具有4.0至8.0pg蛋白/LD50单位、特别是5.0至6.0pg蛋白/LD50单位的生物活性(相对功效)。在此用于评价所述生物活性的LD50测定在本领域中是已知的并且在例如，Pearce L.B.，Borodic G.E.，FirstE.R.，和MacCallum R.D.，肉毒杆菌毒素活性的测量：致死性测定的评价(Measurement ofbotulinum toxin activity：evaluation of the lethality assay)，Toxicol.Appl.Pharmacol.128：69-77，1994中描述。所述生物活性以“单位”(U)表示，其中1U定义为是在腹膜内注射后杀死指定小鼠群体的50％的毒素(即所述神经毒性组分)的当量。
以上描述的高纯度肉毒杆菌毒素神经毒性组分可通过本发明的方法得到。因此，在本发明的优选实施方式中，本文中描述的高纯度肉毒杆菌毒素神经毒性组分通过本发明的方法制备。
在另一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含高纯度的肉毒杆菌毒素神经毒性组分和一种或多种可药用载体。“药物组合物”是其中含有或包含活性成分的制剂。所述药物组合物的剂型没有特别的限制，但是优选是胃肠外制剂，例如用于注射或输注的水或非水溶液或分散体。本发明的药物组合物可以冻干或真空干燥、重构或在溶液状态。当重构时，优选通过添加无菌生理盐水(即0.9wt％NaCl)来制备所述重构溶液。
所述药物组合物通常包括有效量的本发明神经毒性组分。在本发明内，术语“有效量”是指在给药后导致疾病症状或状态部分或完全消除的神经毒性组分的量。治疗有效量可在一次或多次用药、施用或给药中给予并且没有意图限于特定的制剂或给药途径。有效量通常在1至2000U的范围内。然而，也可以使用高达5000U的剂量。当要给予对象高剂量的所述神经毒性组分时，将所述治疗分成多于一个治疗段可能是有益的。术语“多于一个治疗段”是指，例如例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个治疗段。
在本发明的情形内，“载体”是指稀释剂或介质，借助它给予所述活性成分。在此使用的合适的载体包括无菌液体或分散体，尤其适合于胃肠外给药(例如通过肌内或皮下注射)的那些，如雷氏制药科学与实践(Remington：The Science and Practice ofPharmacy)，20版(2000)中论述。优选地，所述载体是水或含水pH缓冲剂，例如磷酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或乙酸盐缓冲剂。术语“可药用的”，在本文中使用时，是指在合理的医疗判断范围内适合与哺乳动物尤其是人类的组织接触而没有过度的毒性、刺激、变态反应和其他问题并发症的那些化合物或物质。
另外，本发明的药物组合物可以包括其他组分，例如赋形剂、稳定剂和/或冷冻保护剂。所述赋形剂可以包括但不限于，糖(例如，单或二糖如蔗糖)、盐(例如NaCl)、清洁剂(例如非离子、阴离子或阳离子型表面活性剂)和螯合剂(例如EDTA)。稳定剂的例子包括蛋白质稳定剂，例如明胶或白蛋白(即HSA)，和非蛋白质稳定剂，例如透明质酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇及其混合物。所述冷冻保护剂在冻干期间对蛋白质(即神经毒性组分)发挥稳定效应，并特别包括醇，尤其多元醇如肌醇、甘露糖醇或甘油。此外，所述药物组合物可以包括与本发明的神经毒性组分共同给药的一种或多种其他活性物质。
优选地，本发明的药物组合物包含如本文中描述的高纯度神经毒性组分、pH缓冲剂优选磷酸盐缓冲剂或乙酸盐缓冲剂、和透明质酸稳定剂或聚乙烯吡咯烷酮稳定剂或聚乙二醇稳定剂或BSA或HSA稳定剂。另外，所述药物组合物可以包含多元醇和/或清洁剂。
而在再一个方面，本发明涉及本发明的肉毒杆菌毒素神经毒性组分用作药物。“药物”，在本文中使用时，是指用于治疗疾病的包含肉毒杆菌毒素神经毒性组分的任何组合物。在这种情形下，术语“疾病”不限于特定疾病，而是包括破坏身体功能、系统或器官的任何失调或体况。
在又一个方面，本发明涉及本发明的肉毒杆菌毒素神经毒性组分在治疗与肌肉或外分泌腺的胆碱能神经支配活动亢进有关的疾病或体况中的应用。术语“治疗”，在本文中使用时，包括疾病或体况的治疗性治疗和预防性治疗(预防)以及美容治疗。本发明的含义内的“治疗”通常包括向患有与肌肉或外分泌腺的胆碱能神经支配活动亢进有关的疾病或体况的对象给予有效量的本发明的高纯度肉毒杆菌神经毒性组分。
术语“对象”，在本文中使用时，是指哺乳动物，优选人类。所述对象可以从未暴露于肉毒杆菌毒素，或可以曾经暴露于肉毒杆菌毒素。术语“有效量”，在这种情形下使用时，具有与上文关于药物组合物所描述的相同的含义。
术语“活动亢进的胆碱能神经支配”，在本文中使用时，是指突触，其特征在于异常高的乙酰胆碱量释放到突触间隙中。“异常高”是指相对于可以得到的参照活性增加直至25％、直至50％或更多，例如通过所述释放与相同类型但不是活动亢进状态的突触处的释放相比较，其中肌张力障碍可以指示所述活动亢进状态。“直至25％”是指，例如，约1％至约25％。执行所需要的测量的方法是本领域已知的。
与肌肉或外分泌腺的胆碱能神经支配活动亢进有关的示例性疾病或体况在Dressler，D.，肉毒杆菌毒素疗法(Botulinum Toxin Therapy)，Thieme，Stuttgart，NewYork，2000中详细地描述，并且包括但不限于，张力障碍(例如，头部张力障碍、颈部张力障碍、咽部张力障碍、喉部张力障碍、肢体张力障碍)，美容应用(例如，鱼尾纹、蹙额、面部不对称、颏肌凹陷)、斜视、外分泌腺活动过度(例如，Frey综合征、鳄鱼泪综合征、多汗症)、鼻液溢、唾液分泌亢进(流口水)、痉挛症和其他疾病。
与肌肉或外分泌腺胆碱能神经支配活动亢进有关的其他疾病包括，例如，腭肌阵挛，肌阵挛，肌颤搐，强直，良性肌肉痉挛，遗传性下巴颤抖，反常颌肌活动，单侧咀嚼肌痉挛，肥大性鳃肌病，咬肌肥大，胫骨前肌肥大，眼球震颤，振动幻视，核上性凝视麻痹，持续性不全癫痫，计划痉挛性斜颈手术，外展肌声带瘫痪，顽固型变声性发声障碍，上食道括约肌功能障碍，声带肉芽肿，口吃，多动秽语综合征(Gilles de Ia Tourette综合征)，中耳肌阵挛，保护性喉闭合，喉切除术后语言障碍，保护性上睑下垂，睑内翻，Odii括约肌功能障碍，假性失弛缓症，非弛缓不能型食道运动障碍，阴道痉挛，术后制动，震颤，膀胱功能障碍，半面痉挛，神经移植术运动障碍，僵人综合征，破伤风，前列腺增生，肥胖症治疗，婴儿脑性麻痹，失弛缓症和肛裂。
合适的给药途径包括但不限于胃肠外给药，特别是皮下和肌肉注射。给药方案没有特别的限制并且包括，例如，两周一次，每月一次，隔月一次，三个、六个或九个月一次，和一年一次或单次应用给药方案。给予对象的本发明高纯度神经毒性组分的治疗有效剂量取决于应用方式、疾病或病症的类型、对象的体重、年龄、性别和健康状态等等。给药根据需要可以是单次或多次的。本发明的高纯度神经毒性组分也可以与其他活性物质共同给药。
本发明现在将通过下面的非限制性实施例进一步说明。
实施例
下面的实施例显示使用如本文中描述的压力梯度装置容许产生无菌并具有极少气载粒子的工作区。令人惊讶地发现，这对总体产物质量、特别是对所述神经毒性组分的纯度方面具有强烈影响。
实施例1
安全工作台的建造
Figure BDA0000918567160000171
传送系统(Getinge Group)的“α”部分安装在配备了HEPA过滤器(ThermoFisher Scientific，Inc.)的II级A2型生物安全柜
Figure BDA0000918567160000172
(NSF)的右侧壁上。刚性传送容器(由不锈钢制成的DPTE190β容器)用作活动的
Figure BDA0000918567160000174
"β"部分。所述
Figure BDA0000918567160000173
传送系统的两个独立单元，即α和β部分，其各自装有门、锁和密封功能并且容许在不破坏在所述α和β组件内包含的无菌或毒性环境的完整性下连续传送毒性或致病材料。
在下面描述的全部试验中，使用这种安全工作台并位于生产室中(在相对于生产室为中性压力下运行)。所述生产室在19℃至26℃的温度和在相对于环境压力为-15Pa的压力下运行。在生产室中，还有在相对于所述生产室的压力为-60Pa的压力下运行的另两个隔离器(隔离器1：发酵；隔离器2：提纯)。所述生产室通过人员气锁和材料气锁与环境通连。
实施例2
本发明的隔离器单元中的微生物纯度
这种研究的目的将显示，在无菌条件下进行利用本发明方法培养肉毒杆菌。因此在三轮连贯运行中，在没有微生物下模拟所有培养程序。所有培养基和添加剂由无菌试验培养基(用于需氧或厌氧过程条件的TSB-和硫代乙酸盐培养基)代替。
为了验证不存在微生物污染，取自不同加工步骤的样品在20℃至35℃如下温育至少14天，但不超过21天：在20℃至25℃下温育至少7天，然后马上在30℃至35℃下温育至少7天。
从表1可以看出，在所述不同的培养阶段，始终检测不到微生物污染。这证明了在本发明内使用的隔离器–尽管在比生产室低的压力下运行，这导致潜在杂质的流入–却允许无菌过程控制。
表1.隔离器单元中的微生物污染
Figure BDA0000918567160000181
另外，在隔离器单元1的三个不同测量点(命名为MP18、MP19和MP20)测定气载菌的数量。如表2中所示，在全部三个测量点都检测不到气载菌。与此相反，在2010年测量的生产室中气载菌的平均数，发现是3cfu/m3。
表2.隔离器单元中气载菌的数量
Figure BDA0000918567160000182
Figure BDA0000918567160000191
因此，使用如用于本发明方法中的隔离器单元允许产生没有微生物污染和气载菌的工作区。
实施例3
隔离器单元中的粒子含量
除了微生物污染和气载菌数量之外，决定产物质量的另一个重要因素是微粒杂质的浓度。这在制药工业中有特殊的意义，在制药工业中保护给定产物免于(气载)粒子至关重要。因此，测量本发明内使用的隔离器单元的不同工作区(命名为MP18、MP19和MP20)中气载粒子数量。所述粒子测量利用可从瑞士CAS Clean-Air-Service AG商购的粒子计数器进行。结果显示在下面表3中。
表3.气载粒子的数量
Figure BDA0000918567160000192
Figure BDA0000918567160000201
结果显示，本发明内使用的隔离器单元在全部三个测量点只包含很少的直径≥0.5μm的粒子并且基本没有直径≥5.0μm的粒子。与此相反，按照2010年的测量，发现生产室中的平均粒子数是直径≥0.5μm的粒子为434个/ft3，和直径≥5.0μm的粒子为22个/ft3。这证明了与周围的生产室相比，在本发明的隔离器单元中微粒纯度很高。
实施例4
在生化纯度方面的产物质量
测定在使用和不使用本发明的隔离器下从Hall菌株(ATCC 3502)产生的A型肉毒杆菌毒素提纯的不同批次神经毒性组分的总纯度和单链含量。
同等份的A型肉毒杆菌工作细胞库Hall菌株(ATCC 3502)接种10ml培养基体积以得到10ml总体积的预培养物。等份的预培养物用于接种50ml培养基以得到初始培养物1。然后用等份的初始培养物1接种1600ml培养基得到初始培养物2。发酵培养物的培养基(17.4l)在发酵罐中就地灭菌。添加1l无菌葡萄糖溶液后，用1600ml初始培养物2接种发酵培养物。在33.5℃进行发酵72h。
如上文所述进行提纯。“总纯度”定义为基于纯化的神经毒性组分样品的总重量，单链和双链形式的神经毒性组分的重量百分比。得到的结果在下面表4中显示。
表4.A型肉毒杆菌毒素神经毒性组分的总纯度
Figure BDA0000918567160000211
从表4可以看出，根据本发明制备的所述神经毒性组分的总纯度高达99.9wt％。相比之下，不使用本发明的隔离器技术所得到的总纯度只有97.8wt％。换句话说，根据本发明制备的神经毒性组分制剂基本只由所述神经毒性组分(单链或双链形式)组成，而不使用本发明的隔离器技术所制备的神经毒性组分制剂包含2.2wt％的可观量的污染。
表4的批次进一步评价它们的单链形式神经毒性组分的含量。SDS-PAGE加上光度计评价用于确定单链含量。单链含量是特别重要的参数，因为未裂解的单链形式是基本无活性的，因此是本发明含义内的“杂质”。此外，它不能通过色谱与活性的双链形式拆分。结果在表5中显示。
表5.单链形式的神经毒性组分的含量
Figure BDA0000918567160000212
Figure BDA0000918567160000221
结果出乎意料地显示，与比较批得到的1.7wt％相比，本发明的方法提供了1.2wt％的平均单链含量。
实施例5
在微生物纯度方面的产物质量
产物的微生物纯度(生物负载)是通过根据欧洲药典2.6.12和USP<61>测量根据本发明制备的批次在不同处理阶段的需氧微生物生物负载，与不用本发明中使用的隔离器技术下制备的批次相比较进行评价。结果在表6、7和8中显示。
表6.在早期处理阶段“透析1后”的需氧生物负载
Figure BDA0000918567160000222
表7.在晚期处理阶段“SP-Pool”的需氧生物负载
Figure BDA0000918567160000223
Figure BDA0000918567160000231
表8.在提纯过程结束时得到的最终产物的需氧生物负载
Figure BDA0000918567160000232
1＝基于1ml最终产物
(含有100-500μg/ml高度纯化的神经毒性组分的溶液)
表6、7和8中呈现的结果显示，本发明方法的早期处理阶段(透析1后)时的生物负载<8，因此比不使用本发明的隔离器所得到的平均值547低得多。这确保了在最终产物中没有需氧(细菌)计数。
实施例6
关于内毒素污染的产物质量
根据本发明制备的批次的内毒素水平根据欧洲药典2.6.14和USP<85>测量并与不使用本发明的隔离器技术而制备的批次的测定结果相比较。测量的内毒素值以IU/ml最终产物(含有100-500μg/ml高度纯化的神经毒性组分的溶液)指示。结果在表9中显示。
表9.最终产物的内毒素负荷
Figure BDA0000918567160000233
Figure BDA0000918567160000241
从表9可以看出，根据本发明制备的批次的内毒素水平明显低于比较批次。发现本发明的神经毒性组分的平均内毒素水平<0.8IU/ml是含有肉毒杆菌毒素的药品可接受的内毒素水平。
以上结果显示，本发明的方法允许制备高纯度肉毒杆菌毒素神经毒性组分，同时符合职业健康和安全标准。

Claims (8)

1.一种制备高纯度的肉毒杆菌毒素神经毒性组分的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)在允许产生肉毒杆菌毒素的条件下培养肉毒杆菌，和
(b)从所述肉毒杆菌毒素分离所述神经毒性组分，
其中培养步骤(a)和分离步骤(b)在压力梯度装置中进行，所述装置包含第一隔离器单元，其含有培养肉毒杆菌的发酵罐，和任选的第二或另一个隔离器单元，所述第一和第二或另一个隔离器单元位于生产室，所述生产室通过气锁与环境通连，其中所述第一和第二或另一个隔离器单元中的压力低于生产室中的压力，所述生产室中的压力低于环境压力，并且所述气锁中的压力高于环境压力，并且其中所述压力梯度装置还包含安全工作台，其是II级BSC(生物安全柜)，配备有允许将材料无菌传送进出所述BSC的传送系统，所述安全工作台也位于所述生产室中，并且
其中培养温度保持在33.5℃±0.2℃的温度下。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中培养期间的细胞密度通过利用福尔马肼作为一级浊度标准品的浊度测量来监测。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中肉毒杆菌的培养持续到细胞密度从培养24小时后达到的1.3±0.3FTU的细胞密度降低到小于0.8FTU为止。
4.根据权利要求1所述的方法，其中用于步骤(a)的肉毒杆菌培养物通过如下所述得到：(i)提供细胞密度为530至850FTU的肉毒杆菌初始培养物和(ii)向发酵培养基添加预定量的所述初始培养物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述初始培养物以5.0％至10.0％v/v的量添加到所述发酵培养基中。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述II级BSC的传送系统包含彼此可拆卸连接的第一传送单元和第二传送单元，所述第一传送单元是安装在BSC表面上或固定在所述BSC的壁上的可密封部件，而所述第二传送单元是可密封的容器。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述肉毒杆菌是A型肉毒杆菌，包括Hall菌株。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述Hall菌株是Hall菌株ATCC 3502。
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