RU2663136C2 - Способ получения высокочистого нейротоксического компонента ботулотоксина и его применения - Google Patents
Способ получения высокочистого нейротоксического компонента ботулотоксина и его применения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2663136C2 RU2663136C2 RU2016103329A RU2016103329A RU2663136C2 RU 2663136 C2 RU2663136 C2 RU 2663136C2 RU 2016103329 A RU2016103329 A RU 2016103329A RU 2016103329 A RU2016103329 A RU 2016103329A RU 2663136 C2 RU2663136 C2 RU 2663136C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- neurotoxic component
- clostridium botulinum
- botulinum toxin
- toxin
- botulinum
- Prior art date
Links
- 231100000189 neurotoxic Toxicity 0.000 title claims abstract description 102
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 title claims abstract description 102
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 title claims abstract description 70
- 229940053031 botulinum toxin Drugs 0.000 title claims abstract description 58
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 claims abstract description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000001713 cholinergic effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 210000003499 exocrine gland Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 230000030214 innervation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 34
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 33
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 28
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 28
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 25
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 17
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 14
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 12
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 15
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 9
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 7
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 7
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 7
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 7
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 7
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 7
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 6
- 230000036541 health Effects 0.000 description 6
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 6
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 206010040954 Skin wrinkling Diseases 0.000 description 5
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 5
- 208000010118 dystonia Diseases 0.000 description 5
- -1 for example Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 4
- 208000014094 Dystonic disease Diseases 0.000 description 4
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 4
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 4
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 206010039424 Salivary hypersecretion Diseases 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000000289 Esophageal Achalasia Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 208000008454 Hyperhidrosis Diseases 0.000 description 2
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 2
- 102100026038 Lens fiber membrane intrinsic protein Human genes 0.000 description 2
- 101710115990 Lens fiber membrane intrinsic protein Proteins 0.000 description 2
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 description 2
- 208000002033 Myoclonus Diseases 0.000 description 2
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 2
- 206010030136 Oesophageal achalasia Diseases 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 2
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 2
- 208000004350 Strabismus Diseases 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010044074 Torticollis Diseases 0.000 description 2
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 108010079650 abobotulinumtoxinA Proteins 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 201000000621 achalasia Diseases 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000000383 hazardous chemical Substances 0.000 description 2
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 2
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000003784 masticatory muscle Anatomy 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000001640 nerve ending Anatomy 0.000 description 2
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 2
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 2
- 206010029864 nystagmus Diseases 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 208000026451 salivation Diseases 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 208000027765 speech disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 2
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 2
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 210000001260 vocal cord Anatomy 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 206010002153 Anal fissure Diseases 0.000 description 1
- 208000016583 Anus disease Diseases 0.000 description 1
- 206010059237 Auriculotemporal syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010004446 Benign prostatic hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 241000270722 Crocodylidae Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 208000012661 Dyskinesia Diseases 0.000 description 1
- 206010013952 Dysphonia Diseases 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000197727 Euscorpius alpha Species 0.000 description 1
- 206010015995 Eyelid ptosis Diseases 0.000 description 1
- 206010068737 Facial asymmetry Diseases 0.000 description 1
- 206010063006 Facial spasm Diseases 0.000 description 1
- 208000009531 Fissure in Ano Diseases 0.000 description 1
- 206010056696 Gaze palsy Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 1
- 208000004041 Gustatory Sweating Diseases 0.000 description 1
- 208000004095 Hemifacial Spasm Diseases 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 208000019430 Motor disease Diseases 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 208000037158 Partial Epilepsies Diseases 0.000 description 1
- 206010061334 Partial seizures Diseases 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 208000036071 Rhinorrhea Diseases 0.000 description 1
- 206010039101 Rhinorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 208000008630 Sialorrhea Diseases 0.000 description 1
- 206010067672 Spasmodic dysphonia Diseases 0.000 description 1
- 208000009505 Sphincter of Oddi Dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 206010072148 Stiff-Person syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000003028 Stuttering Diseases 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 208000000323 Tourette Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010057266 Type A Botulinum Toxins Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000004887 air purification Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 208000003770 biliary dyskinesia Diseases 0.000 description 1
- 239000003131 biological toxin Substances 0.000 description 1
- 206010005159 blepharospasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000744 blepharospasm Effects 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 229940089093 botox Drugs 0.000 description 1
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 206010008129 cerebral palsy Diseases 0.000 description 1
- 201000002866 cervical dystonia Diseases 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003749 cleanliness Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000012786 cultivation procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000002638 denervation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- LNNWVNGFPYWNQE-GMIGKAJZSA-N desomorphine Chemical compound C1C2=CC=C(O)C3=C2[C@]24CCN(C)[C@H]1[C@@H]2CCC[C@@H]4O3 LNNWVNGFPYWNQE-GMIGKAJZSA-N 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940098753 dysport Drugs 0.000 description 1
- 210000000959 ear middle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002567 electromyography Methods 0.000 description 1
- 230000003241 endoproteolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000004709 eyebrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 201000007186 focal epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000008821 health effect Effects 0.000 description 1
- 208000013403 hyperactivity Diseases 0.000 description 1
- 230000037315 hyperhidrosis Effects 0.000 description 1
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004716 idoxuridine Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 108010024001 incobotulinumtoxinA Proteins 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000012499 inoculation medium Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000012153 long-term therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000008155 medical solution Substances 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 238000011169 microbiological contamination Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 210000000715 neuromuscular junction Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 239000006201 parenteral dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003518 presynaptic effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 229940124272 protein stabilizer Drugs 0.000 description 1
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 201000003004 ptosis Diseases 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007832 reinnervation Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- GNBVPFITFYNRCN-UHFFFAOYSA-M sodium thioglycolate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)CS GNBVPFITFYNRCN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940046307 sodium thioglycolate Drugs 0.000 description 1
- 210000001584 soft palate Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 201000002849 spasmodic dystonia Diseases 0.000 description 1
- 230000001148 spastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000035900 sweating Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000002504 synaptic vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940071127 thioglycolate Drugs 0.000 description 1
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M thioglycolate(1-) Chemical compound [O-]C(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000007888 toxin activity Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 210000001942 upper esophageal sphincter Anatomy 0.000 description 1
- 206010046947 vaginismus Diseases 0.000 description 1
- 239000012808 vapor phase Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940018272 xeomin Drugs 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
- A61K38/4893—Botulinum neurotoxin (3.4.24.69)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M37/00—Means for sterilizing, maintaining sterile conditions or avoiding chemical or biological contamination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/40—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of pressure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
- C12Y304/24069—Bontoxilysin (3.4.24.69), i.e. botulinum neurotoxin
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Neurology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен высокочистый нейротоксический компонент токсина Clostridium botulinum с содержанием одноцепочечной формы менее 2,00% по весу для лечения, связанного с гиперактивной холинергической иннервацией мышц или экзокринных желез заболевания или состояния, способ получения вышеуказанного высокочистого нейротоксического компонента ботулотоксина и фармацевтическая композиция для лечения, связанного с гиперактивной холинергической иннервацией мышц или экзокринных желез заболевания или состояния. Способ включает культивирование Clostridium botulinum в обеспечивающих выработку ботулотоксина условиях и выделение нейротоксического компонента из ботулотоксина, причем этап культивирования и этап выделения проводят в устройстве с градиентом давления. Фармацевтическая композиция содержит вышеуказанный высокочистый нейротоксический компонент токсина Clostridium botulinum и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей. Изобретения обеспечивают получение высокочистого нейротоксического компонента ботулотоксина безопасным образом и максимально высокую чистоту лекарственных средств. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 9 табл., 6 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к способу получения высокочистого нейротоксического компонента ботулотоксина путем культивирования Clostridium botulinum в условиях, обеспечивающих продуцирование ботулотоксина, и путем выделения нейротоксического компонента из ботулотоксина. Кроме того, настоящее изобретение относится к высокочистому нейротоксическому компоненту ботулотоксина, получаемому способом по настоящему изобретению, и его применению.
Уровень техники
Ботулотоксины являются самыми высокоактивными белковыми токсинами для человека. Их действие заключается в блокировании высвобождения ацетилхолина в нервно-мышечном соединении, что приводит к денервации мышц. Ботулотоксины также активны в других периферийных холинергических нервных окончаниях и приводят, например, к снижению слюноотделения или потоотделения и к уменьшению складок и морщин на лице. Из-за специфики механизма действия диапазон клинических применений ботулотоксинов постоянно увеличивается, и ботулотоксины сегодня широко используются в качестве фармако-косметических средств.
Ботулотоксины синтезируются и выделяются определенным Clostridium spp. в виде крупных комплексов, включающих молекулу ботулотоксина (далее - «нейротоксический компонент») и ассоциированные нетоксичные бактериальные белки (также называемые «комплексообразующие белки»). Комплексообразующие белки включают различные нетоксичные белки гемагглютинина (НА) и нетоксичные белки негемагглютинина (NTNH). Молекулярная масса токсинового комплекса среди семи различных серотипов ботулотоксина (А, В, С, D, Е, F и G) варьируется от приблизительно 300 кДа до приблизительно 900 кДа. Комплексообразующие белки обеспечивают устойчивость нейротоксического компонента. В отличие от токсинового комплекса нейротоксический компонент в выделенном и чистом виде, то есть лишенном каких-либо комплексообразующих клостридиальных белков, является кислотолабильным и не устойчивым к агрессивной среде желудочно-кишечного тракта.
Нейротоксический компонент синтезируется в виде неактивного одноцепочечного прекурсора (нерасщепленного полипептида), имеющего молекулярную массу для всех семи известных серотипов ботулотоксина приблизительно 150 кДа. Этот одноцепочечный прекурсор активируется посредством протеолитического расщепления с образованием двухцепочечного белка с дисульфидной связью. Легкая цепь 50 кДа содержит каталитический домен, в то время как тяжелая цепь 100 кДа содержит внутренний домен транс локации и рецептор-связывающий домен. Тяжелая цепь 100 кДа опосредует связывание с пресинаптическими холинергическими нервными окончаниями и интернализацию токсина в клетку. Легкая цепь 50 кДа отвечает за токсические эффекты, действуя как цинк-эндопептидаза и расщепляя специфические белки, ответственные за слияние мембран (белки SNARE комплекса). Посредством нарушения процесса слияния мембран в нервных клетках ботулотоксины препятствуют высвобождению ацетилхолина в синаптическую щель.
Комплекс ботулотоксина серотипа А (BoNT/A-комплекс) был впервые одобрен для использования у человека в Соединенных Штатах Америки в 1989 году для лечения косоглазия, блефароспазма и других расстройств. В настоящее время форма А комплекса ботулотоксина коммерчески доступна в нескольких источниках, например, в Allergan под торговым наименованием Botox®, в Ipsen под торговым наименованием Dysport® и в Galderma под торговым наименованием Azzalure®.
Тем не менее, в значительном числе случаев у пациентов вырабатываются нейтрализующие антитела в ответ на повторные инъекции BoNT/A-комплекса. Считается, что этот эффект связан с комплексообразующими белками BoNT/A-комплекса. Пациенты с такой реакцией становятся так называемыми «пациентами с вторичным отсутствием клинического ответа», и терапия BoNT/A -комплексом больше не является эффективной. Как было установлено, риск такой неудачи антитело-индуцированной терапии наблюдается не менее чем у 10%-20% пациентов, получавших лечение. Еще одним недостатком, связанным с использованием комплекса ботулотоксина, является его регионарное или системное распространение после инъекций в целевые мышцы. Например, исследования с использованием одноволоконной электромиографии (SF-EMG) показали усиленное дрожание в мышцах, удаленных от места инъекции.
Эти недостатки не наблюдаются при введении чистого нейротоксического компонента. В частности, введение чистого нейротоксического компонента снижает риск отсутствия ответа или сниженного ответа, что особенно важно для пациентов, проходящих долгосрочную терапию. Другие преимущества, связанные с чистым нейротоксическим компонентом, включают в себя быстрое наступление действия и превосходную температуроустойчивость, вследствие чего даже отсутствует необходимость использования холодовой цепи и хранения в холодильнике. Лекарственная форма, содержащая только нейротоксический компонент типа А без каких-либо комплексообразующих белков, коммерчески доступна в Merz под товарными знаками Xeomin® и Boconture®.
Нейротоксический компонент можно получить культивированием штаммов клостридий, продуцирующих ботулотоксин, и выделением нейротоксического компонента из выработанного комплекса ботулотоксина посредством серий этапов осаждения и хроматографических исследований. При использовании природных штаммов клостридий ботулотоксин вырабатывается и выделяется бактериями клостридий в его активной, остро токсичной форме. Таким образом, необходимо принять определенные меры для предотвращения неблагоприятных последствий для здоровья персонала, связанного с производством ботулотоксина и/или очисткой нейротоксического компонента из токсинового комплекса. Для уменьшения риска воздействия токсичных аэрозолей в WO 2006/133818 А1, 21.12.2006 предлагается, например, осуществлять получение ботулотоксинов в изоляторе, работающем при давлении ниже, чем давление в окружающем производственном помещении, во избежание контакта оператора с какими-либо токсичными материалами.
Хотя производственный процесс, описанный в WO 2006/133818 А1, обеспечивает необходимую безопасность работы, по-прежнему существует возможность повышения чистоты получаемого нейротоксического компонента. В фармацевтической отрасли критически важна высокая химическая и микробная чистота. Таким образом, конечная цель разработчиков лекарственных средств состоит в обеспечении максимально высокой чистоты лекарственных средств для обеспечения требуемой безопасности и эффективности.
Соответственно, целью настоящего изобретения является создание усовершенствованного способа получения высокочистого нейротоксического компонента ботулотоксина безопасным образом.
Раскрытие изобретения
В первом аспекте в настоящем изобретении предложен способ получения высокочистого нейротоксического компонента ботулотоксина, включающий следующие этапы:
(a) культивирование Clostridium botulinum в условиях, обеспечивающих выработку ботулотоксина, и
(b) выделение нейротоксического компонента из ботулотоксина, в котором этап культивирования (а) и этап выделения (b) проводят в устройстве с градиентом давления, которое включает первый изоляторный модуль, содержащий ферментер для культивирования Clostridium botulinum, и необязательно второй или дополнительный изоляторный модуль, а также безопасный рабочий стол, которое представляет собой бокс биологической безопасности BSC класса II, снабженное системой перемещения/перегрузки, которая обеспечивает асептический перенос материала в BSC и из BSC.
Первый и второй или дополнительный изоляторные модули расположены в производственном помещении, соединенном с окружающей средой с помощью воздушного шлюза, при этом давление в первом и втором или дополнительном изоляторном модулях ниже, чем в производственном помещении, давление в производственном помещении ниже, чем давление окружающей среды, и давление в воздушном шлюзее выше, чем давление окружающей среды. Безопасный рабочий стол также находится в производственном помещении.
В еще одном аспекте в настоящем изобретении представлен высокочистый нейротоксический компонент токсина Clostridium botulinum, в котором содержание одноцепочечной формы составляет менее 2,00% в пересчете по весу.
В еще одном аспекте в настоящем изобретении предложен фармацевтическая композиция, содержащая высокочистый нейротоксический компонент токсина Clostridium botulinum, описанный в настоящем документе, и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей.
В еще одном дополнительном аспекте в настоящем изобретении предложен высокочистый нейротоксический компонент токсина Clostridium botulinum, описанный в настоящем документе, для применения в качестве лекарственного средства.
В еще одном аспекте в настоящем изобретении предложен высокочистый нейротоксический компонент токсина Clostridium botulinum, описанный в настоящем документе, для применения в лечении заболевания, связанного с гиперактивной холинергической иннервацией мышц или экзокринных желез.
Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения представлены в прилагаемых зависимых пунктах формулы изобретения.
Осуществление изобретения
Неожиданно было обнаружено, что существуют ключевые производственные параметры, которые до сих пор не были рассмотрены, но которые могут оказывать значительное влияние на качество, в частности на чистоту, нейротоксического компонента ботулотоксина. Кроме того, способ получения по настоящему изобретению удовлетворяет законодательным требованиям, касающимся безопасности, гигиены труда и охраны окружающей среды, а также обеспечивает безопасные и безвредные условия работы. Иными словами, настоящее изобретение основано на неожиданно установленном факте, что существуют дополнительные режимы производственного процесса, которые не только безопасны в плане проблем окружающей среды и здоровья человека, но и позволяют получить нейротоксический компонент ботулотоксина высшего качества, в частности, наивысшего качества.
В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения высокочистого нейротоксического компонента ботулотоксина, включающему следующие этапы:
(a) культивирование Clostridium botulinum в условиях, обеспечивающих выработку ботулотоксина, и
(b) выделение нейротоксического компонента из ботулотоксина.
При использовании в настоящем документе термины «ботулотоксин» или «комплекс ботулотоксина» являются взаимозаменяемыми и относятся к высокомолекулярному комплексу, включающему в себя нейротоксический компонент приблизительно 150 кДа и, кроме того, нетоксичные белки Clostridium spp., включая белки гемагглютинина и негемагглютинина. Также подразумевается, что термины «ботулотоксин» или «комплекс ботулотоксина» охватывают все семь серотипов токсина (т.е. серотипы А, В, С, D, Е, F и G), а также их подтипы (например, A1, А2, C1, С2 и т.д.).
Термин «нейротоксический компонент» при использовании в настоящем документе означает молекулу белка ботулотоксина, включенную в комплекс ботулотоксина (также называемый «чистый токсин» или «чистый нейротоксин»). Иными словами, «нейротоксический компонент» в контексте настоящего изобретения не связан с какими-либо нетоксическими белками Clostridium botulinum и лишен каких-либо связанных нетоксических белков Clostridium botulinum, включая белки гемагглютинина и негемагглютинина. Предпочтительно, чтобы он также не содержал РНК (RNA), потенциально связанную с нейротоксическим компонентом.
Дополнительно отмечено, что «нейротоксический компонент» в контексте настоящего изобретения включает одноцепочечный белок-прекурсор приблизительно 150 кДа и протеолитически обработанную двухцепочечную форму нейротоксического компонента, включающего в себя легкую цепь (ЛЦ) приблизительно 50 кДа и тяжелую цепь (ТЦ) приблизительно 100 кДа, которые обычно связаны одной или несколькими дисульфидными связями. Специалистам в данной области техники будет понятно, что полная биологическая активность достигается только после протеолитической активации, даже при том, что, предположительно, необработанный прекурсор может обнаруживать некоторые биологические функции. «Биологическая функция» может означать: (а) связывание с рецептором, (b) интернализацию, (с) транслокацию через эндосомную мембрану в цитозоль, и/или (d) эндопротеолитическое расщепление белков, участвующих в слиянии мембран синаптических везикул.
Предпочтительно, чтобы нейротоксический компонент был получен из комплекса ботулотоксина серотипа А, В, С, D, Е, F или G природного происхождения. Особенно предпочтительный нейротоксический компонент в контексте настоящего изобретения получают из токсина Clostridium botulinum серотипа А, в частности из токсина Clostridium botulinum типа А, продуцируемого штаммом Hall (АТСС 3502). Тем не менее, в контексте настоящего изобретения нейротоксическим компонентом также может быть полученный рекомбинацией нейротоксический компонент, в том числе химерный (составной) нейротоксический компонент. Также включены генетически модифицированные нейротоксические компоненты, содержащие 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или до 20 аминокислотных мутаций. Мутацией может быть замещение, вставка или делеция. Кроме того, нейротоксические компоненты, содержащие химически модифицированные аминокислоты, например, одну или несколько гликозилированных, ацетилированных, липидированных или иным образом модифицированных аминокислот, также включены в термин «нейротоксический компонент».
Термин «высокочистый нейротоксический компонент» в контексте настоящего изобретения означает очищенный нейротоксический компонент, или композицию, его препарат или лекарственную форму, которые, по существу, не содержат других твердых ингредиентов и которые могут быть получены способом, подробно описанным в настоящем документе. Кроме того, термин «высокочистый», используемый в настоящем документе, относится к нейротоксическому компоненту ботулотоксина или его лекарственной форме, препарату или композиции, которые не содержат комплексообразующих белков (примесей, связанных с продуктом), других клостридиальных белков (примесей, не связанных с продуктом) и неклостридиальных белков. Предпочтительно термин «высокочистый» относилтся к общей чистоте не менее 99,90% в пересчете по весу, более предпочтительно - не менее 99,95%) в пересчете по весу и наиболее предпочтительно - не менее 99,99% в пересчете по весу. «Общая чистота» означает массовую долю одноцепочечных и двухцепочечных форм нейротоксического компонента на основании общего веса образца высокочистого нейротоксического компонента по настоящему изобретению. В соответствии с настоящим изобретением чистоту оценивают методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE).
На этапе (a) Clostridium botulinum культивируют (или ферментируют) в подходящей ферментационной среде, например, среде, содержащей 2% протеозопептона, 1% дрожжевого экстракта, 1% глюкозы и 0,05% тиогликолята натрия, для выработки ботулотоксина. В настоящем документе термин «культивирование» используется взаимозаменяемо с термином «ферментация». Предполагается, что термин «Clostridium botulinum» включает в себя Clostridium botulinum типа А, В, С, D, Е, F или G. В контексте настоящего изобретения предпочтительно используют штамм Clostridium botulinum, продуцирующий ботулотоксин типа А, т.е. Clostridium botulinum типа А. Особенно предпочтительным для использования в настоящем изобретении является штамм Hall типа A Clostridium botulinum (АТСС 3502) (в дальнейшем именуемый «штамм Hall»). Способы культивирования Clostridium botulinum для получения токсинового комплекса известны в данной области (см., например, Schantz Е. and Kautter D., J. Assoc. Off. Anal. Chem. 61:96-99, 1978).
Температура ферментации (культивирования) на этапе (а) способа по настоящему изобретению зависит от конкретного штамма Clostridium botulinum и используемых условий ферментации. Предпочтительно, чтобы температура постоянно поддерживалась в заранее заданном узком диапазоне температур. Например, для получения токсина Clostridium botulinum типа А, в частности штамма Hall, температуру ферментации предпочтительно устанавливают и поддерживают на уровне 33,5°С±1,0°С, более предпочтительно 33,5°С±0,5°С и наиболее предпочтительно 33,5°С±0,2°С.
Авторами настоящего изобретения было установлено, что постоянная температура около 33,5°С является оптимальной температурой для выработки ботулотоксина. Слишком высокие, слишком низкие и/или слишком часто меняющиеся температуры приводят к тому, что Clostridium botulinum вырабатывает нежелательные соединения. Неожиданно было обнаружено, что, если не контролировать поддержание температуры ферментации в пределах температурных диапазонов, указанных выше, содержание нежелательной неактивной одноцепочечной формы нейротоксического компонента значительно увеличивается. Подчеркивается, что в контексте настоящего изобретения одноцепочечная форма нейротоксического компонента считается нежелательной «примесью», поскольку она протеолитически не обработана и, по существу, неактивна.
По настоящему изобретению предпочтительно температуру ферментации устанавливать и поддерживать на уровне указанного диапазона температур, используя нагревательную рубашку. При использовании в настоящем документе «нагревательная рубашка» представляет собой материальную часть, которая окружает большие площади поверхности, обычно все боковые стенки, ферментера и может быть нагрета. Например, нагревательная рубашка может включать различные слои для обеспечения стабильности температуры, необходимой для ферментации, например, термоэлектрический нижний слой для нагревания, изоляционный слой для предотвращения потерь тепла и водонепроницаемый внешний слой для защиты нагревательной рубашки от опасностей внешней среды ферментации. В отличие от повышения и поддержания температуры с помощью нагревательного стержня, использование нагревательной рубашки позволяет в основном избежать перепадов температуры между различными участками в питательной среде, даже если питательную среду не перемешивают, как это обычно происходит в способе по настоящему изобретению, таким образом обеспечивается равномерное распределение температуры.
Рост культур клостридий в процессе ферментации (т.е. плотность клеток) предпочтительно оценивать по мутности культуры, которую можно соответствующим образом контролировать on-line при помощи оптического датчика. Термин «мутность» при использовании в настоящем документе относится к оптическому свойству, вследствие которого свет рассеивается и поглощается, а не передается прямолинейно через образец. Мутность можно измерять с помощью коммерчески доступных турбидиметров. Эти турбидиметры обычно измеряют количество света, рассеянного под прямыми углами к падающему световому лучу частицами, присутствующими в образце жидкости. В настоящем случае турбидиметр используют для измерения рассеивания света бактериальными клетками, присутствующими в питательной среде, под углом 90° относительно падающего светового луча. Для измерения плотности клеток, которая определяется в настоящем документе как количество клеток Clostridium botulinum на единицу объема культуры, турбидиметр откалиброван посредством коммерчески доступных сертифицированных стандартов мутности по формазину (т.е. определенных суспензий частиц). Измеренные значения мутности выражены в настоящем документе через единицы мутности по формазину (FTU).
В контексте настоящего изобретения ферментацию обычно продолжают до тех пор, пока плотность клеток культуры не уменьшится вследствие лизиса клеток после того, как она увеличилась вследствие роста бактерий. Для Clostridium botulinum типа А, в частности для штамма Hall, плотность клеток после 24 часов культивирования предпочтительно составляет приблизительно 1,3±0,3 FTU. Через 24 часа значение рН предпочтительно составляет приблизительно 5,7±0,2. В конце ферментации с Clostridium botulinum типом А, в частности со штаммом Hall, плотность клеток предпочтительно составляет 0,8 FTU. В конце ферментации значение рН обычно составляет приблизительно 5,5±0,3.
Продолжительность ферментации, опять для Clostridium botulinum типа А и, в частности для штамма Hall, как правило, составляет от 65 до 80 часов и предпочтительно приблизительно 72 часа, например, 72 часа ± 4 часа, 72 часа ± 2 часа, 72 часа ± 1 час или 72 часа ± 0,5 часа. Объем культуры, в частности, не ограничен, но обычно составляет приблизительно от 10 до 40 литров, предпочтительно около 20 литров. Выход комплекса ботулотоксина после ферментации с использованием штамма Clostridium botulinum типа А, в частности штамма Hall, обычно составляет приблизительно 3,5±2,0 мкг, в частности 3,5±1,0 мкг, в расчете на 1 мл ферментационной среды в конце ферментации.
Измерения мутности, в отличие от измерений проходящего света, которые обычно используют в данной области для определения плотности клеток в ферментационных бульонах, не зависят от конкретного устройства и показывают более точные и, в частности гораздо лучше воспроизводимые и сопоставимые, результаты измерений. Неожиданно было обнаружено, что оценка плотности клеток путем измерений мутности является не только высокоточной и воспроизводимой, но и позволяет контролировать процесс таким образом, чтобы ограничить образование одноцепочечной формы нейротоксического компонента. Таким образом, использование измерений мутности для контроля роста клеток и, в частности для определения конечной точки ферментации, позволяет уменьшить содержание нежелательной одноцепочечной формы в конечном продукте. Это значительное улучшение способа, так как с помощью современных способов очистки невозможно отделить неактивную (нерасщепленную) одноцепочечную форму от активной (расщепленной) двухцепочечной формы.
По настоящему изобретению культуру Clostridium botulinum на этапе (а) предпочтительно получают (i) созданием исходной культуры Clostridium botulinum с плотностью клеток от 530 до 850 FTU, в частности от 600 до 800 FTU, конкретнее от 650 до 750 FTU, и (ii) добавлением заранее заданного количества исходной культуры в питательную среду. Предпочтительно исходную культуру добавляют в ферментационную среду в количестве от 5,0% до 10,0% по объему, предпочтительно в количестве от 7,7% до 8,2% по объему. Кроме того, предпочтительно исходная культура имеет количество анаэробных жизнеспособных микроорганизмов не менее 5,0×105 КОЕ/мл (колониеобразующих единиц/мл), в частности не менее 2,0×106 КОЕ/мл, конкретнее - более, чем 1,0×107 КОЕ/мл и наиболее конкретно - от 1,0×107 КОЕ/мл до 1,0×108 КОЕ/мл. В настоящем изобретении количество аэробных или анаэробных жизнеспособных микроорганизмов определяют серией разведений посевов исходного образца на чашках с кровяным агаром, инкубацией чашек при заданной температуре (например, 37°С) и в течение заданного времени (например, от 40 часов до 72 часов) в аэробных или анаэробных условиях и подсчетом выросших колоний, в частности, в соответствии с Европейской фармакопеей 2.6.12 и USP<61>.
Исходную культуру можно получить, например, посредством получения сначала прекультуры путем инокуляции в среду для посева Clostridium botulinum и выращивания бактерий при подходящей температуре роста (например, 37°С). Аликвоту полученной прекультуры затем используют для инокуляции на питательную среду, а затем выращивания бактерий при подходящей температуре роста. Потом аликвоту полученной предварительной исходной культуры используют для инокуляции на питательную среду при подходящей температуре роста до достижения желаемой плотности клеток. Затем аликвоту полученной исходной культуры используют для инокуляции на ферментационную среду, используемую на этапе (а) способа по настоящему изобретению.
Источник штамма Clostridium botulinum (например, штамм Hall), используемого в настоящем изобретении, может быть в целях удобства заготовлен в виде замороженной аликвоты рабочего банка клеток (WCB). WCB создают из маточного банка клеток (МСВ) соответствующего штамма согласно способам, известным из уровня техники. Замороженная аликвота WCB может, например, быть поставлена в виде криопробирки, содержащей 800 мкл WCB и 200 мкл стерильного глицерина в качестве криопротектора. Обычно число жизнеспособных анаэробных микроорганизмов замороженной аликвоты Clostridium botulinum, в частности штамма Hall, составляет по меньшей мере 5,0×105 КОЕ/мл, предпочтительно более, чем 1,0×107 КОЕ/мл. Замороженные аликвоты (например, криопробирки) можно хранить при температуре - 80°С в морозильной камере или предпочтительнее при температуре около - 130°С в паровой фазе жидкого азота.
На этапе (b) способа по настоящему изобретению нейротоксический компонент выделяют из полученного ботулотоксина (комплекса). Способы очистки нейротоксического компонента из токсиновых комплексов, выработанных Clostridium botulinum, известны из уровня техники (см., например, DasGupta B.R. and Sathyamoorthy, V., Toxicon. 22:415-424, 1984; и WO 00/74703, 14.12.2000). Концентрация очищенного нейротоксического компонента в конце очистки, как правило, составляет от 100 мкг/мл до 500 мкг/мл, из расчета на один мл конечного раствора очищенного нейротоксического компонента.
Подходящий способ выделения для использования в настоящем изобретении, в частности для выделения нейротоксического компонента токсина Clostridium botulinum типа А, включая штамм Hall, включает в себя этап кислотного осаждения ботулотоксина в конце ферментации (например, добавлением 3 N серной кислоты; конечное значение рН составляет приблизительно 3,5). После центрифугирования осадок экстрагируют (например, с использованием 0,2 М натрий-фосфатного буфера с рН 6,0) для выделения токсинового комплекса в раствор. Затем экстракт подвергают осаждению протамина сульфатом (например, 2% протамина сульфатом) для осаждения нуклеиновых кислот из надосадочной жидкости, и токсиновый комплекс осаждают из надосадочной жидкости, используя сульфат аммония (например, добавлением 38 г сульфата аммония на 100 г надосадочной жидкости).
После растворения с использованияем фосфатного буфера (например, 50 мМ фосфата натрия, рН 6,0), токсин дополнительно очищают в три этапа метода ионообменной хроматографии в следующем порядке: быстропроточную ионообменную колонку с ионообменником с диэтиламиноэтилом и сефарозой (DEAE Sepharose Fast Flow), быстропроточный анионообменник с Q-сефарозой (Q Sepharose Fast Flow) и быстропроточный анионообменник с сефарозой SP (SP Sepharose Fast Flow). После добавления глицерина конечный элюат фильтруют через стерильный фильтр, например, фильтр с размером пор 0,22 мкм, для получения конечного продукта. Затем этот конечный продукт после очистки может быть дополнительно обработан, например, добавлением стабилизирующих добавок (например, человеческого сывороточного альбумина (HSA) или сахарозы) и/или лиофилизирован.
В соответствии с настоящим изобретением этап культивирования (а) и этап выделения (b) способа проводят в устройстве с градиентом давления. Это устройство включает в себя первый изоляторный модуль и необязательно второй или дополнительный изоляторный модуль, а также безопасный рабочий стол. Безопасный рабочий стол используют для асептической загрузки в первый изоляторный модуль и/или второй или дополнительный изоляторный модуль материалов, в частности термочувствительных материалов, которые нельзя обрабатывать в автоклаве (например, рабочие банки клеток). С этой целью материал может быть перенесен из безопасного рабочего места в изолятор (изоляторы) с помощью специальной системы перемещения/перегрузки (например, системы портов альфа/бета, реализуемой Getinge Group), описанной ниже. Это важный аспект настоящего изобретения, поскольку было установлено, что он обеспечивает меньшее загрязнение (микроорганизмами и определенными примесями) и более высокую чистоту нейротоксического компонента ботулотоксина.
В настоящем изобретении безопасным рабочим столом является BSC класса II, оснащенный системой перемещения/перегрузки, которая обеспечивает асептический перенос материала в BSC и из BSC. «Бок биологической безопасности», или «бокс биобезопасности», или «BSC», в контексте настоящего изобретения представляет собой закрытое, вентилируемое лабораторное рабочее пространство для защиты работника лаборатории и окружающей среды от рисков попадания опасных веществ, например, бактерий, вирусов или любых иных токсичных или патогенных веществ, а также для обеспечения стерильности материалов внутри рабочего пространства. Иначе говоря, BSC обеспечивают защиту эксперимента от окружающей среды и защиту окружающей среды от эксперимента. В контексте настоящего изобретения это также включает перенос термочувствительного материала в изолятор 1 или изолятор 2 без этапа стерилизации, например, банков клеток.
Предпочтительно, чтобы боксом биологической безопасности, используемым для безопасного рабочего стола, был BSC класса II, более предпочтительно - BSC класса II типа А1 или типа А2, наиболее предпочтительно - BSC класса II типа А2 по классификации Центров США по контролю и профилактике заболеваний (U.S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC)) (см. документы Министерства здравоохранения и социального обеспечения США, Службы общественного здравоохранения; Центров по контролю и профилактике заболеваний; Национальных институтов здоровья. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Appendix A - Primary Containment for Biohazards: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. 5th Edition, HHS Publication No. (CDC) 21-1112, Revised December 2009) и определенные стандартом NSF/ANSI 49-2007 (см. NSF International (NSF); American National Standards Institute (ANSI). NSF/ANSI Standard 49-2007. Class II (laminar flow) biosafety cabinetry. Ann Arbor (Ml); 2004). Безопасный рабочий стол обычно работает при том же давлении, какое существует в производственном помещении.
BSC включает в себя рабочую камеру, устройство подачи воздуха для подачи воздуха из однонаправленного воздушного потока, идущего в рабочей камере из верхней части в нижнюю часть, и устройство выпуска воздуха для выпуска воздуха однонаправленного воздушного потока. Действие боксов биобезопасности заключается в создании занавеса стерильного воздуха над обрабатываемыми продуктами. Затем воздух втягивается под рабочую поверхность (например, стол), и направляется обратно в верхнюю часть. Часть воздуха отводится, в то время как другая часть снова вводится в рабочее пространство для создания занавеса стерильного воздуха. В некоторой точке в системе воздух проходит через один или несколько фильтров, как правило, НЕРА-фильтров (класс высокоэффективной очистки воздуха от твердых частиц), так что отводимый воздух и рециркуляционный воздух стерильны и не содержат твердых частиц. Отводимый воздух состоит из воздуха, втянутого в передней части бокса, а затем прошедшего под рабочей поверхностью и соединенного с рециркуляционным воздухом, втянутым из бокса под рабочей поверхностью. В случае типичного BSC класса II типа А1, приблизительно 30% воздуха проходит через выпускной HEP А- фильтр, и примерно 70% рециркулируется через подающий НЕРА -фильтр обратно в рабочую зону бокса. BSC класса II типа А2 аналогичен типу А1, но минимальная скорость притока обычно составляет приблизительно 100 фут/мин или выше.
Следует понимать, что «BSC» в контексте настоящего изобретения не является «рабочим столом в чистой комнате». При использовании в настоящем документе «рабочий стол в чистой комнате» относится к «рабочему столу в чистой комнате» с горизонтальным ламинарным потоком или «рабочему столу в чистой комнате» с вертикальным ламинарным потоком, которые, как правило, создают только рабочую зону класса 100 для процедур, для которых необходима среда, не содержащая твердых частиц. Подпиточный воздух фильтруют, отводимый воздух не фильтруют. В отличие от этого, в случае BSC фильтруют как подпиточный, так и отводимый воздух, например, через НЕРА- фильтр. Таким образом, рабочий стол в чистой комнате обеспечивает только защиту продукта, но не предотвращает воздействие на работника материалов, обрабатываемых на рабочем столе в чистой комнате. Как правило, рабочие столы в чистой комнате непригодны для использования с любыми потенциально биологически опасными материалами, включая токсичные, мутагенные или канцерогенные вещества, биологические токсины, возбудители инфекции (например, бактерии, вирусы, паразиты и т.д.), и, как правило, не могут быть использованы, если необходимы асептические условия для работы.
Система перемещения/перегрузки на безопасном рабочем столе предпочтительно включает в себя первый блок перемещения/перегрузки и второй блок перемещения/перегрузки, соединяемые друг с другом с возможностью отсоединения, при этом первый блок перемещения/перегрузки представляет собой герметичный компонент, установленный на поверхности BSC, обычно прикрепленный к стенке BSC, и второй блок перемещения/перегрузки представляет собой герметичный контейнер. Герметичный контейнер может быть изготовлен из различных материалов, таких как нержавеющая сталь, полиэтилен и тому подобное. Он может быть жестким или гибким, например, в форме мешка, и может быть контейнером одноразового или многоразового использования. Предпочтительно система перемещения/перегрузки представляет собой систему перемещения/перегрузки DPTE® (Getinge), состоящая из двух отдельных блоков, то есть Альфа и Бета частей, каждая из которых оснащена дверцей, замком, имеет функцию герметизации и обеспечивает возможность последовательно переносить материалы, не нарушая герметичности стерильной или токсической среды, находящейся в Альфа или Бета компоненте.
Устройство с градиентом давления по настоящему изобретению дополнительно включает в себя первый изоляторный модуль и, необязательно, второй или дополнительный изоляторный модуль. Первый изоляторный модуль и второй или дополнительный изоляторный модуль представляют собой BSC класса II, оснащенные системой перемещения/перегрузки, которая обеспечивает асептический перенос материала в BSC и из BSC. Как правило, в передней части прикреплены перчатки для предотвращения соприкосновения с нейротоксином. Системой перемещения/перегрузки может быть, например, система DPTE, описанная выше в связи с безопасным рабочим столом. Первый изоляторный модуль содержит ферментер, в котором проводят этап культивирования Clostridium botulinum. Первый и второй или дополнительный изоляторные модули расположены в производственном помещении, соединенном с окружающей средой через воздушный шлюз, в котором создается градиент давления между изоляторным модулем (модулями), производственным помещением и воздушным шлюзом.
В частности, давление в первом и втором или дополнительном изоляторных модулях ниже, чем в производственном помещении, например, на 10-100 Па, предпочтительнее 20-80 Па, более предпочтительно 50-70 Па, наиболее предпочтительно 60 Па, ниже, чем в производственном помещении. Кроме того, хотя давление в производственном помещении выше, чем в первом и втором или дополнительном изоляторных модулях, оно, тем не менее, ниже, чем давление окружающей среды, например, на 5-50 Па, предпочтительнее 10-30 Па, более предпочтительно 12-18 Па и наиболее предпочтительно 15 Па, ниже давления окружающей среды.
Давление в воздушном шлюзе выше давления окружающей среды, например, на 10-100 Па, предпочтительнее на 20-80 Па, более предпочтительно на 25-35 Па и наиболее предпочтительно на 30 Па выше давления окружающей среды. Иначе говоря, как правило, существует разница в давлении между воздушным шлюзом и производственным помещением приблизительно на 15-150 Па, предпочтительно приблизительно на 30-110 Па, более предпочтительно приблизительно на 37-53 Па и наиболее предпочтительно приблизительно на 45 Па. Термин «давление окружающей среды» означает давление окружающей атмосферы и, как правило, составляет приблизительно 1 атмосферу, но может варьироваться в зависимости от географического положения или метеорологических условий.
Вторым или дополнительным изоляторным модулем может быть BSC, описанный выше в связи с первым изоляторным модулем. Он может работать при том же самом или ином давлении, что и первый изоляторный модуль. Кроме того, первый изоляторный модуль может быть соединен или не соединен со вторым или дополнительным изоляторными модулями, например, посредством одного или нескольких запираемых воздушных шлюзов, контейнера с двойным замком или портов. В соответствии с настоящим изобретением этап культивирования (а) и этап выделения (b) могут проводиться в первом изоляторном модуле. Однако предпочтительнее, чтобы этап культивирования и, по крайней мере, одну стадию этапа очистки проводили в первом изоляторном модуле, при этом чтобы остальные стадии очистки проводили во втором или дополнительном изоляторных модулях. Первый изоляторный модуль может работать при более высокой температуре, например, приблизительно от 15 до 50°С или от 20 до 40°С, и второй или дополнительный изоляторный модуль может работать при более низкой температуре, например, в диапазоне приблизительно от -5°С до +25°С. Термин «приблизительно», используемый в контексте настоящего изобретения, означает «примерно» или «ориентировочно». В контексте числовых значений, без привязки к строгому численному определению, можно толковать термин как оценочное значение, которое составляет +/- 10% от указанного значения или диапазона.
Производственное помещение по настоящему изобретению является герметичным и воздухонепроницаемым помещением, которое может работать при отрицательном давлении. Снаружи в него можно попасть через один или несколько воздушных шлюзов. В производственном помещении находятся безопасный рабочий стол и первый изолятор, и необязательно второй или дополнительный изолятор. Подача воздуха в производственное помещение и из производственного помещения происходит предпочтительно через фильтры, в частности, НЕРА - фильтры. Внутри производственного помещения поддерживается контролируемая температура, например, от 19 до 26°С, и контролируемая относительная влажность, например, от 40% до 60%, в частности 55%. Некоторые операции или виды деятельности, включая измерения или испытания, которые необходимы или связаны с получением ботулотоксина, могут выполняться вне изоляторного модуля, в частности, если они не связаны с образованием аэрозоля или если присутствует биологический активный материал в форме, которая не представляет никакой опасности для людей, занятых в получении ботулотоксина.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к высокочистому нейротоксическому компоненту токсина Clostridium botulinum, в котором содержание одноцепочечных соединений составляет менее 2,00 вес. %. Предпочтительно содержание одноцепочечных форм составляет менее 1,90 вес. %, 1,80 вес. %, 1,70 вес. %, 1,60 вес. %, 1,50 вес. %, 1,40 вес. %, 1,30 вес. %, 1,20 вес. %, 1,10 вес. %, 1,00 вес. %, 0,90 вес. % или менее 0,80 вес. %. Кроме того, предпочтительно высокочистый нейротоксический компонент по настоящему изобретению имеет общую чистоту по меньшей мере 99,90 вес. %, более предпочтительно - по меньшей мере 99,95 вес. % и наиболее предпочтительно - по меньшей мере 99,99 вес. %, при этом термин «общая чистота» имеет значение, определенное выше. Кроме того, высокочистый нейротоксический компонент токсина Clostridium botulinum по настоящему изобретению может иметь содержание эндотоксина равное или менее 5,0 ME, в частности равное или менее 1,0 МЕ/мл, на мл конечного продукта после очистки, то есть, как правило, один мл раствора, содержащего высокочистый нейротоксический компонент ботулотоксина в концентрации от 100 мкг/мл до 500 мкг/мл.
Кроме того, предпочтительно высокочистый нейротоксический компонент токсина Clostridium botulinum по настоящему изобретению имеет общее содержание аэробных жизнеспособных клеток менее 1 КОЕ/мл, предпочтительно менее 0,5 КОЕ/мл, более предпочтительно, 0 КОЕ/мл, в расчете на один мл раствора, содержащего высокочистый нейротоксический компонент ботулотоксина в концентрации от 100 мкг/мл до 500 мкг/мл.
Кроме того, высокочистый нейротоксический компонент токсина Clostridium botulinum по настоящему изобретению имеет биологическую активность (относительную активность) в анализе LD50 4,0-8,0 пг белка/единицу ЛД50, в частности, 5,0-6,0 пг белка/единицу LD50. Анализ LD50, используемый в настоящем документе для оценки биологической активности, известен в этой области техники и описан, например, в Реаrсе LB, Borodic GE, First ER, MacCallum RD Measurement of botulinum toxin activity: evaluation of the lethality assay. Toxicol Appl Pharmacol 128: 69-77, 1994. Биологическая активность выражается в «единицах» (Е), где 1 Е определяется как эквивалентное количество токсина (т.е. нейротоксического компонента), которое убивает 50% указанной популяции мышей после внутрибрюшинной инъекции.
Описанный выше высокочистый нейротоксический компонент токсина Clostridium botulinum может быть получен посредством способа по изобретению. Таким образом, в предпочтительном варианте настоящего изобретения, высокочистый нейротоксический компонент токсина Clostridium botulinum, описанный в настоящем документе, получен посредством способа по изобретению.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей высокочистый нейротоксический компонент токсина Clostridium botulinum и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей. «Фармацевтическая композиция» представляет собой лекарственную форму, в которой содержится или включен активный ингредиент. Лекарственная форма, или форма выпуска, фармацевтической композиции, в частности, не ограничивается, но предпочтительно представляет собой парентеральную лекарственную форму, например, водный или неводный раствор или дисперсию для инъекций или инфузий. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть лиофилизирована, или высушена вакуумным способом, разведена до исходной концентрации, или поставлена в растворе. В случае разведения до исходной концентрации предпочтительно, чтобы разбавленный раствор готовили путем добавления стерильного физиологического раствора (т.е. 0,9% в пересчете по весу NaCl).
Фармацевтическая композиция, как правило, содержит эффективное количество нейротоксического компонента по настоящему изобретению. В настоящем изобретении термин «эффективное количество» относится к количеству нейротоксического компонента, которое после введения приводит к частичному или полному исчезновению симптомов заболевания или патологических состояний. Терапевтически эффективное количество может быть введено в виде одного или нескольких введений, нанесений или дозировок и, как предполагается, не ограничено определенной формой или способом введения. Эффективные количества, как правило, составляют от 1 до 2000 Е. Тем не менее, также могут использоваться дозировки до 5000 Е. Когда пациенту необходимо ввести высокие дозировки нейротоксического компонента, может быть целесообразно разделить терапию на несколько сеансов процедур. Термин «несколько сеансов процедур» означает, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 сеансов процедур.
В контексте настоящего изобретения «носитель» относится к разбавителю или наполнителю, посредством которого вводят активный ингредиент. Подходящие носители для использования по настоящему изобретению включают в себя стерильные жидкости или дисперсии, в частности подходящие для парентерального введения (например, путем внутримышечной или подкожной инъекции), как описано в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition (2000). Предпочтительно носителем является вода или водный рН буфер, например, фосфатный буфер, физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS) или ацетатный буфер. Термин «фармацевтически приемлемый» при использовании в настоящем документе относится к таким соединениям или веществам, которые, в рамках благоразумного медицинского решения, пригодны для контакта с тканями млекопитающих, особенно людей, без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции и других проблемных осложнений.
Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может включать в себя дополнительные компоненты, например, наполнители, стабилизаторы и/или криопротекторы. Наполнители могут включать в себя, помимо прочего, сахара (например, моно- или дисахариды, такие как сахароза), соли (например, NaCl), детергенты (например, неионогенные, анионные или катионные поверхностно-активные вещества), и хелатирующие вещества (например, ЭДТА (EDTA)). Примеры стабилизаторов включают в себя белковоподобные стабилизаторы, например, желатин или альбумин (т.е. HSA), и небелковоподобные стабилизаторы, например, гиалуроновую кислоту, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и их смеси. Криопротекторы оказывают стабилизирующее действие на белки (т.е. нейротоксический компонент) во время лиофилизации и включают себя, помимо прочего, спирты, в особенности многоатомные спирты, такие как инозит, маннит или глицерин. Кроме того, фармацевтическая композиция может включать в себя один или несколько дополнительных активных веществ, которые вводят совместно с нейротоксическим компонентом по настоящему изобретению.
Предпочтительно фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит высокочистый нейротоксический компонент, описанный в настоящем документе, рН буфер, предпочтительно фосфатный буфер или ацетатный буфер, и в качестве стабилизатора гиалуроновую кислоту или поливинилпирролидон, или полиэтиленгликоль, или BSA, или HSA. Кроме того, фармацевтическая композиция может содержать многоатомный спирт и/или детергент.
В еще одном дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к использованию нейротоксического компонента токсина Clostridium botulinum по настоящему изобретению в качестве лекарственного средства. При использовании в настоящем документе «лекарственное средство» относится к любой композиции, содержащей нейротоксический компонент токсина Clostridium botulinum для лечения заболевания. В этом контексте термин «заболевание» не ограничивается определенным заболеванием, но включает в себя любое расстройство или состояние, которое нарушает функции организма и препятствует функционированию систем и органов организма.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к использованию нейротоксического компонента токсина Clostridium botulinum по настоящему изобретению в лечении заболевания или состояния, связанного с гиперактивной холинергической иннервацией мышц или экзокринных желез. При использовании в настоящем документе термин «лечение» включает в себя терапевтическое лечение и профилактическое лечение (профилактику), а также косметическое лечение заболевания или состояния. В контексте настоящего изобретения «лечение» обычно включает в себя введение эффективного количества высокочистого нейротоксического компонента Clostridium botulinum по настоящему изобретению пациенту, имеющему заболевание или состояние, связанное с гиперактивной холинергической иннервацией мышц или экзокринных желез.
При использовании в настоящем документе термин «пациент» относится к млекопитающему, предпочтительно к человеку. Пациент, возможно, никогда не подвергался воздействию ботулотоксина или, возможно, подвергался воздействию ботулотоксина. При использовании в настоящем контексте термин «эффективное количество» имеет значение, описанное выше в связи с фармацевтической композицией.
При использовании в настоящем документе термин «гиперактивная холинергическая иннервация» относится к синапсу, который характеризуется необычно высоким количеством высвобождения ацетилхолина в синаптическую щель. «Необычно высокий» относится к увеличению до уровня 25%, до уровня 50% или более по сравнению с эталонной активностью, что может быть получено, например, путем сравнения выделения с выделением в синапсе того же самого типа, но который не находится в гиперактивном состоянии, при этом на гиперактивное состояние может указывать мышечная дистония. «До уровня 25%» означает, например, от приблизительно 1% до приблизительно 25%. Способы проведения необходимых измерений известны в данной области техники.
Примеры заболеваний или состояний, связанных с гиперактивной холинергической иннервацией мышц или экзокринных желез, подробно описаны в Dressier, D., Botulinum Toxin Therapy, Thieme, Stuttgart, New York, 2000, и включают в себя, помимо прочего, дистонию (например, черепную дистонию, цервикальную дистонию, фарингеальную дистонию, ларингеальную дистонию, дистонию конечностей), косметическое применение (например, морщины «гусиные лапки», межбровные морщины, асимметрии лица, подбородочные ямки), страбизм, гиперактивность экзокринной железы (например, синдром Фрея, синдром «крокодиловых слез», гипергидроз), ринорею, гиперсаливацию (слюнотечение), спастические состояния и другие заболевания.
Другие заболевания, связанные с гиперактивной холинергической иннервацией мышц или экзокринных желез, включают в себя, например, нистагм мягкого неба, миоклонус, миокимию, ригидность, доброкачественные судороги мышц, наследственное дрожание подбородка, парадоксальную активность жевательных мышц, односторонние спазмы жевательных мышц, гипертрофическую бранхиальную миопатию, гипертрофию жевательных мышц, гипертрофию передней большеберцовой мышцы, нистагм, осциллопсию, надъядерный паралич взора, эпилепсию парциальную непрерывную, планирующаяся операция спастической кривошеи, паралич абдуктора голосовых связок, упорную (не поддающуюся лечению) мутационную дисфонию, дисфункцию верхнего эзофагального сфинктера, гранулему голосовой складки, заикание, синдром Жиля де ля Туретта, миоклонус среднего уха, защитное смыкание гортани, расстройство речи после ларингэктомии, защитный птоз, заворот век, дисфункцию сфинктера Одди, псевдоахалазию, двигательные эзофагальныео расстройства неахалазионного характера, вагинизм, послеоперационную иммобилизацию, тремор, дисфункцию мочевого пузыря, гемифациальный спазм, реиннервационные дискинезии, синдром мышечной скованности, столбняк, гиперплазию предстательной железы, лечение ожирения, детский церебральный паралич, ахалазию и анальные трещины.
Подходящие способы введения включают в себя, помимо прочего, парентеральное введение, в частности подкожную и внутримышечную инъекцию. Режим введения особенно не ограничен и включает в себя, например, схемы, предполагающие введение один раз в две недели, ежемесячно, раз в два месяца, один раз в три, шесть и девять месяцев и один раз в год или однократно. Вводимая пациенту терапевтически эффективная доза высокочистого нейротоксического компонента по настоящему изобретению зависит от способа применения, типа заболевания или состояния, веса, возраста, пола и состояния здоровья пациента, и тому подобного. Препарат может вводиться однократно или многократно, в зависимости от необходимости. Высокочистый нейротоксический компонент по настоящему изобретению может также вводиться совместно с другими активными веществами.
Настоящее изобретение теперь будет дополнительно проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры показывают, что использование устройства с градиентом давления, описанного в настоящем документе, позволяет создавать рабочие зоны, которые являются асептическими и имеют чрезвычайно низкое число присутствующих в воздухе частиц. Как было неожиданно обнаружено, это оказывает сильное воздействие на общее качество продукта, в частности в отношении чистоты нейротоксического компонента.
Пример 1
Конструкция безопасного рабочего стола
Часть «Альфа» системы перемещения/перегрузки DPTE® (Getinge Group) была установлена на правой боковой стенке бокса биологической безопасности HERAsafe® (NSF) класса II типа А2, оснащенного фильтрами НЕРА (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Жесткий контейнер для перемещения/перегрузки (контейнер Бета DPTE 190 из нержавеющей стали) использовали в качестве перемещаемой части «Бета» DPTE®. Каждый из двух отдельных блоков системы перемещения/перегрузки DPTE®, т.е. части Альфа и Бета, оснащен дверцей, замком, имеет функцию герметизации и обеспечивает последовательное перемещение/перегрузку токсического или патогенного материала, не нарушая герметичности стерильной или токсической среды, находящейся в компоненте Альфа или Бета.
Во всех экспериментах, описанных ниже, использовали этот безопасный рабочий стол, который находится в производственном помещении (работает при нейтральном давлении по сравнению с давлением в производственном помещении). Производственное помещение функционировало при температуре 19-26°С и давлении -15 Па относительно давления окружающей среды. В производственном помещении были дополнительно расположены два изолятора (изолятор 1: ферментация; изолятор 2: очистка), работавшие при давлении -60 Па относительно давления в производственном помещении. Производственное помещение было соединено с окружающей средой посредством воздушного шлюза для персонала и воздушного шлюза для материалов.
Пример 2
Микробиологическая чистота в изоляторном модуле по настоящему изобретению
Цель настоящего исследования состояла в демонстрации осуществления культивирования Clostridium botulinum, используя способ по изобретению в асептических условиях. Следовательно, все процедуры культивирования были смоделированы без микроорганизмов в трех последовательных циклах. Все питательные среды и добавки заменили средами для испытаний на стерильность (TSB- и тиогликолятная среда для аэробных или анаэробных условий реализации способа).
Для верификации отсутствия микробиологического загрязнения, образцы, взятые на различных этапах реализации способа, инкубировали в течение по меньшей мере 14 дней, но не более 21 дня, при температуре от 20°С до 35°С следующим образом: инкубация при 20-25°С в течение по меньшей мере 7 дней, непосредственно после этого инкубация при 30-35°С в течение по меньшей мере 7 дней.
Как видно из таблицы 1, не было обнаружено микробных загрязнений на различных этапах культивирования. Это показывает, что изолятор, использованный в настоящем изобретении - несмотря на работу при более низком давлении, чем в производственном помещении, что приводит к притоку потенциальных примесей - обеспечивает контроль асептического процесса.
Кроме того, количество взвешенных в воздухе микроорганизмов определяли в трех различных точках измерения (обозначенных MP 18, MP 19 и МР20) в изоляторном модуле 1. Как показано в таблице 2, во всех трех точках измерения взвешенных в воздухе микроорганизмов обнаружено не было. Наоборот, было установлено, что среднее количество взвешенных в воздухе микроорганизмов в производственном помещении, измеренное в 2010 году, составило 3 КОЕ/м3.
Таким образом, применение изоляторного модуля, используемого в способе по настоящему изобретению, позволяет создать рабочие зоны, свободные от микробного загрязнения и взвешенных в воздухе микроорганизмов.
Пример 3
Содержание частиц в изоляторном модуле
Еще одним важным фактором, дополнительно к микробному загрязнению и количеству взвешенных в воздухе микроорганизмов, который определяет качество продукта, является концентрация примесей в виде частиц. Это имеет особое значение в фармацевтической промышленности, где критически важным является защита данного продукта от (взвешенных в воздухе) частиц. Соответственно, измерили количество взвешенных в воздухе частиц в различных рабочих зонах (обозначенных MP 18, MP 19 и МР20) изоляторного модуля, используемого в настоящем изобретении. Измерение частиц проводили с использованием счетчика частиц, коммерчески доступного в GAS Clean-Air-Service AG, Швейцария. Результаты показаны в таблице 3 ниже.
Результаты показывают, что изоляторный модуль, используемый в настоящем изобретении, содержит только очень небольшое количество частиц с диаметром ≥0,5 мкм и по существу не содержит частиц с диаметром ≥5,0 мкм во всех трех точках измерения. Напротив, было установлено, что средние количества частиц в производственном помещении, измеренные в 2010 году, составляли 434 на фут3 для частиц с диаметрами ≥0,5 мкм и 22 на фут3 для частиц с диаметром ≥5,0 мкм. Это демонстрирует очень высокую чистоту в плане наличия частиц в изоляторном модуле по настоящему изобретению по сравнению с чистотой в окружающем производственном помещении.
Пример 4
Качество продукта с точки зрения биохимической чистоты
Определили общую чистоту и содержание одноцепочечной формы из различных партий нейротоксических компонентов, очищенных из токсина Clostridium botulinum типа А, вырабатываемого штаммом Hall (АТСС 3502), с использованием и без использования изолятора по настоящему изобретению.
Посеяли объем 10 мл питательной среды в аликвоту с рабочим банком клеток штамма Hall Clostridium botulinum типа А (АТСС 3502) для получения прекультуры общим объемом 10 мл. Аликвоту прекультуры использовали для инокуляции 50 мл среды для получения Исходной культуры 1. Получили Исходную культуру 2 посредством посева 1600 мл среды в аликвоту с Исходной культурой 1. Среду для культуры ферментации (17,4 л) стерилизовали in situ в ферментере. После добавления 1 л стерильного раствора глюкозы произвели посев 1600 мл Исходной культуры 2 в культуру ферментации. Ферментацию проводили при 33,5°С в течение 72 часов.
Очистку проводили в порядке, описанном выше. «Общая чистота» означает массовую долю одноцепочечных и двухцепочечных форм нейротоксического компонента на основании общего веса образца очищенного нейротоксического компонента. Полученные результаты показаны в таблице 4 ниже.
Как можно видеть из таблицы 4, общая чистота нейротоксического компонента, полученного согласно настоящему изобретению, достигает 99,9 вес. %. Для сравнения, общая чистота, полученная без использования технологии с применением изолятора по настоящему изобретению, составляет всего 97,8 вес. %. Иными словами, нейротоксический компонент, полученный в соответствии с настоящим изобретением, состоит по существу только из нейротоксического компонента (в одноцепочечной или двухцепочечной форме), при этом нейротоксический компонент, полученный без использования технологии применения изолятора по настоящему изобретению, содержит значительное количество загрязнений в объеме 2,2 вес. %.
Партии, показанные в таблице 4, затем оценивали с точки зрения содержания в них одноцепочечной формы нейротоксического компонента. Для определения содержания одноцепочечной формы использовали SDS-PAGE с фотометрической оценкой. Содержание одноцепочечной формы является особенно важным параметром, так как нерасщепленная одноцепочечная форма в основном является неактивной и, таким образом, «примесью» в контексте настоящего изобретения. Кроме того, при хроматографии ее невозможно отличить от активной двухцепочечной формы. Результаты показаны в таблице 5.
Неожиданно результаты показывают, что способ по настоящему изобретению обеспечивает среднее содержание одноцепочечной формы 1,2 вес. % по сравнению с 1,7 вес. %, полученных для использованных для сравнения партий.
Пример 5
Качество продукта с точки зрения микробиологической чистоты Микробиологическую чистоту (бионагрузку) продукта оценивали путем измерения аэробной микробной бионагрузки в соответствии с Европейской фармакопеей 2.6.12 и USP <61> на разных этапах реализации способа на партиях, подготовленных в соответствии с настоящим изобретением, в сравнении с партиями, подготовленными без технологии применения изолятора, используемой в настоящем изобретении. Результаты показаны в таблицах 6, 7 и 8.
Результаты, представленные в таблицах 6, 7 и 8, показывают, что бионагрузка на начальном этапе (после диализа 1) способа по настоящему изобретению составляет <8 и, таким образом, гораздо ниже среднего значения 547, полученного без использования изолятора по настоящему изобретению. Это гарантирует, что в конечном продукте будут отсутствовать аэробные микроорганизмы (бактерии).
Пример 6
Качество продукта в отношении загрязнения эндотоксином
Уровень эндотоксина в партиях, приготовленных в соответствии с настоящим изобретением, измерили в соответствии с Европейской фармакопеей 2.6.14 и USP <85> и сравнили с уровнем, определенным для партий, приготовленных без использования технологии применения изолятора по настоящему изобретению. Измеренные значения содержания эндотоксина были указаны в ME на мл конечного продукта (раствора, содержащего 100-500 мкг/мл высокоочищенного нейротоксического компонента). Результаты показаны в таблице 9.
Как можно видеть из таблицы 9, уровни эндотоксина в партиях, приготовленных в соответствии с настоящим изобретением, значительно ниже уровня в партиях, используемых для сравнения. Средний уровень эндотоксина <0,8 МЕ/мл, выявленный для нейротоксического компонента по настоящему изобретению, является приемлемым уровнем эндотоксина для фармацевтического продукта, содержащего ботулотоксин.
Приведенные выше результаты показывают, что способ по настоящему изобретению обеспечивает возможность получения высокочистого нейротоксического компонента ботулотоксина, при этом соответствуя стандартам по гигиене труда и технике безопасности.
Claims (16)
1. Высокочистый нейротоксический компонент токсина Clostridium botulinum для лечения заболевания или состояния, связанного с гиперактивной холинергической иннервацией мышц или экзокринных желез, в котором содержание одноцепочечной формы составляет менее 2,00% по весу.
2. Высокочистый нейротоксический компонент по п. 1, дополнительно имеющий общую чистоту по меньшей мере 99,90% по весу.
3. Высокочистый нейротоксический компонент по п. 1 или 2, дополнительно имеющий содержание эндотоксина 5,0 МЕ/мл или менее и/или общее количество анаэробных жизнеспособных микроорганизмов менее 1 КОЕ/мл.
4. Способ получения высокочистого нейротоксического компонента ботулотоксина по п. 1, включающий в себя этапы, на которых осуществляют:
(a) культивирование Clostridium botulinum в условиях, обеспечивающих выработку ботулотоксина, и
(b) выделение нейротоксического компонента из ботулотоксина,
в котором этап культивирования (а) и этап выделения (b) проводят в устройстве с градиентом давления, причем устройство с градиентом давления включает в себя первый изоляторный модуль, содержащий ферментер для культивирования Clostridium botulinum, безопасный рабочий стол и, необязательно, второй или дополнительный изоляторный модуль, при этом первый и второй или дополнительный изоляторные модули расположены в производственном помещении, соединенном с окружающей средой через воздушный шлюз, причем давление в первом и втором или дополнительном изоляторных модулях ниже, чем в производственном помещении, давление в производственном помещении ниже, чем давление окружающей среды, и давление в воздушном шлюзе выше, чем давление окружающей среды, и при этом безопасный рабочий стол находится в производственном помещении и представляет собой BSC (бокс биологической безопасности) класса II, снабженный системой перемещения/перегрузки, которая обеспечивает асептический перенос материала в BSC и из BSC.
5. Способ по п. 4, в котором температуру культивирования поддерживают на уровне 33,5°С±1,0°С.
6. Способ по п. 4 или 5, в котором плотность клеток в ходе культивирования на этапе (а) контролируют посредством измерений мутности с использованием формазина в качестве основного стандарта мутности.
7. Способ по п. 4, в котором культивирование Clostridium botulinum продолжают до тех пор, пока плотность клеток не уменьшится с уровня плотности клеток 1,3±0,3 FTU, достигнутого через 24 часа культивирования, до менее чем 0,8 FTU.
8. Способ по п. 4, в котором культуру Clostridium botulinum, используемую на этапе (а), получают путем (i) создания исходной культуры Clostridium botulinum с плотностью клеток от 530 до 850 FTU и (ii) добавления заранее установленного количества исходной культуры в ферментационную среду.
9. Способ по п. 8, в котором исходную культуру добавляют в ферментационную среду в количестве от 5,0% до 10,0% по объему.
10. Способ п. 4, в котором система перемещения/перегрузки BSC класса II включает в себя первый блок перемещения/перегрузки и второй блок перемещения/перегрузки, соединяемые друг с другом с возможностью отсоединения, при этом первый блок перемещения/перегрузки представляет собой герметичный компонент, установленный на поверхности или прикрепленный к стенке BSC, и второй блок перемещения/перегрузки представляет собой герметичный контейнер.
11. Способ п. 4, в котором Clostridium botulinum представляет собой Clostridium botulinum типа А, включая штамм Hall (АТСС 3502).
12. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания или состояния, связанного с гиперактивной холинергической иннервацией мышц или экзокринных желез, содержащая высокочистый нейротоксический компонент токсина Clostridium botulinum по п. 1 и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей.
13. Применение высокочистого нейротоксического компонента токсина Clostridium botulinum по п. 1 для лечения заболевания или состояния, связанного с гиперактивной холинергической иннервацией мышц или экзокринных желез.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP13003792.2 | 2013-07-30 | ||
EP13003792 | 2013-07-30 | ||
PCT/EP2014/002089 WO2015014487A1 (en) | 2013-07-30 | 2014-07-30 | Process for preparing a highly pure neurotoxic component of a botulinum toxin and uses thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2016103329A RU2016103329A (ru) | 2017-08-31 |
RU2663136C2 true RU2663136C2 (ru) | 2018-08-01 |
Family
ID=48906087
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016103329A RU2663136C2 (ru) | 2013-07-30 | 2014-07-30 | Способ получения высокочистого нейротоксического компонента ботулотоксина и его применения |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9937245B2 (ru) |
EP (1) | EP3027641A1 (ru) |
JP (1) | JP6517800B2 (ru) |
KR (1) | KR102272580B1 (ru) |
CN (1) | CN105658662B (ru) |
AU (1) | AU2014298922B2 (ru) |
BR (1) | BR112016001730B1 (ru) |
CA (1) | CA2918233C (ru) |
HK (1) | HK1225744A1 (ru) |
IL (1) | IL243573B (ru) |
MX (1) | MX2016001220A (ru) |
RU (1) | RU2663136C2 (ru) |
WO (1) | WO2015014487A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2805226C2 (ru) * | 2019-04-15 | 2023-10-12 | Джетема Ко., Лтд. | Способ очистки ботулинического токсина |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AR061669A1 (es) * | 2006-06-29 | 2008-09-10 | Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa | Aplicacion de alta frecuencia de terapia con toxina botulinica |
US10792344B2 (en) | 2006-06-29 | 2020-10-06 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | High frequency application of botulinum toxin therapy |
CA2918233C (en) * | 2013-07-30 | 2022-08-30 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Process for preparing a highly pure neurotoxic component of a botulinum toxin and uses thereof |
SG11201705019PA (en) * | 2014-12-23 | 2017-07-28 | Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa | Botulinum toxin prefilled container |
EP3274044B1 (en) | 2015-03-26 | 2023-03-01 | Vensica Medical Ltd. | Ultrasonic urinary bladder drug delivery |
WO2019193591A1 (en) | 2018-04-01 | 2019-10-10 | Vensica Medical Ltd. | System and method for ultrasonic bladder therapeutic agent delivery |
JP6875318B2 (ja) * | 2018-04-24 | 2021-05-19 | 株式会社日立産機システム | 安全キャビネット |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2206337C1 (ru) * | 2002-10-29 | 2003-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Токсины и сопутствующие продукты" | Лекарственный препарат для лечения мышечных дистоний и способ его получения |
US20080187967A1 (en) * | 2005-06-17 | 2008-08-07 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Device and method for the production of biologically active compounds by fermentation |
US20120088732A1 (en) * | 1999-06-07 | 2012-04-12 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Therapeutic composition comprising a botulinum neurotoxin |
US20120196349A1 (en) * | 2009-10-21 | 2012-08-02 | Revance Therapeutics, Inc. | Methods and Systems for Purifying Non-Complexed Botulinum Neurotoxin |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6903187B1 (en) | 2000-07-21 | 2005-06-07 | Allergan, Inc. | Leucine-based motif and clostridial neurotoxins |
US7339671B2 (en) * | 2004-01-20 | 2008-03-04 | Hong Peng | Apparatus and method for monitoring biological cell culture |
US8518414B2 (en) * | 2005-11-17 | 2013-08-27 | Revance Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of topical application and transdermal delivery of botulinum toxins with reduced non-toxin proteins |
AR061669A1 (es) * | 2006-06-29 | 2008-09-10 | Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa | Aplicacion de alta frecuencia de terapia con toxina botulinica |
AU2009286973B2 (en) * | 2008-08-29 | 2014-06-12 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Clostridial neurotoxins with altered persistency |
EP2248518B1 (en) * | 2009-04-17 | 2013-01-16 | Merz Pharma GmbH & Co. KGaA | Formulation for stabilizing proteins, peptides or mixtures thereof. |
US8129139B2 (en) | 2009-07-13 | 2012-03-06 | Allergan, Inc. | Process for obtaining botulinum neurotoxin |
JP2011074025A (ja) * | 2009-09-30 | 2011-04-14 | Chemo-Sero-Therapeutic Research Inst | ボツリヌス毒素の精製方法 |
US20120189677A1 (en) * | 2011-01-20 | 2012-07-26 | Stephen Tonge | Formulations |
FR2981386B1 (fr) * | 2011-10-14 | 2014-08-22 | Getinge La Calhene | Mecanisme de commande a haut niveau de securite pour un dispositif de transfert etanche entre deux volumes clos |
CA2918233C (en) * | 2013-07-30 | 2022-08-30 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Process for preparing a highly pure neurotoxic component of a botulinum toxin and uses thereof |
-
2014
- 2014-07-30 CA CA2918233A patent/CA2918233C/en active Active
- 2014-07-30 JP JP2016530382A patent/JP6517800B2/ja active Active
- 2014-07-30 EP EP14749719.2A patent/EP3027641A1/en active Pending
- 2014-07-30 BR BR112016001730-7A patent/BR112016001730B1/pt active IP Right Grant
- 2014-07-30 KR KR1020167004505A patent/KR102272580B1/ko active IP Right Grant
- 2014-07-30 US US14/908,235 patent/US9937245B2/en active Active
- 2014-07-30 RU RU2016103329A patent/RU2663136C2/ru active
- 2014-07-30 WO PCT/EP2014/002089 patent/WO2015014487A1/en active Application Filing
- 2014-07-30 CN CN201480043265.8A patent/CN105658662B/zh active Active
- 2014-07-30 MX MX2016001220A patent/MX2016001220A/es active IP Right Grant
- 2014-07-30 AU AU2014298922A patent/AU2014298922B2/en active Active
-
2016
- 2016-01-11 IL IL243573A patent/IL243573B/en active IP Right Grant
- 2016-12-07 HK HK16113961A patent/HK1225744A1/zh unknown
-
2018
- 2018-01-26 US US15/881,135 patent/US10653754B2/en active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120088732A1 (en) * | 1999-06-07 | 2012-04-12 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Therapeutic composition comprising a botulinum neurotoxin |
RU2206337C1 (ru) * | 2002-10-29 | 2003-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Токсины и сопутствующие продукты" | Лекарственный препарат для лечения мышечных дистоний и способ его получения |
US20080187967A1 (en) * | 2005-06-17 | 2008-08-07 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Device and method for the production of biologically active compounds by fermentation |
US20120196349A1 (en) * | 2009-10-21 | 2012-08-02 | Revance Therapeutics, Inc. | Methods and Systems for Purifying Non-Complexed Botulinum Neurotoxin |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2805226C2 (ru) * | 2019-04-15 | 2023-10-12 | Джетема Ко., Лтд. | Способ очистки ботулинического токсина |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN105658662B (zh) | 2022-05-27 |
AU2014298922B2 (en) | 2018-03-15 |
US10653754B2 (en) | 2020-05-19 |
US9937245B2 (en) | 2018-04-10 |
IL243573B (en) | 2019-03-31 |
BR112016001730A2 (pt) | 2017-08-29 |
CA2918233C (en) | 2022-08-30 |
US20180147266A1 (en) | 2018-05-31 |
WO2015014487A1 (en) | 2015-02-05 |
KR20160036581A (ko) | 2016-04-04 |
US20160175407A1 (en) | 2016-06-23 |
JP2016527257A (ja) | 2016-09-08 |
JP6517800B2 (ja) | 2019-05-22 |
IL243573A0 (en) | 2016-03-31 |
AU2014298922A1 (en) | 2016-02-18 |
KR102272580B1 (ko) | 2021-07-05 |
MX2016001220A (es) | 2016-05-24 |
EP3027641A1 (en) | 2016-06-08 |
CA2918233A1 (en) | 2015-02-05 |
HK1225744A1 (zh) | 2017-09-15 |
CN105658662A (zh) | 2016-06-08 |
BR112016001730B1 (pt) | 2023-04-11 |
RU2016103329A (ru) | 2017-08-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2663136C2 (ru) | Способ получения высокочистого нейротоксического компонента ботулотоксина и его применения | |
US8895713B2 (en) | Clostridial neurotoxins with altered persistency | |
Dubin et al. | Bacterial proteases in disease–role in intracellular survival, evasion of coagulation/fibrinolysis innate defenses, toxicoses and viral infections | |
CN111050850A (zh) | 用于用表达lekti的重组微生物治疗内瑟顿综合征的组合物和方法 | |
Tang et al. | Properties of PASP: a Pseudomonas protease capable of mediating corneal erosions | |
US10499655B2 (en) | Reagents and methods for inhibiting or disrupting biofilm | |
US9662372B2 (en) | Compositions and methods to inactivate and/or reduce production of microbial toxins | |
DE69534186T2 (de) | Impfstoff gegen Streptokokkeninfektionen der Gruppe A | |
Stahl et al. | Primary cultures of embryonic chicken neurons for sensitive cell-based assay of botulinum neurotoxin: implications for therapeutic discovery | |
KR20070024718A (ko) | 용균효소의 여드름 치료 약물으로의 활용 및 상기 치료에사용되는 약물 | |
US20140369990A1 (en) | Targeted antimicrobials and related compositions, methods and systems | |
RU2340371C1 (ru) | Субстанция для дерматологических лекарственных средств на основе коллагеназы микробного происхождения "ультрализин" | |
WO2018081282A1 (en) | Neurotoxins and uses thereof | |
Ali | The Influence of Streptococcus pneumoniae Serine Proteases on Pneumococcal Pathogenesis | |
WO2024145577A2 (en) | Selective inhibitors of c. acnes hyaluronidases | |
WO2024145574A2 (en) | Vaccines targeting c. acnes hyaluronidase for prophylaxis and treatment of acne vulgaris | |
US20130085267A1 (en) | Stabilization of Therapeutic Agents to Facilitate Administration | |
Adler et al. | 16Mechanism of Action of Botulinum Neurotoxin and Overview of Medical Countermeasures for Intoxication | |
Massimi | SspB cysteine protease of Staphylococcus aureus promotes detachment of human keratinocytes and degrades fibronectin and vitronectin | |
Mansy | Microbiological and Molecular Studies on Microorganisms Related to Acne Vulgaris in Some Egyptian Hospitals |