KR20160036581A

KR20160036581A - 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분의 제조 방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20160036581A
Application number: KR1020167004505A
Authority: KR
Inventors: 미하엘 페일; 안드레아스 비젠부르크
Original assignee: 메르츠 파마 게엠베하 운트 코. 카가아
Priority date: 2013-07-30
Filing date: 2014-07-30
Publication date: 2016-04-04
Also published as: RU2663136C2; IL243573A0; CN105658662A; EP3027641A1; MX2016001220A; RU2016103329A; WO2015014487A1; KR102272580B1; BR112016001730B1; US20180147266A1; IL243573B; JP2016527257A; CA2918233A1; US9937245B2; BR112016001730A2; CA2918233C; HK1225744A1; CN105658662B; AU2014298922A1; JP6517800B2

Abstract

본 발명은, 클로스트리듐 보툴리눔 (Clostridium botulinum)을 보툴리눔 독소의 생산을 허용하는 조건 하에 배양하는 단계 및 상기 보툴리눔 독소로부터 신경독성 성분을 분리하는 단계에 의해, 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분을 제조하는 방법에 관한 것이다. 아울러, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분과 이의 용도에 관한 것이다.

Description

보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분의 제조 방법 및 이의 용도 {PROCESS FOR PREPARING A HIGHLY PURE NEUROTOXIC COMPONENT OF A BOTULINUM TOXIN AND USES THEREOF}

본 발명은 보툴리눔 독소의 생산을 허용하는 조건 하에 클로스트리듐 보툴리눔 (Clostridium botulinum)을 배양하는 단계 및 보툴리눔 독소로부터 신경독성 성분을 분리하는 단계에 의해 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분 및 이의 용도에 관한 것이다.

보툴리눔 독소는 인간에게 가장 강력한 단백질 독소이다. 이것은 신경근 접합부에서 아세틸콜린의 분비를 차단하는 작용을 하여, 근육의 탈신경화 (denervation)를 발생시킨다. 또한, 보툴리눔 독소는 다른 말초 콜린성 신경 말단에서 활성을 나타내는데, 예를 들어 타액 분비 또는 발한 감소를 유발하며, 얼굴의 선과 주름 완화를 유도한다. 이의 작용 방식의 특이성으로 인해, 보툴리눔 독소의 임상적인 활용 범위는 계속 커지고 있으며, 보툴리눔 독소는 오늘날 약제-화장품으로 널리 사용되고 있다.

보툴리눔 독소는 지정된 클로스티리듐 spp.에서 보툴리눔 독소 분자 ("신경독성 성분")와 조합된 무독성 세균 단백질을 포함하는 거대 복합체 형태 ("복합 단백질"이라고도 함)로 합성 및 분비된다. 이 복합 단백질은 여러가지 무독성 혈구응집소 (HA: hemagglutinin) 단백질 및 무독성 비-혈구응집소 (NTNH) 단백질을 포함한다. 독소 복합체의 분자량은 7가지로 구분되는 보툴리눔 독소 혈청형들 (A, B, C, D, E, F 및 G)에서 약 300 kDa - 약 900 kDa로 다양하다. 복합 단백질은 신경독소 성분에 안정성을 부여한다. 분리 및 정제된 형태인, 즉, 복합 클로스트리듐의 단백질이 모듀 제거된 신경독성 성분은, 독소 복합체와는 달리, 산에 불안정하며, 위장관내 공격적인 환경을 견디지 못한다.

신경독성 성분은, 공지된 보툴리눔 독소 혈청형 7종 모두, 약 150 kDa의 분자량을 가진 비활성 단쇄 전구체 (비-절단된 폴리펩타이드)로서 합성된다. 이 단쇄 전구체는 단백질분해에 의한 절단으로 활성화되어, 이황화 결합된 2쇄 단백질이 된다. 50 kDa 경쇄는 촉매 도메인을 함유하는 반면, 100 kDa 중쇄는 내부 전위 도메인과 수용체 결합 도메인을 함유한다. 100 kDa 중쇄는 시냅스 앞의 콜린성 신경 말단에 결합하여 독소가 세포로 내재화되는 것을 매개한다. 50 kDa 경쇄는 독성 작용을 담당하는데, 아연-엔도펩티다제로서 작용하여 막 융합을 담당하는 특정 단백질 (SNARE 복합체의 단백질)을 절단한다. 보툴리눔 독소는, 신경 세포내 막 융합 공정을 파괴함으로써, 아세틸콜린이 시냅스 간극 (synaptic cleft)으로 분비되지 않게 한다.

보툴리눔 독소 혈청형 A 복합체 (BoNT/A-complex)는 1989년에 미국에서 사시, 안검경련 및 기타 장애를 치료하기 위한 용도로 인간에 대해 최초로 승인받았다. 오늘날, 보툴리눔 독소 복합체의 "A" 형태는 여러가지 소스로부터, 예를 들어 Allergan 사에서 상품명 Botox^®로, Ipsen 사에서 상품명 Dysport^®로, 그리고 Galderma 사에서 상품명 Azzalure^®로 상업적으로 구입가능하다.

그러나, 상당수의 사례들에서, 환자들은 BoNT/A-복합체를 반복 주사받으면 그에 반응하여 중화 항체를 합성하였다. 이러한 효과는 BoNT/A-복합체의 복합 단백질과 연관이 있는 것으로 생각되었다. 중화 항체가 합성된 환자는 소위 "2차 비-반응자"가 되며, BoNT/A-복합체를 이용한 치료가 더 이상 효과를 발휘하지 못한다. 이러한 항체-유도성 치료의 실패 위험성은 치료받은 개체들 중 10% 내지 20% 이상에서 나타나는 것으로 확인되었다. 보툴리눔 독소 복합체의 사용과 관련된 또 다른 문제는 타겟 근육으로의 주사 후 국소 또는 전신성 확산이다. 예를 들어, 단일-섬유 근전도 검사 (SF-EMG: single-fibre electromyography)를 이용한 연구들에서 주사 부위로부터 멀리 떨어져 있는 근육에서 지터 (jitter) 증가가 나타났다.

이러한 문제들은 순수한 신경독성 성분을 투여한 경우에는 관찰되지 않는다. 특히, 순수한 신경독성 성분을 투여하면, 무반응 또는 반응 저하의 위험성이 감소되는데, 이는 장기간 치료 중인 환자에게 특히 중요하다. 순수한 신경독성 성분과 관련된 또 다른 이점으로는 신속한 효과 개시와 우수한 온도 안정성이 있으며, 심지어 저온 유통 및 냉각 장치내 저장 필요성이 불필요해진다. A 타입의 신경독성 성분만 함유하고 어떠한 복합 단백질도 함유하지 않은 제형은 Merz 사로부터 상품명 Xeomin^® 및 Boconture^®으로 상업적으로 입수가능하다.

신경독성 성분은, 보툴리눔 독소를 생산하는 클로스트리듐 균주를 배양하고, 생산된 보툴리눔 독소 복합체로부터 일련의 석출 (precipitation) 및 크로마토그래피 공정을 통해 신경독성 성분을 분리함으로써, 제조할 수 있다. 천연 클로스트리듐 균주를 사용하는 경우, 보툴리눔 독소는 클로스트리듐 박테리아에서 활성형의 급성 독성 형태로 생산 및 방출된다. 따라서, 보툴리눔 독소의 생산 및 독소 복합체로부터 신경독성 성분을 정제하는 과정에 관련된 사람들에 대해 건강상 유해한 문제를 방지하기 위해, 특별한 조처를 취해야 한다. 독성 에어로졸에 노출될 위험성을 낮추기 위해, WO 2006/133818 A1에서는, 예를 들어 작업자가 어떠한 독성 물질과 접촉되는 것을 방지하기 위해, 서라운딩 생산실 (surrounding production room) 보다는 저압으로 운영되는 격리소에서 보툴리눔 독소 생산을 수행할 것을 제시하였다.

WO 2006/133818 A1에 기술된 제조 공정은 적절한 조작 측면의 안정성을 보장하지만, 생산되는 신경독성 성분의 순도는 개선될 여지가 여전히 남아있다. 제약 산업에서, 고도의 화학적 및 미생물적 청결성이 결정적으로 중요하다. 따라서, 약물 개발자의 궁극적인 목적은 원하는 안전성과 효과를 확립하기 위해 가능한 높은 약물 순도를 달성하는 것이다.

이에, 본 발명의 과제는 안전한 방식으로 보툴리눔 독소의 고순도의 신경독성 성분을 제조하는 개선된 방법을 제공하는 것이다.

제1 측면에서, 본 발명은 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분을 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은

(a) 클로스트리듐 보툴리눔 (Clostridium botulinum)을 보툴리눔 독소의 생산을 허용하는 조건 하에 배양하는 단계, 및

(b) 상기 보툴리눔 독소로부터 신경독성 성분을 분리하는 단계를 포함하며,

상기 배양 단계 (a)와 분리 단계 (b)는, 클로스트리듐 보툴리눔을 배양하기 위한 발효기를 구비한 제1 격리 유닛 (isolator unit)과, 선택적으로 제2의 또는 추가적인 격리 유닛뿐 아니라 재료를 생물 안전 캐비닛 (BSC: Biological Safety Cabinet)으로의 무균적인 입출입이 가능한 운송 시스템이 장착된 클래스 II BSC인 안전 작업대를 포함하는, 압력 구배 장치 (pressure gradient device)에서 이루어진다.

제1 격리 유닛과 제2 또는 추가적인 격리 유닛은 에어 락을 통해 외부 환경과 연결되는 생산실 안에 위치되는데, 이때 제1 및 제2 또는 추가적인 격리 유닛 내압은 생산실 내압 보다 낮으며, 생산실 내압은 주위 압력 (ambient pressure) 보다 낮으며, 에어 락의 내압은 주위 압력 보다 높다. 안전 작업대 역시 생산실 안에 위치된다.

다른 측면에서, 본 발명은 단쇄 함량이 2.00 wt.% 미만인 클로스트리듐 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 클로스트리듐 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분과 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본원에 기술된 클로스트리듐 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 근육 또는 외분비선의 과민성 콜린성 신경지배 (hyperactive cholinergic innervation)와 관련된 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 본원에 기술된 클로스트리듐 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예는 첨부된 종속항에 언급된다.

지금까지 고려되진 않았지만 보툴리눔 독소의 신경독성 성분의 품질, 특히 순도에 상당한 영향을 미칠 수 있는, 주요 생산 파라미터들이 존재한다는 것을 놀랍게 발견하게 되었다. 아울러, 본 발명의 생산 방법은 안전성, 건강 및 환경과 관련된 법적 요건들을 충족시키며, 안전하고 무해한 작업 환경을 조성한다. 다시 말해, 본 발명은, 환경과 인간의 건강 이슈와 관련된 안전성 뿐만 아니라 우수한 품질, 특히 순도가 우수한 보툴리눔 독소의 신경독성 성분을 제공하는 제조 공정의 추가적인 작동 방식들이 존재한다는, 예기치 못한 발견을 토대로 한다.

제1 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분을 제조하는 방법에 관한 것이다:

(b) 상기 보툴리눔 독소로부터 신경독성 성분을 분리하는 단계.

본원에서, "보툴리눔 독소" 또는 "보툴리눔 독소 복합체"와 같은 용어들은 상호 호환적이며, 클로스트리듐 spp.의 약 150 kDa의 신경독성 성분과 아울러 무독성 단백질을 포함하는 고분자량의 복합체를 지칭한다. 또한, "보툴리눔 독소" 및 "보툴리눔 독소 복합체"라는 용어는 7종의 독소 혈청형 전부 (즉, 혈청형 A, B, C, D, E, F 및 G)와 이의 서브타입 (예, A1, A2, C1, C2, 등)을 포괄하는 것으로 의도된다.

본원에서, "신경독성 성분"이라는 용어는 보툴리눔 독소 복합체에 함유된 보툴리눔 독소 단백질을 지칭한다 ("순수한 독소" 또는 "순수한 신경독소"라고도 함). 즉, 본 발명의 의미에서 "신경독성 성분"은 혈구응집소 및 비-혈구응집소 단백질 등의 클로스트리듐 보툴리눔의 임의의 조합된 비-독소 단백질과 조합되어 있지 않고 이것이 결여된 것을 의미한다. 바람직하게는, 이는 신경독성 성분과 잠재적으로 조합되는 RNA가 결여된 것이다.

아울러, 본 발명의 의미에서 "신경독성 성분"이, 신경독성 성분의 약 150 kDa의 단쇄 전구체 단백질과, 하나의 이황화 결합에 의해 일반적으로 연결된, 약 50 kDa의 경쇄 (LC)와 약 100 kDa의 중쇄 (HC)를 포함하는 단백질 분해된 2-쇄 형태를 포괄하는 것으로 교시된다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 가공되지 않은 전구체가 일부 생물학적 기능을 발휘할 수 있다고 생각할 수 있음에도 불구하고, 충분한 생물학적 활성은 단백질 분해에 의해 활성화된 후에만 달성됨을 알 것이다. "생물 기능"은 (a) 수용체 결합, (b) 내재화, (c) 엔도솜 막 (endosomal membrane)을 통해 세포질로의 전위, 및/또는 (d) 시냅스 소포 막 융합 (synaptic vesicle membrane fusion)에 관여하는 단백질의 엔도프로테오라이틱 절단 (endoproteolytic cleavage)을 지칭할 수 있다.

바람직하게는, 신경독성 성분은 혈청형 A, B, C, D, E, F 또는 G의 천연 보툴리눔 독소 복합체로부터 유래된다. 본 발명의 문맥에서 특히 바람직한 신경독성 성분은 클로스트리듐 보툴리눔 독소의 혈청형 A, 특히 Hall 균주 (ATCC 3502)에 의해 생성되는 클로스트리듐 보툴리눔 독소 타입 A로부터 유래된다. 그러나, 본 발명의 맥락에서, 신경독성 성분은 또한 키메라 (융합된) 신경독성 성분을 포함하여 재조합에 의해 생산되는 신경독성 성분일 수 있다. 또한, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 최대 20개의 아미노산 돌연변이를 가지는 유전자 변형된 신경독성 성분도 포함한다. 돌연변이는 치환, 삽입 또는 결손일 수 있다. 아울러, 화학적으로 변형된 아미노산, 예를 들어 당화, 아세틸화, 지질화 또는 변형된 아미노산 하나 이상을 가진 신경독성 성분 역시 "신경독성 성분"이라는 용어에 포함된다.

본 발명의 의미에서 "고순도 신경독성 성분"이라는 용어는, 다른 고형 성분들을 기본적으로 함유하지 않으며, 본원에 상세히 기술된 방법에 의해 제조될 수 있는, 정제된 신경독성 성분, 이의 조성물, 조제물 또는 제형을 지칭한다. 아울러, 본원에서, "고순도"라는 용도는 복합 단백질 (생산물-관련 불순물), 기타 클로스트리듐 단백질 (생산물과 무관한 불순물) 및 비-클로스트리듐 단백질이 결여된, 보툴리눔 독소의 신경독성 성분, 또는 이의 제형, 조제물 및 조성물을 지칭한다. 바람직하게는, "고순도"라는 용어는 총 순도가 99.90 wt.% 이상, 더 바람직하게는 99.95 wt.% 이상, 가장 바람직하게는 99.99 wt.% 이상인 것을 의미한다. "총 순도"는 본 발명의 고순도의 신경독성 성분 샘플의 총 중량을 기준으로, 신경독성 성분의 단쇄 및 2-쇄 형태들의 중량%를 의미한다. 본 발명에 따르면, 순도는 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)으로 분석된다.

단계 (a)에서, 보툴리눔 독소를 생산하기 위해, 클로스트리듐 보툴리눔은 2% 프로테오스 펩톤, 1% 효모 추출물, 1% 글루코스 및 0.05% 소듐 티오글리콜레이트를 함유한 배지 등의 적절한 발효 배지 중에 배양 (또는 발효)한다. 본원에서, 용어 "배양"은 용어 "발효"와 상호 호환적으로 사용된다. 용어 "클로스트리듐 보툴리눔"은 클로스트리듐 보툴리눔 타입 A, B, C, D, E, F 또는 G를 포괄하는 것으로 의도된다. 본 발명의 맥락에서, 타입 A의 보툴리눔 독소를 생산하는 클로스트리듐 보툴리눔 균주, 즉, 클로스트리듐 보툴리눔 타입 A가 바람직하게 사용된다. 클로스트리듐 보툴리눔 타입 A Hall 균주 (ATCC 3502) (이하 "Hall 균주"로 지칭됨)가 본원에서 사용하기 특히 바람직하다. 독소 복합체를 생산하기 위한 클로스트리듐 보툴리눔 배양 방법은 당해 기술 분야에 알려져 있다 (예, Schantz E. and Kautter D., J. Assoc. Off. Anal. Chem. 61:96-99, 1978을 참조함).

본 발명의 방법의 단계 (a)에서 발효 (배양) 온도는 구체적인 클로스트리듐 보툴리눔 균주와 사용되는 발효 조건에 따라 결정된다. 바람직하게는, 온도는 미리 결정된 좁은 온도 범위에서 일정하게 유지된다. 예를 들어, 클로스트리듐 보툴리눔 독소 타입 A를 특히 Hall 균주에서 생산하기 위한 경우, 발효 온도는 바람직하게는 33.5℃ ± 1.0℃, 더 바람직하게는 33.5℃ ± 0.5℃, 가장 바람직하게는 33.5℃ ± 0.2℃로 설정되어, 유지된다.

본 발명자들은, 약 33.5℃의 항온이 보툴리눔 독소 생산에 최적 온도임을, 발견하였다. 너무 높거나, 너무 낮거나 및/또는 변동성이 큰 온도는 클로스트리듐 보툴리눔이 부적절한 화합물이 생산하도록 야기할 것이다. 놀랍게도, 발효 온도를 전술한 온도 범위로 통제하지 않는다면, 신경독성 성분의 원치않은 비활성 단쇄 형태가 양적으로 현저하게 증가된다. 본 발명의 맥락에서, 신경독성 성분의 단쇄 형태는, 단백질 분해에 의해 가공되지 않고 기본적으로 비활성이기 때문에, 부적절한 "불순물"로서 간주됨을 강조한다.

본 발명에 따르면, 발효 온도는 바람직하게는 가열 자켓 (heating jacket)을 이용해 지정된 온도 범위로 설정 및 유지시킨다. 본원에서, "가열 자켓"은 넓은 표면 영역들, 전형적으로 발효기의 전체 측벽부를 둘러싸고 있는 물질로서, 가열할 수 있다. 예를 들어, 가열 자켓에는, 가열을 위한 열전 기저층 (thermoelectric base layer), 온도 소실을 방지하기 위한 단열층 및 가열 자켓을 발효 환경의 유해성으로부터 보호하기 위한 방수 외층과 같은, 발효에 필요한 온도 안정성을 제공하기 위해, 여러가지 층들이 구비될 수 있다. 가열 로드 (heating rod)를 이용하여 온도를 승온 및 유지시키는 것과는 대조적으로, 가열 로드의 사용은 본 발명의 방법의 사례에서 전형적인 것과 같이, 배양 배지를 교반시키지 않더라도, 배양 배지내 여러 곳들 간의 차별적인 가열을 방지함으로써, 균일한 온도 분포를 보장한다.

발효 시 클로스트리듐 배양물의 증식 (즉, 세포 밀도)은 바람직하게는, 온-라인 광학 프로브로 적정하게 모니터링할 수 있는, 배양물의 탁도에 의해 평가한다. 용어 "탁도"는 본원에서 샘플 전체에 빛이 직선으로 통과하지 않고 분산 및 흡수되는 광학 특성을 의미한다. 탁도는 시판 탁도계로 측정할 수 있다. 이러한 탁도계는 통상 입사 광에 직각으로 분산되는 광의 양을 유체 샘플에 존재하는 입자에 의해 측정한다. 본원에서는, 탁도계를 사용해, 입사 광빔에 대해 90°의 각도로 배양 배지에 존재하는 박테리아 세포에 의해 분산되는 광을 측정한다. 본원에서 배양물의 단위 부피 당 클로스트리듐 보툴리눔 세포의 수로서 정의되는, 세포 밀도를 측정하기 위해, 탁도계는 시판적으로 이용가능한 공인된 포르마진 탁도 표준물질 (즉, 정의된 입자 현탁물)로 보정한다. 탁도 측정값은 포르마진 탁도 단위 (FTU)로서 본원에서 표시된다.

본 발명의 맥락에서, 발효는 일반적으로 배양물의 세포 밀도가 세포 증식으로 인해 증가된 후 세포 용혈로 인해 감소될 때까지, 계속된다. 클로스트리듐 보툴리눔 타입 A, 특히 Hall 균주의 경우, 24시간 배양 후 세포 밀도는 바람직하게는 약 1.3 ± 0.3 FTU이다. 24시간 후 pH는 바람직하게는 약 5.7 ± 0.2이다. 클로스트리듐 보툴리눔 타입 A의, 특히 Hall 균주의 발효 종료시, 세포 밀도는 바람직하게는 0.8 FTU 이하이다. 발효 종료 시 pH는 통상 약 5.5 ± 0.3이다.

발효 시간은, 클로스트리듐 보툴리눔 타입 A, 특히 Hall 균주의 경우, 전형적으로 65 내지 80시간의 범위이며, 바람직하게는 대략 72시간, 예컨대 72시간 ± 4시간, 72시간 ± 2시간, 72시간 ± 1 시간 또는 72시간 ± 0.5시간이다. 배양 부피는 특별히 한정되지 않지만, 전형적으로 약 10 - 40 L의 범위이며, 바람직하게는 약 20 L이다. 클로스트리듐 보툴리눔 타입 A 균주, 특히 Hall 균주를 이용한 발효 후 보툴리눔 독소 복합체의 수율은, 통상 발효 종료 시 발효 배지 1 ml을 기준으로 3.5 ± 2.0 ㎍, 특히 3.5 ± 1.0 ㎍의 범위이다.

탁도 측정은, 발효 브로스내 세포 밀도를 측정하기 위해 당해 기술 분야에서 관례적으로 사용되는 투과광 측정과는 달리, 장치-특이적이지 않으며, 보다 정확하며, 특히 훨씬 우수한 재현성과 유사한 측정 결과를 제공해준다. 뜻밖에도, 탁도 측정에 의한 세포 밀도 평가는 매우 정확하고 반복가능할 뿐만 아니라 신경독성 성분의 단쇄 형태의 생성을 제한하도록 공정을 통제할 수 있다는 것이 확인되었다. 즉, 세포 증식을 모니터링하는데, 특히 발효 종료 시점을 결정하는데 탁도 측정을 사용하여, 최종 산물내 원치않은 단쇄 형태를 양적으로 줄일 수 있다. 현행 정제 방법으로는 활성형 (절단된) 2-쇄 형태로부터 비활성형 (비-절단된) 단쇄 형태를 분리할 수 없기 때문에, 이는 공정의 유의미한 개선이다.

본 발명에서, 단계 (a)의 클로스트리듐 보툴리눔 배양물은 바람직하게는 (i) 세포 밀도 530 - 850 FTU, 구체적으로 600 - 800 FTU, 보다 구체적으로 650 - 750 FTU인 클로스트리듐 보툴리눔 초기 배양물을 제공하는 단계 및 (ii) 상기 초기 배양물을 미리 정해진 양으로 배양 배지에 투입하는 단계에 의해 수득한다. 바람직하게는, 초기 배양물은 5.0% 내지 10.0 % v/v의 양으로, 바람직하게는 7.7% 내지 8.2 % v/v의 양으로 발효 배지에 투입한다. 초기 배양물은 혐기성 생균수가 적어도 5.0 x 10⁵ cfu/ml (colony-forming units/ml), 구체적으로 적어도 2.0 x 10⁶ cfu/ml, 더욱 구체적으로 1.0 x 10⁷ cfu/ml 이상, 가장 구체적으로 1.0 x 10⁷ cfu/ml - 1.0 x 10⁸ cfu/ml인 것이 바람직하다. 본 발명에서, 호기성 또는 혐기성 생균수는, 특히 Pharm. Eur. 2.6.12 및 USP <61>에 따라, 혈액 아가 플레이트 상에 초기 샘플의 일련의 희석물을 접종하여, 소정의 온도 (예로, 37℃)에서 소정의 시간 (예, 40시간 - 72시간) 동안 호기 또는 혐기 조건 하에 플레이트를 배양하고 배양된 콜로니를 계수함으로써, 결정한다.

초기 배양물은, 예를 들어, 종균용 배지에 클로스트리듐 보툴리눔을 접종하는 단계 및 적절한 증식 조건 (예로, 37℃)에서 박테리아를 증식시키는 단계를 포함하는 사전-배양물을 일차로 제조함으로써, 수득할 수 있다. 그런 후, 수득되는 사전-배양물의 분액을 배양 배지에 접종한 다음 적절한 증식 온도에서 박테리아를 증식시킨다. 다음으로, 수득되는 예비-초기 배양물의 분액을 사용해, 원하는 세포 밀도에 도달할 때까지 적절한 증식 온도에서 배양 배지에 접종하여 배양한다. 이후, 수득되는 초기 배양물의 분액을 본 발명의 방법의 단계 (a)에 사용되는 발효 배지의 접종한다.

본 발명에서 사용되는 클로스트리듐 보툴리눔 균주의 소스 (예, Hall 균주)는 WCB (working cell bank)의 냉동된 분액 형태로 편리하게 제공될 수 있다. WCB는 당해 기술 분야에 공지된 기법에 따라 해당 균주의 마스터 세포 은행 (MCB)으로부터 확립된다. WCB의 냉동된 분액은, 예를 들어, WCB 800 ㎕와 동해 방지제로서 멸균 글리세롤 200 ㎕이 담긴 냉동용기 (cryovial) 형태로 제공될 수 있다. 전형적으로, 클로스트리듐 보툴리눔, 특히 Hall 균주의 냉동된 분액의 혐기성 생균수는 적어도 5.0 x 10⁵ cfu/ml, 바람직하게는 1.0 x 10⁷ cfu/ml 이상이다. 냉동된 분액 (예, 냉동용기)은 냉각장치에서 -80℃에서, 또는 바람직하게는, 액체 질소의 기상에서 약 -130℃에서 보관할 수 있다.

본 발명의 방법의 단계 (b)에서, 신경독성 성분은 생산된 보툴리눔 독소 (복합체)로부터 분리된다. 클로스트리듐 보툴리눔에 의해 생산된 독소 복합체로부터 신경독성 성분을 정제하는 공정은 당해 기술 분야에 공지되어 있다 (예, DasGupta B.R. and Sathyamoorthy, V., Toxicon. 22:415-424, 1984; 및 WO 00/74703을 참조함). 정제 종료 시 정제된 신경독성 성분의 농도는 전형적으로 정제된 신경독성 성분의 최종 용액 1 ml을 기준으로 100 ㎍/ml - 500 ㎍/ml 범위이다.

본 발명에 사용하기에 적합한 분리 방법, 특히 Hall 균주 등의 클로스트리듐 보툴리눔 독소 타입 A의 신경독성 성분을 분리하는 방법은, 발효 종료시 (3N 황산을 첨가하여; 최종 pH는 약 3.5임) 보툴리눔 독소의 산 석출 단계를 포함한다. 이를 원심분리한 후, 석출물을 (예, 0.2 M 소듐 포스페이트 완충제, pH 6.0를 첨가하여) 추출하여, 독소 복합체를 용액으로 해리시킨다. 그런 후, 추출물에 대해 프로타민 설페이트 (예, 2% 프로타민 설페이트) 석출을 수행하여 상층물로부터 핵산을 석출시키고, 암모늄 설페이트 (예, 상층물 100 g 당 암모늄 설페이트 38 g을 첨가함으로써)를 이용해 상층물로부터 독소 복합체를 석출시킨다.

포스페이트 완충제 (예, 50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.0)로 가용화한 후, 다음과 같은 순서로 3번의 이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하여 독소를 추가로 정제한다: DEAE 세파로스 Fast Flow, Q 세파로스 Fast Flow 및 SP 세파로스 Fast Flow. 글리세롤을 첨가한 후, 최종 용출물을 0.22 ㎛ 필터와 같은 멸균 필터로 여과하여 최종 산물을 수득한다. 정제 후 이 최종 산물을 추가로 가공, 예를 들어 안정화 보조제 (예, 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 슈크로스)를 첨가하거나 및/또는 동결건조할 수 있다.

본 발명에서, 본 발명의 방법에서 배양 단계 (a)와 분리 단계 (b)는 압력 구배 장치에서 수행한다. 이 장치는 제1 격리 유닛과, 선택적으로 제2 또는 추가의 격리 유닛을 포함하며, 아울러 안전 작업대를 포함한다. 안전 작업대는 제1 격리 유닛 및/또는 제2 또는 추가의 격리 유닛에 물질, 특히 자동멸균 (예, 워킹 세포 은행)할 수 없는 열-민감성 물질을 무균적으로 부하 (loading)하는데 사용된다. 이를 위해, 이 물질은 추가로 후술된 바와 같이 안전 작업대에서 격리소 (들)로 특수 이송 시스템 (예, Getinge Group 사의 알파/베타-포트 시스템)을 이용해 이송시킬 수 있다. 이는, 오염 (미생물, 특히 불순물)이 적을 수록 보툴리눔 독소의 신경독성 성분의 순도가 높아지는 것으로 확인되었으므로, 본 발명의 중요한 측면이다.

본 발명에서, 안전 작업대는 물질을 BSC로 무균적인 입출입 이송이 가능한 이송 시스템이 구비된 클래스 II BSC이다. 본 발명의 의미에서 "생물 안전 캐비닛" 또는 "생물안전 캐비닛" 또는 "BSC"는, 실험 작업자와 주변 환경을 박테리아, 바이러스, 또는 임의의 그외 독성 또는 병원성 물질과 같은 유해 물질의 위험성으로부터 보호하고 작업 공간 안에서 물질의 무균성을 유지시키기 위한, 밀폐된, 환기되는 실험 작업 공간이다. 다시 말해, BSC는 실험을 주위 환경으로부터 보호하고, 주위 환경을 실험으로부터 보호한다. 본 발명의 맥락에서, 살균 단계 없이 열-민감성 물질을 격리소 1 또는 격리소 2로, 예를 들어 세포 은행으로 이송하는 것도 포함된다.

바람직하게는, 안전 작업대용으로 사용되는 BSC는 미국 질환 방제 및 예방 (CDC) 센터 (U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service; Centers for Disease Control and Prevention; National Institutes of Health. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Appendix A - Primary Containment for Biohazards: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. 5th Edition, HHS Publication No. (CDC) 21-1112, Revised December 2009)에서 분류하고, NSF/ANSI Standard 49-2007에 의해 정의되는 바와 같이 (NSF International (NSF); American National Standards Institute (ANSI). NSF/ANSI Standard 49-2007. Class II (laminar flow) biosafety cabinetry. Ann Arbor (MI); 2004), 클래스 II BSC, 더 바람직하게는 클래스 II, 타입 A1 또는 타입 A2 BSC, 가장 바람직하게는 클래스 II, 타입 A2 BSC이다. 안전 작업대는 전형적으로 생산실과 동일한 압력하에 운영된다.

BSC는 작업 챔버, 작업 챔버내 위에서 아랫쪽으로의 공기의 한방향 기류 이동을 제공하기 위한 공기 공급 수단, 및 한방향 기류의 공기를 방출시키기 위한 공기 방출 수단을 포함한다. 생물안전 캐비닛은 취급 중인 제품 위로 살균 공기 커튼을 드리움으로써 작동한다. 그런 후, 공기는 작업 표면 (예, 테이블 또는 벤치) 밑으로 흘러나가 다시 상향 이동한다. 공기는 일부 배기되며, 또 다른 일부는 작업 공간으로 다시 유입되어 살균 공기 커튼을 드리운다. 본 시스템에서 일부 지점에서는, 공기가 하나 이상의 필터, 통상 HEPA (high efficiency particulate air 유형) 필터를 통과하여, 배기 공기와 재순환 공기는 살균되고 입자 (particle)가 제거된다. 배기 공기는, 캐비닛 정면에서 유입된 다음 작업 표면의 아래로 흐르는 공기에 의해 보급되며, 작업 표면 아래 캐비닛 내부로부터 흘러나오는 재순환 공기와 합쳐진다. 전형적인 클래스 II, 타입 A1 BSC의 경우, 대략 30%의 공기가 배기 HEPA 필터를 통과하고, 약 70%가 공급 HEPA 필터를 통해 캐비닛의 작업 구역으로 다시 재순환된다. 클래스 II, 타입 A2 BSC는 A1 타입과 유사하지만, 최저 유입 속도가 전형적으로 약 100 ft/min 이상이다.

본 발명의 의미에서 "BSC"는 "클린 벤치 (clean bench)"가 아닌 것으로 이해되어야 한다. 본원에서, "클린 벤치"는 수평 층류형 "클린 벤치" 또는 수직 기류형 "클린 벤치"를 의미하며, 일반적으로 입자-프리 환경 (particle-free environment)이 필요한 공정을 위한 클래스 100 작업 영역을 제공하는 것에 불과하다. 보급 공기는 여과되며, 배기 공기는 여과되지 않는다. 반면, BSC의 경우, 보급 공기와 배기 공기 둘다, 여과되며, 예를 들어, HEPA-여과된다. 따라서, 클린 벤치는 제품에 대한 보호를 제공할 뿐이며, 클린 벤치에서 조작되는 물질에 작업자가 노출되는 것을 방지하지 못한다. 일반적으로, 클린 벤치는 독성, 돌연변이성 또는 발암성 물질, 생물 독소, 감염성 물질 (예, 박테리아, 바이러스, 기생동물 등)을 비롯한 임의의 잠재적으로 생물유해한 물질을 사용하는데에는 부적절하며, 일반적으로 작업에 무균 조건이 필요한 경우에는 유용하지 않다.

안전 작업대의 이송 시스템은, 바람직하게는, 서로 탈착가능하게 연결가능한 제1 이송 유닛과 제2 이송 유닛을 포함하며, 제1 이송 유닛은 BSC의 표면 위에 탑재된 밀봉가능한 파트로서, 통상적으로 BSC의 벽부에 고정되며, 제2 이송 유닛은 밀봉가능한 용기이다. 이 밀봉가능한 용기는 스테인레스 스틸, 폴리에틸렌 등과 같은 다양한 재료들로 만들어질 수 있다. 이것은 단단하거나 또는 가요성일 수 있으며, 예를 들어 백 (bag) 형태일 수 있으며, 1회용 용기 또는 재사용가능한 용기일 수 있다. 바람직하게는, 이송 시스템은 2개의 개별 유닛, 즉 알파 파트와 베타 파트로 구성된 DPTE^® 이송 시스템 (Getinge)으로, 이들 파트에는 도어, 락 및 실링 요소 (sealing function)가 각각 장착되어 있으며, 알파 또는 베타 컴포넌트의 내부에 수용된 멸균 또는 독성 환경의 완전성을 파기하지 않으면서 물질을 연속적으로 이송시킬 수 있다.

본 발명의 압력 구배 장치는 제1 격리 유닛과 선택적으로 제2 또는 추가의 격리 유닛을 더 포함한다. 제1 격리 유닛 및 제2 또는 추가의 격리 유닛은, 물질의 BSC 내부 및 외부로 무균적으로 이송시킬 수 있는 이송 시스템을 구비한, 클래스 II BSC이다. 일반적으로, 신경독소와의 접촉을 방지하기 위해 앞부분에 장갑이 부착되어 있다. 이송 시스템은, 예를 들어, 안전 작업대와 연결되어 있는 전술한 DPTE 시스템일 수 있다. 제1 격리 유닛은 클로스트리듐 보툴리눔의 배양 단계를 수행하는 발효기를 구비한다. 제1 및 제2 또는 추가의 격리 유닛은, 에어 락을 통해 외부 환경과 연결된 생산실 안에 위치하며, 격리 유닛(들), 생산실 및 에어 락 간에는 압력 구배가 형성된다.

구체적으로, 제1 및 제2 또는 추가의 격리 유닛의 내부 압력은 생산실 보다 낮으며, 예를 들어 생산실 보다 10 - 100 Pa, 바람직하게는 20 - 80 Pa, 더 바람직하게는 50 - 70 Pa, 가장 바람직하게는 60 Pa 낮다. 아울러, 생산실의 압력은 제1 및 제2 또는 추가의 격리 유닛의 압력 보다는 높지만, 여전히 주위 압력 보다 낮으며, 예를 들어 주위 압력 보다 5 - 50 Pa, 바람직하게는 10 - 30 Pa, 더 바람직하게는 12 - 18 Pa, 가장 바람직하게는 약 15 Pa 낮다.

에어 락내 압력은 주위 압력 보다 높으며, 예를 들어, 주위 압력 보다 10 - 100 Pa, 바람직하게는 20 - 80 Pa, 더 바람직하게는 25 - 35 Pa, 가장 바람직하게는 30 Pa 높다. 즉, 전형적으로 에어 락과 생산실 간의 압력 차이가 약 약 15 - 150 Pa, 바람직하게는 약 30 - 110 Pa, 더 바람직하게는 약 37 Pa - 53 Pa, 가장 바람직하게는 약 45 Pa로 존재한다. 용어 "주위 압력"은 주위 대기의 압력을 의미하며, 통상 약 1기압이며, 지리학적 위치 또는 기상 상태에 따라 달라질 수 있다.

제2 또는 추가의 격리 유닛은 제1 격리 유닛에 대한 전술한 바와 같이 BSC일 수 있다. 이것은 제1 격리 유닛과 동일하거나 또는 상이한 압력에서 운영될 수 있다. 아울러, 제1 격리 유닛은, 예를 들어, 잠글 수 있는 에어 락, 이중 트랩 용기 또는 포트 중 한가지 이상에 의해 제2 또는 추가의 격리 유닛과 연결되거나, 또는 연결되지 않을 수 있다. 본 발명에서, 배양 단계 (a)와 분리 단계 (b)는 제1 격리 유닛에서 수행될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 배양 단계와, 정제 단계 중 한가지 이상의 공정은 제1 격리 유닛에서 수행되는 반면, 나머지 정제 공정들은 제2 또는 추가의 격리 유닛에서 수행된다. 제1 격리 유닛은 고온에서, 예를 들어, 약 15℃ 내지 50℃ 또는 20℃ 내지 40℃에서 운영될 수 있으며, 제2 또는 추가의 격리 유닛은 저온, 에를 들어 약 -5℃ 내지 +25℃의 범위에서 운영될 수 있다. 본원의 맥락에서, 용어 "약"은 "대략" 또는 "거의"를 의미한다. 수치 값들과 관련된 문맥에서, 엄격한 수치 정의를 규정하는 것은 아니나, 이 용어는 지정된 값 또는 범위에서 +/- 10%인 값을 추정하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명의 생산실은 밀폐되며, 밀폐실은 음압 (negative pressure)에서 운영될 수 있다. 이곳은 하나 이상의 에어 락에 의해 외부로부터 접근할 수 있다. 생산실은 안전 작업대 뿐만 아니라 제1 격리소 및 선택적으로 제2 또는 추가의 격리소를 가진다. 생산실로의 공기의 유입 및 유출은 바람직하게는 필터, 특히 HEPA 필터를 통해 이루어진다. 생산실 안은, 예를 들어 19℃ 내지 26℃로 온도가 통제되며, 상대 습도가 예를 들어 40% - 60%, 특히 55%로 통제된다. 보툴리눔 독소의 제조에 필수적이거나 또는 이와 관련있는 측정 또는 검사 등의 특정 조작 또는 행위들은, 특히 에어로졸 형성과 관련없거나 또는 생물학적 활성 물질이 보툴리눔 독소 생산과 연관된 사람들에게 임의의 유해성을 가지지 않는 형태로 제시된다면, 격리 유닛 밖에서 수행될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 단쇄 함량이 2.00 wt.% 미만인 클로스트리듐 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분에 관한 것이다. 바람직하게는, 단쇄의 함량은 1.90 wt.% 미만, 1.80 wt.% 미만, 1.70 wt.% 미만, 1.60 wt.% 미만, 1.50 wt.% 미만, 1.40 wt.% 미만, 1.30 wt.% 미만, 1.20 wt.% 미만, 1.10 wt.% 미만, 1.00 wt.% 미만, 0.90 wt.% 미만 또는 0.80 wt.% 미만이다. 아울러, 본 발명의 고순도 신경독성 성분은 바람직하게는 총 순도가 적어도 99.90 wt.%, 더 바람직하게는 적어도 99.95 wt.%, 가장 바람직하게는 적어도 99.99 wt.%이며, 이때 용어 "총 순도"는 상기에서 정의되는 바와 같은 의미를 가진다. 또한, 본 발명의 클로스트리듐 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분은, 정제 후 최종 산물 ml 당, 즉, 전형적으로 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분이 100 ㎍/ml - 500 ㎍/ml 농도로 함유된 용액 1 ml 당, 내독소 함량이 5.0 IU 이하, 특히 1.0 IU 이하일 수 있다.

아울러, 본 발명의 클로스트리듐 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분은, 바람직하게는, 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분을 100 ㎍/ml - 500 ㎍/ml의 농도로 함유하는 용액 1 ml을 기준으로, 총 호기성 생균수가 1 cfu/ml 미만, 바람직하게는 0.5 cfu/ml 미만, 더 바람직하게는 0 cfu/ml이다.

또한, 본 발명의 클로스트리듐 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분은 LD₅₀ 분석에서 4.0 - 8.0 pg 단백질/LD₅₀ unit, 구체적으로 5.0 - 6.0 pg 단백질/LD₅₀ unit의 생물 활성 (상대적인 효능)을 가진다. 생물 활성을 평가하기 위해 본원에 사용되는 LD₅₀ 분석은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, Pearce L. B., Borodic G. E., First E. R., and MacCallum R. D., Measurement of botulinum toxin activity: evaluation of the lethality assay, Toxicol. Appl. Pharmacol. 128:69-77, 1994에 언급되어 있다. 생물 활성은 "unit" (U)으로 표시되며, 1 U은 복막내 주사 후 특정 마우스 개체군의 50%를 사멸시키는 독소 (즉, 신경독성 성분)의 양에 해당되는 것으로 정의된다.

전술한 클로스트리듐 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분은 본 발명에 따른 방법으로 수득할 수 있다. 이에, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 클로스트리듐 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분은 본 발명에 따른 방법을 통해 제조된다.

다른 측면에서, 본 발명은 클로스트리듐 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분과 한가지 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. "약학 조성물"은 활성 성분이 함유 또는 포함된 제형이다. 약학 조성물의 투약 형태는 구체적으로 한정되지 않으나, 바람직하게는, 주사 또는 주입용 수성 또는 비-수성 용액 또는 분산물과 같은, 비경구 제형이다. 본 발명의 약학 조성물은 동결건조 또는 진공 건조되거나, 재구성되거나 또는 용액 형태일 수 있다. 재구성되는 경우, 재구성된 용액은 멸균 생리 식염수 (즉, 0.9 wt.% NaCl)를 첨가함으로써 제조하는 것이 바람직하다.

약학 조성물은 일반적으로 본 발명의 신경독성 성분을 유효량으로서 포함하다. 본 발명에서, "유효량"이라는 용어는, 투여 후 질환의 증상 또는 병태를 일부 또는 완전히 제거하는 신경독성 성분의 양을 의미한다. 치료학적인 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 투약으로 투여할 수 있으며, 구체적인 제형 또는 투여 경로로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 유효량은 일반적으로 1 - 2000 U의 범위이다. 그러나, 5000 U 이하의 용량도 사용할 수 있다. 신경독성 성분을 고용량으로 개체에게 투여하는 경우, 2회 이상의 치료기로 치료제를 분할하는 것이 유익할 수 있다. 용어 "2회 이상의 치료기"는 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 치료기를 의미한다.

본 발명의 맥락에서, "담체"는 활성 성분이 투여되게 하는 희석제 또는 비히클을 지칭한다. 본원에 사용하기 적합한 담체로는 멸균 액체 또는 분산물, 특히 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition (2000)에 논의된 바와 같이 (근육내 또는 피하 주사에 의한) 비경구 투여에 적합한 것을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 물이거나, 또는 포스페이트 완충제, 포스페이트 완충화된 염수 (PBS) 또는 아세테이트 완충제와 같은 수성 pH 완충제이다. 본원에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한"은, 적절한 의학적 판단 범주내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 및 기타 문제성 합병증 없이 포유류, 특히 인간의 조직과 접촉하는데 적합한 화합물 또는 물질을 지칭하는 것이다.

아울러, 본 발명의 약학 조성물은 부형제, 안정화제 및/또는 동해 방지제와 같은 부가적인 성분을 포함할 수 있다. 부형제는, 비제한적으로, 당 (단당류 또는 슈크로스와 같은 이당류), 염 (예, NaCl), 디터전트 (예, 비-이온성, 음이온성 또는 양이온성 계면활성제) 및 킬레이트제 (예, EDTA)를 포함할 수 있다. 안정화제의 예로는 단백질성 안정화제, 예를 들어 젤라틴 또는 알부민 (즉, HSA) 및 비-단백질성 안정화제, 예를 들어 히알루론산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌글리콜 및 이의 혼합물을 포함한다. 동해 방지제는 동결건조하는 동안 단백질 (즉, 신경독성 성분)을 안정시키는 효과를 발휘하며, 특히 알코올, 특히 이노시톨, 만니톨 또는 글리세롤과 같은 다가알코올을 포함한다. 또한, 약학 조성물은 본 발명의 신경독성 성분과 공동-투여되는 하나 이상의 부가적인 활성 성분을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물은 본원에 기술된 고순도 신경독성 성분, pH 완충제, 바람직하게는 포스페이트 완충제 또는 아세테이트 완충제 및 히알루론산 안정화제 또는 폴리비닐피롤리딘 안정화제 또는 폴리에틸렌글리콜 안정화제 또는 BSA 또는 HSA 안정화제를 포함한다. 아울러, 약학 조성물은 다가알코올 및/또는 디터전트를 포함할 수도 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 약제로서의 본 발명의 클로스트리듐 보툴리눔 독소의 신경독성 성분의 용도에 관한 것이다. 본원에서, "약제"는 질환을 치료하기 위한 클로스트리듐 보툴리눔 독소의 신경독성 성분을 포함하는 임의의 조성물을 지칭한다. 이러한 문맥에서, 용어 "질환"은 구체적인 질환으로 한정되지 않지만, 신체 기능, 시스템 또는 장기를 파괴하는 모든 장애 또는 병태를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 근육 또는 외분비선의 과민성 콜린성 신경지배와 관련된 질환 또는 병태를 치료하기 위한 본 발명의 클로스트리듐 보툴리눔 독소의 신경독성 성분의 용도에 관한 것이다. 본원에서, 용어 "치료"는 치료학적 치료 및 예방학적 치료 (예방) 뿐만 아니라 질환 또는 병태의 미용학적 처치도 포함한다. "본 발명의 의미에서 "치료"는 일반적으로 본 발명의 고순도의 클로스트리듐 보툴리눔 신경독성 성분을 유효량으로 근육 또는 외분비선의 과민성 콜린성 신경지배와 관련된 질환 또는 병태를 가진 개체에게 투여하는 단계를 수반한다.

본원에서, 용어 "개체"는 포유류, 바람직하게는 인간을 지칭한다. 개체는 보툴리눔 독소에 노출된 적 없거나 또는 보툴리눔 독소에 노출된 적이 있을 수 있다. 본 문맥에서 사용되는 용어 "유효량"은 약학 조성물과 관련하여 상기에 기술된 바와 동일한 의미를 가진다.

본원에서, 용어 "과민성 콜린성 신경지배"는, 이례적으로 다량의 아세틸콜린이 시냅스 간극으로 분비되는 것을 특징으로 하는, 시냅스에 관한 것이다. "이례적으로 다량"은, 예를 들어, 분비를 동일한 유형의 시냅스에서의 분비와 비교함으로써 알 수 있지만, 근 긴장이상증이 과민 상태 (hyperactive state)를 나타내는 것일 수 있는 과민 상태는 아닌, 기준 활성 대비 최대 25%, 최대 50% 또는 그 이상의 증가를 의미한다. "최대 25%"는 예를 들어 약 1% - 약 25%를 의미한다. 필요한 측정을 수행하기 위한 방법들은 당업계에 공지되어 있다.

근육 또는 외분비선의 과민성 콜린성 신경지배와 관련된 질환 또는 병태의 예들은 Dressler, D., Botulinum Toxin Therapy, Thieme, Stuttgart, New York, 2000에 상세히 기술되어 있으며, 비제한적으로, 근 긴장이상증 (예로, 두개 근긴장이상증, 자궁경부 근긴장이상증, 인두 근긴장이상증, 후두 근긴장이상증, 손발 근긴장이상증), 미용학적 용도 (예로, 눈가 주름, 주름 (frowning), 안면 비대칭, 턱근 함몰)(mentalis dimples)), 사시증, 외분비선 과민증 (예, 프로이 (Frey) 증후군, 악어의 눈물 증후군, 다한증), 비루 (rhinorrhea), 과다 침 분비증 (hypersalivation) (침 흘림 (drooling)), 강직성 병태 (spastic condition) 및 기타 질환을 포함한다.

근육 또는 외분비선의 과민성 콜린성 신경지배와 관련된 기타 질환으로는, 예를 들어, 입천장 간대성 근경련 (palatal myoclonus), 근육간대경련 (myoclonus), 근파동증 (myokymia), 강직, 양성 근육 경련 (benign muscle cramps), 유전성 턱 떨림 (hereditary chin trembling), 기이성 턱 근육 활성 (paradoxic jaw muscle activity), 반측 저작성 경련 (hemimasticatory spasm), 비대성 기관지 근병증 (hypertrophic branchial myopathy), 교근 비대증 (maseteric hypertrophy), 앞정강근 비대증 (tibialis anterior hypertrophy), 안진증 (nystagmus), 동요시 (oscillopsia), 핵상 안구운동마비 (supranuclear gaze palsy), 지속성 부분 발작 (epilepsia partialis continua), 경련성 사경 수술 계획 (planning of spasmodic torticollis operation), 성대 외전근 마비 (abductor vocal cord paralysis), 난치성 변성 발성장애 (recalcitant mutational dysphonia), 상부 식도 괄약근 기능부전 (upper oesophageal sphincter dysfunction), 성대 육아종 (vocal fold granuloma), 말더듬 (stuttering), 질 드라 투렛 증후군 (Gilles de Ia Tourette syndrome), 중이 간대성 근경련 (middle ear myoclonus), 보호성 후두 폐쇄 (protective larynx closure), 후두적출술후 발성 장애 (postlaryngectomy speech failure), 보호성 눈꺼풀 처짐 (protective ptosis), 눈꺼풀속말림 (entropion), Odii 괄약근 기능부전 (sphincter Odii dysfunction), 가성 식도이완 불능증 (pseudoachalasia), 비-식도이완 불능성 식도의 운동 장애 (nonachalsia oesophageal motor disorder), 질 경련 (vaginismus), 수술 후 고정 (postoperative immobilization), 진전증 (tremor), 방광 기능부전 (bladder dysfunction), 반측 안면 경련 (hemifacial spasm), 재신경지배 운동 장애 (reinnervation dyskinesias), 전신 근강직 증후군 (stiff person syndrome), 파상풍, 전립선 비대증 (prostate hyperplasia), 비만증 처치 (adipositas treatment), 유아성 뇌성마비 (infantile cerebral palsy), 이완불능증 (achalasia) 및 치열 (anal fissure)을 포함한다.

적합한 투여 경로로는, 비제한적으로, 비경구 투여, 특히 피하 및 근육내 주사를 포함한다. 투약 용법은 구체적으로 한정되지 않으며, 예를 들어, 2주마다, 매달, 2달에 한번, 3달에 한번, 6개월에 한번 또는 9개월에 한번, 1년에 한번 또는 1회 적용 투여 계획을 포함한다. 개체에게 투여되는 본 발명의 고순도 신경독성 성분의 치료학적인 유효량은, 적용 방식, 질환 또는 병태의 유형, 개체의 체중, 나이, 성별 및 건강 상태 등에 따라 결정된다. 투여는 필요에 따라 1회 또는 다회일 수 있다. 또한, 본 발명의 고순도 신경독성 성분은 다른 활성 성분과 공동-투여될 수도 있다.

이제 본 발명은 하기 비제한적인 실시예들을 들어 추가로 설명될 것이다.

실시예

아래 실시예들은, 본원에 기술된 압력 구배 장치의 사용은 무균성 작업 구역을 구축시킬 수 있으며 부유 입자의 수가 매우 적다는 것을 입증해준다. 이는, 전체 제품의 품질, 특히 신경독성 성분의 순도 측면에서 상당한 영향력이 있는 것으로, 놀랍게도 확인되었다.

실시예 1

안전 작업대의 구축

DPTE^® 이송 시스템 (Getinge Group)의 "알파" 파트를, HEPA 필터가 장착된 HERAsafe^® (NSF) 클래스 II, 타입 A2 생물 안전 캐비닛 (Thermo Fisher Scientific, Inc.)의 우측 측벽부 상에 장착하였다. 견고한 이송 용기 (스테인레스 스틸로 제조된 DPTE 190 베타 용기)는 이동가능한 DPTE^® "베타" 파트로서 사용하였다. DPTE^® 이송 시스템의 2개의 분리된 유닛, 즉, 알파 파트와 베타 파트에는 각각 도어, 락 및 실링 기능이 설치되어 있으며, 알파 또는 베타 컴포넌트 내부에 담긴 살균 또는 독성 환경의 온전성을 파기하지 않으면서 독성 또는 병원성 물질의 연속적인 이송을 가능하게 한다.

후술된 모든 실험들에서, 이러한 안전 작업대를 사용하였으며, (생산실에 비해 중립적인 압력 (neutral pressure)에서 운영되는) 생산실에 위치시켰다. 생산실은 19℃ 내지 26℃의 온도와 주위 압력 대비 -15 Pa의 압력으로 운영하였다. 생산실에는, 생산실 내부 압력에 대비 -60 Pa 압력에서 운영되는 2개의 격리소 (격리소 1: 발효; 격리소 2: 정제)가 추가로 존재하였다. 생산실은 퍼스널 에어 락과 머터리얼 에어 락 (material air lock)에 의해 환경과 연결되어 있었다.

실시예 2

본 발명에 따른 격리 유닛에서의 미생물 청결성 (microbial purity)

본 실험의 목표는 본 발명의 방법을 이용한 클로스트리듐 보툴리눔의 배양이 무균 조건 하에 수행되는 지를 확인하기 위한 것이었다. 따라서, 모든 배양 절차들은 3번의 연속적인 운영을 통해 미생물 없이 시뮬레이션하였다. 모든 배양 배지와 첨가제들은 무균 검사용 매질 (호기성 또는 혐기성 프로세스 조건용 TSB- 및 티오글리콜레이트 매질)로 치환하였다.

미생물 오염이 없음을 입증하기 위해, 여러가지 프로세스 단계들로부터 취한 샘플들을 14일 이상, 21일을 넘지 않는 기간 동안 20℃ 내지 35℃에서 하기와 같이 배양하였다: 20℃ 내지 25℃에서 7일 이상 배양한 후, 즉시 30℃ 내지 35℃에서 7일 이상 배양함.

표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 서로 다른 배양 공정들에서 미생물 오염은 검출할 수 없었다. 이는, 본 발명에서 사용된 격리소가 - 생산실 보다 낮은 압력에서 운영되어 잠재적인 불순물의 유입이 발생될 수 있음에도 불구하고 - 무균성 공정의 통제가 가능함을 입증해준다.

표 1. 격리 유닛에서의 미생물 오염

발효 프로세스 공정	실험 1 (호기성)	실험 2 (호기성)	실험 3 (혐기성)
	미생물 오염
전배양	없음	없음	없음
1차 배양물 1	없음	없음	없음
글루코스 용액	없음	없음	없음
1차 배양물 2	없음	없음	없음
발효 배양물 96 h	없음	없음	없음
발효 배양물 120 h	없음	없음	없음

아울러, 공기 중 미생물의 수를 격리 유닛 1내 3곳의 측정 지점 (MP18, MP19 및 MP20으로 표시됨)에 측정하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 공기 중 미생물은 3곳의 측정 지점에서는 검출할 수 없었다. 반면, 생산실에서 공기 중 미생물의 평균 수는 2010년에 측정시 3 cfu/m³으로 확인되었다.

표 2. 격리 유닛내 공기 중 미생물의 수

Lot.	격리 유닛에서의 측정 지점
	MP18	MP19	MP20	MP18	MP19	MP20
	공기 중 미생물 [cfu/m³]
MP050807	0		0		0
	0		0		0
MP050908	0		0		0
	0		0		0
MP051009	0		0		0
	0		0		0
MP061201	0		0		0
	0		0		0
MP071007	0		0		0
	0		0		0
MP090201	0		0		0
	0		0		0
MP091002	0		0		0
	0		0		0
MP110504	0		0		0
	0		0		0

따라서, 본 발명의 방법에 채택된 바와 같이 격리 유닛의 사용은 미생물 오염와 공기 중 미생물이 없는 작업 구역을 구축할 수 있다.

실시예 3

격리 유닛의 입자 함량

미생물 오염과 공기 중 미생물의 수 외에도, 제품의 품질을 결정하는 다른 주요 인자는 미립자 불순물의 농도이다. 이는 (공기 중) 입자로부터 소정의 제품을 보호하는 것이 매우 중요한 제약 산업에서 매우 의미가 있는 일이다. 따라서, 본 발명에서 사용된 격리 유닛의 서로 다른 작업 구역내 공기 중 입자의 수를 측정하였다. 입자 측정은 스위스의 CAS Clean-Air-Service AG 사로부터 상업적으로 구입가능한 입자 계수기를 이용해 수행하였다. 그 결과는 아래 표 3에 나타낸다.

표 3. 공기 중 입자 수

Lot No.	입자 ≥ 0.5 ㎛ [ft^-3]			입자 ≥ 5.0 ㎛ [ft^-3]
	격리 유닛내 측정 지점
	MP18	MP19	MP20	MP18	MP19	MP20
MP050807	5	5	8	0	0	0
MP050807	3	15	18	1	1	1
MP050908	5	2	7	3	1	2
MP050908	7	13	1	3	4	0
MP051009	0	5	1	0	1	0
MP051009	10	6	3	1	2	0
MP061201	1	2	3	0	0	1
MP061201	5	6	5	1	1	1
MP071007	1	0	0	0	0	0
MP071007	2	14	3	1	0	2
MP090201	0	5	0	0	3	0
MP090201	3	6	7	0	0	1
MP091002	0	0	0	0	0	0
MP091002	0	11	3	0	2	1
MP110504	2	1	2	0	0	0
MP110504	3	1	1	2	0	0

그 결과는, 본 발명에서 사용한 격리 유닛에는 기본적으로 측정한 3곳 모두에서 직경 ≥ 0.5 ㎛인 입자가 극소수개만 존재하고, ≥ 5.0 ㎛ 직경의 입자는 본질적으로 없다는 것을 보여준다. 반면, 2010년에 측정한 바에 따르면, 생산실의 평균 입자 수는 직경 ≥ 0.5 ㎛인 입자가 434개/ft³이고, 직경 ≥ 5.0 ㎛인 입자가 22개/ft³인 것으로 확인되었다. 이는 주변 생산실과 비교해 본 발명의 격리 유닛이 미립자 청결성이 매우 높다는 것을 입증해준다.

실시예 4

생화학적 청결성 측면에서 제품의 품질

본 발명의 격리소를 사용한 경우와 사용하지 않은 경우에 Hall 균주 (ATCC 3502)에 의해 생산된 클로스트리듐 보툴리눔 독소 타입 A로부터 정제된 서로 다른 lot 번호의 신경독성 성분들의 총 순도와 단쇄 함량을 측정하였다.

배양 배지 10 ml에 클로스트리듐 타입 A Hall 균주 (ATCC 3502)의 워킹 세포 은행의 분액을 접종하여, 총 10 ml의 사전-배양물을 수득하였다. 사전-배양물의 일부를 사용해, 배지 50 ml에 접종하여, 초기 배양물 1을 수득하였다. 그런 후, 초기 배양물 1의 분액을 배지 1600 ml에 접종하여, 초기 배양물 2를 수득하였다. 발효 배양의 배지 (17.4 L)를 발효기에서 인 시추 살균하였다. 살균된 글루코스 용액 1 L를 첨가한 후, 발효 배양물에 초기 배양물 2 1600 ml을 접종하였다. 발효는 72시간 33.5℃에서 수행하였다.

정제는 본원에 전술된 바와 같이 수행하였다. "총 순도"는 정제된 신경독성 성분의 샘플의 총 중량에 대한 신경독성 물질의 단쇄와 2-쇄 형태들의 중량%로서 정의된다. 수득한 결과들은 아래 표 4에 나타낸다.

표 4. 클로스트리듐 보툴리눔 독소 타입 A의 신경독성 성분의 총 순도

격리 유닛을 사용하지 않고 제조		격리 유닛을 사용하여 제조
Lot No.	총 순도 [%]	Lot. No.	총 순도 [%]
A 29-02	98.8	MP050403	100.0
A 30-02	97.0	MP050606	100.0
A 31-02	97.6	MP050807	100.0
평균값	97.8	MP050908	99.0
		MP051009	100.0
		MP101003	100.0
		MP110101	100.0
		MP110302	100.0
		평균값	99.9

표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 신경독성 성분의 총 순도는 99.9 wt.로 높다. 비교해보면, 본 발명의 격리소 기법을 사용하지 않고 제조한 총 순도는 불과 97.8 wt.%이다. 다시 말해, 본 발명에 따라 제조된 신경독성 성분은 기본적으로 (단쇄 또는 2-쇄 형태) 신경독성 성분으로만 구성되는 반면, 본 발명의 격리소 기법을 사용하지 않고 제조한 신경독성 성분은 2.2 wt.%의 상당한 오염 수준을 가진다.

표 4의 lot들에 대해 신경독성 성분의 단쇄 형태의 함량을 추가로 평가하였다. SDS-PAGE와 광도 측정 평가를 이용해 단쇄 함량을 결정하였다. 단쇄 함량은 비-절단형 단쇄 형태가 특히 비활성이며 따라서 본 발명의 의미에서 "불순물"이기 때문에, 특히 중요한 파라미터이다. 아울러, 이것은 크로마토그래피를 통해 활성형 2-쇄 형태로부터 분리시킬 수 없다. 그 결과는 표 5에 나타낸다.

표 5. 신경독성 성분의 단쇄 형태의 함량

격리 유닛을 사용하지 않고 제조		격리 유닛을 사용하여 제조
Lot No.	단쇄 함량 [wt.%]	Lot. No.	단쇄 함량 [wt.%]
A 29-02	1.8	MP050403	0.4
A 30-02	1.9	MP050606	0.8
A 31-02	1.4	MP050807	2.0
평균값	1.7	MP050908	1.3
		MP051009	1.1
		MP101003	1.6
		MP110101	1.3
		MP110302	1.2
		평균값	1.2

그 결과, 예상치못하게도, 본 발명의 방법은 평균 단쇄 함량이 1.2 wt.%로, 비교 lot에서 수득되는 1.7 wt.%와 비교되는 것으로 나타났다.

실시예 5

미생물 순도 측면에서 제품의 품질

제품의 미생물 순도 (바이오버든 (bioburden))를 본 발명에 따라 제조한 lot의 여러 공정 단계들에서 Pharm. Eur. 2.6.12 및 USP <61>에 따라 호기성 미생물의 바이오버든을 본 발명에 사용된 격리 기법을 사용하지 않고 제조된 lot와 비교하여 측정함으로써, 평가하였다. 그 결과는 표 6, 7 및 8에 나타낸다.

표 6. 초기 공정 단계 "투석 1일 후"의 호기성 미생물의 바이오버든

격리 유닛을 사용하지 않고 제조		격리 유닛을 사용하여 제조
Lot No.	총 호기성 균수 [cfu/ml]	Lot. No.	총 호기성 균수 [cfu/ml]
A 29-02	220	MP050807	< 10
A 30-02	440	MP050908	< 10
A 31-02	980	MP051009	< 10
평균값	547	MP101003	< 5
		MP110101	< 5
		MP110302	< 5
		평균값	< 8

표 7. 후기 공정 단계 "SP-Pool"의 호기성 미생물의 바이오버든

격리 유닛을 사용하지 않고 제조		격리 유닛을 사용하여 제조
Lot No.	총 호기성 균수 [cfu/ml]	Lot. No.	총 호기성 균수 [cfu/ml]
A 29-02	28	MP050807	< 10
A 30-02	52	MP050908	< 10
A 31-02	34	MP051009	< 10
평균값	38	MP101003	< 5
		MP110101	< 5
		MP110302	< 5
		평균값	< 8

표 8. 정제 공정 완료 후 최종 제품의 호기성 미생물의 바이오버든

격리 유닛을 사용하지 않고 제조		격리 유닛을 사용하여 제조
Lot No.	총 호기성 균수 [cfu/ml]¹	Lot No.	총 호기성 균수 [cfu/ml]¹
A 29-02	< 2	MP101003	0
A 30-02	< 2	MP110101	0
A 31-02	< 2	MP110302	0
평균값	< 2	평균값	0

¹ = 최종 제품 1 ml 당 (고순도의 신경독성 성분 100-500 ㎍/ml이 함유된 용액)

표 6, 7 및 8에 제시된 결과들은, 본 발명에 따른 방법의 초기 공정 단계 (투석 1일 후)의 바이오버든이 <8이며, 따라서 본 발명의 격리 유닛을 사용하지 않고 수득한 평균값 547 보다 훨씬 낮다는 것을 보여준다. 이는, 최종 제품에 호기성 (박테리아) 생균이 없다는 것을 보증해준다.

실시예 6

내독소 오염과 관련된 제품의 품질

본 발명에 따라 제조된 lot의 내독소 수준을 Pharm. Eur. 2.6.14 및 USP <85>에 따라 측정하였으며, 본 발명의 격리 기법을 사용하지 않고 제조한 lot에서 측정된 수준과 비교하였다. 측정된 내독소 값은 최종 제품 (고순도의 신경독성 성분 100-500 ㎍/ml이 함유된 용액) ml 당 IU로 나타낸다. 그 결과는 표 9에 나타낸다.

표 9. 최종 제품의 내독소 수준 (Endotoxin load)

격리 유닛을 사용하지 않고 제조		격리 유닛을 사용하여 제조
Lot No.	내독소 농도 [IU/ml]	Lot. No.	내독소 농도 [IU/ml]
A 29-02	< 2.0	MP050403	< 1.0
A 30-02	< 1.5	MP050606	< 0.8
A 31-02	< 1.5	MP050807	< 0.8
평균값	< 1.7	MP050908	< 0.8
		MP051009	< 0.8
		MP101003	< 0.8
		MP110101	< 0.8
		MP110302	< 0.8
		평균값	< 0.8

표 9에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 lot의 내독소 농도는 비교용 lot의 수준 보다 현저하게 낮다. 본 발명의 신경독성 성분에서 확인된 내독소 평균 농도 < 0.8 IU/ml은 보툴리눔 독소를 함유한 약제 제품에서 허용가능한 내독소 수준이다.

전술한 결과들은, 본 발명의 방법이 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분을 제조할 수 있으며, 동시에 직무상 건강과 안전성에 대한 규정을 충족함을 보여준다.

Claims

보툴리눔 독소 (botulinum toxin)의 고순도 신경독성 성분의 제조 방법으로서,
(a) 클로스트리듐 보툴리눔 (Clostridium botulinum)을 보툴리눔 독소의 생산을 허용하는 조건 하에 배양하는 단계, 및
(b) 상기 보툴리눔 독소로부터 신경독성 성분을 분리하는 단계를 포함하며,
상기 배양 단계 (a)와 분리 단계 (b)는, 클로스트리듐 보툴리눔을 배양하기 위한 발효기를 구비한 제1 격리 유닛 (isolator unit)과, 선택적으로 제2의 또는 추가적인 격리 유닛를 포함하는, 압력 구배 장치 (pressure gradient device)에서 수행되며,
상기 제1 격리 유닛 및 상기 제2 또는 추가의 격리 유닛은 에어 락 (air lock)을 통해 외부 환경과 연결되는 생산실 안에 위치하며,
상기 제1 격리 유닛 및 상기 제2 또는 추가의 격리 유닛내 압력은 상기 생산실내 압력 보다 낮고, 상기 생산실내 압력은 주위 압력 (ambient pressure) 보다 낮고, 상기 에어 락내 압력은 주위 압력 보다 높고,
상기 압력 구배 장치는, 물질의 BSC (생물 안전 캐비닛: Biological Safety Cabinet)로의 무균적인 입출입 수송을 허용하는 운송 시스템을 구비한 클래스 II BSC인, 안전 작업대 (safety work bench)를 더 포함하며, 상기 안전 작업대도 상기 생산실 안에 위치하는, 고순도 신경독성 성분의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양 온도가 33.5℃ ± 1.0℃의 온도에서 유지되는, 고순도 신경독성 성분의 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배양 단계 (a) 동안의 세포 밀도가 프라이머리 탁도 표준시약 (primary turbidity standard)으로서 포르마진을 이용한 탁도 측정에 의해 모니터링되는, 고순도 신경독성 성분의 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 클로스트리듐 보툴리눔의 배양이, 세포 밀도가 1.3 ± 0.3 FTU에서 24시간 배양 후 0.8 FTU 미만까지 감소할 때까지, 지속되는, 고순도 신경독성 성분의 제조 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 이용되는 클로스트리듐 보툴리눔의 배양물은 (i) 세포 밀도 530 - 850 FTU인 클로스트리듐 보툴리눔의 초기 배양물을 제공하는 단계 및 (ii) 상기 초기 배양물을 사전 결정된 양으로 발효 배지에 첨가하는 단계에 의해 수득되는, 고순도 신경독성 성분의 제조 방법.
제5항에 있어서, 상기 초기 배양물이 상기 발효 배지에 5.0% 내지 10.0 % v/v의 양으로 첨가되는, 고순도 신경독성 성분의 제조 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서,
상기 클래스 II BSC의 이송 시스템이 서로 탈착가능하게 연결가능한 제1 이송 유닛과 제2 이송 유닛을 포함하며,
상기 제1 이송 유닛은 상기 BSC의 표면 상에 탑재되거나 또는 상기 BSC의 벽부에 고정되는 밀봉가능한 파트이며,
상기 제2 이송 유닛은 밀봉가능한 용기인, 고순도 신경독성 성분의 제조 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서, 상기 클로스트리듐 보툴리눔은 Hall 균주 (ATCC 3502)를 포함하는 클로스트리듐 보툴리눔 타입 A인, 고순도 신경독성 성분의 제조 방법.
단쇄 함량 (single-chain content)이 2.00 wt.% 미만인 클로스트리듐 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분.
제9항에 있어서, 추가적으로 총 순도가 99.90 wt.% 이상인, 고순도 신경독성 성분.
제9항 또는 제10항에 있어서, 추가적으로 내독소 함량 (endotoxin content)이 5.0 IU/ml 미만이거나, 및/또는 총 혐기성 생균수가 1 cfu/ml 미만인, 고순도 신경독성 성분.
제9항 내지 제11항 중 어느 한항에 있어서, 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 따른 방법에 의해 수득가능한, 고순도 신경독성 성분.
제9항 내지 제11항 중 어느 한항에 따른 클로스트리듐 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분과 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
약제로 사용하기 위한, 제9항 내지 제12항 중 어느 한항에 따른 클로스트리듐 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분.
근육 또는 외분비선의 과민성 콜린성 신경지배 (hyperactive cholinergic innervation)와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는데 사용하기 위한, 제9항 내지 제12항 중 어느 한항에 따른 클로스트리듐 보툴리눔 독소의 고순도 신경독성 성분.