MX2011001823A - Neurotoxinas clostridiales con persistencia alterada. - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona con un polipéptido que comprende: (a) un dominio HC o un fragmento del mismo del componente neurotóxico de una toxina clostridial; y (b) un primer dominio LC o un fragmento del mismo del componente neurotóxico de una toxina clostridial; y (c) por lo menos un dominio LC adicional o un fragmento del mismo del componente neurotóxico de una toxina clostridial en donde el primer y por lo menos un dominio LC adicional pueden ser iguales o diferentes entre sí y en donde cada uno de los fragmentos del primero y de por lo menos un dominio LC adicional aún muestra actividad proteolítica.

Description

- - NEUROTOXINAS CLOSTRIDIALES CON PERSISTENCIA ALTERADA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con neurotoxinas clostridiales, por ejemplo neurotoxinas botulihicas que están alteradas con respecto a su estructura proteínica en comparación con neurotoxinas naturales correspondientes. La diferencia en la estructura proteínica resulta, por ejemplo, en un período dé actividad desplazada en tiempo, por ejemplo una actividad prolongada o persistencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La quimiodesnervación se refiere al uso de un agente para evitar que un nervio estimule su tejido objetivo, por ejemplo un músculo, una glándula u otro nervio. La quimiodesnervación se realiza, por ejemplo, con fenol, alcohol etílico o toxina botulínica. La quimiodesnervación es apropiada, por ejemplo, en pacientes con espasticida localizada en uno o dos músculos grandes o en varios músculos pequeños. Se puede utilizar para aliviar síntomas tales como espasmos musculares y dolor e hiperreflexia .

Los agentes quimiodesnervantes bloquean la transmisión neuromuscular en la unión neuromuscular, provocando parálisis o paresis de los músculos esqueléticos afectados. El término "paresis" se define en lo siguiente como una condición tipificada por pérdida parcial de movimiento o movimiento deteriorado. Esto se lleva a cabo ya sea al actuar presinápticamente vía la inhibición de síntesis o liberación de acetilcolina (ACh) o actuando postsinápticamente en el receptor de acetilcolina. Los ejemplos de medicamentos que actúan presinápticamente son toxina botulínica, tetrodotoxina y toxina tetánica.

El término "quimiodesnervación" también abarca todos los efectos los cuales son inducidos directa o indirectamente por el agente quimiodesnervante y por lo tanto también comprenden efectos previos, posteriores o a largo plazo del agente quimiodesnervante. Por lo tanto, los efectos presinápticos también son abarcados también como efectos postsinápticos, efectos tisulares y/o efectos indirectos vía neuronas espinales o aferentes.

Un agente quimiodesnervante, la toxina botulínica, aunque es uno de los compuestos más tóxicos conocidos hasta ahora, en el pasado se ha utilizado para el tratamiento de una gran cantidad de condiciones y trastornos, algunos de los cuales se describen, por ejemplo, en el documento PCT/EP 2007/005754. Además, las formas comerciales de toxina botulínica tipo A basado en el complejo de proteína de toxina A botulínica están disponibles bajo el nombre comercial BotoxMR (Allergan Inc.) y bajo el nombre comercial Dysport (Ipsen Ltd.), respectivamente. Una composición farmacéutica basada en una preparación de toxina purificada superior y que comprende el componente neurotóxico de tipo A de toxina botulinica libre de proteina que formen complejos en forma aislada está disponible comercialmente en Alemania de Merz Pharmaceuticals GmbH bajo el nombre comercial XeominMR.

La bacteria grampositiva anaeróbica Clostridium botulinum produce una neurotoxina polipeptidica potente, toxina botulinica la cual provoca enfermedad neuroparalitica en humanos y animales a la que se le denomina como botulismo. Las esporas de Clostridium botulinum se encuentran en el suelo y pueden crecer en recipientes de alimentos esterilizados inapropiadamente y sellados o en latas elaboradas en casa las cuales son la causa de muchos casos de botulismo. La toxina A botulinica (BoNT/A) es el agente biológico natural más mortífero conocido por el hombre. En ratones la LD50 es de aproximadamente 50 picogramos de toxina botulinica (complejo de neurotoxina purificada) serotipo A. No obstante, pese a sus efectos tóxicos, el complejo de toxina botulinica así como la neurotoxina pura se han utilizado como un agente terapéutico en una gran cantidad de enfermedades .

Las toxinas botulínicas son liberadas de cultivos de Clostridium Usados generalmente en forma de una proteina responsable de las propiedades tóxicas de la toxina botulinica (el componente neurotóxico) en asociación con otras proteínas bacterianas (las "proteínas que forman complejos" no tóxicas o "proteínas clostridiales" ) , las cuales juntas forman un complejo de toxina también denominado "complejo de toxina botulinica". El complejo de toxina botulinica es de naturaleza metastable dado que su estabilidad parece depender de diversos factores tales como, por ejemplo, concentración de sal y/o pH. El peso molecular del complejo puede variar de aproximadamente 300,000 hasta aproximadamente 900,000 Da, es decir, de 300 kDa a aproximadamente 900 kDa. Las proteínas que forman complejos son, por ejemplo, diversas hemaglutininas . Las proteínas de este complejo de toxina en sí mismas no son tóxicas pero se considera que proporcionan estabilidad al componente neurotóxico y son las responsables de la toxicidad oral en intoxicaciones con Botulinum. Existen siete serotipos antigénicamente distintos de toxina botulinica, específicamente las toxinas botulínicas A, B, Cl, D, E, F y G. Siempre que se mencionen las toxinas botulínicas serotipo A, B, Cl, D, E, F o G, también se conocen variantes de los serotipos y están abarcados, como los serotipos Al, A2, A3, A4 , etc.

El componente de las toxinas clostridiales responsables de su alta toxicidad es el componente neurotóxico de la proteina (peso molecular * 150 kD, el peso molecular exacto depende del serotipo) . Los diferentes serotipos diversos difieren de su secuencia de aminoácidos pero poseen todos una estructura similar: una cadena ligera (LC) de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada (HC) de aproximadamente 100 kDa, en la cual puede estar enlazada por uno o más enlaces disulfuro (para una revisión véase, por ejemplo, Simpson LL, Ann Rev Pharmacol Toxicol. 2004; 44:161-93). El componente neurotóxico del complejo de toxina botulinica inicialmente se forma como una cadena polipeptidica única. En el caso del serotipo A, por ejemplo, el procesamiento proteolitico de los polipéptidos resulta en un polipéptido activado en forma de un polipéptido de dos cadenas que consiste de una cadena pesada y una cadena ligera, las cuales están enlazadas por un enlace disulfuro. En los humanos, la cadena pesada media la unión a terminales nerviosas colinérgicas presinápticas e internalización de la toxina en la célula. Se considera que la cadena ligera es la responsable de los efectos tóxicos, actuando como proteínas zinc, endopeptidasa y separadoras responsables de la fusión de membrana (complejo SNARE) (véase, por ejemplo, ontecucco C, Shiavo G., Rosetto O: The mechanism of action of tetanus and Botulinum neurotoxins. Arch Toxicol. 1996; 18 (Suppl.): 342-354)).

El término "toxina botulinica", como se utiliza en la presente solicitud, se refiere al componente neurotóxico carente de cualquier otra proteina clostridial, pero también al "complejo de toxina botulinica". El término "toxina botulinica" se utiliza en la presente en casos cuando no es necesario ni se desea diferenciación entre el complejo de toxina y el componente neurotóxico. Los términos "BoNT" o "NT" se utilizan comúnmente como abreviaturas para neurotoxina botulinica o neurotoxina, respectivamente. La subunidad neurotóxica del complejo de toxina botulinica se denomina en este documento como el "componente neurotóxico" o el "componente neurotóxico libre de proteínas formadoras de complejo". La producción del componente neurotóxico de toxina botulinica tipo A y B se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 00/74703.

Los diversos serotipos difieren en su duración de efecto terapéutico. El período de actividad normal de medicamentos de toxina A botulinica es, en inyecciones intramusculares en humanos, entre 3 y 4 meses. En casos particulares el período incluso se puede extender a más de 12 meses. Durante el tratamiento de las glándulas sebáseas se ha informado en una actividad incluso de 27 meses (Bushara K. , botulinum toxin and rhinorrhea, Otolaryngol. Head. Neck, Surg., 1996; 11 (3): 507 y The Laryngoscope 109: 1344 1346:1999). El período de actividad del tipo Cl de toxina botulinica es comparable con el período de actividad de la toxina A botulinica (Eleopra et al., 1997 & 2002). Sorprendentemente, el período de acción es mucho más corto en roedores (por ejemplo ratones) en comparación con humanos: Aproximadamente 1-2 meses para la toxina 'A botulinica, 21 días para la toxina B botulinica y sólo 4 días para la toxina E botulinica (DePaiva et al., 1999, Juradinski et al., 2001).

Foran et al. analizaron en 2003 el tiempo de período de acción in vitro de neuronas de cerebelo de ratas y encontraron semividas de la inhibición de exocitosis de glutamato para la toxina A botulinica de más de 31 días; para la toxina botulinica tipo Cl de más de 25 días; para la toxina botulinica tipo B es de aproximadamente 10 días; para la toxina botulinica tipo F de aproximadamente 2 días y para la toxina botulinica tipo E de sólo 0.8 días.

El período de tiempo de actividad de la toxina botulinica tipo A durante, por ejemplo el tratamiento de distonias (por ejemplo torticolis, blefaroespasmos ) en humanos es de entre 3 a 4 meses. Después de este período, el paciente debe recibir otra inyección de un medicamento que comprenda toxina botulinica. Sería una gran- ventaja para el paciente prolongar el tiempo de período de acción de la neurotoxina. Al hacerlo de esta manera se reduciría - - el número de inyecciones necesarias al año, asi como la cantidad total de proteínas clostridiales . Esto nuevamente reduciría el riesgo de producción de anticuerpos contra la proteína extraña. Por lo tanto, sería deseable el suministro de una toxina botulínica con persistencia prolongada .

No obstante, no siempre se desea la paralización a largo plazo. Por ejemplo, en ciertos tratamientos cosméticos algunas veces sólo se requieren "ajustes finos" temporales. Para obtener una reducción de persistencia el médico está limitado por los métodos de la técnica anterior para una reducción de volumen o cambiando el serotipo. Estas técnicas han demostrado que generan resultados poco satisfactorios y requieren de un conocimiento profundo tanto de la cinética de actividad como de la antigenicidad de los diferentes serotipos de neurotoxina. Por lo tanto, el suministro de una neurotoxina con un ajuste de persistencia "interconstruido" sería una mejora notable.

Los documentos de E.U.A. 2003/0219462, EP1849801 y WO 02/08268 describen toxinas botulínicas modificadas con motivos basados en leucina o tirosina agregados a la neurotoxina nativa.

La idea de estas alteraciones se basa en la observación de que ciertos motivos basados en leucina o tirosina permite la localización de la cadena ligera del - - componente neurotóxico de ciertos subtipos hacia la membrana interna de la célula objetivo. Se ha establecido la hipótesis de que este mecanismo cambia la persistencia de algunas cadenas ligeras. No obstante, hasta ahora los autores no han proporcionado prueba alguna de tal efecto y los experimentos más recientes sugieren que toda la hipótesis es inexacta.

Además, incluso si en ciertos casos una adición de motivos puede generar una localización en membrana, tal enfoque no es aplicable a modificaciones de toxina A botulinica. Esto es debido a que la cadena ligera nativa de la toxina botulinica tipo A está localizada de antemano en la membrana celular interna, y por lo tanto, un amarre adicional a la membrana no proporciona beneficio adicional alguno .

Por lo tanto, la presente invención sigue una trayectoria diferente. Dado que se ha encontrado, como se describe en esta solicitud, la adición de una segunda cadena ligera a la neurotoxina, aún posee su actividad proteolitica, genera una alteración en el tiempo de periodo de actividad. Dependiendo de la combinación de los serotipos utilizados, se puede prolongar el periodo de tiempo lo que permite la producción de neurotoxinas ajustadas adecuadamente. Se considera proporcionar al médico con una gama de neurotoxinas cuyo serotipo es independiente de su persistencia lo que permite un tratamiento más estandarizado.

DESCRIPCION BREVE DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con neurotoxinas clostridiales, en una modalidad toxinas botulinicas con actividad aumentada o prolongada, es decir, con persistencia. Asi, en un primer aspecto, la presente solicitud se relaciona con un polipéptido que comprende: (a) un dominio HC o un fragmento del mismo del componente neurotoxico de una toxina clostridial; y (b) un primer dominio LC o un fragmento del mismo del componente neurotoxico de una toxina clostridial; y (c) por lo menos un dominio LC adicional o fragmento del mismo del componente neurotoxico de una toxina clostridial en donde el primero y por lo menos un dominio LC adicional puede ser igual o diferente entre si, y en donde cada uno de los fragmentos del primero y por lo menos un dominio LC adicional aún presenta actividad proteolitica .

En una modalidad, las unidades y/o dominios están conectados vía un enlace, un enlazante peptidico, un enlazante químico, un enlace disulfuro o vía una combinación de dos o más de los mismos.

En una modalidad, la secuencia de aminoácidos del dominio LC y/o HC es por lo menos 50% idéntica a la secuencia de aminoácidos de un componente neurotóxico de toxina botulinica de serotipo A, B, C, D, E, F o G.

En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del dominio LC y/o HC es por lo menos 50% idéntico a la secuencia de aminoácidos de la toxina del tétanos (tétano espasmina) .

En una modalidad, el primero y/o el segundo dominio LC y/o el dominio HC comprende por lo menos una modificación.

En una modalidad, la modificación es una mutación; en otra modalidad, una supresión; en otra modalidad adicional, una inserción; en otra modalidad, una adición; o en otra modalidad adicional, un intercambio de aminoácidos; o en una modalidad adicional, una combinación de dos o más de los anteriores.

En una modalidad, la invención se relaciona con un polipéptido en donde el dominio que se une a gangleósido y/o el dominio que une a receptor de proteina de la neurotoxina se modifica de manera que incrementa la capacidad de unión en comparación con la neurotoxina natural de la cual se deriva el dominio HC.

En una modalidad, el polipéptido es uno que se selecciona del grupo que consiste de: LCBoNT/A-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/C-LCBoNT/A-HCBoNT/A, - - LCBoNT/B-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/A-LCBoNT/C-HCBoNT/C, LCBoNT/C-LCBoNT/C-HCBoNT/C, LCBoNT/B-LCBoNT/C-HCBoNT/C y LCTeNT-LCBoNT/A-HCBoNT/A .

En otra modalidad adicional la modificación es una modificación química mientras que la modificación química se puede seleccionar del grupo que comprende una fosforilación, una pegilación, una glucosilación, una fosforilación, una sulfatación, una metilación, una acetilación, una lipidación, una hidroxilación, una amidación o, en una modalidad adicional, una combinación de dos o más de las mismas. En una modalidad adicional, la lipidación puede ser una miristoilación, palmitoilación, isoprenilación o enlace de glucosil-fosfatidilinositol o en una modalidad adicional una combinación de dos o más de los mismos .

La invención también describe un anticuerpo específico para cualquiera de los polipéptidos mencionados en lo anterior.

La invención también describe un ácido nucleico que codifica para cualquiera de los polipéptidos mencionados en lo anterior. La invención describe además un vector que comprende al ácido nucleico o fragmentos del mismo. También se describe en la presente una célula hospedadora que comprende al ácido nucleico o al vector.

La invención también describe un método para producir un polipéptido que comprende las etapas de cultivar la célula hospedadora como se menciona en lo anterior, producir y purificar el polipéptido codificado por el ácido nucleico o vector y opcionalmente formular el polipéptido en una composición farmacéutica.

La invención además describe una composición que comprende el polipéptido mencionado antes o el polipéptido que se puede obtener por el método mencionado antes. La invención también describe la composición que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad la composición comprende además un amortiguador de pH, un excipiente, un crioprotector, un conservador, un analgésico, un estabilizante o cualquier combinación de los mismos. En una modalidad, la composición se proporciona como un liofilizado. En otra modalidad, la composición se proporciona como una solución.

La invención también describe las composiciones para uso en un tratamiento terapéutico.

La invención también describe el uso de las composiciones para la elaboración de un medicamento para tratamiento terapéutico.

En una modalidad el tratamiento terapéutico comprende tratamiento de distonia focal, espasticidad o una condición la cual puede ser tratada al suprimir la secreción .

La invención también describe el uso de la composición para tratamiento cosmético. Dentro del tratamiento cosmético con la cual puede ser adecuado que en particular los mamíferos sean tratados quienes padecen fisiológicamente de condiciones, por ejemplo, arrugas o glabela en línea del ceño fruncida, ' que debe ser tratada.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con: Un polipéptido que comprende: (a) un dominio HC del componente neurotóxico o fragmento del mismo de una toxina clostridial; y (b) un primer dominio LC o un fragmento del mismo, y (c) por lo menos un dominio LC adicional o fragmento del mismo, en donde el primero y segundo dominios LC pueden ser iguales o diferentes entre sí.

En particular, la invención se relaciona con un polipéptido que comprende: (a) un dominio HC o fragmento del mismo del componente neurotóxico de una toxina clostridial; y (b) un primer dominio LC o un fragmento del mismo del componente neurotóxico de una toxina clostridial; y (c) por lo menos un dominio LC adicional o fragmento del mismo del componente neurotóxico de una toxina clostridial en donde el primero y por lo menos un dominio LC adicional pueden ser iguales o diferentes entre si en donde cada uno de los fragmentos del primero y por lo menos un dominio LC adicional aún presenta actividad proteolitica .

Sorprendentemente, se ha encontrado que la adición de una o más (adicionales) cadenas ligeras (LC) a un polipéptido que comprende por lo menos una cadena pesada (HC) y por lo menos una cadena ligera (LC) del componente neurotóxico de neurotoxinas clostridiales, como se define en lo anterior, resulta en un polipéptido con persistencia aumentada, es decir, prolongada, de la actividad de toxina en comparación con la toxina natural.

Sin unirse a teoría alguna, se establece la hipótesis de que, después de unión a la superficie celular, ambas cadenas ligeras son desplazadas al interior de la célula, incrementado la concentración de proteínas activas proteolíticas en la célula, por lo que ambas incrementan la actividad así como la persistencia de la neurotoxina.

Es decir, si se desea una persistencia prolongada del polipéptido de la invención, los expertos en la técnica se les instruye para utilizar ciertas combinaciones de dominios HC y LC, por ejemplo, dominios LC derivados de serotipos con persistencia grande. En otras modalidades se obtiene una persistencia más corta al combinar algunos - - dominos o fragmentos LC diferentes, por ejemplo, los derivados de serotipos con persistencia más corta.

El término "persistencia", como se utiliza en la presente, describe el tiempo de periodo de reacción de un componente neurotóxico. En general este es el periodo de tiempo hasta que el agente activo muestra sólo la mitad de su actividad comparada con su actividad inicial. Por lo tanto, el término "persistencia" se puede utilizar de manera sinónima al término "semivida de actividad" o al término "semivida de estabilidad metabólica" los cuales definen el punto en el tiempo en donde sólo la mitad de la concentración de proteina inicial está activa debido a procesos metabólicos, es decir, la semivida hasta que la proteina es metabolizada . Dado que la semivida de una proteina se relaciona con la duración del efecto terapéutico, el término "persistencia" también abarca indirectamente el tiempo de duracción de interferencia o influencia causal por un componente neurotóxico con una función celular.

Las personas expertas en el ámbito conocen diversos análisis para determinar persistencia. De acuerdo con las enseñanzas de la presente invención se puede determinar persistencia con un análisis que se lleva a cabo en un ratón (Keller JE., 2006, Neuroscience . 139(2) :629-37). Este análisis muestra la relación de persistencia con la actividad de movimiento. De manera alternativa, la persistencia se puede determinar con un análisis de separación SNAP-25 el cual muestra la relación de la actividad proteolitica con la persistencia. El efecto de una persistencia aumentada se satisface si se puede determinar un incremento en la persistencia en uno de los análisis descritos antes, en donde el análisis de separación SNAP-25 es el que se prefiere.

El término persistencia aumentada y persistencia prolongada se utilizan en la presente de modo intercambiable .

Para determinar el impacto de una cadena LC adicional o un fragmento de cadena LC sobre el polipéptido de la invención con respecto a la persistencia, el polipéptido de la invención se compara . con un polipéptido correspondiente que carece de la cadena LC adicional (extra) . Este puede ser, por ejemplo, un polipéptido de la invención a partir de la cual se ha suprimido la cadena LC adicional. Cualquiera de los análisis de persistencia conocidos por los expertos en el ámbito se puede utilizar para determinar persistencia. En una modalidad, la persistencia se determina como se describe en la presente en lo anterior o en los ejemplos que ilustran la invención.

En otra modalidad se considera la prolongación de la persistencia de los serotipos de neurotoxina de acción corta. Por ejemplo, la persistencia del serotipo E se puede prolongar al agregar cadenas ligeras de serotipos activos más grandes como por ejemplo serotipo A, por lo que se genera una neurotoxina con una persistencia similar que la toxina A botulinica natural. Dado que la mayor parte de los epitopos antigénicos de la neurotoxiha están situados en la subunidad de cadena pesada, esta modificación se puede utilizar para aplicar una neurotoxina a pacientes los cuales han desarrollado una respuesta inmunitaria contra cierto serotipo. De esta manera, se combina la ventaja de proporcionar un serotipo diferente y mantener el tiempo de periodo de actividad previo.

Como se indica en lo anterior, los términos "dominio HC" y "dominio LC" se refieren a la cadena pesada y cadena ligera, respectivamente del componente neurotóxico de la neurotoxina ya sea de origen natural o recombinante . Además, en algunas modalidades, los dominios HC y/o LC se derivan de serotipos diferentes y/o toxinas diferentes. Dentro de esta definición también se abarcan fragmentos de la cadena ligera y la cadena pesada. El dominio HC y LC puede subdividirse adicionalmente en subdominios.

El término "dominio o fragmento LC adicional" del mismo, como se utiliza en la presente, se refiere a uno o más, por ejemplo un segundo dominio LC. De acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, el polipéptido de la invención puede contener dominios LC adicionales o fragmentos de los mismos. Por ejemplo, el polipéptido de la invención puede comprender el dominio HC del componente neurotóxico de una toxina clostridial y un primer dominio LC o un fragmento del mismo y un segundo dominio LC o un fragmento del mismo y un tercer dominio LC o fragmento del mismo.

En una modalidad, el fragmento del primero y del dominio LC adicional muestra la actividad proteolitica de LC natural.

Para obtener el efecto de persistencia aumentada no se necesita ni se desea un motivo adicional basado en leucina o tirosina (como se describe en el documento de E.U.A. 2003/0219462, EP1849801 y WO 02/08268). Por lo tanto, en una modalidad, la cadena ligera adicional no posee ninguno de tales motivos.

En una modalidad, la neurotoxina modificada no contiene un motivo basado én leucina que comprenda siete aminoácidos, en donde los primeros cinco aminoácidos a partir de la sección amino terminal del motivo basado en leucina forman un "quintento de aminoácidos" y los siguientes dos aminoácidos forman un "doblete de aminoácidos" y en donde el quinteto de aminoácidos comprende por lo menos un aminoácido que se selecciona del grupo que consiste de glutamato de aspartato; y el doblete de aminoácidos comprende por lo menos un aminoácido de un grupo que consiste de isoleucina y leucina.

En otra modalidad, la neurotoxina modificada no contiene, ninguna de las secuencias FEFYKLL, EEKRAIL, EEKMAIL, SERDVLL, VDTQVLL, AEVQALL, SDKQNLL, SDRQNLI, ADTQVLM, SDKQTLL, SQIKRLL, ADTQALL y NEQSPLL .

El término "el mismo que" utilizado en la presente se refiere a un dominio LC con una secuencia de aminoácidos idéntica, es decir, con una identidad en la secuencia de aminoácidos de 100%. Por lo tanto, por ejemplo, un segundo dominio LC, como se utiliza en la presente, el cual es "el mismo" significa que es idéntico en la secuencia de aminoácidos al primer dominio LC. Por otra parte, un segundo dominio LC el cual es "diferente" se refiere a un segundo dominio LC el cual tiene una identidad de secuencias de menos de 100%, es decir, por ejemplo 99.95% o menos en comparación con el primer dominio LC. Un "domino LC diferente" es un dominio LC de un serotipo diferente o un dominio LC con una secuencia de aminoácidos que es diferente del primer dominio LC, por ejemplo uno con una sustitución de aminoácidos. Otro ejemplo de un dominio LC diferente es un dominio LC con un corte en la parte N o C terminal o con una supresión interna. Otro ejemplo adicional de un dominio LC diferente es un dominio LC con una modificación química. Un "domino LC diferente" por lo tanto se puede derivar de un serotipo igual o diferente, respectivamente, en comparación con el primer dominio LC. Lo anterior también se aplica a un "tercer" o cualquier otro dominio LC adicional.

En una modalidad, los serotipos de todos los dominios HC y LC son de toxina botulinica tipo A, en otra modalidad, la segunda cadena ligera es el serotipo Cl. No obstante, es claro para una persona experta en el ámbito que todas las combinaciones posibles de serotipos A, B,. Cl, D, E, F y G están cubiertas por esta solicitud y las personas expertas en el ámbito serán capaces de seleccionar una combinación apropiada en base en la persistencia publicada de los diferentes serotipos. Ni la combinación de serotipos ni el número de cadenas pesadas y ligeras está limitado en esta invención. Por lo tanto, en otra modalidad, las proteínas de fusión más grandes, es decir, proteina de fusión con más de tres subunidades también están consideradas, por ejemplo, proteína-concatémeros que comprenden tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez dominios LC.

Los dominios HC y LC de por ejemplo la neurotoxina A de C. botulinum comprende subdominios diferentes. El dominio HC, por ejemplo, comprende tres subdominios, es decir, un subdominio de translocación de 50 kDa amino terminal HCN con un subdominio HCN de 25 IcDa - - subsecuente y el subdominio HCCc de 25 kDa localizado en la parte carboxilo terminal. Tomados juntos, los dominios HCN- HCCN y HCcc se denominan como el dominio HC.

Los intervalos de aminoácidos respectivos de los dominios respectivos se muestran para diferentes serotipos BoNT/A y sus variaciones en la Tabla 1.

TABLA 1: NUMEROS DE ACCESO DE BASE DE DATOS DE LAS SECUENCIAS DE AMINOACIDOS DE NEUROTXINA A BOTULINICA SEROTIPOS 1-4 E INTERVALOS DE AMINOACIDOS DE LOS DOMINIOS RESPECTIVOS - - El término "fragmento del dominio LC", como se utiliza en la presente se refiere a un fragmento del dominio LC con actividad reológica. Como se utiliza en la presente, un fragmento con actividad biológica es un fragmento el cual (aún) muestra la actividad proteolitica preferiblemente de LC natural, es decir, el cual es capaz de separar un polipéptido del complejo SNARE tal como, por ejemplo, sintaxina, SNAP-25 o syn-aptobrevina . En consecuencia, la actividad biológica se puede probar, por ejemplo, por un análisis de proteasa SNAP-25, un análisis de LD50, un análisis HDA y similares. Por lo tanto, cualquier dominio LC, el cual muestra actividad proteolitica de más de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% y hasta 100% del dominio LC natural correspondiente en un análisis SNAP-25 se considera "biológicamente activo" o "muestra actividad proteolitica" dentro del alcance de esta invención.

Un análisis SNAP-25 adecuado es, por ejemplo, el "análisis de liberación de fluorescencia "GFP-SNAP-25" (WO/2006/020748) o el "inmunoanálisis de endopeptidasa SNAP25 mejorado" (Jones et al., Journal of Immunologica . Methods, Volume 329, Issues 1-2, 1 de enero del 2008, páginas 92-101) .

Un "fragmento del dominio HC", como se utiliza en la presente, se refiere a un fragmento de un dominio HC con actividad biológica, de manera más especifica, este es un fragmento el cual aún es capaz de unión al receptor de dominio HC nativo del cual se deriva. Además, el fragmento también es un fragmento capaz de translocación de un dominio LC unido al mismo.

Por lo tanto los fragmentos son, por ejemplo, polipéptidos de los cuales se han suprimido 1, 2, 3, 5 o hasta 10, 50 ó 100 aminoácidos. En donde la supresión puede ser un corte en la parte C o N terminal o una supresión interna .

En algunas modalidades, los dominios HC y/o LC son modificados adicionalmente, por ejemplo, por una mutación, una supresión, una inserción, una adición o un intercambio de aminoácido. En modalidades adicionales el HC y/o LC es adicionalmente modificado de manera química, por ejemplo, por una fosforilación, una pegilación, una glucosilación, una fosforilación, una sulfatación, una metilación, una acetilación, una lipidación - - (miristoilación, palmitoilación, isoprenilación, enlace de glucosil-fosfatidilinositol) , una hidroxilación, una amidación o cualquier otra modificación adecuada. Adicionalmente, el dominio que une gangleósido y/o el dominio de unión de la neurotoxina en una modalidad están modificados de manera que incrementan la capacidad de unión comparada con la neurotoxina natural de la cual se deriva el dominio HC. En algunas modalidades, el HC y/o LC comprende una secuencia etiqueta, es decir, otra secuencia de aminoácidos la cual permite un procedimiento de purificación simplificado.

El término "método de purificación" abarca todos los métodos conocidos en el ámbito para purificación de proteínas. Los ejemplos para métodos de purificación para neurotoxinas son las publicaciones de DasGupta y Sathyamoorthy y WO2000074703 los cuales se incorporan como referencia en la presente. Para una guía adicional de los métodos de purificación de proteína útiles para la purificación de componentes neurotóxicos recombinantes, se hace referencia a los documentos de Walker et al., 2002; Harris et al. 1989 y Scopes et al., 1994, los cuales se mencionan en la sección "literatura" siguiente.

El término "producción del polipéptido" abarca todas las etapas necesarias para la producción del polipéptido, es decir, por ejemplo creación de ácido nucleico codificante, incorporación del ácido nucleico en un vector, expresión del polipéptido in vitro y/o una célula hospedadora, modificaciones del polipéptido in vivo y/o in vitro, purificación del polipéptido y/o producción de una composición que contiene el polipéptido. De esta manera, el término "expresión" o "expresión de gen" se define en la presente como el procedimiento por el cual la información heredable en un gen, tal como la secuencia de ADN, se elabora en un producto de gen funcional, tal como proteina o ARN.

En una modalidad se considera incorporarlo en el polipéptido de la presente invención, los sitios de unión de receptor adicionales para proporcionar una neurotoxina la cual posee, además de una persistencia aumentada, características adicionales que permiten aplicaciones nuevas, por ejemplo una neurotoxina con sitios de unión específicos de célula adecuados, por ejemplo, para el tratamiento de alergias o dolor (WO 2007/13839) . De manera alternativa, el sitio de unión nativo localizado dentro del dominio HC se puede alterar con el fin de dirigir el polipéptido de la presente invención a tipos de células específicos . En un ejemplo más particular, el dominio HC de la presente invención.

En una modalidad, la segunda cadena ligera se conecta a la parte N terminal de la primera cadena ligera. - - Esta conexión puede ser directamente vía un enlace o indirectamente vía un enlazante. En general, la unión entre los dominios se puede obtener via cualquier entidad adecuada para sujetar las diferentes subunidades juntas que comprende, además de las otras, enlace directo o enlace via un enlazante peptidico, via un enlazante químico o vía un enlace disulfuro. La unión puede ser separable o una unión no separable. Una unión separable es una unión la cual puede ser separada, por ejemplo, por una proteasa específica de secuencia. Una unión no separable es una unión la cual es estable después de la captación celular, en otras palabras varios ' dominios LC conectados por una unión no separable permanecen unidos entre sí, incluso después de translocación al citoplasma.

Los términos "unión", "uniones" o "enlace" describen cualquier posibilidad para conectar las diferentes cadenas polipeptídicas entre sí. En una modalidad el enlace es un enlace químico, por ejemplo un enlace covalente (por ejemplo un enlace disulfuro) , un enlace covalente polar, un enlace iónico, un enlace covalente coordinado, enlaces torcidos, enlaces 3c-2e y 3c-4e, enlaces de uno y tres electrones, enlaces aromáticos, enlaces metálicos, Unión intermolecular, unión dipolo permanente a dipolo permanente, en enlace de hidrógeno, unión dipolo instantáneo a dipolo inducido (van der Waals) y/o una interacción catión-pi. Como se menciona en lo anterior, esta definición abarca enlaces directos asi como enlaces indirectos vía enlazantes químicos.

Un "enlazante químico" se define en la presente como una entidad molecular producida por medios químicos, la cual es adecuada para conectar las diferentes subunidades del polipéptido de la presente invención. Este enlace químico se puede obtener, por ejemplo, por agentes bifuncionales conocidos en el ámbito. En otra modalidad, el enlace químico se obtiene por enlaces disulfuro, similar a la conexión entre la cadena pesada y ligera en el tipo natural. En otra modalidad adicional, la inducción de un enlace disulfuro se obtiene al introducir una secuencia que contiene cisteína de la cadena pesada (por ejemplo los aminoácidos 440-459 de BoNT/A) en la cadena ligera. Los ejemplos adicionales no limitantes de dichos enlazantes químicos son ácidos carboxílicos, alcohol polihídrico etoxilado, polivinilpirrolidona, polietilenglicol , etc.

Un "enlazante peptídico" se define en la presente como un péptido de una longitud de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 o hasta 100 aminoácidos, el cual conecta las diferentes subunidades del polipéptido de la presente invención entre sí. En una modalidad', el enlazante peptídico comprende por lo menos dos cisteínas. En otra modalidad, el enlazante comprende uno, dos, tres, cuatro, - - cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o hasta 10 histidinas en otra modalidad el enlazante es un sitio de separación de proteasa. En una modalidad adicional el enlazante habilita la producción de la proteina de fusión completa por métodos recombinantes .

En otra modalidad un sitio de separación de proteasa se puede introducir entre la primera y segunda cadenas ligeras, por ejemplo un sitio el cual puede cortarse por proteasas de E. coli como son listadas, por ejemplo, en el documento DE102005002978 pero sin la restricción de estas proteasas. En otra modalidad, el sitio de separación de proteasa es cualquiera de los sitios de reconocimiento para cualquiera de las serinas proteasas (por ejemplo quimiotripsina, tripsina, elastasa, subtilisina) , . treonina proteasas, cisteina proteasas (por ejemplo papaina, catepsina, caspasa, calpaina) , proteasas de ácido aspártico (por ejemplo VIH-proteasa, quimiocina, renina, catepsina, pepsina, plasmepsina) , metaloproteasas o ácido glutámico proteasas o cualquier combinación de las mismas .

La persona experta en el ámbito comprenderá que está invención no solo es adecuada para el uso de cadenas pesadas y ligeras naturales sino que también los péptidos recombinantes y/o componentes neurotóxicos híbridos están abarcados por esta invención. Por lo tanto, en una modalidad, una proteina de fusión de por lo menos una cadena pesada, por lo menos una primera cadena ligera y por lo menos una segunda cadena ligera está considerado, en donde por lo menos uno, parte o la totalidad de los dominios usados son producidos de manera recombinante, en otra modalidad se utilizan péptidos híbridos, es decir, péptidos constituidos de subdominios de serotipos diferentes (por ejemplo, una cadena pesada que comprende un dominio de unión y uno de translocación de serotipos diferentes o incluso una toxina diferente, por ejemplo toxina de tétanos, toxina de cólera o toxina pertussis) .

En otra modalidad, una o varias de las cadenas ligeras de otras toxinas clostridiales, por ejemplo Clostridium bifermentans, Clostridium botulinum de un serotipo diferente, Clostridium difficile, Clostridium histolyticum , Clostridium kluyveri, Clostridium novyi , Clostridium oedematiens , Clostridium perfringens, Clostridium ramosum, Clostridium sporogenes , Clostridium tetan!, Clostridium tertium o Clostridium welchii se pueden utilizar, por ejemplo en una modalidad se utiliza toxina de tétanos (también denominada tetanoespasmina o toxina espasmogénica ) así como cualquier variación y serotipo de las toxinas diferentes. Además, la parte de unión a célula de la cadena pesada se puede intercambiar con una secuencia polipeptídica la cual involucra la proteína de fusión con otro dominio dirigido, es decir, otra especificidad de célula (por ejemplo WO 2007/13839) . Otra modalidad adicional de la invención hace uso de las cadenas pesada y ligera, las cuales han sido alteradas por métodos moleculares o bioquímicos, de manera más preferible supresiones, inserciones, intercambio de aminoácidos o elongación .

En una modalidad, el serotipo del subdominio de translocación de HC (es decir, la parte N terminal de la cadena pesada) es el mismo serotipo que uno de la primera LC.

En una modalidad, la capacidad de separación del complejo SNARE del dominio LC es de interés principal. Por lo tanto, en una modalidad, uno de los dominios LC de la proteína de fusión se intercambia por la proteasa IGA de Neisseria gonorrhoeae, la cual posee también la capacidad de separación del complejo SNARE.

En modalidades adicionales de la presente invención también se refiere a neurotoxinas las cuales están modificadas químicamente, por ejemplo, por pegilación, glucosilación, sulfatación, fosforilación o cualquier otra modificación, en particular de uno o más aminoácidos de superficie o expuestos a solvente.

Además, en otra modalidad, la neurotoxina posee una secuencia etiqueta para permitir métodos de purificación simplificados. Dichos métodos de marcado conocidos hacen uso de moléculas pequeñas o péptidos, por ejemplo biotina, estreptavidina, etiqueta strep, etiqueta His, antigenos, fragmentos de anticuerpo, etc., los cuales están unidos de manera covalente o no covalente al polipéptido de la presente invención y permiten la purificación via cromatografía de afinidad, esferas u otros métodos de separación.

Como se establece en lo anterior en algunas modalidades, la proteína de fusión contiene dominios recombinantes o es producida recombinantemente en su totalidad. Las secuencias de ADN de todas las cadenas pesada y ligera de todos los serotipos de toxina botulínica están disponibles a partir de bases de datos públicas. Por lo tanto, se considera construir vectores que transporten los genes deseados para las cadenas pesada y ligera que se basen en esta información de base de datos. El vector después se expresa, por ejemplo, en E. coli para producir una proteína de fusión. En otra modalidad, el vector se puede expresar en otros sistemas de expresión, como por ejemplo células de levadura, de insecto o células CHO. En otra modalidad, los dominios de proteína se producen por separado y después se conectan posteriormente por métodos químicos. La proteína resultante después se aisla por métodos conocidos de purificación de proteína después, si - - es necesario se procesa adicionalmente (por ejemplo separación, enlace químico o tratamiento) como se utiliza en un agente activo en una formulación farmacéutica.

En una modalidad, la neurotoxina modificada es modificada adicionalmente para alterar (es decir, aumentar y disminuir) su' afinidad de unión a su receptor. La afinidad de unión se puede determinar en comparación con una neurotoxina nativa, es decir, una neurotoxina derivada de C. botulinum y que tiene una secuencia de aminoácidos natural. De manera alternativa, se pueden realizar análisis de unión con un fragmento de la neurotoxina. Preferiblemente, la neurotoxina se puede obtener de C. j otulinum. Una afinidad aumentada significa que la neurotoxina de acuerdo con la invención tiene una constante de disociación menor en comparación con la neurotoxina no modificada. Preferiblemente, la neurotoxina nativa es neurotoxina botulínica de serotipo A que incluye cualquier subtipo A, el cual se define con detalle en lo siguiente. Una neurotoxina botulínica producida de manera recombinante del serotipo A, cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a una neurotoxina botulínica obtenida de C. botulinum se comporta de una manera farmacológicamente idéntica o similar a la neurotoxina botulínica nativa que se obtiene de C. botulinum. La neurotoxina recombinante se puede producir, por ejemplo, en E. coli y se denomina comúnmente - - como la "neurotoxina botulínica recombinante" . Se pueden realizar análisis de unión con una neurotoxina aislada de C. botulinum o una neurotoxina que se obtiene por expresión de proteina recombinante. Preferiblemente, el polipéptido, el fragmento activo o derivado de acuerdo con la presente invención se une específicamente a moléculas asociadas a membrana plasmática, proteínas transmembranales, proteínas de vesícula sináptica, una proteína de la familia sinaptotagmina de las glucoproteínas de vesícula sináptica 2 (SV2), preferiblemente sinaptotagmina I y/o sinaptotagmina II y/o SV2A, SV2B o SV2C, de manera particularmente preferida sinaptotagmina I humana y/o sinaptotagmina II humana y/o SV2A, SV2B o SV2C, humanas. La unión preferiblemente se determina in vitro. Una persona experta en el ámbito conoce diversos análisis para determinar afinidades de unión entre una primera proteína (la neurotoxina) y una segunda proteína (el receptor) . Cualquiera de estos análisis puede ser útil para determinar el efecto de una mutación sobre la unión de receptor. Uno de tales análisis es el análisis de disminución de GST, el cual es el que se prefiere de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención. Este análisis se describe en los ejemplos de la presente invención. También se puede utilizar la resonancia de plasmón de superficie para estudiar la afinidad de unión. Las condiciones - - experimentales por lo tanto son descritas, por ejemplo, en Yo ler et al., Biochemistry 43(2004), 9725-9731. Además, se puede determinar la afinidad de unión utilizando microcalorimetria isotérmica. En una modalidad, el dominio de unión a gangliósido y/o el dominio de unión a receptor de proteina de neurotoxina se modifica de manera que se incremente la capacidad de unión en comparación con la neurotoxina natural de la cual se deriva el dominio HC. Como referencia se hace mención de los documentos WO2006/027207A1, WO2006/114308A1 y PCT/EP2008/006151 (EP 07 014 785.5) las cuales se incorporan completamente como referencia en este documento.

En otra modalidad, también se abarcan isoformas, homólogos, ortólogos y parálogos de toxina botulinica los cuales muestran por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90% y hasta 60%, hasta 70%, hasta 80%, hasta 90%, hasta 100% de identidad de secuencia. La identidad de secuencia se puede calcular por cualquier algoritmo adecuado para proporcionar resultados confiables, por ejemplo mediante la utilización del algoritmo FASTA (W.R. Pearson & D.J. Lipman PNAS (1988) 85:2444-2448). La identidad de secuencia se puede calcular al comparar dos polipéptidos o dos dominios tales como dos dominios LC o fragmentos de los mismos.

En una modalidad, el polipéptido de la invención es uno de los siguientes: LCBoNT/A-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/C-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/B-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/A-LCBoNT/C-HCBoNT/C, LCBoNT/C-LCBoNT/C-HCBoNT/C, LCBoNT/B-LCBoNT/C-HCBoNT/C y LCTeNT-LCBoNT/A-HCBoNT/A.

De estas neurotoxinas modificadas mencionadas antes especialmente las construcciones con una cadena ligera adicional tipo A se van a mencionar, debido a su excelente actividad proteolitica y estabilidad.

La invención también se relaciona con un anticuerpo capaz de unirse específicamente al polipéptido de la presente invención.

El término "anticuerpo" se utiliza en la presente para cualquier proteína o polipéptido que sea capaz de unirse de manera específica al polipéptido de la invención (por ejemplo aminoácidos, elementos de estructura primaria, secundaria o terciaria, epítopos, fragmentos, etc.). Los ejemplos para anticuerpos son las gamma-globulinas IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, fragmentos de las mismas, versiones modificadas de las mismas, etc.; también cualquier producto de gen de los genes V, D, J, receptores de linfocitos T, receptores de linfocitos B, etc. También se incluyen anticuerpos de cadena sencilla o anticuerpos modificados tales como anticuerpos humanizados. Dado que los antígenos se acaban de definir por su capacidad para ser unidos a un anticuerpo, representan un grupo muy heterogéneo. Los - - ejemplos para "antígenos" son proteínas; oligopéptidos ; azúcares, lipidos, lipopolisacáridos, moléculas celulares, virales o de superficie bacteriana; macromoléculas , etc. El término "específico" describe una afinidad de unión suficientemente alta para diferenciar entre diferentes patrones estructurales, es decir, la diferencia entre la afinidad por el antígeno debe ser de por lo menos 10 veces, 20 veces, 102 veces, 103 veces, lO4 veces, 105 veces, 106 veces, 107 veces, 108 veces o hasta 109 veces mayor que la afinidad a una estructura de referencia, el cual no es el antígeno o epítopo. En una modalidad, la estructura de referencia no es la neurotoxina de serotipo A a G. El anticuerpo de la presente invención es específico para el polipéptido de la presente invención. En una modalidad, no se une a las neurotoxinas naturales (es decir, serotipos A a G) y/u otras neurotoxinas y/o fragmentos de neurotoxina conocidos en el ámbito, en otra modalidad, el anticuerpo se une con afinidad muy reducida a neurotoxinas naturales y/u otras neurotoxinas conocidas en el ámbito mientras que la diferencia en afinidad suficientemente alta, en donde el anticuerpo aún es adecuado para purificación, inactivación de toxina y/o métodos de detección. Los ejemplos para anticuerpos de esta invención son tales anticuerpos los cuales reconocen uno o varios dominios LC adicionales y/o modificaciones de uno o varios de los "dominios LC adicionales .

Los anticuerpos se pueden producir por el método conocido en el ámbito. Además se conocen varios métodos de como seleccionar positiva y negativamente anticuerpos, los cuales reconocen el polipéptido de la invención pero no (o en un grado mucho menor) neurotoxinas ' y/o fragmentos conocidos. Como ejemplo se hace referencia a los documentos WO2005/063817, WO 2003/029458 y O2002/086096 los cuales se incorporan completamente en lo siguiente como referencia.

En una modalidad, el anticuerpo es adecuado para métodos de purificación, inactivación y/o detección de toxina. Los ejemplos para la aplicación de los anticuerpos son, por ejemplo, HDA (análisis de hemidiafragma) , inmunoprecipitación, cromatografía de afinidad, transferencia Western, etc.

La invención también abarca ácidos nucleicos que codifican para el polipéptido de la invención. En una modalidad, el ácido nucleico contiene secuencias adicionales conocidas en el ámbito, como, por ejemplo, promotores, mejoradores, elementos bacterianos, regiones IRES, estructuras de remate terminal, etc. Esta molécula de ácido nucleico puede ser ARNhn, ARNm, ARN, ADN, PNA, LNA y/o moléculas de ácido nucleico modificadas, etc. El ácido nucleico puede ser circular, lineal o se puede integrar en un genoma. Además se abarcan ADN-concatémeros que codifican para proteínas de fusión que comprenden tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez dominios LC.

La invención también abarca un vector adecuado para expresión in vitro y/o in vivo del polipéptido de la presente invención. Mientras que el vector in vivo puede ser expresado de manera transitoria, y/o estable. En una modalidad, el vector comprende además elementos reguladores y/o marcadores de selección. En una modalidad, el vector se basa en un origen viral, en otra modalidad es de origen de fago, en otra modalidad es de origen bacteriano.

La invención también abarca células hospedadoras procarióticas y/o eucarióticas adecuadas para expresar el vector y en particular el polipéptido de la invención. En una modalidad, la célula hospedadora es de origen clostridial, en otra modalidad, la célula hospedadora se deriva de células estándar para expresión recombinante, por ejemplo E. coli, etc. En una modalidad, el polipéptido es modificado dentro de la célula hospedadora (es decir, glucosilado, fosforilado, procesado por proteasas, etc. ) . Por lo tanto, tanto el pre-polipéptido, cualquier producto proteínico intermediario así como el polipéptido final están abarcados por esta invención.

El polipéptido de la invención puede ser parte de una composición o una composición farmacéutica. Una "composición farmacéutica" es una formulación en la cual un ingrediente activo para uso. como un medicamento o un diagnóstico está contenido o comprendido. La composición farmacéutica puede ser adecuada para diagnóstico o administración terapéutica (es decir, por inyección intramuscular o subcutánea) a un paciente humano.

La composición farmacéutica para ser utilizada en la presente puede comprender el polipéptido de la invención (es decir, el componente neurotóxico modificado) como el único componente activo o puede contener componentes adicionales farmacéuticamente activos, por ejemplo un ácido hialurónico o una polivinilpirrolidona o un polietilenglicol, opcionalmente la composición es estabilizada en pH por un amortiguador de pH adecuado, en particular por un amortiguador de acetato de sodio y/o un polialcohol crioprotector .

Dentro de una modalidad de la presente invención se considera que la formulación farmacéutica no contenga proteínas encontradas en el complejo de toxina botulínica diferentes al componente neurotóxico el cual es parte del polipéptido de la presente invención. El precursor del polipéptido de la presente invención se puede separar o estar sin separar, no obstante, dentro de una modalidad de interés particular, el precursor ha sido separado en cadenas pesada y ligera. Como se indica en lo anterior, los polipéptidos pueden ser de secuencia natural o se pueden modificar en uno o más residuos. La modificación comprende modificación química, por ejemplo mediante glucosilación, acetilación, acilación o similar lo cual puede ser benéfico, por ejemplo, para la captación o estabilidad del polipéptido. No obstante, la cadena polipeptídica del polipéptido de la' invención de manera alternativa o adicional se puede modificar por adición, sustitución o supresión de uno o más residuos aminoácidos.

En una modalidad, el polipéptido de la invención tiene una actividad biológica de 10 a 500 unidades LD50 por ng de polipéptido de la invención, determinado en uñ análisis LD50 en un ratón. En otra modalidad, el polipéptido de la invención tiene una actividad biológica de aproximadamente 150 unidades LD50 por nanogramo. Generalmente, la composición farmacéutica de la presente invención comprende el polipéptido de la invención en una cantidad de aproximadamente 6 pg a aproximadamente 30 ng.

Una composición farmacéutica que comprende el componente neurotóxico de toxina botulinica tipo A en forma aislada está disponible comercialmente en Alemania de erz Pharmaceuticals GmbH bajo la marca comercial XeominMR. La producción del componente neurotóxico de toxina botulinica tipo A y B se describen, por ejemplo, en las solicitudes de patentes internacionales WO 00/74703 y WO 2006/133818. Una persona experta en el ámbito puede adaptar las composiciones al polipéptido de la invención al que se hace referencia en la presente.

En una modalidad, la composición es una solución reconstituida del polipéptido de la invención. En otra modalidad, la composición comprende además sacarosa o albúmina sérica humana o ambos, en otra modalidad adicional la relación de albúmina sérica humana respecto a sacarosa es de aproximadamente 1:5. En otra modalidad, la albúmina sérica humana es albúmina sérica humana recombinante . De manera alternativa, la composición está libre de proteínas derivadas de mamífero tales como albúmina sérica humana. Cualquiera de las soluciones puede proporcionar estabilidad suficiente de neurotoxina al sustituir la albúmina sérica con otros estabilizantes no proteináceos (véase más adelante) .

Dentro de la presente solicitud de patente, el uso de un medicamento basado en el componente neurotóxico modificado mencionado en lo anterior se puede utilizar.

Con respecto a la composición y dosificación del medicamento en base en la toxina botulínica y con respecto a la composición, dosificación y frecuencia de administración del medicamento en base en el componente neurotóxico de la toxina botulínica, se hace referencia a PCT/EP2007/00575 .

La composición farmacéutica puede ser liofilizada - - o secada al vacio, reconstituida o puede prevalecer en solución. En una modalidad, cuando se reconstituye, la solución reconstituida se prepara agregando solución salina fisiológica estéril (NaCl 0.9%).

La composición puede comprender excipientes adicionales. El término "excipiente" se refiere a una sustancia presente en una composición farmacéutica diferente del ingrediente farmacéutico activo presente en la composición farmacéutica. Un excipiente puede ser un amortiguador, portador, antiadherente, analgésico, aglutinante, desintegrante, material de relleno, diluyente, conservador, vehículo, ciclodextrina y/o agente que proporcione volumen tal como albúmina, gelatina, colágeno, cloruro de sodio, conservador, crioprotector y/o estabilizante.

Un "amortiguador de pH" se refiere a una sustancia química que es capaz de ajusfar el valor de pH de una composición, solución o similar en cierto valor o en cierto intervalo de pH . En una modalidad, este intervalo de pH puede estar entre pH 5 y pH 8, en otra modalidad pH 7 a pH 8, en otra modalidad adicional 7.2 a 7.6 y en una modalidad adicional a un pH de 7.4. En otra modalidad la composición farmacéutica tiene un pH de entre aproximadamente 4 y 7.5 cuando se reconstituyen o para inyección, en otra modalidad de aproximadamente pH 6.8 y pH - - 7.6 y en una modalidad adicional entre pH 7.4 y pH 7.6.

En una modalidad, la composición también contiene 1-100 mM, en otra modalidad 10 mM de amortiguador de acetato de sodio.

Los intervalos de pH mencionados antes son solo ejemplos típicos del pH real y pueden incluir cualquier intervalo entre los valores numéricos indicados antes. Los amortiguadores adecuados los cuales están de conformidad con las enseñanzas de la presente invención son, por ejemplo, amortiguador de fosfato de sodio, amortiguador de acetato de sodio, amortiguador TRIS o cualquier amortiguador el cual sea adecuado para amortiguar dentro de los intervalos de pH anteriores.

Los términos "estabilizante", "estabiliza" o "estabilización" significa que el ingrediente activo, es decir, el polipéptido de la invención en una solución reconstituida o acuosa de una composición farmacéutica tiene más de aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% y hasta aproximadamente 100% de la toxicidad que presenta el polipéptido biológicamente activo de la invención al ser incorporado en la composición farmacéutica .

Los ejemplos de los estabilizantes son gelatina o albúmina, en una modalidad, de origen humano u obtenido de una fuente recombinante . También se incluyen proteínas de - - fuentes no humanas o no animales. Los estabilizantes se pueden modificar por medios químicos o por genética recombinante . En una modalidad de la presente invención se considera el uso de alcoholes, por ejemplo inositol, manitol como excipientes crioprotectores para estabilizar proteínas durante la liofilización .

En otra modalidad de la presente invención el estabilizador puede ser un agente estabilizante no proteináceo que comprende un ácido hialurónico o una polivinilpirrolidona (KollidonMR) , hidroxetil almidón, alginato o un polietilenglicol o cualquier combinación de los mismos, tal composición es estabilizada opcionalmente en pH por un amortiguador de pH adecuado, en particular por un amortiguador de acetato de sodio o un crioprotector o ambos. La composición puede comprender además de los estabilizantes mencionados antes agua y por lo menos un polialcohol tal como manitol o sorbitol o mezclas de los mismos. También puede comprender mono-, di- o poli-sacáridos superiores tales como glucosa, sacarosa o fructosa. Se considera que la composición es una composición más segura que presenta estabilidad notable.

El ácido hialurónico en la presente composición farmacéutica en una modalidad se combina con el polipéptido de la invención en una cantidad de 0.1 a 10 mg, especialmente 1 mg de ácido hialurónico por mi en una solución de toxina botulínica de 200 U/ml.

La polivinilpirrolidona (KollidonMR) cuando está presente en esta composición, se combina con el polipéptido de la invención en una cantidad tal que proporciona una solución reconstituida que comprende 10 a 500 mg, especialmente 100 mg de polivinilpirrolidona por mi en 200 U/ml de polipéptido de la solución de invención. En otra modalidad la reconstitución se lleva a cabo hasta en 8 mi de solución. Esto resulta en concentraciones de menos de 12.5 mg de polivinilpirrolidona por mi en 25 U/ml de polipéptido de la solución de la invención.

El polietilenglicol en la composición farmacéutica presente, en una modalidad, está combinado con el polipéptido de la invención en una cantidad de 10 a 500 mg, especialmente 100 mg de polietilenglicol por mi en 200 U/ml de solución de toxina botulínica. En otra modalidad, la solución objeto también contiene 1-100 mM, en otra modalidad adicional amortiguador de acetato de sodio 10 mM.

La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención en una modalidad retiene su potencia sustancialmente sin cambio durante períodos de seis meses, un año, dos años, tres años y/o cuatro años cuando se almacena a una temperatura entre aproximadamente +8°C y aproximadamente -20°C. Adicionalmente, las composiciones farmacéuticas indicadas pueden tener una potencia de porcentaje de recuperación de entre aproximadamente 20% y aproximadamente 100% cuando se reconstituyen.

El término "crioprotector" se refiere a excipientes que resultan en un ingrediente activo, es decir, el polipéptido de la invención en una solución reconstituida o acuosa de una composición farmacéutica que tiene más de aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% y hasta aproximadamente 100% de la toxicidad que presenta el polipéptido biológicamente activo de la invención antes de ser liofilizado en la composición farmacéutica .

En otra modalidad, la composición puede contener un compuesto polihidroxi, por ejemplo un polialcohol como crioprotector. Los ejemplos de polialcoholes que pueden ser utilizados incluyen, por ejemplo inositol, manitol y otros alcoholes no reductores. Algunas modalidades de la composición no comprenden un estabilizante proteináceo o no contienen trehalosa o maltotriosa o lactosa o sacarosa o un azúcar relacionado o compuestos de carbohidratos los cuales algunas veces se utilizan como crioprotectores .

Los términos "conservador" y "conservadores" se refieren a una sustancia o un grupo de sustancias, respectivamente, las cuales evitan el crecimiento o la supervivencia de microorganismos, insectos, bacterias u - - otros organismos contaminantes dentro de la composición. Los conservadores también evitan que la composición produzca cambios químicos no deseados. Los conservadores los cuales pueden ser utilizados en el ámbito de esta patente son todos los conservadores del estado de la técnica conocidos por las personas expertas en el ámbito. Los ejemplos de conservadores que se pueden utilizar incluyen, por ejemplo, alcohol bencílico, ácido benzoico, cloruro de benzalconio, propionato de calcio, nitrato de sodio, nitrito de sodio, sulfitos (dióxido de azufre, bisulfito de sodio, sulfito ácido de potasio, etc.), EDTA disódico, formaldehído, qlutaraldehído, tierra de diatomáceas, etanol, metilcloroisotiazolinona, hidroxianisol butilado y/o hidroxitolueno butilado.

El término "analgésico" se refiere a medicamentos analgésicos que actúan de diversas maneras sobre los sistemas nerviosos periférico y central e incluyen, por ejemplo, paracetamolMR (acetaminofeno) , los medicamentos antiinflamatorios no esteroides (MAINE) tales como los salicilatos, medicamentos narcóticos tales como morfina, medicamentos sintéticos con propiedades narcóticas tales como TramadolMR y muchos otros. También se incluye cualquier compuesto con uno efecto analgésico local tal como, por ejemplo, lidocaína, alcohol bencílico, ácido benzoico y otros .

En una modalidad, el analgésico es parte de la composición, en otra modalidad el analgésico se administra antes, durante o después del tratamiento con el agente quimiodesnervante .

El término "liofilización" se utiliza en este documento para un tratamiento de una solución que contiene el polipéptido de la invención, mientras que esta solución es congelada y secada hasta que solo los componentes sólidos de la composición permanecen. El producto liofilizado de este tratamiento por lo tanto se define en este documento como "liofilizado".

En este documento, el término "reconstitución" se define como el proceso de solubilización de la composición liofilizada del polipéptido de la invención. Esto se puede llevar a cabo al agregar la cantidad apropiada de agua estéril, por ejemplo si todos los componentes necesarios ya están contenidos en el liofilizado. 0, si este no es el caso, se puede realizar, por ejemplo, al agregar una solución salina estéril sola o, si es aplicable, con la adición de componentes que comprenden, por ejemplo, un amortiguador de pH, excipiente, crioprotector, conservador, estabilizante analgésico o cualquier combinación de los mismos. La solución salina mencionada antes "solución salina" es una solución de sal, por ejemplo una solución de cloruro de sodio (NaCl) , o una solución de cloruro de sodio - - isotónica (es decir, una concentración de cloruro de sodio de 0.9%). La solubilización se lleva a cabo de manera tal que la "reconstitución" final es administrable directa o indirectamente, es decir, por ejemplo después de dilución, al paciente. La neurotoxina se puede reconstituir en medios isotónicos, por ejemplo en solución salina ' isotónica o solución salina estéril.

Es notable que el concepto de la presente invención, el cual involucra la administración del polipéptido de la invención para el tratamiento de cualquier trastorno que esté asociado con inervación colinérgica hiperactiva de un músculo o una glándula exocrina, en donde el polipéptido de la invención bloquea la secreción de acetilcolina al espacio sináptico. Por lo tanto, el tratamiento ofrecido por la presente invención se puede dirigir a cualquiera de las siguientes indicaciones, la mayor parte de las cuales se describen con detalle en Dressler D (2000) (Botulinum Toxin Therapy. Thieme Verlag, Stuttgart, New York) : ¦ distonia ¦ distonia craneal • blefaroespasmo • distonia oromandibular o tipo de abertura de mandíbula o tipo de cierre de mandíbula - - bruxismo Síndrome de Meige distonia lingual apraxia de abertura del párpado distonia cervical antecolis retrocolis laterocolis tortícolis distonia faríngea distonia laríngea disfonia espasmódica/tipo aductor disfonia espasmódica/tipo abductor disnea espasmódica distonia de extremidad distonia de brazo distonia específica de tarea calambre de escritor calambres de músico calambre de jugador de golf distonia en la pierna aducción del muslo, abducción del muslo flexión de la rodilla, extensión de la rodilla flexión del tobillo, extensión del tobillo deformidad equinovara - - distonia del pie punta del pie de estriato flexión de la punta del pie extensión de la punta del pie distonia axial síndrome de pisa distonia de ombligo de bailarín distonia por segmentos hemidistonia distonia generalizada distonia en distonia en distonia en distonia ta distonia en distonia en distonia en distonia en discinesias inducidas por dopa/distonia inducida por dopa discinesias tardias/distonia tardía discinesias/distonia paroxismícas kinesiogénica no kinesiogénica inducida por la acción mioclono palatal - - mioclono mioquimia rigidez calambres musculares benignos temblor hereditario de la mandíbula actividad paradógica del músculo de la mandíbula espasmos hemimasticatorios miopatia branquial hipertrófica hipertrofia del masetérico hipertrofia de la tibia anterior nistagmo osciloscopsia hiperhidrosis parálisis supranuclear de la mirada epilepsia parcial continua aplanado de operación de torticolis espasmodica parálisis de cuerdas vocales abductoras disfonia mutacional recalcitrante disfunción del esfínter esofágico superior granuloma del pliegue vocal tartamudeo síndrome de Guilles de la Tourette mioclono del oído medio cierre protector de la laringe fallas de habla post-laringectomía - - tosis protectora entropio disfunción del esfínter de Odii pseudoacalasia trastornos motores de nonacalasia esofágica vaginismo inmovilización postquirúrgica temblor enfermedades genitourinarias disfunción de la vejiga vejiga hiperactiva incontinencia urinaria retención urinaria vejiga espástica enfermedades gastrointestinales disinergia del esfínter detrusor espasmo de la esfínter de la vejiga espasmo semifacial discinesias por reinervación uso cosmético patas de gallo señudo • asimetría facial hoyuelos en el mentón línea de seño de glabela - - líneas frontales platisma lineas de fumador lineas de marioneta elevación del masetero síndrome de persona rígida tétanos enfermedades de próstata hiperplasia prostática cáncer de próstata tratamiento de adiposidades parálisis cerebral infantil estrabismo mixto paralítico concomitante después de cirugía de desprendimiento de retina después de cirugía de cataratas en afacia estrabismo miosítico estrabismo miopático desviación vertical disociada como un adyuvante de cirugía para estrabismo esotropía - - exotropia acalasia fisuras anales hiperactividad de glándulas exocrinas síndrome de Frey Síndrome de lágrimas de cocodrilo hiperhidrosis axilar palmar plantar rinorrea hipersalivación relativa en apoplejía en enfermedad de Parkinson en esclerosis lateral amiotrófica condiciones espásticas en encefalitis y mielitis procesos autoinmunes esclerosis múltiple mielitis transversal síndrome de Devic infecciones virales infecciones bacterianas infecciones parasitarias infecciones por hongos - - • paraparesis espástica hereditaria • síndrome post-apopléjico o infarto hemisférico o · infarto en el tallo cerebral o infarto en mielina • en traumatismo del sistema nervioso central o lesiones hemisféricas o lesiones del tallo cerebral o lesiones en mielina · en hemorragia del sistema nervioso central o hemorragia intracerebral o hemorragia subaracnoidea o hemorragia subdural o hemorragia intraespinal · en neoplasias o tumores hemisféricos o tumores en el tallo cerebral o tumores en mielina cefalea · migraña • cefalea por tensión • cefalea de los senos cefalea crónica y/o pérdida de cabello.

La composición farmacéutica que comprende la - - toxina botulinica se administra, en una modalidad, varias veces en una cantidad eficaz para mejorar la condición del paciente. También debe hacerse notar que, en base en la persistencia del polipéptido de la invención se pueden necesitar dosificaciones menores o mayores, y por lo tanto la siguiente referencia de dosificación solo para propósitos de orientación.

Típicamente, la dosis administrada al paciente será de hasta aproximadamente 1000 unidades, pero en general no debe exceder de 400 unidades por paciente. En una modalidad el intervalo se encuentra entre aproximadamente 80 y aproximadamente 400 unidades. En una modalidad, estos valores son para pacientes adultos. Para niños el intervalo de dosis respectiva es de 25 a 800 y en otra modalidad de 50 a 400 unidades.

Aunque los intervalos anteriores se relacionan con las dosis totales máximas, el intervalo de dosis por músculo en una modalidad puede estar dentro de 3 a 6 unidades/kg de peso corporal (b.w.), para músculos pequeños, 0.5-2 U/kg de peso corporal, en otra modalidad 0.1-1 U/kg de peso corporal. Generalmente, las dosis no deben exceder de 50 U por sitio de inyección y de 100 U por músculo .

En una modalidad de la presente invención, la cantidad eficaz de toxina botulínica administrada excede de 500 U de polipéptido de la invención en adultos o excede de 15 U/kg de peso corporal en niños.

Respecto a la frecuencia de dosificación, el intervalo de reinyección dependerá en gran medida en la persistencia de la neurotoxina modificada. De esta manera, de acuerdo con la presente invención, el medicamento que se va a administrar se readministra en intervalos de entre 3 y 6 meses, en otra modalidad, el medicamento se readministra en intervalos de entre 2 semanas y menos de 3 meses. No obstante, dependiendo de las modificaciones de la neurotoxina, en otras modalidades se consideran tratamientos de más de 6 meses hasta 12 meses o tratamientos en periodos de tiempo más cortos de 2 semanas.

Con respecto a la composición y dosificación del medicamento en base en la toxina botulinica y con respecto a la composición, dosificación y frecuencia de administración del medicamento en base en el componente neurotóxico de toxina botulinica, el documento de E.U.A. 60/817 756 se incorpora en la presente como referencia.

Aunque los valores establecidos en lo anterior deben entenderse como una linea de guia general para administrar el medicamento como se utiliza dentro de la presente invención, no obstante finalmente es el médico quien es el responsable del tratamiento la persona que debe decidir sobre la cantidad de toxina administrada y la - - frecuencia de su administración.

El medicamento en base en toxina botulínica se puede inyectar directamente en los músculos afectados. Con el fin de encontrar el sitio de inyección apropiado existen diversos medios los cuales ayudan al médico con el fin de encontrar este lugar. Dentro de la presente invención son aplicables todos los métodos para encontrar el mejor sitio de inyección tal como inyección guiada por electromiografia (E G) , inyección guiada por palpación, inyección guiada por CT/MRI asi como inyección guiada por sonografia (ultrasonido) . Entre estos métodos, este último en una modalidad es el método de elección cuando se trata a niños. Con respecto a detalles adicionales respecto a la inyección guiada por sonografia véase Berweck "Sonography-guided injection of botulinum toxin A in children with cerebral palsy", Neuropedia trie 2002 (33), 221-223.

El término "inyección" se define como cualquier procedimiento el cual permite que una persona experta en el ámbito administre el agente activo al sitio objetivo al penetrar en la piel. Un número incompleto de ejemplos para "inyecciones" son subcutánea, intramuscular, intravenosa, intratecal, intraarterial, etc.

Debe entenderse que la terminología utilizada en la presente es para propósitos de describir modalidades particulares únicamente y no se pretende que sea limitante. - - Debe hacerse notar que, como se utiliza en la especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referencias a las formas plurales a menos que el contexto claramente lo indique en otro sentido.

LITERATURA. de Paiva A, Meunier FA, Molgo J, Aoki KR, Dolly JO. Related Articles, Functional repair of motor endplates after botulinum neurotoxin type A poisoning: biphasic switch of synaptic activity between nerve sprouts and their parent termináis. Proc Nati Acad Sci U S . 1999; 96(6) :3200-5.

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Eleopra R, Tugnoli V, Rossetto 0, Montecucco C, De Grandis D. Botulinum neurotoxin serotype C: a novel effective botulinum toxin therapy in humano Neurosci Lett. 1997,-224 (2) : 91-4.

- - Foran PG, Mohammed N, Lisk GO, Nagwaney S, Lawrence G , Johnson E, Smith L, Aoki KR, Dolly JO.

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EJEMPLO 2 - PRODUCCION DE LA PROTEINA DE FUSION EN E. coli La proteína de fusión se transfecta en E. coli TG1. La inducción se realiza a 21°C durante 4 horas. La proteína de fusión después se purifica por cromatografía en columna con StrepTactin-Sepharose (IBA GmbH, Góttingen) de acuerdo con el procedimiento de los fabricantes. La proteína de fusión después se activa por trombina inmovilizada (Thrombin-Sepharose) lo cual separa al enlace peptidico entre la cadena pesada y las dos cadenas ligeras. Las subunidades de la proteína permanecen conectadas únicamente vía enlaces disulfuro.

EJEMPLO 3 - PRUEBA DE PERSISTENCIA (EXTENSOR DIGITAL BREVE, EDB) A una persona de prueba se le aplican 4 unidades de XeominMR ( erz Pharmaceuticals GmbH) en el EDB derecho solubilizado en 0.1 mi de solución salina fisiológica y en el EDB izquierdo 4 unidades de una toxina botulínica modificada (proteína de fusión de toxina botulínica tipo A conjugada con una cadena ligera adicional de toxina botulínica tipo A. Cada 30 días el "potencial de acción de músculo compuesto" (CMAP) se mide electrofisiológicamente . Después de 90 días la amplitud de CMAP en el EDB derecho se reduce aproximadamente 40% (en comparación con la actividad inicial) mientras que en el EDB de lado izquierdo la amplitud se reduce en aproximadamente 70%. En el lado izquierdo el CMAP alcanza 40% después de 150 días.

EJEMPLO 4 - PROLONGACION DE PERSISTENCIA Un paciente quien padece de tortícolis espasmódica se trata con BotixMR (Allergan, Inc.) (240 unidades) . La persona debe ser tratada cada 10 a 12 semanas en una oficina neurológica debido a una actividad disminuida de la toxina botulínica. El paciente después recibe una inyección de 240 unidades de una neurotoxina - - modificada (toxina botulinica tipo A con una cadena ligera fusionada adicional de toxina botulinica tipo A) . El paciente no necesita inyección adicional hasta 18 semanas después del primer tratamiento.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que comprende: (a) un dominio HC o un fragmento del mismo del componente neurotóxico de una toxina clostridial; y (b) un primer dominio LC o un fragmento del mismo del componente neurotóxico de una toxina clostridial; y (c) por lo menos un dominio LC adicional o fragmento del mismo del componente neurotóxico de una toxina clostridial en donde el primero y por lo menos un dominio LC adicional puede ser igual o diferente entre si, y en donde cada uno de los fragmentos del primero y por lo menos un dominio LC adicional aún presenta actividad proteolitica .

2. El polipéptido como se describe en la reivindicación 1, en donde los dominios están conectados via un enlace, un enlazante peptidico, un enlazante químico o una combinación de dos o más de los mismos.

3. El polipéptido como se describe en la reivindicación 1 ó 2, en donde la secuencia de aminoácidos de uno o varios de los dominios LC y/o HC es por lo menos 50% idéntico a la secuencia de aminoácidos de un componente neurotóxico de toxina botulínica de serotipo A, B, C, D, E, F o G.

4. El polipéptido como se describe en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el HC o por lo menos un dominio LC o el HC y por lo menos un dominio LC comprende por lo menos una modificación.

5. El polipéptido como se describe en la reivindicación 4, en donde la modificación es una mutación, una supresión, una inserción, una adición o un intercambio de aminoácido o una combinación de dos o más de los mismos.

6. El polipéptido como se describe en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el dominio de unión a gangleósido y/o el dominio de unión a receptor de proteina de la neurotoxina se modifica de manera que incrementa la capacidad de unión en comparación con la neurotoxina natural de la cual se deriva el dominio HC.

7. El polipéptido como se describe en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que se selecciona del grupo que consiste de: LCBoNT/A-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/C-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/B-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/A-LCBoNT/C-HCBoNT/C, LCBoNT/C-LCBoNT/C-HCBoNT/C, LCBoNT/B-LCBoNT/C-HCBoNT/C y LCTeNT-LCBoNT/A-HCBoNT/A.

8. Un anticuerpo especifico para el polipéptido como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Un ácido nucleico que codifica para el polipéptido como se describe en cualquiera de las-reivindicaciones 1 a 7.

10. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 9 o fragmentos del mismo.

11. Una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 9 o el vector de la reivindicación 10.

12. Un método para producir un polipéptido que comprende las etapas de cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 11, producir y purificar el polipéptido codificado por el ácido nucleico o vector y, opcionalmente, formular el polipéptido en una composición farmacéutica.

13. Una composición que comprende el polipéptido como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o el polipéptido que se puede obtener por el método de la reivindicación 12.

14. Una composición como se describe en la reivindicación 13, para uso en un tratamiento terapéutico.

15. El uso del polipéptido como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o la composición de la reivindicación 13, para tratamiento cosmético.